Using solid-phase particles having a transponder, a method for determining the nucleic acid sequence

【発明の詳細な説明】 トランスポンダーを有する固相粒子を用いた、核酸配列の決定方法発明の背景 本発明は未知のまたは標的核酸の配列を決定するための材料および方法に関するものであり、より具体的には、固相粒子に結合したトランスポンダーを備えた電子的に標識された固相を用いて標的核酸の配列を決定する材料と方法に関する。 サンプル核酸の配列を確かめるための大量処理方法はハイブリダイゼーションによるシーケンシング（ＳＢＨ）である。 この方法では、沢山のオリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の核酸分子と相互作用できるようにし、個々のオリゴヌクレオチドがテンプレートにアニーリングしたか否かを決定する検出システムが提供される。 ２つの基本的な設計が記述されている。 そのひとつでは、オリゴヌクレオチドプローブがメンブレン、フィルター、VLSI チップ等の表面に２次元的なアレイとして配置される。 他方では、メンブレン上のアレイは多量のサンプルＤＮＡ配列によって形成され、各メンブレンは異なったオリゴヌクレオチドプローブとの連続的なハイブリダイゼーションステップにかけられる。 結合を監視するために用いるラベルは、放射性同位元素またはフルオロフォアであってもよく、サンプルＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブ上に保持される。 配列は２次元アレイ上に高レベルのラベルの沈着を示すスポットの座標により導かれる。 従来のＳＢＨ法はＤＮＡのアレイの調製、ＤＮＡの非特異的なアニーリング、 データの読取りに特殊な装置が必要なこと、操作およびデータ解析の自動化に関する困難さのために限界がある。 ＳＢＨでは、沈着したＤＮＡ分子によって形成される、アレイ中の関連するドットの２次元座標を定めることによって配列が決定される。 本発明では、既知の配列のＤＮＡプローブに結合した電子メモリー素子をデコードすることによってＤＮＡ分子の一部または完全な配列が決定される。 従来のシーケンシング法に対する本発明の有利な点は、ＤＮＡの化学的または物理的性質の連続的な測定、あるいはアレイ上のＤＮＡの位置からではなく、トランスポンダーにデジタルに保存された配列を連続的に読み取ることにより配列が推定されるので、非常に速いことである。 本発明の方法は以後デジタルシーケンシングという。 発明の概要本発明は、各粒子に結合したトランスポンダーを有する固相粒子を用いることにより従来のシーケンシング法の問題を克服する。 この粒子はその表面に結合したしたオリゴヌクレオチドプローブを有し、このオリゴヌクレオチドの配列はトランスポンダー上のメモリー素子にエンコードされている。 このオリゴヌクレオチドプローブは標的配列に存在すると考えられる部分配列に対応する。 サンプルまたは「標的」ＤＮＡの配列を決定するために、未知の配列の標的ＤＮ Ａをフルオロフォアでラベルし既知のオリゴヌクレオチドを保持するトランスポンダー粒子とアニーリング条件下で一緒にする。 このトランスポンダーを解析し、標的ＤＮＡがトランスポンダーの表面に結合したプローブに結合していることを示すラベルに由来する蛍光又は色を検出し、トランスポンダーに電子的に保存されている情報をデコードする。 次に、専用のシーケンスソフトウエアを用いて標的ＤＮＡの完全な又は部分的な配列を決定してもよい。 一つの特徴としては、本発明はトランスポンダーを有する固相粒子およびその粒子の外表面に結合した既知の配列をもつオリゴヌクレオチドプローブを含む、 核酸配列決定に用いる固相粒子を提供する。 他の特徴としては、本発明はトランスポンダーを備えた固相粒子を用いるステップを含んだ、サンプル核酸の配列を決定する方法を提供する。 他の特徴は、本発明は、アッセイ容器、トランスポンダーを有する固相粒子のセット、プローブ表面に結合した異なるオリゴヌクレオチドを含んだ、未知の核酸の配列を決定するためのキットを提供するものである。 図面の簡単な説明図１は、本発明のシーケンシング手順の略図である。 図２は、トランスポンダーを備えた固相粒子の断面図と、その表面に結合した生体分子の１次層である。 図３は、固相のトランスポンダー上のデータをエンコードおよびデコードするための信号経路の概略図である。 図４は、微小トランスポンダーの略図である。 図５は、微小トランスポンダーの平面図である。 図６は、本発明を実施するための搬送システム／解析装置の平面図である。 図７は、本発明の固相粒子を高速に解析するための修正フロ−サイトメーターの平面図である。 発明の詳細な説明図１は本発明の単純なシーケンシング手順を示している。 トランスポンダー12 を備えた固相粒子 10 は、その粒子 10 の外表面 16 に既知の配列のオリゴヌクレオチドプローブ 14 を結合することにより誘導体化される。 このトランスポンダー12 は、オリゴヌクレオチドプローブ 14 の配列を示すインデックス番号によりエンコードされている。 粒子 10 はラベルされた標的ＤＮＡ 11 を含む溶液中に沈められ、この溶液はＤＮＡを解離させるために加熱され、次にＤＮＡがアニールできるように冷却され、その結果標的ＤＮＡ 11 がプローブ 14 にアニールする。 トランスポンダー12 に結合したどの標的ＤＮＡ 11 の蛍光をも検出するためトランスポンダー12 が解析され、読取り／書込みスキャナー装置（示していない）を用いてトランスポンダー12 がデコードされる。 実際には、それぞれ異なるプローブを有しそのプローブの配列でエンコードされた一群のトランスポンダーが用いられるであろう。 標的ＤＮＡは適当な制限エンドヌクレアーゼ消化により前処理されるか、又は、DNase I消化による断片化によって、比較的短く(好ましくは 10nt〜100nt)好ましくは１本鎖ＤＮＡとなっていることが好ましい。 前処理は、クローニングおよびin vitroの転写によるＤＮＡからＲＮＡへの変換、必要であればそれに続くＲＮＡの部分加水分解、またはＰＣＲによるＤＮＡ断片の生成を含んでもよく、 後者はフルオロフォアによるＤＮＡのラベル化と組み合わせてもよい。 シーケンシングのために提供されるＤＮＡはすでに好ましい形態であるかもしれない。 しかし、もしＤＮＡが長い２本鎖ＤＮＡ分子、長い１本鎖ＤＮＡ分子、閉環状ＤＮ Ａ分子、またはニックの入った環状２本鎖ＤＮＡ分子である場合には、そのＤＮ Ａ分子は前処理されなければならない。 アニーリングの前にサンプルＤＮＡを蛍光ハプテンでラベルすることは、デジタルシーケンシングにおいては必ずしも必要ではないが実際的なステップである。 5'-突出末端をもつ制限断片は蛍光ハプテンにより誘導体化された１以上のdＮ ＴＰを用いたＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長反応によってラベルすることができる。 ＤＮＡ分子の3'-末端はターミナルデオキヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）および蛍光ハプテンで誘導体化されたdＮＰＴと酵素反応によってラベルすることができる。 ある種のサンドイッチタイプの応用例では、蛍光ハプテンは抗体（または結合パートナー）が入手できるどんなハプテン（例えばビオチン）にも置き換えることができ、この目的は、抗-ハプテン抗体および酵素に結合した抗-抗体２次抗体で、この酵素が沈殿する蛍光基質との反応を触媒するような抗体を含むサンドイッチ構成を通じてラベルされたＤＮＡのトランスポンダーへの結合を検出することである。 いくつかのタイプの核酸はトランスポンダー上に固定化することができる。 それらには、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質-核酸（ＰＮＡ）分子のようなＤＮ Ａ、ＲＮＡの修飾物が含まれる。 この固定化核酸は１本鎖であることが好ましい。 標的ＤＮＡへの結合特異性に必要なレベルを与えるに十分な長さであることが要求されるので、固定化核酸の長さはデジタルシーケンシングの異なる実施において変わりうる。 本発明の一つの実施態様では、オリゴヌクレオチドは標的核酸配列中に存在していると考えられる部分配列に対応する。 本発明の固相粒子上に核酸を固定化するいくつかの方法があり、トランスポンダーへのオリゴヌクレオチドの結合、またはトランスポンダー上でオリゴヌクレオチドを直接化学合成することが含まれる。 直接化学合成法には組み合わせ合成が好ましく、４つの容器中の、多量のトランスポンダー上での４種の異なるヌクレオシド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）の４つまでの独立した縮合が含まれる。 このトランスポンダーは４つのプールに分けられ、各プールは異なるヌクレオシドと反応させられる。 各縮合の後、４つのプール中のトランスボンダーは縮合に用いたヌクレオシドを示すシンボルでエンコードされる。 次に４つのトランスポンダープールは一緒に合わされ、４つの容器に再分配され、必要な及び実用的な回数だけ前記のプロセスが繰り返される。 トランスポンダー上の組み合わせ合成の正味の結果として、このトランスポンダーは異なるオリゴヌクレオチドで誘導体化され、そのオリゴヌクレオチドの配列はトランスポンダー内にエンコードされる。 誘導体化されたこのトランスポンダーと標的ＤＮＡは適当なバッファーの入った一つの容器中に保たれる。 バッファーの量は、トランスポンダーがバッファー中に完全に沈むのに十分でなければならない。 アニーリング反応に適当なバッファーはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であるが当業者の知るとおり他の多くのバッファーも適切である。 容器は典型的には 60℃〜100℃に加熱される。 温度は容器中に存在するかもしれない２本鎖ＤＮＡが１本鎖の形態にメルティングできるのに十分でなければならない。 次に、トランスポンダー上に固定化された配列のメルティング温度より低い、典型的には０℃〜60℃、多くの場合室温までこの容器はゆっくりと冷却される。 次に、結合していない標的ＤＮＡを除去するためこのトランスポンダーは数回徹底的に洗浄される。 標的ＤＮＡがアニーリングの前に蛍光ラベルされている場合は、アニーリング後処理は不要であり、トランスポンダーはデコーディングすることができ、表面の蛍光を測定することができる。 また、標的ＤＮＡがラベルされていない場合は、アニーリング後に蛍光ラベルしなければならない。 標的ＤＮＡ（トランスポンダーに結合したオリゴヌクレオチドと会合したもの）をラベルすることも可能であり、トランスポンダー上のオリゴヌクレオチドプローブ（但し、標的ＤＮＡと会合したもののみ）をラベルすることも可能である。 双方のアプローチに適切な方法はＤＮＡポリメラーゼを用いた鎖伸長である。 鎖伸長の手順は、（ａ）ラベルに用いるフルオロフォア-標識ヌクレオチドの型、（ｂ）伸長反応に用いる異なる蛍光ヌクレオチドの種類数（アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン誘導体の選択）に関して変えることができる。 使用するヌクレオチドの型については、ヌクレオチドはデオキシ型でもジデオキシ型でもよい。 鎖の伸長部分に１以上のラベルされたデオキシヌクレオチドが取り込まれ得るが、ジデオキシヌクレオチドはそれ以上の鎖伸長を妨げるため、ただ１つのジデオキシヌクレオチドの取り込みが行われうる。 ラベル化は、Applied Biosystems シーケンサーの自動シーケンシングの実行と同様に、フルオロフォアの最大蛍光波長を識別することによって使用した蛍光ラベルの型を区別することのできる、トランスポンダーの蛍光検出法と組み合わせることができる。 従って、デジタルシーケンシングにおいてジデオキシヌクレオチドを使用することは、使用するアプローチに依存して標的ＤＮＡまたはトランスポンダー上のオリゴヌクレオチドの 3'末端にすぐ近接する残基を同定しうる可能性を与える。 ４種の蛍光ラベルされたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ddＡＴＰ、ddＣＴ Ｐ、ddＧＴＰ、ddＴＴＰ)の存在下におけるラベル手順の好ましい実施態様においては、標的にアニールした、トランスポンダーに結合しているプライマーはＤ ＮＡポリメラーゼによって１つのヌクレオチド残基だけ伸長される。 取り込まれる残基の種類（Ａ、Ｃ、Ｇ またはＴ）は標的の配列により決まる。 したがって、蛍光の最大強度が見られる波長は残基の種類を示す。 伸長ステップの後、粒子は放射光の４つの波長を弁別できるフルオロメーターに通される。 このアプローチでは、本方法の基本的な実施におけるよりも多くの情報が得られる。 前述したように、蛍光の存在はアニーリングが起こったことの指標であるが、ここでは蛍光の波長がさらにプライマのすぐ下流にある（すなわち、プライマーの３'末端近くの）標的残基を識別する。 上述の手順の他のやり方では、反応にただ１つのフルオロフォアが用いられるが、４つの別個の容器中で、その４つの各容器中に４種の ddＮＴＰの１つが入っており、それを用いて４つの別個の伸長反応が行われる。 反応および適当な洗浄後、４つの容器の粒子は一緒に混合され、残りの手順は上述のように行われる。 しかしながら、この場合は、そのトランスポンダーについて伸長反応に使用されたヌクレオチドの型に関する情報を与えるために粒子のメモリーの追加のエンコードステップが必要である。 図２に、本発明に用いる固相粒子を記載する。 粒子 10 は粒子 10 の表面 16 に既知配列のオリゴヌクレオチドプローブ 14 を結合させることによって誘導体化される。 トランスボンー12 は粒子 10 に取りつけられている。 このトランスポンダー12 はプローブ 14 の配列を示すインデックス番号でエンコードされている。 このトランスポンダーはメーカーによってあらかじめプログラムされているかもしれないし、スキャナー読取り／書込み装置によってユーザーによってエンコードされるかもしれない。 トランスポンダーはあらかじめ定めた信号を受けることによって動作してデータを送信するするラジオ送信−受信機であり、微小トランスポンダー、ラジオトランスポンダー、ラジオタグ、トランシーバーなどとも称される。 信号は専用のスキャナーから送られ、このスキャナーはまた信号に応答してトランスポンダーから送られるデータを受け取って処理する。 このスキャナー機能は書込み機能、 すなわち、トランスポンダー上にデータをエンコードする過程と組み合わせることができる。 このような組み合わせ機器はスキャナー読取り／書込み装置と呼ばれる。 トランスポンダー-スキャナーシステムの利点は、この２つのユニットが物理的にワイヤーでつながっておらず、誘導的に、すなわち、典型的には 5〜1, 000kHz、しかし 1 GHz およびそれ以上の電磁波放射によりつながっていることに由来する。 図３は、トランスポンダ−１２とリモートスキャナー読取り／書込み装置 18 との通信を説明するフローチャートである。 固相ビーズ 10 に取りつけられたトランスポンダー12 はリモート読取り／書込み装置 18 からの電磁波によって送られたデータでエンコードされる。 アッセイステップが完了した後、このビーズ 10は解析物の結合を示すラベルの存在を検出するために解析され、ラベルの存在を示すビーズがデコードされる。 スキャナー18 はトランスポンダー12 へ信号を送る。 この信号に応答して、トランスポンダー12 はエンコードされたデータをスキャナー18 へ送信する。 本発明に用いられるものに似たいくつかのトランスポンダーは商業的に入手可能である。 Bio Medic Data Systems Inc.(ＢＭＤＳ,255 West Spring Valley Av e.,Maywood,New Jersey)は実験動物の識別に用いるプログラム可能なトランスポンダーを製造している。 このトランスポンダーはマウスのような動物の体内に埋め込まれ、トランスポンダー内部のエレクトロニクスを周囲の環境から保護するためにガラス封入される。 この会社が製造するトランスボンダーの一つ、モデル#IPTT-100 は、14x2.2x2.2mm の大きさを持ち重さ 120mg である。 このトランスポンダーは 16 英数文字までユーザーがプログラム可能で、16 番目の文字も他の 15 文字と独立にプログラム可能であり、また組込み温度センサーも備えている。 電子動物監視システム（ＥＬＡＭＳ）もまたトランスポンダーへの／からのデータをエンコードまたは読み取るためのスキャナー読取り／書込みシステムを含む。 トランスポンダー及びスキャナーの構造は米国特許第 5,250,944 号、5,2 52,962 号及び5,262,772 号に記載されており、これらの開示は本明細書に含まれるものとする。 他の類似のトランスポンダー−スキャナーシステムには、ＡＶ ＩＤコーポレーション（Norco,ＣＡ）によって造られたマルチ−メモリー電子タグ(米国特許第5,257,011 号)およびＴＥＭＩＣ-Telefunken（Eching,Germany） によって作られたシステムが含まれる。 ＡＶＩＤのトランスポンダーは 1mm x1m m x11mm の大きさがあり、96 ビットの情報をエンコードでき、ユーザーによってプログラム可能である。 本発明は、異なる大きさと異なる電子メモリー容量を持つかもしれない、異なるトランスポンダーでも実施できる。 商業的に入手可能なトランスポンダーは比較的サイズが大きい。 トランスポンダーがデコードされる速度は搬送周波数とデータの送信方法によって制限される。 典型的な信号送信機構においては、データは搬送波の振幅、周波数または位相のいずれかを変調することによってエンコードされる。 選択した変調方法、圧縮方法、送信環境、ノイズ及び他の因子に依存して、信号の送信速度は搬送周波数の大きさの２桁以内となる。 例えば、搬送周波数の 1,000Hz は１秒当たり 10〜 100,000 ビットの速度（bps）に対応する。 10,000bps の速度では 100 ビットの送信には0.01 秒かかる。 搬送周波数は 1,000Hz より数桁高くすることができ、 それに比例して送信速度もまた高くなる。 従って、スクリーニングプロセスにおける限定要因はフルオロメーター／スキャナー装置の読取り窓を通して搬送機構がトランスポンダーを運ぶ速度である。 微小な粒子または細胞の移動速度は最新のフローサイトメーターで１秒あたり10 ⁴ 〜10 ⁵である。 以下の２つの条件が充たされるならフローサイトメーターを本発明の実施に用いてもよい。 すなわち、（１）トランスポンダーがフローチャンバーを通過するに充分なほど小さいこと、および（２）フローチャンバーの設計がトランスポンダーから放射される電磁放射を収集するためのアンテナを含むように修正されることである。 微小トランスポンダーが図４および図５に描かれている。 トランスポンダー12 aの電力源はトランスポンダー12a 中の少なくとも１個の光起電力電池 40 であり、光、好ましくはレーザー（示していない）からの光によって照射される。 同じ光が、トランスポンダー12a の表面に固定化された蛍光分子の蛍光を誘導する。 トランスポンダー12a はＥＥＰＲＯＭ型であってもよいメモリー素子 42 を含む。 メモリーの内容はトランスポンダー12a 上にマウントされたデジタル-アナログ変換器 44 によってデジタルからアナログへ変換される。 信号は増幅器 46 によって増幅され、オシレーター48 によって作り出された搬送信号と混ぜ合わされ、アンテナ 50 によりトランスポンダー12a の外部へ放射される。 トランスポンダーメモリーの内容はトランスポンダーの製造過程の間に永久的にエンコードすることができ、トランスポンダーの異なるバッチは異なってエンコードされる。 好ましくは、トランスポンダーのメモリーはユーザーがプログラム可能で、生体物質がトランスポンダーの表面に沈着する直前、その間、または直後にユーザーによってエンコードされる。 ユーザーがプログラム可能なトランスポンダー12a は、専用のスキャナー読取り／書込み装置 27 だけでなく、アンテナ 50 によって可能とされる「書込み」属性、トランスポンダー12a 上に作られた増幅器 44 およびアナログ-デジタル変換器 46 を備えていなければならない。 図４および図５のトランスポンダーの利点は数倍ある。 第１に、現状のトランスポンダーの体積の大部分はソレノイドが占めているため、本トランスポンダーの大きさを小さくすることができる。 上記で議論した設計は１辺が 0．01〜1.0m m、好ましくは 0.05〜0.2mm の立方体のトランスポンダーの製造を可能にする。 第２に、単一のシリコンウェハ上にたくさんのトランスポンダーを製造することができ、VLSI チップにソレノイドを取りつけるためのそれ以上のアセンブリが必要とされないであろう。 図５に模式的に記述したように、シリコンウェハ60 は単にカットされて、作動するトランスポンダー12a を作り出す。 第３に、 この新規な設計によるトランスポンダーは、封入容器としてガラスカプセルを必要としないであろうが、そのことは更にトランスポンダーのサイズを小さくする。 二酸化ケイ素（SiO ₂ ）は本トランスポンダー表面のかなりの部分を構築するであろうが、SiO ₂は生体分子の誘導体化または固定化の可能性という点でガラスによく類似した化学的性質を有する。 また、微小トランスポンダーはプラスティック、ラテックスその他のいろいろな物質で被覆してもよい。 最後に、最も重要なことに、レーザー光のビームの狭い焦点は一度に一つのトランスポンダーを動作させることができるであろうし、このことはノイズのレベルを大きく低下させる。 より進んだ、ユーザによるプログラミングの可能性も望まれ、種々のメモリーレジスターは独立にアドレス指定できることが必要である（１つのレジスタへの書込みが他のレジスタの内容を消去してはならない）。 図６は本発明の実施態様で用いる解析計測装置と搬送システムを示す。 クォーツ管 20 がフルオロメーター24 の読取り窓 22 中に取りつけられている。 このクォーツ管 20 は金属漏斗 26 に接続されている。 クォーツ管 20 の長さはトランスポンダー12 の大きさと同様である。 トランスポンダー12 は金属漏斗 26 に入れられ漏斗 26 からクォーツ管 20 へ通過し、フルオロメーター24 によって蛍光が読み取られトランスポンダー12 はスキャナー27 によってデコードされ、 金属管28 を通って外に出て、回収容器（示していない）に導かれる。 金属漏斗 26 および金属管 28 は金属からなりスキャナー27 からの電磁信号をシールドすることにより、読取り窓 22 の外側でトランスポンダー12 をシールドしている。 このシールドは１以上のトランスポンダー12 にスキャナーの信号が達して複数のトランスポンダー12 がデコードされるのを防止する。 トランスポンダー読取り装置の位置決めができるように、この管が占める位置付近でフルオロメーター24 の微小な修正が読取り時に必要であろう。 既存のアッセイとの共存を保証するために、トランスポンダーを取り囲むガラスはビーズの製造に現在用いられているプラスチックで被覆することができる。 図７に示した好ましい設計では、フローサイトメータ 29 のフローセル 32 の周囲に金属コイルアンテナ 30 が巻かれている。 トランスポンダー12 はフローセル 32 を通りスキャナー装置 27 によってデコードされる。 トランスポンダー12 から送られるデータを運ぶ信号は第１の増幅器 34 によって増幅されスキャン装置 27 によって処理される。 トランスポンダー12 がデコードされるときには、 フローサイトメーター29 によってトランスポンダー12 からの蛍光が検出され解析される。 本発明の一つの実施態様では、トランスポンダーの同一セットの検出器への複数回通過が実施される。 各通過において温度を次第に上昇させるが、この目的は結合のストリンジェンシーが次第に増大し、標的のトランスポンダー上のプローブへの非特異的結合による効果を減少させることにある。 検出ステップが完了した後、このトランスポンダーは他の実験にさらに使用するために生体分子被覆を化学的に引きはがし、メモリーを消去しすることによって元の状態にすることができる。 標的ＤＮＡがフルオロフォアでラベルされている場合は、化学的な引きはがしに代わるものは非共有結合した標的ＤＮＡを解離させ除去するために高温でよく洗浄することである。 解析ステップおよびトランスポンダーのデコーディングが完了すると、そのデータが解析され、トランスポンダー上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの配列とそのプローブを有するトランスポンダーの読み取られた蛍光の情報とを関係づけることにより配列が決定される。 読み取られた蛍光の情報に関連するデータの型は使用する手順に依存して変化し得る。 アニーリングに先立ち標的ＤＮＡがフルオロフォアでラベルされている、またはラベルが単一のフルオロフォアであって、アニーリング後にＤＮＡポリメラーゼでの鎖伸長反応において導入された場合は、読み取られた蛍光の情報は単にその蛍光の強度である。 また、プローブまたは標的ＤＮＡ（実験計画に依存する）の 3'末端付近のヌクレオチド残基を同定する目的で４つのddＮＴＰが用いられたときは、読み取られた蛍光の情報は強度と最大蛍光波長に関する情報の双方である。 データセットの形態は、ハイブリダイゼーション法によるシーケンシング（ＳＢＨ）によって生み出されるものと類似しており、ＳＢＨのために以前に開発されたアルゴリズムもデジタルシーケンスに利用することができる(Drm anacR.ら、1993,ＤＮＡ Sequence Determination By Hybridization:ＡStrategy ForEfficient Large-Scale Sequencing.Science 260,1649-1652)。実施例１ ＤＮＡの化学合成を用いたトランスポンダー上へのＤＮＡプローブの固定化 ガラス支持体上で直接化学合成をすることにより核酸はガラスに共有結合させることができる。支持体を調製するために、5'-ジメトキシトリチルチミジンを１当量のトリレン-2,6-ジイソシアネートと、触媒としての１当量のＮ-エチルジイソプロピルアミン存在下でピリジン／1，2−ジクロロエタン中で反応させモノイソシアネートを生成した。モノイソシアネートは単離せずに直接アルキルアミンガラス支持体、すなわち、トランスポンダーのアミノプロピルトリエトキシシラン-誘導体化ガラス表面に直接添加した。この手順はＢ.Ｓ.Sproat およびＤ. Ｍ.Brown， A New Linkage For Solid Phase Synthesis OfOlgodeoxyri bonucleotides,Nucleic Acids Res.13,2979-2987,1985 に詳細に記載されている。安定なヌクレオシド-ウレタン結合を含むこのようなチミジン-誘導体化支持体は以前に記載されたような（Caruthers,Ｍ.Ｈ.ら、Deoxyohgonucleotides synth esis via the phosphoramidite method．GeneAmplification and Analysis,第II I巻(Ｔ.Ｓ.Papas らの編集）,Elsevier/NorthHolland,Amsterdam)標準的なホスホラミダイトベースのＤＮＡ合成試薬を用いる焼結漏斗上の手動合成プロトコルを用いたオリゴデオキシヌクレオチドの化学合成に直接用いられる。チミジン- ウレタンリンカーは保護除去の際塩基による切断に耐性であり、生ずる生成物はウレタン-チミジレートリンカーを介してトランスポンダーの表面上に結合した保護を外されたオリゴヌクレオチドである。実施例２ ＡＶＩＤトランスポンダーを用いた３ヌクレオチド領域の配列の決定 標的ＤＮＡは１本鎖の 50 残基の長さのオリゴデオキシヌクレオチドである。これは 5'-フルオレセイン化されたオリゴヌクレオチドをプライマーの１つとするＰＣＲ反応を用いて、ＤＮＡの直線的増幅によって得た。この実験で用いたＤ ＮＡ はＰＣＲ後に精製した。 50nt の標的の大部分である 47 ヌクレオチドの配列は、以下の図でＮＮＮと記された塩基番号 18〜20 の３残基からなる領域を除いて既知である。

記号「｜」は２つの配列の相補性を表す。 5'-GGTACTGCXXXACCTTCCA（式中Ｘはどのヌクレオチド残基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）であってもよい）には正確に 64 通りの可能な配列がある。 64 セットのＡＶＩＤトランスポンダーを調製し，各セットは実施例１に記載したように標準的なホスホラミダイト化学を用いてトランスポンダーの表面上に合成された異なるオリゴヌクレオチドプローブ（前述の図の上の配列）を有するようにした。 リンカーはアニーリングを容易にするために（dT）

₁₀配列を有する。 トランスポンダーを１番から 64 番の番号でエンコードし、各番号がトランスポンダーに結合したオリゴヌクレオチドに対応するようにした。 それぞれが異なるセットに由来する 64 種のトランスポンダーを10ml の容器に入れた。 標的を含む溶液（5ml）をこの容器に加え、その容器の内容物を 95℃に加熱し、10 分以上の時間でゆっくりと予め実験的に定めた洗浄温度Ｔ

_was

_hまで冷却した(Ｔ

_washは室温から 60℃までの範囲でよいが、データは示していない)。 アニーリングステップの後、このトランスポンダーを温度Ｔ

_washで徹底的に洗浄し、室温でバッファー中に保存した。 64 種のトランスポンダーのそれぞれを蛍光測定とタグの電子的デコーディングの双方にかけた。 その結果、６４の可能な配列が番号、読み取られた蛍光と関連付けられ、それはテンプレートがトランスポンダー上のオリゴヌクレオチドとアニールしたか否かを示し、従って、3nt 領域の配列に関する情報を与えた。 実施例３ ＢＭＤＳトランスポンダー上のオリゴヌクレオチドの組み合わせ合成を用いた２ ヌクレオチド領域の配列の決定 標的ＤＮＡは１本鎖の 50 残基の長さのオリゴデオキシヌクレオチドである。 これは5'-フルオレセイン化されたオリゴヌクレオチドをプライマーの１つとするＰＣＲ反応を用いて、ＤＮＡの直線的増幅によって得た。 この実験で用いたＤ ＮＡはＰＣＲ後に精製した。 50nt の鋳型の大部分である 48 ヌクレオチドの配列は、以下の図でＮＮと記された塩基番号 18〜19 の２残基からなる領域を除いて既知である。 記号「｜」は２つの配列の相補性を表す。 リンカーはアニーリングを容易にするために（dT）

₁₀配列を有する。 オリゴヌクレオチド5'-GGTACTGCAXXACCTTCCA（ 式中Ｘはどのヌクレオチド残基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）であってもよい）には正確に 16 通りの可能な配列がある。 これらの配列は以下のように200個のＢＭＤ Ｓトランスポンダー（14x2x2mm、各トランスポンダーの体積は約 50μl）上に組み合わせ方式で合成した。 まず、トランスポンダーの誘導体化されていないガラス表面を実施例１に記載したように処理し、トランスポンダーの表面に反応性の水酸基を導入した。 次に、そのトランスポンダーを標準的なホスホラミダイト化学を用いて１８サイクルの固相オリゴヌクレオチド合成にかけ、以下の残基を連続的に合成した：TTTTTTTTTTGGTACTGCA-3'。 このトランスポンダーをほぼ等しい数（すなわち50）の４つのグループに分けた。 ４つのグループの各々を、異なるヌクレオチドホスホラミダイトで１サイクルの固相オリゴヌクレオチド合成にかけた。 すなわち、グループ１のトランスポンダーはアデノシンホスフォラミダイト（Ａ）で誘導体化され、グループ２−シトシンホスホラミダイト（Ｃ ）、グループ３−グアニンホスホラミダイト（Ｇ）、およびグループ４−チミジンホスホラミダイト（Ｔ）とした。 ４つの縮合物の体積は約 4ml とする。 第１ サイクルが完了した後、４つのグループを上に示した残基の略号で電子的にエンコードした。 従って、最初の英数字は組み合わせ合成の第１サイクルでどの縮合が起こったかを示す。 次に、全てのトランスポンダーを一緒にプールし、完全に混合し、ほぼ同じ数のトランスポンダーを含む新たな４つのグループに分けた。 この新しい４つのグループを第２の組み合わせカップリングステップにかける。 第２のカップリングの概略は第１のカップリングと同一である。 第２のサイクル後の電子的エンコードは第２合成サイクルにおいてカップリングされたヌクレオシドに対応する第２の英数文字を付け加える。 この結果、各トランスポンダーはトランスポンダーの表面に結合したオリゴヌクレオチドの3'末端の２つのヌクレオチド残基の配列を識別する２つの英数文字でエンコードされる。 表面に結合したオリゴヌクレオチドを有するトランスポンダーを 20ml の容器中で鋳型を含む溶液中に沈め、この溶液の内容物を 95℃に加熱し、10分以上の時間でゆっくりと予め実験的に定めたアニーリング温度Ｔ

_annまで冷却した(Ｔ

_annは室温から 60 ℃までの範囲でよいが、データは示していない)。 アニーリングステップの後、 このトランスポンダーを温度Ｔ

_annで徹底的に洗浄した。 個々のトランスポンダーの蛍光を記録しそのトランスポンダーメモリーをデコードした。 強い蛍光は、 トランスポンダーに結合しているジヌクレオチド配列の相補配列が標的中に存在することを示す。 実施例４ ＤＮＡポリメラーゼによる単一ヌクレオチド伸長を用いた３ヌクレオチド領域の配列の決定 標的はＰＣＲ反応でＤＮＡの直線的増幅によって得られた１本鎖の 50 残基の長さのオリゴデオキシヌクレオチドである。 この標的ＤＮＡはフルオロフォアラベルを有していない。 50nt の標的の大部分である 47 ヌクレオチドの配列は、 以下の図でＮＮＮと記された塩基番号 18〜20 の３残基からなる領域を除いて既知である。 記号「｜」は２つの配列の相補性を表す。 リンカーはアニーリングを容易にするために（dT）

₁₀配列を有する。 ５つのＡＶＩＤトランスポンダーからなる９つのグループを上の図に示したようにオリゴヌクレオチド１〜９の化学合成によって誘導体化し、それぞれ１から９の番号で電子的にエンコードした。 このトランスポンダーを１つの 5ml 容器に入れ、標的を含む 2ml の溶液をこの容器に加えた(最終濃度は 10nM から 10μM)。 容器の内容物を 95℃まで加熱し 10 分以上の時間でゆっくりと予め実験的に定めた伸長温度Ｔ

_exまで冷却する（Ｔ

_exは室温から60℃までの範囲でよいが、データは示していない)。 アニーリングステップの後、このトランスポンダーを温度Ｔ

_exで徹底的に洗浄する。 ＤＮＡポリメラーゼおよび、Applied Biosystems の自動シーケンサーで用いるような４つの異なったフルオロフォアで誘導体化された４種のジデオキシヌクレオチドニリン酸、 ddＡＴＰ、ddＣＴＰ、ddＧＴＰ、ddＴＴＰ（Applied Biosystemsより入手）をこの容器に加え、この容器を 15 分間Ｔ

_exでインキュベートした。 続いて、トランスポンダーを洗浄温度Ｔ

_washで徹底的に洗浄した。 データ点のセットが、それぞれ「オリゴヌクレオチド＿配列、蛍光＿強度、最大＿蛍光＿波長」の形で得られた。 強い蛍光のトランスポンダーについては、最大蛍光波長は残基の種類を示し、トランスポンダー上にエンコードされた番号は各鎖中の残基の位置を示す。 従って、標的の 3nt 領域の配列が明らかになった。