各试验化合物物种的具有预定频率的组合文库

         1.发明所属技术领域

本发明属于在固相支持物上合成的试验化合物物种的组合文库领域。组 合文库是由随机选择的亚单位组成的多种化合物的集合体。所说的文库是 有用的，因为可对它们进行筛选以鉴别兴趣受体的配体。更具体地说，本 发明涉及当固相支持物是易于形成进一步可分的片段时的用于构建这样的 文库的方法。

            2.发明背景

在用于产生新的药学上的榜样(lead)的现代方法中，组合化学技术赢得 了广泛的接受(Gallop，M.A等，1994，药物化学杂志，37：1233-1251； Gordon，E.M等，1994，药物化学杂志，37：1385-1401.)。正在使用的 一种组合方法基于以下策略：合成在固相支持物的每个粒子上包含一种不 同结构的文库；使文库与可溶性受体相互作用；鉴别与大分子靶相互作用 的‘小珠’；确定鉴别的小珠所具有的结构(Lam，K.S等，1991，自然， 354：82-84)。另一种这样的方法是：从固相支持物上顺序释放限定等分 样的化合物；尔后在溶液中测定活性；鉴别活性化合物从中释放的粒子； 通过直接测序(Salmon，S.E等，1993，美国科学院学报，90：11708- 11712)或通过阅读其密码(Kerr，J.M等，1993，美国化学学会杂志， 115：2529-2531；Nikolaiev，V等，1993，肽研究，6：161-170； Ohlmeyer，M.H.J等，1993，美国科学院学报，90：10922-10926)阐 明其结构。

可使用首先由Furka描述的(Furka等，1988，药物化学第五次国际专 题研讨会，1988，布达佩斯；Furka等，1988，第14次国际生物化学大 会，1988，布拉格；Furka等，1991，国际肽蛋白质研究杂志，37： 487-493)产生等摩尔混合物肽的简单的原理合成可溶性随机组合文库。用 于反复筛选的可溶性文库的构建也已有描述(Houghten，R.Aal.1991，自 然，354：84-86)。K.S.Lam公开了使用不溶性随机组合文库的新的和意 外有用的技术。Lam在固相支持物上合成了随机组合文库，这样每种支持 物上有一种单一分子结构的试验化合物，而且，他还通过固相结合方案筛 选了没有预先从固相支持物除去试验的化合物的文库(Lam，K.S等， 1991，自然，354：82-84)。

然而，当合成了随机组合文库后，仅仅在用于合成的粒子数目至少比合 成的结构数目高一个数量级的情况下，所有可能的结构的重现才有可能完 成(Burgess，K.等，1994，药物化学杂志，37：2985-2987)。

对于文库构建，需要的是在限定数目的固相粒子上进行合成，固相粒子 的数目确切地与组成文库的化合物的数目相匹配。该数目通常是在每个预 定数目的“随机化”位置上亚单位类型数的数目的结果。例如，每个位置 可由五类亚单位的一种占据的三个位置(三体)的文库中有5×5×5＝125个物 种。对于这种理想的状态，我们能消除通过分裂和混合方法产生的文库的 统计不确定性。然后文库的分析可在不“丢失”活性化合物或检测同一结 构若干次进行，这种分析在小文库的情况下尤其有利(十个到一千种结构的 范围)，其中经常只发现一种活性化合物(参见，例如，(Stankova，M等， 1994，药物开发研究，33：146-156))。这样，在合成组合文库的领域中 需要按预定的次数合成具有每一潜在物种的文库(优选的是一次)的方法。

                    3.发明概述

本发明包括在固相支持物(通过切割易于而可连续地形成分开的 (separate)片段的基质)上制备组合文库的方法。组合文库的试验化合物由 各种位置上的亚单位组成。组合文库的试验化合物物种(species of test compound)通过在试验化合物的每个位置由亚单位逐步添加合成。亚单位选 自那个位置的一类亚单位。按照本发明，在逐步添加之前，把支持物基质 分割成相等于那一步添加的亚单位类型数目的片段。这一步骤可重复进 行，直到支持物基质片段小得无法分割。

按照本发明的方法，操作者可构建具有预定数目的物种和预定数目的片 段(pieces)的固相支持物的组合文库。在文库中，仅有一种试验的化合物 连接到任何固相支持物的一个片段上。按照本发明构建的文库包含在预定 数目片段的固相支持物上的各预定的试验化合物物种。在一个更为理想的 实施方案中，每一试验化合物物种存在于唯一的一个支持物上。

本发明不同于以前使用的合成组合文库的方法，因为本发明的方法使用 了预定的分割方案来代替混合和再次随机分配的步骤。这样，这些文库称 为“非随机”或“定向”文库。

可以设计分割方法以便产生的片段肉眼可辨，例如，具有不同的长度、 宽度，或者在片段为平面的情况下，它们的侧面和末端会形成不同的形状。 通过亚单位类型的逐步添加的配位，就可鉴别支持物的肉眼可辨的特征和 亚单位的类型。

                     4.附图简述

图1：定向文库合成的总的图解。具有三个位置的文库例子在每个步骤 中由两种氨基酸随机化，产生八种三肽文库。

图2：在棉线上125种四肽混合物模型文库的合成图解。

图3：2888种五肽膜文库的合成图解。“n”＝在特定位置上随机化的 氨基酸的数目。

                     5.发明详述

本文使用的试验化合物物种可以是单一限定的分子结构。另外，试验化 合物物种可以是限定分子的混合物的基元物种(motif species)，其中多亚 单位物种存在于这种试验化合物物种的一个或多个位置上。基元文库是其 中试验化合物物种是基元物种的组合文库。当构建基元文库时，本文使用 的术语“亚单位的类型”指亚单位的化学物种或者指亚单位物种的有限的 混合。关于基元文库，试验化合物物种的位置(其中添加了混合的亚单位物 种)称为“混合位置”。与随机组合文库的命名法相一致，基元文库或非基 元文库的试验化合物物种位置(其中存在一种亚单位)称为“随机位置”， 除了文库的所有物种在一个给定的位置有相同的亚单位物种之外，在这种 情况下其中位置称为不变量或固定位置。基元文库在1994年5月20日提 交的未决专利申请08/246,435中描述，本文一并参考。

为使得可以进行连接到支持物基质上的试验化合物物种的合成，提供了 一种连接物(linking means)。连接物对亚单位的连接可有多个反应位点。 在一个实施方案中，亚单位是具有可移动的保护基的双功能亚单位；氨基 酸是熟悉的例子。在这种情况下试验化合物是聚合物。

在另一个实施方案中，连接物包含多个正交封闭(orthogonally blocded)反应位点，其被称为支架(scaffolds)。在这个实施方案中，亚单 位提供了支架的取代基。这样，试验化合物物种是替代支架的物种。在支 架的每一点添加的亚单位可以是双功能或单功能的，连接到支架反应位点 的取代基可由一种或多种亚单位组成。

按照本发明，取代支架的文库的双功能和单功能亚单位以及聚合物文库 的双功能亚单位可以通过许多化学键连接到增长的试验化合物上，下列是 一些非限制性的例子：酰胺键、酯键、脲键、氨基甲酸乙酯键、碳-碳酰键、 碳-氮键、碳-碳单键、烯烃键、硫醚键以及二硫键。支架中的试验化合物 和非肽聚合物文库的产生化学在1994年5月24日提交的未决专利申请 08/249,830中描述，本文一并参考。

肽的固相合成通常在串珠状的聚合物上进行(Merrifield，R.B.， 1963，美国化学协会杂志，85：2149-2154)，然而，可以使用固相支持 物的替代形式。固相支持物包括膜(Daniels，S.B等，1989，Tetrahedron Lett.30：4345-4348)、纸片(Frank，R.，1992，Tet rahedron，48： 9217-9232；Frank，R.和R.Doring，1988，Tetrahedron，44：6031 6040)或棉(Eichler，J.和R.A.Houghten，1993，生物化学，32： 11035-11041；Lebl，M.和J，Eichler，1989，肽研究，2：232- 235)。多个合成技术的回顾参见Frank，R.，1993，Bioorg.Med.Chem. Lett.3：425430；J ung，G.和A.G.Beck-Sickinger，1992，Angew. Chem.T.Ed.Engl.31：367-383。先前用棉进行的试验(Eichler，J. 等，1991，肽研究，4：296-307)导致选择棉线作为一种合成“定向”或 “非随机”文库的实验固相支持物。这种文库的简单原理在图1中说明。 连续的支持物被分割成和使用在随机化第一步的亚单位类型的数目相同的 部分，片段分别和适当的残基反应。反应完成后，支持物基质的每一片段 分成和使用在随机化第二步的亚单位类型的数目相同的部分，收集每一片 段的适当片段用于偶联。

以这种方式，合成可以继续到亚单位添加到试验化合物的所有位置或直 到达到操作支持物的机械限制。棉线常规的机械限制是几毫米的直径，这 限定了棉线文库的实际容量在10个试验化合物和50,000个试验化合物之 间。这些比例的文库是实质上有价值的，尤其在非肽文库的情况下。这样， 具有少达二、三、四和五种随机位置的文库(亚单位类型的数目在2或3和 19或更多之间)在本发明的范围之内。

在另一个实施方案中，所述基质可以是功能化的膜。适合的支持物基质 的非限制例子包括聚丙烯和聚四氟乙烯(特氟隆)。最小的操作区域是大约 1mm2，由于膜仅仅10μm厚，当使用这种方法的自动化方法时，很容易构建 几百万化合物的文库。使用膜支持基质构建的文库大小仅仅由筛选文库的 经济、效率和花费的考虑所限制，而不受其合成的任何技术限制。

本发明的第三个实施方案是“可重构的牙刷(toothbrush)”，该牙刷具 有成束功能化的比棉机械性质更好的物质的线。不同刷子的线束可以解装 配并重装配成不同的组合以进行亚单位的逐步添加。单束线可在两或三轮 的添加步骤之后解装配并为进行下一步而重组。对于最后的随机化步骤， 线可按照本发明上述方法切割成片段。

定向文库构建方法的公开使得可以结合简单的编码方案，该方案在文 库中使用支持物的重要结构特征的简单(即肉眼可辨的)鉴别，它基于支持 物的物理特征，如颜色(Campian，E.等，1993，第13次腺苷酰硫酸大会， Edmonton，加拿大)、大小和材料的形状(在线的情况下为长度)。

与文库不同，其物种以固定的排列构建(其中所说的每个物种的位置与 其结构一致)，在本发明优选的实施方案中，试验化合物物种的全部结构不 是由肉眼可辨的特征确定的。相反，在筛选试验之后选择的试验化合物物 种的结构通过结构分析确定。结构分析可以通过使用如Edman降解法或通 过质谱法(在肽试验化合物的情况下)进行。分析的结构可以是试验化合物 自身或结构可以是除试验化合物外连接到每个固相支持物上的编码分子。 连接到固相支持物上的编码分子的结构首先是任意地和系统地连接到支持 物上的试验化合物物种有关，以便于鉴别试验化合物，其次，这样选择便 于测定。在组合文库中任意的编码分子的选择和使用在1994年5月24日 提交的未决专利申请08/249,830中描述，本文一并参考。

                       6.实施例

下列实施例作为本发明的某些实施方案的说明性实施例，无意于作为对 本发明范围的限制。

我们制备了两个“非随机”肽文库模型。每个这样的文库的制备和筛选 首先简要概述如下。这两个文库中每一个的材料和方法、筛选的合成的更 详尽描述在6.1-6.5部分。

第一个文库在棉线上制备，仅包含125种肽混合物(参见图2)。通过β- 丙氨酸(Eichler，J.等，1991，肽研究，4：296-307)和甘氨酸修饰的棉 线(125cm)连接到它之上。然后把线分割成五个部分，甘氨酸、丙氨酸、亮 氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸分别偶联到每一片段上。在完全的偶联和Fmoc脱 保护之后，把L-氨基酸的混合物偶联到所有线上。其后是两个连续的步骤， 每条线段切成5个片段，每一片段用一个选自上述五个氨基酸的组的氨基 酸酰化。接着重组、脱保护、中和、洗涤和干燥产生的125个片段；这就 导致了125种四肽基元物种的基元文库的产生(具有作为随机位置的位置 1，2和4和作为混合位置的位置3的每种粒子上的19种肽混合物)。

每片段切割成两半，然后把两半置于两个相配对的微滴定平板中，其中 之一装备有滤膜。然后使滤膜平板在真空干燥器中接触氨气以从棉上释放 肽。选择较早描述的气体氨解裂解(Bray，A.m.等，1994，J.Org.Chem. 59：2197-2203；Bray，A.M.等，1993，Tetrahedron Lett.34： 4411-4414)作为裂解方式，因为在断裂之后，肽保留在干燥的支持物粒子 的表面。肽可溶解进试验的缓冲液中。

在用缓冲液抽取肽之后，把肽转移到另一个平板上，进行抗-β-内啡肽 抗体结合测定。一个孔用于观察阳性反应，相应棉段的测序鉴别出序列 Tyr-Gly-Mix-Phe(Mix是所有氨基酸的混合物)，这片段序列相对应于已知 的抗-β-内啡肽抗体的基元。进一步的分析表明：1cm的棉线可产生400 nmol的释放肽，可以制备40ml的10μM试验化合物溶液，足够进行多重测 定。

第二个实施例是2888种肽的文库，该文库使用16×16cm功能化的聚四 氟乙烯(“特氟隆”)膜合成。膜通过N-保护的β-丙氨酸酰化，然后构建β- 丙氨酸和甘氨酸的重复序列组成的接头。合成图解在图3中给出。文库的 试验化合物物种具有下列结构：Xxx-Xxx-Pro/Gly-Gln/Phe-Phe/Leu(Xxx 是用于随机化的19种L氨基酸之一)，这种结构包含具有链霉抗生物素蛋 白的已知基元His-Pro-Gln的Leu-His-Pro-Gln-Phe序列的一个拷贝 (Xxx-His-Pro-Gln-Xxx的38个拷贝)、和包含抗-β-内啡肽单克隆抗体的 已知基元的Tye-Gly-Xxx-Phe序列的Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu的一个拷贝 (Barrett，R.W.等，1992，Ana l.Biochem.204：357-364；Cwirla， S.E.等，1990，美国科学院学报，87：6378-6382；Devlin，J.J.等， 1990，科学，249：404-40625；Lam，K.S.等，1993，Bioorg.Med. Chem.Lett.3：419-424；Lam，K.S.等，1991，自然，354：82-84； McLafferty，M.A.，1993，基因，128：2936；Pinilla，C.，1993， 基因，128：71-76)。然后文库使用固相结合方案用两个模型目标(链霉抗 生素蛋白和抗β-内啡肽)筛选。

用链霉抗生素蛋白筛选产生了55个阳性方形(squares)。肽的特异性通 过添加已知的竞争性生物素测定。17个方形包含在生物素存在时不和链霉 抗生素蛋白进行反应的肽，然而，所有的17个方形在缺少生物素的情况下 用大约相等的强度可再次阳性染色。对3个方形上的肽分别测序，结果在 表1中给出。所有方形的小片段立即切割下来并放置测序。这种多测序实 验(Lebl，M.等，1993，见C.H.Schneider和A.N.Eberle的肽，1992， Proc.22.EPS Eds.ESCOM，Leiden)揭示了对肽链的个别位置的需要。

用抗-β-内啡肽温育提供了21个染色的方形。使这些阳性相互作用的粒 子脱色，使用另外的检测方案与抗-β-内啡肽抗体重新温育。在第一次染色 中，抗体通过生物素标记，然后结合的靶的检测通过和链霉抗生素蛋白-碱 性磷酸酶复合物温育来达到。第二轮的检测通过和抗小鼠抗体-碱性磷酸酶 复合物温育进行。按这种方法，消除了第一种检测方案的非特异性相互作 用，因为第二轮的检测仅和选择性粒子进行；检测非特异性相互作用(检测 系统的特异性相互作用)的可能性显著降低。第二轮的温育仅检测出三个阳 性方形。对它们进行测序，测得的序列在表1中给出。发现了有基元Tyr- Gly-_-Phe的预期序列。

表1.在选择用于结合链霉抗生素蛋白和抗-β-内啡肽的阳性方形上的 发现的序列

 链霉抗生素蛋白                抗-β-内啡肽

Gly-His-Pro-Gln-Phe        Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

Met-His-Pro-Gln-Phe        Tyr-Gly-Gly-Phe-Phe

Lys-His-Pro-Gln-Phe    Tyr-Gly-Pro-Phe-Leu

                  6.1.材料和方法

仪器：使用1cm的石英杯记录在Hewlett Packard HP 8452A二极管排 列分光光度计上的UV/VIS吸收谱。通过Edman降解法测序在ABI 4778蛋 白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)和Porton PI 3010 仪器(Porton Instruments，Tarzana，CA)上进行。

材料：使用没有进一步纯化的商业级溶剂。保护的氨基酸从Bachem (Torrance，CA)、Advanced ChemTech(Louisville，KY)或 Propeptide(Vert-le-Petit，法国)获得。单克隆的抗-β-内啡肽抗体(克隆 3-E7)从Boehringer Mannheim购买。缀合到碱性磷酸酶上的链霉抗生素蛋 白从Pierce(Rockford，IL)获得，山羊-抗-小鼠碱性磷酸酶复合物从 Bio-Rad(Richmond，CA)获得。d-生物素从Sigma(St.Louis，MO)购买。

一般过程：固相合成在聚丙烯注射器中人工进行(Krchnak，V.和 J.Vagner，1990，肽研究，3：182-193)。Fmoc保护基用50％六氢吡啶/DMF 裂解1×10分钟。在DMF中的DIC用于Nα-Fmoc氨基酸的激活。每个浓缩反 应的完成通过溴酚蓝方法监测(Krchnabk，V.等，1988，Collect.Czech. Chem.Commun.53：2542-2548)。偶联方案包括在偶联和脱保护之间以及 脱保护和偶联之间以DMF洗涤(6-8次)。最后的脱保护由混合物K完成 (King，D.S.等，1990，国际肽蛋白质研究杂志，36：255-266)。

6.2.在棉线上的定向文库的合成

棉线于在二氯甲烷(DCM)中的25％三氟醋酸(TFA)里处理1小时。用DCM 洗涤(3×)，用在DCM中的5％二异丙基乙胺(diisopropylethylamine)中和(5 分钟)，再用DMF和DCM洗涤(3×)。Fmoc-β-丙氨酸(2mmol)在加入N-甲基 咪唑的同时通过DIC(2mmol)和HOBt(2mmol)激活偶联过夜(3.5mmol)。棉线 用DMF洗涤，取代通过裂解的Fmoc基-0.41mmol/g(683 nmol/cm)的光度测 定法测定。五段(每段25cm)棉线置于聚丙烯注射器中，Fmoc保护的氨基 酸(苯丙氨酸、酪氨酸(But)、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸)通过DIC/HOBt方 案偶联。偶联完成后(用溴酚蓝方法监测)棉线用DMF洗涤并置于一个注射 器中，然后裂解Fmoc基。以DMF和在DMF中的2％HOBt溶液洗涤之后，调 整摩尔比率以用于不同反应(以试点试验测定)的19种L(除了半胱氨酸之 外)Fmoc氨基酸的混合物(Eichler，J.和R.A.Houghten，1993，生物化 学，32：11035-11041；Geysen，H.M.等，1986，分子免疫学，23： 709-715；Pinilla，C.等，1992，生物技术，13：901-905)偶联到所有 的棉段上。在此偶联完成之后，洗涤棉段，裂解Fmoc基，洗涤的棉线以下 列方法分割给五个注射器。从每条线上切割下5cm的棉线并置于不同的注 射器中。按这种方法，所有注射器中仅有一段从每条25cm的棉线上切割下 来的5cm棉段，没有一个注射器中有一个以上的棉段。进行了五种氨基酸 衍生物(同上)的偶联，洗涤棉线，除去Fmoc基，再次细分棉线。在这种情 况下，1cm的片段从所有5cm的片段上切割下来并置于五个注射器中。进 行了相同的五种氨基酸的偶联，裂解Fmoc基，侧链保护基通过TFA、DCM 和茴香醚(50∶45∶5)的混合物裂解2小时。棉段用DCM、MeOH洗涤并干燥。 一个样品片段的氨基酸定量分析表现出400nmol/cm的取代。

6.3.在棉线上的定向文库的筛选

把棉段切割成两半，并置于两个相配对的微滴定板(一个装备有滤膜 底，一个为常规平板-“结构评价平板”)的配对位置上。滤膜平板放置到 用气体氨重复真空和充满的干燥器中。在接触20小时的氨之后，使干燥器 真空，然后除去氨。释放缓冲液PBS/Tween添加到每个孔中(100μl)，平板 在室温下振荡过夜。溶液过滤到试验平板上。

为了抑制ELISA，使用了96-孔的免疫平板(Dynatech)。每个孔最初用 在碳酸氢盐缓冲液(pH 9.4)中的50μl链霉抗生素蛋白(20μg/ml)(Pierce) 中包被过夜，其后用PBS洗涤三次。孔使用200μl在PBS中的牛血清蛋白 (BSA，3mg/ml)处理以防止非特异性连接，然后孔用PBS/Tween洗涤三次， 加入50μl的生物素化的Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(Salmon，S.E.等，1993， 美国科学院学报，90∶11708-11712)(10ng/ml)。1小时之后，以 PBS/Tween洗涤平板，加入从棉段上释放的50μl溶液(或Tyr-Gly-Gly- Phe-Leu，阳性对照)，然后加入50μl的抗-β-内啡肽(40ng/ml)。在室温 下温育1小时之后，以PBS/Tween洗涤平板，加入50μl的山羊-抗小鼠IgG 辣根过氧化物酶缀合物(Bio-Rad)的1∶1000稀释液。又一个小时后，洗涤 平板，加入100μl的在10ml 2，2-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑磺酸)底物中 的30μl 30％的H2O2的溶液(溶液在柠檬酸缓冲液中，pH 4.2)。15分钟后， ELISA平板在405nm下读数。仅一个孔表现出了明显的抑制。对来自“结构 评价平板”上相配对孔中的棉段样品(0.3mm)测序，发现了Tyr-Gly-Mix-Phe 序列。

6.4.在功能化的交联特氟隆膜上的定向文库的合成

有大约35nmol/cm2取代的亲水的氨丙基功能化膜(UV交联的氨丙基异丁 烯酸氨、N，N-二甲基丙烯和亚甲基-双-丙烯酰胺，16×16cm， Perseptive Biosystem，Bedford，MA)置于50ml的Falcon试管中，使 用DIC/HOBt方法在DMF中通过Fmoc-β-丙氨酸酰化。与Fmoc-甘氨酸、 Fmoc-β-丙氨酸、Fmoc-甘氨酸先后偶联。在脱保护之后，把膜分割成两部 分，Fmoc-苯丙氨酸和Fmoc-亮氨酸分别和它们相偶联。在偶联完成(溴酚 蓝监测)和脱保护之后，再次把棉段分割成两部分，为进行Fmoc-谷氨酰胺 和Fmoc-苯丙氨酸偶联而重组。在下一次的偶联中，膜再次分割成两片段， 为进行Fmoc-脯氨酸和Fmoc-甘氨酸的偶联而重组。从这些偶联物(8×4cm) 产生的棉段分割成19条(8×0.21)，条带置于19个小聚丙烯试管中。十九 种天然氨基酸(除了半胱氨酸之外)用于这个阶片段的偶联。在偶联完成和 Fmoc脱保护之后，条带再次切割成19片段(4×2.1 mM)，分到19个容器中。 同组的19种Fmoc氨基酸用于最后的偶联。重组所有的棉段，除去Fmoc基， 通过混合物K裂解侧链保护基(King，D.S.等，1990，国际肽蛋白质研究 杂志，36：255-266)。用TFA(2×)、DCM(5×)、MeOH(3×)、水(5×)洗涤膜 片段。基于最后的Fmoc释放的吸收率测量的取代为43.3nmol/cm2。

6.5.在交联的特氟隆膜上的定向文库的筛选

肽文库按照公开的方案筛选(Lam，K.S.和M.Lebl，1992，免疫方法， 1：11-15)。肽方形首先以双蒸水洗涤。在彻底洗涤之后，再洗涤方形并 用0.05％明胶(w/v)封闭非特异性结合。在以PBS/Tween(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，pH 7.2和0.1％Tween-20)和 2×PBS/Tween/明胶(2×PBS，0.1％Tween-20(v/v)和(w/v))洗涤之后，再和 在2×PBS/Tween/明胶中的20nM链霉抗生素蛋白-碱性磷酸酶一起温育。文 库再用PBS/Tween、2×PBS/Tween/明胶和TBS(137mM NaCl，2.7mM KCl， 25mM Tris base，pH 7.4)洗涤。加入标准底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐， 然后再加入一次。接着，将文库和底物转移到培养皿上显色。收集55个显 色方形，用PH 1.0的6M盐酸胍硫胺素洗涤，用DMF脱色，用明胶包被， 与100nM的d-生物素和在2×PBS/Tween/明胶中的20nM链霉抗生素蛋白-AD 竞争。与底物温育产生了17个无色的、竞争性的方形。在用底物处理之后 再和20nM的链霉抗生素蛋白-AD温育产生17个阳性反应的方形。

然后其余的文库以6M盐酸胍硫胺素、pH 1.0、DMF和明胶包被循环。 以PBS/Tween和2×PBS/Tween/明胶洗涤之后，加入在2×PBS/Tween/明胶中 的250ng/ml生物素化的抗-β-内啡肽抗体。在彻底洗涤之后，加入链霉抗 生素蛋白-碱性磷酸酶。然后如上所述进行文库洗涤、底物加入和显色。有 21个方形显色，尔后循环制备它们用于特异性测定。使用2×PBS/Tween/明 胶作为缓冲液，加入200ng/ml的抗-β-内啡肽抗体，然后以1.5nM山羊-抗 -小鼠-AP彻底洗涤。然后方形以PBS/Tween、2×PBS/Tween/明胶和TBS洗 涤，加入底物。结果3个方形显出了表明结合的颜色。