采用寿命编码的复合悬液分析/阵列 |
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| 申请号 | CN201380043924.3 | 申请日 | 2013-06-21 | 公开(公告)号 | CN104641233A | 公开(公告)日 | 2015-05-20 |
| 申请人 | 麦考瑞大学; | 发明人 | 金大勇; 陆怡青; 赵江波; | ||||
| 摘要 | 用于复合分析的系统、设备和/或方法。在具体但非限制性实例中提供了一种复合阵列如悬液阵列。将 荧光 衰减寿命用于悬液阵列中的探针，并从时间分辨 光谱 中编码/解码代码。寿命种群可以在不同色带产生。将一种新型时域技术或维度用于传统光谱和强度组合，从而扩展了悬液阵列的复合能 力 。在一种实例形式中，悬液阵列的复合能力可以扩展到约58的数量级。这为各个领域的应用如生命科学、数据存储和防伪提供了可靠的、高通量且相对便宜的复合分析方案。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于确定复合阵列中荧光探针的复合分析方法，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 采用寿命编码的复合悬液分析/阵列技术领域[0001] 本发明整体涉及复合分析和/或阵列；在一个实例中，更具体地涉及基于悬液的分析和/或阵列。换言之，本发明提供一种用于生物技术和生命科学实例领域的方法、系统和/或设备，如生物分子物种的确定和量化及防伪如防伪油墨或印刷。 背景技术[0002] 分子生物学前沿需要能够同时确定和量化大量生物分子物种的高通量分析技术。这涵盖基因组学、蛋白质组学、细胞间和分子信号、代谢组学、细胞组学和个体化用药广泛的生物信息学领域。例如，因为每个人的遗传特征变化很大，且传统的症状诊断技术经常无法诊断，新兴个体化用药领域致力于检测个体基因表达谱，以将重点放在针对个体特定的治疗上。现在，受分析速度和成本及基因组/蛋白质组的复杂性阻碍，目前无法更广泛的采用这种个体化生物分子诊断。理想工具将是能够支持不是几十个而是数千个不同分子靶标的分析通道文库或数据库。 [0003] 在数据存储中，复合的主要目标是提高空间有限的存储元件中数据存储能力。在钞票、身份证、商标标签等的防伪印刷中，复合有助于防止伪造、篡改或仿造，为了该目的，已经使用热变色、磁性、多色荧光剂和光变可变色油墨。复合一般需要地理想由纳米/微米尺寸物体承载的光学编码的矩阵，每种物体应当可高速准确确定，并优选低成本的。 [0004] 原则上，用于复合分析技术的平面阵列生物芯片提供基于平面阵列中微点预定位置的无限复合能力。然而，实际上，此技术未提供足够准确的量化数据。例如，因为其要求高度精确的机器人编码、扩散问题和/或每个反应微点之间变化的生物环境。另外，相对较高的制造成本和要求在分析前制造确定格式的阵列板妨碍或抑制有益定制。 [0005] 悬液阵列是新兴技术，将是未来基于复合分析的分子检测的领导技术。悬液阵列基于特别编码(最常用的是改变荧光染料组合)的全部微球。因此，微球被赋予一系列分别分配给特定分析物的个体可确定颜色编码。悬液阵列的主要优势包括快速反应动力学、无需洗涤带来更高的样品通量及微球系列的再现制造。由于微载体的均匀表面、使用简单及与替代产品相比费用降低，悬液阵列还为量化分析提供了可能性。 [0006] 目前使用悬液阵列可得到的光谱复合水平限制为约100，通过在不同强度比下用荧光染料编码微球实现。通过使用颜色和强度产生更大量的编码比较困难，因为在最受欢迎的微球材料聚苯乙烯中荧光染料和本底荧光的宽光谱宽度。替代方法包括使用不同尺寸和形状的微球、图案化反射金属纳米棒、微加工特征、空间选择光学漂白微球、稀土质谱流式细胞术和稀土掺杂玻璃微条形码。这些方法被认为不可能成为主流，因为存在各种缺陷(例如尺寸大和/或高密度材料)。 [0007] 图形编码，例如将颗粒设计为1D条形码、2D甚至是3D型式，提供可与平面阵列媲美的复合能力。但是，图形代码的解密需要主动定向机制和高分辨率的型式确定，基本限制分析通量。电子编码还可以形成大量代码，但是主要缺点来自对大尺寸的要求(>100μm)。包括利用拉曼散射、IR吸收或质谱指纹的图谱编码以及利用尺寸、形状和磁的物理编码的其他技术的应用也因其各自的局限而受到限制。 [0008] 基于不同荧光色带的数字化强度的光学编码被视为是最可行的方法。然而，尽管尝试使用新型材料如量子点取代传统有机染料，但是当需要多于约十种强度时，荧光探针2 的光谱重叠是有问题的。光学编码的复合能力实际上仍局限为约10。给如此庞大数量的编码解码呈现出另一个难题。尽管在原则上基于成像的解码系统能够给任何悬液阵列解码，但是平面上一些颗粒高度的细微变化都将严重妨碍基于强度的解码过程。 [0009] 因此，还有些悬而未决的问题需要克服或改进，以提供新或改善的复合分析和/或阵列，例如能够增加编码维数，其中表面量化结合分析对这些编码免疫。这些编码应该能够在高通量条件下被解开。 [0010] 本说明书中提及的任何现有出版物(或来自现有出版物的信息)或任何已知事物均不得视为或应该被视为承认、许可或任何形式的表明现有出版物(或从现有出版物得到的信息)或已知事物构成本发明相关领域公识常识的一部分。 发明内容[0012] 在各种形式中，本发明提供一种系统、设备和/或用于复合分析的方法。具体但不限于实例，提供了一种复合阵列如悬液阵列。 [0013] 作为具有一般临床潜能的平面阵列的替代品，悬液阵列遭受内部容量实际限制为2 约10个编码的问题。申请人已经开发了一种新型复合阵列，在一个优选实例中，提供了一种利用和/或设计探针的荧光衰减寿命编码悬液阵列以及解码由时间分辨光谱产生、得到或形成的编码的方法。在一个实例形式中，可以在不同色带形成寿命种群，例如通过用于不同探针的多重机制。 [0014] 采用一种新型基于时域的技术或维度，或用之取代或与传统光谱和强度组合结合，从而扩展复合阵列如悬液阵列的复合能力。在一个实例形式中，传统悬液阵列的复合能6 力可以扩展至约10数量级。通常，传统光谱编码能够形成用于珠面生物分析的自发荧光背景，影响灵敏度和量化性能。 [0015] 申请人已经意识到利用寿命(与荧光直接相关的参数)的潜能，使得除了光谱和强度，可以利用寿命形成光学标识(optical identity)的新维度，用于针对高通量筛选的复合检测。特别地，与已知传统方法相比，荧光探针为寿命维度提供了更大的用武之地和无背景优势，使得寿命的控制和差分提供实际和准确的替代方法。 [0016] 在实例形式中，申请人已经开发了基于稀土荧光的光学编码和/或探针，其在可见光照明下为黑暗，以及用于敏化和量化表面分子生物分析的无背景或背景减少的基质如珠基质。这个及其他实例形式为复合分析提供了一种可靠、高通量且相对便宜的方案，带来大量机遇或应用，例如生命科学和生物应用包括基因组学、蛋白质组学、药物学、诊断学等，防伪应用包括防伪油墨、或钞票、身份证、商标标签等的防伪印刷，以及数据存储应用。 [0017] 一方面，本发明提供了一种用于确定复合阵列中荧光探针的复合分析方法，该方法包括：激发所述荧光探针以产生荧光；以及测量由激发所产生的荧光的衰减寿命。 [0018] 另一方面，提供了一种用于检测分析物的复合分析系统，所述系统包括：配置为结合分析物的荧光探针；用于激发荧光探针以产生荧光的激发器；以及用于测量由激发所产生的荧光的衰减寿命的检测器。 [0019] 另一方面，本发明提供了一种用于复合阵列的荧光探针，所述荧光探针包括能够被激发以产生荧光的稀土元素，从而能够测量激发所产生的荧光的衰减寿命。 [0020] 优选地，复合阵列为悬液阵列。 [0021] 在一个实例中，该方法还包括：激发多个荧光探针以产生荧光；测量荧光的多个衰减寿命；以及时间分辨荧光，以确定荧光探针的类型。 [0022] 在另一个实例形式中，时间分辨荧光提供不同类型的荧光探针的寿命种群(lifetime population)。在另一个实例形式中，衰减寿命为微秒衰减寿命。在另一个实例形式中，时间分辨荧光提供一个或多个编码。在另一个实例形式中，在不同色带形成时间分辨荧光。在另一个实例形式中，不同色带用于提供基于时域的光学标识的文库。在另一个实例形式中，激发探针包括将探针暴露于电磁辐射中。 [0023] 在另一个实例形式中，通过UV辐射激发荧光探针。在另一个实例形式中，通过IR辐射激发荧光探针。在另一个实例形式中，荧光探针在可见光激发时保持黑暗。在另一个实例形式中，荧光探针为微球的一部分。在另一个实例形式中，探针包括一种或多种稀土元素。在另一个实例形式中，所探针包括一种或多种镧系元素。 [0024] 在另一个实例形式中，已经使用荧光共振能量转移(LRET)改变了荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，使用LRET先前调整具有可区分衰减寿命的两种或更多种探针。 [0025] 在另一个实例形式中，荧光探针包括一种或多种纳米晶体。在另一个实例形式中，荧光探针的衰减寿命通过改变纳米晶体已经改变。在另一个实例形式中，通过调整纳米晶体的掺杂浓度已经改变了荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，纳米晶体为稀土掺杂的上变频(上转换，upconversion)纳米晶体。在另一个实例形式中，通过改变供体与受体距离，改变衰减寿命。在另一个实例形式中，通过改变供体和受体的各自浓度，改变供体与受体距离。在另一个实例形式中，通过调整敏化剂(sensitizer)-激活剂的浓度差，改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，纳米晶体掺杂镱敏化剂和铒或铥发射剂。在另一个实例形式中，纳米晶体被封装到微球中。在另一个实例形式中，通过调整纳米晶体的尺寸，已经改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，通过调整纳米晶体的晶体相，改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，在单个色带中，存在多于十个具有不同衰减寿命的纳米晶体种群。 [0026] 在另一个实例形式中，衰减寿命在25.6μs至662.4μs之间。在另一个实例形式中，通过添加淬灭染料已经改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，通过在探针内使用金属基体(matrix)调整衰减寿命已经改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，荧光探针包括不同镧系元素复合螯合物(complex chelate)或不同基质晶体(host crystal)结构。在另一个实例形式中，除了测量荧光光谱和荧光强度，还测量荧光衰减寿命。 [0027] 在其他实例形式中，探针选自微球、组装以提供微球的纳米颗粒或纳米晶体、稀土掺杂的二氧化硅微球、嵌入钯(Pd)和/或铂(Pt)磷光的微球、嵌入电荷转移(CT)激发跃迁发射剂的微球及嵌入钌、锇或铼电荷转移(CT)激发跃迁发射剂的微球的组中。 [0028] 在另一个实例形式中，提供了至少五个红色带中的不同衰减寿命。在另一个实例形式中，提供了至少五个蓝色带中的不同衰减寿命。在另一个实例形式中，提供了至少四个绿色带中不同衰减寿命。在另一个实例形式中，对于UV脉冲激发束(excitation beam)和IR脉冲激发束照射，使用带通滤色器将探针分辨为四个通道(channel)，每个通道具有初始强度参数和衰减寿命参数，从而提供八个维度。 [0030] 从以下说明中，实例实施方式应该变得显而易见，其仅是通过至少一个优选而非限制性实施方式的实施例并结合附图描述给出。 [0031] 图1示出了一种时间分辨悬液阵列的实例解码概念。 [0032] 图2通过每个微球的寿命直方图示出了编码微秒域时间分辨悬液阵列的实例方法。具体地，(a)荧光共振能量转移法，(b)将上变频纳米晶体作为构造单元的实例悬液阵列组件，(c)通过调节敏化剂-激活剂的浓度差的上变频能量转移方法，及(d)通过调整上变频纳米晶体的尺寸和相位的尺寸相关的荧光方法。 [0033] 图3示出了单个微球的实例绘图，以及携带编码寿命的五个种群的时间分辨分离。 [0034] 图4示出三维时间分辨光谱，例如应用UV和IR脉冲激发束后的编码微球(a)，其可以使用带通彩色过滤器分解成四个通道，每个通道有自己的初始强度和衰减寿命作为两个独立参数(b)，导致共计八个维度作为八个数字(c)。 [0035] 图5a示出了Eu螯合物(低于365nm)、Er和Tm上变频纳米晶体(低于980nm)的标准化发射光谱。 [0036] 图5b示出了Er和Tm发射带在不同强度水平时的光谱重叠。 [0037] 图5c示出了对实例微球测得的寿命，与并入相同单个探针的微球相比，这种微球并入了混合探针(Eu、Er和Tm)。 [0038] 图6示出了LRET设计的每个含Eu微球的实例寿命测量结果。将含有相同数量Eu复合物的不同溶液作为供体，之后将数量不断增加的受体染料封装到每组聚合物微球中，然后进行时间分辨扫描细胞计数分析：(a)示出了当原染料溶液中受体浓度上升时，因为3+ 较强的LRET效应，在Eu 红色发射谱带测得的荧光寿命缩短。插图曲线为从单个Eu-LRET微球测得的荧光衰减信号，(b)示出了在实例样品中，五种实例维修给出了完全独立的寿命直方图(如图2a)，从而使它们能够使用时间分辨扫描细胞仪确切区分开。每个直方图左边的数字为高斯拟合平均寿命±寿命CV。 [0039] 图7示出了使用寿命编码Eu-LRET实例微球和时间分辨扫描细胞仪进行复合DNA检测的实例示例：(a)选择的五种Eu-LRET微球(参见图6b)与五种不同的DNA序列捕获探针结合(四个与HIV、EV、HBV和HPV-16的病原体DNA互补，另一个用于对照目的)。此3+ 外，在夹入珠分析中还使用了通用报告基因染料，(b)通过测量它们Eu 荧光衰减寿命，将实例微球确定为四种类型，(c)通过测量报告基因染料的荧光强度，确定试样中靶病原体DNA数量。在持续激发下，使用不同发射带通滤波器在500ms暴露时间拍摄图像。(比例尺： 10μm)。 [0040] 图8示出了寿命调整实例方法和NaYF4:Yb,Tm上变频纳米晶体的时间分辨共聚焦图像。每个像素在激发200μs，然后是延迟检测窗口期上达至3.8ms，以记录时间门控荧光衰减。每个像素的阴影或灰度代表从衰减曲线解码得到的其寿命值。所述图像中的纳米晶体从左到右的Tm掺杂浓度分别为4、2、1、0.5和0.2mol％。 [0041] 图9示出了通过时间分辨扫描细胞仪系统测得的实例τ点标记的贾地鞭毛虫的结果：(a)和(b)示出了从具有不同寿命编码τ点的鞭毛虫得到的寿命直方图((a)的Tm/Yb掺杂浓度(mol％:mol％)为1:20，(b)为4:20)。扫描细胞仪能够取回荧光的每个靶鞭毛虫及明视场成像确认，(c)示出了相同鞭毛虫在4小时持续激光激发条件下的典型记录荧光图像。 [0042] 图10示出了对于作为载有独特寿命代码的复合悬液阵列表示的微球实例τ点编码种群的结果：(a)合成单分散Tm上变频纳米晶体(顶部TEM图像)可以嵌在微球壳上(底部SEM图像)，(b)通过调节敏化剂-激活剂共掺杂浓度，上变频能量转移机理可以在Tm蓝光发射带产生8种微球寿命种群。每个直方图旁边的数字表示从高斯分布拟合得到的平均寿命±寿命CV。轴上的区域代表每个种群占用的寿命资源(±3σ)，而空白处表示可以设计更多种群，(c)二维(强度与寿命)散点图示出了独立于每个微载体强度的所有寿命污染。 [0043] 图11示出了寿命编码文件防伪和光子数据存储应用实例。用不同Tmτ点打印三个重叠图形：“澳大利亚麦考瑞大学”标识为(CTm:CYb)4:20；歌剧院图像为1:20，及悉尼港口大桥图像为0.5:20。尽管基于强度的荧光成像仅给出了难以分辨图片(a)的难题，而对比时间分辨扫描根据每个像素的寿命将图形分开(b)，从而使文件相同重叠空间中载有的真正复合信息得以解码(用于描绘c中每个像素的荧光寿命的假彩色/色度)。 具体实施方式[0044] 描述通过实施例给出的以下方式旨在提供更精确的理解优选实施方式的主题。 [0045] 时间分辨扫描：时域中的复合检测 [0046] 申请人已经扩展了复合分析的能力，例如悬液阵列中的复合。这是通过使用或添加新时间维度实现的。在一个实例中，基于寿命，除了光谱复合中目前可能的编码数量外，还已经实现了约100另外编码的可能因子(倍数，factor)，从而将可能复合总水平增加到约10,000或更多编码。这使复合能力与生物样品的实际复杂程度一致，还允许构建或产生承载约10,000编码的探针文库或数据库如特定微球，从而使用户在进行复合分析设计有更大的范围和更大的灵活性。 [0047] 复合策略的原理是基于时域作为光谱和强度外的额外维度的探索。在一个实例中，选择一种或多种镧系元素作为实例荧光探针以产生时间分辨悬液阵列。镧系元素具有与它们的超长寿命(>100μs)相关的广泛动态范围，以及其他吸引人的性质包括窄发射光谱和大斯托克斯位移。实例实施方式可以单独使用任何一种镧系元素或其任意组合，包括镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。其他实例实施方式可以单独使用任何一种稀土元素或其任意组合，包括除钪和钇之外的十五种镧系元素。 [0048] 申请人已经确认了大量精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率及产生单个探针和/或微球的可行技术、方法或机理。在一个非限制性实例中，探针/微球为稀土掺杂的探针/微球。在另一个非限制性实例中，探针/微球为镧系元素掺杂的探针/微球。在另一个非限制性实例中，探针/微球为稀土掺杂的聚苯乙烯探针/微球。 [0049] 应当理解地是，各种其他类型的探针/微球也是可能的，包括例如组装以提供微球的纳米颗粒、稀土掺杂的二氧化硅微球、嵌入钯(Pd)和/或铂(Pt)磷光的微球和嵌入电荷转移(CT)激发跃迁发射剂(如钌、锇和铼)的微球。 [0050] 具有明确可区分的寿命、通过荧光共振能量转移(LRET)有意调整的两个或更多个靶标的复合检测例如讨论五种实例微球，已经得到证实，并成功用于各种应用，例如不同DNA链的同时探测。 [0051] 在多种基于荧光的分析技术中，表现出特别长寿命(毫秒到微秒)的荧光探针与有机荧光团(寿命为纳秒级)相比提供优势，包括无背景生物感应和生物成像(bioimaging)、防伪应用扫描或印刷、高精度能量转移测量和低功率光学超高分辨率成像。 这些结果允许在混杂的光谱维度顶部构建带有寿命标识的新光学文库，努力激发需要高级分析方法的生物科学领域或其他领域的新发现，例如防伪油墨或染料。 [0052] 荧光例如从有机染料或量子点的衰减寿命一般为几十纳秒的范围内；然而，含有特定族元素的材料，尤其是镧系金属或铂族金属，通常展现出具有从微秒至甚至是毫秒的寿命的延长的荧光衰减。当从荧光寿命测量供体与受体之间的距离时，使用长寿命探针取代有机染料作为共振能量转移供体提供更高的准确度、更大可测量范围以及更高的标记公差。长寿命还可以有助于降低受激发射损耗(STED)超高分辨率成像所需的功率，例如可以在不损坏生物样品或其他物理样品的情况下进行实时监控，如用于安全认证。 [0053] 另外，寿命维度在现代防伪应用、微生物学、生物化学和生物医学所需要的高级高通量分析技术中有很大的潜能。在生物应用中，同时筛选多个生物分子物种，称为复合，依赖多个不同生物探针荧光可区分颜色的已知流行技术，然而，其彼此掺混，因为它们的发射光谱通常存在交盖(spillover，溢出)问题。随着生物探针的数量增加，此串扰问题变得更加棘手。例如，如果只需提供全面的颜色补偿，最新多色流式细胞仪就能够测量多达十七种荧光颜色(十一种来自有机染料以及六种来自量子点)，更不用说用于四种激光设备和十七种单独的光检测器及二色镜和带通滤波器不可持续的级联。作为替代方法，已经利用其他分光镜特征如使用特定生物探针的质谱或拉曼光谱，以增加复合容量。然而，这些方法一般与荧光测量不兼容，而荧光测量产生的最终灵敏度往往高出两个数量级。 [0054] 与此相反，申请人已经认识到将寿命作为与荧光直接相关的参数的潜能，使得对于针对高通量筛选的复合检测，寿命可以用于产生光学标识的新维度(除了光谱和强度)。特别地，荧光探针为寿命维度提供更大的用武之地和无背景优势，使得与传统已知方法相比，寿命的控制和区分提供实际且准确的替代方法。 [0055] 长荧光寿命的辨别一般超出大部分已知的在售系统的能力。寿命参数的提取主要在溶液/悬液中，借助后处理进行，而不是在每个探针或微靶上实时进行。这不仅是因为荧光探针不合适激发/发射波长组合，还因为三大重要原因：1)延长的荧光衰减可能导致基于流行的非线性拟合算法的不可接受的长处理时间；2)对于快速寿命测量的情况(其依赖低水平荧光信号)，不合适的检测通道结构可能实质上无法精确测量超长寿命；3)必须考虑暗电流或暗计数的噪声，在纳秒范围时，对于测量寿命其一般会忽略，因为与长寿命有关的信号分布组合了较高水平的噪声(与检测窗口的长度成比例)，该噪声影响结果的准确性。 [0056] 用于调整荧光衰减速率的荧光共振能量转移(LRET) [0057] 精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率的第一种技术、方法或机理基于荧光共振能量转移(LRET)，其中镧系元素络合物例如铕络合物的供体与能量受体如六氟磷酸盐非常接近并彼此相互作用，因此，原本短寿命的受体染料减少长寿命荧光。通过改变供体与受体的各自浓度来改变它们之间的距离，从而能够精细调整供体和受体的荧光寿命，并伴随强度变化。 [0058] 参见图2a，其中示出了一种实例荧光共振能量转移方法或工艺。通过添加数量逐渐增加的淬灭染料，可以调整稀土或镧系元素络合物寿命例如铕络合物寿命，形成更多微球种群，例如2、3、4、5或多于5个微球种群。 [0059] 为了将荧光团引入微球，采用了借助有机溶剂的溶剂膨胀法(solventswelling)，其允许染料分子渗入微球。当这些微球之后转移到水溶液后，微球收缩，并且供体和受体染料被均匀截留。通过原型时间分辨扫描细胞计数器扫描单个微球，其中将每个微球的615nm(供体铕发射)荧光寿命绘制成直方图，如图2a所示。 [0060] 增加受体浓度导致提高的LRET效率且加速铕供体的衰减速率，这与使用建立的公式LRET一致。这允许编码和解码寿命种群。 [0061] 寿命CV在1.9％至5.7％范围内。形成更多寿命种群的替代方法是通过采用不同稀土络合物，例如不同的铕络合物如新铕络合物BHHBCB、1,2-双 [4'-(l",1",1",2",2",3",3"-七氟-4",6"- 己二 酮-6"-基)苄 基]-4-氯 苯磺 酸(sulfobenzene)，其具有520μs的更长的荧光寿命。 [0062] 用于调整荧光衰减速率的上变频纳米晶体(UPNC) [0063] 精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率的第二种技术、方法或机理基于稀土掺杂的上变频纳米晶体(UPNC)。在本实例中，探针或纳米晶体一般与数千个镱(Yb3+)敏化剂和铒(Er3+)或铥(Tm3+)发射剂共掺杂，这显著增大了可调尺寸在几纳米到几十纳米的每个晶体的整体强度。从敏化剂(Yb3+)到激活剂(Er3+)或(Tm3+)的内部多光子次序能量转移可用于形成单个寿命可调纳米晶体作为构造单元组装到寿命和发射编码探针或微球(也称为超级珠或巨大珠)中。 [0064] 通过在NaYF4纳米晶体中以不同浓度和比例共掺杂Yb和Tm，并使用简单的膨胀法将纳米晶体封装到微球中首次证实了此机理。 [0065] 参见图2b-d，其中示出了(b)可以通过作为构造单元的上变频纳米晶体组装的悬液阵列；(c)通过调整敏化剂-激活剂浓度差的上变频能量转移方法，可以形成多于5种蓝色带Tm微球种群；(d)通过调整上变频纳米晶体的尺寸和相位实现尺寸相关荧光的方法，可以形成绿光带另外4种Er微球种群。每个种群直方图左边的数字为从高斯统计拟合得到的平均寿命±寿命CV。 [0066] 尽管多光子能量转移给敏化剂-激活剂距离和荧光衰减速率之间带来了非线性关系，有趣的是，0.5％-4％的Tm变化(Yb固定在20％)导致在～474nm的从58.3μs到369.6μs的显著大范围的寿命，而Yb的浓度从10％升高到30％(Tm固定为1％)还显著加速蓝色发射衰减从206.7μs变为115.4μs。这些结果是使用时间分辨上变频扫描细胞计数器得到的。 [0067] 这清楚实现了蓝色带另外五个完全分离的寿命通道。所展示的寿命CV动态范围低至从5％到8％。通过Yb或Tm变化的窄CV和持续可调寿命范围可以轻松支持多达七个寿命通道。 [0068] 用于调整荧光衰减速率的上变频纳米晶体(UPNC)的尺寸和相位 [0069] 精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率的第三种技术、方法或机理是基于不同尺寸和相位的上变频纳米晶体的寿命可调特征，如NaYF4：Yb、Er。当Yb和Er掺杂浓度分别固定在20％和2％时，立方相(cubic phase)晶体产生的寿命一般比六角相晶体的短，因为晶体缺陷和内部淬灭水平上升，且较小尺寸的晶体发射寿命较短的荧光，因为其表面-体积比大，导致较高的表面淬灭。 [0070] 在一个具体实例中，通过封装6nm(立方)、15nm(立方)、30nm(六角)和40nm(六角)纳米晶体到微球中，在绿色带产生四个清楚分离的寿命通道，其统计寿命直方图为图2d。例如，通过高级纳米晶体自组装技术制备的微球实现了约200μs的绿光荧光寿命。因此，可以在绿光带产生约五个或更多个寿命通道，例如在约33μs(6nm，立方)到约200μs之间。具有略高光子能量的可替换的不同纳米晶体基质材料如Y2O3纳米晶体可以淬灭荧光衰减速率。 [0071] 现在参考图3，其中示出了实例的每个微球的绘图和载有编码寿命的五种红色种群的时间分辨分离。灰度棒代表寿命值。当混合不同寿命微球种群时，解码系统可以准确将其分成其5个原寿命组。这表明相邻寿命种群之间的无串扰。 [0072] 为了进一步评估时间分辨悬液阵列，将五个家族的铕LRET微球混合到一起，并沉2 淀到载玻片上。使用时间分辨扫描细胞计数器分析样品的15*15mm的区域。快速扫描3分钟后，位于x-y坐标轴上的混合微球的位置如图3a所示，然后，将单个微球的不同寿命解码为灰色强度色调。从寿命直方图(参见图3b)，可以清晰恢复图2b中的相同界限，以将混合样品分成原来的五个子种群(参见图3c)。此方法表明使用悬液阵列的复合分析技术提供了平面阵列复合方法的随机分布固相模拟。此实例示出了使用时间分辨扫描细胞仪进行寿命编码Eu-LRET实例微球复合检测过程的结果。图3a示出了选择的五种Eu-LRET微球混合物的绘图结果实例(在此显微镜载玻片上实例位置)。色调棒代表寿命值。图3b示出了使用寿命种群之间的明确界限，基于寿命种群的分离确定的混合样品中的各个类型的微球。图3c示出了对混合样品的初始绘图结果，混合样品分解为对于每种带有寿命标识的Eu-LRET微球的不同寿命区域的五个平面。 [0073] 在另一个具体实例中，聚合物微球与四种不同浓度的镧系元素探针掺杂：两个为下变频荧光材料：发射红色荧光的Eu螯合物或Eu纳米晶体(615nm)、Tb络合物或Tb纳米晶体，其仅在UV(<400nm)激发时发射荧光，以及两个为上变频荧光材料：发出蓝色荧光的Tm UPNC(475nm)和发出绿光荧光的Er UPNC(545nm)，两者仅通过IR照射发射荧光。另外，其辐射衰减分布为专门设计的，导致对于每个发射波长的不同寿命。 [0074] 参见图1，其示出了时间分辨悬液阵列的实例解码概念。它们为长命荧光微球，设计了不同的荧光寿命，并随机分布在显微镜载玻片上。(a)其通常采用宽场扫描显微镜，例如，申请人悬而未决的且通过参考并入本文的国际申请PCT/AU2103/000559中披露的，通过UV LED脉冲激发和反相中的时间门控荧光检测在无背景条件下描绘这些珠(微球)。指明微载体运输的信号序列轮廓(底部)用于检测每个微球的位置。(b)位置坐标指引在宽场显微视野中心靶珠的正交逐点检验，从而使单个微球的光学寿命编码在脉冲UV(365nm LED)照射下可以在蓝色带(铽发射470-490nm或520-560nm)和红色带(铕发射610-625nm)及在脉冲IR(980nm LD)照射下在蓝色带(铥发射450-490nm)和绿光带(525-545nm)可以同时解码。IR照射下铕和铽发射不可见，而铒和铥在UV照射下发射不可见。这些微球在可见光激发下完全不可见。 [0075] 图4示出了在使用UV脉冲激发束和IR脉冲激发束后，每个编码微球呈现出三维时间分辨光谱(参见图4a)，其可以使用带通滤色器分辨为四个通道。每个通道具有自己的初始强度和衰减寿命作为两个独立的参数(参见图4b)，产生了共计八个维度作为八个数字(参见图4c)。通过控制化学合成条件，这些强度和寿命能够被设计成离散水平，从而使得将唯一编码数字化(参见图4c)。例如，如果对于每个数字可以产生五个不同水平，则8 此时间分辨编码策略提供5种组合，显著超越了目前已知的基于颜色和强度的悬液阵列方法。在另一个实例中，如果对于每个数字可以产生四个不同水平，此时间分辨编码策略提供 8 4种组合。 [0076] 利用各种实例，申请人成功得到了5(Eu：红色)x5(Tm：蓝色)x4(Er：绿光)＝100无串扰寿命通道。在UV激发下存在寿命的至少两个以上寿命光谱带(Tb 545nm；Pt 5 700nm)，其光谱分离自存在的寿命通道。这将用于悬液阵列的实际寿命编码扩展至约5＝3125水平。铽(Tb)荧光可以从铽络合物(如Tb(PTA)3苯)或铽下变频纳米晶体(如GdOHC03:Tb)得到。 [0077] 创建寿命复合通道如使用基于稀土荧光的微球提供了如以下优势。 [0078] 1.寿命解码更不容易因为环境背景和电子噪声而错误解码，因为它基于衰减轮廓而不是绝对强度测量。 [0079] 2.微秒域的超长荧光时间分辨检测可以显著或完全抑制常见络合物生物样品及珠上表面键合报告染料(surface bound reporter dye)的自动荧光背景。 [0080] 3.使用的稀土材料仅在UV(300nm至370nm)和IR(976nm)辐射下发光，因此在通过用于生物分析的可见光激发微球或珠表面时，这些光学编码保持黑暗。 [0082] 另外的实施例 [0083] 以下实施例提供了具体实例实施方式的更详细的讨论。实施例仅为了说明，而不是限制本发明的范围。 [0084] 使用上变频纳米晶体和LRET染料编码的微球的制备 [0085] 微球珠(～15.14μm、2.6x 105)在200μl含有5％氯仿和95％丁醇(vol/vol)的溶剂混合物中膨胀1h。然后，将上变频纳米晶体(25μl、20mg/ml)、2.5μmol Eu(TTFA)3与25μl环己烷中指定摩尔数量的淬灭染料充分混合，随后使用制备的膨胀珠孵育。此孵育过程为24h，其以一个步骤将荧光纳米晶体和染料封装到聚苯乙烯微球中。最后，通过离心分离出编码的珠，使用乙醇:水(vol/vol＝1:1)和无水乙醇洗涤几次，并重新分散在去离子水中。 [0086] 上变频纳米晶体(UPNC)合成 [0087] 使用有机金属法合成NaYF4:Yb,Tm和NaYF4:Yb,Er。简言之，将5mlLnCU(1.0mmol、Ln＝Y、Yb、Tm/Er)的甲醇溶液与6ml OA和15ml ODE一起加入三颈圆底烧瓶中。在氩气流下，在150℃加热得到的混合物30min，形成透明的黄色溶液。冷却到50℃后，在剧烈搅拌下添加含有0.16g NH4F和0.10g NaOH的10mL甲醇溶液持续30min。然后，在真空下，将浆液缓慢加热到110℃持续30min以除去甲醇和少量水。接着，使用氩气氛保护反应混合物，将其快速加热到305℃并维持1.5h。在此过程中，产生大量白烟。冷却该溶液，并通过添加乙醇和离心分离出产品，无需尺寸选择性分馏。得到的NaYF4:Yb,Tm/Er纳米晶体重新分散在环己烷中，浓度为10mg/ml。 [0088] 使用UPNC编码的微球的制备 [0089] 通过以下任何步骤可以实现将纳米晶体并入到用于编码的微球中。 [0090] (i)纳米颗粒可以被捕捉或亲和分配到制备微球的表面或表面下。 [0091] (ii)纳米颗粒可以通过逐层策略结合到相反电荷的微球上。 [0092] (iii)所述纳米颗粒可以在聚苯乙烯微球合成期间通过乳液或悬液聚合加载。 [0093] 使用上述方法制备上变频纳米晶体。简言之，在200μl含有5％氯仿和95％丁醇5 (vol/vol)的溶剂混合物中温和搅拌1h，得到膨胀珠(2.6x 10个珠)。将纳米晶体(50μl、 10mg/ml)与聚苯乙烯珠分散物混合和孵育。并入过程在室温下通过疏水-疏水相互作用持续约12h。最后，通过离心收集标记的珠，使用乙醇洗涤三次，并重新分散在去离子水中。 [0094] 微球的寿命测量及不同颜色通道之间的串扰 [0095] 图5a示出了Eu(TTFA)3螯合物、NaYF4:Yb,Er上变频纳米晶体和NaYF4:Yb,Tm上变频纳米晶体的光谱。Eu螯合物通过365nm UV-LED激发，而其不能激发Er/Tm纳米晶体照亮。同样的，980nm IR激光下的上变频过程只在Er/Tm纳米晶体中发生。施加激发波长的依次操作，以确保Eu通道和上变频通道之间没有相互干扰。 [0096] Tm掺杂的发蓝光纳米晶体和Er掺杂的发绿光纳米晶体都吸收980nm光子。因此，需要考虑此因素，避免用其他荧光探针常出现的严重光谱重叠的问题。为了将Tm纳米晶体的蓝色上变频荧光与Er纳米晶体的绿光上变频荧光分开，插入单个带通滤色器以选择光谱限制(spectral-confined)发射。 [0097] 从图5b可以看出，当纳米晶体具有类似的强度时，一种纳米晶体到另一种纳米晶体的检测带的泄漏仅为约0.1％。即便一个强度比另一个亮10倍，泄漏仍保持在大约1％，虽然发射光谱的拖尾明显对另一个的检测带有贡献。为了确保寿命通道中无串扰，可选地不允许强度水平的差异大于10倍，因为这种干扰无法在之后的寿命计算中消除。这通过控制向初始微乳液悬浮(micro-emulsion suspension)中添加的纳米晶体的量实现。例如，如果发现一批微球的蓝光发射比绿光发射强10倍以上，则此批将废弃，使用较少Tm纳米晶体或较多Er纳米晶体的批次。 [0098] 进行实验验证以调查由光谱重叠引起的串扰(即寿命是否受到影响)。使用的Er纳米晶体和Tm纳米晶体专门选择为具有基本不同寿命的，从而可以确定少量串扰。还并入了Eu络合物，借助使用的适度的寿命种群，以测试UV和IR次序激发下的无串扰假定。嵌入了三种探针。 [0099] 在LRET溶液中，使用含有0.25μmol/ml淬灭剂的Eu络合物并入了一组微球，Tm纳米晶体中Yb:Tm共掺杂浓度为20:0.5，且Er纳米晶体的直径为30nm。扫描载玻片样品，发现142个微球，并测量红光、蓝光和绿光通道的寿命。直方图结果在图5c上面示出。为了比较，将并入一种探针的微球的寿命分布绘制在图5c下面，结果表明探针混合物并未诱发寿命测量的任何串扰。 [0100] 时间分辨扫描细胞计数 [0101] 为了检测和确定六数字复合探针或微球，开发了基于Olympus 1X71倒置显微镜框架的原型时间分辨扫描细胞计数器。该细胞计数器包括两个一起操作的子系统：扫描子系统和检测子系统。在扫描子系统中，一个电控载物台(motorized stage)(例如Prior Scientific生产的HI01A型)以迂回扫描模式移动含有待测样品的固体衬底如显微镜载玻片。因为移动是预定的且很好校准，在扫描期间，电控载物台可以提供样品在每个时间点的精确位置。检测子系统具有与常用荧光显微镜结构的物理相似性，但是操作时间次序不同。激发源和检测器(例如Hamamatsu生产的型号HI0304-20)不是同时开关，而是在反相中电子调制，称为时间门控发光(TGL)模式。检测子系统只能发现发射长寿命荧光的靶标，使任何自发荧光及时衰减和散射，以使检测器看不到。考虑到本实例实施方式中使用的镧系元素探针，选择(例如，UV LED的FF511-Di01，传输频带525～800nm；IR激光的FF750-SDi02，传输频带450～730nm；均为Semrock生产)的365nm UV LED(例如，Nichia生产的型号NCCU033A，在500mA持续注入电流下为250mW)和980nm IR激光作为激发源，连接至在显微镜双色向轮中的各个双色相滤波器。三个带通滤波器被放在滤波器轮上，然后检测器匹配不同的发射峰(Eu螯合物为FF01-607/36，中心波长为607nm，半高度的全宽(FWHM)为42.5nm；Tm UPNCs的FF02-475/50，中心波长475nm、FWHM 55.7nm；Er UPNCs的FF01-540/50，中心波长540nm、FWHM 55.6nm；均为Semrock生产)。两个子系统通过多功能数据采集卡(例如，National Instruments生产的型号PXIe-6358)同步，并使用定制Labview程序控制。 [0102] 在显微镜载玻片样品上，含有微球的所有点均在较高的准确度下定位，因为它们的时间分辨荧光与背景形成鲜明对比。然后，依次找回每种点，以测量其衰减轮廓，从而计算强度和寿命。因此，每个微球的编码显示出其进行的分析类型，例如生物分析类型，且可以以传统方式确定结果，例如免疫荧光测定。 [0103] Eu-LRET微球和载玻片样品的制备 [0104] 使用固定2.5μmol Eu(TTFA)3络合物与在单独体积的200μl二氯甲烷(DCM)中0.1～1.2μmol之间变化摩尔量的六氟磷酸盐制备一系列溶液。通过向聚苯乙烯珠悬液 5 (直径15.14μm，Bangs Laboratories，美国；900μl乙醇中的2.6x 10个珠，使用前进行超声处理)中滴加控制量的供体和受体混合物进行荧光染料至微球的封装。将含染料的聚苯乙烯珠搅拌48小时，然后膨胀的珠在无水乙醇溶剂中收缩。然后，通过离心快速分离浸渍的珠，并使用乙醇:水(vol/vol 1:1)洗涤三次，并储存在500μl去离子水中。为了制备试样，特定量的微球(通常含有300～500个珠)滴涂到载玻片表面上。在40℃下孵育 4小时，让溶剂完全蒸发，使用玻璃盖玻片密封样品以用于扫描细胞分析。 [0105] 复合DNA检测应用 [0106] 从NCBI数据库确定了四种病原体–人体免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒(EV)、乙型肝炎病毒(HBV)和人乳头瘤病毒16(HPV-16)-的靶DNA序列。氨基改性捕获DNA低聚物和5'-生物素结合的靶DNA低聚物是从Integreated DNA Technologies采购的。每个50μL如此制备的Eu-LRET寿命编码微球分别用于结合每种捕获探针，并通过l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC，购自Sigma Aldrich)激活2小时。通过离心收获功能化微球，然后混合形成测试板。然后，将含有5nmol每种病原体DNA低聚物的试样添加到测试板上，并将2×盐水-柠檬酸钠(SSC，购自Invitrogen)缓冲液作为杂交缓冲液。孵育1小时后，洗涤微球，并将其重新悬浮到含有50μg/ml抗生蛋白链菌素结合的太平洋橙色(Invitrogen)的100μl溶液中，然后继续孵育另外1小时。最后，纯化微球悬液，并将其制备到载玻片上以用于通过时间分辨扫描细胞仪分析。 [0107] 通过荧光共振能量转移(LRET)机理制备用于校准时间分辨扫描细胞仪系统的实例寿命可调荧光微球。基于简单的溶剂膨胀法，将三价铕络合物Eu(TTFA)3和香豆素六氟磷酸盐封装到多孔聚苯乙烯珠作为供体和受体染料。通过近距离二极耦合，一部分激发的3+ Eu 络合物以非辐射方式将其能量转移给受体染料。这导致在约612nm的红光发射谱带的 3+ Eu 络合物的荧光寿命缩短。通过改变浓度梯度，可以控制供体与受体平均距离，从而还能够微调整相应步骤中微球的寿命。 [0108] 图6a表明，随着受体浓度增加(在相同的供体浓度下)，通过时间分辨扫描细胞仪系统/方法测量每个微球的供体寿命从359μs有效下降到188μs。每个寿命种群具有在1.9％至5.7％范围内的变化系数(CV)，从而使控制良好的寿命性质用作时域光学标识。在如此制备的Eu-LRET微球中，仅根据寿命(平均值±CV：359.4μs±2.9％、314.7μs±1.9％、275.5μs±2.6％、236.7μs±2.6％和188.3μs±5.7％)可以完全分离五个种群(受体浓度为0、0.1、0.25、0.4和1.2μmol/ml)，如图6b所示。 [0109] 应当注意的是，用于产生Eu-LRET微球的LRET机理不一定保持荧光衰减为单指数的，这可以从图6a记录的衰减曲线中看出。然而，设计和测量寿命的目的是使用寿命参数作为复合生物检测的可区分标识。重要的要求是可靠性和速度，以保证寿命编码的准确度和通量。因此，在本实例中，用单指数模型拟合曲线，并且计算的寿命实际上为体现所有寿命组分加权平均值的表观寿命。 [0110] 将选择的五种实例微球混合到一起，以进一步评估寿命复合检测的准确性。将混2 合样品固定在15x 15mm的载玻片区域，然后通过时间分辨扫描细胞仪分析。扫描3分钟后，定位这些微球的X-Y位置，然后给单个微球的变化寿命解码。因此，时间分辨扫描细胞仪区分每种微球(从而分类为R-359、R-315、R-276、R-237和R-188；"R"代表红色，数字为寿命值)，其可以用于探测不同生物分子(参见图7)。 [0111] 作为生物应用的实例说明，寿命复合技术还用于同时检测不同病原体DNA(HIV、EV、HBV和HPV-16)。分别将四种实例微球(R-315、R-276、R-237和R-188)结合到互补DNA链，其充当每种靶探针的捕获探针。将其他类型的微球(R-359)结合到参照DNA探针上，以证实复合检测的特异性。混合靶病原体DNA作为试样，并将其添加到由五种微球组成的测试板上，然后添加太平洋橙色作为通用报告基因染料(参见图7a)。 [0112] 将得到的悬液涂布在载玻片上，并使用时间分辨复合系统/方法分析，其通过检3+ 测Eu 络合物的时间门控荧光发现载玻片上的所有微球，并通过解码寿命确定其捕获探针(参见图7b)，以及通过检查报告基因荧光测量相应靶探针的数量(参见图7c)。结果示出了寿命编码微球可以通过利用夹心珠分析的标准形式在单个测试中成功识别了多种病原 3+ 体DNA。特别是，需要重点注意的是，尽管通过用于Eu 络合物的相同光源激发报告基因染料，但其荧光不妨碍编码荧光寿命，因为其时域完全分开，而基于颜色和强度的传统复合技术通常遇到严重的串扰问题。 [0113] 时间分辨扫描细胞仪系统有能力将荧光寿命分辨为对于每个靶的独立光学标识，例如通过不同微球与荧光共振能量转移设计的它们的寿命检测的多DNA链。这些结果为将高度敏感荧光探针如镧系元素络合物和纳米晶体用于基于寿命生物感应和生物成像以及其他应用例如防伪或防伪油墨提供了新机遇，包括通过时间分辨细胞仪的高通量复合筛选，以及通过荧光寿命成像显微术(FLIM)的局部动态分析。 [0114] 提供微秒时域编码的可调"τ点"–其他应用 [0115] 光学复合广泛影响从光学数据存储和文件防伪到分子探针及珠分析到个体化用药的多个领域。如前面讨论的，传统的荧光颜色编码受到光谱重叠和背景干扰的限制，限制了可区分标识的数量。申请人已经意识到，可以利用新荧光寿命维度(τ)给每种上变频纳米晶体编码。在单色带中，可以形成多于10种具有不同寿命(25.6μs至662.4μs)的纳米晶体种群，并给其无串扰寿命标识解码，这实质上或完全与其颜色或强度无关。所述"τ点"(即荧光寿命探针)可简单用于如多通道生物成像、高密度数据存储及与伪造抗争的防伪应用。 [0116] 在一个实例中，复合方法/系统操控上变频纳米晶体的荧光衰减寿命，这允许产生复合可用的全新的时域维度。寿命复合分析法具有显著的优势，例如：i)寿命更不容易出现通过光学失焦、环境背景和电子噪声诱导的解码错误，这是因为它们的读数是基于衰减轮廓而不是绝对强度测量结果；ii)微秒域中的超长荧光时间分辨检测能够显著或完全抑制来自常用络合物生物样品或嵌入基质的所有荧光背景；iii)采用的稀土掺杂的上变频材料只需要二极管激发，使得解码仪器可以是非常简单，本发明的解码仪器由一个激光二极管和一个单光检测器组成。 [0117] 通过以级变(stepwise varied)浓度将敏化剂Yb3+离子和发蓝光的Tm3+离子共掺杂到NaYF4纳米晶体中已经实施了基于寿命可调性的实例复合分析方法、系统、阵列和靶颗粒。在这种情况下，在不同的敏化剂-发射剂距离下从敏化剂到发射剂离子的能量转移提供寿命可调性(参见图8)。通过使用此方法，可以在48μs(4mol％Tm)至668μs(0.2mol％Tm)之间调整寿命。利用时间分辨检测中纳米晶体的光稳定性和无背景扫描，对于475nm处单纳米晶体发射的寿命测量，时间分辨共聚焦扫描系统实现了足够高的信号-背景比率2 (大于10)。图8示出了使用假彩色(pseudocolour)/色度(scale)描绘每个像素的荧光寿命得到的五个典型的寿命编码铥掺杂的τ点组的共聚焦图像。 [0118] τ点发射微秒范围内的荧光，该范围是背景自发荧光(小于10纳秒)的约三个数量级长，该范围的荧光可以通过时间分辨测量简单抑制。这可用于为单个细胞的快速检测提供无背景读数。 [0120] 图9示出了分别使用寿命为约160μs的1mol％Tmτ点和寿命为约40μs的4mol％Tmτ点标记的并使用时间分辨扫描细胞仪系统快速扫描的贾第鞭毛虫囊的两个种群的简单示范。寿命参数产生窄种群分布(变化系数<10％)，与现在面临颜色过多和强度波动问题的传统高通量细胞仪系统相比，提供优质的检测准确度和系统简化。此结果示出了基于寿命编码而无需颜色/强度补偿要求的“数字细胞计数法”的可行性。持续几小时照明记录的τ点染色贾第鞭毛虫图像表明无可观测的光漂白效应(图9c)，这表明这些寿命编码纳米晶体为用于生物成像的可靠标记材料。 [0121] 将纳米晶体涂覆薄二氧化硅层。然后，将改性的纳米晶体(1mg/ml)用通用抗体接头在缓冲液中功能化。这种独特的接头一端能够与二氧化硅相互作用，以固定到二氧化硅表面，而另一端与任何抗体分子结合。将贾地鞭毛虫抗体(G203，0.44mg/ml、囊壁特异的，BTF Pty Ltd.，澳大利亚悉尼)用于与上述功能化纳米晶体孵育20min，然后慢速离心，以除去聚集物。将得到的含有抗体的纳米晶体分散到200μl缓冲溶液中，然后与5μl贾地5 鞭毛虫制剂(1.8ml中有10个细胞、直径为6-9μm、BTF Pty Ltd.)在摇晃下混合20min。 最后，在使用缓冲液洗涤三次后，将标记的细胞置于载玻片上，并使用盖玻片密封用于扫描细胞计数分析。 [0122] τ点还几乎除去了已知悬浮阵列中的复合限制，如目前微球组装仅限于100种颜色和强度编码通道(两个颜色发射谱带的10个强度水平)。图10示出了通过将上述制备的纳米晶体吸附到多孔聚苯乙烯微球壳上产生的新寿命编码微球矩阵(图1010a)。在使用时间分辨扫描细胞仪系统快速扫描期间已经记录了每种微球的寿命和强度。如图10b所示，发射剂(Tm)在0.2mol％-8mol％的范围内变化(而敏化剂Yb固定为20mol％)，从而导致蓝色带显著大范围的寿命，范围为25.6μs到662.4μs。将Yb的浓度从10mol％升高到30mol％(Tm固定为1mol％)也显著加速了蓝色发射衰减，从206.7μs下降到120.2μs。 这表明较高浓度的发射剂和/或敏化剂导致敏化剂和发射剂之间较小的平均距离以及提高的能量转移速率。 [0123] 对于时间分辨共聚焦扫描显微镜，使用了光纤共聚焦显微镜，该显微镜使用单模光纤980nm激光源(LE-LS-980-300-FCS、LEO Technology Ltd.、中国深圳)和油浸物镜(100X、NA＝1.4、Olympμs)以将激发荧光聚焦到样品载玻片上。来自样品的荧光信号由相同物镜收集，并通过二色镜(ZT765dcspxrxt、Chroma)与激发光路分开。它进而经过带通滤波器(FF02-475/50、Semrock)，然后结合到与光计数雪崩光电二极管(SPCM-AQRH-13-FC、PerkinElmer)连接的多模光纤(M24L01、Thorlabs)。为了得到共聚焦图像，使用压电扫描平台(Nanomax-TS、Thorlabs)移动试样，并记录每个像素的以光计数描绘的脉冲激发后的荧光衰减曲线。扫描和数据收集使用多功能数据采集设备(USB-6353、National Instruments)进行。使用基于连续集成方法(successive integration method)和线性回归的快速拟合算法实现实时提取寿命参数的高可靠性，而不是采用常用的非线性算法如最大可能性拟合。 [0124] 还发现，立体相晶体产生的寿命一般比六角相的短，这是由于晶体缺陷和内部淬灭水平增加造成的。通过使用此方法，可以将lTm/20Yb(mol％/mol％)纳米晶体的寿命从155.1μs(六角相)调整到104.1μs(立方相)。有趣的是，对于这些种群中的每个，尽管强度变化为两个数量级(图10c)，但其寿命变化系数(CV)可以低至1.5％(大部分种群至多为约3.9％，除了寿命最短的两个，其CV因为平均值小略高)。这些结果表明寿命编码完全独立于强度，从而无补偿，这进一步表现出与已知光谱域细胞计数方法相比的绝对优势。窄CV可用于实现蓝色中至少八个完全独立的寿命通道，且有足够的能得到蓝色中十个或更多通道(注意，最后三个种群之间的间隙较大)。 [0125] 专门设计的带有可区分寿命编码的复合τ点还可用于高容量数据存储和数据安全的光子学领域，优于现在使用的其他波长和极性光学维度及空间维度。 [0126] 图11示出了涵盖用Tm:Yb比为0.5:20、1:20和4:20(mol％:mol％)的τ点打印的三个重叠图片的混合图片。 [0127] 尽管正常的荧光颜色成像无法确定混合图片中隐藏了什么(图11a)，使用时间分辨扫描细胞仪可以清晰地将混合图像解码成三张单独的图片/图像，因为它们表现出不同的寿命：48μs、155μs和450μs(图1lb)。在一个实例中，这表明使用τ点的新型文件编码术作为防伪油墨的应用，从而使只有知道荧光寿命正确解码规则的授权人员才能从一组信息或数据或复合图像中得到或找回真正的信息或数据、个别信息或数据或组成信息或数据。 [0128] 对于防伪油墨，分别将处于四氢呋喃(1mg/ml)中的低(0.5mol％)、中(1mol％)和高(4mol％)Tm掺杂浓度(Yb浓度固定为20mol％)掺杂的上变频纳米晶体注入商用墨盒中，以使用商业喷墨打印机将麦考瑞标志、悉尼歌剧院和悉尼港口大桥的重叠图像(尺寸：40mm x 20mm)打印到一张普通纸上。打印后，将纸样放在载玻片上并盖上盖玻片进行保护，然后使用时间分辨扫描细胞仪系统扫描图像。 [0129] 在另一个实例中，规则的将该材料布置到次微米级单元，为使用寿命作为数字的高密度数据存储提供了新方案。特别是，一种寿命组分的存在/不存在可用作一个二元数字，从而对于每个单元通过简单使用三种寿命编码纳米晶体可以实现8位容量。在这两个实例中，方法、设备或系统的显著优点是解码系统的复杂性并未增加，因为无需额外光源、滤波器或检测器。 [0130] 因此，本发明提供了一种用于复合的新时域方法。展示了具有独立于颜色和强度的单独的寿命标识的新系列纳米或微米标记、球、颗粒和/或载体。这些在无可观察到的串扰下被解码。从而能够开发纳米/微米探针的文库/数据库，例如载有大于10,000个可区分编码(通过颜色、强度和寿命组合)，其大大增加了荧光成像或扫描作为强大的分析技术的潜能，以能够应对各种应用如生命科学、药品、高密度数据存储和防伪造或认证防伪中的复杂难题。 [0131] 本发明的可选实施方式还可以描述为基于本发明提及或指明任何或所有部分、要素和特征，两种或更多种部分、要素和特征的任何或所有组合，且其中本发明提及的特定统一体指的是在本发明有关技术中已经已知的等效物，该已知等效发明视为是本发明的一部分，就像单独在本发明中规定一样。 |
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