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휴대용 핵산 분석 시스템 및 고성능 미세유체 전기활성 중합체 작동기 {PORTABLE NUCLEIC ACID ANALYSIS SYSTEM AND HIGH-PERFORMANCE MICROFLUIDIC ELECTROACTIVE POLYMER ACTUATORS}
본 출원은 2014년 11월 18일 출원된 시리얼 번호 62/081,525, 2014년 8월 25일 출원된 62/041,430, 및 2014년 4월 14일 출원된 시리얼 번호 61/979,377를 우선권 주장한다. 본 발명은 계약 번호 HR0011-14-C-0082하에 미국 국방성 고등 연구 계획국(Defense Advanced Research Projects Agency)하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
사용이 용이한 시스템에서의 샘플 제조와 증폭 및 검출의 통합은 핵산 진단에 있어 중요한 도전 과제를 남긴다. [1] 세페이드즈(Cepheid's) 진X퍼트(GeneXpert) 플랫폼, 나노스피어즈 베리진(Nanosphere's Verigene) 플랫폼, 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company)로부터의 BD 맥스 시스템(BD Max System), 및 리아트스(Liat's) "랩-인-어-튜브(lab-in-a-tube)" 일회용 장치를 비롯한 다수의 시스템이 가까운 POC 적용에서의 사용을 위한 "적당한 복잡성(moderate complexity)" 장치로서 FDA 승인을 받았다. [2] 연구 문헌에서 많은 병원체 검출 기술 및 장치를 살펴볼 수는 있지만; 어느 누구도 원료 생물학적 샘플을 수용하도록 구성된, 다중 자동식 통합형 "샘플-투-리절트(sample to result)" 시스템을 개발하지는 못했다. [3] 조기의 한 예에서는 전혈로부터 추출되고, 증폭된 병원체 DNA의 존재를 검출하기 위하여 전기영동 분리 및 레이저 유도성 형광을 사용하였다 [4]. 수(Xu) 등 [5]은 증폭 동안 100개의 카피수/㎕ 정도로 적은 카피수를 검출하는 데 실시간 형광 판독을 사용하였다. 퍼거슨(Ferguson) 등 [6]은 전기촉매성 완충제의 존재하에 나노구조형 전극 상에서 PNA 프로브에 하이브리드화된 바이러스성 RNA를 전기화학적으로 검출한 반면, 램(Lam) 등 [7]은 금 전극 상에 증착된 산화환원 표지된 분자 프로브에의 증폭된 ssDNA의 하이브리드화를 검출하였다. 퍼거슨 [6]은, 임상 역가 값보다 10 4 배(4 orders of magnitude) 더 적은 값인 10 TCID50 (조직 배양 감염량)에 등가인 LOD를 입증하였다. 램 [7]은 비록 스파이킹된 뇨 샘플 분석 수행시 100 CFU/㎕ 농도를 사용하였음에도, 1개의 박테리아/㎕인 LOD를 입증하였다. 상기 두 군은 그의 핵산 검출을 위한 기초로서 측면-유동 샌드위치 검정법을 사용하였고 [8, 9], 프라운호퍼 인스티튜츠 ivD-플랫폼(Fraunhofer Institutes ivD-Platform) [10]은 모듈식 플랫폼을 사용하였다. 수십년 동안 미국 국방성(Department of Defense: DoD)은 현장-휴대용 생물학적 분석의 필요성을 인식해 왔다. 초기에 상기 필요성은 생물학적 위협을 확인하기 위한 것이었지만; 개인 맞춤형 의약이 출현함에 따라, DoD는 환경 모니터링 이외에도 통상의 건강 상태 모니터링의 가치 및 현장 현시 (POC) 진단의 이용가능성 또한 인식하였다. 사실상, DARPA는 신속한 중재가 가능하도록 생물학적 시스템을 모니터링하는 것을 목적으로 하는 많은 프로그램을 가지고 있다. 그러나, 수십년간의 투자에도 불구하고, 필요 시점에 핵산 프로세싱을 수행하는 데 이용가능한 상업적 장치는 없다. 이러한 결함을 충족시켜 주기 위해, SRI는 "샘플-인 투 앤설-아웃(sample-in to answer-out)" 분석을 수행하는 휴대용 통합형의 신속한 재구성이 가능한 자동식 바이오검출 시스템을 개발하였고, 본 발명자들은 여기서 상기 시스템을 개시한다.
본 발명은 다중 서열 증폭 및 동시 하이브리드화 판독을 통하여 한 세트의 상이한 핵산 서열의 병렬 검출을 위한 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 미세유체 연결부에, 다중 서열 증폭 및 동시 마이크로어레이 하이브리드화 판독을 통해 상이한 핵산 서열을 병렬로 검출하도록 구성된 샘플 용해, 정제, PCR 및 검출 모듈을 포함하는 자동식 핵산 분석 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 검출 모듈은 소산파 여기(evanescent wave excitation)를 이용하는 마이크로어레이 스캐너를 포함하는 마이크로어레이 검출용 광학 장치를 포함하고/거나; 검출 모듈은 온도를 통해 다중 엄격도를 제공하도록 구성된 자동식 하이브리드화 프로세서를 포함하고/거나; PCR 모듈은 단일 반응으로 역전사 및 PCR을 수행하도록 구성되어 있는 것인, 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 상기 모듈을 포함하는 통합형 미세유체 카드, 및 상기 카드를 수용하도록 구성된 용기, 유체 작동기를 포함하는, 상기 카드를 작동시키도록 구성된 오퍼레이터, 및 상기 오퍼레이터를 전자적으로 제어하도록 구성된 제어 장치를 포함하는 분석기, PCR 써모사이클러, 및 자동식 하이브리드화 프로세서 및 마이크로어레이 검출용 광학 장치를 포함하는 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 시약을 함유하고, 그를 용해, 정제, PCR 및 검출 모듈로 전달하도록 구성된 시약 모듈을 추가로 포함하는 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 1,000 in 3 미만이고, 10 lbs미만으로 휴대용이고/거나; 분석 소요 시간이 120분 미만으로 신속하고/거나; 50개 초과의 표적 서열을 동시에 분석하는 다중성이고/거나; 샘플 도입과 결과 표시 사이에 사용자가 개입할 필요가 없는 자동식인, 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 샘플이 단백질 분석물을 포함하고, 시스템이 핵산 서열을 포함하는 태그로 단백질 분석물을 태그부착하도록 추가로 구성되어 있고/거나; 고정된 프로브가 서열을 그의 공간적 위치에 의해 정의하고/거나; 증폭이 분석되는 서열의 개수보다 더 적은 개수의 프라이머 쌍에 의해 수행되고/거나; 상이한 핵산 서열이 다중 종/유기체의 것이고/거나; PCR 모듈이 금속 (예컨대, 알루미늄) PCR 반응 챔버를 포함하고/거나; 미세유체 연결부가 기포 제거를 위해 구성된 통기성 막을 포함하고, 여기서, 통기성 막은 채널 층 아래에 위치하며, 이로써, 전체 채널이 대기압에 노출될 수 있고/거나 (특정 실시양태에서, 상기 막은 비록 그가 오직 채널 층 아래에서만 기능을 하기는 하지만, 개별 조각보다는 층으로서 제조가 더 용이하기 때문에, 카드에 걸쳐 있다); 증폭은 (개방형 튜브 등이 아닌) 소모재에 완전히 포함되어 있고/거나; 검출은 프라이머 세트보다는 (새로운 시험 구축이 더욱 용이한) 프로브 세트에 기반하는 것인, 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 (샘플 분할 없이) 단일 베쓸에서 증폭시키도록; 혈액, 타액, GI 샘플, 뇨, 상처 면봉 채취물, 요추 천자, 비강 면봉 채취물, 수의학적 공급원 및 농업상 공급원의 분석물 샘플을 수용하고, 프로세싱하도록; 표본 수집 도구 또는 수송 매질을 통해 샘플을 수용하도록; 1-100 ul의 샘플 부피를 프로세싱하도록; 모듈식이도록 (모듈은 상이한 적용을 지원하도록 교환될 수 있다); (채널 크기 및 기포 제거에 의해 수행되는) 계량이 가능하도록; 및/또는 한 방향이고, 자기 밀봉식이 되도록 (샘플 상호 오염을 막도록) 구성된 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 모듈을 포함하는 통합형 미세유체 카드, 및 하우징 (박스) 및 하우징 내에 상기 카드를 수용하도록 구성된 용기를 포함하는 분석기를 포함하는 시스템으로서, 여기서, 분석기는 카드와 체결하여 용해, 정제, PCT (증폭 및 표지), 및 검출을 수행하고/거나; 압력 (예컨대, 샘플 수송), 자기장 (예컨대, 샘플 혼합), 온도 (예컨대, 증폭, 엄격도, 하이브리드화) 및/또는 빛 (예컨대, 하이브리드화 검출)을 통해 샘플과 상호작용하고/거나; 소산파를 샘플과 커플링하여 실시간으로 하이브리드화를 관찰하고/거나, 동역학적 성질 및 가능한 염기쌍 미스매치를 측정하여 서열 정보를 생성함으로써 검출을 수행하는 것인, 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 모듈을 포함하는 통합형 미세유체 카드 (카트리지)를 포함하는 시스템으로서, 여기서, 카드는 질병 유형 (예컨대, 호흡기 질환)에 특이적이도록; 환자 유형 (예컨대, 소아 환자)에 특이적이도록; 병원체 유형 (예컨대, 생물전쟁 작용제)에 특이적이도록; 개체 (예컨대, 약리유전체학)에 특이적이도록; 환자 특이 정보에 대한 독특한 식별자를 포함하도록; 1회 사용 동안 멸균성을 유지하고, 상호 오염을 최소화하도록; 롤-투-롤(roll-to-roll) 제조 단계를 사용하여 생산되도록 구성되어 있고/거나; 폴리카르보네이트 섀시, 금속 호일 PCR 챔버, 아크릴계 성분, 통기성 막 물질, 및/또는 폴리우레탄 시일로부터의 것인, 시스템을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 입자 또는 세포 정렬을 위해 유체역학적 및/또는 관성 집속을 제공하도록 구성되어 있고, 분류를 위해 구성된 미세규모 전기활성 중합체 (EAP) 작동기를 포함하는 미세유체 입자 분류기, 예컨대, 형광 활성 세포 분류기 (FACS)와 기능적으로 통합된 시스템을 제공한다. EAP μ-분류기는 iMFC 시스템의 입자-농축/분류 모듈과 기능적으로 통합될 수 있거나, 또는 그러한 모듈로서 도입될 수 있고, 큰 부피에서 묽은 입자 농도를 농축시킴으로써 (예컨대, 환경 샘플 중에 1 ml당 수개의 세포로 존재하는 박테리아), 또는 다수의 세포 배경으로부터 최상의 세포를 분류함으로써 (예컨대, 말초 혈액 단핵구 세포 집단으로부터 활성화된 T 세포) 시스템이 작동 범위를 증가시킬 수 있도록 구성될 수 있다. 추가로, 미세규모 전기활성 중합체 작동기는 세포 포획, 유체 혼합 및 펌핑을 비롯한, 분류 이외의 대안적 적용에 적합하고, 따라서, 대상 자동식 핵산 분석 시스템과 독립적으로 제공, 구성 및/또는 작동될 수 있다. 본 발명은 또한 개시된 시스템을 사용하여 다중 서열 증폭 및 동시 마이크로어레이 하이브리드화 판독을 통해 상이한 분석물 핵산 서열을 병렬로 검출하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 작동기에 인가된 전압 펄스가, 작동기가, 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하고, 여기서, 작동기는 내장 유체 챔버를 포함하고, 여기서, 챔버의 하나 이상의 표면 (예컨대, 벽, 바닥, 천장)은 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하는 것인, 유동 채널 주변에 구성된 고성능 미세유체 전기활성 중합체 (μEAP) 작동기를 제공한다. 단일 uEAP 작동기는 작동기에 의해 구동되는 유체 제트를 수용하는 순응형 챔버 (즉, "벨로우즈")와 쌍을 형성할 수 있다. 이러한 구성은 오직 하나의 능동 작동기만을 필요로 하지만, 여전히 교차 유동이 발생될 수 있도록 허용한다. 순응형 챔버는 단지 전기 연결부가 없는 작동기 중 하나일 수 있거나, 또는 본 발명자들이 다채널/단계 분류기용으로 사용하는 것과 같은, 상이한 기하학적 구조를 가진 챔버일 수 있다. 주로 고체 전극 (예컨대, 유리 슬라이드 상의 인듐 주석 산화물 (ITO) 전극)으로 예시되지만, 전극은 또한 또는 대안적으로는 유체, 예컨대, 전도성 유체를 인접 채널에 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 유동 채널 주변 및 서로 다른 위상에 구성되어 있는 복수 개의 상기 작동기로서, 여기서, 작동기에 인가된 전압 펄스는, 작동기가, 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하고, 여기서, 각 작동기는 내장 유체 챔버를 포함하고, 여기서, 챔버의 표면은 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하는 것인, 복수 개의 상기 작동기를 제공한다. 또 다른 측면에서, 복수 개는 서로 180° 다른 위상에 구성되어 있는 한 쌍의 상기 작동기이다. 실시양태에서: - 챔버(들)의 복수 개의 표면은 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하고/거나; - 유동 채널은 입자의 수평 정렬을 위한 유체역학적 집속, 및 입자의 수직 정렬을 위한 관성 집속의 조합을 제공하도록 구성되어 있고/거나; 새로운 패스라인은 분류 배출구로 이어지고/거나; 유동 채널은 샘플 유입 채널, 및 분류된 및 비분류된 배출 채널을 포함하고, 새로운 패스라인은 분류된 배출 채널로 이어지고/거나; 유동 채널은 형광 검출을 위해 구성되고, 여기서, 표적화된 입자의 검출시, 전압 펄스는 μEAP 작동기에 인가되고/거나; - EAP 층은 1-50 (또는 2-25, 또는 5-15 ㎛ 두께)이고/거나; 탄성체는 실리콘이고/거나; - 작동기(들)는 다채널 장치에서 병렬 분류를 제공하도록 구성되어 있고/거나; - 작동기(들)는 다단계 연속 분류를 다중 배출구로 제공하도록 구성되어 있고/거나; - 작동기(들)는 형광 활성 입자 분류기에 기능적으로 통합되어 있다. 본 발명은 또한 예컨대, 전압 펄스를 인가하여 작동기(들)가 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하는 단계를 포함하는, 작동기를 제조하고, 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 마치 각각의 조합을 힘들여 개별적으로 기술된 것과 같이, 언급된 실시양태의 모든 조합을 구체적으로 제공한다.
도 1: 분자 진단 시스템의 물리적 구성.
도 2a 및 2b: iMGC 카드.
도 2c: 비강 면봉 채취물에 대한 유입 모듈.
도 2d: 한 TEC의 배열이다.
도 2e: PCR 및 검출 프로세싱 블록 주변의 iMFC 카드의 섹션.
도 2f: 검출 웰, 격자 및 크롬을 포함하는 유리 기판.
도 2g: 빛이 유리 기판으로 커플링되는 방식을 보여주는 유리 기판의 측면도.
도 2h: 빛이 유리 기판 내에서 전반사를 통해 이동하는 방식을 보여주는 유리 기판의 측면도.
도 2i: 마이크로어레이와 관련하여 TEC 및 카메라 시스템의 배열.
도 3: 핵산을 실리카 프릿에 결합시키는 기법.
도 4: 통기성 막을 이용한 부피 제어.
도 5a 및 5b: 유동을 제어하기 위한 밸브 제어 기법.
도 6: iMFC 카드의 투영도.
도 7: 공압 시스템.
도 8: 장치(10)의 물리적 하드웨어의 기능 블록 다이어그램.
도 9: μEAP FACS의 채널 레이아웃을 보여주는 EAP 미세분류기 개략도.
도 10: 7 ㎛ 녹색 형광 입자의 스트리크(streak) 영상.
도 11: 피코에리트린 표지된 B 세포의 분류.
도 12: 다중 분류기의 이중-채널 장치로의 통합.
도 13: 다중 분류기의 단계식 분류 장치로의 통합.
본 발명자들의 발명은, 인간의 개입은 오직 샘플을 유입하고, 결과 판독시에만 요구되는, 인간의 개입 없이 결과를 얻을 수 있는 저가 휴대용 분자 진단 시스템을 제공한다. 또한 상기 기술된 다양한 기술에 기인하여 결과를 매우 신속하게 얻을 수 있다. 시스템은 iMFC로 불리는 일회용 부재와 접속시키는 방법을 포함한다. 본 방법 및 본 시스템을 통하여 기본 하드웨어를 변형시키지 않고 상이한 유형의 시험을 쉽게 실행할 수 있도록 iMFC를 구성할 수 있다. 마지막으로, 카드 그 자체는 상이한 유형의 시험을 실행하는 데 쉽게 변경될 수 있는, 모듈식이다. 한 측면에서, 본 발명은 유입물로서 샘플을 취하고, 분자 진단 단계를 수행하고, 진단 시험의 결과를 표시할 수 있는 자급식 시스템을 제공한다. 전형적으로, 단계는 (i) 예컨대, 혈액, 조직, 뇨, 타액 또는 다른 신체 체액일 수 있는 유입 샘플로부터 DNA 샘플을 추출하는 추출 및 정제; (ii) 예컨대, 샘플의 특이 서열을 증폭시키는 증폭 및 표지; (iii) 하이브리드화; (iv) 표적 서열에 결합한 불필요한 분자를 제거하는 엄격한 세척, 및 (v) 확인 단계를 완료하고, 특이 서열을 확인하는 판독을 포함한다. 시스템은 통합형 미세유체 카드 (iMFC)로 불리는 일회용 부재 및 비일회용 베이스 유닛을 포함한다. 통합형 미세유체 카드는 접속 방식을 통해 베이스 유닛에 커플링될 수 있다. iMFC에서의 유체 유동은 카드 구조의 일부를 형성하는 밸브를 제어함으로써 달성될 수 있다. 각 카드는 특정 세트의 생물학적 마커를 검출 및 확인하도록 디자인될 수 있다. 실시양태에서, 유입과 판독 사이의 단계는 인간의 어떤 개입도 없이 수행되며, 본 시스템은 샘플을 분할하지 않고, 시스템은 1,000개 이상의 표적을 확인할 수 있으며, 시스템은 1회 실행당 50개 초과 표적을 확인할 수 있고/거나, 단일 시스템에서 모든 시험 단계를 실행할 수 있고/거나, 실시간 하이브리드화를 사용하여 시스템은 하이브리드화 완료 이전에 결과를 예측할 수 있고, 표적 농도에 대한 정보를 제공할 수 있다. 도 1은 전체 시스템(10)을 보여주는 것이다. 시스템은 유닛 베이스(20), 유닛 리드(30), 및 일회용 통합형 미세유체 카드 (iMFC)(40)를 포함한다. 카드 디자인은 모듈식이며, 이로써, 혈액 방울, 비강 면봉 채취물, 객담 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 샘플 유입을 수용할 수 있도록 맞춤화될 수 있거나, 또는 상이한 시험을 수행할 수 있도록 맞춤화될 수 있다. 일반적으로, 시험 프로세스는 먼저 적절한 카드를 선택하고, 카드의 유입 챔버에 샘플을 배치하고, 카드를 유닛 베이스에 배치하고, 리드를 덮고, 적절한 실행 소프트웨어를 선택함으로써 시작된다. 일단 시험 프로세스가 개시되고 나면, 인간의 어떤 개입도 요구되지 않는다. 결과는 시스템의 일부로서 통합될 수 있는 스크린 상에 표시될 수 있거나, 또는 외부 장치, 예컨대, 컴퓨터 또는 스마트 폰으로 전송될 수 있다. 시험 완료 후, 카드는 처리될 수 있고, 다음 시험을 위해 다른 카드가 선택될 수 있다. 상기 단계의 순서는 필요에 따라 변경될 수 있다. 일회용 통합형 미세유체 카드. 카드는 일반적으로 한 카드에서 다중 기능, 예컨대, 용해, 정제, 증폭, 표지 및 검출을 조합한다. 전형적인 시판용 시스템에서, 이들 기능은 다중 장치로 달성된다. 본 발명자들은 기포 제거 및 정확한 계량, 소산장 영상화 시스템의 통합, 다양한 단계에서 시약 및 화학 물질의 선택, 및 신속한 증폭 및 실시간 하이브리드화 등을 위한 많은 기술 및 특징을 통합함으로써 기능 통합을 달성하였다. 다중 기능을 한 카드로 통합함으로써 CLIA를 면제받을 수 있다. 도 2a는 카드의 투시도를 도시한 것이고, 도 2b는 평면도를 도시한 것이다. 도 2b는 또한 카드 내에서 다양한 기능이 이루어질 수 있는 영역 (파선으로 표시)을 도시한 것이다. 예를 들어, 블록(100)은 용해 블록일 수 있고, 블록(110)은 정제 블록일 수 있고, 블록(120)은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 프로세스가 이루어지는 블록일 수 있고, 블록(130)은 검출이 이루어지는 블록일 수 있다. 시험 샘플을 함유하는 유체는 카드 내에 도입된 채널을 통해 상기 기술된 순서로 한 블록에서 또 다른 블록으로 유동하게 된다. 상기 채널을 통한 한 블록에서 또 다른 블록으로의 액체의 유동은 마이크로밸브에서 부과된 압력에 의존하여 개방 또는 폐쇄될 수 있는 상기 밸브에 의해 제어된다. 용해 블록. 샘플 유입은 또한 용해 블록인 도 2a 및 2b의 블록(100) 내에서 이루어질 수 있다. 예컨대, 혈액 방울 및 비강 면봉 채취물을 사용하는 것과 같이, 샘플을 유입하는 데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 카드는 샘플을 수집하는 데 사용되는 도구를 직접 수용한다. 전형적으로, 시판용 시스템에서, 샘플을 수집하는 데 사용되는 도구는 시험 장치와 직접적으로 접속하지 않는다. 도구가 시험 장치와 직접 접속할 수 있도록 허용함으로써, 오염원 및 사용자 오류를 제거할 수 있다. 카드는 모듈식이기 때문에, 용해 블록은 다양한 유입 방법을 수용하도록 변형될 수 있다. 도 2a 및 2b를 참조하면, 부재(102)는 샘플, 예컨대, 혈액 방울을 수용하는 유입 챔버일 수 있다. 도 2c는, 용해 블록이 유입물로서 비강 면봉 채취물(250)을 수용하도록 구성되어 있는 것인, 모듈 방식의 이점을 나타낸 것이다. 혈액 방울 또는 비강 면봉 채취물을 사용하는 이들 두 경우 모두에서 카드(40)의 기본 디자인은 동일할 수 있고; 오직 유입 모듈만이 상이할 수 있다. 다양한 유입 방법을 제공하는 것 이외에도, 용해 모듈은 예컨대, 기계적, 화학적 또는 다른 유형의 용해와 같은 상이한 유형의 용해를 수행하도록 구성될 수 있다. 도 2a 및 2b를 참조하면, 용해 블록은 비드로 충전된 비드 챔버, 및 비드에 힘을 가하여 서로 충돌시키는, 비드 챔버 맨 위에 탑재된 소형 모터를 포함하는, 비드 비터(104)를 가지는 것으로 제시되어 있다. 충돌하는 비드 사이에 위치하는 세포는 그의 내용물을 용해 완충제 용액으로 유리시키면서 용해된다 - 기계적 용해의 한 예. 다른 모듈은 다른 유형의 용해를 수행하도록 구성될 수 있고, 이들 모듈은 도 2a 및 2b에 제시된 것과 다른 또는 그보다 더 적은 개수의 챔버 또는 서브모듈을 가질 수 있다. 예를 들어, 화학적 용해를 수행할 수 있는 모듈은 비드 비터 대신 (아마도 시약 블록에 보관되어 있고, 적절한 시점에 파이프를 통해 챔버 내로 수송되는) 화학 물질이 샘플을 함유하는 용해 완충제 용액과 혼합될 수 있는 또 다른 챔버를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 유형의 용해는 동일한 기본 디자인의 카드로 제공될 수 있다. 용해 프로세스를 개시하기 위해, 시약 블록(140) 중 용해 완충제 웰(142)에 보관된 용해 완충제 용액은 파이프를 통해 챔버(108) 내로 수송된다. 카드 내의 유체 유동을 제어하는 방법은 마이크로밸브 제어를 통해 달성될 수 있다. 챔버(108)는, 액체가 벤트(vent)와 접촉하게 됨에 따라, 챔버와 대기 사이와 압력차에 기인하여 공기 폐색되어, 챔버는 충전되면서, 챔버 내의 공기는 밖으로 방출되도록 상부에 기체 투과성 벤트를 가질 수 있다. 상기 벤트는 다양한 물질, 예컨대, 테프론(Teflon)으로 제조될 수 있다. 챔버(108)가 충전되었을 때, 상기 챔버와 유입 챔버(102) 사이의 밸브가 개방될 수 있고, 이로써, 완충제 용액은 유입 샘플과 혼합되게 된다. 일단 용해 완충제와 유입 샘플이 혼합되고 나면, 유입 챔버(102)와 비드 비터(104) 사이의 밸브가 개방될 수 있고, 이로써, 혼합물은 비드 비터 내로 유입된다. 이어서, 비드 비터 맨 위에 있는 모터는 그 이후에 특정 기간 동안 작동하고, 비드 비터(104)와 챔버(106) 사이의 밸브는 개방되고, 이에 상기 용액은 챔버(106) 내로 유동된다. 챔버(106)는 시약, 예컨대, 구아니딘-히드로클로라이드로 미리 충전될 수 있고, 여기서, 용해된 용액과 혼합된다. 시약과의 혼합이 완료된 후, 챔버(106)와 정제 블록(110) 사이의 밸브는 개방될 수 있고, 이로써, 상기 혼합물은 정제 블록으로 유도될 수 있다. 구아니딘-히드로클로라이드는 샘플 중의 DNA가 정제 블록 중의 실리카 기반 구조와 결합할 수 있게 할 수 있으며, 이로써, 정제 프로세스에 도움을 줄 수 있다. 상이한 유형의 용해를 수행할 수 있고, 다양한 유입 방법을 수용할 수 있고, 유입 방법을 위한 실제 도구를 수용할 수 있는 능력을 제공하는 구성이 유익한 특징이 되며, 이는 장치(10)에서 시너지적으로 조합될 수 있다. 정제 블록. 챔버(106)와 정제 블록 사이의 밸브가 개방되었을 때, 용액은 정제 블록 내에 배치된 실리카 프릿과 접촉하게 된다. 프릿, 및 상기 프릿을 담고 있는 구조는 도 2a 및 2b에 각각 (112) 및 (114)로 열거되어 있다. 프릿을 통과하는 용액의 유동은 도 3에 도시되어 있다. 상기 도면은 실리카 프릿(112) 주변의 카드의 단면도를 보여주는 것이다. 실리카 프릿은, 베이스 층(400)과 상단 캡 층(430) 사이에 끼여 있을 수 있는 채널(410)에 안착되어 있는 메쉬 형태일 수 있다. 베이스 층, 상단 캡 층은 프릿을 담고 있는 구조(114)의 일부를 형성한다. 화살표 표시는 채널(410)내 유체 유동을 나타낸다. 구아니딘-히드로클로라이드를 함유하는 챔버(106)로부터의 용액 중의 핵산을 함유하는 용액은 프릿에 결합하게 될 것이며, 화살표 방향으로 유동하게 될 것이다. 용액이 프릿을 통과하여 유동한 후, 용액의 유동은 마이크로밸브에 의해서 잔류물 챔버 내로 유동하도록 하는 방향으로 유도될 수 있거나, 또는 추가 프로세싱을 위한 방향으로 유도될 수 있다. 그러므로, 용액 중의 DNA는 프릿에 결합하지만, 프릿 유동에 결합하지 않은 용액의 다른 성분, 예컨대, 단백질 및 지질은 프릿을 통과하여 유동하여, 채널을 통해 잔류물 수집 챔버(144) 방향으로 유도될 수 있다. DNA 결합 단계 후, 세척 단계가 수행된다. 에탄올 저장소(146)에 함유하되어 있는 에탄올은 프릿 상을 유동하도록 허용되고, 이로써, 세척 단계를 수행함으로써 DNA에 여전히 결합되어 있을 수 있는 용해물의 원치않는 성분을 세척하여 제거해낼 수 있다. 이어서, 에탄올을 건조시킬 수 있다. 정제 프로세스에서 다음 단계는 용리 완충제 웰(148) 중에 보관된 용리 완충제를 프릿 상에 흘려 보내 세척하는 것이다. 이 단계를 통해 핵산은 프릿으로부터 커플링 해제된다. 이에, 용액은 PCR 프로세스 블록(120)으로 진입하게 된다. 이 단계에서, 추가의 프로세싱 단계 (PCR 프로세스)로의 밸브는 개방되지만, 잔류물 챔버로의 밸브는 폐쇄된다. PCR 블록. 정제 블록 후, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 바람직하게는, 예컨대, 상기 기술되는 것과 같은 시스템 개조물을 이용하여 실시될 수 있다. PCR은 (120)으로 열거된 PCR 블록에서 수행되고, 이는 도 2a 및 2b에 제시된 바와 같이 다단계로 수행될 수 있다. 정제 단계로부터의 용리 세척 완료 후, 핵산을 함유하는 정제된 용액은 PCR 마스터 믹스 챔버(122) 내로 유동된다. 여기서, 정제된 용액은 마스터 믹스 챔버의 구조 내에 보유되어 있는 동결건조된 (냉동 건조된) 효소와 혼합된다. 상기 효소는 프로세싱 연쇄 중 하류에서 추가로 발생하는 증폭 단계를 위해 요구된다. 마스터 믹스 챔버는 웰을 포함할 수 있는데, 상기 웰을 충전시키는 용액의 부피는 제어될 수 있으며, 이로써, 정확한 부피의 용액이 허용될 수 있고, 기포 발생을 막거나, 그를 제거할 수 있다. 프로세싱의 다양한 단계에서 부피가 정확하면, 이를 통해 정확한 결과를 얻을 수 있다. 효소와의 혼합이 완료된 후, 용액은 PCR 프라이머 챔버(124) 내로 유동될 수 있고, 여기서, 용액은 동결건조된 프라이머와 혼합된다. 프라이머 챔버는 또한 용액 중에 포획된 기포 발생을 막거나, 그를 제거하는 것 이외에도, 부피를 정확하게 제어하는 웰일 수 있다. 마스터 믹스 및 프라이머와의 혼합을 포함하는 단계를 분리하는 것이 일부 상황에서는 이것이 보편적으로 이용가능한 마스터 믹스 모듈의 사용을 허용하고, 장치의 총 비용을 절감시키는 바, 이에 이로울 수 있다. 추가로, 두 단계로 분리하면, 예를 들어, 상이한 표적 분자의 존재에 대하여 체크하는 데 사용될 수 있는 상이한 프라이머를 포함하는 다중 카드를 제조하는 것이 가능할 수 있는 바, 신생 위협을 시험하는 키트를 신속하게 활용할 수 있다. 프라이머 (올리고뉴클레오티드)의 동결건조 프로세스는 신속하고, 간단하며, 장치(10) 외부 실험실에서 수행될 수 있다. 따라서, 비록 바람직할 경우에는 혼합 프로세스가 한 단계로 수행될 수도 있지만, 두 혼합 단계를 분리함으로써, 카드는 상이한 물질을 시험하도록 변형될 수 있다. 프라이머와의 혼합 완료 후, 이어서, 용액은 PCR 챔버(126)로 유동하게 된다. PCR 챔버가 비금속 물질로 제조될 수 있는 것인 전통의 시판되는 접근법과 달리, iMFC 카드 중의 PCR 챔버는 예컨대, 알루미늄으로 제한되는 것은 아니지만, 패시베이션된 금속으로 제조될 수 있다. 금속, 및 특히 알루미늄을 사용하는 것은, 이를 통해 알루미늄 챔버 내의 용액을 온도가 신속하게 제어될 수 있는 바, 이에 이롭다. 이러한 신속한 제어는 알루미늄 챔버의 상부 및 하부가 열전기 냉각기 (TEC)와 긴밀하게 접촉해 있도록 함으로써 달성될 수 있다. PCR 챔버와 TEC 사이의 긴밀한 접촉은 PCR 챔버 위 및 아래에 TEC 2개를 위치시킴으로써 수득된다. PCR 챔버 위의 TEC는 장치(10)의 리드(30) 상의 (도 1) TEC 하우징 유닛(200) 내에 배치된다. TEC(210)의 면의 형상 및 PCR 챔버(126)의 형상은 리드를 닫았을 때, TEC 면이 PCR 챔버의 상부 표면 바로 위에 위치할 수 있도록 매칭되게 제조된다. PCR 챔버 아래의 TEC는 간단하게 유닛 베이스(20) 내에 배치된다. 도 2d는 PCR 챔버가 2개의 TEC(220) (TEC 면(210)을 포함하는 것)과 (230) (도면에서는 보이지 않는 TEC 면(240)을 포함하는 것) 사이에 어떻게 끼여 있을 수 있는지를 도시한 것이다. 따라서, 이러한 TEC 배열 및 알루미늄 PCR 챔버의 사용을 통해 PCR 혼합물의 신속한 온도 사이클링이 가능하다. 측정한 결과, 상기 조합이 >15℃/s의 온도 램프 (정확도 ±1℃)를 허용한다는 것이 밝혀졌다. 이어서, 이러한 구성은 샘플 유입과 결과 출력 사이의 시간을 단축시키는 데 직접적으로 기여한다. 패시베이션된 알루미늄 사용에 기인하여 용액의 신속한 온도 제어가 이루어질 수 있다는 이점 이외에도, PCR 챔버용으로 비금속 물질이 사용되는 경우에 필요한 에너지와 비교하였을 때, 용액을 가열 및 냉각시키는 데 더 낮은 에너지량이 필요하다는 점에서 추가의 또 다른 이점은 실현될 수 있다. 에너지량이 더 낮다는 것은 직접적으로 장치를 작동시키는 데 필요한 총 동력은 더 낮고, 이로써 임의적인 배터리 작동 및 현장 휴대성이 가능하다는 것으로 해석된다. 이제, PCR 챔버(126)의 또 다른 측면은 PCR 챔버 주변의 카드 및 검출 블록(130)의 단면도를 보여주는 도 2e를 참조로 하여 설명된다. 용액의 농도를 보존하기 위해서는, PCR 프로세스가 일어나는 동안, PCR 챔버 내의 포획된 공기가 없거나, 최소화되어야 한다. 기술된 바와 같이 상부 및 하부 섹션의 PCR 챔버는 패시베이션된 알루미늄으로 제조될 수 있고; 따라서, 여기서 통기성 막은 사용될 수 없다. 따라서, 저장소(255)로 유도되고, 결국에는 개방되어 또 다른 채널(257)을 통해 대기로 배출되는, PCR 챔버로부터의 배출구 채널(250)을 제공한다. 따라서, 챔버(126)가 용액으로 충전됨에 따라, 공기는 밀려나가고, 대기로 배출된다. 챔버(126)가 충전되는 동안, 채널(260)의 밸브는 폐쇄될 수 있다. 충전 프로세스 동안, 채널(250) 및 저장소(255) 또한 용액으로 충전될 수 있으며, 이는 공기가 챔버(126)로 다시 되돌아오지 못하도록 막는다. 또한, 용액은 6 psi의 일정한 압력에 의해 구동되는 바, 채널(250) 또는 저장소(255)로부터의 역류는 발생하지 않는다. 챔버 충전 후, PCR 프로세스가 개시된다. PCR 프로세스 종료시, 필요한 표적 서열이 증폭되고, 검출 블록 내에서의 검출을 위해 표지된다. 검출 블록 - 일반적 설명. PCR 프로세스 완료 후, 도 2e를 참조하면, 채널(260)의 밸브(262)는 개방될 수 있고, PCR 챔버(126)에서의 증폭된 성분 (앰플리콘)을 포함하는 용액은 혼합 챔버(275) 내로 유동될 수 있다. 여기서, 용액은 시약 블록 중의 하이브리드화 완충제 웰(150)에 보관되어 있을 수 있는 하이브리드화 완충제와 혼합된다. 하이브리드화 완충제로부터의 용액은 PCR 생성물과의 혼합이 허용되기 이전에 계량된다. 믹스 챔버(275)에서의 혼합 프로세스 완료 후, 용액은 채널(330)을 통해 검출 챔버(325) 내로 유동될 수 있다. 검출 챔버(325), 믹스 챔버(275), 용액을 상기 챔버 안 및 밖으로 수송하는 채널 모두가 도 2b에 도시된 검출 블록(130)의 일부를 형성한다. 이어서, 검출 챔버 내에서, 하이브리드화 완충제와 혼합된 PCR 생성물은 DNA 마이크로어레이 위로 유동하도록 허용될 수 있다. 이는, 웰이 용액을 담고 있고, 마이크로어레이(315)가 웰의 하부에 배치되어 있는, 도 2f에 제시되어 있는 검출 웰(317)에서 일어난다. 따라서, 이러한 구성을 가지는 경우, 용액은 마이크로어레이의 상부에 위치한다. 도 2f는 DNA 마이크로어레이(315)의 배열을 도시한 것으로, 이는 빛이 마이크로어레이 판독에 사용되는 광학 시스템의 일부를 형성하는 경우, 그 빛이 마이크로어레이로 커플링되는 방식을 설명해 주는 것이다. DNA 마이크로어레이는 유기 기판(310) 상에 격자 패턴으로 배열된 수개의 프로브로 함유할 수 있다. 각 프로브는 DNA (또는 RNA)를 함유할 수 있고, 이는 프로브 중의 서열에 상보적인, 샘플 용액 중의 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 데 사용된다. 언급한 바와 같이, 상기 프로브는 유기 기판(310) 상에 격자 패턴으로 위치한다. 빛은 유리 내에서 에칭되는 격자(305)를 통하여 유기 기판으로 커플링된다. 도 2g를 참조하면, 격자가 입사광(306)과 함께 도시되어 있다. 입사광(306)은 특정 파장의 것일 수 있다. 격자의 존재로 인해 입사광은 다방향으로 이동할 수 있고; 일부 빛은(307)로 표시된 바와 같이 곧바로 전송될 수 있고, 일부 빛은 (308) 및 (309)로 표시된 바와 같이 특정 각도로 전송될 수 있다. 빛은 빛(307)과 관련하여 추가 및 더 급경사인 각도로 전송될 수 있지만, 더 급경사인 각도의 빛의 강도는 더 낮은 경향이 있는 바, 본 개시내용에서는 무시된다. (빛이 직선으로 전송되지 않는 경우의) 빛이 전송되는 각도는 널리 공지된 격자 방정식에 의해 측정된다. 빛(308 및 309)의 각도는 입사광(306)의 파장을 조정함으로써, 및 격자의 패턴화에 의해 조정될 수 있다. 이어서, 빛을 유리 기판으로 커플링시키기 위해, 전반사 프로세스가 사용된다. 이 개념은 도 2h에 도시되어 있다. 상기 도면에서, 곧바로 전송되는 빛(307) 및 한 각도로 전송된 빛(309)은 무시된다. 빛(308)은 격자(305) 크기에 의해 제약을 받는 빔으로 도시되어 있다. 따라서, 빛(308)의 빔은 격자의 좌측 가장자리로부터 방사되는, 실선(308L)으로, 및 격자의 우측 가장자리로부터 방사되는, 파선(308R)으로 도시되어 있다. 실선 및 파선은 빔의 두 가장자리를 구별하는 데 사용되며; 다른 차이는 표시되어 있지 않다. 빔(308)의 각도 및 유리 기판의, 및 주변 환경 (본질적으로 공기)의 굴절률에 따라, (R1)로 마킹된 유리 기판 영역 1의 상부 표면에 설정될 수 있다. 상기 반사광은 유리 기판의 하부 표면에 도달할 수 있고, 이는 다시 완전히 ((R2)로 마킹된) 영역 2에서 내부로 반사될 수 있다. 따라서, 비록 전반사이기는 하지만, 빛은 마이크로어레이(315) 아래 검출 웰(317) 뒤쪽 방향으로 진행될 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 마이크로어레이(315)는 검출 웰(317)의 바닥에 위치한다. 이제, 빛은 마이크로어레이 위치 방향으로 진행되고, DNA 마이크로어레이에서 감광 분자를 여기시키는 데에는 소산장으로 불리는 또 다른 현상이 사용된다. 전반사가 일어나는 경계부에서 소산장은 경계부의 남은 다른 한쪽 상에 설정된다는 것이 광학 분야에는 널리 공지되어 있다. 이러한 소산장은 근접장 현상이고, 강도는 경계부에서 멀리 떨어진 곳에서 기하급수적으로 하락한다. 그러나, 경계부에 매우 가까운 소산장은 감광 분자를 여기시킬 수 있고, 검출 웰(317) 중의 용액은 경계부에 및 그 주변에 위치해 있기 때문에, 소산장을 사용하는 검출 방법이 가능해진다. 도 2h로 다시 돌아가서, 검출 웰은 외함 층(320) 내에 배치되어 있는 것으로 제시되어 있고; 이 외함 층은 크롬으로 제조된 것이다. 4면 모두 검출 웰을 둘러싸고 있는 크롬 층은 또한 도 2f에도 제시되어 있다. 크롬은 디자인의 일부로서 포함되어 있는 바, 검출 웰 바로 가까이에 있는 인접부로부터의 미광은 감소되거나, 또는 제거된다. 일탈 빛의 가능성은 검은색 플라스틱 시트(327)를 검출 웰 상에 커플링시킴으로써 추가로 제거된다. 플라스틱 이외의 물질이 웰로서 사용될 수 있다. 격자 디자인 및 빛(308)의 후속 각도, 유리 기판의 두께, 유리 기판의 굴절률, 격자와 검출 웰 사이의 거리가 본 발명자들이 본 장치를 위해 최적화시킨 파라미터이고, 이는 시너지 기능성을 제공한다. 추가로, 빛(308)의 각도는, 완전히 영역, 예컨대, (R1) 및 (R2)로부터 (본질적으로, 유리-공기 경계부로부터) 뿐만 아니라, 검출 웰 중 유리-용액 경계부로부터 내부로 반사될 있도록 선택될 수 있다. 검출 웰 중 용액의 굴절률은 대략 1.33인 반면, 공기의 굴절률은 대략 1이다. 다른 파장의 레이저 광을 사용하기 위해 격자 피치, 격자 물질, 및 기판 굴절률을 변경시킬 수 있다. 한 예에서, 750 ㎛ 용융 실리카 기판 상의 195 nm 피치의 150 nm 질화규소 격자와 함께 633 nm 파장의 빛이 사용되었다. 빛은 10° 발산각으로 기판으로 커플링된다. 격자와 마이크로어레이 사이의 거리는 전체 내부 반사 바운스에 대한 정수에 상응하는 거리에 배치되도록 선택된다. 상기 명시된 모든 파라미터는 필요에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 다른 파장의 빛이 사용될 수 있고, 이는 이어서 상기 명시된 것과 다른 격자 이격화를 필요로 할 수 있다. TEC(365)는 용액의 온도를 제어하기 위해 검출 웰(317) 상에 배치될 수 있다. 마지막으로, CCD 카메라(360)는 마이크로어레이의 1 대 1 영상이 카메라 검출기 상에 형성될 수 있도록 마이크로어레이 아래에 배치될 수 있다. 카메라 시스템은 마이크로어레이 상에서 용액의 사진을 촬영한다. 사진을 통해 형광성일 수 있는 마이크로어레이 상의 영역을 밝혀낼 수 있다. 이러한 정보는 확인 및 검출 프로세스에서 사용된다. 본 발명은 검출 기능을 실행시키기 위해 기술된 개선안 및 개조물의 시너지적인 조합을 이용한다. 검출 블록 - 품질 관리. 마이크로어레이는, 샘플 내의 표적 서열을 확인하는 것 이외에도, 단계 (용해, 정제, 효소 및 프라이머와의 혼합 등)가 원하는 대로 이루어졌는지 확인하는 데에도 사용될 수 있다. 각 단계에서 마커가 첨가될 수 있고, 마커의 존재 또는 부재는 마이크로어레이 내에서 광학적으로 시험될 수 있다. 따라서, 마커의 존재 또는 부재를 분석함으로써 품질 관리를 달성함으로써 시험이 적절하게 수행될 수 없는지 여부 및 그러한 경우를 확인할 수 있다. 검출 블록 - 범(pan)- 증폭. 장치(10)를 사용함으로써 각종 핵산 서열에 대해 시험하는 데 있어 샘플 분할을 피할 수 있다. 샘플 분할은 시판용 시스템에서 통상 사용되는데; 이는 샘플이, 각각의 분할된 샘플이 특정 서열에 대해 시험될 수 있는 다중 샘플로 분할되는 것을 필요로 한다. 원 샘플이 다중 샘플로 분할되기 때문에, 이 방법은 샘플 분할 개수와 같은 배수만큼 검출 한계가 감소된다. 샘플 분할을 사용하는 대신, 본 발명자들은 범-증폭이라 불리는 프로세스를 실행하는데, 이를 통해서, 박테리아 또는 바이러스 종 내의 변종도 샘플 분할 없이 확인될 수 있다. 종 내의 변이체의 DNA의 일부 단편은 동일하거나, 유사할 수 있는 바, 이러한 유형의 시험이 가능해진다. 특정 서열이 존재한다는 것이 인지되면, 이어서, 변이체를 확인하기 위해 프라이머를 디자인할 수 있다. 전형적으로, PCR은 약 20개의 상이한 프라이머 세트로 제한되며, 이는 시판용 시스템이 검출할 수 있는 표적의 개수를 제한한다. 본 발명자들의 시스템은, PCR 프라이머 세트가 다수의 유기체 사이에 공통된 DNA 서열을 표적으로 하는 반면, 상기 프라이머 사이의 영역은 유기체들 간에 고도로 가변적인 DNA 서열을 함유하는 것인, 범-증폭에 의해 상기 한계를 극복한다. 범-증폭 접근법을 통해 고도로 다중화가 가능한 마이크로어레이에서 샘플 유형을 구별해낼 수 있다. 예를 들어, 코로나바이러스 폴리머라제 유전자의 보존 영역을 통해 6개의 상이한 코로나바이러스 혈청형은 단일 프라이머 세트를 사용함으로써 증폭될 수 있지만, 각 혈청형은 프라이머 세트 사이에서 증폭된 가변 영역을 분석함으로써 마이크로어레이 상에서 식별가능하다. 범-증폭의 한가지 이점은 전형적인 시판용 PCR 수행 장치에 비하여 더 적은 개수의 프라이머가 요구된다는 점이다. 20개 초과의 프라이머를 사용하면, 프라이머 분자가 프라이머 중의 상보적인 염기의 스트링에 기인하여 서로 하이브리드화되는 "프라이머 이량체"라고 불리는 현상이 일어날 수 있는 반면, 본 발명자들의 범-증폭 프로세스를 통해서는 더 적은 개수의 프라이머를 사용할 수 있으며, 이로써 이로운 구성을 얻을 수 있다. 검출 블록 - 실시간 하이브리드화. 또 다른 이로운 구성에서, 실시간 하이브리드화 접근법이 장치(10) 내에서 실행되며, 이로써, 샘플 유입부터 결과 출력까지의 시간은 단축될 수 있다. 전형적인 시판되는 접근법에서 하이브리드화는 시험되는 샘플 또는 샘플들의 농도가 안정화될 때까지 계속해서 이루어질 수 있다. 그에 반해, 장치(10)에서 샘플 또는 샘플들의 농도는 샘플 또는 샘플들의 농도가 하이브리드화 시작 후 곧바로 상승할 수 있는 시간 동안 반복적으로 추정되는 실시간 접근법이 실행된다. 이러한 기술은 CCD 카메라로부터의 신호 강도가 상기 동적 곡선 방정식에 따른 농도와 관련이 있을 수 있다는 관찰 결과에 기초한다. 동적 모델을 사용할 때, 시간에 대한 형광 신호 증가가 모니터링될 수 있다. 이 신호는 시간 상수가 추정될 수 있는 기점인 지수로서 모델링되거나, 피팅될 수 있다. 시간 상수 추정치를 이용함으로써, 분석물의 농도를 추정할 수 있다. 검출 블록 - 다단계 온도 제어 사용. 전형적인 시판되는 하이브리드화 방법에서, 하이브리드화 완료 후, 비결합 프로브가 세척되어 제거될 수 있도록 엄격한 세척이 수행된다. 전형적으로, 엄격한 세척은 염 농도에 변화를 줌으로써 수행될 수 있지만, 장치(10)에서는 염 농도는 일정하게 유지시키면서, TEC를 사용하여 샘플의 온도에 변화를 줌으로써 유사한 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 하이브리드화를 완료하고, 초기 사진 세트를 촬영한 후, 비결합 분자 중 일부가 제거될 수 있도록 TEC 온도를 증가시킬 수 있다. 용액의 온도에 변화를 주는 것이 하이브리드화 완충제의 염 농도에 변화를 주는 것보다 더 용이하기 때문에, 이는 결과 체크를 수행할 수 있는 이로운 방법이 된다. 부피 제어. 시험 방법은 정확한 부피를 필요로 하는데, 상기 부피는 충전 챔버 중에 존재하는 기포에 의해 파괴될 수 있다. 전형적인 시판용 시스템에서, 각종 장치, 예컨대, 연동 펌프가 사용되지만, 이들 장치의 부가는 장치의 복잡성 및 비용을 증가시킨다. 본 발명자들의 장치는 높은 정확도 및 정밀도를 달성하는 부피 제어를 제공하고(바람직하게 10% 이하), 실행 비용이 저렴하다. 도 4는 충전 챔버 주변 구조와 함께 충전 챔버(450)를 횡단면으로 도시한 것이다. 충전 챔버는 베이스 층(490) 위에 위치할 수 있다. 챔버의 면은 (460)으로 표시되어 있다. 유체는 화살표(480)를 따라 챔버로 진입할 수 있다. 충전 챔버의 배출구는 파선 화살표(495)로 마킹되어 있다. 부재(470)는 밸브일 수 있고; 닫혀 있다면, 파선 화살표(495)를 따라 진행되는 유동은 일어나지 않는다. 통기성 막(440)은 도시된 바와 같이 충전 챔버 위에 탑재될 수 있다. 밸브가 닫혀 있는 경우, 유체는 (480) 방향을 따라 충전 챔버(450)로 유동할 수 있다. 통기성 막은 포획된 공기를 배출할 수 있고, 충전 챔버가 충전됨에 따라, 모든 공기는 강제 배출된다. 통기성 막은 챔버와 대기 사이의 압력차에 기인하여 어떤 공기도 다시 안으로 진입하지 못하도록 하며; 따라서, 밸브(470)가 닫혀 있는 경우, 충전 챔버 내에 정확한 양의 유체가 수집될 수 있다. 충전 챔버 내의 부피의 정확도는 챔버 크기의 정확도에 의해 결정될 수 있고, 챔버 크기는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 기계 가공 및 에칭과 같이, 널리 공지된 기술을 사용하여 제어될 수 있다. 통기성 막은 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 미세다공성 폴리프로필렌과 같은 물질로 제조될 수 있다. 따라서, 정확하게 제조된 챔버와 통기성 막이 조합될 경우, 정확하고, 정밀한 부피 제어가 달성될 수 있다. 막과 함께 충전 챔버는 iMFC 카드 내의 다양한 위치에 위치한다. 따라서, 예를 들어, 통기성 막과 함께 충전 챔버는 PCR 마스터 믹스 챔버(122) 및 PCR 프라이머 챔버(124) 용도로 사용될 수 있다. 이들 두 위치에서, 특히, 동결건조된 상기 챔버 내에서 펠릿으로서 위치할 수 있고; 따라서, 이들 챔버 내에서 재수화 프로세스가 부피 제어식 환경에서 일어날 수 있다. 밸브 제어. 도 5a 및 b는 유체 유동 채널(520) 및 공기 유동 채널(540), 및 가요성 막(530)을 포함하는 iMFC 카드 내에서 유체 유동 및 밸브가 어떻게 제어될 수 있는지 그 방식을 도시한 것이다. 도 5a에는 유체가 유체 유동 채널(520)을 통해 유동할 수 있다는 것을 보여주는 2개의 추가 화살표(550)가 제시되어 있다. 유체는 특정 압력, 예컨대, 6 psi에서 시스템을 통해 펌핑될 수 있다. 도 5a에 도시된 바와 같이 막(530)이 변형되지 않을 경우, 이때 채널(520)은 유체의 자유로운 유동을 허용할 수 있다. 그러나, 더 높은 압력, 예컨대, 18 psi이 공기 유동 채널에 가해질 경우, 막은 도 5b에 도시된 바와 같이 변형될 수 있고, 이는 채널(520)을 통한 유동을 효과적으로 중단시킨다. 따라서, 막 양쪽의 압력을 제어함으로써 유동 채널을 통한 유동을 제어할 수 있다. 차압을 가한 공압 시스템은 하기에 기술된다. iMFC 층. 상기 언급된 바와 같은 iMFC 카드는 일회용일 수 있고, 저렴한 물질, 예컨대, 폴리카르보네이트, 아크릴계, 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 구축될 수 있다. 카드는 상이한 모듈을 수용할 수 있는 "마더 보드"로 간주될 수 있으며, 예컨대, 카드는 상이한 유입 방법을 수용하는 각종의 상이한 유형의 유입 모듈을 가지도록 디자인될 수 있다. 카드는 각종 모듈을 수용할 수 있을 뿐만 아니라, 채널 구성은 또한 상이한 진단 시험을 수용하도록 또는 진단 시험에 단계를 부가하거나, 공제하도록 개조될 수 있다. 따라서, 각 카드는 기본 하드웨어를 변화시킬 필요 없이, 특정 시험 또는 시험 세트를 수용하도록 디자인될 수 있다. 각 카드는 하나의 층 또는 다중 층으로 제조될 수 있다. 카드의 주요 기능 중 하나는 적절한 시점에 유체를 카드 내로 구축된 유체 유동 채널 및 공기 유동 채널로 이루어진 시스템을 통하여 한 위치에서 또 다른 위치로 루트를 따라 전송하는 것이다. 다른 기능으로는 유동을 계량하는 기능, 및 온도 제어식 환경을 제공하는 기능을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 도 6은 iMFC 카드의 모든 층에 대한 합성 "투영" 영상을 도시한 것이다. 일반적으로, 카드는 하나 또는 다중 채널, 예컨대, (600)을 가지며, 이로써, 유체는 상기 채널 중의 한 위치에서 또 다른 위치로 유동할 수 있다. 채널은 홈을 카드 내의 층 물질로 절단함으로써 형성될 수 있다. 추가로, 카드는 또한 하나 또는 다중 밸브, 예컨대, (630) 및 부피가 계량될 수 있는 하나 또는 다중 채널 또는 저장소, 예컨대, (620)을 가질 수 있다. 일부 층 또는 층의 섹션은 통기성 막으로 구성될 수 있다. 카드는 다수의 포트, 예컨대, (610)을 포함할 수 있다. 포트는 하드웨어와 카드 사이의 계면을 형성할 수 있다. 이들 포트는 (유체를 구동시키는) 구동 압력 또는 (밸브를 제어하는) 밸브 압력을 가하는 데 사용된다. 이들 포트의 위치는 상기 카드에 대하여 동일하게 그대로 유지될 수 있으며, 이는 기본 하드웨어를 변형시켜야 할 필요가 없게 만든다. 그러나, 카드는 임의의 편리한 방식으로 디자인될 수 있고, 카드 상의 기능은 임의의 편리한 방식으로 배치될 수 있다. 기본 하드웨어를 변화시킬 필요 없이 다양한 시험을 수행하도록 디자인될 수 있기 때문에, 상기와 같은 측면을 통해서 카드는 다용도 카드가 된다. 공압 시스템. 공압 시스템 (도 7)은 카드 내의 유동 조절을 담당한다. 공압 시스템은 유닛 베이스 내에 위치할 수 있는 펌프를 가질 수 있다. 이 펌프는 축압기 내의 공기를 원하는 압력으로까지, 예컨대, 16 psi까지 압축시킨다. 도면에는 또한 축압기 내의 압력이 일정하게 유지되도록 하는 축압기로부터 펌프까지로의 피드백 루프가 제시되어 있다. 한 경로는 축압기로부터 조절 장치로 진행되고, 여기서, 상대적으로 높은 축압기 압력은 더 낮은 압력, 예컨대, 6 psi로 하향 조절된다. 이러한 더 낮은 압력은 전체 시스템 내에서 유체를 구동시키는 데 사용된다. 솔레노이드 밸브는 유체 구동을 작동시키기 위해 조절 장치의 출력 위치에 포함되어 있을 수 있다. 축압기로부터로부터의 또 다른 경로는 밸브의 개방 또는 폐쇄를 제어하기 위해 하나 또는 다중 솔레노이드 밸브를 통과할 수 있다. 따라서, 상대적으로 높은 축압기 압력 (16 psi)은 밸브를 제어하는 데 사용될 수 있다. 도면에 제시되어 있는 바와 같이, 각 솔레노이드 밸브는 하나 또는 다중 밸브를 제어할 수 있다. 도 5a 및 5b에는 유체 유동이 유체 채널 및 공기 유동 채널의 디자인을 통하여 어떻게 제어되는지 그 방식이 도시되어 있다. 도 7과 관련하여, 유체 채널은 "구동" 출력 위치로 연결될 수 있고, 공기 유동 채널은 "밸브" 출력 위치 중 하나로 연결될 수 있다. 공압 시스템은 하드웨어의 일부일 수 있으며; 따라서, 유체 유동을 위해 또는 밸브 제어를 위해 압력을 공급하는 경로 중 일부는 쉽게 변형될 수 없다. 그러나, 카드 디자인의 유연성을 달성하기 위해서는 오직 포트만이 같은 위치에 위치하여야 하고; 이들 포트가, 압력이 밸브를 제어하기 위해 공기 유동 채널에, 또는 유체 구동 채널에 공급되는 방식이다. 이들 포트는 도 6에 (610)으로 표시되어 있다. 따라서, 카드가 동일 위치에 포트를 가지도록 함으로써, 동일한 하드웨어 유닛이 사용될 수 있지만, 카드 그 자체는 다른 목적으로 디자인될 수 있다. 하드웨어. 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 기술된 시험 시스템은 유닛 베이스(20) 및 유닛 리드(30)를 포함하는 휴대용 박스 내로 구축될 수 있다. 다양한 기능 및 수행 능력이 베이스 및 리드 내에 물리적으로 구성될 수 있다. 도 8에는 하드웨어의 기능 블록 다이어그램이 도시되어 있다. 하드웨어는 프로세서 및 전원, 예컨대, 배터리를 포함할 수 있다. 프로세서는 다른 부재, 예컨대, TEC, 모터, 광학 시스템, 공압 시스템, 디스플레이, 및 통신 시스템과 접속되어 있을 수 있다. 디스플레이 시스템과 관련하여, 장치(10)는 메세지 또는 결과를 전달할 수 있는 스크린을 가질 수 있다. 통신 시스템과 관련하여, 유닛(10)은 임의의 적합한 통신 방법, 예컨대, 이더넷 및 블루투스를 통하여 외부 컴퓨터에 접속될 수 있다. 디스플레이 및 통신 서브시스템, 이들은 널리 공지된 기술을 사용하여 실행될 수 있다. 도 8에는 또한 카드가 서브시스템, 예컨대, TEC, 모터 등 중 일부와 기계적으로 접속될 수 있다는 것이 도시되어 있다. 이러한 접속은 파선으로 표시되어 있다. 본 발명자들이 청구하는 본 발명의 실시양태로는 하기를 포함한다: 1. 샘플 주입 또는 삽입 및 결과 판독 목적의 개입을 제외하면, 시험 프로세스를 수행하는 데 인간 어떤 개입도 없는 큰 세트의 (>6개, >10개, >20개 또는 >50개) 핵산 서열을 검출하는 분자 진단 장치, 시스템 또는 방법. 2. 용해, 정제, PCR 및 하이브리드화 단계가 한 시스템으로 통합되어 있고, 상기 단계는 일회용 카드에서 수행되는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 3. 모듈을 변화시킴으로써 카드가 상이한 시험을 위해 구성될 수 있도록 일회용 카드가 모듈을 포함할 수 있는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 4. 분석물이 예를 들어: 혈액, 타액, GI 샘플, 뇨, 상처 면봉 채취물, 요추 천자, 비강 면봉 채취물, 수의학적 및 농업상 공급원을 비롯한 다양한 공급원으로부터의 샘플 중에서 검출될 수 있는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 5. 샘플을 수집하는 데 사용되는 도구가 카드 내로 직접 유입될 수 있는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 6. PCR 프로세스의 증폭 단계가 샘플 분할보다는 범-증폭으로 불리는 프로세스를 통해 수행되는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 7. 검출 단계가 마이크로어레이를 사용하는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 8. 마이크로어레이가, 시험 프로세스의 각 단계가 적절하게 일어났는지 여부를 확인하는 제어를 포함하는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 9. 검출 단계가 동적 모델에 기초하여 샘플을 농도를 예측하는 실시간 하이브리드화 방법을 사용하고, 여기서, 판독 시간이 단축되는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 10. 챔버 내의 온도가, 금속화된 챔버를 TEC에 인접하게, 및 그와 접촉하게 위치시킴으로써 신속하게 제어될 수 있도록 PCR 프로세스가 패시베이션된 금속화된 챔버에서 수행되고, 바람직하게, 여기서, 사용되는 금속은 알루미늄인 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 11. 용액의 부피가 통기성 막과 커플링된 챔버 또는 채널의 사용을 통해 계량되고, 이로써, 상기 챔버 또는 채널이 충전됨에 따라, 공기가 통기성 막 밖으로 강제 배출되고; 따라서, 계량된 부피 중 공기를 가짐으로써 발생되는 오류는 최소화되거나, 제거될 수 있는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 12. 공압 시스템이 상이한 압력을 가하여 유체를 구동시키고, 밸브를 제어함으로써 유체 유동을 제어하는 것인, 본원의 장치, 시스템 또는 방법. 추가 실시양태 및 그의 예에 관한 상세한 설명 다양한 샘플 중의 핵산 서열 내용물을 분석할 수 있는 휴대용 시스템을 개시한다. 시스템은 다양한 (진단학적 또는 환경적) 원료 샘플을 포함할 수 있고, 자급식 유닛 중 마이크로어레이에 의해 핵산 추출, 정제, 증폭, 표지, 및 서열 분석을 수행할 수 있다. 시스템은 자동식이고, 신속한 바, 이로써, 숙련된 실험 기술자가 아닌 사용자에 의한 샘플 현장 분석이 이루어질 수 있다. 실시양태에서, 시스템은 (1) 재사용이 가능한 하드웨어 플랫폼, 및 (2) 수행하고자 하는 검정법을 결정하는 소모성 통합형 미세유체 카드 (iMFC)를 포함하고/거나; 시스템은 소형이고 (<150, <250, 또는 400 in 3 ), 경량이며 (<3, 5 또는 10 lb), 고속이고, 사용이 용이하고/거나; 재사용이 가능한 하드웨어는 공압, 압력 조절, 온도 제어, 레이저 제어, 및 최종 마이크로어레이의 영상화를 제어 및 제공하고/거나; iMFC 소모재는 샘플 용해, 정제, PCR, 및 검출을 수행하고, 필요한 건식 시약 모두를 수용하는 카드를 포함하고/거나; iMFC는 건식 시약의 무결성을 손상시키지 않도록 모든 액체 시약을 따로 담고 있는 시약 보관 소자를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 시스템은 하기를 제공한다: 사용 용이성: 미숙련 오퍼레이터에 의한 현장 사용시 작동이 용이하고, 결과 해석이 간단하며; 임상 실험실 개선 개정안(CLIA: Clinical Laboratory Improvement Amendments) 면제가 되도록 구성되고/거나; 사용자 개입 없이 샘플-인 투 앤설-아웃 수행 능력을 제공한다. 구성 가능성: iMFC는 모듈식인 것으로서, 주 iMFC의 저장이 가능하고, 최종 생성물 검점 기능성을 정의하는, 별개의, 신속하게 제조되는, 더 낮은 저비용의 모듈을 부착할 수 있는 것이며; 주 iMFC는 동일한 것으로 그대로 유지되는 바, 시스템은 새로운 위협 출현에 따른 적시 생산 방식의 새로운 검정법 개발을 제공한다. 검정 유연성; 샘플 유형 (강성 포자에서부터 쉽게 파열되는 포유동물 세포에 이르기까지) 및/또는 분석물 부류 (DNA, RNA, 및 단백질)에서의 유연성. 제조 가능성 및 비용; iMFC 및 모듈식 컴포넌트는 저비용 사출 성형 또는 첨단 제조 레이저 전환 프로세스를 사용함으로써 제조 가능하고; 고속 레이저 전환 및 정밀 적층을 통해서 125 ㎛만큼 작고, 공차가 50 ㎛ 미만이며, 생산율이 분당 50 피트에 달하는 특징을 가지는 iMFC를 제조할 수 있으며; 종래 사출 성형 기술과 첨단 레이저 전환 기술의 조합을 통해서 일정 부피로 카드 1개당 $10 미만으로 복합 일회용 카트리지를 제조할 수 있다. 실시양태에서, 본 발명자들의 시스템은 원료 샘플 유입에서부터 답변 출력에 이르기까지 전자동이고/거나, 다중 분석 유형을 허용하도록 구성될 수 있다. 실시양태에서, 본 발명자들의 시스템은 핵산, 전형적으로, DNA 또는 RNA를 검출하는, 예컨대, 미생물, 전형적으로 박테리아, 바이러스 또는 진균을 검출하는, 및 mRNA 및 단백질 검출, 및 세포 선별 및 농축을 통해 건강을 모니터링하는 휴대용 생체분석 플랫폼을 제공한다. 한 실시양태에서, 시스템은 2개의 소자: (1) 재사용이 가능한 하드웨어 플랫폼, 및 (2) 수행하고자 하는 검정법을 결정하는 소모성 통합형 미세유체 카드 (iMFC)로 이루어진다. 실시양태에서, 본 발명자들의 시스템은 명백하게 다양한 적용에 맞게 적합화될 수 있다. 박테리아 작용제 검출. 본 발명자들의 DNA 검출 iMFC는 실험실 작업 플로우: 용해, DNA 정제, DNA 증폭 및 표지, 및 하이브리드화와 유사한 방식으로 작동된다. 각 단계에 대한 본 발명자들의 미세유체 기술적 접근법은 하기에서 강조된다. 용해는 강성 포자에서부터 포유동물 세포에 이르는 샘플 유형의 강력한 용해를 위해 실리카 비드 및 저비용 일회용 모터를 사용하여 달성된다. 본 발명자들은 DNA를 실리카 프릿에 결합시키고, 불순물을 세척하여 제거하고, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 준비가 된 용액 중에서 용리시킴으로써 DNA를 정제한다. 본 발명자들의 DNA 정제 모듈 및 방법을 통해 사용자 개입 없이 ~5 min 내에 처음 6 ㎕ 중 고농도의 DNA를 용리시킬 수 있다. 그에 반해, 포자 용해 및 DNA 정제를 위한 실험실 벤치 접근법은 7 단계에 걸쳐 30 min이 소요되며, 이는 실험실용 원심분리기를 필요로 한다. 본 발명자들은 2개의 맞춤형 열전기 냉각기 (TEC) 사이의 알루미늄-벽으로 둘러싸인 챔버에서 DNA 증폭을 수행한다. TEC 및 알루미늄 챔버를 통해 TEC 및 PCR 믹스 사이의 빠른 열 전달이 이루어질 수 있다. 본 발명자들은 12 min 이내에 E. 콜라이( E. Coli ) O104:H4 병원체와 연관된 두 유전자 (AGG 및 STX2)의 PCR 이중체를 입증하였고, 10개까지로 하향된 게놈 카피를 검출하였다. 본 발명자들은 맞춤형 DNA 마이크로어레이 및 광학 시스템을 사용하여 DNA를 하이브리드화한다. 빛은 격자 사용으로 유리 슬랩으로 커플링되고, 이는 전체 내부 반사에 의해 한정된 상태 그대로 유지된다. 표면 상의 소산파는 마이크로어레이의 표면상에서 그의 상보체에 하이브리드화된 표적 서열을 여기시키는 데 사용된다. 소산파를 사용함으로써 본 발명자들은 실시간으로 하이브리드화를 시각화할 수 있다. 맞춤형 광학 릴레이 및 CCD는 마이크로어레이의 표면을 영상화하는 데 사용된다. 본 발명자들은 다중의 잠재적인 생물전쟁 작용제의 다중 검출을 확인할 수 있고, 본 발명자들의 검정법 및 하드웨어 플랫폼에 대한 수신자 오퍼레이터 특성 (ROC) 곡선을 확립할 수 있다. 바이러스 RNA 검출. 바이러스 RNA를 검출하는 본 발명자들의 기술적 접근법은 본 발명자들의 DNA 검출 접근법과 동일하되, 단, 예외적으로, 본 발명자들은 단일 역전사/PCR 믹스를 사용한다. 본 발명자들은 인플루엔자 H3N2 및 H1N1 바이러스에 대하여 30 min 내에 단일 마스터 믹스 역전사 및 PCR을 보였다. 현장 휴대 능력은 DARPA의 프라퍼시(DARPA's Prophecy) 프로그램으로부터 얻은 정보에 직접적으로 영향을 줄 수 있고, 가축 떼 또는 무리 중의 바이러스 집단에서의 잠재적인 광역 유행병 유발 돌연변이의 조기 검출을 허용한다. mRNA 검출. 본 발명자들은 iMFC를 갱신하여 폴리-T 비드를 이용하여 mRNA가 포획될 수 있도록 하고, 동적 데이터를 포착하기 위해 실시간으로 마이크로어레이를 영상화할 수 있도록 하면서, 동일한 하드웨어를 사용함으로써 mRNA 분석을 처리할 수 있다. 동적 측정을 이용함으로써 본 발명자들은 평형에 도달하기 훨씬 이전에 각 분석물의 농도를 측정할 수 있으며, 이로써, 전형적으로 유전자 발현 분석을 구동시키는 하이브리드화 시간을 단축시킨다. 혈액 샘플을 신속하게, 및 mRNA가 필요한 시점에 분석할 수 있는 본 발명자들의 능력에 의해 건강 및 질병 예측 프로그램(Predicting Health and Disease program)에 대해 이루어지는 DARPA 투자를 받았다. 단백질 검출. 본 발명자들은 단백질 결합 이벤트를 핵산 판독으로 변환시킴으로써 본 발명자들의 동일한 플랫폼에 핵산 및 단백질 둘 모두를 검정할 수 있는 검정법을 제공할 수 있다. 혈장 단백질 농도는 건강 상태 또는 환경 노출을 나타낸다. 본 발명자들은 전리 방사선 노출을 나타내는 4-호스트-반응 단백질 패널을 개발하였고; 다른 환경 노출 진단을 위한 유사 패널도 또한 플랫폼으로 통합시킬 수 있다. 본 발명자들은 mRNA 검출을 위해 비드 상에 단백질 분석물을 포획하는 것과 동일한 비드-포획 미세유체 모듈을 사용하였다. 비드는 폴리-T 올리고뉴클레오티드 대신 특정 단백질 분석물에 대한 항체로 관능화된다. 종래 면역검정법에서와 같이 리포터 분자로서 올리고뉴클레오티드로 표지된 제2 항체가 사용된다. 일단 샌드위치 검정법에서 엄격한 세척 단계를 거치고 나면, 리포터 올리고뉴클레오티드를 증폭시키고, 표지하고, DNA 검출을 위한 것과 동일한 모듈을 사용하여 하이브리드화시킨다. 본 발명자들은 이 접근법을 "미소구-면역-PCR" (MSiPCR)로 명명한다. 세포 선별 및 농축 . 본 발명자들의 프런트-엔드 모듈을 통하여, 실험실 규모의 형광 활성 세포 분류기 (FACS)와 유사한 미세유체 전기활성 (EAP) 중합체 세포 분류기를 사용함으로써 특정 세포를 선별하고, 농축시킬 수 있다. 모듈은 큰 부피 중의 묽은 세포 농축물 (1 ml당 소수의 박테리아)을 농축시킴으로써, 많은 세포의 배경으로부터 최적의 세포 (모든 말초 혈액 단핵구 세포로부터 오직 활성화된 T 세포만)를 분류함으로써 시스템의 작동 범위를 증가시킨다. 상기 모듈에서, 본 발명자들은 유체역학적 및/또는 관성 집속을 사용하여 세포를 정렬시킨 후, EAP 작동기를 사용하여 형광 트리거에 기반하여 분류한다. 본 발명자들은 25,000개의 세포/초 과량의 속도로 분류할 수 있는 기술적 잠재능을 입증하였다. 기선 핸드헬드 분석기 하드웨어 플랫폼은 미생물 DNA 샘플의 iMFC 프로세싱을 지원하는 데 요구되는 모든 필수 하드웨어 작동을 제공한다. 사용자는 컴퓨터 USB 포트를 통해 하드웨어 플랫폼과 상호작용한다. 일단 iMFC를 하드웨어에 삽입하고, 리드를 닫고 나면, 사용자는 원하는 검정법을 위한 구체적인 프로세싱 스크립트를 선택한다. 스크립트 개시 후, 핸드헬드는 완료시까지 사용자와의 상호작용 없이 작동한다. 작동하는 동안 영상은 핸드헬드에서 호스트 PC로 전송되고, 여기서 분석된다. 작동 완료시, 분석 및 결과는 사용자 리뷰를 위해 스크린 상에 표시될 것이다. 하드웨어는 바람직하게, 총 부피가 1 ft 3 미만, 바람직하게, 200 in 3 미만인 소형 휴대용 장치에서 세포 용해, 정제, 증폭 및 검출이 이루어질 수 있도록 디자인된다. 한 실시양태에서, 하드웨어 크기는 4.75 in. (깊이) x 6.25 in. (너비) x 5 in. (높이)로, 총 부피는 148 in. 3 이다. iMFC 상에서, 막 밸브 및 액체 유체 유동은 정압에 의해 제어된다. 공압 서브시스템은 핸드헬드 분석기 (HHA) 중의 모든 공압 컴포넌트를 상호 연결하고, iMFC 상에서 상기 컴포넌트의 출력 값을 유입 포트로 루트를 따라 전송하는 맞춤형 아크릴계 매니폴드에 집중되어 있다. 상기 매니폴드는 iMFC 상에서의 미세유체 밸브 막 작동을 위해 적절한 조절된 압력 (18 psi)으로 공기 부피를 유지시키기 위해 축압기를 포함한다. 단일 솔레노이드는 검정 프로세싱 동안 어느 시점에서든 iMFC에 구동 압력을 가하도록 일으키는 데 사용된다. 상기 구동 압력 포트는 (통합형 매니폴드에 탑재된) 압력 조절 장치를 통해 루트를 따라 진행되고, 이로써, 구동 압력은 임의의 주어진 HHA에 대하여 0-10 psi로 조정될 수 있다. 하기 표 1은 기능성 컴포넌트 및 그의 용도 및 기선 시스템에서의 실행을 보여주는 것이다. 증폭 (PCR) 및 검출 모듈을 지원하는 하드웨어는 기선 iMFC에 관한 설명의 일부로서 하기에서 상세하게 기술된다. 제2 열에는 기능성 컴포넌트의 용도가 열거되어 있고, 마지막 열에는 원하는 수행 능력을 달성하기 위해 하드웨어 플랫폼 상에서 실행되는 본 발명자들의 기술적 접근법이 열거되어 있다. <표 1> 기선 iMFC 및 iMFC 모듈 iMFC 소모재는 (1) 샘플 용해, 정제, PCR, 및 검출을 수행하고, 필요한 건식 시약 모두를 수용하는 카드, 및 (2) 건식 시약의 무결성을 손상시키지 않도록 모든 액체 시약을 따로 담고 있는 시약 보관 소자를 포함한다. iMFC가 모듈 방식으로 디자인되었기 때문에 - 즉, 적용 특이 모듈은 일반 카드에서 어셈블리되기 때문에 - 새 적용을 위한 iMFC는 간단하게 모듈을 교체함으로써 쉽고 빠르게 개발될 수 있다. 이러한 다용도 특징을 통해 가장 복잡한 컴포넌트가 신규 카드를 다시 디자인하고, 개발하고, 제조할 필요가 없게 된다. 일단 제작되고 나면, 동일 카드가 매우 다양한 적용에 사용될 수 있으며, 이로써, 비용은 절감되고, 개발 시간도 단축될 수 있다. 미세유체 카드. 카드는 정압-구동 유동을 이용하고, (1) 유체 채널, (2) 유체 유동을 제어하는 22개의 막 밸브, 및 (3) 유체 채널로부터의 기포 제거를 위한 벤트를 포함하는 3개의 기능층으로 이루어진다. 이들 기능층은 함께 2개의 사출 성형된 부분으로 둘러싸여져 있는 9개의 라미네이트 층으로 구성된다. 7개의 모듈이 카드 상에 미리 탑재되는데, 4개 (용해 모듈, 정제 필터, PCR 마스터 믹스 챔버, 및 프라이머 챔버)는 상부 표면에, 및 3개 (PCR 챔버, 교반 막대 믹서 챔버, 및 검출 챔버)는 하부 표면에 탑재된다. 관심 표적을 감지하는 DNA 마이크로어레이를 포함하는 광도파관 칩은 검출 챔버에 부착되어 있다. 시약 블록. 사용자가 본 프로그램을 시작할 때, 핸드헬드 하드웨어 중의 팽창식 블래더는 날카로운 것 위에서 시약 블록을 프레싱하여 호일 시일에 구멍을 뚫고, 이는 결국 액체 시약을 방출시킨다. 정압-구동 유동시, 공기는 시약 블록 중의 각 챔버 내로 진입하게 되고, 액체 시약을 배출구 바이어스(outlet bias)를 통해 카드 내로 유입되도록 구동시킨다. 카드 상의 압축성 개스킷은 시약 블록-카드 계면에서 유체 또는 공기가 누출되지 못하게 이를 막는다. 하기 표 2는 DNA 분석을 위해 시약 블록에 보관될 수 있는 액체를 확인시켜 주는 것이다. 상이한 적용 (mRNA 또는 단백질 분석)을 위한 것으로 디자인된 카드는 상이한 시약을 가지게 될 것이다. 시약 블록은 또한 카드를 통해 유동하는 시약을 수집하기 위해 흡착성 물질을 함유하는 폐기물 저장소를 포함한다. 시약 블록은 바람직하게는 생물학적 검정 분석에 요구되는 모든 액체 시약을 프리패키지된 단일의 포맷으로 함유한다. 하기 표에는 DNA 분석을 위해 현재 사용되고 있는 시약이 열거되어 있다. 완충제 명칭은 완충제 용도 및 정확한 화학 제제와 함께 명시된다. 시약 블록은 일반용이고, 필요한 시약은 iMFC에 의해 수행되는 생물학적 검정법에 의존하게 변경될 것이다. 본 발명자들의 기술적 접근법은 동일한 패키지를 사용하지만, RNA 바이러스 검출, mRNA 검출, 및 단백질 검출을 위한 새로운 검정 능력을 지원하기 위해 상이한 시약으로 충전시키는 것이다. <표 2> 용해. 시약 블록으로부터의 액체 방출 후, 자동식 프로그램에서 다음 단계는 용해이다. 심지어 포자 샘플까지도 취급할 수 있는 용해 모듈은 3개의 챔버: 샘플 챔버, 비드 비팅 챔버 (포자 용해시), 및 결합제 챔버로 이루어진다. 시약 블록으로부터의 용해 완충제가 샘플 챔버 내로 유동한 후, 모터 작동으로 용해 완충제는 샘플과 혼합하게 된다. 이어서, 혼합된 샘플은 비드-비팅 챔버 내로 유동하게 되고, 여기서, 제2 모터는 3 min 동안 작동하여 유리 비드를 교반하고, 비드 비팅을 통해 포자 샘플을 용해시킨다. 이어서, 용해된 샘플은 결합제 챔버로 진입하게 되고, 여기서, 구아니디니움 히드로클로라이드 및 소듐 비술페이트 (결합제)의 고체 혼합물이 샘플 중에 용해되어 다음 단계에서의 DNA의 정제 필터에의 결합을 촉진시키게 된다. 본 접근법에 대한 개념 증명으로서, 본 발명자들은 용해 모듈에 의해 용해된 B. 섭틸리스( B. subtilis ) 포자 샘플로부터 용해 효율 데이터를 얻었다. 포자는 도전 과제로서 가장 어려운 용해 상황을 나타내는 것이다. 비포자 적용시, 비드-비팅 챔버는 디자인을 간소화하고, 비용을 절감하기 위해 모터가 없는 챔버 모듈로 교체될 수 있다. 정제. 본 발명자들은 미세유체 DNA 정제를 위한 기술적 접근법을 개발함에 있어 몇가지 도전 과제에 직면하게 되었다. 예를 들어, 본 발명자들은 포자 샘플을 성공적으로 용해시키고 정제하기 위해서는 다회 원심분리 단계와 함께 7 단계가 요구되고, 30 min이 소요되는 실험실 방법을 모사하는 접근법을 개발하여야 했다. 추가로, 본 발명자들은 6 ㎕의 제1 분획 중에서 DNA를 용리시켜야 했다. 실험실 검정법에서, 정제된 DNA는 전형적으로는 더 큰 부피 (예컨대, 20 ㎕) 중에서 용리된 후, 이어서, PCR 증폭을 위해 더 작은 부피의 분취량 (1-3 ㎕)이 사용된다. 이러한 상황에서, DNA는 혼합되고, 그러므로, 용리율은 전체 20 ㎕에 걸쳐서 평준화된다. 유동 대부분이 층류 유동이기 때문에, 미세유체 접근법은 혼합을 거의 포함하지 않으며; 그러므로, 최고 농도의 용리 DNA는 제1 분획 중에 존재하여야 한다. <표 3> 용해 후 iMFC 상에서, 샘플은 정제 모듈을 통해 유동하고, DNA는 필터에 결합하고, 남은 용해된 샘플 내용물은 폐기물 저장소로 유동하게 된다. 이어서, 시약 블록으로부터의 세척 완충제는 필터를 통해 유동하여 잔류 불순물을 제거하고, 이 또한 폐 저장소에 수집된다. 정제 모듈을 통한 공기 취입으로 필터를 건조시킨 후, 시약 블록으로부터의 용리 완충제를 건조시키고 (제1 분획에서의 유의적인 용리를 달성하는 데 중요한 측면은 용리 완충제의 pH이다), 이는 그의 유동에 따라, PCR용 제제 필터로부터 정제된 DNA를 제거한다. 하기 표 4는 미세유체 카드 상에서 정제된 E. 콜라이 샘플에 관한 3회의 반복 실험으로부터 얻은 데이터를 나타내고, 이는 상기 결과를 표준 정제 필터로부터 얻은 결과와 비교하는 것이다. 각 경우에서, 최고 농도는 제1 분획에서 보여지고 있다는 것이 명백하다. 각 분획은 용리 완충제 중 ~6 ㎕의 DNA를 나타낸다. <표 4> PCR 증폭 및 표지 . 정제된 DNA를 필터로부터 운반하면서, 용리 완충제는 동결건조된 마스터 믹스를 함유하는 PCR 마스터 믹스 챔버를 충전시킨다. 이어서, 재수화된 마스터 믹스는 프라이머 챔버 내로 유동하고, 건조된 프라이머를 재수화시킨다. 본 발명자들은 일반 PCR 마스터 믹스 모듈이 재사용될 수 있도록 하기 위해 프라이머 및 마스터 믹스를 분리시켰다. 올리고뉴클레오티드의 동결건조는 신속하게 이루어지고, 이러한 접근법을 통하여 본 발명자들은 신생 위협을 시험하는 키트의 신속한 활용을 지원할 수 있다. 재수화 단계 후, 마스터 믹스 및 프라이머와 함께 샘플을 PCR 챔버로 진입하게 되고, 이어서, 여기서 샘플 DNA는 증폭된다. (1) 알루미늄 PCR 모듈 표면, 및 (2) >15℃/s (정확도 ±1℃)로 램핑할 수 있는 신규한 TEC 어셈블리라는, 2가지 중요한 특징을 통하여 본 발명자들은 신속한 PCR을 달성할 수 있다. PCR 모듈은 두 TEC 어셈블리 사이에 끼여 있다. PCR 마스터 믹스는 2개의 25 ㎛ 알루미늄 벽으로 외함되어 있는 1 mm 높이의 아크릴계 챔버에 담겨 있다. PCR 챔버의 알루미늄 표면을 통해 열은 TEC 어셈블리로, 및 그로부터 액체 PCR 믹스로 빠르게 전도될 수 있다. 비교로서, 50 ㎛ 두께의 플라스틱은 램프 속도를 ~3X만큼 하향으로 저속화시킨다. SRI는 맞춤형 TEC 어셈블리를 디자인하고, 시험하였다. 본 발명자들은 제작을 위해 상기 디자인을 RMTltd로 이행시켰다. 맞춤형 SRI 어셈블리는 히트 싱크, TEC, 피드백 센서 (써미스터), 및 상기 센서를 둘러싸고 있는 질화알루미늄 (AlN) 열 스프레더를 조합한 것이다. 각 써미스터 센서는 HHA가 임의의 센서 제조 허용 오차를 상쇄시킬 수 있도록 보정된다. 본 발명자들의 PCR 시스템에 대한 개념 증명으로서, 본 발명자들은 2011년 독일 집단 발병으로부터의 E. 콜라이 O104:H4 병원체와 연관된 집합성 부착성 핌브리아에(AGG: aggregative adherence fimbriae) 및 시가(Shiga) 독소(STX2) 유전자에 대한 이중 PCR 검정법을 고안하였다. 집단 발병이 시작된 직후 BGI에 의해 업로딩된 서열 분석에 기초하여 독특한 영역에 대한 프라이머 및 프로브를 선택하였다. 벤치탑 장치를 사용하는 실험실용 검정법을 이용하여 AGG 및 STX2 표적을 위한 프로브 선택 및 프라이머 최적화를 확립하였다. 일단 확립되고 나면, 검정을 SRI 미세유체 PCR 시스템으로 이행시켰다. SRI PCR 시스템은 열 전도 및 온도 균일을 위해 최적화된 알루미늄 PCR 챔버, 및 신속한 온도 사이클링을 위한 신규한 써미스터-구동 TEC 디자인을 이용하기 때문에, 알루미늄 챔버를 패시베이션시키는 데 사용되는 애주번트를 포함하는 맞춤형 마스터 믹스 제제를 통하여 16 min 내에 AGG 및 STX2 표적을 이중으로 증폭시킬 수 있었다. 결과는 40회 PCR 사이클 (95℃ 변성 단계, 62℃ 어닐링 및 73℃ 연장)의 오버레이를 제공하였다. 각 사이클은 40회 사이클 동안 21 s씩 계속되고, PCR 써모사이클링은 총 14 min 동안에 걸쳐 지속된다. 나머지 시간은 초기 변성 및 우라실-DNA 글리코실라제 (UNG) 처리를 위한 시간이다. 본 발명자들의 맞춤형 마스터 믹스는 증폭의 일부로서 dUTP를 함유하고, UNG 단계는 확실하게 하드웨어 플랫폼의 다른 사용 중간에 오염이 없도록 한다. 본 발명자들은 5개의 상이한 유입 카피수 (10, 50, 100, 500, 및 1,000개)로 16 min PCR을 시험하였고, AGG 및 STX2 유전자, 둘 모두에 대한 증폭률을 정량화하였다. 추가로, 본 발명자들은 12 min PCR 프로토콜을 이용하여 카피수가 500개인 유입을 시험하였고, 사이클 시간이 사이클 1회당 21 s에서 15 s로 단축되었다는 것을 관찰하게 되었다. 또한, 단지 10 min의 사이클링 시간 동안 2 min의 UNG 처리 및 초기 변성이 사용되었다. 하기 표 5에는 각 샘플 중의 앰플리콘을 정량화하고, 증폭률을 측정한, 앰플리콘 표준에 대한 네스티드 PCR의 결과가 제시되어 있다. 전반적으로, 본 발명자들은 모듈식 PCR에 대해 1.6x10 9 내지 3.4x10 11 의 증폭 범위를 가졌다. 추가로, 모듈식 PCR 시스템으로 생성된 앰플리콘은 SRI 모듈식 하이브리드화 시스템을 검출되었다. <표 5> 검출. 특이 표적의 존재를 검출하기 위해, 증폭된 샘플을 광도파관 칩 상의 마이크로어레이에 하이브리드화시킨다. 하이브리드화를 촉진시키기 위하여, 시약 블록으로부터의 SSPE 완충제가 먼저 증폭된 샘플에 첨가된다. 최적의 샘플 대 SSPE 완충제의 비를 달성하기 위해 2개의 계량 챔버가 사용된다. SSPE 및 PCR 생성물을 혼합한 후, 검출 챔버 안으로 밀어 넣고, 이 챔버는 광도파관 칩 상의 마이크로어레이 상에서 샘플을 인큐베이션시킨다. 본 발명자들의 맞춤형 TEC 어셈블리를 사용하여 5 min의 온도 제어식 하이브리드화 후, 추가의 SSPE 완충제는 검출 챔버 내로 유동하여 샘플을 세척해 내고, 하이브리드화되지 않은 앰플리콘을 제거한 후, 이어서, 온도를 승온시켜 교차 하이브리드화 또는 잘못된 프로브에 비특이적으로 결합된 임의의 앰플리콘을 제거한다. 최종적으로, 맞춤형 조명, 수집, 및 영상화 광학 블록을 이용하여 DNA 마이크로어레이를 영상화한다. 광학 장치 블록은, 레이저 조명을 수행하고, 마이크로어레이 하이브리드화를 영상화하는 필요한 모든 것을 포함하는 독립형 서브컴포넌트로서 디자인된다. 광학 장치 블록은 HHA 내로 설치되기 이전에 미리 정렬되고, 조정될 수 있다. 일단 상기와 같이 미리 정렬되는 단계가 수행되고 나면, 설치 시점에는 추가로 조정할 필요가 없다. 레이저 조명 광학 장치는 선 발생 레이저 다이오드 모듈 및 터닝 미러로 이루어진다. 레이저 조명에 대한 표적은 마이크로어레이 칩 상의 격자이다. 선 발생 레이저 다이오드는 직사각형 패턴으로 635 nm의 10 mW 빔을 방출하여 마이크로어레이에의 하이브리드화를 시각화하는 데 사용되는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 nm 염료 분자를 여기시킨다. 선 발생 다이오드 모듈은 기성 패키지 (코히런트(Coherent))로 통합된 집속 및 선 발생 광학 장치를 가진다. 마이크로어레이 영상화 광학 장치는 폴딩된 1:1 릴레이 렌즈 및 간섭 필터를 포함한다. 맞춤형으로 디자인된 릴레이 렌즈군은 최대 집광력을 위해 (f/1.5로) 빠르다. 크기는 작다 (직경 12 mm 및 길이 < 27 mm). 릴레이 렌즈는, 레이저 여기광 및 산란광이 본 발명자들의 모노크롬 CCD 영상 장치에 도달하지 못하게 거부되도록 하는 데 사용되는 (유전체 스택으로 제조된) 2개의 간섭 필터로 빛을 충분히 시준하도록 디자인된다. CCD 칩 및 전자 기기는 잡음을 감소시키고, 신호 손실을 최소화하기 위해 마이크로어레이 영상화 광학 장치에 직접 연결된다. CCD는 CCD를 냉각시킬 필요 없이, 마이크로어레이 분석에 충분한 판독 속도 (4 프레임/s), 및 마이크로어레이 영상화 분석에 충분한 신호 대 잡음비가 가능하다. 광학 시스템에 대한 개념 증명으로서, 본 발명자들은 SRI 알루미늄 PCR 챔버 및 TEC 어셈블리에 의해 생성된 PCR 앰플리콘을 하이브리드화하고, 기술된 광학 시스템을 사용하여 결과를 판독하였다. 시험 프로토콜은 (본 발명자들의 고속 DNA 합성 장치에 의해 확인된) 스폿팅된 프로브, 37℃에서 5 min 동안의 내장형 인큐베이션, 37℃에서 60℃로 온도를 증가시키면서 수행되는 다회에 걸친 엄격한 세척, 및 자동식 영상 포착용 광학 장치 패키지를 포함하였다. 본 발명자들은 오직 대조군 (A3) 분석물만을 포함하는 음성 대조군, 10개의 카피로부터 PCR로의 생성된 앰플리콘, 및 50개의 카피로부터 PCR로의 생성된 앰플리콘을 하이브리드화하였다. 음성 대조군 샘플, 및 AGG 및 STX2에 대한 개별 프라이머로부터 증폭된 샘플을 선택적으로 하이브리드화함으로써 검정 결과는 입증되었다. 하이브리드화의 영상은, 표적 프로브가 10개 및 50개의 유입 주형 경우, 둘 모두에서 뚜렷이 육안상 관찰되고, A3 대조군 경우에는 존재하지 않는다는 것을 입증하였다. iMFC 소모재의 저비용 대량 제조. 본 발명자들은 대량 생산을 위한 iMFC 제작 비용의 절감을 유도하는 제조 프로세스 계획을 개발하였다. 사출 성형은 간단하고, 저렴한 부품 제작 방법이기 때문에, 본 발명자들은 카드의 상부층 및 하부층, 둘 모두 뿐만 아니라, 용해 모듈 및 시약 블록도 사출 성형하였다. 카드의 나머지 라미네이트 층은 자동식 롤-투-롤 프로세스로 제작되며, 여기서, 물질의 롤은 함께 적층되고, 레이저로 절단된 후, 또 다른 롤로 재권취되는데, 이들은 모두 신속한 파이프라인 방식으로 동일한 장치 시스템 상에서 이루어진다. 대략 수백만 개의 카드가 대량으로 생산됨과 동시에, 비용은 카드 1개당 $10 정도로 낮게 절감될 수 있다. DNA 검출 접근법. 본 발명자들의 시스템은 앰플리콘에 대한 모든 가능한 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 어레이를 10시간 미만인 시간 내에 포토리소그래픽 방식으로 합성할 수 있는 능력을 가지고 있는 바, 이에, 본 발명자들은 적절한 프로브를 선택할 수 있고, 약 2주 내에 벤치 PCR 검정법을 본 발명자들의 플랫폼으로 이행시킬 수 있다. 본원에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 증폭 검정법을 개발할 수 있고, 이를 iMFC PCR로 이행시킬 수 있으며, E. 콜라이 O104:H4에 대한 프로브를 선택할 수 있는 상기 능력을 성공적으로 입증하였다. 바이러스 RNA 검출 접근법. RNA 바이러스 검출은 RNA 바이러스 게놈의 역전사 및 증폭을 위한 미세유체 검정법의 경우, DNA 검출과 동일한 모듈 모두를 사용한다. 본 발명자들은 계절성 인플루엔자 및 돼지 인플루엔자를 구별할 수 있는 검정법을 이용하여 상기 접근법의 개념 증명을 입증하였다. 인플루엔자 검정법을 개발하는 데 취한 접근법은 일반화가 가능하고, 이는 RNA 바이러스에 대한 작용제를 선택하는 것과 동일한 접근법을 사용할 수 있다. 인플루엔자 확인을 위해, 본 발명자들의 제1 단계는 인플루엔자 A 기질 유전자의 세그먼트 뿐만 아니라, H1 (돼지) 및 H3 (계절성) 균주를 구별짓는 헤마글루티닌 유전자의 일부를 선택적으로 증폭시키는 프라이머를 확인하는 것이었다. 본 발명자들의 RT-PCR 프로토콜은 42℃에서의 5 min의 역전사 (RT) 단계를 포함하는데, 여기서, 역 프라이머는 RNA 표적에 어닐링되고, 제1 DNA 가닥의 합성을 개시한다. 이어서, 2 min의 역전사 효소 비활성화 및 동시 Taq 폴리머라제 "고온 개시(hot start)"를 통해 정방향 프라이머는 제1 DNA 가닥에 어닐링하여 제2 DNA 가닥을 합성할 수 있도록 허용된다. 이 시점에서, 95℃에서 10 s 동안의 변성, 62℃에서 20 s 동안의 어닐링, 및 75℃에서 5 s 동안의 연장으로 40회 PCR 사이클은 시작된다. 일단 벤치탑 장치에서 증폭이 잘 이루어지고 나면, 본 발명자들은, 본 발명자들의 iMFC에서 증폭을 모의하는 본 발명자들의 모듈식 증폭 시스템으로 이동한다. 상기 시스템에서의 온도 램핑은 빠르기 때문에, 상기 기술된 RT-PCR 프로토콜은 <33 min이 소요된다. 먼저 겔 전기영동을 사용한 후, 이어서, 마이크로어레이 상에서 RT-PCR 생성물을 평가한다. CA 2009 돼지 플루 균주 (H1N1) 및 HK 68 계절성 균주 H3N2 (삼중 증폭)에 대한 기질 및 헤마글루티닌 유전자의 모듈식 증폭에 대한 겔 전기영동 결과를 얻었다. 244 bp의 앰플리콘은 인플루엔자 A 기질 유전자를 나타낸다. H1 균주에 대한 헤마글루티닌 앰플리콘은 173개의 염기쌍인 반면, H3 앰플리콘은 177개의 염기쌍이다. DNA 마이크로어레이 상의 서열 특이 프로브에 대한 하이브리드화를 통하여 H1 및 H3 균주를 분명하게 구별할 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 감응성 및 선택적 검출을 달성하는 제1 단계는 본 발명자들의 관심 표적에 대한 전체 앰플리콘에 대해 적용되는 20-25 mer 프로브를 함유하는, 포토리소그래픽 방식으로 합성된 프로브 선택 칩을 제조하는 것이다. 1일 미만인 기간 동안 관심 앰플리콘에 대한 모든 가능한 프로브를 합성할 수 있는 본 발명자들의 능력은 본 발명자들이 감응성 및 특이 프로브에 대해 실험적으로 시험할 수 있다는 것을 의미한다. 이어서, 본 발명자들은 마이크로어레이에 대해 하이브리드화 실험을 수행하여 가장 고감도이고, 특이적인 프로브를 선택하였다. H1 및 H3을 쉽게 구별하는 프로브 선택을 확인하였고; 앰플리콘의 수개 영역이 두 앰플리콘을 쉽게 구별짓는다. 본 발명자들의 핸드헬드 장치에서 사용되는 에폭시로 관능화된 현미경 슬라이드 또는 도판관 칩 상의 스폿팅을 위해 아민 변형으로 최적의 프로브를 피팅할 수 있다. mRNA 검출 접근법. 말초 단핵구 세포 (PBMC)의 유전자 발현 프로파일링은 질환 상태, 환경 노출, 및 감염의 전조 증상 진단을 모니터링하는 유용한 방법이다. mRNA 발현 분석을 수행할 수 있는 본 발명자들의 iMFC는 마이크로어레이 상에서 약간 변형된 버전의 하드웨어 플랫폼 - 추가 TEC 및 조명 균일성 증가를 이용하고, 이는 하기의 것을 수행할 수 있다: - PBMC 선별 및 용해: 전혈로부터의 PBMC 정제를 위한 시판용 크기 배제 필터 및 본원에 기술된 세포 선별기 모듈을 이용하여 수행. - mRNA 정제: 폴리-T 올리고뉴클레오티드로 코팅된 미소구를 이용하여, 용해된 세포로부터 mRNA를 포획함으로써 수행. - T7 선형 증폭 및 표지: T7 증폭 및 표지용 현 PCR 챔버 및 상업적으로 이용가능한 키트를 이용하여 수행. - 고속 하이브리드화: 하이브리드화의 동적 측정을 사용하여 분석물 농도를 측정함으로써 수행; 이는 유전자 발현 하이브리드화 소요 시간을 수시간에서 수분으로 단축시킴. - T7 증폭은 현존 iMFC PCR 모듈 및 상업적으로 이용가능한 키트에 영향을 준다. mRNA 정제. mRNA 정제를 위해, 본 발명자들은 mRNA를 폴리-T 코팅된 비드에 하이브리드화시킬 수 있고, 오염 물질을 세척해 낼 수 있고, 이어서, 폴리-T 비드로부터 mRNA를 유리시킬 수 있는 미세유체 정제 모듈을 이용한다. 본 발명자들은 용액 중에서 ~5 ㎛ 미소구 비드를 유지시키는 혼합기, 및 세척 단계 후 포획된 mRNA를 비드로부터 용융시키는 새 TEC를 이용한다. 본 발명자들은 5 ㎛ 비드가 벨로우 혼합 챔버와 필터 사이를 잘 이동하는지 확인하기 위해 장치를 시험하였다. 본 발명자들은 또한 폴리-T:mRNA 이중체가 변형될 수 있도록 허용하기 위해 유체가 ~80℃까지 가열될 수 있다는 것을 입증하였다. 고속 하이브리드화. 하이브리드화 시간을 단축시키고, 반복성을 개선시키기 위해, 본 발명자들은 동적 속도 파라미터로부터 농도를 추론한다. 프로브 개수와 비교하였을 때 표적 전사체의 개수가 그를 초과하는 경우, 신호 값 대 시간은 동적 곡선을 따라야 한다: Y = C (1 - e -rt ), r = k 오프 + [A] k 온 상기 방정식에서, Y는 배경이 감산된 신호이고; k 오프 및 k 온 은 온도, 유전자 서열, 및 프로브 변이에 의존하는 동적 파라미터이고; [A]는 용액 중 표적 유전자의 농도이고; C는 빛의 강도, 프로브 밀도, 표적 밀도, 및 동적 파라미터를 비롯한, 다중 인자에 의존하는 환산 계수이다. 본 발명자들의 프로브 선택 기술은 다중 농도 간의 하이브리드화 신호의 시계열에 상기 방정식을 피팅함으로써 k오프 및 k온을 추정한다. 상기 추정치는 실시간으로 저장되고, [A]를 추정하는 데 사용될 수 있다. 빛의 강도 및 프로브 합성 밀도 변동이 파라미터 C에는 영향을 주지만, 지수 함수 내에서 변수에는 영향을 주지 않기 때문에, 상기 동적 기술은 칩-대-칩 및 동일-칩 복제 반복성을 유의적으로 개선시킨다. 개념 증명으로서, 본 발명자들은 합성된 25개의 염기쌍으로 이루어진 올리고머 표적으로부터 출발하여, 동적 속도 접근법을 이용함으로써 실험하였다. A3 대조군 표지된 올리고뉴클레오티드에 대한 한 프로브의 동적 반응에서, 각 선은 상이한 농도의 A3: 50 nM, 100 nM, 300 nM에 대한 반응을 나타내는 것이다. 비선형 최소 제곱 피트는 각 시계열에 대한 파라미터 C 및 r을 추정하는 데 사용된다. 이어서, 다중 농도 [A]에서의 실험을 통해 r과 [A] 사이의 아핀 관계를 밝힌다. 본 발명자들은 r과 [A] 사이의 감응성이고 반응성인 관계를 형성하는 조건을 확인한다. 본 발명자들의 데이터는 관계가 오른쪽 방향으로 존재할 수 있으며, 여기서, [A] = (50, 100, 300) nM일 때, r = (0.0031, 0.0033, 및 0.0058) s-1라는 것을 나타낸다. 동적 곡선 피팅의 추가 이점은 심지어 평형 값 C가 동적 속도 r보다 더 우수한 것으로 입증된 경우에도, 피팅 프로세스는 단기간의 잡음의 평균을 구할 수 있다는 점이다. 본 발명자들은 또한 동적 파라미터를 측정할 수 있는 능력은 iMFC의 소산파 사용에 의존하는데, 이는 칩 표면에 결합된 형광 분자만을 오직 여기시킴으로써, 심지어 표적 용액이 제자리에 있는 동안에도 높은 신호-대-배경 비를 얻게 한다는 것에도 주목한다. 단백질 검출 접근법. 단백질 바이오마커를 포함할 수 있는 iMFC 플랫폼의 검출 능력을 확장시키는 한가지 방법은, 표적 항원이 존재할 때, 비선형 증폭 가능한 DNA 표적을 형성하는 올리고뉴클레오티드로 표지된 항체를 사용하는 미소구 면역검정법이고, 본 발명자들은 SRI의 입증된 미소구 면역-PCR 검정법 (MSiPCR)에 기반한 iMFC 플랫폼을 포함하는 면역검정법 모듈을 개발하였다. 표적 항원의 초기 포획을 위해 비오티닐화된 표적-표적 항체를 스트렙트아비딘으로 코팅된 6 ㎛ 폴리스티렌 비드 상에 접합시킨다. 표적 단백질의 제2 포획 이벤트를 위해 별개의 표적-특이 항체를 한 올리고뉴클레오티드와 화학적으로 접합시킨다. 두 단백질 포획 이벤트 사이에 철저한 세척을 통해 임의의 비결합 표적 뿐만 아니라, 유리 접합체를 세척해 낸다. 이어서, 남은 비드 부분은 택맨(taqman) 프로브와 함께 특이 표지된 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨다. 이어서, 증폭된 핵산 신호를 검출 및 판독을 위해 마이크로어레이 상에서 하이브리드화시킨다. 본 발명자들은 본 발명자들의 벤치탑 검정법을 iMFC 플랫폼으로 이동시켰고: iMFC 플랫폼에 대한 본 발명자들의 개념 증명 모듈식 시스템은 핵산 증폭 이후의 비드 포획을 위한 필터와 함께, 세척 및 인큐베이션 단계를 위해 벨로우즈 혼합기를 도입한다. 시스템 개선. 마이크로어레이 격자에 더욱 균일한 패턴을 제공하기 위해, 및 532 nm 여기를 사용하여 검출 신호-대-잡음비를 개선시키기 위해 광학 장치 블록을 변형시킬 수 있다. 여기 광원을 635 nm에서 532 nm으로 전환시키는 프로세스는 오직 격자 피치 변화에 관한 문제이다. 이러한 변형된 광학 장치 블록은 레이저 표적 조명 광학 장치 및 마이크로어레이 영상화 광학 장치, 둘 모두로 이루어져 있다. 레이저 표적 조명 광학 장치는 소형 다이오드-펌프 고체 상태 (DPSS) 레이저 모듈, 스캐닝 및 집속 광학 장치, 및 2D 스캐닝 미세 전자 기계 시스템 (MEMS) 미러를 이용한다. DPSS 레이저 모듈은 Cy3 염료 분자를 여기시키기 위해 532 nm의 40 mW 레이저 빔을 출력할 수 있다. 빔은 집속 광학 장치를 이용하여 MEMS 미러 상에 집속될 수 있다. 2D MEMS 미러는 직사각형 상에 스폿을 스캐닝하고, 빔을 격자를 향하게 겨냥할 수 있다. 스캐닝 미러 반사 후, 빔은 스캔 렌즈에 도달하는데, 이 스캔 렌즈는 마이크로어레이 칩 상의 격자로 진입하기 이전에 빔을 시준한다. 상기 시스템은 전체 격자에 걸쳐, 및 따라서, 전체 마이크로어레이에 걸쳐 동일한 레이저 스폿을 스캐닝한다. 이는 강도가 25% 정도로 달라질 수 있는 조명 비균일성을 선 발생 광학 장치로부터 제거한다. 스캔 렌즈는 또한 본 발명자들이 마이크로어레이 칩 격자로 진입하기 이전에 빔을 시준할 수 있게 한다. 본 발명자들은 새로운 스캐닝 기술적 접근법에 관한 개념 증명 입증을 통해 입증하였다. 마이크로어레이 영상화 광학 장치는, 상이한 여기 (532 nm) 및 방출 (570 nm) 파장의 필터를 제외하고는 현 광학 장치 블록과는 변경된 차이가 없다. 참고 문헌 본 발명자들이 청구하는 발명의 실시양태는 하기를 포함한다: 1. 미세유체 연결부에, 다중 서열 증폭 및 동시 마이크로어레이 하이브리드화 판독을 통해 상이한 핵산 서열을 병렬로 검출하도록 구성된 샘플 용해, 정제, PCR 및 검출 모듈을 포함하는 자동식 핵산 분석 시스템. 2. 제1항, 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 모듈이 소산파 여기를 이용하는 마이크로어레이 스캐너를 포함하는 마이크로어레이 검출용 광학 장치 및 검출을 포함하고/거나; 검출 모듈이 온도를 통해 다중 엄격도를 제공하도록 구성된 자동식 하이브리드화 프로세서를 포함하고/거나; PCR 모듈이 단일 반응으로 역전사 및 PCR을 수행하도록 구성되어 있는 것인 시스템. 3. 제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈을 포함하는 통합형 미세유체 카드, 및 상기 카드를 수용하도록 구성된 용기, 유체 작동기를 포함하는, 상기 카드를 작동시키도록 구성된 오퍼레이터, 및 상기 오퍼레이터를 전자적으로 제어하도록 구성된 제어 장치를 포함하는 분석기, PCR 써모사이클러, 및 자동식 하이브리드화 프로세서 및 마이크로어레이 검출용 광학 장치를 포함하는 시스템. 4. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 시약을 함유하고, 그를 용해, 정제, PCR 및 검출 모듈로 전달하도록 구성된 시약 모듈을 추가로 포함하는 것인 시스템. 5. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 2,000, 1,000 또는 500 in 3 미만이고, 50, 25 또는 10 lbs미만으로 휴대용이고/거나; 분석 소요 시간이 60, 120, 180 또는 240분 미만으로 신속하고/거나; 10, 50, 500개 초과의 표적 서열을 동시에 분석하는 다중성이고/거나; 샘플 도입과 결과 표시 사이에 사용자가 개입할 필요가 없는 자동식인 것인 시스템. 6. 제1항 내지 제5항, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 단백질 분석물을 포함하고, 시스템이 핵산 서열을 포함하는 태그로 단백질 분석물을 태그부착하도록 추가로 구성되어 있고/거나; 고정된 프로브가 서열을 그의 공간적 위치에 의해 정의하고/거나; 증폭은 분석되는 서열의 개수보다 더 적은 개수의 프라이머 쌍에 의해 수행/달성되고/거나; 상이한 핵산 서열이 다중 종/유기체의 것이고/거나; PCR 모듈이 금속 (예컨대, 알루미늄) PCR 반응 챔버를 포함하고/거나; 미세유체 연결부가 기포 제거를 위해 구성된 통기성 막을 포함하고, 여기서, 통기성 막은 채널 층 아래에 위치하며, 이로써, 전체 채널이 대기압에 노출될 수 있고/거나 (특정 실시양태에서, 상기 막은 비록 그가 오직 채널 층 아래에서만 기능을 하기는 하지만, 개별 조각보다는 층으로서 제조가 더 용이하기 때문에, 카드에 걸쳐 있다); 증폭은 (개방형 튜브 등이 아닌) 소모재에 완전히 포함되어 있고/거나; 검출은 프라이머 세트보다는 (새로운 시험 구축이 더욱 용이한) 프로브 세트에 기반하는 것인 시스템. 7. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (샘플 분할 없이) 단일 베쓸에서 증폭시키도록; 혈액, 타액, GI 샘플, 뇨, 상처 면봉 채취물, 요추 천자, 비강 면봉 채취물, 수의학적 공급원 및 농업상 공급원의 분석물 샘플을 수용하고, 프로세싱하도록; 표본 수집 도구 또는 수송 매질을 통해 샘플을 수용하도록; 1-100 ul의 샘플 부피를 프로세싱하도록; 모듈식이도록 (모듈은 상이한 적용을 지원하도록 교환될 수 있다); (채널 크기 및 기포 제거에 의해 수행되는) 계량이 가능하도록; 및/또는 한 방향이고, 자기 밀봉식이 되도록 (샘플 상호 오염을 막도록) 구성된 시스템. 8. 제1항 내지 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈을 포함하는 통합형 미세유체 카드, 및 하우징 (박스) 및 하우징 내에 상기 카드를 수용하도록 구성된 용기를 포함하는 분석기를 포함하는 시스템으로서, 여기서, 분석기는 카드와 체결하여 용해, 정제, PCT (증폭 및 표지), 및 검출을 수행하고/거나; 압력 (예컨대, 샘플 수송), 자기장 (예컨대, 샘플 혼합), 온도 (예컨대, 증폭, 엄격도, 하이브리드화) 및/또는 빛 (예컨대, 하이브리드화 검출)을 통해 샘플과 상호작용하고/거나; 소산파를 샘플과 커플링하여 실시간으로 하이브리드화를 관찰하고/거나, 동역학적 성질 및 가능한 염기쌍 미스매치를 측정하여 서열 정보를 생성함으로써 검출을 수행하는 것인 시스템. 9. 제1항 내지 제8항, 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈을 포함하는 통합형 미세유체 카드 (카트리지)를 포함하는 시스템이며, 여기서 카드는 질병 유형 (예컨대, 호흡기 질환)에 특이적이도록; 환자 유형 (예컨대, 소아 환자)에 특이적이도록; 병원체 유형 (예컨대, 생물전쟁 작용제)에 특이적이도록; 개체 (예컨대, 약리유전체학)에 특이적이도록; 환자 특이 정보에 대한 독특한 식별자를 포함하도록; 1회 사용 동안 멸균성을 유지하고, 상호 오염을 최소화하도록; 롤-투-롤 제조 단계를 사용하여 생산되도록 구성되어 있고/거나; 폴리카르보네이트 섀시, 금속 호일 PCR 챔버, 아크릴계 성분, 통기성 막 물질, 및/또는 폴리우레탄 시일로부터의 것인 시스템. 10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 또는 세포 정렬을 위해 유체역학적 및/또는 관성 집속을 제공하도록 구성되어 있고, 분류를 위해 구성된 미세규모 전기활성 중합체 (EAP) 작동기를 포함하는 미세유체 형광 활성 세포 분류기 (μFACS)와 기능적으로 통합된 것인 시스템. 11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 시스템을 사용하여 다중 서열 증폭 및 동시 마이크로어레이 하이브리드화 판독을 통해 상이한 분석물 핵산 서열을 병렬로 검출하는 단계를 포함하는 방법. 추가 실시양태 및 그의 예에 관한 상세한 설명 : 신규한 현장 현시, 휴대용, 및 고도 통합형 적용을 위한 고성능 형광 활성 분류 (FACS). 고급 시판용 FACS 장치는 하전된 소적 내에 함유되어 있는 세포를 정전기적 방식으로 편향시킴으로써 10,000 내지 40,000개 분류/s의 분류 속도를 달성한다. [1, 2] 이는 예를 들어, 면역요법을 위한 암 표적화 T 세포 단리, 조직 조작을 위한 줄기 세포 농축, 및 조작 또는 추가 분석 (예컨대, DNA 서열분석, RNA 발현, 및 형광 계내 하이브리드화)을 위한 특이 세포의 분리와 같은, 매우 다양한 적용에 응용될 수 있다. 그러나, 상기 장치는 전문 조작자를 필요로 하는 고가의 대형 장치인 바, 따라서, 현장 현시 또는 휴대 적용에는 적합하지 않다. 추가로, 그의 모놀리식 성질은 다른 장치 또는 프로세스와는 쉽게 통합될 수 없다는 것을 의미한다. 이러한 한계를 처리하기 위한 시도에서, 연구원들은 많은 다른 종류의 미세유체 FACS를 개발하게 되었다. 최근까지, 이들 장치는 느리고 (종래 FACS보다 10배 넘게 더 느리고), 대부분은 제작이 어렵거나, 또는 다르게는 제조 및 실제 적용에 부적절하였다. 펄스 레이저-활성 세포 분류 (PLACS)의 개발로, 최신 기술의 미세유체공학은 고순도로 ~10,000개의 세포/s로까지 증가하였다 [3]. PLACS에서, 세포는 플라즈마 기포를 빠르게 팽창 및 수축시킴으로써 발생되는 유체 제트를 사용하여 분류된다. 유체 장치는 간단하고, 저렴하며, 일회용인 반면, 상기 시스템은 높은 반복률의 펄스 레이저를 필요로 하는 데, 이는 고가이면서, 대형이다. 따라서, PLACS는 규모 및 비용면에서 도전 과제를 다루지 못한다. 본 발명자들은 전기 자극에 대한 반응으로 형상을 변화시키는 중합체인 EAP에 기반한 유체 작동에의 더욱 간단한 접근법을 개시한다. 이는 미세유체 장치에서 채널의 횡단면의 기하학적 구조를 변화시켜 전기영동 분리를 위한 소규모 주입을 발생시키고 [4], 채널의 유체 저항성을 변형시키고, 장애물을 제거하는 데 [5] 사용되었다. 본 발명자들은 신규한 고성능 미세유체 EAP (μEAP) 작동기를 개발하고, 이를 마이크로-FACS로 통합시켰다. 전기활성 중합체 작동. 본 발명자들의 유체 작동기는 하나 이상의 표면이 EAP를 포함하는 내장 유체 챔버를 포함한다. 한 구현에서, 챔버의 바닥은 유전성 탄성체 (실리콘)로 이루어진 얇은 (~12 ㎛) EAP 층으로 커버링된 전극이다. 개념상, 실리콘은 가요성 커패시터와 같이 작용한다. 이는 전압이 전극에 인가되었을 때에는 일그러지고, 이로써, 챔버 부피는 증가하게 되고, 유체는 챔버 내로 유입되게 된다. 전압이 해제되면, 실리콘은 이완되고, 챔버로부터 유체를 밀어낸다. EAP 작동기는 입증된 미세규모 제조 기술을 사용하여 쉽게 제작된다. 작동기 제작을 위해, 본 발명자들은 베이스 기판이 되는 인듐-주석-산화물-코팅 슬라이드 상에 전극을 패턴화한다. 이어서, 본 발명자들은 슬라이드 상에서 미경화 실리콘 층을 회전시키고, 이를 열로 경화시킨다. 채널 층 제작을 위해, 본 발명자들은 종래 소프트 리소그래피를 이용하여 미세유체 채널을 성형한다. 이어서, 본 발명자들은 채널 층을 실리콘 코팅 슬라이드에 정렬하고, 플라즈마 결합시킴으로써 장치를 완성한다. 작동기의 소프트 리소그래피와의 양립성이란, 작동기가 현존하는 큰 라이브러리의 미세유체 장치로 쉽게 통합될 수 있다는 것을 의미한다. 이는 또한 래피드 프로토타이핑을 가능하게 한다. 상기 장치는 작동을 위한 전압원만을 필요로 하기 때문에 저렴하고, 제작 접근법은 저비용 제조로 처리할 수 있다. 특정 예로, 본 발명자들은 반응 시간이 10 μs인 < 1 ㎟의 작동기를 제조하였지만; 그러나, 작동기 크기는 또한 마이크론 규모 (1, 10 또는 100 ㎛ 2 )일 수 있고, 반응 시간은 더 짧은 반응 시간인, 10, 1, 0.1 μs 미만일 수 있다. 그의 크기 옵션으로 작동기는 특히 핸드헬드 및 통합형 적용으로 쉽게 처리될 수 있고, 병렬 작동인 경우, 쉽게 증가될 수 있다. 상기 예시된 EAP 작동기 (< 20 μs)의 빠른 반응 속도는 또한 상기 작동기가 >25,000개의 세포/s인 속도로 분류한다는 것을 나타낸다. 상기 장치는 작동을 위한 전압원만을 필요로 하고, 저비용 미세제작 기술을 사용하여 구축되기 때문에, 저렴한다. 중합체로서 실리콘을 사용함으로써 소프트 리소그래피를 통하여 EAP 작동기를 미세유체 채널과 간단하게 통합시킬 수 있다. 이는 래피드 프로토타이핑 및 대량 제조 규모로 규모 확장시킬 수 있는 잠재 가능성, 둘 모두를 가능하게 한다. EAP μFACS는 핸드헬드 포맷에서 벤치탑 FACS에 등가인 처리량을 산출한다. 본 발명자들은 EAP μFACS의 성능을 최적화시켰고, 개선된 장치를 iMFC 시스템과 통합되는 세포-농축/분류 모듈로 도입하였다. 상기 모듈은 큰 부피 중의 묽은 세포 농축물 (예컨대, 환경 샘플 중 1 ml당 소수의 세포로 존재하는 박테리아)을 농축시킴으로써, 많은 세포의 배경으로부터 최적의 세포 (예컨대, 말초 혈액 단핵구 세포로부터 활성화된 T 세포)를 분류함으로써 시스템이 작동 범위를 증가시킬 수 있도록 허용한다. 미세분류기의 실시양태는 하기에서 추가로 기술한다. 분류기 디자인 . 분류기는 3가지 중요한 기능: 정렬, 검출, 및 분류를 수행한다. 본 발명자들의 디자인 (예컨대, 도 9)은 정렬을 위해 유체역학적 및 관성 집속의 조합, 및 신속한 분류를 위해 EAP 작동 사용을 비롯한, 다중의 기술 혁신을 도입한다. 종래 세포 분류기에서는 입자 또는 세포는, 기밀형 라인으로 샘플 스트림을 핀칭하는 동축 외장 유동 (coaxial sheath flow)을 사용하여 수평 및 수직 둘 모두로 집속된다. 대부분의 미세유체 장치는 평면이기 때문에, 이는 오직 한 방향으로 (즉, 수평으로) 입자를 집속시킬 수 있고; 다층 장치는 수직으로 또는 측면으로도 또한 입자를 집속시킬 수 있지만, 제조하기가 상당히 더 복잡하다. 수직 집속이 없는 경우, 입자는 채널의 높이에 걸쳐 분포될 수 있고, 이로써 속도 및 오버랩에 변화가 일어날 수 있다. 본 발명자들의 디자인에서, 본 발명자들은 유체역학적 집속을 통해 교차 영역에 수평으로 정렬시키고, 관성 집속을 통해 긴 "목부(neck)"에 수직으로 정렬시킨다. 관성 집속은 유체 속도가 입자 상에서 양력을 발생시킬 수 있을 정도로 충분히 높은 경우에 발생한다 [6]. 조합을 통해 본 발명자들은 단일-층 장치에 입자를 효과적으로 정렬시킬 수 있으며, 이로써, 본 발명자들의 간단한 제조 접근법은 유지된다. 분류를 위해, 본 발명자들은 먼저 형광을 이용하여 입자를 검출하고, 여기서, 표적화된 입자 검출시, 전압 펄스가 하나 이상의 EAP 작동기에 인가된다. 도 9에 제시된 바와 같이, 작동기는, 분류 배출구로 이어지는 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 생성한다. 도 9는 μEAP FACS의 채널 레이아웃을 보여주는 (a) EAP 미세분류기 개략도를 도시한 것이다. 삽입된 영상은 채널의 주요 기능을 보여주는 것이다. 수평 정렬은 유체역학적 집속에 의해 달성되는 반면 (좌측), 수직 정렬은 관성 집속을 통해 달성된다 (중간). 마지막으로, 표적화된 입자는 μEAP 작동기를 통해 분류된다 (우측). 확대된 노출 영상은 비분류된 입자 및 분류된 입자로부터의 스트리크를 보여주는 것이다. 유동 속도는 8 ㎕/min (107 mm/s)이고, 작동 펄스는 400 V에서 1 ms였다. 180° 다른 위상으로 작동하는 쌍형성한 작동기의 사용은 유체에 인가되는 힘을 배가시킴으로써, 및 채널 길이에 비례하는 유체 저항성을 감소시킴으로써 성능을 개선시킨다. 두 작동기를 사용할 경우, 하나는 유체는 "잡아 당기는" 반면, 나머지 다른 하나는 유체를 "밀어내고," 유체는 오직 작동기 사이의 짧은 거리 (전형적으로 ~2 mm)만을 따라 변위된다. 그에 반해, 단일 작동기를 사용할 경우, 작동기로부터 장치 배출구 (~30 mm)로의 유체 변위가 발생하게 된다. 본 발명자들의 μFACS 장치를 시험하기 위해, 본 발명자들은 에피형광 현미경, 전하 결합장치 (CCD) 카메라, 광전자 증배관, 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGA: field-programmable gate array) 기반 데이터 획득 시스템, 및 전압 증폭기로 이루어진, 검출 및 제어 시스템을 사용한다. 초기 입자 분리 입증. μEAP 분류기의 분리 능력을 입증하기 위해, 본 발명자들은 녹색 형광 신호에서 게이팅하고, 620 V, 500 μs 펄스를 EAP 작동기에 인가함으로써 녹색 (7 ㎛) 및 적색 (5 ㎛) 형광 입자의 혼합물을 분류하였다. 유체 유동 속도는 10 ㎕/min이었고, 이로써, 133 mm/s의 평균 선형 속도를 얻었다. 비분류된 세포는 그의 디폴트 경로를 따라 폐기물 채널로 이동한 반면, 분류된 세포는 분류 채널을 통해 빠져 나간 패스라인으로 편향되었다 (도 10). 본 발명자들은 분류 불가능 및 분류 가능인 두 채널 배출구 모두에서 10 ㎕ 유체 부피를 포획하였다. 별개의 수동식 세포 측정기에서 부피를 영상화하였다. 세포 측정기 결과에 기초하여, 본 발명자들은 순도는 100%이고, 수율 93%인 것으로 추정하였다. 작동기 성능 최적화. 본 발명자들의 초기 개념 증명에 따라, 본 발명자들은 본 발명자들의 분류 처리량을 개선시키는 EAP 유체 작동기에 관한 디자인 연구를 개시하였다. 본 발명자들은 콤솔 멀티피직스(COMSOL Multiphysics)를 사용하여 간소화된 전기기계식 모델의 작동기를 개발하였다. 본 발명자들의 결과는 대부분이 작동이 장치 둘레에서 일어난다는 것을 나타내었다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 다양한 작동기 디자인을 개발하고, 그의 성능에 관하여 실험적으로 시험하였다. 인가되는 전압을 증가시키고, 작동기의 기하학적 구조를 변형시킴으로써, 본 발명자들은 EAP 작동기의 성능을 개선시킬 수 있었다. 본 발명자들은 25 μs, 800 V 펄스를 이용하여 30 ㎕/min (400 mm/s)의 유동 속도로 입자를 성공적으로 분류하였으며, 이는 본 발명자들의 초기 입자 분리 입증에서 사용되는 분류기보다 20배 개선된 것이다. 세포 분류 입증 . μEAP FACS에서의 세포 분리를 입증하기 위해, 본 발명자들은 형광 표지된 B 세포와 함께 마우스의 림프구로 이루어진 샘플을 제조하였다. 원심분리를 통해 백혈구를 분리한 후, 피코에리트린 접합된 B220 항체로 표지하기 전에 고정시켰다. 샘플을 FACS 내로 유입시켰다. 도 11은 분류된 B 세포의 영상을 보여주는 것이다. 100 μs, 800 V 펄스를 이용하여 11 ㎕/min (147 mm/s)으로 분류를 수행하였다. 형광 스트리크가 중심부에서 가장 밝다는 점에 주목한다. 표지된 세포는 형광 입자보다 유의적으로 밝기가 더 낮기 때문에, 본 발명자들은 검출 영역 중의 세포에 조명하기 위하여 488 nm 다이오드 레이저를 사용한 반면, 밝기가 더 낮은 발광 다이오드 (LED) 램프는 전시야에 조명하였다. 오른쪽으로 향하는 밝은 스폿은 오염성 필라멘트에 의해 벽 위애 포획된 세포이다. 다중 분류기 통합. μEAP 분류기는 그의 간단한 제작 및 소프트 리소그래피와의 양립성에 기인하여, 더욱 복잡한 장치로 쉽게 통합될 수 있다. 본 발명자들의 EAP 작동기의 통합 능력을 예시하기 위해, 본 발명자들은 다중의 독립 분류기를 특징으로 하는 추가 장치를 개발하였다. 도 12는, 연장된 시간 노출이 병렬 채널에서 독립적으로 분류된 두 입자를 나타내는 것인, 이중 채널 장치에서의 병렬 분류를 보여주는 것이고, 도 13은, 연장된 시간 노출이 2개의 연속 분류기에 의해 3개의 빈 중 하나로 분류된 두 입자를 나타내는 것인, 다중 배출구로의 이중 단계 연속 분류를 보여주는 것이다 (주석: 빈 3은 디폴트 (비분류된) 빈이었다). 더 높은 고차원 다중 채널 병렬 및 다단계 연속 분류 구조는 유사하게 구축된다. 본 발명자들의 미세유체 형광 활성 세포 분류기 (μFACS)는 입자를 분류하는 데 필요한 모든 기능: 입자 정렬 기능, 그의 형광 신호를 검출하는 기능, 형광에 기초하여 분류를 결정하는 기능, 및 이어서, 적절하게 분류하는 기능을 제공한다. 입증된 능력으로는 20 μs 정도로 낮은 다중 작동기 펄스 길이를 이용한 입자 분류; 다중 및 단일 작동기 구조, 둘 모두를 이용한 분류; 다중 채널 분류기에서의 독립 병렬 분류; 다단계 분류기에서의 순차적 분류를 포함한다. 미세전기활성 중합체 (μEAP) 분류기의 이점으로는 (a) 분류가 간단한 전기 유입을 통해 신속하게 일어난다는 점 (20 μsec 분류로 입증); (b) μEAP 작동기가 다양한 미세제작 기술과 양립성이라는 점; 및 (c) μEAP 분류기가 쉽게 통합되고, 병렬화가 가능하고, 휴대용 규모의 장치로 잘 적합화되었다는 점을 포함한다. 참고 문헌 본 발명자들이 청구하는 발명의 실시양태는 하기를 포함한다: 1. 작동기에 인가된 전압 펄스가, 작동기가, 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하고, 여기서, 작동기는 내장 유체 챔버를 포함하고, 여기서, 챔버의 표면은 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하는 것인, 유동 채널 주변에 구성된 고성능 미세유체 전기활성 중합체 (μEAP) 작동기. 2. 제1항에 있어서, 유동 채널 주변 및 서로 다른 위상에 구성되어 있는 것으로서, 여기서, 작동기에 인가된 전압 펄스는, 작동기가, 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하고, 여기서, 각 작동기는 내장 유체 챔버를 포함하고, 여기서, 챔버의 표면은 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하는 것인, 복수 개의 작동기. 3. 제1항에 있어서, 유동 채널 주변 및 서로 180° 다른 위상에 구성되어 있는 것으로서, 여기서, 작동기에 인가된 전압 펄스는, 작동기가, 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하고, 여기서, 각 작동기는 내장 유체 챔버를 포함하고, 여기서, 챔버의 표면은 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하는 것인, 한 쌍의 작동기. 4. 제1항 내지 제3항, 또는 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버(들)의 복수 개의 표면이 유전성 탄성체의 EAP 층으로 커버링된 전극을 포함하는 것인 작동기(들). 5. 제1항 내지 제4항, 또는 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 채널이 입자의 수평 정렬을 위한 유체역학적 집속, 및 입자의 수직 정렬을 위한 관성 집속의 조합을 제공하도록 구성되어 있는 것인 작동기(들). 6. 제1항 내지 제5항, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 새로운 패스라인이 분류 배출구로 이어지는 것인 작동기(들). 7. 제1항 내지 제6항, 또는 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 채널이 샘플 유입 채널, 및 분류된 및 비분류된 배출 채널을 포함하고, 새로운 패스라인은 분류된 배출 채널로 이어지는 것인 작동기(들). 8. 제1항 내지 제7항, 또는 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 채널이 형광 검출을 위해 구성되고, 여기서, 표적화된 입자의 검출시, 전압 펄스는 μEAP 작동기에 인가되는 것인 작동기(들). 9. 제1항 내지 제8항, 또는 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, EAP 층이 1-50 (또는 2-25, 또는 5-15 ㎛ 두께)인 것인 작동기(들). 10. 제1항 내지 제9항, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 탄성체가 실리콘인 것인 작동기(들). 11. 제1항 내지 제10항, 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 다채널 장치에서 병렬 분류를 제공하도록 구성되어 있는 것인 작동기(들). 12. 제1항 내지 제11항, 또는 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 다단계 연속 분류를 다중 배출구로 제공하도록 구성되어 있는 것인 작동기(들). 13. 제1항 내지 제12항, 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 활성 입자 분류기에 기능적으로 통합되어 있는 것인 작동기(들). 14. 전압 펄스를 인가하여 작동기(들)가 유동 채널 내의 새로운 패스라인 상에서 표적화된 입자를 편향시키는 과도적 교차 유동을 유동 채널을 가로질러 생성하도록 유도하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 작동기(들)를 사용하는 방법. 본 발명은 언급된 특정 및 바람직한 실시양태의 모든 조합을 포함한다. 본원에 기술된 예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제안될 것이고, 이를 본 출원의 정신 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함시키고자 한다는 것을 이해한다. 본원에서 인용된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원 (그 안의 인용문 포함)은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다. |
