리간드 라이브러리를 사용한 진단 및 치료 방법들

리간드 라이브러리를 사용한 진단 및 치료 방법들 {DIAGNOSTIC AND TREATMENT METHODS USING A LIGAND LIBRARY}

본 발명은 리간드 라이브러리를 사용한 진단 및 치료 방법들 그리고 이들로부터 유래된 활성을 가진 화합물들에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 질환 바이오마커 프로파일들을 결정하는 데 그리고 약물 유해 반응, 부작용들, 약물 저항성, 및 치료적 효능을 포함하는 약물 유도성 반응을 진단하거나 검출하는 데 사용되는 리간드들을 찾도록 리간드 라이브러리를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약물 유도성 반응과 연관된 바이오마커들을 확인하고 개인화된 의학적 치료를 제공하는 것에 관한 것이다.

소분자 마이크로어레이들이 점차적으로 조합 화학에서 중요한 도구들이 되고 있다. 어레이들은 일반적으로 적합한 비드 레진 상의 조합성 라이브러리를 먼저 합성하고, 비드들을 마이크로타이터 플레이트들의 웰들 내로 분리하고, 다음으로 비드들로부터 화합물들을 방출하여 생산된다. 그 결과 얻은 용액들은 다음으로 화학적으로 변형된 유리 슬라이드 상에 로봇으로 스폿되어 라이브러리-유래된 분자가 표면에 공유적으로 부착된다. 대안적으로, 어레이 표면 상에 화합물들의 소정의 부류들의 제자리 ( in situ ) 합성 방법들이 존재한다. 지금까지 소분자 마이크로어레이들의 가장 공통적인 적용은, 보통 관심 있는 주어진 단백질의 소분자 리간드들을 확인하려는 목적을 가진 라이브러리 검색을 위한 다재다능한 플랫폼으로서 된 것이었다.

미국 특허공고 제 2007/0003954호는 소분자 마이크로어레이들을 사용한 단백질 및 항체 프로파일화를 개시하고 있다. 본 출원은 리간드 결합 분체들과 결합하는 리간드로서, 합성 분자들의 어레이들에 배열되고, 바이오마커들 및 분자적 지문들 (fingerprints)을 검색하는 데 사용될 수 있는, 리간드를 개시한다. 본 명세서에서 기술된 특이적 어레이들은, 예를 들면 어레이와 결합된 7,680개의 서로 다른 화합물들을 가지는 펩토이드 마이크로어레이를 포함한다. 해당 개시에서, 비드 기초 라이브러리들은 생물학적 유체들을 검색하도록 다음으로 마이크로어레이 상에 에드레스 가능한 (addressable) 위치들을 가진 마이크로어레이들로 전달된 펩토이드들을 만드는 데 초기 수단으로서 사용되었다. 본 검색은 복합 생물학적 혼합물에서 특정한 단백질이라면 모두를 위한 어레이 상에 독특한 양상 또는 분자적 지문을 가져온다. 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합되는 미국 특허출원 제 2010/0303805호는 중추신경계 장애들과 연관된 바이오마커들을 위한 생물학적 유체들을 검색하는 데 유용한 소정의 펩토이드들 및 진단적 어레이들을 기재한다. 해당 명세서에서 어레이들을 형성하는 데 사용된 해당 명세서에 기재된 특이적 단일체들은, 라이브러리들이 훨씬 더 많은 비드들/펩토이드들 또는 비드들/리간드들 - 예로, 100 K 내지 150 MM개 사이의 범위로 확대되는 경우라면 본 발명의 새로운 검색 방법론에도 역시 사용될 수 있다.

본 출원의 발명자들은 유의하게 더 큰 비드를 기초로 한 라이브러리들이 (항체 바이오마커들에 대한 마이크로어레이 기초 검색들 또는 세포들에 대한 비드 기초 검색들과 대비하여) 올바른 조건들 하에서, 질환 연관된 바이오마커들뿐만 아니라 이러한 리간드-결합 분체들과 결합하는 리간드들의 유의하게 더 큰 풀을 찾도록 복합 생물학적 시료들을 직접적으로 검색하는 데 사용될 수 있다. 본 유의하게 더 큰 풀은 진단적 도구들뿐만 아니라 잠재적인 치료제들로서 작용하는 유의하게 개선된 수의 고친화도 리간드들을 포함한다.

관련 출원들에 관한 교차-참조

본 출원은 2011년 3월 24일, 2011년 5월 31일, 및 2012년 1월 6일에 각각 제출된 미국 가특허 출원들 제 61/467,256호, 제 61/491,717호, 및 제 61/583,881호에 대한 우선권을 주장하고, 이들 모두는 본 명세서에서 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 리간드 라이브러리를 제공한다. 대표적인 구현예에서, 본 발명은 무작위 펩토이드 리간드 라이브러리를 포함하는 큰 비드 기로 무작위 리간드 라이브러리를 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커들이 상기 약물 유도성 반응과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 상기 개체에서 상기 약물 유도성 반응을 진단하는 단계:를 포함하는, 개체에서 약물 유도성 반응을 진단하는 방법을 제공한다. 한 가지 대표적인 구현예에서, 상기 약물 유도성 반응은 유해 반응이다. 또 다른 대표적인 구현예에서, 상기 약물 유도성 반응은 부작용이다. 또 다른 대표적인 구현예에서, 상기 약물 유도성 반응은 상기 약물에 대한 저항성이다. 또 다른 대표적인 구현예에서, 상기 약물 유도성 반응은 용량 효능을 포함하는 그의 치료적 효능이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 상기 하나 이상의 마커들이 질환을 치료하기 위한 약물에 대한 반응과 연관되는지 여부를 결정하는 단계; 및 상기 반응에 대한 상기 하나 이상의 마커들 간의 연관성의 결정을 기초로 하여, 상기 개체에게 상기 약물을 투여하고, 이에 의해 상기 개체에서 상기 질환을 치료하는 단계:를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 시료에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커들이 상기 위험성과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 상기 개체에서 약물에 대한 유해 반응의 상기 위험성을 검출하는 단계:를 포함하는, 개체에서 약물에 대한 유해 반응의 위험성을 검출하는 방법을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커들이 약물을 위한 반응과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 질환을 치료하도록 상기 하나 이상의 개체들을 상기 약물에 대한 상기 반응을 위해 프로파일 하는 단계:를 포함하는, 질환을 치료하도록 하나 이상의 개체들을 약물에 대한 반응을 위해 프로파일 하는 방법을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 생물학적 시료에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 리간드와 상기 시료에서 마커의 결합 특징들을 결정하는 단계; 및 상기 마커가 질환을 치료하기 위한 약물 유도성 반응과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 상기 질환을 치료하기 위한 상기 약물 유도성 반응과 연관된 상기 마커를 확인하는 단계:를 포함하는, 질환을 치료하기 위한 약물 유도성 반응과 연관된 마커를 확인하는 방법을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 질환을 치료하기 위한 약물에 대한 반응을 나타내는 하나 이상의 개체로부터 생물학적 시료들의 첫 번째 집합을 획득하는 단계; 상기 질환을 치료하기 위한 상기 약물에 대한 상기 반응을 나타내는 하나 이상의 개체로부터 생물학적 시료들의 두 번째 집합을 획득하는 단계; 상기 첫 번째 및 두 번째 생물학적 시료들에 대한 무작위 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 상기 첫 번째 및 두 번째 생물학적 시료들 간의 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 하나 이상의 마커들의 결합에서 차이들을 결정하는 단계; 및 상기 질환을 치료하기 위한 상기 약물에 대한 상기 반응과 연관된 마커를 확인하는 단계:를 포함하는, 질환을 치료하기 위한 약물에 대한 반응과 연관된 마커를 확인하는 방법을 제공한다.

다음의 상세한 설명에서, 수적인 특정한 세부사항들은 본 발명의 철저한 이해를 제공하도록 개시된다. 그러나, 당업자들라면 본 발명이 이들 특정한 세부사항들이 없이 실행될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 다른 경우들에서, 숙지된 방법들, 절차들, 및 구성성분들은 본 발명을 감추지 않도록 자세하게 기술되지 않았다.

본 발명은 리간드 라이브러리 및 그의 용도들을 포괄한다. 상세하게, 본 발명은 분자들의 검색, 약물단백질학 (pharmacoproteomics), 진단, 치료, 및 무작위 라이브러리의 다른 용도들을 포괄한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 개인화된 의약을 위한 리간드 라이브러리를 제공한다. 용어들 "개인화된 의약 (personalized medicine)"은, 본 명세서에서 사용되는 바 이로부터 유익을 가장 얻을 환자들에게 약물 (또는 요법)을 표적하거나, 상기 요법으로부터 유해의 위험성을 가질 수 있는 환자들을 확인하는 테스트 (또는 진단제)의 용도를 말할 수 있다. 약물 또는 진단적 산물이 미국 및 대부분의 다른 국가들에서 시판될 수 있기 이전에, 그의 안전성 및 효능의 엄격한 규제적 검토를 거쳐야 한다. 개인화된 의약을 위한 진단제의 경우에, 이것은 요법에 대한 환자들의 반응 및 특정한 마커의 존재 간에 연관이 존재하는지 여부를 확인하도록 약물을 수여받는 환자들로부터 얻은 조직 또는 체액들의 테스트를 아마도 요구할 것이다. 이에 따라, 한 가지 구현예에서, 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커들이 상기 약물에 대한 상기 반응과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 상기 개체에서 상기 질환을 치료하도록 상기 약물에 대한 상기 반응을 진단하는 단계:를 포함하는, 개체에서 질환을 치료하도록 약물에 대한 반응을진단하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 반응의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 유해 반응, 부작용, 약물에 대한 저항성, 또는 용량 효능을 포함하는 치료적 효능을 포함한다.

유해 약물 반응들은 약물 개발 프로그램들의 낮은 성공율의 기본적인 원인이다 (인간 임상시험에 들어가는 4개 화합물 중 하나 이하가 궁극적으로 미국 식품의약품안전부 (FDA)에 의해 사용이 승인된다). 약물-유도성 질환 또는 독성은 이들 반응들이 종종 전임상적 연구들로부터 예측가능하지 않고 작은 수의 개체들이 관여하는 초기 임상시험들에서 검출되지 않을 수 있기 때문에, 약물 개발자들에게 독특한 일련의 도전들을 제시한다. 이러한 효과들이 임상적 개발의 후기 단계들에서 검출될 때, 그들은 종종 약물 개발 프로그램의 종결을 가져온다. 약물이 일정 독성에도 불구하고 승인될 때, 그의 임상적 사용은 빈번하게 작은 그룹의 환자들이라도 유해 반응들의 가능한 발생에 의해 심하게 제한된다. 이러한 화합물이 첫 번째 요법이 될 가능성은 (경쟁하는 제품들이 존재하지 않더라도) 작다. 본 발명을 사용하는 임상시험들은 작은 수의 개체들이 관여하는 연구들에서 가능한 독성 반응들의 개선된 예측들을 허용할 수 있다. 본 발명의 방법들은 개입의 가능한 미래 독성 효과들의 신속하게 유래된 예측을 제공한다. 이에 따라, 또 다른 구현예에서, 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 및 상기 하나 이상의 마커들이 상기 위험성과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 상기 개체에서 약물에 대한 유해 반응의 상기 위험성을 검출하는 단계:를 포함하는, 개체에서 약물에 대한 유해 반응의 위험성을 검출하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.

본 발명은 부분적으로 펩토이드 결합 바이오마커들의 조합이 환자들에서 요법을 개인화하는 데 사용될 수 있는 점의 놀라운 발견을 기초로 한다. 약물에 반응한 높은 환자 간의 다양성이 주어지는 경우, 본 발명의 검정 방법들은 특히, 그들이 환자의 질환이 특이적 약물 또는 약물들의 조합으로 치료에 반응할 높은 가능성을 가지는 여부를 결정하도록 복수의 분자적 결정기들 (예로, 펩토이드 결합 바이오마커들)의 결합 특징들에서 차이들을 고려하는 조합적 전략을 사용하기 때문에, 장점을 가진다. 환자가 반응자으로서 분류되는 경우라면, 다음으로 해당 환자에 재단된 투여 요법이 독성 부작용들을 유도하지 않고도 치료적 효능을 달성하도록 작성될 수 있다. 결론적으로, 반응자들로서 분류된 환자들은 약물 유도성 요법의 전적인 유익들을 이러한 요법과 연관된 부작용들을 겪지 않고도 받을 수 있다. 유사하게, 약물로 이미 치료를 받고 있는 환자들은 약물의 연속적 투여를 조정하여 치료적 효능을 타협하지 않고도 독성 부작용들의 감소를 경험할 수 있다. 마찬가지로, 약물로 이미 치료를 받고 있는 환자들은 약물에 대한 저항성이 발생하였는지 그리고 대안의 요법이 투여되어야 하는지 여부를 평가하도록 감시될 수 있다.

그 결과로, 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 상기 하나 이상의 마커들이 상기 질환을 치료하기 위한 약물에 대한 반응과 연관되는지 여부를 결정하고; 및 상기 반응과 상기 하나 이상의 마커들 간의 연관성의 결정을 기초로 하여 상기 개체에게 상기 약물을 투여하고, 이에 의해 상기 개체에서 상기 질환을 치료하는 단계:를 포함하는, 본 발명의 방법들은 개체에서 질환을 치료하는 것을 가능하게 한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 개체에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 상기 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 상기 시료에서 하나 이상의 마커들의 결합 특징들을 확인하는 단계; 상기 하나 이상의 마커들이 상기 질환을 치료하기 위한 약물에 대한 반응과 연관되는지 여부를 결정하는 단계; 및 상기 반응에 대한 상기 하나 이상의 마커들 간의 연관성의 결정을 기초로 하여, 상기 개체에게 상기 약물을 투여하고, 이에 의해 상기 개체에서 상기 약물에 의한 치료를 감시하는 단계:를 포함하는, 개체에서 약물에 의한 치료를 감시하는 방법을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 약물단백질학을 위한 및 약물에 대한 반응과 여관된 마커를 확인하는 리간드 라이브러리를 제공한다. 이에 따라 한 가지 구현예에서, 개체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계; 상기 생물학적 시료에 대한 리간드 라이브러리를 검색하는 단계; 라이브러리에서 리간드들과 상기 시료에서 마커의 결합 특징들을 결정하는 단계; 및 상기 마커가 질환을 치료하기 위한 약물 유도성 반응과 연관되는지 여부를 결정하고, 이에 의해 상기 질환을 치료하기 위한 상기 약물 유도성 반응과 연관된 상기 마커를 확인하는 단계:를 포함하는, 질환을 치료하기 위한 약물 유도성 반응과 연관된 마커를 확인하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 대표적인 구현예에서, 약물에 대한 반응은 환자의 투약, 그의 용량, 또는 유해 반응에 대한 반응이다.

한 가지 구현예에서, 바이오마커들의 하나 이상의 잠정적 히트들 또는 선도들 (lead)은 본 발명의 리간드 라이브러리를 사용하여 확인된다. 생물학적 시료는 개체 또는 다수의 개체들 (예로, 환자 집단 또는 소집단)로부터 획득될 수 있다. 일정 구현예들에서, 생물학적 시료들의 첫 번째 집합은 반응 (예로, 약물 유도성 반응 또는 약물에 대한 반응)을 나타내는 다수의 개체들로부터 획득될 수 있고 생물학적 시료들의 두 번째 집합은 반응을 나타내는 다수의 개체들로부터 획득될 수 있다. 리간드 라이브러리는 첫 번째 및 두 번째 집합 생물학적 시료들과 대비하여 검색될 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 집합 생물학적 시료들 간에 라이브러리에서 하나 이상의 리간드들과 하나 이상의 마커들의 결합 특징들의 차이들이 결정될 수 있다. 결합 특징들의 차이들을 기초로 하여, 바이오마커들의 잠정적 히트들 또는 선도물들이 확인될 수 있다. 일정 구현예들에서, 잠정적 히트들 또는 선도물들은 반응예를 들면 환자의 약물에 대한 반응, 질환에 대한 반응, 및 질환의 특정한 단계에 대한 반응과 연관된 항원들에 대한 자가항체들을 인지하는 바이오마커들이다.

한 가지 구현예에서, 바이오마커들의 잠정적 히트들 또는 선도물들을 확인하기 위하여, 약 350 K로부터 약 250 MM까지의 범위를 가지는 펩토이드 리간드를 가지는 비드-기초 큰 무작위 펩토이드 리간드 라이브러리가 사용될 수 있다. 초기 무작위 라이브러리 검색에서 확인되는 바이오마커들의 잠정적 히트들 또는 선도물들은 다음으로 진단제들 또는 본 명세서에서 논의된 동반 진단제들을 위한 연속적 검색으로 시료들에 대해 검색하는 데 사용될 수 있다.

일정 구현예에서, 잠정적 히트들 또는 선도물들은 연속적 검색에서 확인된다. 한 가지 구현예에서, 초기 검색에서 사용되었던 동일한 리간드 라이브러리가 확인 연속적 검색에서 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 서로 다른 리간드 라이브러리 (초기 검색에서 사용되었던 것과 서로 다름)가 확인 연속족 검색에서 사용될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 형질 (예로, 질환에 대한 반응)과 연관된 잠정적 히트들 또는 선도물들이 초기 검색에서 확인되고 확인된 잠정적 히트들 또는 선도물들은 그들의 두 번째 형질 (예로, 약물에 대한 반응)과 연관성을 결정하도록 시료들에 대비하여 검색하는 데 사용된다. 한 가지 구현예에서, 질환과 연관된 잠정적 히트들 또는 선도물들이 초기 검색에서 확인되고 확인된 잠정적 히트들 또는 선도물들은 상기 질환의 특정한 단계와 연관성을 확인하고 또한 결정하도록 시료들에 대비하여 검색하는 데 사용된다.

일정 구현예들에서, 잠정적 히트들을 확인하기 위한 초기 검색은 큰 무작위 리간드 라이브러리를 사용하는, 비드-기초 장치 상에서 수행될 수 있고, 진단제들 또는 동반 진단제들을 위한 연속적 검색은 비-무작위 또는 무작위 리간드 라이브러리를 사용하는, 임의의 플랫폼, 예를 들면 마이크로어레이를 사용하여 수행될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 진단제들 또는 동반 진단제들을 위한 연속적 검색에서 첫 번째 검색은 첫 번째 리간드 라이브러리에 대해 수행되고 역속적 검색은 두 번째 리간드 라이브러리에 대해 수행되며, 여기에서 첫 번째 리간드 라이브러리는 리간드들의 첫 번째 집합을 포함하고 두 번째 리간드 라이브러리는 리간드들의 두 번째 집합을 포함한다. 한 가지 예에서, 첫 번째 리간드 라이브러리는 질환과 연관된 마커들을 확인하도록 검색되고, 두 번째 리간드 라이브러리는 약물 유도성 반응과 연관된 마커들을 확인하도록 연속적 검색에서 검색된다.

한 가지 예에서, 잠정적 히트들 또는 선도물들은 그들의 질환과의 연관성을 결정하도록, 약물 치료 이전에 수집된 환자 시료들의 첫 번째 검색에서 사용된다. 약물 치료 이후에, 시료들이 환자들로부터 수집될 수 있고, 한 가지 구현예에서, 전-치료 그룹에서 사용된 동일한 잠정적 히트들이 소정의 질환 단계들 또는 약물 치료에 대한 반응성 변화들을 가지는 이들 환자들을 확인하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 서로 다른 잠정적 히트들은 약물 투여로 인하고 전치료 프로파일과 반드시 상관되거나 관련되지 않는 약물 관련 부작용들 또는 치료 효과들을 감시하는 데 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 또 다른 무작위 라이브러리는 약물 치료와 연관될 수도 있는 추가적인 바이오마커들을 찾는 데 사용될 수 있다.

용어 "약물"은 본 명세서에서 사용되는 바, 이에 제한되는 것은 아니지만 합성, 무기 또는 유기 화합물, 단백질, 펩타이드, 탄수화물들, 및 기타 당들, 지질, DNA 및 RNA 핵산 서열들, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 수용체 리간드, 효소, 부착 펩타이드, 항원, 호르몬, 성장인자, 리보자임, 및 레트로바이러스성 벡터를 포함하는, 약물이라면 모두를 말할 수 있다.

본 발명은 당업자에게 알려진 적합한 약물이라면 모두를 포괄한다. 이들 약물들은 머크 인덱스 (Merck Index); Physicians' Desk Reference, PDR Network, 2011 개정판 (2010년 12월 1일); 미국 특허 제 7,932,294호 및 미국 특허공고 제 20060046967호, 제 20110274695호, 제 20110269722호, 제 20110269709호, 및 제 20060205674호에 나열되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에서 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다.

한 가지 구현예에서, 약물은 다음의 카테고리들/그룹들의 하나 이상으로부터 선택된다: 항생제들 (antibiotics), 진정제들 (sedatives), 수면제들 (hypnotics), 항우울제들 (antidepressants), 신경이완제들 (antipsychotics), 항정신제들 (antimanics), 진통제들 (analgesics), 해열제 (antipyretics), 항편두통제들 (antimigraine agents), 간질약들 (anticonvulsants), 파킨슨증 및 운동 장애들에 사용되는 약물들, 치매를 위한 약물들, 구토방지제 (antiemtics), 어지러움을 위한 약물, CNS 촉진제들 활성제들, 항감염 눈 제조물들, 항염증제, 항알레르기 제조물들, 항녹내장 약물들, 눈 질환들을 치료하는 제조물들, 귀 제조물들, 코 제조물들, 입인두 제조물들, 항부정맥 약물들, 항고혈압제들, 알파/베타 차단제들, 통로 차단제들, ACE 저해제들, 안지오텐신 Ⅱ 수용체 길항제들, 이뇨제들 (diuretics), 항협심증 제들 (antianginals), 질산염들, 칼슘 통로 차단제들, 심부전 및 심장마비를 위한 약물들, 혈관확장제, 응고제들, 항응고제들, 혈전용해제들 (thrombolytics), 항혈소판 약물들, 호흡 촉진제들, 기침약들 (antitissives), 가래약들 (expectorants), 점액용해제들 (mucolytics), 코 혈관수축제 (decongestants), 항히스타민제들 (antihistamine agents), 항천식제들 (antiasthmatics), 항궤양, 항 분비성 약물들, H.sub.2 수용체 길항제들, 양성자 펌프 저해제들, 프로스타글란딘 유사체들, 제산제 (antacids), 진경약들 (antispasmodics), 위 운동을 변형하는 약물들, 항설사제들 (antidiarrhoeals), 항운동성 약물들, 항미생물성 약물들, 담낭에 작용하는 약물들, 비뇨기 항감염제들, 이뇨제들, 비뇨기 진통제들, 진경제들, 뇨관 및 질에 작용하는 항감염성 약물들, 자궁에 작용하는 약물들, 전립성 비대를 위한 약물들 , 알파 차단제들, 항안드로겐들, 발기부전을 위한 약물들, 살정자제들, 비호르몬성 피임약들, 연화제들, 각질분해제들 (keratolytics), 국소적 항감염제들, 국소적 항진균제들, 국소적 항기생충약들, 국소적 스테로이드들, 여드름을 위한 국소적 약물들, 건선을 위한 약물들, 색소침작 장애들, 및 항지루약들, 비스테로이드성 항염증성 약물들 (NSAIDs), COX-2 저해제들, 항관절염제들, 면역억제제들, 국소적 진통제들, 근육 이완제들, 신경근육 약물들, 페니실린 항생제들, 세팔로스포린 항생제들, 퀴놀린, 플루오로퀴놀린 항생제들, 매크로라이드 항생제들, 클로르암페니콜, 테트라사이클린 항생제들, 술폰아마이드들, 항혐기생물제 (antianaerobics), 메트로니다졸 (metronidazole), 항결핵 약물들 (antitubercular drugs), 항나병 약물들 (antileprosy drugs), 항진균제들, 항원생물제들 (antiprotozoals), 항기생충제 (anthelminthics), 항감염성 약물들, 항말라리아제들, 항바이러스제들, 동화제들 (anabolics), 안드로겐성 스테로이드들, 코르티코스테로이드들 (corticosteroids), 에스트로겐들 (oestrogens), 프로게스테론들 (progestogens) 및 호르몬성 피임약들, 임신제들, 자극 호르몬들 및 관련 약물들, 갑상샘 및 항갑상샘 약물들, 항당뇨제들 및 고당제들, 비타민들, 아미노산들, 항-비만 약물들, 저지질증 약물들 (hypolipidaemic drugs), 핌브르산 유도체들 (fibric acid derivatives), 스타틴들 (statins), HMG CoA 환원효소 저해제들, 니코틴산 그룹, 통풍에 사용되는 약물들, 골 대사에 영향 주는 약물들, 비스포스페이트염들, 항암 약물들, 알킬화제들, 세포독성 항생제들, 항대사제들 (antimetabolites), 사이타빈 (cytarbine), 플루다빈 (fludarbine), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 머캅토 퓨린 (mercaptopurine), 티오구아닌 (thioguanine), 빈카 알칼로이드들 (vinca alkaloids), 에토포사이드 (etoposide), 탁산들 (taxanes), 토포이소머라제 (topoisomerase 1) 저해제들, 세포독성 면역억제제들, 면역촉진제들, 세포보호제들 (cytoprotectives), 아미포스틴 (amifostine), 에스트로겐들 (oestrogens), 프로게스트로겐 (progestogens), 호르몬 길항제들, 항종양 약물들, 항알레르기제들, 비-최면성 항히스타민들, 세티리진 (cetirizine), 데스로라타딘 (desloratadine), 테르페나딘 (terfenadine), 페소페나딘 (fexofenadine), 최면성 히스타민들, 히스타민 수용체 차단제들, 국소적 마취제들, 정맥내 마취제들, 흡입 마취제들 및 근육 이완제들.

또 다른 구현예에서, 약물은 하기 표 1에 나열된 하나 이상의 약물들로부터 선택된다. 표 1은 시판되는 브랜드화된 약물들의 선택된 예들을 나타낸다.

또 다른 구현예에서, 약물은 다음의 하나 이상으로부터 선택된다: 아바카비르 (Abacavir), 아리피프라졸 (Aripiprazole), 아르센 트리옥사이드 (Arsenic Trioxide), 아톰옥섹틴 (Atomoxetine), 아토르바스타틴 (Atorvastatin), 아자티오프린 (Azathioprine), 보세프레비르 (Boceprevir), 브렌투시마브 (Brentuximab) 베토틴 (Vedotin), 부설판 (Busulfan), 카페시타빈 (Capecitabine), 카바마제핀 (Carbamazepine), 카리소프로돌 (Carisoprodol), 카베디롤 (Carvedilol), 셀레콕시브 (Celecoxib), 세투시마브 (Cetuximab) (1), 세투시마브 (2), 세비메린 (Cevimeline), 클로르디아제폭사이드 (Chlordiazepoxide) 및 아미트리프틸린 (Amitriptyline), 클로로퀸 (Chloroquine), 시타로프람 (Citalopram) (1), 시타로프람 2), 클로바잠 (Chlobazam), 크로미펜 (Clomiphene), 크로미프라민 (Clomipramine), 크로피도그렐 (Clopidogrel), 크로자핀 (Clozapine), 코데인 (Codeine), 크리 조티닙 (Crizotinib), 다프존 (Dapsone), 다사티닙 (Dasatinib), 데시프라민 (Desipramine), 데스로라타빈 (Desloratadine) 및 슈도에페드린 (Pseudoephedrine), 덱스란소프라졸 (Dexlansoprazole) (1), 덱스란소프라졸 (2), 덱스트로메톨판 (Dextromethorphan) 및 퀴니딘 (Quinidine), 디아제팜 (Diazepam), 도세핀 (Doxepin), 드로스피레논 (Drospirenone) 및 에티닐 (Ethinyl), 에스트라디올 (Estradiol), 에르로티닙 (Erlotinib), 에소메프라졸 (Esomeprazole), 플루오로우라실 (Fluorouracil), 플루옥세틴 (Fluoxetine), 플루옥세틴 및 올란자핀 (Olanzapine), 플루르비프로펜 (Flurbiprofen), 플루보옥사민 (Fluvoxamine) (1), 플루보옥사민 (2), 플루보옥사민 (3), 풀베스트란트 (Fulvestrant), 갈란타민 (Galantamine), 제피티닙 (Gefitinib) (1), 제피티닙 (2), 일로페리돈 (Iloperidone), 이마티닙 (Imatinib) (1), 이마티닙 (2), 이마티닙 (3), 이마티닙 (4), 이미프라민 ( imipramine), 인다카테롤 (Indacaterol), 이리노테칸 (Irinotecan), 이소소르비드 (Isosorbide) 및 하이드라라진 (Hydralazine), 라파티닙 (Lapatinib), 레나리도마이드 (Lenalidomide), 마라비록 (Maraviroc), 머캅토퓨린 (Mercaptopurine), 메토프로롤 (Metoprolol), 미바쿠리움 (Mivacurium), 모다피닐 (Modafinil) (1), 모다피닐 (2), 네파조돈 (Nefazodone), spfvlskqlfm (Nelfinavir), 닐로티닙 (Nilotinib) (1), 닐로티닙 (Nilotinib) (2), 노르트리프틸린 (Nortriptyline), 오메프라졸 (Omeprazole), 파니투무마브 (Panitumumab) (1), 파니투무마브 (2), 판토프라졸 (Pantoprazole), 파록세틴 (Paroxetine), 페기테르페론 (Peginterferon) 알파-2b, 퍼페나진 (Perphenazine), 페니토인 (Phenytoin), 피모자이드 (Pimozide), 프라수그렐 (Prasugrel), 프라바스타틴 (Pravastatin), 프로파페논 (Propafenone), 프로프라노롤 (Propranolol), 프로트리프틸린 (Protriptyline), 퀴니딘 (Quinidine), � �베프라졸 (Rabeprazole), 라스부리카제 (Rasburicase), 리팜핀 (Rifampin), 이소니아지드 (Isoniazid), 피라진아마이드 (Pyrazinamide), 리스페리돈 (Risperidone), 소듐 페닐아세테이트 (Sodium Phenylacetate) 및 소듐 벤조에이트 (Sodium Benzoate), 소듐 페닐부틸레이트 (Sodium Phenylbutyrate), 타목시펜 (Tamoxifen), 텔라프레비르 (Telaprevir), 터비나핀 (Terbinafine), 테트라베나진 (Tetrabenazine), 티오구아닌 (Thioguanine), 티오리다진 (Thioridazine), 티카그렐러 (Ticagrelor), 티모롤 (Timolol), 티오트로피움 (Tiotropium), 톨테로딘 (Tolterodine), 토시투모마브 (Tositumomab), 트라마돌 (Tramadol) 및 아세트아미노펜 (Acetaminophen), 트라스투주마브 (Trastuzumab), 트레티노인 (Tretinoin), 트리미프라민 (Trimipramine), 발프록산 (Valproic Acid), 베무라페닙 (Vemurafenib), 벤라팍신 (Venlafaxine), 보리코나졸 (Voriconazole), 와파린 (Warfarin) (1), 및 와파린 ( 2).

또 다른 구현예에서, 본 발명은 기지의 약물 표적을 목표로 하는 약물에 대한 동반 진단제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 임상시험을 거치고 있는 약물 표적에 대한 동반 진단제를 포함한다. 임상시험을 거치고 있는 약물 표적의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 바피뉴주마브 (Bapineuzumab), 솔라네주마브 (Solanezumab), 정맥내 면역글로불린 (IVIg), 라트레피르딘 (Latrepirdine, Dimebon), 실로-이노시톨 (Scyllo-inositol)/ELND 005, 염화 메틸티오니움 (Rember), CERE-110, PBT2, 다베누타이드 (Davenutide)/AL-108, BMS-708163, PF-04494700/ TTP488, 티데글루십 (Tideglusib)/NP-12 (Nypta), 베리무마브 (Belimumab), 아타시셉트 (Atacicept), 마파투무마브 (Mapatumumab), 아포마브 (Apomab), 둘라너민 (Dulanermin), 오다나카팁 (Odanacatib), AMG-785, DG-041, OC-000459, PLX-4032, LX-1031, 및 LX-1032을 포함한다.

하나 이상의 시료 구성성분들 (예로, 바이오마커들)의 결합 프로파일은 당업자에게 알려진 임의의 질환을 예측하거나, 진단하거나, 치료하는 데 사용될 수 있다. 용어들 "질환" 또는 "병태"는 당해 기술분야에 공통적으로 인식되어 있고, 일반적으로 비정상으로서 인식된 개인 또는 환자에서 징후들 및/또는 증상들의 존재를 지정한다. 질환들 또는 병태들은 병리학적 변화들을 기초로 하여 진단되고 부류될 수 있다. 징후들은 환자의 신체 검사 또는 진단적 테스트들의 결과들에 의해 명확해진 변화들과 같은 질환의 임의의 객관적인 증거를 포함할 수 있다. 증상들은 질환 또는 환자의 병태, 예로 정상적인 기능, 감각, 또는 외모와는 다른 비정상적 병태의 환자의 감지의 객관적인 증거이고, 이는 제한되지 않고 신체적 장애들, 이환, 통증, 및 개인에 의해 경험된 정상적 조건과는 다른 변화들을 포함할 수 있다. 다양한 질환들 또는 병태들은 이에 제한되는 것은 아니지만; 제한되지 않고도 영양, 역증요법 (allopathic), 동종요법 (homeopathic), 및 골병성 (osteopathic) 의약의 교과서들을 포함하는 의약의 표준 교과서들에서 분류되어 있는 것들을 포함한다. 본 발명의 소정의 관점들에서, 질환 또는 병태는 본 명세서에서 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는 Harrison's Principles of Internal Medicine, 제 14.sup 개정판 (Fauci et al, Eds., McGraw Hill, 1997), 또는 Robbins Pathologic Basis of Disease, 제 6.sup 개정판 (Cotran et al, Ed. WB Saunders Co., 1998), 또는 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: DSM-IV, 제 4.sup 개정판 (American Psychiatric Press, 1994), 또는 기타 교과서들과 같은 표준 교과서들에서 나열된 질환들의 유형들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 질환들은 미국 특허공고 제 2007/0003954호 및 제 2011/0092384호에도 역시 나열되어 있고, 이들은 본 명세서에서 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다.

질환 또는 병태의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 자가면역 질환, 염증성 질환, 감염성 질환, 신경퇴화성 질환, 심혈관 질환, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 곰팡이 감염, 프리온 감염, 생리적 상태, 오염 상태, 또는 일반적인 건강을 포함한다.

본 발명의 무작위 리간드 라이브러리 검색 방법들은, 전-질환 상태들 또는 질환 상태의 중증도를 포함하는 질환 또는 그의 상태들의 서로 다른 유형들 간에 구별하도록 결합 특징들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 방법들은 암의 전이 상태 또는 제제 또는 질환 상태에 대한 민감성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명은 암, 예를 들면 이에 제한되는 것은 아니지만 유방암, 폐암, 전립선암, 자궁경부암, 두경부암, 고환암, 난소암, 피부암, 뇌암, 췌장암, 간암, 위암, 결장암, 직장암, 식도암, 림프종, 또는 백혈병에서 존재하거나 이와 연관된 리간드 결합 분체들을 평가하는 방법들 및 이를 위한 조성물들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 본 발명은 자가면역 질환들, 예를 들면 이에 제한되는 것은 아니지만 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 만성 활성 간염, 일차 담경변, 확장 심근병, 심근염, 자가면역 다중내분비 증후군 제 I형 (APS-I), 자가면역 간염, 낭성 섬유증 혈관염, 후천적 부갑상샘 기능저하, 굳파스처 증후군, 크론병, 심장 동맥병, 낙엽 천포창, 보통 천포창, 길리안-바르 증후군, 제 1형 당뇨병, 경직인 증후군, 라스무센 뇌염, 자가면역 위염, 에디슨병, 인슐린 저혈당 증후군 (히라타병), B형 인슐린 저항성, 가시세포증, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 악성 빈혈, 치료-저항성 라임 관절염, 다중신경병, 다발성 경화증, 탈수초 질환들, 류마티스열, 아토피 피부염, 일차 담경변, 그레이브병, 자가면역 갑상샘 저하증, 백반증, 갑상샘 연관된 눈병, 자가면역 갑상샘염, 자가면 역 하시모토 갑상샘염, 복강병, ACTH 결핍, 근육염, 피부근염, 다중근육염, 피부근염, 스조렌 증후군, 전신성 경화증, 진행성 전신 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 국소 피부경화증, 일차 항인지질 증후군, 수포성 천포창, 임신헤르페스, 반흔성 천포창, 만성 특발성 두드러기, 연결조직 증후군들, 괴사 및 초승달 사구체신염 (NCGN), 전신 혈관염, 웨그너 육아종증, 처그-스트라우스 증후군, 다중근육염, 레이노드 증후군, 만성 간질환, 내장 리슈마니아증, 자가면역 C1 결핍, 막 증식성 사구체신염 (MPGN), 연장된 응고 시간, 자가면역 혈소판감소 자색반병, 면역결핍, 동맥경화증, 신경병증, 부신생물 천포창, 부신생물 경직인 증후군, 부신생물 뇌척수염, 아급성 자율 신경병증, 암-연관된 망막증, 부신생물 안간대 근간대 실조, 하위운동신경원 증후군, 람버트 -이튼 근무력 증후군, 및 부신생물 소뇌 퇴화에 존재하는 리간드 결합 분체들을 평가하는 방법들 및 이를 위한 조성물들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 감염성 질환, 예를 들면 이에 제한되는 것은 아니지만 AIDS, 탄저병 (anthrax), 보툴리눔 독소증 (botulism), 브루셀라증 (brucellosis), 무른 궤양 (chancroid), 클라미디아 감염 (chlamydial infection), 콜레라 (cholera), 콕시디오이데스 진균증 (coccidioidomycosis), 크립토스포리디움증 (cryptosporidiosis), 사이클로스포리디아증 (cyclosporiasis), 디프테리아 (dipheheria), 에르리히증 (ehrlichiosis), 아보바이러스 뇌염 (arboviral encephalitis), 장출혈성 대장균 (E. coli), 지알디아증 (giardiasis), 고노리히증 (gonorrhea), 뎅기열 (dengue fever), 헤모필러스 인플루엔자, 한센변 (나병), 한타바이러스 호흡 증후군, 용혈요독 증후군, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 레지오넬라증, 리스테리아증, 라임병, 말라리라, 홍역, 수막구균병, 유행성 이하선염, 백일 해 (백일해), 흑사병, 기생충 회색질척수염, 프시타증 (앵무새열), Q열, 광견병, 록키산 스폿열, 루벨라증, 선천적 루벨라 증후군 (SARS), 살모넬라증, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS), 쉬겔라증, 천연두, 스트렙토구균병 (감염 그룹 A), 스트렙토구균 독성 충격 증후군 (STSS), 스트렙토구균 폐렴, 매독, 파상풍, 독성 충격 증후군, 선모충증, 결핵, 야생토끼병, 장티푸스, 반코마이신 중간물 저항성 스태필로코커스 아우레우스, 배리셀라, 옐로우열, 변이 크루츠펠트-야코브병 (vCJD), 에볼라 용혈열, 포충증 (꽈리형 포충병), 헨드라 바이러스 감염, 인간 원숭이폭스 인플루엔자 A, H5N1 (조류 인플루엔자), 라사열, 마르거그 용혈열, 니파 바이러스 (Nipah virus), 언양열 (O'nyong fever), 리프트 계곡열, 베네주엘라 말 뇌염, 및 웨스트 나일 바이러스에 존재하는 리간드 결합 분체� �을 평가하는 방법들 및 이를 위한 조성물들을 포함한다.

본 발명의 리간드 라이브러리는 질환의 임의의 단계, 예를 들면 질환의 초기 단계 또는 질환의 진행된 후기 단계에 대해 검색하는 데 사용될 수 있다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 신경퇴화성 질환들, 예를 들면 이에 제한되는 것은 아니지만 뇌졸중, 저혈량 충격 (hypovolemic shock), 외상성 충격 (traumatic shock), 재관류 손상 (reperfusion injury), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), AIDS, 연관된 치매, 뉴런 독성, 알츠하이머병, 두부 외상, 어른 호흡기 질환 (ARDS), 급성 척수 손상, 헌팅턴병, 및 파킨슨병에서 존재하는 리간드 결합 분체들을 평가하는 방법들 및 이를 위한 조성물들을 포함한다.

본 발명은 펩토이드들, 펩타이드들, 올리고체들, 소분자들 및 자연적으로 유래되거나 합성적으로 만들어진 임의의 분자로부터 선택된 화합물들의 입자 기초 라이브러리들을 포함하고, 비드 또는 작은 입자와 같은 지지체 시스템 상에 놓아둘 수 있는 조성물들을 포함한다.

본 발명에 따르면, 약물에 대한 반응을 가리키는 항체들과 결합하는 펩토이드(들)을 포함하는 조성물들, 및 항체-포함 시료를 이에 고정된 펩토이드를 가지는 지지체와 접촉시키는 단계를 포함하는 항체-포함 시료에서 항체들을 검출하는 방법들이 제공된다. 리간드 라이브러리들은 화학식 I의 화합물들을 포함할 수 있고, 여기에서 아민 측쇄 또는 알파 탄소 둘 중 하나 상의 R 그룹들은 독립적으로 수소; 알킬; 아릴; 메틸; 에틸; n-프로필; 이소프로필; n-부틸; 이소부틸; n-부틸아민; 세크-부틸; 터르-부틸; 펜틸; 헥실; 이소펜틸; 아릴; 헤테로아릴; 퓨라닐; 인도릴; 티오페닐; 티아조릴; 이미다조릴; 이소옥사조일; 옥사조일; 피페로닐; 피라조일; 피롤릴; 피라지닐; 피리딜; 피리미딜; 피리미디닐; 퓨리닐; 시노리닐; 벤조퓨라닐; 벤조티에닐; 벤조트리아조릴; 벤조옥사조일; 퀴놀린; 이소옥사조릴; 이소퀴놀린; 고리알킬; 알케닐; 고리알케닐; 페닐; 피리딜; 메톡시에틸; (R)-메틸벤질; C _{0 -6} 알킬아릴; C _0-6 알킬헤테로아릴; OH, SH, 할로겐, OR ^l5 , COOR ¹⁵ , NR ¹⁵ (여기에서 R ¹⁵ 는 H 또는 C _{1 -6} , 알킬 또는 C _{1 -6} 알키닐로부터 선택됨) 또는 R ¹⁶ (여기에서 R ^l6 는 H 또는 C _{1 -6} 알키닐로부터 선택됨)로부터 선택된 C _{0 -6} 알킬; OC _{1 -6} 알킬; C _{2 -6} 알케닐; C _{2 -6} 알키닐; C _{2 -6} 알케닐; 및 C _{2 -6} 알키닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고- 본 명세서에서 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 가특허출원 제 61/467,256호의 표 1 및 표 2에서 기술된 하나 이상의 화학적 그룹들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 리간드 라이브러리는 지지체 상에 화학식 I의 화합물을 포함할 수 있고,

여기에서 R ₁ 은 전자 농축 아미노산 측쇄 Y로부터 선택되고;

R ₂ -R ₆ 는 독립적으로 H, -C ₁ -C ₆ 알킬, -C ₁ -C ₆ 알킬SCH ₃ , -C ₀ -C ₆ 알킬C ₂ -C ₆ 알케닐, -C ₀ -C ₆ 알킬 C ₂ -C ₆ 알키닐, -C ₁ -C ₆ COOH, -C ₁ -C ₆ 알킬OH, -C ₁ -C ₆ 알킬N(R) ₂ , -C ₃ -C ₈ 고리알킬, -C ₁ -C ₆ 알킬아릴, -C ₁ -C ₆ 알킬헤테로아릴, -C ₁ -C ₆ 알킬NC(O)C ₁ -C ₆ 알킬, -C ₁ -C ₆ 알킬고리아마이드로 이루어진 그룹들로부터 선택되고, 여기에서 임의의 아릴 또는 헤테로아릴기들은 독립적으로 -OH, Cl, F, Br, -OCH ₃ , -SO ₂ NH ₂ 또는 -O-CH ₂ -O-로 치환될 수 있는다.

복합 생물학적 유체를 검색하기 위한 무작위 리간드 라이브러리 (예로, 리간드 라이브러리들)의 화합물들은 전적으로 미국 가특허출원 제 61/467,256호 및 제 61/491,717호에 기술되어 있고, 이들은 본 명세서에서 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다.

본 발명의 큰 리간드 라이브러리들은 더 적은 지지체 구성원들 (예로, 100,000개 이하)을 사용할 필요 또는 생물학적 유체를 검색하기 이전에 이러한 펩토이드들 또는 리간드들을 마이크로어레이로 트랜스퍼해야 할 요구가 없이도 이러한 마커들을 위해 검색하도록, 적당한 실험적 조건들 하에 생물학적 유체에서 직접적으로 사용될 수 있다. 또한, 리간드 라이브러리들은 특정한 세포 표면 마커와 특이적으로 관련한 세포 기포 수용체들에 대해 검색하는 데도 역시 사용될 수 있다. 본 발명은 이전의 방법들과는 다르게, 복합 생물학적 시료들을 직접적으로 검색하도록 더 많은 수들의 비드들/레진들의 포함, 이에 따라 리간드 결합제 검색 또는 세포 수용체 검색의 둘 중 하나의 더 큰 라이브러리들을 허용한다.

마이크로어레이 시스템들에 관하여 이전에 기술된 바와 같이, 실질적으로 임의의 분자 또는 화합물은 무작위 비드 또는 레진 기초 라이브러리를 제작하는 데 사용될 수 있다. 이들 "분자들" 또는 "화합물들"은 천연 산물들 또는 인조 화합물들 또는 합성적으로 유래된 분자들을 포함할 수 있다. 이러한 분자들의 출처는 생물학적 시스템들으로부터 나올 뿐만 아니라 비-생물학적으로 유래된 출처일 수 있다. 본 발명에서 청구된 조건들 하에서 큰 비드 라이브러리들을 사용한 초기 검색의 목적들을 위한 바람직한 리간드들은, 부분적으로 임의의 기지의 단일체 아민으로부터 그리고 임의의 기지의 아세트산 할로겐화물 또는 치환된 아세트산 할로겐화물로부터 선택된 소단일체들로부터 만들어질 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 가특허출원 제 61/467,256호에서의 표 1은 단일치환된 아민 상의 R 그룹들의 범위를 제공한다.

일정 구현예들에서, 단일체들 및/또는 소단일체들은 시스테인, 글리신, 메티오닌, 아릴아민, 에탄올 아민, 이소부틸아민, 디아미노부탄, 메틸벤질아민 (라세미체 또는 거울상 이성질체), 피페로닐아민, 고리헥실아민, 3,4-디메톡시펜에틸아민, 벤질아민, N-(2-아미노에틸)아세트아마이드, N-(3-아미노프로필)-2-피롤리돈, 4-(2-아미노에틸)벤젠술폰아마이드 및 퍼퓨릴아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

아세트산 할로겐화물 및/또는 R 치환된 아세트산 할로겐화물, 여기에서 R은 아미노산 측쇄로부터 또는 단일 치환된 아민들 상에 이들 그룹들 또는 변수들을 포함하는 기타 다른 그룹로부터 선택된다. 대안적으로, 임의의 아민 및 임의의 아세트산 할로겐화물의 조합은 단일체를 형성하도록 반응될 수 있고, 다음으로 이는 본 발명의 올리고체를 형성하도록 성장하는 펩토이드 사슬 상에서 또 다른 반응성 단일체와 반응된다.

펩토이드들의 조합적 라이브러리들은 다음과 같이 제조될 수 있다: 지지체 또는 지지체 또는 레진 또는 비드 상의 링커와 부착된 시스테인 또는 메티오닌 단일체 아미노산을 가지는 펩토이드가 먼저 보호된 아미노산을 지지체 또는 지지체 상의 링커에 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 아미노산 (또는 올리고체 또는 상기 올리고체를 가지는 진단제에서 기능적 또는 다른 목적을 부여할 수 있는 원하는 아미노산이라면 모두)의 첨가에 이어서, 남은 단일체들이 표준 펩타이드 화학을 사용하거나 브로모아세트산 (또는 α-치환된 브로모아세트산 또는 유사한 반응물) 및 아민이 R 그룹으로 치환된 단일치환된 아민을 사용하여 첨가될 수 있다. R 그룹은 예를 들면 미국 특허공고 제 2010/0303805호 또는 제 2010/0303835호에서 기술된 것들 및/또는 주커만 (Zuckermann) 및 다양한 코다텍 (Kodadek) 출판물에서 기술된 것들을 포함하는 기지의 펩토이드 치환물이라면 모두로부터 선택될 수 있다. 바람직한 아민들은 본 명세서에서 인용된 라이브러리들로부터 선택된 것들이고, 여기에서 특정한 단일체 아민들은 1 내지 250 MM개의 비드 또는 레진 라이브러리들을 제작하도록 각각의 라이브러리에 첨가된다. 바람직한 라이브러리 크기는 상기 화합물들의 다양성을 가지는 1 MM 내지 50 MM개 비드들 또는 레진들의 범위를 가진다.

각각의 펩토이드들 만드는 공정은 일반적으로 (1) 지지체 상에 아미노산 반응물의 제조 (지지체 상의 선택적 링커를 포함함); (2) 할로겐화된 유도체를 형성하도록 브로모아세트산 또는 클로로아세트산과 같은 아실 할로겐화물과 상기 지지체 상의 아미노산 분체의 반응; (3) 아마이드를 형성하도록 단일치환된 아민과 할로겐화된 유도체의 반응; 및 (4) 펩토이드를 형성하도록 단계들 (2) 및 (3)의 반복:이 관여한다. 펩토이드들을 포함하는 시스테인은 전형적으로 더 큰 규모 정량들의 고친화도 펩토이드들을 원할 때 큰 비드 또는 레진 라이브러리들의 초기 검색에 이어서 만들어진다. 혈청과 같은 복합 생물학적 유체를 초기 검색하는 데 사용된 큰 비드 기초 라이브러리들에서, 마이크로어레이 검색들에 전형적으로 필요한 긴 PEG 링커를 위한 필요성 또는 요구는 전혀 없다. PEG 링커는 이것이 약 10개 단일체 단위들 이하의 짧은 링커인 경우라면 비드 또는 레진 상에 있을 수 있다. 약 50 마이크론 이하 (예로, 10 마이크론)의 비드들 또는 텐타겔 비드들을 포함하는 진단적 키트들에서, 짧은 PEG 링커들 (예로 2 내지 10개의 PEG 단일체들)를 사용하는 것이 유용하고 더 긴 PEG 올리고체들도 사용될 수 있다.

올리고체 제작 공정에서 각각의 단계를 수행하는 데 사용되는 조건들은 DMF 또는 아세토니트릴 또는 디클로로메탄과 같은 용매들을 사용한다. 트리플루오로아세트산은 절단의 목적들로 사용되고 피페리딘 또는 다른 적합한 염기는 브로모 유도체 밑 아민 간의 반응에서 염기로서 사용된다. 다양한 보호기들은 아미노산 반응물의 제조에 사용된다. 바람직한 구현예에서, 디아미노부탄은 펩토이드의 C-말단에서 시스테인 잔기와 인접한 사슬의 첫 번째 아민 소단일체로서 사용된다. 공정의 첫 번째 단계에서, 선택된 비드들 또는 레진들 (그램 또는 밀리그램 정량들)은 DMF와 같은 적합한 용매에서 팽창된다. 비드들이 상기 비드 상의 반응성 아민 상의 보호기로 보호되는 경우라면, 피페리딘과 같은 염기 용액은 비드를 탈보호하도록 DMF로의 연속적인 세척과 함께 반복적으로 첨가된다. 일단 비드가 탈보호된 경우라면 또는 텐타겔 비드와 같은 비드가 초기에 사용된 경우라면, 이것은 (각각의 비드와 반응하기에 충분한 몰 정량들로 질소 상에서 Fmoc 또는 다른 적합한 보호기로 보호되고 황 상에서 Trt (트리페닐메틸)로 보호된) 시스테인 또는 메티오닌과 같은 적합한 아미노산과 DMF와 같은 적합한 용매에서 반응될 수 있다. HBTU (테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트 (결합 시약) 및 4-메틸몰포린 (염기))가 보호된 아미노산과 함께 비이커 (또는 튜브 또는 플라스크)에 넣은 비드 용액으로 첨가되고 레진 상에서 (또는 레진 상의 링커 상에서) Fmoc/Trt 보호된 아미노산을 형성하도록 실온에서 진탕된다. 다음으로 비드들은 DMF와 같은 용매로 다수 번 세척된다. 다음으로 Fmoc기는 또 다른 보호된 아미노산과 같은 또 다른 반응물 또는 브로모아세트산 및 활성화 제제, 예로 DIC (3-이소프로필카보디이미드)와 같은 소단일체와 아미노산 상에서 아민의 반응을 허용하는 적합한 시약을 사용하여 적합한 용매로 가열 (교반하면서 전자레인지 처리) 하에 탈보호된다. 다음으로 결과로 얻은 비드들은 복수 회 세척된 다음 (약간 과다 몰의) 원하는 단일체 아민과 적합한 용매로 가열 하에 처리된다. 결과로 얻은 비드들은 복수 회 세척되고 다음으로 올리고체 및 올리고체 라이브러리를 제작하도록 브로모아세트산 및 선택적 아민과 반복적으로 처리된다. 펩토이드들은 트리플루오로아세트산을 사용하여 비드들로부터 절단될 수 있다. 바람직한 구현예들 - 예로, 1-일-n-부틸아민을 가지는 단일체와 인접한 두 개 아미노산들을 가지는 펩타이드들을 포함하는 이들 펩토이드들을 위한 대안의 또는 다른 적합한 공정은 C-말단 상에 두 개 아미노산들을 가지는 펩토이드를 제작하는 단계를 포함하고, 두 번째 아미노산이 라이신인 소단일체 공정에서 제작된 단일체들이라면 모두를 첨가하는 단계를 더 포함하는 공정으로 이어진다. 이것은 α-치환된 브로모아세트산 소단일체들을 만들도록 임의의 단일체 또는 소단일체의 선택을 더 포함하고, 여기에서 탄소 치환물들은 전형적인 아미노산 측쇄들로부터 선택되어 반응물들의 반응 이후에 α-치환된 펩토이드들을 형성할 수 있고 여기에서 R기는 펩토이드 사슬 상의 탄소 또는 펩토이드 사슬 상의 질소의 둘 중 하나 또는 둘 다 상에서 발견된다. α-탄소 또는 질소 둘 중 하나의 위에 치환물들은 실질적으로 본 명세서에서 재인용된 임의의 치환물일 수 있다.

소분자들의 조합적 라이브러리들은 상업적으로 획득되거나 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, Bichler et al., 1995; Cho et al., 1999; LePlae et al., 2002; Ostergaard and Holm, 1997; Yang et al., 1999을 참조한다. 또한, 미국 특허 제 6,344,334호 및 출판물들 Gallop et al., (1994); Gordon et al., (1994); Thompson 및 Ellman (1996)도 역시 이러한 분자들 및 라이브러리들의 출처들이다.

펩타이드들의 조합적 라이브러리들은 상업적으로 획득되거나 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, Stewart 및 Young (1984); Tam et al., (1983); Merrifield (1986); 그리고 Barany 및 Merrifield (1979)을 참조하라, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

각각의 경우에, "리간드들" 또는 무작위 리간드들은 지지체 레진들에 첨가되거나 검색 라이브러리들을 형성할 비드들이 본 명세서에서 기술된 조건들 하에서 복합 생물학적 유체의 바이오마커들을 위해 검색하는 데 사용된다. 바람직한 리간드들은 펩토이드 리간드들이다.

이러한 라이브러리들을 제작하고/하거나 사용하는 것에 추가하여, 임의의 이러한 리간드를 특성분석하고 정제하고/하거나 합성하거나 재합성하는 것이 필요하거나 기대될 수 있다. 이러한 방법들은 당해 기술분야에서 알려져 있고 크로마토그래피 수단에 의한 HLPC 또는 화학적 수단에 의한 정제 방법들; 질량 스펙 또는 NMR 또는 임의의 이들 방법들의 조합들과 같은 특성분석 방법들의 전 범위를 포함한다. 이러한 방법들은, 예를 들면 미국 특허공고 제 2007/0003954호에서 더 기술되고 이는 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합된다. 이러한 경우들에서, 임의의 이러한 정제된 리간드가 화합물 또는 실질적으로 정제된 화합물로서 언급될 수 있다.

본 발명의 초기 검색 방법론에서, 비드들 및/또는 레진들은 상기 지지체에 작동적으로 연결된 올리고체를 가지는 지지체 수단으로서 사용된다. 이러한 초기 검색으로부터 "히트들" 또는 "잠정적 히트들"을 가지는 진단적 키트들 또는 다른 키트들에서, 지지체 시스템들은 마이크로어레이들 또는 기타 다른 기지의 진단적 플랫폼들을 포함하는 실질적으로 임의의 지지체 시스템로 확장될 수 있다. 이들 경우들에서, 이러한 키트들 또는 잠정적 히트들을 가지는 다른 지지체 시스템들은 또한 이러한 리간드들과 부착된 리간드 결합 분체들을 가지는 리간드들의 검출을 허용하도록 검출기 또는 검출 방법들을 가지거나 가지도록 적응되는 점을 보증하는 것이 필요하다. 바람직한 검출 방법들은, 예를 들면 엘라이자 또는 표지된 이차 항체들의 사용이 관여하는 다른 방법들을 포함한다.

지지체들은 임의의 적합한 물질로 만들어질 수 있다. 이러한 지지체를 만드는 데 사용된 물질들은, 예를 들면 유리, 플라스틱, 세라믹 또는 중합성 레진들 또는 비드들을 포함할 수 있다. 지지체들은 니켈, 주석, 철강, 또는 기타 금속들 또는 금속들의 혼합물들과 같은 물질들도 역시 포함할 수 있다. 지지체들은 리간드 또는 리간드 상의 활성기와 결합하거나 연결되거나 반응하도록 링커들 및/또는 다른 수단들을 가지도록 역시 조정될 수 있다. 이러한 그룹들도 역시 미국 특허공고 제 2007/0003954호에 기술된다. 본 발명에서, 지지체에 또는 링커 다음으로 상기 지지체에 결합된 개별 리간드들을 가지는 레진들 또는 비드들의 수는 100 K개 및 150 백만 (MM)개 이상의 범위를 가진다. 본 발명의 초기 검색 방법들에서 사용된 바람직한 수는 1 MM개 및 2 MM개의 리간드들/레진들 사이의 범위를 가진다.

텐타겔® 레진들은 본 발명의 큰 리간드 검색 방법론을 위해 가장 바람직하다. 이들 레진들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 또는 POE)이 위에 접목된 낮은 교차결합된 폴리스티렌 기질로 구성된 접목된 공중합체들이다. 텐타겔 레진들은 시판되고 있다 (Rapp Polymere GmbH). PEG가 소수성 및 친수성 성질들을 가진 "카멜레온 유형"의 중합체이기 때문에, 접목 공중합체는 변형된 화학적 성질들을 보여준다. 제조사에 따르면, 원칙적으로 PEG를 변형된 폴리스테렌 기질 상에 도입하는 두 가지 방식들이 존재한다. 가장 단순한 고정화 절차는 고전적인 에테르 합성에 따라 PEG를 그의 말단 하이드록실기들의 하나를 통해 클로로메틸화된 폴리스티렌과 연결하는 것 또는 고체 지지체 상의 연결을 위해 다른 이중기능적 PEG's를 사용하는 것이다. 제조사는 PEG를 기질 상에 단계별로 직접 세우는 음이온성 접목 공중합화에 의해, 분자적 질량 20 킬로달톤까지의 PEG 사슬들이 기능화된 교차결합된 폴리스테렌들 상에 고정되었다. 약 2000 내지 3000 달톤의 PEG 사슬들을 가진 접목 공중합체들은 역학적 속도들, 운동성, 팽창 및 레진 수용력의 측면에서 최적인 것으로 입증되었다. 10개 이상의 에틸렌 옥사이드 단위들을 가진 단일분산 PEG를 중합화 기법들에 의해 얻는 절차가 전혀 존재하지 때문에, 이론적으로 10개 이상의 에틸렌 옥사이드 단위들을 가진 단일분산 PEG를 레진에 도입하거나 폴리스테렌 골격 상에 직접 중합화에 의해 단일분산 PEG를 얻는 방식은 전혀 존재하지 않는다 (단일분산은: 분자량 배분이 없는 PEG로서 정의됨). 이들 접목 공중합체들은 압력 안정하고 회분식 공정들에서뿐만 아니라 연속적 유동 조건들 하에서 사용될 수 있다. 공중합체는 약 50 내지 70% PEG (w/w)를 포함한다. 이들 중합체들의 성질들은 폴리스티렌 기질에 의해서와 대비하여 PEG의 성질들에 의해 매우 지배된다.

"하나의 비드 하나의 화합물" 접근법에 의해 화학적 라이브러리 또는 펩타이드 라이브러리를 세우기 위하여, 소정의 양의 레진 내에서 사용가능한 비드들의 수뿐만 아니라 단일 비드들의 수용력을 알아내는 것이 필수적이다. 표 2는 일정 입자 크기들을 요약하고 그들을 단일 비드의 해당하는 수용력과 상관시킨다. 계산들은 0.25 내지 0.3 mmol/g의 범위를 가지는 텐타겔 비드들의 전형적인 로딩을 기초로 한다. 분석적인 특성분석을 위해 적어도 5 pmol의 레진-결합 펩타이드가 비드 상의 서열결정을 위해 필요하다. 경제적으로 조작될 수 있는 라이브러리를 위한 최적 레진 정량을 추정하기 위하여, 비드 크기들 및 비드 수용력들을 고려해야 한다. 분산 공정의 균질성 및 역학적 속도들의 측면에서뿐만 아니라 단일 비드 분석 및 단일 비드 정량화를 위해, 우리의 비드들 모두는 매우 협소한 크기 분포를 보여준다.

입자 크기, 레진 그램 당 비드들의 수 및 단일 비드 당 수용력의 상관관계. 단일 비드 수용력의 계산은 0.25 내지 0.3 mmol/g 레진의 수용력을 기초로 한다.

그들의 적용에 의존하여 재단된 성질들을 보여주는 사용가능한 여러 유형들의 텐타겔 레진들이 존재한다.

텐타겔 S 레진들:

PEG 공간체 (spacer)가 알킬 연결 (linkage)을 통해 폴리스티렌 골격과 부착된다. 본 연결은 산들 또는 염기들에 민감하지 않다. 본 유형의 레진은 펩타이드 합성, 고형상 유기합성 또는 조합 화학에 사용된 표준 유형의 레진이다.

텐타겔 PAP 레진들:

PEG는 벤질 에테르 연결을 통해 폴리스티렌 골격과 부착된다. 본 벤질 에테르 연결은 100 % TFA 또는 TFA/TMSBr의 혼합물들처럼 엄격한 산 조건들에 민감하다.

이들 특별하게 재단된 레진들은 면역화 절차들을 위해 또는 PEG 변형된 유도체들 (PEG 부착된 산물들)을 합성하는 데 사용된다. 엄격한 산 조건들을 사용하여, PEG 공간체는 합성된 화합물과 함께 고형 지지체로부터 절단되어 고체상 조건들을 적용하여 용해성 PEG 변형된 화합물들을 얻는다 (예로, PEG 변형된 펩타이드들).

텐타겔 N 레진들:

PEG 공간체가 벤질 에테르 연결을 통해 폴리스티렌 골격과 부착된다. 이들 재단된 레진들은 소규모 및 대규모 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 올리고뉴클레오타이드 화학에 사용된다. CPG 유리와 비교하여, 수용력은 팩터 10까지 증가된다.

텐타겔 레진은 폴리스티렌 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 구성되는 공중합체들이기 때문에, 염기 중합체들 둘 다의 화학적 및 물리화학적 성질들이 고려되어야 한다.

PEG 자체는 흡습성 중합체이다. PEG 에스테르들이 매우 안정하지 않고 쉽게 가수분해되는 점이 문헌으로부터 알려져 있다. 보관 조건들 및 보관 시간에 의존하여, PEG 자체는 폴리에스테르 사슬을 따라 산화되어 과산화물들 또는 에스테르들을 형성할 수 있다. 결론적으로, 산 처리 또는 염기들로의 처리는 적은 양의 "PEG-연결"을 가져하는 형성된 PEG - 에스테르들을 가수분해한다. 본 연결은 PEG 신호들로서 MS 또는 NMR 및 최종 산물의 불순물들에 의해 관찰될 수 있다. 본 화학적 행동은 모든 PEG's - 및 PEG 기초 중합체들에 해당된다.

텐타겔 비드들에 추가하여, 다른 레진들 및/또는 입자들이 비드 라이브러리 당 하나의 리간드를 제작하도록 사용되었다. 예를 들면, 가볍게 교차-연결된 폴리스티렌 레진들 또는 폴리아마이드 레진들이 사용될 수 있다. 기질물질 (substrate)을 레진 비드와 결합하는 그룹은 고체상 합성의 필수적인 부분일 수 있다. 링커는 특수화된 보호기이고, 이것이 합성의 종결 시 재출현하도록 이 시간 동안 기능기를 잡을 것이다. 링커는 부착된 화합물을 변형하거나 연장하는 데 사용된 화학에 의해 영향을 받지 않아야 한다. 또한 마지막으로 절단 단계가 바로 좋은 수율로 진행되어야 한다. 최상의 링커는 정량적 수율로 부착 및 절단을 허용해야 한다.

소정의 관점들에서, 지지체는 비드, 플레이트, 딥스틱, 필터, 막, 핀 또는 웰일 수 있다. 시료는 혈액, 혈청, 타액 또는 CSF일 수 있다. 검출은 RIA, FIA, 엘라이자, 웨스턴 블럿, 유동 세포측정법, FRET, 또는 표면 플라스몬 공명을 포함할 수 있다.

카복실산 링커들

펩타이드 합성에 사용되는 첫 번째 연결기는 고체상 합성의 아버지의 이름을 보유한다. 왕의 레진은 클로로메틸기로 기능화된 교차-연결된 폴리스티렌이다. 카보닐기는 DMF에 녹인 세슘 카복실레이트 염으로 염소의 핵친화성 치환에 의해 부착된다. 카복실산를 재생하는 절단은 보통 불화수소에 의해 달성된다.

카복실산을 위해 사용된 두 번째 부류의 링커는 왕 링커이다. 본 링커는 일반적으로 교차-연결된 폴리스티렌, 텐타겔 및 폴리아크릴아마이드와 부착되어 완 레진을 형성한다. 이것은 Fmoc-보호 전략을 사용하여 펩타이드 카복실산들의 합성을 위해 설계되었고, 활성화된 벤질 알코올 설계로 인해, 카복실산 산물은 TFA로 절단될 수 있다. 왕의 레진의 더욱 산-불안정 형태가 개발되어 왔다. SASRIN 레진은 왕 링커와 동일한 구조를 가지지만, 메톡시기의 첨가로 산 촉매된 절단 동안 형성된 카로보늄 이온을 안정화한다.

카르복사마이드 링커들

연결 링커는 일반적으로 고체상 상의 일차 카르복사마이드를 생성하는 데 선호된다. 본 발명에서, 본 링커는 본 발명의 일차적인 검색으로부터 히트들 또는 잠정적 히트들을 제조하거나 재합성할 때 사용된다. 이러한 경우들에서, 시스테인은 연결 링커와 반응된 첫 번째 단일체이고 다음으로 공정은 올리고체를 제작하도록 연속적 단일체 첨가 또는 올리고체를 제작하도록 연속적인 소단일체 화학이 관여한다. 연결 링커에서 더 큰 산 민감성은 두 개의 추가적인 전자 공여 메톡시기들의 결과이다. 일차 카르복사마이드의 생성에서, 시작 물질은 카복실산으로서 링커와 부착되고 합성적 변형 이후에 TFA로 레진으로부터 절단된다.

TFA-촉매된 절단에 이어서 카복사마이드를 생산하도록 연결 레진의 사용.

알코올 링커들

테트라하이드로피라닐 (THP) 보호기를 기초로 하는 하이드록실 링커는 톰슨 및 엘만에 의해 개발되었다. 모든 유형의 알코올들이 디하이드로피란에 바로 첨가되고 결과로 얻은 THP 보호기는 강한 산에 안정하지만 산으로 쉽게 절단된다. 본 링커는 메리필드의 레진과 부착된다. 트리틸기는 β-머캅토케톤들의 라이브러리의 합성에서 알코올들을 고정하는 데 사용되어 왔다.

카바메이트류 및 아민류 링커

카바메이트류 링커는 트리파노조마성 기생충 감염들의 저해제들의 탐색에서 제조된 576개 폴리아민들의 조합적 라이브러리의 합성에 사용되어 왔다. 하나는 하이드록시메텔벤조산 을 기초로 하였고 1, 다른 하나는 전자-공여기가 첨가되었다 2. 마지막 것은 TFA에 의한 절단을 허용하였던 한편 첫 번째 것은 강한 산 조건들로 절단될 수 있었다.

매우 유용한 링커가 삼차 아민의 생성을 위해 최근 개발되었다. (삼차 아민들은 공통적으로 약물 분자들에 사용된다.) 일차 및 이차 아민들은 마이클 첨가에 의해 링커로 도입된다. 아민은 레진-결합된 사차 암모니움 이온을 주도록 알킬화될 수 있다. 중간 정도의 염기 조건에서, 호프만 제거가 고순도의 삼차 아민들을 주도록 일어난다.

무자국 링커들

일정 경우들에서, 시작 물질들은 카복실산과 같은 한 가지 형태로 레진 상에 로딩되고 또 다른 형태, 예를 들면 카복사마이드로 절단된다. 이것은 표적 화합물이 방출된 기능을 요구하는 경우라면 완벽하게 허용가능하다. (펩타이드들은 변함없이 카복실산 또는 카복사마이드를 포함한다.) 그러나, 낮은 분자량 비-펩타이들의 조합적 라이브러리들에서 관심 있는 성장은 새로운 유형들의 링커의 필요성을 표현하여 왔다. 이들 링커들은 절단 이후에 비-특이적 기능을 보여준다. 무자국 링커들은 최종 화합물의 조사가 고체상과 연결 지점의 자국을 전혀 드러내지 않기 때문에 이와 같이 불린다.

시료들

이전에 논의된 바와 같이, 본 발명의 공정에서 분석을 위해 제조된 복합 생물학적 유체들은 세포들 (T-세포들 또는 다른 면역 효과기 세포들을 포함하는 비-부착성 세포들), 미생물들, 단백질들, 지질들, 탄수화물들, 소분자들, 유기분자들, 무기분자들, 생물학적 분자들 상에 발현되는 마커들을 포함하고, 이러한 복잡한 환경에서 검출가능하거나 반응가능한 임의의 분체를 포함하는 잠재적인 바이오마커들의 숙주를 포함하거나 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 마커들은 항체들이고, 상세하게는 질환 또는 병태의 결과로서 생성된 항체들이다. 바람직한 구현예에서, 혈청, 혈장, 타액 또는 기타 유체들 또는 환자 또는 동물 또는 유기체로부터 유래된 시료들은 이러한 마커들의 출처이다. 각각의 시료 또는 조직 또는 생물학적으로 유래되거나 환경적으로 유래되거나 획득된 시료는 상기 시료를 최기 검색 또는 이러한 바이오마커들에 대한 친화도를 가지는 잠적적인 히트들 또는 리간드들을 사용한 임의의 연속적 검색에 노출하기 위하여 조정되거나 처리되거나 희석되거나 달리 조작된다. 시료들은 기저값 수준들 또는 노이즈 및 리간드 결합 분체와 리간드의 결합과 연관된 신호들 간의 충분한 구별을 제공하거나 허용하도록 본 명세서에서 인용된 방법들을 따라 희석된다.

이러한 시료들에 리간드들/지지체들을 노출하는 데 필요한 시간 및/또는 조건들은 특정한 시료 및 다른 요인들에 의존한다. 청구된 발명의 공정을 위한 바람직한 조건들은 본 명세서에서 더 기술된다. 거의 모든 경우들에서, 세척 또는 용출 단계들 및 다른 조정 수단은 큰 리간드 라이브러리 및/또는 이러한 라이브러리로부터 유래된 리간드들 또는 키트들에 생물학적 유체의 노출에 이어서 사용된다. 수용성 용액들이 HEPES 완충액, 트리스 완충액 또는 포스페이트 완충된 식염수과 같은 완충된 용액들을 포함하여 사용된다. 지지체 시스템들도 역시 지지체 표면으로부터 "복합"의 탈착 또는 이온화를 용이하게 하도록 에너지 흡수 물질들로 처리될 수 있다. 화학적 수단도 역시 지지체들로부터 리간드-리간드 결합 분체 복합체들을 탈결합하거나 제거하는 데 사용된다.

리간드-리간드 결합 분체 복합체들을 지지체 상에서 검출하는 검출 방법들은 광학분석 및 비-광학분석 수단들을 포함한다. 이러한 방법들은 공정이 흡광도, 형광, 반사 지표, 편광화 또는 광 분산을 검출하고 측정하는 방법을 포함하는 점을 보증하는 것을 포함한다. 이들은 이러한 매개변수들을 측정하도록 직접적 및/또는 감접적 수단들을 포함한다. 형광이 관여하는 방법들은 엘라이자 또는 샌드위치 검정법과 같은 면역학적 방법들에서 형광 표지화를 포함한다. 반사 지표가 관여하는 방법들은 표면 플라스몬 공명 (SPR), 회절격자 결합된 방법들 (예로, 감지기 일정 회절격자 커플러들, 파장-문진된 광학 감지기들 (WIOS) 및 소리내는 회절격자 커플러들), 공명성 거울 및 간섭측정 기법들을 포함한다. 광 분산 방법들도 역시 사용될 수 있다. 태그화 및/또는 분리 및/또는 검출을 위한 기타 수단은 자기적 수단도 역시 포함할 수 있다. 자기 공명 영상화, 기체상 이온 분광분석법, MRI가 모두 사용될 수 있다.

전형적으로 생성된 데이타의 분석은 대조군 또는 참조 대비 검출된 바이오마커로 인한 신호의 정량 측정이 관여한다. 데이타는 적합한 수단이라면 모두에 의해 분석될 수 있다. 컴퓨터들 밑 컴퓨터 프로그램들이 데이타를 생성하고 분석하는 데 사용될 수 있다. 비드들 및/또는 다른 지지치들은 컴퓨터 암호화되거나 확인 목적들을 위해 암호화될 수 있다. 데이타 분석은 검정 또는 검출 방법의 특정한 조건들 하에서 신호 강도의 분석을 포함한다. 리간드들, 리간드 결합 분체들 또는 참조 분체들 및/또는 이차 검출 분체들이 표지되거나 방사성-표지되거나 검출가능한 분체로 태그화된다. 당업자들이라면 질환 연관된 바이오마커들을 가지는 생물학적 유체 대비 이러한 마커를 포함하지 않는 이들 대조군 또는 건강한 환자 간의 차이 및/또는 구별을 평가할 수 있다. 당업자들이라면 또한 본 명세서에서 기술된 방법들에 따라, 위양성들 또는 대조군 시료들에 있거나 이에서 찾을 수 있는 다른 히트들의 존재를 결정하여 이러한 "히트들"을 설명하고/하거나 제거할 수 있으며, 당업자들이라면 본 명세서에서 기술된 방법들에 따라, 임의의 질환 또는 병태를 가지는 환자 시료들에서 질환 연관된 바이오마커들을 결정하거나 찾는 공정을 계속할 수 있다. 모든 경우들에서, 이러한 히트들의 "검출"은 본 명세서에서 기술된 것들과 같은 리간드 라이브러리의 리간드들과 질환 연관된 바이오마커와 같은 리간드-결합 분체 또는 다른 마커의 결합을 검출하기 위한 수단에 의해 달성된다.

본 명세서에서 재인용된 질환 및/또는 병태와 연관된 바이오마커들은 특정한 환자 또는 동물 또는 평가된 다른 유기체의 질환 및/또는 병태의 특정한 단계에 의존하여 다양화할 수 있다. 잠정적 히트들 및 본 명세서에서 인용된 화합물들인 리간드들은 먼저 면역 반응 및/또는 항체들 또는 면역 세포들의 형성을 개시하는 자연적 항원을 모방하도록 대부분의 경우들에서 기대된다. 본 발명 및 본 명세서에서 청구되고 재인용된 검색 공정은 특정한 항원 또는 항원에 반응하여 생성된 항체 둘 중 하나의 지식을 요구하지 않는다. 그러나, 리간드들은 검색들 및 본 명세서에서 재인용된 진단적 방법들에서 유용한 것에 추가하여 그들 자체로도 백신들 또는 약물 후보들로서 유용할 수 있다. 따라서 본 발명은 화합물들 및 약제학적 조성물들을 포함한다.

펩토이드 검색들:

하나의 비드-하나의 화합물 (OBOC) 조합적 펩토이드 라이브러리들을 검색하기 위하여, 수천 내지 수백만 개의 펩토이드 보유 비드들의 수십 개가 제조되었고 다음으로 복합 생물학적 시료와 혼합되었다. 초기 복합 생물학적 시료는 바람직하게 대조군 시료이고 다음으로 대조군 히트들을 "제거한" 리간드 라이브러리로 처리된 연속적 복합 생물학적 시료는 병든 복합 생물학적 시료에 대해 처리되고/되거나 검색된다. 적어도 하나의 질환 연관된 바이오마커와 상호작용하는 리간드들/비드들은 다음으로 검출되고, 확인되고, 분리되고/되거나 특성분석된다. 바람직한 구현예에서, (1) 비드 제조, (2) 복합 생물학적 유체의 검색 및 (3) 히트들의 검출을 포함하는 텐타겔 검색 프로토콜이 사용된다.

펩타이드 검색들:

하나의 비드-하나의 화합물 (OBOC) 조합적 펩토이드 라이브러리들을 검색하기 위하여, 수천 내지 수백만 개의 펩토이드 보유 비드들의 수십 개가 제조되었고 다음으로 본 명세서에서 기술된 공정들에 이어서 복합 생물학적 시료와 혼합되었다. 다음으로 질환 연관된 바이오마커들과 상호작용하는 비드들이 확인되었고 화합물 구조 결정을 위해 분리되었다. 예를 들면, 스트렙트아비딘 (SA)를 탐침 단백질로서 사용하고 적색 형광 염료으로 표지되고 비형광 비드들로부터 형광을 분리하는 COPAS BIO-비드 유동 선별 기구를 사용한 OBOC 펩타이드 라이브러리 검색이 수행될 수 있다. Marani et al ., J. Comb . Chem . , 2009, 11 (1), pp 146-150를 참조하라. 사용될 수 있는 적색 염료들은 ATTO 590 및 텍사스 레드이다. 라이브러리를 SA-적색 형광 염료 결합체와 배양한 이후에, 펩타이드-SA 상호작용에 의해 유도된 양성 비드들이 획득되었다. 비드들은 매트릭스-지원된 레이저 탈착 이온화 비행시간 질량 분광분석법 (MALDI-TOF MS)에 의해 분석된다. 따라서, 펩타이드 라이브러리들이, 초기 대조군 생물학적 시료들은 시작 화학물 라이브러리로부터 임의의 리간드/비드 히트들을 제거하는 데 사용되고, 라이브러리의 남은 구성원들은 다음으로 병든 복합 생물학적 시료에서 임의의 히트들을 검색하는 데 사용되는 본 명세서에서 기술된 공정과 유사한 방식으로 펩토이드들과 함께 사용될 수 있다. 이들 히트들은 다음으로 임의의 진단적 키트들에서 진행되는 잠정적 히트들이다.

유사한 방식으로, 임의의 리간드가 본 명세서에서 기술된 공정들을 사용하여 비드들 또는 지지체들 상에서 검색될 수 있다. 이들 리간드들은, 펩토이드들 또는 펩타이드들에 추가하여 핵산 올리고체들, 탄수화물들, 소분자들 및/또는 라이브러리들 내로 제작되고 본 명세서에서 재인용된 조건들 하에서 복합 생물학적 유체를 검색하는 데 사용될 수 있는 그들의 조합이라면 모두를 포함한다.

키트들 및 진단적 도구들

본 명세서에서 기술된 임의의 화합물들 또는 조성물들은 임상적 또는 연구실 설정 둘 중 하나에서 진단적 키트들에서 또한 사용될 수 있다. 이들 키트들은 단순한 휴대용 진단적 검정들로부터 복합 및 다중복합 기구들 또는 탐침들까지의 범위를 가질 수 있다. 지지체 시스템들 및 핵심 지지체/리간드 시스템을 감싸는 "포장"은 잠정적 히트들 및/또는 재합성되고 이러한 적합한 플랫폼들 상에 장착된 히트들을 포함하도록 설계된 현재 시판되는 키트들로부터 선택될 수 있거나 그들은 새로이 설계된 진단적 키트들로 사용될 수 있다. 키트들은 전형적으로 키트가 설계된 목적의 특정한 질환 또는 병태를 위해 검색하고/하거나 진단하는 데 사용되도록 적합한 반응시약들 및 지침들을 모두가 동반될 것이다. 이러한 키트 또는 방법이라면 적어도 하나의 잠정적 히트 또는 본 명세서에서 재인용된 검색 방법에 따라 확인되었던 리간드를 포함할 것이다. 본 리간드 또는 다수의 리간드들은 동일한 리간드 또는 본 발명의 화합물들을 포함하는 리간드들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 리간드들은 질환 연관된 바이오마커에 대한 그들의 친화도를 기초로 하여 하나의 특정한 질환 상태 또는 질환들 또는 병태들의 그룹 또는 한 벌을 위해 선택될 수 있다. 바람직한 리간드들은 펩토이드 리간드들이다. 키트들은 특정한 질환 또는 병태를 진단하는 의사들을 위한 지침들 및 특정한 키트 및 질환 상태 또는 병태에 대한 특이적 라벨링도 역시 포함할 것이다. 본 발명은 따라서 본 명세서에서 기재된 라이브러리들의 임의의 하나를 사용한 초기 검색으로부터 찾아낸 및/또는 본 명세서에서 재인용된 특이적 방법들에 따라 알려진 잠정적 펩토이드들 또는 리간드들과 같은 필수적 구성성분들 모두 및 라벨링 지침들을 포함하는 키트의 조합을 포함한다. 본 명세서에서 기재된 특정한 공정들 및 방법들 그리고 재료들은 숙련된 기술자의 관리 하에 임상적 및 연구실 설정에서 사용될 수 있다. 키트들 및/또는 기구들 또는 장비들은 질환 연관된 항체들 및/또는 세포들에 특이적인 펩토이드들과 같은 리간드들을 포함한다. "키트"는 완전한 진단적 키트 또는 검색 키트를 포함할 수 있거나, "키트"는 이러한 진단적 펩토이드들, 자가항체와의 상호작용 및 이로부터 발견의 결과로서 발견되고 정제되고/되거나 특성분석된 원래의 항원들을 통해 발견되고 특성분석된 항체들을 포함하거나 (containing) 구성하는 (comprising) 구성성분들 또는 소-구성성분들을 포함할 수 있다. 이러한 항체들 및 정제된 항원들은 본 발명의 일부를 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 명세서에서는 질환의 진단을 위한 키트가 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서는 질환을 치료하는 키트가 제공된다. 본 키트는 리간드 라이브러리, 생물학적 시료에 대해 리간드 라이브러리를 검색하기 위한 검출 반응시약들, 검색을 위한 아쥬반트들, 및 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 포장 삽입물은 진단적 단계들을 수행하기 위한 지침들, 약물 투여를 결정하기 위한 지침들, 및 결정을 기초로 하여 약물을 투여하기 위한 지침들을 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 키트는 FDA에 의해 승인된 라벨 또는 다른 국가들에서 약물 승인 증명서가 되는 포장 삽입물을 포함할 수 있다.

본 발명의 리간드 라이브러리들은 질환 연관된 바이오마커들과 결합하는 리간드들을 찾고 결정하는 데 사용된다. 이러한 리간드들은 다음으로 질환 상태들 또는 병태들을 평가하거나 검색하거나 진단하도록 상기에 일반적으로 기술된 키트들 및/또는 방법들에서 사용된다. 이들 진단적 방법들은 전형적으로 항체들 및/또는 다른 생물학적 마커들을 포함하는 질환 연관된 바이오마커들에 대해 검색하고 찾는 단계가 관여한다. 상기에 진술된 바와 같이, 이들 항체들은 혈액 시료들로부터 이러한 항체들을 고르거나 제거하도록 적합한 컬럼들 상의 본 발명의 리간드들을 사용하여 더 확인되고 특성분석될 수 있다. 항체들은 다음 순서로 이러한 항체와 연관된 원래의 항원을 탐색하고 발견하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 항체들 및 이러한 항체들과 연관되고 본 발명의 방법들을 사용하여 발견되고 분리되고 특성분석된 정제된 항체들을 둘 다 포함한다.

질환 상태들 또는 병태들에 대해 검색하고/하거나 진단하는 키트들 및/또는 다른 수단들은 먼저 환자 시료들에 대해 평가되어야 한다. 이들 환자 시료들은 정상 대조군 시료들로부터 또는 상기 환자가 질환 또는 변태를 가지거나 가질 것으로 의심된 환자로서 확인되었던 환자 시료들로부터 유래될 수 있다. 환자는 질환 연관된 바이오마커의 "존재"를 넘어 질환과 연관된 다른 증상들을 가질 수 있다. 환자는 질환의 초기 단계에 있을 수 있거나 질환 또는 병태를 전혀 가지지 않을 수 있거나 특정한 질환의 말기 단계에 있을 수 있다. 임의의 임상적 맥락에서 그리고 적당한 지침들 및 조절들 하에서, 환자 및 임상적 시료들은 미고지된 방식으로 제공되고 다음으로 본 발명의 화합물들을 사용하여 평가될 수 있다. 검색의 결과로서 생성된 데이타는 다음으로 고지 이후에 임의의 특정한 환자 또는 환자들의 그룹에 대한 통계학적으로 유의한 결과들 또는 기지의 또는 근간이 되는 데이타와의 상관성들을 찾거나 찾지 못한 것으로 분석될 수 있다. 본 발명은 (1) 환자로부터 얻은 생물학적 시료를 본 발명의 적어도 하나의 화합물로 검색하는 단계; (2) 상기 적어도 하나의 화합물을 사용하여 대조군 생물학적 시료를 동일한 조건들 하에서 검색하는 단계; 및 (3) 환자 데이타 대비 건강한 대조군 데이타를 비교하여 질환 연관된 바이오마커의 존재 또는 부재를 결정하는 단계;를 포함하는, 질환 또는 병태의 존재에 대해 검색하는 방법을 포함한다. 질환 X를 가지거나 가질 것으로 의심된 환자들의 그룹 또는 환자 시료들은 본 발명의 적어도 하나의 화합물을 가지는 키트 또는 진단적 탐침에 대항하여 검색될 수 있고, 각 환자에 관하여 생성된 데이타는 사례별 기초로 하여 질환 상태 또는 병태 또는 그의 결여를 입증하거나 확인하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 생성된 이러한 데이타는 환자의 병태를 평가하고 치료 선택사항들을 제공하는 의사들에게 지침을 제공하도록 해당 특정한 환자에 대하여 알려진 정보 전부와 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 검색의 결과로서 생성된 "정보"는 약물 요법을 받는 개별 환자들을 평가하도록 임상시험 설정에서 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 본 명세서에서 기술된 방법들에 따라 수행된 검색의 용도를 포함하는 임상시험 진행을 평가하는 방법을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 질환 연관된 바이오마커를 검출하도록 본 명세서에서 청구된 검색 또는 화합물의 용도를 포함하는 초기 질환을 검색하거나 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 마커들의 검출이 질환의 공격적 진행 이전에 잘 일어나는 것으로 기대되는 초기 암 개입의 맥락에서 특히 유용하다. 또 다른 맥락에서, 심혈관 질환 및/또는 대사적 질환뿐만 아니라 신경학적 질환의 초기 개입은 생명들을 구하고 조기 의학적 개입 또는 치료 없이 이러한 질환들의 심화 발생을 예방하거나 예방하는 데 유용할 것으로 기대된다.

본 발명은 대조군 또는 표준 용액 및 질환 연관된 바이오마커를 포함하는 복합 생물학적 유체 간의 차이의 해상도 또는 효율을 증가시키는 방법들도 역시 포함한다. 예를 들면, 방법들은 완충액들 및/또는 대장균 용출물 및/또는 라이신과 같은 조정화 제제들로 시스템/혈청을 전조정하거나 전처리하거나 전차단하는 단계를 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, (a) 개체로부터 얻은 항체-포함 시료를 본 명세서에서 재인용된 화학식의 펩토이드들 포함하는 펩토이드가 이에 고정되었던 하나 이상의 지지체들과 접촉시키는 단계; (b) 상기 펩토이드들과 결합된 항체들을 검출하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 결과를 기초로 하여 치료 결정을 주는 단계;를 포함하는 질환을 가질 것으로 의심된 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 본 방법은 개체로부터 상기 시료를 획득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 펩토이드와 항체 결합이 대조군 비-질환 환자들의 결합보다 더 큰 경우라면 상기 시료가 획득된 개체를 위해 질환의 진단을 주는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 상기 개체를 위해 치료 결정을 주는 단계를 더 포함할 수 있다. 시료는 본 명세서에서 재인용된 화학식의 펩토이드 하나 이상과 접촉될 수 있다. 시료는 복수의 질환 상태들 또는 병태들을 진단할 목적들을 위해 다중복합 플랫폼과 접촉될 수 있다. 지지체는 비드, 플레이트, 딥스틱, 필터, 막, 핀, 또는 웰일 수 있다. 시료는 혈액, 혈청, 타액 또는 CSF일 수 있다. 검출하는 단계는 RIA, FIA, ELISA, 웨스턴 블럿, 유동 세포측정법, FRET, 또는 표면 플라스몬 공명을 포함할 수 있다.

다른 구현예는 질환을 지시하는 생물학적 유체로부터 분리된 항체 조성물을 지향한다. 소정의 구현예들에서 항체는 질환을 지시하거나 이와 연관된 항체들을 특이적으로 결합하는 펩토이드와 이러한 항체들을 가지는 시료를 접촉하여 분리된다. 항체들은 다른 비-항체 및 비-D 특이적 구성성분들로부터 제거되거나, 분리되거나, 정제될 수 있다. 다음으로 항체들은 펩토이드 포획 제제(들)로부터 세척되고/되거나 해리될 수 있다.

소정의 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 공정에서 발견된 펩토이드들로 만들어진 펩토이드 어레이는 박테리아 용출물, 예로 대장균 용출물이 보충되었던 생물학적 시료와 혼성화된다. 생물학적 시료는 대조군 시료 및 중주신경계 장애에 대한 마커를 가지는 시료를 포함한다. 예를 들면, 마이크로어레이 슬라이드들은 혼성화 체임버로 덮히고 1× TBST (50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈20)으로 약 15분 동안 평형화된다. 다음으로 슬라이드들은 적어도, 많아야, 또는 약 0.5, 1, 1.5, 2 mg/mL 용출물 농도에서 박테리아 용출물로 차단된다. 용출물은 제거되고 슬라이드들은 박테리아 용출물에서 약 밀리그램의 생물학적 시료 (전 범위들 및 이들 간 수치들을 포함하는 5, 10, 15, 20 또는 25 μg/mL의 대략적 단백질 농도를 가짐)와 부드럽게 진탕하면서 배양된다. 다음으로 마이크로어레이들은 1× TBST로 세척되고 표지된 항-IgG 항체들 (예로, 1:400 희석)과 혼성화된다. 다음으로 슬라이드들은 적당한 완충액으로 희석된다. 슬라이드들은 원심분리기를 사용하여 (예로, 1,500 rpm에서 5분 회전) 건조되고 마이크로어레이 스캐너 상에서, 예를 들면 100% 파워에서 635-nm 레이저 및 600 또는 650 광증폭기 튜브를 사용하여 스캔된다. 본 발명은 따라서 대조군 혈장 시료 및 병든 시료를 대장균 용출물로 처리하는 단계 및 상기 시료들을 펩토이드 또는 리간드 어레이와 접촉시키는 단계를 포함하는, 진단적 검정법에서 기저값 항혈청 노이즈를 감소시키는 방법에도 역시 관한 것이다. 본 공정은 대조군 시료를 병든 시료와 비교하는 맥락에서 혈청들에서 항체들을 검출하고 구별하는 데 사용된 임의의 어레이의 처리를 지지하는 데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.

본 명세서에서 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에서 기술된 기타 다른 방법 또는 조성물에 관하여 실행될 수 있는 것으로 참작된다.

단어 "하나 (a)" 또는 "하나 (an)"의 사용은 청구항들 및/또는 명세서에서 "용어 "포함하는 (comprising)"과 결합하여 사용될 때 "한 개 (one)"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와도 역시 일치한다.

본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물에 관하여 실행될 수 있고, 그의 역도 성립하는 것으로 참작된다. 또한, 본 발명의 조성물들 및 키트들은 본 발명의 방법들을 달성하는 데 사용될 수 있다.

본 출원 전체를 통하여, 용어 "약 (about)"은 수치가, 연구 주제들 중에 존재하는 수치 또는 변화를 결정하는 데 사용되는 방법인 기기의 경우에 오차의 본래 변화를 포함하는 점을 가리키는 데 사용된다.

본 명세서에서 재인용된 공정들을 통해 발견되는 잠정적 히트들 또는 펩토이드들의 임의의 하나도 역시 치료적 약물 또는 백신 후보일 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 따라서 본 명세서에서 기술된 방법들에 따른 검색의 용도를 포함하는 약물 후보들 또는 백신들을 발견하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 다음의 상세한 설명, 실시예들 및 도면들로부터 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화들 및 변형들이 당업자들에게는 본 상세한 설명으로부터 자명할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 구체적 실시예들은 본 발명의 바람직한 구현예들을 가리키면서 단지 설명으로서 주어진다.
도 1은 알츠하이머 혈청 시료들을 검색하는 데 사용된 텐타겔 비드들의 라이브러리 (KN1B)의 제조의 기본 화학적 모식도를 나타낸 것이다. 도 1A는 아미노기를 반응물로서 가지는 폴리스티렌 비드로부터 시작을 나타낸다 (PEG 또는 동등물 또는 대안의 링커가 비드 및 말단 아미노기 간에 형성될 수 있다). 도 1B는 비드 상에 메티오닌으로서 및 다음으로 B에 나타낸 화합물을 형성하도록 반응되는 시작 아미노산을 나타낸다. 도 1C는 화합물들의 올리고체 라이브러리를 형성하는 데 사용된 소단일체 (단일체 아민들 및 할로아세트산)를 나타낸다.
도 2는 알츠하이머 혈청 시료들을 검색하는 데 역시 사용된 텐타겔 비드들의 라이브러리 (JC3B)의 제조의 기본 화학적 모식도를 나타낸 것이다. 도 2A는 아미노기를 반응물로서 가지는 폴리스티렌 비드로부터 시작을 나타낸다 (PEG 또는 동등물 또는 대안의 링커가 비드 및 말단 아미노기 간에 형성될 수 있다). 도 2B는 비드 상에 메티오닌으로서 및 다음으로 B에 나타낸 화합물을 형성하도록 반응되는 시작 아미노산을 나타낸다. 도 2C는 화합물들의 올리고체 라이브러리를 형성하는 데 사용된 소단일체 (단일체 아민들 및 할로아세트산)를 나타낸다. JC3B는 췌장암 혈청을 검색하는 데도 역시 사용될 수 있었다 (데이타 미도시).
도 3은 알츠하이머 혈청 시료들을 검색하는 데 사용된 텐타겔 비드들의 라이브러리 (JC4B)의 제조의 기본 화학적 모식도를 나타낸 것이다. 도 3A는 아미노기를 반응물로서 가지는 폴리스티렌 비드로부터 시작을 나타낸다 (PEG 또는 동등물 또는 대안의 링커가 비드 및 말단 아미노기 간에 형성될 수 있다). 도 3B는 비드 상에 메티오닌으로서 및 다음으로 B에 나타낸 화합물을 형성하도록 반응되는 시작 아미노산을 나타낸다. 도 3C는 화합물들의 올리고체 라이브러리를 형성하는 데 사용된 소단일체 (단일체 아민들 및 할로아세트산)를 나타낸다.
도 4는 알츠하이머 혈청 시료들을 검색하는 데 사용된 텐타겔 비드들의 라이브러리 (JC5B)의 제조의 기본 화학적 모식도를 나타낸 것이다. 도 4A는 아미노기를 반응물로서 가지는 폴리스티렌 비드로부터 시작을 나타낸다 (PEG 또는 동등물 또는 대안의 링커가 비드 및 말단 아미노기 간에 형성될 수 있다). 도 4B는 비드 상에 메티오닌으로서 및 다음으로 B에 나타낸 화합물을 형성하도록 반응되는 시작 아미노산을 나타낸다. 도 4C는 화합물들의 올리고체 라이브러리를 형성하는 데 사용된 소단일체 (단일체 아민들 및 할로아세트산)를 나타낸다. JC5B 단일체들은 이소부틸아민, 2-메톡시에틸아민, 디아미노부탄, 퍼퓨릴아민, 고리헥실아민, R-메틸벤질아민, 피페로닐아민 및 4-(아미노에틸) 벤젠술폰아마이드를 포함하였다.
도 5는 혈청 시료들을 검색하는 데 사용된 텐타겔 비드들의 라이브러리 (JC7B)의 제조의 기본 화학적 모식도를 나타낸 것이다. 도 5A는 아미노기를 반응물로서 가지는 폴리스티렌 비드로부터 시작을 나타낸다 (PEG 또는 동등물 또는 대안의 링커가 비드 및 말단 아미노기 간에 형성될 수 있다). 도 5B는 비드 상에 메티오닌으로서 및 다음으로 B에 나타낸 화합물을 형성하도록 반응되는 시작 아미노산을 나타낸다. 도 5C는 화합물들의 올리고체 라이브러리를 형성하는 데 사용된 소단일체 (단일체 아민들 및 할로아세트산)를 나타낸다.
도 6은 펩토이드 리간드들의 비드 기초 라이브러리들을 사용하여 복합 생물학적 시료를 검색하는 본 발명의 공정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 알츠하이머 정상 대조군 혈청 및 알츠하이머병을 앓는 혈청 시료에 대해 검색하도록 제조된 펩토이드 라이브러리 (JC3B)에 QDot 첨가 이후 정상 대조군 (NC) 다이나비드 히트들을 나타낸 것이다.
도 8은 NC 히트들이 제거된 이후 알츠하이머 환자 혈청 시료들로부터 얻은 병든 혈청의 텐타겔 비드 검색을 나타낸 것이다. 히트들은 적색으로 나타내고, 이는 PEG 링커를 통해 비드와 연결된 펩토이드와 결합된 혈청에서 질환 연관된 바이오마커 (항체)와 결합된 QDot 이차 항체이다.
도 9는 SDS 세척 및 QDOT 첨가 이후에 정상 대조군 시료 (NC 030093)를 사용하는 재생산도 테스트를 나타낸 것이다. 화살표는 NC 펩토이드 히트들이 서열결정되도록 선별된 것을 나타낸 것이다.
도 10은 SDS 세척 및 QDOT 첨가 이후에 정상 대조군 시료 (NC 050047)를 사용하는 재생산도 테스트를 나타낸 것이다.
도 11은 SDS 세척 및 QDOT 첨가 이후에 병든 시료를 사용하는 재생산도 테스트를 나타낸 것이다.
도 12는 JC3B 라이브러리로부터 얻은 알츠하이머 검색으로부터 선택된 잠정적 히트들의 펩토이드 서열들을 나타낸 것이다.
도 13은 JC1B 라이브러리로부터 얻은 알츠하이머 검색으로부터 얻은 바람직한 고친화도 히트들의 화학적 구조들을 나타낸 것이다. 본 예에서, 나타낸 구조들은 시스테인 잔기를 가지고 예비적인 검색에서 초기 히트의 구조를 결정한 이후에 재합성되었다. JC1B 라이브러리는 유사 펩토이드를 포함하였지만 C-말단 상에 메티오닌은 가지고 시스테인 잔기는 가지지 않았다.
도 14는 용액에서 고친화도 리간드 (ADTG1) 대비 마이크로어레이 지지체 상의 ADTG-1-ADTG-42 간의 경쟁 실험을 나타낸 것이다. 경쟁 실험은 용액에서 ADTG1가 펩토이드들 ADTG-1, ADTG14, ADTG24, ADTG25, ADTG31, ADTG35 및 ADTG40과 결합될 동일한 항체와 결합하였던 점을 나타낸다. 유사한 실험들이 네 가지의 구별된 알츠하이머 자가항체들과 결합된 네 벌의 펩토이드들을 찾도록 각각의 펩토이드들 상에서 시행되었다 (데이타 미도시).
도 15는 알츠하이머 검색에서 서로 다른 자가항체들과 결합한 네 가지 그룹들의 구별된 펩토이드들을 나타낸 것이다.
도 16A는 P1aag1 (JC3B-1) 펩토이드를 사용한 환자들의 풀을 위한 AD 테스트 데이타 (미고지)를 나타내고, 도 16B는 P1aag2 (JC3B-21)를 사용한 AD 환자들의 동일한 풀을 위한 테스트 데이타 (미고지)를 나타낸 것이다. 각각의 펩토이드는 마이크로어레이 상에서 제시된다.
도 17A는 P1aag3 (JC3B-7) 펩토이드를 사용한 환자들의 풀을 위한 AD 테스트 데이타 (미고지)를 나타내고, 도 17B는 P1aag4 (JC3B-5)를 사용한 AD 환자들의 동일한 풀을 위한 테스트 데이타 (미고지)를 나타낸 것이다. 각각의 펩토이드는 마이크로어레이 상에서 제시된다.
도 18A는 P1aag5 (JC3B-R8) 펩토이드를 사용한 환자들의 풀을 위한 AD 테스트 데이타 (미고지)를 나타내고, 도 18B는 P1aag6 (JC3B-R12)를 사용한 AD 환자들의 동일한 풀을 위한 테스트 데이타 (미고지)를 나타낸 것이다. 각각의 펩토이드는 마이크로어레이 상에서 제시된다.
도 19A는 P1aag1-6을 사용하여 시행된 테스트들을 위한 환자들의 동일한 풀에서 ADP2를 위한 마이크로어레이 데이타를 나타낸 것이다. 도 19B는 동일한 집합의 환자들로 P1aag4을 사용한 비교 데이타를 나타낸다. 데이타는 동일한 환자 풀에서 이전에 확인된 ADP2 및 새로이 확인된 P1aag4로 달성된 결과들 간의 분명한 상관성을 보여준다.
도 20A는 P1aag1-6을 사용하여 시행된 테스트들을 위한 환자들의 동일한 풀에서 ADP3를 위한 마이크로어레이 데이타를 나타낸 것이다. 도 20B는 동일한 집합의 환자들로 P1aag2를 사용한 비교 데이타를 나타낸다. 데이타는 동일한 환자 풀에서 이전에 확인된 ADP2 및 새로이 확인된 P1aag2로 달성된 결과들 간의 분명한 상관성을 보여준다.
도 21은 병든 AD 혈청 대비 건강한 대조군 (풀)의 비교에서 40 μg/mL로 텐타겔 비드들 상의 P1aag5 (잠정적 히트 5 또는JC3B-R8)의 확인을 나타낸 것이다.
도 22A는 QDot 655를 사용하고 JC5B 라이브러리를 사용한 췌장암 검색에서 펩토이드 히트들을 나타낸 것이다. 도 22B 및 도 22C는 QDot 655를 사용한 히트들의 재검증을 나타낸다 (화살표들은 히트들을 지적한다).
도 23은 췌장 펩토이드 히트 확인을 나타내고, 질환 혈청 첨가 및 검출을 QDot 655 대비 정상 혈청 첨가와 비교한 것이다.
도 24는 AD 마커들 및 PC 마커들을 혼합하여 히트 확인을 나타낸 것이다. 데이타는 PC 마커들이 검출되는 한편 췌장암 혈청 (혈청 1)에서는 AD 펩토이드 비드 상의 검출가능한 항체가 전혀 없는 점을 보여준다.
도 25는 JC3B 라이브러리로부터 얻은 췌장암 검색 히트 서열들을 나타낸 것이다.
도 26은 JC5B 라이브러리로부터 얻은 췌장암 검색 히트 서열들을 나타낸 것이다.
도 27A, 도 27B 및 도 27C는 SLE (루푸스) 검색의 결과들을 나타낸 것이다. A는 정상 대조군이고 B 및 C는 두 가지 다른 그룹들 1 및 2로부터 얻은 SLE 혈청이다. 화살표들은 히트들을 나타낸다.
도 28은 KN1B 라이브러리로부터 얻은 SLE 히트들을 나타낸 것이다. C-말단은 도면의 오른쪽 면 위에 있다.
도 29는 펩토이드 KN1B-20을 위한 히트 확인을 나타낸 것이다. 그룹 1은 약 0.374 mg/mL의 농도에서 병든 혈청 풀이고 (왼쪽 도면)(히트들은 비드 상의 적색 색조로 나타난다). 비-질환 혈청 풀 (중앙 도면)은 약 0.378 mg/mL의 농도로 제공되고 먼 오른쪽 도면은 무혈청 대조군을 보여준다.
도 30은 형광 태그를 사용하는 펩토이드의 서로 다른 농도들에서 두 가지 다른 결합 방법들을 사용한 SLE (루푸스) 펩토이드들 중의 하나의 엘라이자 플레이트와의 결합/검출을 나타낸 것이다.
도 31은 용액에서 플레이트 결합된 KN1B-20-바이오틴-플루오레신 대비 자유 KN1B-20-바이오틴 간의 다양한 농도들에서 경쟁 검정법을 나타낸 것이다. 신호 감폭이 자유 KN1B-20-바이오틴이 결합 대비 자유의 동등 몰 농도로부터 증가하면서 일어난다.
도 32는 다양한 농도들에서 펩토이드를 가지는 엘라이자 플레이트를 나타낸 것이고, 병든 혈청 (AD)(P 컬럼 1) 및 정상 대조군 혈청 (컬럼 3) [각각의 웰은 1:200을 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400, 1:12,800으로 배가함] 간의 차이를 분명하게 나타낸다. 화살표들은 1× TBST 완충액으로 1:800 희석을 지적한다. 웰들에서 펩토이드 농도는 10 mM이다. 도 32는 병든 및 대조군 혈청들 간을 구별하도록 텐타겔 비드 플랙폼의 확인도 역시 보여준다.
도 33은 AD 혈청들 대비 대조군 혈청들의 다양한 희석들에서 p10 mM ADP3을 가진 엘라이자 플레이트를 나타낸 것이다. 화살표들은 1:800 희석을 지적한다.
도 34는 AD 혈청들 대비 대조군 혈청들의 다양한 희석들에서 p10 mM SLE-KN1B-20을 가진 엘라이자 플레이트를 나타낸 것이다. 화살표들은 1:800 희석을 지적한다.
도 35는 결합 완충액으로 다양한 혈청 희석들로 제조된 10 mM ADP3을 사용한 AD 혈청 엘라이자 그래프를 나타낸 것이다. 정상 및 병든 혈청 간의 분리가 1:200을 거쳐 대략 1:10,000의 희석 범위 동안 일어났다. 시작 희석들은 1:200이었다 (그룹 1 AD 혈청 0.394 mg/mL 및 비-질환 혈청 0.386 mg/mL).
도 36은 결합 완충액으로 다양한 혈청 희석들로 제조된 10 mM KN1B-20을 사용한 SLE 혈청 엘라이자 그래프를 나타낸 것이다. 정상 및 병든 혈청 간의 분리가 1:200을 거쳐 대략 1:10,000의 희석 범위 동안 일어났다. 시작 희석들은 1:200이었다 (그룹 1 SLE 혈청 0.375 mg/mL 및 비-질환 혈청 0.396 mg/mL).
도 37은 DMSO로 다양한 혈청 희석들로 제조된 10 mM KN1B-20을 사용한 SLE 혈청 엘라이자 그래프를 나타낸 것이다. 정상 및 병든 혈청 간의 분리가 1:200을 거쳐 대략 1:10,000의 희석 범위 동안 일어났다. 시작 희석들은 1:200이었다 (그룹 1 SLE 혈청 0.367 mg/mL 및 비-질환 혈청 0.322 mg/mL).
도 38은 텐타겔 비드들 히트들 확인을 위한 FACS 플랫폼을 나타낸 것이다.
도 39는 혈청들의 다양한 농도들에서 (100 μg/mL 내지 1,000 μg/mL) 항-DNP 표지된 이차 항체로의 처리에 반응한 아세틸기를 가지는 비드들 및 2,5-디니트로페닐기 (DNP)를 가지는 비드들 간의 분리 정도를 나타낸 것이다. 평균 형광 강도 (MFI) 분리는 더 높은 1,000 μg/mL 혈청의 희석에서 가장 컸다.
도 40은 1,000 μg/mL 혈청 농도에서 자유 에탄올아민-DNP 및 DNP의 항-DNA 항체와 결합 간의 직접적인 경쟁이 존재하는 점을 나타낸 것이다.
도 41은 정상 대조군 혈청들 풀 및 AD 혈청들 풀로부터 얻은 ADP3 결합된 항-항체를 나타낸 것이다. 데이타는 두 가지 서로 다른 이차 항체들 (염소 항-인간 딜라이트 649 및 염소 항-인간 알렉사 647)를 사용한 20 및 140 μg/mL의 혈청 농도 범위들에서 좋은 분리를 보여준다.
도 42는 다양한 혈청 농도 범위들에서 기저값 차감 이후에 정상 대조군 및 AD 혈청들로부터 얻은 ADP3 결합된 자가-항체를 나타낸 것이다. 유의한 정도의 분리가 20 μg/mL 이하로부터 120 μg/mL 이상까지 대부분의 혈청 농도 범위들에서 존재한다.
도 43 및 도 44는 SLE (루푸스) 재합성된 펩토이드 리간드 히트들의 구조들을 나타낸 것이다.
도 45는 10 μm 텐타겔 비드들 상의 ADP3의 제조 및 연속하여 관찰된 락톤의 질량 분광분석법 해독과 함께 CNBR을 사용한 절단을 나타낸 것이다.
도 46은 서로 다른 농도들에서 정상 대조군 및 알츠하이머병 혈청들로부터 얻은 ADP3 결합된 자가항체를 나타낸 것이다. 비드들은 1× TBST로 3시간 동안 전차단되었고 다음으로 염소 항-인간 알렉사 647 이차 항체를 사용하여 검출되었다.
도 47은 서로 다른 혈청 농도들에서 정상 대조군 및 알츠하이머병 혈청들로부터 얻은 ADP3 결합된 자가항체를 나타내고 또한 DNP 수치들을 나타낸 것이다.
도 48 및 도 49는 대장균 용출물 및 라이신과 같은 전-차단 조건들을 사용하여 정상 대조군 대비 알츠하이머병 혈청들로부터 얻은 ADP3 결합된 자가항체를 나타낸 것이다.
도 50은 마이크로어레이들에 사용되는 펩토이드들의 제조 및 이들 대비 엘라이자 플레이트들 상에 놓인 이들 펩토이드들 간의 구분의 단순한 모식도를 나타낸 것이다. 펩토이드 마이크로어레이들이 제작되는 방식을 위한 모식도: 개별 비드들은 마이크로타이터 플레이트들의 웰들 내로 분리되고 펩토이드들은 비드들로부터 절단되어 농축된 스톡 용액을 만든다. 각각의 웰이 지금 단일한 종류의 펩토이드를 포함하게 될 점을 주목한다. 다음으로 수천 개의 펩토이드들은 표면과 공유적으로 결합하는 이러한 방식으로 화학적으로-변형된 유리 현미경 슬라이드들 위에 스폿팅된다. 수천 개의 슬라이드들이 단일한 합성 라이브러리로부터 매우 재생산적으로 생산될 수 있다. 엘라이자 생산은 표면 상에 PEG 사슬이 전혀 없는 점을 제외하고 유사하지만, 엘라이자 플레이트 상의 펩토이드들의 밀도는 마이크로어레이들 상보다 다를 수 있다.
도 51은 질환 연관된 항체-펩토이드 복합체를 검출하는 이차 항체와 연결된 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하여 혈청 희석 1: 800에서 정상 대조군 및 병든 혈청 간의 분명한 구별을 가진 엘라이자 실험들을 나타낸 것이다. 무색 기질이 첨가되어 결합된 HRP 효소와의 반응 시 색 (청색)을 변화시킨다.
도 52는 병든 혈청 (A) 대비 정상 혈청 (B)의 다양한 혈청 희석들에서 엘라이자 테스트로 다양한 AD 펩토이드들을 비교하는 적정 데이타를 나타낸 것이다. 정상 혈청에서는 신호들의 강도가 존재하지 않지만, 농도가 1:12,800로부터 1:200까지 증가하면서 모든 AD 펩토이드들의 분명한 구분 및 강도가 존재한다.
도 53은 알츠하이머병 (또는 알츠하이머병이 아님)의 다양한 단계들에서 AD 환자들의 고지된 시료 집합의 임상적 진단 대비 동일한 환자 혈청 시료들로부터 획득되고 (미고지) 질환 연관된 항체들을 검출하도록 ADP3 펩토이드에 대해 검색되었던 데이타 간의 상관성을 확인하는 도면을 나타낸 것이다. 관찰된 결과들은 메이어 병원 (Mayo Clinic Jacksonville)으로부터 얻은 혈장 시료들의 미고지 연구로부터 나온다. UND = 미측정. 좌표는 단일 혈청 농도 (1:800) 희석을 취하는 것으로부터 유래되었다. > 1의 해독은 양성으로 고려되었고 1 및 0.7 사이의 해독은 미측정으로 고려되었으며 0.7 미만의 해독은 음성으로 고려되었다.
도 54는 알츠하이머병 (또는 알츠하이머병이 아님)의 다양한 단계들에서 AD 환자들의 고지된 시료 집합의 임상적 진단 대비 동일한 환자 혈청 시료들로부터 획득되고 (미고지) 질환 연관된 항체들을 검출하도록 본 발명의 다양한 AD 펩토이드들에 대해 검색되었던 (좌표는 9개 펩토이드들의 결과들의 평균 수치임) 데이타 간의 상관성을 확인하는 도면을 나타낸 것이다. 관찰된 결과들은 메이어 병원 (Jacksonville)으로부터 얻은 혈장 시료들의 미고지 연구로부터 나온다. UND = 미측정. 좌표는 단일 혈청 농도 (1:800) 희석을 취하는 것으로부터 유래되었다. > 1의 해독은 양성으로 고려되었고 1 및 0.7 사이의 해독은 미측정으로 고려되었으며 0.7 미만의 해독은 음성으로 고려되었다.
도 55는 알츠하이머병 (또는 알츠하이머병이 아님)의 다양한 단계들에서 AD 환자들의 고지된 시료 집합의 임상적 진단 대비 동일한 환자 혈청 시료들로부터 획득되고 (미고지) 질환 연관된 항체들을 검출하도록 본 발명의 다양한 AD 펩토이드들에 대해 검색되었던 데이타 간의 상관성을 확인하는 도면을 나타낸 것이다. 관찰된 결과들은 메이어 병원 (Jacksonville)으로부터 얻은 혈장 시료들의 미고지 연구로부터 나온다. UND = 미측정. 좌표는 단일 혈청 농도 (1:800) 희석을 취하는 것으로부터 유래되었다. > 1의 해독은 양성으로 고려되었고 1 및 0.7 사이의 해독은 미측정으로 고려되었으며 0.7 미만의 해독은 음성으로 고려되었다. 데이타는 MCI/우울증 시료들이 표지되고 루이스체 치매 시료들이 마찬가지로 표기된 다른 치매들에 관한 측정도 역시 보여준다. 데이타는 적어도 세 명의 MCI 환자들이 본 발명의 AD 선택적인 펩토이드들에 의해 포획된 항체들의 1 초과의 검출가능한 양들을 가진 혈청 시료들을 가지는 점을 보여준다.
도 56A 내지 도 56D는 복수의 AD 펩토이드들을 사용한 Opko 헬스 펩토이드 진단적 검정법 대비 본 정보가 미고지 시 제공된 이후 임상적 진단 간의 불일치들을 가지는 환자들로부터 얻은 시료들의 해당 소집합에 관한 데이타를 나타낸 것이다. 도 56A는 펩토이드들 ADP3 및 임상적으로 병들었지만 Opko 펩토이드 P1aag4가 1.0 미만이었던 (단일점에서 UND; 적정 AD 양성) 환자의 경우에 관찰되는 바와 같은 다른 펩토이드들을 위한 데이타를 나타낸다. 모든 다른 Opko 펩토이드들은 AD에 대해 양성 (예로, 1.0 초과)이었다. 도 56B는 모든 Opko 펩토이드들이 현재 전-AD를 제시하는 정상 (비-치매)으로서 진단되었던 환자에서 질환 연관된 항체들에 대해 양성이었던 점을 나타낸다. 도 56C는 Opko AD 펩토이드들 모두가 본 환자가 치매의 일정 다른 형태를 가진 것으로 제시하면서 임상적으로 AD로 진단되었던 환자에서 희석점에서의 강도 1 초과를 보여주지 않았던 점을 나타낸다. 도 56D는 임상적으로 양성 AD 환자에서, 복수의 Opko AD 펩토이드들이 질환 연관된 항체들에 대해 양성이 아니지만 두 가지 펩토이드들 (P1aag6 및 P1aag4)은 단일점에서 UND 및 적정 이후에도 UND 양성이었던 점을 나타낸다.
도 57은 ADP3로 스폿된 마이크로어레이를 사용하여 이전의 AD 시료들로부터 생성된 도면 집합을 나타낸 것이다. 질환 대비 대조군 간의 분명한 상관성이 마이크로어레이 데이타 및 엘라이자 플랫폼을 사용하여 생성된 데이타에 존재한다. 도 57은 ADP3 펩토이드가 알츠하이머병과 연관되고 파킨슨병 또는 루푸스 (SLE)와는 연관되지 않은 질환 연관된 항체들에 대해 선택되는 점도 역시 나타낸다.
도 58은 전체 106개의 테스트된 혈청 시료들을 사용한 엘라이자 분석법의 요약을 나타낸 것이다.
도 59는 P1aag7 내지 9의 화학적 구조들을 나타낸 것이다.

다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구현예들을 더욱 완벽하게 기술하기 위하여 제시된다. 그러나, 그들은 본 발명의 광범위한 범주를 제한하는 것으로서는 결코 참작되지 않는다.

실시예들

실시예 1: 라이브러리 제조

펩토이드 합성을 위한 프로토콜 (시스테인- 펩토이드 또는 메티오닌-펩토이드)

다음의 실시예는 본 발명의 펩토이드 라이브러리들이 생성되는 방식을 기술한다. 본 실시예에서 사용된 재료들은 플라스크들, 플라스틱 튜브들, 바늘들을 가진 10 내지 15개의 3 mL 주사기들, 라텍스 장갑들, 10 내지 15개의 15 mL 폴리프로필렌 테스트 튜브들 및 용매 보호 팁들을 가진 마이크로피펫들 (1000 μL), 유리 피펫들 및 레진 비드들을 포함한다. 사용된 화학물질들 및/또는 반응시약들로는 N,N 디메틸포름아마이드, 브로모아세트산 (BMA), 무수 디메틸포름아마이드, 피페리딘, 아세토니트릴, 3-디이소프로필카보디이미드 (DIC), 트리플루오로아세트산, 5(6)-카복시플루오레신, 디클로로메탄 (DCM) 및 4-메틸몰포린 (NMM)을 포함한다. HBTU (테트라메틸우로니눔 헥사플루오로포스페이트) 및 트리에틸실란뿐만 아니라 각 라이브러리 제조에 사용된 다양한 아민들도 역시 사용되었다.

펩토이드 제조

공정에 사용된 각 아민의 농도는 다음의 공식을 사용하여 계산된다:

V = FW/d/1000 × 2 M × 5 mL

절차:

단계 1

레진 비드들의 팽창

(a) 250 밀리그램의 레진 비드들이 깨끗한 건조된 반응 플라스크 내에 두었고 5 mL들의 무수 DMF가 한 시간 이하의 기간 동안 팽창하도록 허용된 비드들에 첨가되었다. 다음으로 비드들은 DMF로 다수 번 (2 또는 3×) 진공 하에서 세척되었다.

단계 2

단계들 (b), (c) 및 (d)는 "비보호된 비드들" (예로, 텐타-겔)이 사용될 때 생략되었다.

무수 DMF를 용매로서 사용하는 피페리딘 (염기)의 20% 용액이 다음의 공정에서 사용되었다:

단계들 (b), (c) 및 (d)를 포함하는 다음의 공정은 "보호된 비드들"을 사용할 때 2번 시행되었다.

(b) 2.5 mL의 20% 피페리딘 용액이 보호된 비드들에 첨가되었다.

(c) 피페리딘을 첨가한 이후에, 반응 플라스크는 200 rpm ＠ 25℃로 설정된 진탕기/배양기 위에 20분 동안 놓아두었다.

(d) 다음으로 반응 플라스크는 5 mL들의 DMF를 사용하는 무수 DMF로 8 내지 10번 세척되었다.

다음의 용액들도 역시 제조되었다:

무수 DMF (2 mL 부피)에 넣은 468 mg Fmoc-Cys(Trt)-OH (용액 A).

무수 DMF 2 mL에 넣은 161.6 mg의 NMM

303.2 mg HBTU가 NMM 바이알에 첨가되었다 (용액 B).

HBTU/NMM 및 Fmoc-Cys의 첨가

1 mL의 각각의 용액 A 및 용액 B가 비드들 - (HBTU/NMM) 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH)에 첨가되었고 1시간 동안 진탕되었다.

비드들은 DMF로 5 내지 10번 세척되었다.

용액 A 및 용액 B의 1 mL 용액이 1시간의 기간 동안 진탕된 비드들에 첨가되었고 다음으로 DMF로 5 내지 10번 다시 세척되었다.

다음의 용액들도 역시 제조되었다.

20% 피페리딘 (무수 DMF에 녹임)

2 M 브로모아세트산

50% DIC/A. DMF

2 M 각각의 아민의 용액

다음의 단계들 (a), (b) 및 (c)는 2번 수행되었다. 2.5 mL의 20% 피페리딘 용액이 첨가되었다; (b) 반응 플라스크는 200 rpm으로 25℃에서 진탕되었고 다음으로 (c) 비드들은 DMF로 8× 내지 10×번 세척되었다.

2 M 브로모아세트산의 10 mL 용액이 제조되었다.

50% 3.2 M DIC/무수 DMF (v/v)의 10 mL 용액도 역시 제조되었다.

각각의 아민들의 2 M 아민 용액들이 각각의 라이브러리를 위해 제조되었다.

펩토이드 합성을 위해, 1 mL의 2 M 스톡 용액이 각각의 경우에 사용되었고 펩토이드 사슬 상에 첨가되었다.

단계 3

(a) 1 mL의 브로모아세트산이 반응 용기에 첨가되었다.

(b) 1 mL의 50% DIC/DMF 용액이 다음으로 첨가되었고 그 결과 얻은 용액은 (c) 전자레인지에 ＠ 10% 능력으로 15분 동안 처리되었다.

단계 (c)는 전자레인지 처리들 사이에 측면으로 플라스크를 회전하면서 2번 수행되었다.

흰색 침전물이 각각의 전자레인지 처리 단계 이후에 형성되었다. 다음으로 비드들은 DMF로 8 내지 10번 세척되었다.

단계 4

첫 번째 아민의 1 mL이 순서대로 선행 단계로부터 얻은 브롬 중간산물을 포함하는 반응 플라스크에 첨가되었고 다음으로 용기가 비드들 상에 아민을 고르게 분배하도록 진탕되었다. 다음으로 반응이 전자레인지를 ＠ 10% 능력으로 15분 동안 사용하여 개시되었다. 다음으로 반응된 비드들은 수화 DMF로 8 내지 10번 세척되었다.

단계 3 및 단계 4는 모든 아민들이 첨가되어 표적 펩토이드들을 만들 때까지 반복되었다.

단계 5

다음으로 비드들이 디클로로메탄 (DCM)으로 3번 세척되었고 건조되도록 허용되었다.

단계 6

다음으로 펩토이드들이 95% TFA 용액 (5 mL)을 사용하여 비드들로부터 절단되었다. 다음으로 펩토이드들은 잔여 펩토이드들을 제거하도록 용매 (CH ₃ CN 및 물)로 세척된 비드들로부터 수집되었다. 아르곤 기체가 남은 TFA를 제거하는 데 사용되었다. 다음으로 펩토이드들은 동결건조되었고 필요한 바와 같이 특성분석되었고 정제되었다.

상기에 특정된 반응 조건들은 특정한 비드 조성을 위해 필요한 정량들에 의존한 필요를 기초로 하여 변형될 수 있다.

도 1 내지 도 5는 일반적으로 본 발명의 라이브러리가 AD 진단제들, 췌장암 진단제들 및 루푸스를 위해 제조되었던 방식을 도시하고 있다. 일반적으로, 아민 분체를 가지는 비드들은, 다음으로 할로겐화물 그룹을 가지는 활성화된 카보닐 분체와 반응하고 다음으로 R기를 가지는 단일체 아민과 반응하는 표준 펩타이드 화학을 사용한 일련의 단계들을 통하여 아미노산 잔기와 연결되었다. 회로의 단계 2 및 단계 3은 도면들에 나타난 바와 같이 1 MM개 내지 2 MM개의 구별된 리간드들을 가지는 큰 펩토이드 라이브러리들을 제작하도록 반복되었다. 텐타겔 레진 또는 비드들 상에 제조된 초기 검색 라이브러리는 전형적으로 사슬에서 첫 번째 단일체로서 메티오닌 아민노산을 가졌다. 본 발명자는 절단가능한 링커를 가지지 않는 비드 또는 레진으로부터 절단을 용이하게 하도록 이러한 아미노산을 사용한다. 시스테인 포함 펩토이드들을 제작하는 데 사용된 링크 레진은 첫 번째 아미노산으로서 메티오닌의 사용을 필요로 하거나 요구하지 않는 링커들을 가진다. 시스테인 포함 펩토이드들은 전형적으로 초기 검색이 잠정적 히트들 찾아낸 이후에 재합성되었다. 시스테인 황 그룹은, 예를 들면 진단적 플랫폼 기질 상의 또 다른 반응성 분체와 펩토이드 사슬의 반응을 허용한다. 재합성된 펩토이드들도 역시 아미노산 아민 이후에 사슬에서 첫 번째 측쇄로서 1-일-n-이소부틸아미노 분체를 포함하였다. 본 그룹은 펩토이드들을 전시하고 수용성 포함 용액들에서 펩토이드를 용해하는 데 필요한 것으로 여겨진다.

실시예 2. 일반적인 검색 방법론

선택된 펩토이드에 부착된 160 마이크론 텐타겔 비드들이 DMF로 밤샘 팽창되었다. 다음으로 비드들은 반응 용기에서 밀리포아 물 및 격렬한 진탕으로 10번 세척되었다. 신선한 밀리포아 물이 각각 첨가되었고, 10번째 세척 시 비드들은 150 내지 200 rpm으로 밤샘 진탕하도록 허용되었다. 다음날, 비드들은 1× TBST로 동일한 방식으로 세척되었고 150 내지 200 rpm으로 적어도 3시간 동안 진탕하도록 허용되었다.

다음으로 비드들은 15 mL 원추형 튜브 내에 1× TBST로 튜브 당 약 0.5 그램이 고르게 나누어졌다. TBST는 제거되었고, 4 mL의 희석된 정상 인간 혈청이 각각의 튜브에 첨가되었다. 1× TBST에 만들어진 혈청 스톡은 20 μg/mL의 원하는 농도를 얻도록 나노드롭으로 첨가되었다. 다음으로 혈청 및 비드들을 포함하는 튜브들은 암소에서 4℃로 밤샘 굴려졌다. 다음으로 혈청은 튜브들로부터 피펫팅되었고, 4 mL의 1× TBST로 대체되었다. 다음으로 튜브들은 느리게 역전되어 현탁되었고 다음으로 가라앉히도록 허용되었다. TBST는 제거되었고 전부 3번 TBST 세척들을 위해 두 번 더 첨가되었다.

다음으로 이차 항체 용액이 1 mL의 1× TBST 당 5 μL의 염소 항-인간 IgG Qdot 655를 제조하여 제조되었다. 일단 마지막 TBST 첨가가 비드들로부터 제거되면, 4 mL의 Qdot 용액이 첨가되었고 비드들은 암소에서 2시간 동안 4℃로 굴려졌다. 다음으로 비드들은 가라앉히도록 허용되었고 Qdot 용액은 제거되었다. 다음으로 비드들은 4 mL의 1× TBST로 3번 세척되었다. 다음으로 비드들은 깨끗한 페트리 접시 내에 부어졌고 DAPI 필터를 포함하는 UV 현미경 하에서 관찰되었다. 적색으로 염색된 비드들 모두는 제거되었다.

첫 번째 검색이 완료된 이후에, 비드들은 다기 15 mL 원추형 튜브들 내레 부어졌고, 다음 혈청 시료의 첨가 이전에 적어도 4시간 동안 4℃로 굴려졌다. 다음으로 질환 혈청은 혈청이 1× TBST와는 다르게 PBS 시작 블록으로 희석되는 것을 제외하고는, 정상 혈청의 첨가와 동일한 방식으로 비드들에 첨가되었다. 그러나, 고유 스톡은 나노드롭으로 적절한 농도를 획득하기 위하여 1× TBST로 제조되었다. 혈청 첨가 및 이차 항체 첨가는 정상 혈청과 동일하다.

일단 병든 "히트들"이 제거되고 나면, 그들은 1.5 mL 에펜도르프 튜브 내에 풀 되었고, 1% SDS에서 25 내지 30분 동안 95℃로 가열되었다. 다음으로 SDS는 튜브로부터 제거되었고, 밀리포아 물로 대체되었다. 다음으로 비드들은 15분 동안 4℃로 굴려졌다. 다음으로 물은 신선한 물로 대체되었고, 비드들은 추가 15분 동안 굴려졌다. 다음으로 물은 제거되었고 50/50 아세토니트릴/물 용액으로 대체되었으며 추가 15분 동안 굴리도록 허용되었다. 다음으로 비드들은 96 웰 플레이트에서 개별 웰들 내로 분리되었고 건조하도록 허용되었다.

20 내지 30 mg 시아노겐 브로마이드, 500 μL 아세토니트릴, 400 μL 빙초산 및 100 μL 밀리포아 물의 용액이 만들어졌고 20 μL의 용액이 히트 비드를 포함하는 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트는 덮혔고 100 rpm으로 16시간 동안 진탕하도록 허용되었다. 다음으로 커버가 제거되었고, 절단 용액은 웰들로부터 증발되었다. 다음으로 히트들이 MSMS 플레이트 상에서 스폿되었고 4800 MALDI/TOF/TOF 분석기를 사용하여 서열결정되었다.

도 6은 본 명세서에서 기재되고 청구된 검색 방법론의 일반적인 모식도를 제공한다.

실시예 3: 질환을 치료하기 위한 약물에 대한 반응을 진단하기

160 마이크론 텐타겔 비드들 (JC3B 라이브러리)의 500 밀리그램이 15 mL 원추형 튜브에 첨가되었다. 5 mL의 DMF가 튜브에 첨가되었고, 비드들은 팽창하도록 밤샘 놓아두도록 허용되었다. 다음날, DMF가 튜브로부터 피펫팅되었고 5 mL의 1× TBST로 대체되었다. 튜브는 혼합되도록 역전되었고, 다음으로 비드들은 바닥에 가라앉도록 허용되었으며 1× TBST는 제거되었다. 5 mL의 1× TBST가 5번 더 첨가되고 제거되었다.

정상 AD 혈청 시료들이 4 mL의 PBS 시작 블록을 튜브에 첨가하고 7 μL의 각각의 4가지 분리된 AD 시료들을 동일한 튜브에 첨가하여 제조되었다. 혈청이 세척된 비드들에 첨가되었고 비드들 및 혈청이 암소에서 4℃로 밤샘 굴려지도록 허용되었다. 다음날 아침, 비드들은 텀블러로부터 제거되었고 혈청이 튜브로부터 피펫팅되기 이전에 가라낮도록 허용되었다. 4 mL의 1× TBST가 튜브에 첨가되엇고, 튜브는 혼합되도록 역전되었다. 다음으로 TBST가 튜브로부터 피펫팅되엇고 4 mL의 신선한 1× TBST로 대체되었으면 다시 제거되었다.

다음으로 DYNA-비드 용액이 50 μL의 잘-혼합된 염소 항-인간 IgG DYNA 비드들을 4 mL의 1× TBST에 첨가하여 제조되었다. 다음으로 혼합물은 세척된 비드들에 첨가되었다. 다음으로 비드들은 암소에서 2시간 동안 4℃로 굴려지도록 허용되었다.

비드들을 세척하지 않고도, DYNA 비드들 검색이 수행되었다. 튜브는 자석 홀더에 놓아두었고 가장자리로 1× TBST로 채워졌다. 자석 및 튜브는 느리게 2분 동안 교반되었고, 비드들은 자석 홀더에 놓이도록 허용되었다. TBST 및 바닥에 가라앉은 자유 비드들은 측면에 부착된 히트 비드들을 건드리지 않도록 가만히 제거되었고, 신선한 1× TBST로 대체되었다. 공정은 비드들이 튜브의 측면에 부착되어 관찰되지 않을 때까지 두 번 내지 세 번 반복되었다. 히트 비드들은 다음으로 하나의 튜브에 합쳐졌다.

남은 비-히트 비드들은 1.5 mL 튜브들로 나뉘었고, 역전되었으며 신속하게 잠시 원심분리되었다. 상청액은 제거되었고 신선한 1× TBST로 대체되었다. 본 공정은 DYNA 비드들이 비드/TBST 용액에서 전혀 가시적이지 않을 때까지 6 내지 8번 반복되었다. 히트 비드들은 동일한 방식으로 세척되었다.

비드들은 15 mL 튜브 내로 다시 합쳐졌고, 정상 혈청은 이전에 진술된 바와 동일한 방식으로 비드들에 첨가되었고, 암소에서 4℃로 밤샘 굴려지도록 허용되었다. 또한, 3 mL의 각각의 4가지 AD 혈청들이 PBS 시작 블록에 첨가되었고 본 용액은 DYNA 비드 "히트" 비드 튜브에 첨가되었다. 다음날, 비드들은 정상 혈청의 첨가와 동일한 방식으로 세척되었다.

20 μL의 염소 항-인간 IgG 퀀텀 도트 655는 4 mL의 1× TBST로 희석되었고 ("히트" 튜브를 위해 1 M 1× TBST에 녹인 20 μL Qdot), 비드들에 첨가되었다. 용액은 암소에서 4℃로 2시간 동안 굴려졌다. 히트 및 비-히트 튜브 둘 다는 1× TBST로 4번 세척되었고 밝은 적색 비드들에 대해 UV 현미경 하에서 검색되었다. 남은 비드들은 4 mL의 1× TBST에서 1시간 동안 굴려졌고, 질환 AD 혈청이 정상 혈청과 동일한 방식으로 첨가되었다. 자기 검색 및 Qdot 첨가들이 이전에 진술된 바와 동일한 방식으로 수행되었다. 다음으로 히트들이 MALDI TOF/TOF 질량 분광분석기 상에서 서열결정되었다.

실시예 4: 단일한 측정으로의 마이크로어레이 데이타

마이크로어레이들은 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합된 미국 특허공고 제 2010/0303805호에서 기술된 바와 같이 제조되었다. 마이크로어레이 슬라이드들은 혼성화 체임버로 덮히고 1× TBST (50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈20)으로 15분 동안 평형화된다. 다음으로 슬라이드들은 1 mL의 차단 완충액으로 4℃에서 1시간 동안 차단된다. 차단 완충액은 제거되고 슬라이드들은 1 mL의 혈청 (20 mg/mL)과 4℃에서 16시간 동안 부드럽게 진탕하면서 배양된다. 대안의 방법에서, 슬라이드들은 1 mL의 대장균 용출물 (1.5 mg/mL)로 4℃에서 1시간 동안 차단된다. 대장균 용출물은 제거되고 슬라이드들은 대장균 용출물 (1.5 mg/mL)에 넣은 1 mL의 혈청 (15 mg/mL)과 4℃에서 18시간 동안 부드럽게 진탕하면서 배양된다. 다음으로 마이크로어레이들은 1× TBST로 3번 세척되고 알렉사-647 표지된 항 IgG 항체 (5 mg/mL)와 궤도 진탕기 상에서 4℃로 2시간 동안 혼성화된다. 체임버 카세트는 마이크로어레이 슬라이드들로부터 제거되었고 1× TBST (3 × 15분)으로 세척되었고 0.1× TBST (1 × 10)가 이어졌다. 다음으로 슬라이드들은 원심분리기 상에서 (1500 RPM으로 5분) 건조되고 100% 파워에서 635-nm 레이저 및 600 또는 650 광증폭기 튜브를 사용하여 마이크로어레이 스캐너 (Gene Pix Autoloader 4200) 상에서 스캔된다. 모든 스캔된 영상들은 진 픽스 프로 6.0 소프트웨어 및 진스프링 소프트웨어에 의해 분석되었다.

실시예 5: 엘라이자 프로토콜

96 웰 말레이미드-활성화된 플레이트들은 써모 사이언티픽사 (Thermo Scientific)로부터 획득되었고 400 μL/웰 세척 완충액 (0.1 M 소듐 포스페이트, 0.15 M 염화나트륨, 0.05% 트윈 20, pH 7.2)으로 벡크만 쿨터사 (Beckman Coulter)로부터 나온 플레이트 세척기를 사용하여 3번 세척되었다. 관심 있는 펩토이드는 PBS 완충액 (0.1 M 소듐 포스페이트, 0.15 M 염화나트륨, 10 mM EDTA, pH 7.2)으로 10 mM까지 희석되었고, 200 μL의 펩토이드 용액이 적당한 웰들에 첨가되었다. 다음으로 플레이트는 암소에서 실온으로 2시간 동안 500 rpm으로 진탕하면서 배양되도록 허용되었다. 펩토이드 용액은 다음으로 플레이트 세척기를 사용하여 웰들로부터 흡입되었고, 다시 400 μL/웰의 세척 완충액으로 3번 세척되었다. L-시스테인 HCL: H20 (Thermo Scientific)는 결합 완충액으로 10 μg/mL까지 희석되었고, 웰 당 200 μL가 첨가되었다. 다음으로 플레이트는 암소에서 실온으로 1시간 동안 500 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 200 μL의 StartingBlock ^TM (PBS) 차단 완충액 (Thermo Scientific)이 웰들에 첨가되었고 플레이트는 암소에서 4℃로 1시간 동안 500 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 플레이트는 플레이트 세척기로 3번 세척되었고, 혈청 시료들은 결합 완충액으로 1:200 아래로 일련 희석하여 제조되었다. 1:200 시료 스톡들의 농도는 그들이 유사한 점을 보장하도록 나노-드롭 (Thermo Scientific)으로 취해졌다. 각각의 희석된 시료들은 다음의 희석을 제조하기 이전에 볼텍스되었다. 대조군으로서 혈청이 없는 결합 완충액 뿐만 아니라 혈청 (질환 및 정상 둘 다)의 적당한 희석의 200 μL이 플레이트에 첨가되었다. 혈청은 암소에서 실온으로 2시간 동안 500 rpm으로 진탕하면서 배양되도록 허용되었다. 플레이트는 다시 세척되었고, 결합 완충액으로 염소 항-인간 IgG HRP (Millipore)의 1:30,000의 200 μL이 적당한 웰들에 첨가되었고 암소에서 실온으로 30분 동안 500 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 플레이트는 3번 세척되었고 100 μL의 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액이 각각의 웰에 첨가되었고, 색상이 암소의 벤치 상에서 30분 동안 현상되도록 허용되었다. 100 μL의 2 M 황산 정지 용액이 반응을 정지하도록 첨가되었고, 웰들이 플레이트 해독기를 사용하여 450의 흡광도에서 해독되었다.

따라서, 각각의 경우에 그리고 각각의 질환 또는 임의의 질환에 관하여, 본 발명의 공정은 질환 연관된 바이오마커들 및 이러한 마터들과 결합하는 리간드들을 신속하게 발견하는 데 사용될 수 있다. 이들 리간드들은 - 이러한 리간드들의 더 큰 풀 - 다음으로 복수의 진단적 및/또는 치료적 목적들을 위해 사용될 수 있다. 진단적 플랫폼들은 마이크로어레이들, 비드 기초 방법들 및 엘라이자 시스템들을 포함한다. 상기에 사용된 조건들은 본 발명의 중요한 관점을 포함한다. 이들 조건들은 혈청의 희석 범위들뿐만 아니라 비드 상에서 또는 웰 및 검출 방법들에서 특정한 펩토이드의 농도를 포함한다. 비드 상의 펩토이드를 가지는 비드들의 수는 특정한 테스트 키트 또는 검색 키트에 의존하여 다양화할 수 있다. 이들 수들도 역시 비드들/리간드들이 초기 검색 프로토콜 및 본 명세서에서 재인용된 방법에서 사용되는지 및/또는 고친화도 리간드의 발견을 기초로 한 테스트 키트에 사용되는지 여부에 의존하여 다양화할 수 있다.

당업자들이라면 변화들이 상기 기술된 구현예들로 그들의 광범위한 발명적 개념을 벗어나지 않고도 만들어질 수 있는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 개시된 특정한 구현예들에 제한되지 않고, 첨부된 청구항들에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 변형들을 포괄하도록 의도하는 것으로 이해된다.