마이크로어레이의 해석 방법 및 판독 장치

마이크로어레이의 해석 방법 및 판독 장치{ANALYSIS METHOD AND READING DEVICE FOR MICROARRAY}

본 발명은 마이크로어레이의 해석 방법 및 마이크로어레이의 판독 장치에 관한 것이다.

1990년 이후 생물학, 의학, 약학 방면에서 마이크로어레이라 불리는 기술의 개발이 진행되어 이용되어 왔다. 마이크로어레이는 유리나 플라스틱 등의 기판 위에 수십 내지 수만의 프로브를 고정한 것으로, 형광 분자 등으로 표지된 샘플(타겟)을 이 기판에 어플라이하고, 프로브와 샘플의 결합 반응을 형광 등으로 검출하는 것이다. 마이크로어레이의 특징으로는 한번에 망라적인 측정이 가능하여, 향후 테일러메이드 의료에 필수적인 것이 될 것으로 기대되고 있다.

기판에 고정하는 프로브의 종류에는, 후술하는 바와 같은 것이 있으며, 그 종류에 따라 명칭이 부여되어 있다. 즉, 프로브로서 DNA를 기판에 고정한 DNA 마이크로어레이(DNA 칩), 단백질을 기판에 고정한 단백질 마이크로어레이, 다수의 미소 표본을 기판에 고정화한 조직 마이크로어레이, 다수의 저분자 화합물을 기판에 고정화한 화합물 마이크로어레이 등이 알려져 있다.

이 중, DNA 마이크로어레이(이하 DNA 칩)는 가장 실용화가 진전되어 있으며, 질환과 관련된 유전자의 탐색이나, 그 유전자를 이용하여 검사, 진단을 행하고자 하는 연구가 활발히 행해지고 있고, 일부는 실용화되어 있다.

이하에 마이크로어레이의 한 형태인 DNA 칩에 대해서 상세히 설명한다.

DNA 칩이란, 유리나 수지 등을 포함하는 기판 위에 DNA를 그리드상으로 스폿(고정화)한 것을 말한다. DNA 칩 위에는, 표지되는 DNA 샘플과 특이적으로 반응 가능한 프로브로서, DNA(프로브 DNA)가 스폿되어 있다. 한편, 해석해야 할 미지의 DNA 샘플에는 광학적으로 검출 가능한 발광 또는 형광 마크를 붙여 놓는다. 이렇게 하면, 해석해야 할 미지의 DNA 샘플을 상기 DNA 칩 위에 유입시킴으로써, 상기 DNA 샘플이 스폿된 DNA와 상보적인 관계에 있으면 결합되어 이중쇄가 된다. 따라서, 프로브 DNA와 결합되지 않은 DNA 샘플을 전부 세정하여, DNA 칩 위에 잔존하는 판정하고자 하는 DNA 샘플을 발광시키고, 이를 판독 장치(스캐너)에 의해 판독하면, 이중쇄가 된 DNA의 상황을 화상으로서 관찰할 수 있다. 즉, DNA 칩 위에서 발광하는 마크의 분포를 해석함으로써, 원하는 유전자의 존재나, 어떤 유전자가 발현하고 있는지의 여부, 또는 어느 정도 발현하고 있는지를 해석할 수 있다. 이와 같이, DNA 칩 위에 기지의 프로브 DNA 세팅를 구성하고, 이 프로브 DNA를 다종류 DNA 칩 위에 탑재함으로써, 유전자의 변이나 유전자의 발현량 등을 검출할 수 있다.

이하, 도 1에 DNA 칩 해석의 일련의 처리 공정의 상세를 나타낸다.

도 1에 나타내는 전처리 공정에서는, 검체로부터 추출한 DNA 샘플 중에 포함되는 미지의 DNA를 증폭하고, 이들 DNA에 형광 마크를 부여한다.

다음으로 혼성화 공정에서, 다종류의 프로브 DNA가 탑재된 DNA 칩의 기판 위에, 형광 마크(예를 들면, Cy3, Cy5 등)를 부여한 DNA 샘플을 적하한다. 여기서, DNA 샘플이 스폿된 DNA와 상보적인 관계에 있으면 결합되어 이중쇄가 된다.

다음으로, 세정 공정에서, 소정의 세정액에 의해 혼성화된 DNA 칩을 세정한다. 이에 따라, 그리드상으로 배치된 프로브 DNA와 결합되지 않은 DNA 샘플이 전부 씻겨 내려간다.

계속해서, 세정된 DNA 칩을 스캐닝한다. 스캐닝 공정에서는, 판독 장치 내에서, 형광 마크(예를 들면, Cy3, Cy5 등)를 여기하는 데에 적합한 소정의 파장의 레이저광을 DNA 칩에 조사하여 주사한다. 이에 따라, 스폿된 각 DNA(유전자)의 발광량이 측정되고, 그것에 기초하여 해석 처리를 행하는 형광 화상 데이터를 취득한다.

해석 공정에서는, 얻어진 형광 화상 데이터에 대하여 템플릿을 이용하여 각 스폿의 형광 강도를 산출하고, 각종 해석을 실행한다.

여기서, 도 2에 DNA 칩 해석에 이용되는 DNA 칩 (1)의 일례를 나타낸다. 도 2에 도시한 DNA 칩 (1)은, 기판 (2) 위에 개개의 유전자에 대응하는 프로브 DNA가 행 방향 및 열 방향으로 소정수, 매트릭스상으로 배열된 블록을 갖고 있다(이하, 해당 블록에 배치되어 있는 프로브 DNA를 "스폿" (3)이라 함). 또한, 기판 (2) 위에 배치되는 스폿 (3)은, 이미 그의 염기 배열이 해독되어 있는 서로 다른 유전자에 각각 대응하는 것으로, 기판 (2) 위에서의 그의 배치 위치는 미리 정해져 있다.

또한, 도 3에 DNA 칩의 형광 화상 데이터에 대하여 적용되는 템플릿의 일례를 나타낸다. 도 3에 도시한 바와 같이, 템플릿은, 예를 들면 1 내지 32 등의 복수의 블록으로 분할되어 있고, 각 블록 내에서는 m행 n열(도 3에서는 22×22)의 매트릭스상으로 배치된 검출 영역(DNA 칩의 개개의 스폿에 대응함)이 설치되어 있다.

상기한 해석 공정에서는, 판독한 DNA 칩의 형광 화상 데이터 중 개개의 스폿에 해석툴이 제공하는 템플릿의 검출 영역을 적용시켜(얼라인먼트), 해당 검출 영역에서 각 스폿의 형광 강도를 산출한다. 이 때, 정확한 해석을 실행하기 위해서는 화상 위의 개개의 스폿에 대하여 템플릿의 개개의 검출 영역이 정확하게 설정되도록 얼라인먼트 처리가 정확하게 실행될 필요가 있다.

이 얼라인먼트의 방법으로는, 블록 단위로 얼라인먼트를 행하는 패턴 매칭법이나 투영법 등이 있다. 그리고, 특허문헌 1에 나타낸 바와 같이, 포지티브 컨트롤이라 불리는 형광 물질이나 어떠한 검체에도 포함되어 있는 하우스키핑 유전자를 스폿한 칩을 사용하여, 얼라인먼트를 정확하게 행하고자 하는 시도도 이루어지고 있다.

그러나, 블록 단위로 얼라인먼트를 행하는 전형적인 패턴 매칭법이나 투영법은, 모두 혼성화한 샘플 DNA의 양이 많고, 충분한 강도의 형광을 발하는 스폿이 1/4에서 절반 정도 존재하지 않으면 정확하게 얼라인먼트할 수 없다. 그 때문에, 검체로부터 추출한 샘플 중에 포함되는 DNA 양이 적은 경우, 얼라인먼트를 정상적으로 행할 수 없는 경우가 있다. 한편, 포지티브 컨트롤이라 불리는 형광 물질을 배치하는 방법은, 충분한 강도의 형광을 발하는 스폿이 적어도 얼라인먼트를 행할 수 있다는 이점이 있지만, 배치 가능한 DNA수가 감소하여, 칩 제조시에 있어서의 비용 상승 등의 문제가 있다. 또한, 형광 물질을 포지티브 컨트롤로서 이용한 경우, 혼성화 중에 그것이 유리되어 포지티브 컨트롤의 주변을 오염시켜, 데이터를 얻을 수 없을 우려도 있다. 또한, 하우스키핑 유전자에 대응하는 DNA 프로브를 배치한 경우에는, 샘플에 포함되는 DNA 양이 적을 때, 포지티브 컨트롤로부터의 형광도 작아, 결과적으로 얼라인먼트가 곤란해진다는 문제도 있다.

본 발명은 상기한 과제를 해결하기 위해서 이루어진 것으로, 포지티브 컨트롤을 배치하지 않은 DNA 칩의 해석에 있어서도, 또는 샘플에 포함되는 DNA 양이 적은 칩의 해석에 있어서도, 얼라인먼트 처리를 적절히 행하는 것이 가능한 해석 방법 및 장치를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하는 본 발명은 이하 중 어느 하나의 구성을 특징으로 하는 것이다.

(1) 요철 형상을 갖는 기판 표면에 프로브가 배치된 마이크로어레이에 여기광을 조사하고, 여기광으로 여기된 각 프로브로부터의 형광량을 수치 데이터로서 얻는 마이크로어레이의 해석 방법으로서, 프로브의 형광량을 측정하여 형광 화상 데이터를 취득하는 스텝 (a)와, 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 수광하여, 이 광의 수광 강도로부터 마이크로어레이의 기판 표면의 요철 형상을 얼라인먼트용 화상 데이터로서 취득하는 스텝 (b)와, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터에 기초하여 상기 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정하는 스텝 (c)를 포함하는, 마이크로어레이의 해석 방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광은, 상기 여기광을 조사하는 광원으로부터의 광이 상기 마이크로어레이에서 반사 및/또는 산란한 광인 마이크로어레이의 해석 방법.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 스텝 (c)는, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터에서 수광 강도의 차에 기초하여 상기 마이크로어레이의 3개 이상의 기준점 A를 검출하는 스텝 (c1)과, 검출한 기준점 A를 기초로 상기 형광 화상 데이터의 왜곡을 보정하는 스텝 (c2)를 포함하고 있는, 마이크로어레이의 해석 방법.

(4) 상기 (4)에 있어서, 상기 스텝 (c1)은, 적어도 8개의 소정의 관찰 영역 각각에서 상기 기판의 윤곽선 위의 점인 윤곽 기준점 a를 산출하는 스텝 (c11)과, 중복되지 않은 소정의 적어도 2개의 관찰 영역을 한조로 하여 각 조에서 복수의 윤곽 기준점 a에 대한 근사 직선을 구하는 스텝 (c12)와, 각 조에서 구한 근사 직선의 교점을 산출하여 상기 교점을 상기 기준점 A로 하는 스텝 (c13)을 포함하고 있는, 마이크로어레이의 해석 방법.

(5) 상기 (3) 또는 (4)에 있어서, 상기 스텝 (c2)가 상기 기준점 A로부터 프로브를 배치하고 있는 스폿의 배열 각도 θx, θy를 얻어, 상기 스폿의 배열 각도θx, θy 및 하기 수학식 1, 2로부터 상기 형광 화상 데이터의 전단 변형 왜곡을 보정하는 것인 마이크로어레이의 해석 방법.

(6) 상기 (3) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 스텝 (c1)은 4개의 기준점 A를 검출하고, 그 4개의 기준점 A를 직선으로 연결하여 형성되는 사각형이 평행사변형이 아닌 경우에는, 추가로 상기 사각형을 평행사변형에 근사하고, 상기 평행사변형의 정점을 기준점 A로서 다시 설정하는 마이크로어레이의 해석 방법.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이크로어레이가 DNA 마이크로어레이인 마이크로어레이의 해석 방법.

(8) 요철 형상을 갖는 기판 표면에 프로브가 배치된 마이크로어레이에 여기광을 조사하는 레이저 광원과, 상기 기판 표면에서 반사한 여기광과 상기 프로브로부터의 형광의 광속을 평행광으로 하는 대물렌즈와, 상기 기판 표면에서 반사한 여기광을 차단함과 함께 상기 프로브로부터의 형광을 투과하는 광학 필터와, 상기 광학 필터를 투과한 형광을 수광하여 형광 화상 데이터를 취득하는 결상 렌즈 및 검출기를 구비한 마이크로어레이의 판독 장치로서, 상기 결상 렌즈 및 검출기는 상기 기판 표면에서 반사 및/또는 산란한 광을 수광하여, 마이크로어레이의 기판 표면의 요철 형상이 나타난 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득 가능하며, 또한 상기 얼라인먼트용 화상에 기초하여 상기 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 검출하는 연산 처리 장� ��를 구비하고 있는 마이크로어레이의 판독 장치.

(9) 상기 (8)에 있어서, 상기 결상 렌즈와 상기 검출기 사이에 피사체 심도를 제한하는 핀홀을 갖는 마이크로어레이의 판독 장치.

본 발명에 따르면, 포지티브 컨트롤을 배치하지 않은 DNA 칩의 해석이나, 샘플에 포함되는 DNA 양이 적은 칩의 해석의 경우에도 얼라인먼트 처리를 적절히 행할 수 있어 해석이 가능해진다.

[도 1] DNA 칩 해석의 일련의 공정을 도시한 개략도이다.
[도 2] DNA 칩 해석에 이용되는 DNA 칩의 일례를 도시한 개략도이다.
[도 3] DNA 칩 해석에 있어서, DNA 칩의 형광 화상 데이터에 대하여 적용되는 템플릿의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 4] 본 발명의 한 실시 형태를 나타내는 DNA 칩의 해석 장치의 개략 모식도이다.
[도 5] DNA 칩의 판독 장치에 있어서의 광학계의 한 실시 형태를 나타내는 개략 모식도이다.
[도 6] 스폿 배열의 행 방향과 열 방향이 수직으로 직교하는 DNA 칩을 스캐닝했음에도 불구하고 왜곡이 발생하여 상기 스폿 배열이 수직이 되지 않는 형광 화상 데이터의 일례를 나타내는 모식도이다.
[도 7] DNA 칩의 판독 장치에서 얻어진 얼라인먼트용 화상의 일례이다.
[도 8] DNA 칩의 해석 방법의 한 실시 형태를 나타내는 블럭도이다.
[도 9] DNA 칩의 판독 장치에서 얻어진 얼라인먼트용 화상에 있어서의 네 모서리의 좌표를 도시한 도면이다.
[도 10] 도 6에 있어서의 Step 4, Step 5의 처리를 도시한 도면이다.
[도 11] 본 발명에서 해석에 제공한 얼라인먼트용 화상 데이터 (a) 및 형광 화상 데이터 (b), (c)의 일례이다.
[도 12] 기준점의 검출 방법의 일례를 도시한 도면이다.
[도 13] 얼라인먼트용 화상 데이터에서 DNA 칩에 회전이 가해지고 있을 때의 일례이다.
[도 14] 사다리꼴을 평행사변형에 근사한 방법을 도시한 도면이다.

본 발명의 마이크로어레이의 해석 장치는, 프로브로서의 DNA를 기판에 고정한 DNA 마이크로어레이(DNA 칩)나, 프로브로서의 단백질을 기판에 고정한 단백질 마이크로어레이, 다수의 미소 표본을 기판에 고정화한 조직 마이크로어레이, 다수의 저분자 화합물을 기판에 고정화한 화합물 마이크로어레이 등을 해석하는 장치이며, 마이크로어레이의 기판 표면의 요철 형상을 이용하여, 얻어지는 형광 화상 데이터의 얼라인먼트를 행하는 것이다. 상기 해석 장치에 있어서는, 요철 형상을 갖는 기판 표면에 프로브가 배치된 마이크로어레이에 여기광을 조사하고, 여기광으로 여기된 각 프로브로부터의 형광량을 수치 데이터로서 얻지만, 그 때 프로브의 형광량을 측정하여 형광 화상 데이터를 취득함과 함께(스텝 (a)), 상기 스텝 (a)와는 별도로 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 수광하여, 이 광의 수광 강도로부터 마이크로어레이의 기판 표면의 요철 형상을 얼라인먼트용 화상 데이터로서 취득한다(스텝 (b)). 그리고, 스텝 (b)에서 얻어진 얼라인먼트용 화상 데이터에 기초하여 스텝 (a)에서 얻어진 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정한다(스텝 (c)).

본 발명에서 말하는 마이크로어레이란, 유리나 플라스틱 등의 기판 위에, 예를 들면 수십 내지 수만의 프로브를 고정한 것이다. 형광 분자 등으로 표지된 샘플(타겟)을 이 마이크로어레이의 기판에 어플라이하고, 프로브와 샘플의 결합 반응을 형광으로 검출한다. 상술한 바와 같이, 기판에 고정하는 프로브의 종류에 따라 명칭이 부여되어 있으며, 프로브로서 DNA를 기판에 고정한 DNA 마이크로어레이(DNA 칩), 단백질을 기판에 고정한 단백질 마이크로어레이, 다수의 미소 표본을 기판에 고정화한 조직 마이크로어레이, 다수의 저분자 화합물을 기판에 고정화한 화합물 마이크로어레이 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 마이크로어레이의 대표예인 DNA 칩의 해석 방법 및 해석 장치를 예로 들어 설명한다.

DNA 칩 등의 마이크로어레이의 해석은, 예를 들면 도 4에 도시한 바와 같이, 스캐너 (4)와, 스캐너 제어용 PC (5)와, 화상 서버 (6)과, 해석용 PC (7) 등을 이용하여 행해진다.

스캐너 (4)는 레이저 광원, 광학 필터, 대물 광학계, 형광 화상 데이터 및 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 검출기 등으로 구성된다. 더욱 상세하게는, 스캐너 (4)는, 예를 들면 도 5에 도시한 바와 같이, DNA 칩 (1) 등의 기판을 두 방향으로 주사하기 위한 주사 기구(도시하지 않음, 또한 본 명세서에 있어서는 칩의 길이 방향을 y축, 그것에 직교하는 방향을 x축으로 함)와, DNA 칩 등의 기판을 복수 올려놓은 오토로더 기구(도시하지 않음)와, 각각 특정 파장의 여기광을 기판 표면에 출사하는 레이저 광원 (501, 502)와, 상기 여기광을 수광한 프로브로부터의 광(형광) 및 상기 여기광의 기판 표면으로부터의 반사광·산란광의 광속을 평행광으로 하는 대물렌즈 (504)와, 레이저 광원 (501)로부터의 여기광을 차단하면서 프로브로부터의 형광을 투과시키는 여기광 차단 필터 (508)과, 레이저 광원 (502)로부터의 여기광을 차단하면서 프로브로부터의 형광을 투과시키는 여기광 차단 필터 (507)과, 프로브� �부터의 형광을 수광·결상함으로써 형광 화상 데이터를 취득함과 함께, 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 수광·결상하고, 그의 수광 강도로부터 마이크로어레이의 기판 표면의 요철 형상을 얼라인먼트용 화상 데이터로서 취득하는 결상 렌즈 (509) 및 검출기 (511)을 구비하고 있다.

또한, 도 5에 도시한 양태에 있어서는, 장치를 작게 하기 위해 여기광을 미러 (512, 513)에 의해 굴절시켜 DNA 칩 (1)에 도달시킨다.

또한, 주사 기구의 기준축은, 왜곡이 없는 화상을 얻기 위해 직교하고 있는 것이 바람직하다. 주사 기구로는, 일반적으로 2축 모두 슬라이더를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 실시 양태는, DNA 샘플에 2종의 형광 마크를 붙여, 이들을 판독하는 장치로 했기 때문에, 해당 2종의 형광 마크에 대응한 파장의 광을 출사하는 레이저 광원 (501, 502)와, 출사되는 여기광의 파장에 각각 대응한 여기광 차단 필터 (508, 507)을 구비하고 있다. 그러나, DNA 샘플에 1종만으로 형광 마크를 붙여, 그 판독을 행하는 장치로 할 수도 있고, 3종 이상의 형광 마크를 붙여, 이들의 판독을 행하는 장치로 할 수도 있다. 어느 경우에도 이용하는 형광 색소에 대응한 레이저 광원과 여기광 차단 필터를 설치할 수 있다.

해석용 PC (7)(연산 처리 장치)에는, 상기 검출기 (511)에서 취득한 얼라인먼트용 화상에 기초하여 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 검출하기 위한 연산 처리를 행하는 프로그램이 도입되어 있다.

이상과 같은 장치에 있어서는, 기본적으로 발광성의 마커에 의해 마킹된 DNA 샘플을 적하한 DNA 칩을 레이저광에 의해 여기하여, 형광 화상 데이터를 취득한다. 형광 화상 데이터를 취득할 때에는, 스캐너 제어용 PC (5)에 의해, 스캐너 (4)에서의 DNA 칩 (1)의 주사나 화상 취득의 제어를 행한다. 해당 스캐너 제어용 PC (5)로는 범용 개인용 컴퓨터 등을 이용한다.

얻어진 형광 화상 데이터는, DNA 칩 화상 파일 (8)로서 화상 서버 (6)에 보존된다. DNA 칩 (1)은, 후술하는 바와 같이, 예를 들면 형광 색소 Cy3, Cy5에 대응하는 여기 파장으로 스캔되고, 하나의 DNA 칩 (1)에 대응하여 각각의 여기 파장에 대응한 형광 화상 데이터가 얻어지지만, 이 형광 화상 데이터는, 예를 들면 16 비트 그레이스케일 Tiff 포맷, BMP 포맷, JPEG 포맷 등의 파일 형식으로 보존된다.

해석용 PC (7)은, 화상 서버 (6)에 보존된 DNA 칩 화상 파일 (8)을 읽어들인다. 또한 해석 실행용 매개변수 등을 정의하는 해석 정의 파일 (9)를 읽어들여 DNA 칩 화상의 해석을 실행하고, 수치화된 해석 결과 데이터를 수치화 데이터파일 (10)으로서 출력한다. 이 해석용 PC (7)에는, 후술하는 얼라인먼트 처리를 포함한 해석 처리를 실행하기 위한 프로그램이 도입된다.

기본적으로는 이상과 같은 방법으로 DNA 칩 등 마이크로어레이의 해석이 행해지지만, 본 발명에서는 형광 화상 데이터를 취득하는 공정((상기 스텝 (a))과는 별도로, 마이크로어레이의 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 수광하여, 상기 기판의 요철 형상을 얼라인먼트용 화상 데이터로서 취득하고(상기 스텝 (b)), 얻어진 얼라인먼트용 화상 데이터에 기초하여 얼라인먼트 처리를 행하여 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정한다(상기 스텝 (c)).

다음으로, 스캐너 (4)에서의 형광 화상 데이터 및 얼라인먼트용 화상 데이터의 취득 방법과 얼라인먼트 처리 방법에 대해서 자세히 설명한다.

우선, 도 5를 이용하여 상기 스텝 (a)에 대응하는 화상 취득 방법에 대해서 설명한다. 또한, 이하에서는 형광 색소로서 Cy5, Cy3을 이용한 양태를 설명하는데, 샘플을 표지하기 위한 형광 색소는 어느 하나일 수도 있으며, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 형광 색소로는, 예를 들면 Fluorescin, FITC, Alexa Fluor 555, Rodamine, Cy3.5, Texas Red, TAMURA, Oyster 650, Cy5.5 등을 사용할 수 있다.

예를 들면, 최초로 형광 색소 Cy5를 판독하기 위해, Cy5용 레이저 광원 (501)(예를 들면 파장 635 nm의 레이저 광원)로부터 레이저광(즉 형광 색소 Cy5의 여기광)을 조사한다. 레이저광은 구멍뚫린 미러 (503) 및 대물렌즈 (504)를 통해 DNA 칩 (1)에 조사된다. 조사된 레이저광에 의해 여기 발광한 형광 분자로부터의 형광 (505) 및 칩 표면에서 반사 및/또는 산란한 레이저광 (506)은, 대물렌즈 (504)에서 서로 대략 평행해지도록 집광된다. 그 후, 상기 형광 (505) 및 레이저광 (506)은, 구멍뚫린 미러 (503)으로 반사되어, Cy5용 여기광 차단 필터 (508)에 입사된다. 또한, 칩 표면에서 정반사한 레이저광은, 구멍뚫린 미러 (503)의 구멍을 통과한다. 여기 발광한 형광 분자로부터의 형광 (505)는, 이 여기광 차단 필터 (508)을 투과하여 결상 렌즈 (509)로 집광된다. 한편, 여기광 차단 필터 (508)에 도달한 여기광(칩 표면에서 반사 및/또는 산란한 광)은 차단된다. 결상 렌즈 (509)에서 집광된 형광 (505)는, 핀홀 (510)에 의해 결상 렌즈 (509)의 촛점 위치 부근 이외의 광이 차단되어, 검출기 (511)에 입사된다. 검출기 (511)은, 광의 강약에 따른 전기 신호를 출력한다. 이러한 공정을 스캐너 제어용 PC (5)에 의해 DNA 칩 (1)을 두 방향으로 주사시켜 반복하면서, 검출기 (511)로부터 출력된 전기 신호를 A/D 변환하여 형광 화상 데이터를 작성한다.

계속해서, 형광 색소 Cy3의 판독을 행한다. 형광 색소 Cy3의 판독은, Cy5용 레이저 광원 (501)을 Cy3용 레이저 광원 (502)(예를 들면 레이저 파장 532 nm의 레이저 광원)로 대체함과 함께, Cy5용 여기광 차단 필터 (508)을 Cy3용 여기광 차단 필터 (507)로 대체하는 것 이외에는, 형광 색소 Cy5의 판독과 마찬가지로 행할 수 있다. 즉, Cy3용 레이저 광원 (502)로부터 레이저광(즉 형광 색소 Cy3의 여기광)을 조사함과 함께, Cy3용 여기광 차단 필터 (507)로 상기 여기광 차단 필터 (507)에 도달한 여기광(즉 칩 표면에서 반사 및/또는 산란한 광)을 제거함으로써, Cy5와 마찬가지로 형광 화상 데이터를 작성한다.

여기서, 스캐너의 주사 기구가 2개인 슬라이더를 구비한 경우, 이들 슬라이더가 반드시 직교하고 있다고는 한정되지 않는다. 장치 조립시 또는 시간의 경과 등에 따라 어긋나는 경우도 있다. 그 때문에, 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상도, 예를 들면 도 6(a)에 도시한 바와 같이 기울어져 있을 가능성이 있다. 이와 같이, 주사 기구의 x축과 y축이 직교하지 않은 경우에는 얻어진 형광 화상 데이터가 왜곡되어, 템플릿의 검출 영역이 얻은 화상에 정확하게 위치 정렬할 수 없다.

이 때문에, 화상으로부터 직교도의 어긋남을 검출하여, 슬라이더가 직교하는 주사 기구에서 얻어지는 화상과 동등해지도록 보정하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 형광 화상 데이터를 x축에 대하여 y축 방향에 투영하고, 좌표 X마다 적산 강도(각 화소값의 적산값)를 산출한다. 이 처리를, 좌표 원점 주위에 형광 화상 데이터를 미리 설정한 각도씩 회전시켜 반복한다. 투영 방향과 스폿의 y축 방향의 배열 방향이 어긋나 있는 경우의 적산 강도 그래프는, 도 6(b)에 도시한 바와 같이 진폭이 없는 그래프가 된다. 한편, 투영 방향과 스폿의 y축 방향의 배열 방향이 일치한 경우의 적산 강도 그래프는, 도 6(c)에 도시한 바와 같이, 신호의 진폭이 최대가 된다. 투영 데이터의 이러한 특징을 이용하여, 적산 강도의 표준편차가 최대값을 취하는 각도를 구함으로써, 스폿의 y축에 대한 배열의 각도를 검출할 수 있다. 마찬가지로 x축에 대한 배열의 각도를 구하고, 전단 변형 등의 화상 처리를 실시함으로써 스폿의 배열 방향을 직교시키는 것이 가능하다.

이상과 같이 하여 형광 화상 데이터를 취득하는 경우, 검체로부터 추출한 샘플 중에 포함되는 DNA가 매우 적으면, Cy5, Cy3 모두 발광하는 스폿수가 적어지기 때문에 블록의 경계를 알 수 없으며, 화상의 직교도 보정도 불가능하기 때문에, 얼라인먼트 처리가 불가능해진다.

따라서 본 발명에서는, 상기한 바와 같은 형광 화상 데이터 이외에, 칩을 재세팅하지 않고 이하와 같은 얼라인먼트용 화상 데이터도 취득한다(상기 스텝 (b)). 즉, DNA 칩 (1)에 광을 조사하고, 상기 칩의 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 수광함으로써, 얼라인먼트용 화상 데이터를 얻는다. 이는 요철 형상을 갖는 기판 표면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 적극적으로 수광하고, 이 광의 수광 강도에 기초하여 기판 표면의 요철 형상을 화상화하여, 상기 요철 형상을 얼라인먼트에 이용하기 위함이다.

DNA 칩에서의 스폿 위치는, 상기 DNA 칩을 재세팅할 때까지 변화하지 않는다. 그 때문에, 얼라인먼트용 화상 데이터에서의 스폿 위치와 Cy5 및 Cy3의 형광 화상 데이터에서의 스폿 배치는 일치한다. 따라서, 본 발명에서는 얼라인먼트용 화상 데이터에서 얻어지는 얼라인먼트 결과를 Cy5 및 Cy3의 형광 화상 데이터에 적용함으로써, 상기 형광 화상 데이터의 얼라인먼트 처리가 가능해진다.

여기서, 구체적으로 상기한 구성의 장치에서 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하기 위해서는, Cy5용 레이저 광원 (501)로부터 레이저광을 조사함과 함께, Cy3용 여기광 차단 필터 (507)을 사용하는 것이 바람직하다. Cy3용 여기광 차단 필터 (507)에는 일반적으로 550 내지 600 nm의 대역 통과 필터를 이용하는 경우가 많지만, 상기 여기광 차단 필터 (507)은, 일반적으로 Cy5의 여기광의 파장의 광(635 nm)을 약간 투과하기 때문에(예를 들면, 635 nm의 광의 OD값이 약 5), 예를 들면 도 7(a)에 도시한 바와 같이, DNA 칩의 요철 형상을 화상화하는 것이 가능하다. 즉, 특정 파장의 광에 의해서 여기 발광한 형광 분자로부터의 형광이 아닌, 기판 표면으로부터의 반사광이나 산란광을 수광하여, 상기 기판 그 자체의 요철 형상을 화상화할 수 있다. 또한, 도 7(a)의 PP' 선분에서의 화소값의 프로파일을 도 7(b)에, 대응하는 장소의 DNA 칩의 높이 프로파일을 도 7(c)에 도시하였다. 이와 같이 레이저광을 적극적으로 수광함으로써, 결상 렌즈 (509)의 촛점 부근이면서 레이저의 광축에 수직인 DNA 칩의 표면으로부터의 광의 수광 강도가 강해지기 때문에, 도 7(a)와 같은 기판 표면의 요철 형상이 나타난 얼라인먼트용 화상 데이터가 얻어진다.

얼라인먼트 화상 데이터 취득용 광원에 대해서는, 스캐너의 부품 갯수를 적게 할 수 있기 때문에, 형광 분자를 여기하기 위한 여기광을 출사하는 광원을 이용하는 것이 바람직하지만, 별도로 얼라인먼트 화상 데이터 취득용 광원을 설치하여도 관계없다.

또한, 얼라인먼트용 화상 데이터의 취득시에 필터를 사용하지 않는 방법도 채용할 수 있다. 그러나, 필터를 이용하지 않는 경우에는, 검출기에 입사되는 광량이 너무 커지기 때문에 검출기를 망가뜨릴 가능성이 있다. 따라서, 상기한 바와 같이, Cy5용 레이저 광원 (501)로부터 레이저광을 조사하는 경우에는 여기광 차단 필터 (507)을 사용하는 등, 조사하는 광원의 파장을 약간 투과하는 필터를 이용하는 것이 바람직하다. 반대로, Cy3용 레이저 광원 (502)로부터 레이저광을 조사하여 여기광 차단 필터 (508)을 이용할 수도 있다. 또한, 여기광 차단 필터 (507, 508) 대신에 ND 필터를 이용하거나, 여기광 차단 필터 (507, 508)이나 ND 필터를 사용하지 않고 상기 레이저광의 출력 자체를 약하게 하여 얼라인먼트용 화상 데이터를 얻어도 관계없다. 물론, 이들의 조합도 적용할 수 있다.

또한, 얼라인먼트용 화상 데이터에는, DNA 칩을 스캐너에 세팅할 때에 회전 어긋남이나 위치 어긋남이 발생할 우려가 있다. 그러나, 이들 회전 어긋남이나 위치 어긋남의 양도 DNA 칩을 재세팅할 때까지 일정하다. 이 때문에, 얼라인먼트용 화상 데이터에서의 스폿 위치와 Cy5 및 Cy3의 형광 화상 데이터에서의 스폿 배치는 일치한다.

다음으로, 이 얼라인먼트용 화상 데이터에 기초하여 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정하고(상기 스텝 (c)), 마이크로어레이의 해석을 행한다. 이하에, 이 방법의 상세에 대해서, 도 8에 도시한 블럭도를 이용하여 설명한다. 다만, 도 8에 있어서의 Step 1, 2는 상기한 공정에 상당하는 공정이다.

우선, Step 1에서는, 스캐너에 DNA 칩을 세팅하고, 상술한 바와 같이 형광 색소 Cy5 및 Cy3의 형광 화상 데이터를 읽어들인다(상기 스텝 (a)). 계속해서, Step 2에서는, DNA 칩을 세팅한 상태로 Cy5용 레이저 광원 (501)로부터 여기광을 조사함과 함께, Cy3용 여기광 차단 필터 (507)을 사용하여 얼라인먼트용 화상을 읽어들인다(상기 스텝 (b)). 또한, 본 공정에서는, Cy3용 레이저 광원 (502)로부터 여기광을 조사함과 함께 Cy5용 여기광 차단 필터 (508)을 사용할 수도 있다. 또한 별도의 광원을 준비하여, 그 광의 DNA 칩으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 수광하여 얼라인먼트용 화상을 취득할 수도 있다.

그리고, Step 3 이후에, 얼라인먼트용 화상 데이터를 사용하여 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정하여(상기 스텝 (c)) 해석한다.

구체적으로는, 우선 Step 3에서 얼라인먼트용 화상 데이터에서의 적어도 3개의 기준점 A를 검출한다(스텝 (c1)). 여기서 적어도 3개의 기준점 A로는, 예를 들면 도 9에 도시한 바와 같이, 얼라인먼트용 화상에서의 네 모서리의 좌표를 들 수 있다. 이러한 네 모서리의 좌표의 검출 방법은, 명암 정보를 이용한 엣지 검출이나, 마찬가지로 명암 정보를 이용하는, 네 모서리의 화상을 마스터 화상으로 한 패턴 매칭 등이 바람직하다.

계속해서, Step 4, 5에 있어서, 상기 기준점 A에 기초하여 형광 화상 데이터의 왜곡을 보정한다(스텝 (c2)).

구체적으로는, Step 4에 있어서, 예를 들면 상술한 네 모서리의 좌표로부터, 스폿의 x축에 대한 배열 각도(가장 근처에 인접하는 스폿을 직선적으로 연결한 선의 x축에 대한 경사각도) θx, 스폿의 y축에 대한 배열 각도(가장 근처에 인접하는 스폿을 직선적으로 연결한 선의 y축에 대한 경사각도) θy를 검출한다. θx, θy는, 네 모서리의 좌표를 연결한 4개의 선분에 대해서, 해당 방향의 2개의 선분의 각도의 평균값을 취하는 것이 바람직하다. 또한, 기준점이 3점이어도 θx, θy를 산출 가능하다. 그리고, 도 10(a), (b)에 도시한 바와 같이, 스폿의 y축에 대한 배열 각도 θy를 보정 각도로서 이용하여 형광 화상 데이터를 회전시켜, 스폿을 y축에 대하여 평행하게 한다.

또한, Step 5에 있어서, 회전 후의 화상에 대하여, 상술한 바와 같이 검출한 두 방향으로 규칙적으로 배열되어 있는 스폿의 배열 각도 θx, θy 및 하기 수학식 1, 2에 기초하여 변환(전단 변형)을 실시한다. 이에 따라, 화상의 전단 변형 왜곡을 보정한다. 이 변환 후의 화상을 도 10(c)에 도시하였다. 또한, 하기 수학식의 (x, y)는 변환 전의 좌표(X, Y)는 변환 후의 좌표이다. 또한, 스캐너의 주사 기구의 어긋남(주사 기구의 기준축의 직교도)에 상당하는 θxy는, 수학식 4에 나타낸 바와 같이, 스폿의 x축에 대한 배열 각도 θx로부터 y축에서 대한 배열 각도 θy를 빼서 구한다.

<수학식 1>

<수학식 2>

또한, DNA 칩 (1)이 수지 성형품인 경우, 혼성화 공정이나 세정 공정에서의 흡습이나 온도 변화에 의해 수지가 팽창하는 경우가 있다. 각 공정에서의 처리 시간에 따라서도 다르지만, 수십 ㎛ 팽창하는 경우가 있어, 얼라인먼트의 정밀도에 영향을 미친다.

이 때문에, Step 6, 7에 있어서, 예를 들면 상기 네 모서리의 좌표로부터 x축 방향 및 y축 방향의 칩 길이를 산출함과 함께, 설계값과 일치하도록 형광 화상 데이터를 수축시킨다.

계속해서, 상기한 바와 같이 하여 회전 보정, 전단 변형 보정, 수축 보정을 한 형광 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한다. 미리 해석 정의 파일에 보존되어 있는 템플릿에서의 각 스폿의 위치 정보는, 예를 들면 칩 좌측 상단의 모서리를 원점으로 한, 각 스폿의 중심 좌표로 되어 있다. 이 때문에, Step 7에서 수축 보정한 후의 화상에 대해서, 예를 들면 좌측 상단 모서리의 좌표를 원점으로 하고 각 스폿 프레임을 계산함으로써, 도 11(b), (c)에 도시한 바와 같이 얼라인먼트가 가능하다(Step 8). 또한, 도 11(b)가 Cy3의 형광 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한 결과를 나타내는 화상, 도 11(c)가 Cy5의 형광 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한 결과를 나타내는 화상이다. 또한, 확인을 위해, Step 2에서 얻어진 얼라인먼트용 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한 결과를 도 11(a)에 도시하였다. 각 도면에 있어서 점선으로 묘화한 원의 내부가 템플릿으로 규정된 검출 영역이다.

그 후, Step 9에 있어서는, Step 8에서 구한 각 스폿의 중심 좌표로부터, 스폿 반경 내의 화소의 신호 강도에 대해서 평균값, 메디안값, 표준편차 등의 통계량을 산출하고, 스폿이 속하는 블록번호, 스폿의 행렬번호, 배치되어 있는 프로브 DNA명과 합쳐서 각종 수치 데이터를 파일로서 출력한다.

또한, 상기한 바와 같은 도 8에 도시한 공정에서, 상기 Step 1, 2의 순서는 변경할 수도 있다.

또한, 혼성화시의 검체 유동성을 양호하게 하기 위한다는 것 등의 이유로 인해, DNA 칩의 네 모서리는 각이 둥글게 성형되어 있는 경우가 있다. 이 때문에, Step 3에서의 기준점 A의 검출시에는, DNA 칩의 윤곽선 위의 점의 좌표에 기초하여 기준점 A를 검출하는 것이 바람직하다.

즉, 도 12에 도시한 바와 같이, DNA 칩의 네 모서리 각각의 근방에 실질적으로 x축 방향으로 계속되는 윤곽선을 포함하는 것과 같은 윤곽점 검출용 윈도우(관찰 영역) Wy와, 실질적으로 y축 방향으로 계속되는 윤곽선을 포함하는 것과 같은 윤곽점 검출용 윈도우 Wx를 설정한다. 그리고, 상기 윤곽점 검출용 윈도우 Wx, Wy 각각에 있어서, DNA 칩의 윤곽선 위의 일점에 상당하는 윤곽 기준점 a를 검출하고, 윈도우 Wy에서의 윤곽 기준점 a의 y 좌표와, 윈도우 Wx에서의 윤곽 기준점 a의 x 좌표로부터, DNA 칩의 각에 상당하는 기준점 A의 좌표를 산출한다. 이를 예를 들면 네 모서리에 대해서 행한다.

또한, 네 모서리의 각각에 대하여 윤곽점 검출용 윈도우 Wx, Wy가 각각 1개씩밖에 설정되어 있지 않은 경우, DNA 칩이 스캐너의 고정 조정 기구에 비스듬히 고정되어 있으면, 도 13(a), 및 도 13(a)의 이점 쇄선으로 둘러싸인 부분을 확대한 도 13(b)에 도시한 바와 같이, 검출하여야 할 기준점 A의 위치와 실제로 검출된 기준점 A와의 위치에 오차가 생겨, 스폿을 제대로 얼라인먼트할 수 없다.

그 때문에, 본 발명에서는 윤곽점 검출용 윈도우 Wx, Wy를 각각 적어도 4개씩, 즉 합계 8개 이상 설정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 도 13(c)에 도시한 바와 같이, 네 모서리 각각에 대하여 적어도 2개의 윤곽점 검출용 윈도우 Wx(1301, 1302) 및 적어도 2개의 윤곽점 검출용 윈도우 Wy(1303, 1304)를 설정하는 것이 바람직하다(스텝 (c11)).

그리고, 네 모서리 각각에 대하여, 이들 적어도 2개의 윤곽점 검출용 윈도우 Wx(1301, 1302)를 조로 만들어, 상기 조에서의 복수의 윤곽 기준점 a에 대한 근사 직선을 구함과 함께, 적어도 2개의 윤곽점 검출용 윈도우 Wy(1303,1304)를 조로 하여, 상기 조에서의 복수의 윤곽 기준점 a에 대한 근사 직선을 구한다(스텝 (c12)). 이와 같이 하여 얻어진 2개의 근사 직선의 교점을 구하고, 상기 교점을 기준점 A로 한다(스텝 (c13)).

이와 같이 함으로써, 칩이 비스듬하게 고정된 경우에도 고정밀도로 기준점 A를 검출하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명에서는, 반드시 네 모서리에서 기준점 A를 구할 필요가 없이, 세 모서리에서 기준점 A를 산출할 수도 있다.

또한, 상기한 바와 같이 기준점 A를 검출하는 경우, 검출부에 흠집이나 먼지 등이 있으면 측정 오차가 발생한다. 그 때문에, 기판의 네 모서리의 각에 상당하는 4개의 기준점 A를 검출하여도, 이들 4개의 기준점 A를 연결하여 형성되는 형상이 평행사변형(직사각형·정사각형을 포함함)이 아닌, 사다리꼴 등의 사각형이 되는 경우가 있다. 그러나, 그 후 처리 Step 5에 있어서의 전단 변형 왜곡의 보정은, 검출한 기준점에서 형성되는 형태가 평행사변형인 것이 전제이고, 그 때문에 상기한 바와 같은 경우에는 스폿을 제대로 얼라인먼트할 수 없을 우려가 있다.

따라서 본 발명에서는, 도 14에 도시한 바와 같이, 일단 검출한 4개의 기준점 A 600 내지 603으로 형성되는 사각형이 평행사변형(직사각형 및 정사각형을 포함함)이 아닌 경우에는, 평행사변형에 근사하고, 근사한 평행사변형의 정점을 다시 기준점 A 700 내지 703으로 다시 설정하는 것이 바람직하다.

최초로 검출된 4개의 기준점 A 600 내지 603으로 형성되는 사각형을 평행사변형에 근사함에 있어서는, 예를 들면 대변이 되는 2개의 선분 (1401과 1402)의 기울기의 평균과 선분 (1401과 1402) 각각의 중점을 구하고, 이들 중점을 통하면서 상기 평균 기울기를 갖는 2개의 직선을 구한다. 이를 별도의 2개의 선분에 대해서도 마찬가지로 행하여, 얻어진 4개의 직선의 교점을 평행사변형 근사 후의 기준점 A 700 내지 703으로서 다시 설정한다. 이에 따라, 일단 검출된 기준점에 측정 오차가 있는 경우에도, 고정밀도로 얼라인먼트를 행할 수 있다.

본 발명에서는, 이와 같이 하여 유전자의 발현에 기초하여 얻어진 형광 화상 데이터를 처리하여 원하는 수치 데이터를 취득하지만, 얻어지는 각종 수치 데이터는, 검체 내에서 구하는 유전자의 존재나, 어떤 유전자가 발현하고 있는지의 여부, 또는 어느 정도 발현하고 있는지를 해석할 때 등에 이용된다.

또한, 이상과 같은 DNA 칩의 해석에 있어서는, DNA 칩의 요철을 이용하여 화상의 보정, 얼라인먼트를 행한다. 그 때문에, 검체로부터 추출한 샘플 중에 포함되는 DNA 양이 적고 발광하는 스폿이 적은 화상, 게다가 주사 기구의 정밀도가 나쁜 판독 장치에 의해서 얻어진 화상에 대해서도, DNA 칩의 기판 위에 배치된 검출 영역의 위치 결정 처리를 고정밀도로 실행 가능해진다.

상기 실시 형태에서는, 마이크로어레이에 DNA가 스폿된 DNA 칩의 실시 형태를 설명했지만, 본 발명은 RNA, 단백질, 미소 표본, 저분자 화합물, 세포 등을 스폿한 칩에 대해서도 적용 가능하다.

예를 들면, 상기에서 설명한 요철 형상을 갖는 DNA 칩의 기판에 DNA 대신에 단백질(항체)을 고정화하고, 검체와의 반응의 유무나 정량화를 형광으로 검출하는 경우에도 동일한 방법을 사용할 수 있다. 시료 세포의 용해액에 존재하는 단백질을 Cy5, 컨트롤 세포 용해액에 존재하는 단백질을 Cy3으로 표지하여, 양자를 혼합하여 항체 어레이와 반응하는 경우나, 단백질을 형광 표지하는 대신에 비오틴 표지하여 항체 어레이에 결합한 후, 효소 표지 아비딘을 이용하여 시그널을 증감하는 수법 등이 있다. 이러한 경우에도, 본 발명에 의해 고정밀도로 얼라인먼트가 가능해져, 형광 강도의 각종 수치 데이터를 파일로서 출력 가능하다. RNA 어레이의 경우에도, 요철 형상을 갖는 기판 위에 고정화된 RNA와 형광 표지한 DNA나 RNA와의 혼성화를 형광으로 검출하는 경우에 본 수법을 사용할 수 있다. 미소 표본·세포 어레이에 있어서도, 요철 형상을 갖는 기판 위에 고정화된 미소 표본이나 세포와 형광 표지 검체(예를 들면 항체)의 결합 반응을 형광에 의해 검출할 때에, 본 발명을 적응하는 것이 가능하다.

1 DNA 칩
2 기판
3 스폿
4 스캐너
5 스캐너 제어용 PC
6 화상 서버
7 해석용 PC
8 DNA 칩 화상 파일
9 해석 정의 파일
10 수치화 데이터 파일
501 레이저 광원(Cy5용)
502 레이저 광원(Cy3용)
503 구멍뚫린 미러
504 대물렌즈
505 형광 분자로부터의 형광
506 기판 표면에서 반사 및/또는 산란한 레이저광
507 여기광 차단 필터(Cy3용)
508 여기광 차단 필터(Cy5용)
509 결상 렌즈
510 핀홀
511 검출기
512 미러
513 미러
600 내지 603 일단 검출된 기준점 A
700 내지 703 평행사변형에 근사 후의 기준점 A
1101 얼라인먼트 화상의 기준점
1102 계산된 스폿 프레임
1301, 1302 윤곽점 검출용 윈도우 Wx
1303, 1304 윤곽점 검출용 윈도우 Wy
1401 내지 1402 선분