서브트랙티브 접촉 프린팅 백그라운드를 사용하여 바이러스들과 같은 미생물들을 스크리닝하고 어레이하는 방법들

서브트랙티브 접촉 프린팅 백그라운드를 사용하여 바이러스들과 같은 미생물들을 스크리닝하고 어레이하는 방법들{METHODS FOR SCREENING AND ARRAYING MICROORGANISMS SUCH AS VIRUSES USING SUBTRACTIVE CONTACT PRINTING BACKGROUND}

본 발명은 생물학적 라이브러리 스크리닝(biological library screening)과 관련되고, 특히 서브트랙티브 접촉 프린팅(subtractive contact printing)을 사용하여 어레이에서 바이러스들을 스크리닝하고 정렬하는 방법들과 관련된다.

크고 랜덤한 생물학적 라이브러리를 준비함으로써, 펩티드들(peptides), 약물들(drugs), 효소들(enzymes), 촉매들(catalysts), 기능성 유기 재료들(functional organic materials) 및 생물학적 수용체들(biological receptors)을 위한 리간드들(ligands)과 같은 흥미로운 분자들을 합성하는 것에 상당한 관심이 기울여지고 있다. 이러한 라이브러리들은 흔히 미생물들을 사용하는 것에 기초한다. 각각의 미생물은 한 유형의 분자를 합성한다. 그리고, 수많은 미생물들을 포함하는 라이브러리들을 채용함으로써 큰 화학적 다양성이 달성된다. 라이브러리들을 준비하기 위해 가장 많이 사용되는 미생물들은 효모(yeast)와 박테리오파지들(bacteriophages)이다. 특히 박테리오파지들(이는 파지들(phages)로도 일컬어짐)의 경우, 관심대상 분자(molecule of interest)는 파지의 표면에서 보여질 수 있다. 상기 파지 내에는 보여지는 그 관심대상 분자, 즉 보여지는 단백질(protein)을 위해 인코딩하는 올리고뉴클레오티드 시퀀스(oligonucleotide sequence)(유전자(gene))가 존재한다. 이는 박테리오파지들이 라이브러리들을 준비하고 스크리닝하는데에 매우 편리한 수단이 되도록 한다. 왜냐하면, 상기 관심대상 분자와 타겟(target) 사이에서 인터랙션(interaction)이 발견되는 경우, 그 분자의 구조는 그것을 인코딩하는 유전자의 배열 순서를 밝힘(sequencing)으로써 해독(decipher)될 수 있기 때문이다. 그러나 불행히도, 라이브러리에서 특정 관심대상 분자를 스크리닝하는 것은 매우 어렵다. 예를 들어, 특정 유형의 파지에 대해 스크리닝하도록 현재 채용되는 한 가지 방법은 마이크로타이터 플레이트 웰(microtiter plate well) - 이는 특정 유형의 파지에 부착될 수 있는 수용체(receptor)로 덮혀 있음 - 에 파지 라이브러리를 추가하는 것을 수반한다. 상기 파지들의 일부가 상기 수용 체를 바인딩(binding)하도록 허용한 후, 특정하여(specifically) 또는 불특정하여(non-specifically), 바인딩되지 않은 파지들(unbound phages)은 세정(washing)에 의해 제거될 수 있다. 상기 바인딩된 파지들(bound phages)은 그것들의 수(numbers)를 증가시키기 위해 복원(recover)되고 복제(copy)될 수 있다. 앞서 언급한 선택 방법은 유전적 시퀀스들(genetic sequences)이 일치(consensus)를 보일 때까지 반복될 수 있다. 몇 가지 스크리닝 라운드들(rounds)이 요구될 수 있다. 왜냐하면 라이브러리는 각각이 고유의 라이브러리 엘리먼트를 표현하는 수 십억 개의 서로 다른 파지들을 포함할 수 있기 때문이다.

생물학적으로 영감을 얻을 수 있는(inspired) 접근법들이 라이브러리에서 바이러스들의 스크리닝을 개선하기 위해 개발되어 왔다. 이들 접근법들은, 화학적 연결자들(chemical linkers), 핵산 교배(nucleic acid hybridization), 또는 금속 이온들을 사용하여 어레이 내에서 박테리오파지들과 같은 바이러스들(즉, 박테리아를 감염시키는 바이러스들)의 자기 조립(self-assembly) 또는 유도 조립(directed assembly)을 제공한다. 특히, 사상(filamentous) M13 박테리오파지 바이러스는 생물학적 무기 재료들(예를 들어, 금속성, 자성(magnetic), 및 반도전성을 포함함)을 자기 조립되고 유전적으로 변경가능한 구조 내에 편입시키기 위한 엄청난 용량을 보여 왔다. M13 박테리오파지들의 매크로 조직(macroscopic organization)은 액정상 분리 현상들(liquid crystalline phase separation phenomena) 및 바이러스-멤브레인 복합체들(virus-membrane complexes)을 사용하고, 높은 균일성(uniformity) 및 엘리먼트 밀도(element density)의 재료들을 생성함으로써 달성되어 왔다.

그러나 불행히도, 현재의 자기 조립 및 유도 조립 방법들은 흔히 상기 접근법의 특수성(specificity)과 일반성(generality) 사이를 트레이드 오프하는 것에 직면한다. 그러나, 샘플 준비 및 처리 동안 항체 활동의 총 손실(gross loss)로 인해, 매우 특정된 항체 인터랙션들의 사용은 비교적 연구되지 않은 상태로 남겨져 왔다. 마이크로접촉 프린팅(microcontact printing)을 포함하는 소프트 리소그래픽 방법들(soft lithographic methods)은 항체들의 생체 분자 활동들을 유지함에 있어서 성공적이었지만, 상기 항체들의 프린팅에 사용되는 탄성중합체 재료들(elastomeric materials)의 기계적 특성들로 인해 피쳐(feature) 크기 및 피치가 제한된다.

상술한 종래 기술의 단점들은 서브트랙티브 접촉 프린팅을 사용하여 어레이에서 바이러스들과 같은 미생물들을 스크리닝하고 정렬하는 방법들을 제공함으로써 극복되고, 또한 이러한 방법들에 의해 추가의 이점들도 제공된다. 일 실시예에서, 미생물들을 위한 수용체들(receptors)의 어레이를 형성하는 방법은, 제1 기질(substrate) 상에 템플릿(template)을 형성하기 위해 상기 제1 기질 상에 구조들의 어레이를 패턴하는 단계; 제2 기질의 표면(face)에 수용체 재료(receptor material)를 도포(apply)하는 단계; 및 상기 수용체 재료의 일부를 상기 제2 기질로부터 제거하기 위해 상기 제2 기질의 표면을 상기 템플릿과 접촉시키는 단계 - 이에 따라 상기 제2 기질 상에 수용체들의 어레이를 형성함 - 를 포함한다.

본 발명의 추가 특징들 및 이점들은 본 발명의 기술들을 통해 실현된다. 본 발명의 다른 실시예들 및 측면들이 본 명세서에서 기술되는데, 이는 청구되는 발명의 일부로 고려된다. 발명의 이점들 및 특징들에 대해 더 잘 이해하기 위해, 이하의 설명 및 도면들을 참조할 수 있다.

본 발명의 주제는 명세서의 결론 부분에 있는 청구항들에서 구체적으로 언급되고 분명하게 청구된다. 본 발명의 전술한 목적들, 특징들 및 이점들, 또는 기타 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부되는 도면들과 함께 이하의 상세한 설명을 읽는 경우 분명해질 것이다.
도 1-5는 특정 바이러스들이 스크린될 수 있도록 어레이에서 바이러스들을 정렬하기 위해 서브트랙티브 접촉 프린팅이 사용되는 방법의 일 예를 보여준다.
도 6은 여기에 기술되는 방법을 사용하여 생성되는 파지 어레이의 AFM(atomic force microscopy) 이미지를 보여준다.
상세한 설명은 도면들을 참조하여 본 발명의 이점들 및 특징들과 함께 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 단지 예로서 제공되는 것이다.

이제 도면들을 참조하여, 본 발명에 관해 설명하도록 한다. 도 1-5는 서브스트랙티브 접촉 프린팅을 사용하여 박테리오파지들과 같은 바이러스들을 스크리닝하는 방법의 일 실시예를 보여준다. 이 방법은 바이러스들의 라이브러리 내에 존재하는 특정 바이러스들을 캡쳐할 수 있는 나노스케일 단백질 수용체들의 밀집되어 팩된(densely packed) 어레이를 패턴하기 위해 사용될 수 있다. 상기 수용체들에 대한 상기 바이러스들의 바인딩 조건들(conditions)은, 불특정(non-specific) 바인등을 방지하기 위해, 상기 바이러스들의 집합(aggregation) 및 손상을 방지하기 위해, 그리고 하나 정도로 낮게 이르기까지 각각의 단백질 수용체를 바인딩하는 바이러스들의 수를 감소시키기 위해, 제어될 수 있다. 이와 같이, 많은 수의 바이러스들은 매우 큰 라이브러리로부터 비교적 짧은 시구간에 스크리닝될 수 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 상기 스크리닝 방법은 구조들(12)의 어레이를 포함하는 서브트랙티브 접촉 프린팅을 위한 템플릿(10)을 형성하기 위해, 먼저 기질을 패턴하는 것을 수반한다. 예를 들어, 상기 기질은 실리콘 기반의 기질이다. 구조들(12)은 상기 기질의 선택된 부분들 상에 레지스트(resist)를 패턴하기 위해 리소그래피 기술을 사용함으로써, 그런 다음 상기 패턴된 레지스트에 의해 보호되지 않은 기질의 부분들을 제거하기 위해 식각 기술(예를 들어, 반응성 이온 식각(reactive ion etching))을 사용함으로써 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 레지스트의 고 해상(high-resolution) 패터닝을 달성하기 위해 전자-빔 리소그래피가 사용된다. 그런 다음, 그 결과의 템플릿(10)은 산소-함유 플라즈마로 처리함으로써 세정(clean)될 수 있다.

도 2에 도시된 바와 같이, 여기에 기술되는 방법은 또한 스탬프(14)로 사용하기 위해 실질적으로 평면 표면(planar face)을 갖는 기질을 획득하는 것 그리고 스탬프(14)의 평면 표면에 수용체 재료(16)를 도포하는 것을 수반한다. 스탬프(14)는 그것이 접촉된 상태로 배치된 표면들의 모양(coutours)을 따르도록 하기 위해 충분한 양의 기계적 변형성(deformability)을 갖는 재료를 포함할 수 있다. 스탬프(14)로 사용하기에 적합한 재료들의 예들에는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)과 같은 탄성중합체들(elastomer)이 포함되나, 이러한 예들로 한정되는 것은 아니다. 일반적인 탄성중합체들은 그것들의 양호한 기계적 변형성으로 인해 본 목적을 달성하기 위해 사용될 수 있는데, 이러한 양호한 기계적 변형성은 그것들이 접촉하게 되는 표면들의 모양들(coutours)을 따르도록 할 수 있다. 탄성중합체들의 특정 예들은 써모플라스틱 탄성중합체들(thermoplastic elastomers)인데, 이 써모플라스틱 탄성중합체들에는 스티레닝 블록 코폴리머들(styrenic block copolymers), 폴리올레핀(polyolefin) 기반의 탄성중합체들, 폴리아미드들(oplyamides), 폴리우레탄들(polyurethanes), 및 코폴리에스테르들(copolyesters) 등이 있다. 또한 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리이소프렌(polyisoprene), 폴리이소부틸렌(polyisobutylene), 및 플루오르화된(fluorinated) 실리콘 탄성중합체들과 같은 유사 고무 탄성중합체들(rubber-like elastomers)이 사용될 수 있다. 스탬프(14)의 표면은 이상적으로는 그것의 표면 상에 단백질들이 용액으로부터 침착(deposit)될 수 있도록 하기 위해 소수성(hydrophobic)이다. 이 경우, 단백질들의 침착은 자발적이고 스스로 제한하는 방식(self-limiting)인데, 이는 스탬프(14)의 잉킹(inking)이 매우 간단하도록 하여, 완충액(buffer solution)에 용해된 단백질들로 그것의 표면을 간단히 덮음으로써 수행되도록 한다. 스탬프(14)는 또한 산소 플라즈마 또는 자외선 방사 및 오존을 사용하여 처리되어 그것의 표면을 산화시킬 수 있다. 이 산화력이 있는 처리(oxidative treatment)는 스탬프(14)의 표면이 더 친수성(hydrophilic)이 되도록 하고 또한 그 상에 극성(polar), 대전된(charged), 및/또는 친수성 수용체 재료를 침착시키기 위해 사용될 수 있다.

이 실시예는 대부분 단백질 수용체들의 예로 기술되지만, 많은 다른 유형의 수용체 재료들도 또한 사용될 수 있다. 적절한 수용체 재료들의 예들에는, 단백질, 생체 분자(biomolecule), 또는 화학물질 - 미생물(예를 들어, 스크리닝될 바이러스)은 이것들에 대해 바인딩할 수 있음 - 이 포함되나, 이러한 예들로 한정되는 것은 아니다. 수용체 재료들의 특정 예들은, 단백질, 항체, 항체 단편(antibody fragment), 단백질 수용체, 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA), 설탕, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 및 몇몇 올리고뉴클레오티드들로 형성된 복합체(complex) 등이다. 수용체 재료(16)의 도포(application)는, 예를 들어, 배양 접시(Petri dish)에 똑바로(face-up) 스탬프(14)를 배치함으로써, 그리고 상기 수용체 재료의 용액으로 그것을 덮음으로써 달성될 수 있다. 이 단계, 즉 잉킹 단계 동안, 상기 용액에 포함된 수용체들 중 일부는 스탬프(14) 상에 침착된다. 스탬프(14) 상에 침착되는 수용체의 양은 수용체 재료(16)와 스탬프(14) 사이의 친화력(affinity), 상기 잉킹 단계의 지속시간, 상기 잉킹 용액에서 상기 수용체 재료의 농도, 사용되는 용액의 유형, 및 스탬프(14)가 린스(rinse)되는 방법에 의존한다. 단백질 수용체들(16)이 스탬프(14) 상에 잉킹되는 경우, 상기 잉킹 용액 내의 수용체 농도는, 예를 들어, 약 1㎍/mL(마이크로그램/밀리미터) 내지 약 1mg/mL(밀리그램/밀리미터)일 수 있다. 잉킹은 4℃ 또는 상온에서 하룻밤동안(overnight) 또는 20분 내에서 상온(room temperature)에서 수행될 수 있다. 특정 잉킹 조건들에 대해 침착되는 수용체 재료의 양은 기질(14)로부터 평면 표면으로 전달(transfer)된(프린팅에 의해) 수용체 재료(예를 들어, 실리콘 웨이퍼의 네이티브 산화물(native oxide))의 조성물(composition) 및 그 두께를 측정함에 의해 간접적으로 결정될 수 있다. 상기 프린트된 수용체 재료의 양을 특징짓기 위해, X-선 광전자방출 스펙트로스코피 및 엘립소미트리(ellipsometry)가 사용될 수 있다. 잉킹 및 린싱(rinsing) 후, 스탬프(14)는 그것이 액체막(liquid film)에 의해 덮히는 것을 방지하기 위해 질소의 흐름 하에서 건조될 수 있다. 만약 이렇게 되지 않는다면, 이러한 액체의 막은 수용체 재료(16)가 구조들(12)의 어레이에 전달되는 것을 방해한다.

스탬프(14)의 표면에 수용체 재료(16)를 도포하는 것에 이어서, 구조들(12)의 어레이를 포함하는 템플릿(10)은 도 2에 도시된 바와 같이 스탬프(14)의 표면과 접촉될 수 있다. 화살표(18)로 표시한 바와 같이, 수용체 재료(16)가 구조들(12)과의 친밀하게 접촉하도록 하기 위해 스탬프(14)의 뒷면(back)에 작은 압력이 가해질 수 있다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 수용체들(20)의 어레이는 스탬프(14)의 표면(face) 상에 남아 있는 반면, 수용체 재료(22)의 서브트랙트된(subtracted) 부분은 구조들(12)의 상측 표면들 상에 침착(deposit)된다. 그런 다음, 스탬프(14)는 타겟 기질(30)에 수용체들(20)의 어레이를 전달하기 위해 타겟 기질(30)에 적용될 수 있다. 예를 들어, 타겟 기질(30)은 글래스 슬라이드(glass slide), 네이티브 실리콘 이산화물(산화물) 또는 이보다 더 두꺼운 층의 산화물로 덮힌 실리콘 웨이퍼, 또는 이러한 웨이퍼의 일부분일 수 있다. 최종 어레이는 도 4에 도시되어 있다.

앞서 서술한 방법들은 상기 수용체 재료를 타겟 기질에 전달하기 위해 서브트랙티브 접촉 프린팅과 결부된 피쳐리스 탄성중합체(featureless elastomer)을 채용하므로, 수용체들의 어레이의 피치 및 피쳐 크기는 상기 탄성중합체의 기계적 특성들에 의해 영향을 받지 않는다. 이와 같이, 상기 단백질 수용체들의 평균 측면 크기는 1,000 나노미터(nm, "나노스케일" 크기)보다 더 작게 감소될 수 있고, 상기 단백질 수용체들의 피치는 10 마이크로미터(㎛)보다 더 작게 감소될 수 있다.

바이러스들의 라이브러리로부터 특정 바이러스들을 분리하고 스크리닝하기 위해, 기질(30)은 바이러스들을 포함하는 용액에 배치될 수 있고 또한 특정 바이러스들이 수용체들(20)의 어레이에 대해 바인딩할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 배양(incubate)될 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스들은 M13 박테리오파지들(파지들)과 같은 박테리오파지들일 수 있다. 상기 수용체 영역의 바깥에는 기질(30) 상에 침착되는 바이러스들은 적거나 거의 없을 수 있다. 수용체들(20)의 어레이에 대한 상기 바이러스들의 일부분의 이러한 바인딩의 결과로서, 바이러스들의 어레이는 기질(30) 상에 형성된다. 수용체들(20)의 어레이로 전달된 그러한 바이러스들을 캡쳐하기 위해, 상기 표면-바인딩된 바이러스들은 용리법(elution method) 또는 마이크로유체 프로브(microfluidic probe)를 사용하여 찾아내어질 수 있다. 마이크로유체 프로브는 두 개의 애퍼춰들(apertures)을 갖는 칩으로 구성되는 마이크로유체 디바이스이다. 상기 칩은 관심대상 표면에 인접하게 배치되고, 얇은 액체막은 상기 칩을 그 표면으로부터 분리시킨다. 하나의 애퍼춰를 사용하여 상기 칩을 그 표면으로부터 분리시키는 갭(gap)에 주입(inject)하고 가까이의 다른 애퍼춰를 사용하여 그 주입된 액체를 흡입(aspirate)함에 의해, 상기 주입된 액체는 상기 관심의 대상 표면 상에 한정(confine)된다. 마이크로유체 프로브 동작의 설계 및 모드는 정커(Juncker) 등의 Nature Materials , vol.4, p. 628(2005)에 상세히 기술되는데, 이는 참조로써 본 명세서 내에 편입된다. 마이크로유체 프로브는 용리액(eultion liquid), 단백질 수용체를 포함하는 액체, 상기 바이러스들에 부착될 수 있는 리간드(ligand)를 포함하는 액체, 또는 전술한 액체들 중 적어도 하나를 포함하는 조합된 것을 상기 기질에 전달하기 위해 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 전달된 단백질 수용체들에 대해 바인딩되는 바이러스들은 상기 전달된 바이러스들 상의 단백질 코팅(M13 파지들을 위한 pVIII)에 대해 바인딩할 수 있는 형광으로 라벨된 수용체(fluorescently labeled receptor)를 사용하여 모두 평행하게 염색(stain)될 수 있다. 형광 마이크로스코프를 사용하여 상기 기질로부터 형광 신호들을 검출하는 것은 바이러스들이 단백질 수용체들에 의해 성공적으로 바인딩된 장소를 밝혀낸다. 그런 다음, 상기 마이크로유체 프로브는 계속되는 증폭 및 분석을 위해 상기 바이러스를 용리(elute)하도록 국부적(locally)으로 사용될 수 있다. 이와는 다르게, 상기 마이크로유체 프로브는 형광으로 라벨된 수용체를 포함하는 액체를 항체와 같은 상기 기질로 국부적으로 전달할 수 있다. 이 경우, 상기 마이크로유체 프로브는 기질의 표면 상에 바이러스들을 염색하기 위해 그리고 상기 바이러스들을 용리하기 위해 사용될 수 있다.

생물학적 시스템들의 복잡함은 pH, 이온 원자가(ionic valency) 및 세기, 및 농도에 대해 큰 상호의존성을 생성하는데, 이는 표면들 상에 그것들의 고정화(immobilization)을 통제하는 원동력들(driving forces)을 복잡하게 만든다. M13 파지 용액들은 그것들의 형광 구조(880nm x 60nm) 및 상기 바이러스의 큰 음의 표면 전하 밀도(surface charge density, SCD, σ)(σ _M13 = 1e ^- /256A ² , 반면 σ _DNA = 1e ^- /106A ² )로 인해 소수 용액(minor solution) 변화들 하에서 래디컬(radical)한 물리적 변형들을 겪을 수 있다. 매크로 피쳐들(2㎛ x 2㎛)을 갖는 항체 패턴들에 M13 파지를 바인딩하기 위한 용액 조건들은 이들 효과들을 피쳐 크기들의 영향을 연구하는 것으로부터 분리시키는데에 최적화될 수 있다. 상기 M13 파지의 표면 전하 밀도는 pH의 함수이고, 7 및 이보다 더 높은 값들에 대해 최대이다. 파지 바인딩 동안 큰 음의 SCD를 유지하는 것은, 실리콘도 또한 이들 조건들하에서 음의 SCD를 가지므로(1e ^- /2381 A ² ), 파지-파지 및 파지-실리콘 정전 반발(electrostatic repulsion)을 증가시킴으로써 멀티-사이트 점유(occupancy) 및 불특정 백그라운드 바인딩을 최소화시킬 수 있다. 50 퍼센트로 완충된 파지 용액들의 이온 세기의 감소는 전하 스크리닝 효과들을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 바인딩 조건들의 최적화는 결국 상기 기질에 대한 최소의 불특정 백그라운드 바인딩을 갖는 패턴된 항체의 완전한 커버리지를 초래할 수 있다. 상기 파지와 상기 기질 사이에 반발 정전 인터랙션이 존재하는 경우 어떠한 표면 패시베이션(passivation)도 요구되지 않는다.

단일 엘리먼트 어레이들이 형성될 수 있는데, 이 단일 엘리먼트 어레이들에는 도 5에 도시된 바와 같이, 수용체 사이트들(20)의 다수(majority)가 단일 파지(40)에 의해 점유된다는 것이 예상치 않게 발견되었다. 특히, 단일 엘리먼트 어레이들은 항체 피쳐 크기와 바인딩 동역학(binding kinetics)을 제어함에 의해 달성될 수 있다. 상기 파지 용액 농도를 감소시키는 것은 단일 엘리먼트 사이트 점유를 정적으로 달성하기 위해 사용될 수 있지만, 이 감소는 상기 캡쳐 항체의 바인딩 친화력에 의해 제한된다. 사이트 점유 및 패턴 커버리지에서의 증가를 갖는, 개별적이고, 잘 분리된 파지를 생성하기 위해, 약 10 ⁷ 내지 약 10 ⁹ 플락(plaque) 형성 유닛들/밀리미터(plaque forming units/milliliter, pfu/mL)의 파지 농도를 갖는 파지 용액이 사용될 수 있다. 약 10 ⁹ pfu/mL보다 높은 농도들에 대해, 바인딩 통계들에서 극적인 변화들은 상기 파지 용액에서 큰 국부적 이질성들(inhomogeneities)을 암시한다. 10 ¹⁰ 내지 10 ¹¹ pfu/mL 범위의 매우 높은 농도들에서, 상기 물리적 인터랙션들에서의 변화들은 별과 유사한 패턴들의 생성 및 파지 번들링(phage bundling)을 초래한다.

상기 박테리오파지 단백질 코트와 패턴된 항체 사이의 인터랙션을 이해하는 것은 단일 사이트 점유를 달성하도록 도울 수 있다. 2㎛ x 2㎛ 매크로 패턴들 상에서, 두 개의 박테리오파지 바인딩 형태들이 존재하는데, 이 바인딩 형태들 내에는 상기 단백질 코트의 완전한 고정화 또는 상기 피쳐 에지에 대한 국부화가 발생한다. 예상치 않게, 약 625nm 아래의 항체 수용체들의 평균 측면 크기(또는 피쳐 크기)를 감소시키는 것은, M13 파지(흔히 보고된 값은 2.2㎛로, 최근의 보고는 1.2㎛의 더 짧은 길이를 제안함)의 지속(persistence) 길이 및 물리적 크기에 기초하여, 대부분 에지-바인딩 체제(edge-binding regime)를 촉진시킨다는 것이 또한 발견되었다. 즉. 상기 바인딩은 수용체 사이트들의 에지들에서 주로 발생하는 것으로 보인다. 이론에 의해 제한될 의도없이, 상기 항체 피쳐를 벗어난 파지의 확장은 상기 반발 정전 파지-실리콘 인터랙션을 증가시키키고, 상기 단백질 코트의 다수를 용액 내로 드라이브(drive)하는 것으로 알려진다. 240nm x 240nm의 평균 측면 크기들을 갖는 항체 패턴들이 10 ⁹ pfu/mL의 파지 용액으로 배양되는 경우, 상기 항체 사이트들의 다수는 둘 또는 그 이상의 파지들로 점유된다. 상기 항체 패턴들의 평균 측면 크기들을 200nm x 200nm로 감소시키는 것은 단일 파지, 높은 커버지리, 및 더 높은 정도의 재생산가능성(reproducibility)에 의해 점유되는 사이트들의 다수를 갖는 어레이들을 달성할 수 있다. 그러나, 둘 또는 그 이상의 파지들을 갖는 복수의 사이트들이 남는다. 상기 항체 피쳐 크기를 90nm x 90nm로 더 감소시키면 로우(low) 커버리지의 코스트(cost)로 완전한 단일 사이트 점유를 달성할 수 있다. 그러므로, 상기 항체 사이트들의 평균 측면 크기는, 약 60nm 내지 약 250nm, 더 구체적으로는 약 120nm 내지 약 200nm, 또는 더욱더 구체적으로는 약 140nm 내지 약 180nm의 바람직한 범위로 상기 기질 상에 패턴된다. 또한 상기 항체 사이트들 사이의 평균 피치는 약 5㎛ 내지 약 700nm, 더 구체적으로는 약 2㎛ 내지 약 600nm, 더욱더 구체적으로는 약 1.5㎛ 내지 약 500nm이다. 도 6은 여기에 기술되는 방법을 사용하여 200nm의 넓은 항체 사이트들 위에 생성된 파지 어레이의 AFM 이미지를 도시한다. 이들 농도들, 피치들, 및 치수들은 단일 파지 디스플레이 어레이를 위해서는 좋지만, 그것들은 다른 어플리케이션들을 위해서는 조정되어야 한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 더 큰 피치가 사용될 수 있는데, 이는 그 요구되는 파지 농도에서의 감소를 초래한다.

상기 M13의 파지의 높은 형상비(aspect ratio)는 유체 흐름(fluid flow)에서 정렬을 위해 충분히 큰 유체역학 계수(hydrodynamic coefficient)의 드래그(drag)를 제공한다. 상기 파지 코트의 다수(majority)가 나노스케일 피쳐들을 위한 용액 내에 있다고 가정하면, 유체 흐름은 상기 파지 어레이의 방향을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 파지 밀도에서의 네 겹의(four-fold) 증가는 2.5㎛ 내지 1.0㎛의 인터-피쳐(inter-feature) 피치를 감소시킴에 의해 달성될 수 있다. 상기 유체 흐름에서의 파지의 광범위한 벤딩(bending)은 강한 항체-단백질 바인딩을 암시하는 한편, 형광 시스템들의 지속 길이를 연구하는 가능한 수단들을 제안한다. 이러한 방법으로 정렬된 파지 어레이들은 나노와이어들과 같은 구조들의 제조를 위한 템플릿들로 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 파지 밀도를 증가시키고, 더 복잡한 아키텍쳐들의 생성을 위해 미리 제조된 구조에 정렬하는 것은 서브트랙티브 프린팅 및 흐름 정렬(flow alignment)의 조합을 사용하여 실현될 수 있다.

생물학적 시스템들을 기능적인, 어드레스가능한 어레이들 내에 조직하는 것은 마이크로-어레이 기술 및 바텁-업 나노-조립들을 포함하는 많은 기술적 어플리케이션들을 갖는다. 상기 기술적 어플리케이션들을 넘어서, 개별적인 생물학적 컴포넌트들의 어드레스가능한 어레이들은 공간 조직(spatial organization)과 셀룰러 시스템들에서 외부 자극들의 결과적인 기능 사이의 복잡한 관계들을 설명할 수 있는 가능성을 갖는다. 확산, 마이그레이션, 및 분화(differentiation)과 같은 매크로 활동들은 그 크기 및 조직이 나노스케일로 정의된 엘리먼트들과의 인터랙션들에 의존한다.

본 발명은 다음의 예들에 의해 더 설명된다. 그러나, 본 발명은 다음의 예들에 의해 한정되지 않는다.

예들(EXAMPLES)

나노템플릿들의 준비( Preparation of Nanotemplates )

고해상 나노템플릿들은 전자빔 리소그래피를 사용하여 생성되었다. 폴리 메틸 메타아크릴레이트(poly methyl methacrylate)(PMMA) 레지스트가 코팅된 실리콘 웨이퍼들은 독일 도르트문트의 Raith GmbH에 의해 제조된 e-라인 전자빔 리소그래피 시스템(전압 : 20 킬로볼트(kV), 애퍼춰 :10㎛, 빔 전류 : 20 피코암페어(pA))을 사용하여 노광된다. 상기 PMMA 레지스트는, 메틸 이소부틸 케톤(methyl isobutyl ketone, MIBK):이소프로판올의 용액을 1:3의 비율로 30초 동안, 그리고 1분 동안 이소프로판올에 침지(immerse)되고, N ₂ 의 흐름 하에 건조(blown dry under stream of N ₂ )되었다. PMMA 패턴은 밸런스된 프로세스에서 저 식각율(low-etch-rate) 반응성 이온 식각기(프랑스의 Alcatel Vacuum Technology France of Annecy에 의해 제조됨)를 사용하여 25초의 지속시간 동안 식각함으로써 상기 실리콘 기질 내로 전달된다. 상기 밸런스된 프로세스는 측벽들의 패시베이션을 위한 옥타플루오로시클로부탄(C ₄ F ₈ ) 및 상기 식각을 위한 전구체(precursor)로서 설퍼 헥사플루오라이드(SF ₆ )를 채용한다(프랑스의 Alcatel Vacuum Technology France, Annecy).

평면 탄성중합체들의 단백질 잉킹

미시건(Michigan), 미드랜드(Midland)의 Dow Corning으로부터 상업적으로 이용가능한 Sylgard ^® 184 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS) 탄성중합체들은 배양 접시들에서 적어도 24시간 동안 60℃에서 경화(cure)되었다. 배양 접시와 접촉되어 있는 각각의 탄성중합체의 측면(side)은 45분 동안 항체 용액의 약 100 마이크로리터(㎕)로 잉킹되었다. 항(anti)-fd 박테리오파지(MO, 세인트루이스의 시그마에 의해 판매된 B7786)는 PBS(phosphate buffered saline)(시그마에 의해 판매된 A7906)에서 0.1 밀리그램/밀리미터(mg/mL)의 농도로 사용되었다. 잉킹 후, 상기 탄성중합체들은 PBS 및 탈이온화된 물(deionized water)를 사용하여 린스되었고 약 30초 동안 N ₂ 의 흐름 하에서 건조되었다.

단백질들의 서브트랙션 및 프린팅

상기 서브트랙티브 프린팅 기술의 상세 내용들은 예를 들어 Coyer, SR, Gracia, AJ & Delamarche의 "E. Facile preparation of complex protein architectures with sub-100nm resolution on surfaces", Angew. Chem. Int. Ed, vol. 46, p. 1-5(2007)에서 이미 발행되었는데, 이는 본 명세서에 참조로 편입된다. 요컨대, 실리콘 기질들 및 나노템플릿들은 Florence, KY의 테크닉스 플라즈마 100-E에 의해 제조된 디바이스를 사용하여 60초 동안 200와트에서 산소 플라즈마로 처리함에 의해 세정되었다. 동질성으로 잉크된 탄성중합체들 상의 단백질들은, 상기 탄성중합체들을 15초 동안 상기 나노템플릿과 접촉하도록 하고, 뒤이어 손으로 릴리스함에 의해, 선택된 영역들에서 제거되었다. 상기 단백질 패턴들은 30초의 긴 프린팅 단계를 사용하여 상기 탄성중합체들로부터 상기 최종 기질으로 전달되었다. 상기 탄성중합체와 상기 나노템플릿/기질 사이의 친밀한 접촉은 손으로 상기 나노템플릿/기질 상에 상기 탄성중합체를 배치하고 핀셋들로 약한 압력을 가한 후에 발생한다. 나노템플릿들은 재사용 전에 산소 플라즈마로 처리하는 것을 반복함으로써 유기 재료에 관해서는 세정된다.

시각화( visualization )

AFM(Atomic force microscopy) 이미지들은 스위스의 Neuchatel의 나노센서들에 의해 판매된 174-191 킬로헤르츠(kHz) 실리콘 캔틸레버들(cantilevers)를 사용하여 탭핑 모드에서 동작되는 나노스코프 차원 3000(캘리포니아 산타 바바라의 디지털 인스트루먼츠에 의해 판매됨)을 사용하여 획득되었다. AFM 이미지들은 나노스코프 6.12r1 소프트웨어를 사용하여 평탄화(planarize), 표시(display), 및 분석되었다.

파지 준비

M13 박테리오파지 스톡(NEB)는 Barbas, CF, Burton, DR, Scott, JK의 Phage Display : A Laboratory Manual( Cold Spring Harbor Oaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001) - 이는 본 명세서 내에 참조로 편입됨 - 에 기술된 표준 파지 방법을 사용하여 호스트 박테리아 e.coli(ER2738 NEB)에서 증폭되었다. 요컨대, 파지 스톡(1 x 10 ¹² pfu/mL)은 박테리아의 밤샘 배양(overnight culture)의 1:100 희석에 추가되었고 5.5 시간 동안 37℃로 흔들어서 배양(incubate)되었다. 파지들은 원심분리(centrifugation)를 통해 박테리아로부터 분리되었고, 4℃에서 하룻밤동안 폴리에틸렌 글리콜/소듐 클로라이드 침전(precipitation), 그리고 뒤이어 원심분리에 의해 농축(concentrat)되었다. 그 결과의 파지의 투석(dialysis)은 과잉 염들(salts)을 제거하고 적절한 pH를 보장하기 위해 사용되었다.

샘플 준비

TBS(tris-buffered saline)의 용액 내에 파지 스톡의 5mL 그리고 0.1 중량 % Tween-20(시그마 올드리치(Sigma Aldrich)에 의해 판매됨)은 1 시간 동안 서브트랙티브 프린트된 기질들로 배양되었고, 뒤이어 TBST(TBS + Tween-20), TBS, 및 물(18.2 메가오옴의 전기 저항을 가짐)을 사용하여 조심스럽고(gentle) 철저한 세정이 이뤄지고, 압축된 질소로 건조하였다. 상기 샘플들은 AFM 분석에 앞서 하룻밤동안 진공 데시케이터(dessicator)에 배치되었다.

여기에 사용되는 바와 같이, "한", "일" 및 "하나" 라는 용어들은 참조되는 항목들 중 적어도 하나의 존재를 나타내는 것이지 수량의 한정을 나타내는 것은 아니다. 더욱이, 동일한 컴포넌트 또는 성질로 지시된 범위들은 그들 범위들에 대해 주어진 끝점들을 포함한다. 예를 들어, "약 5 중량 % 내지 약 20 중량 %"는 약 5 중량 % 내지 약 20 중량 %의 범위의 모든 중간 값들 및 끝점들을 포함한다. 명세서 전체에서 "일 실시예", "다른 실시예" 등등의 용어들은 그 실시예와 연관되어 기술되는 특정 요소(예를 들어, 피쳐, 구조, 및/또는 특성)이 여기에서 기술되는 적어도 하나의 실시예 내에 포함되고, 또한 다른 실시예들에는 존재하거나 존재하지 않을 수도 있음을 의미한다. 또한, 기술되는 요소들은 여러 실시예들에서 어떤 적절한 방법으로든 조합될 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다. 특별히 다른 것으로 정의되지 않는다면, 여기에 사용되는 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다.

본 발명에 대한 바람직한 실시예가 기술되었으나, 당해 기술 분야에서 숙련된 자들이라면, 현재 그리고 장래에, 다음의 청구항들의 범위 내에 들어오는 여러 가지 개선 및 향상을 이룰 수 있다. 이들 청구항들은 처음에 기술된 발명에 대한 적절한 보호를 유지하도록 해석되어야 할 것이다.