Monitoring of the hybridization reaction is capable of bio-chip, a device for monitoring the hybridization reaction on the biochip, hybridization method of monitoring on the biochip

本発明は、蛍光検出を通じたサンプル分析と混成化反応に対するリアルタイムモニタリングが可能に構成されたバイオチップ、蛍光検出を通じたサンプル分析のために混成化反応を行う間にバイオチップ上での混成化反応をリアルタイムモニタリングする装置、及び１つのバイオチップで蛍光検出を通じたサンプル分析とバイオチップ上での混成化反応に対するリアルタイムモニタリングを可能にする方法に関する。

バイオチップは、生物の酵素、蛋白質、抗体、ＤＮＡ、微生物、動植物細胞及び器官、神経細胞のような生体有機物を組み合わせて、まるで半導体チップのように小さなチップの形態に作った生体検査用素子である。 例えば、ＤＮＡチップは、ＤＮＡオリゴマーを固体基板上にマイクロアレイの形態に固定化させ、これを利用して多様なＤＮＡ基盤の検査を可能にする。 このようにバイオチップの基板上にあらかじめ固定された蛋白質や抗体、ＤＮＡオリゴマーなどをプローブと称する。 バイオチップにサンプルを流せば、特定プローブに対応する遺伝子や蛋白質のみが該当プローブに結合され、結合されない残りは、後処理過程で洗浄される。 したがって、バイオチップ内のどのプローブにサンプルが結合されているかを検査すれば、サンプルの生体情報が容易に分かる。 特に、最近ヒト遺伝子の全体塩基配列に関する研究が結実を結び、ＤＮＡチップを利用した遺伝子の機能に関する研究、遺伝子発現様相などの研究、先天性疾病に関する理解と治療方法の開発、新薬開発などについての関心が高まりつつある。

このようなバイオチップを利用した検査は、色々な長所を提供する。 例えば、小型の基板上に数百万個以上のプローブが集積されているために、極少量のサンプルでも非常に多様な検査が可能である。 また、数百万個の反応が１つのチャンバ内で同じ条件下で進むために、各プローブから得られたデータの直接的な比較が可能であり、検査結果に対する定量的な分析が可能である。 また、工程の自動化が可能であるという長所もある。

一方、バイオチップ内のどのプローブにサンプルが結合されているかを確認する方法として、多様な技術が提案されたが、そのうち、代表的なのは蛍光検出法である。 蛍光検出法の場合、励起光により励起されて特定色を放出する蛍光性質を帯びた蛍光物質をサンプルにあらかじめ結合させる。 このように操作されたサンプルをバイオチップに流した後、バイオチップに励起光を照明して得た蛍光イメージを分析することによって、サンプルがいかなるプローブに結合されているかを容易に確認することができる。 このような蛍光検出法は、非常に精密な検出が可能であって、高密度バイオチップの分析に好適に利用しうる。

しかし、蛍光検出法は、反応に参与していないサンプルが存在する場合には、残っているサンプルに結合された蛍光物質によって正確な分析が難しいという短所がある。 このような理由で、反応終了後に、サンプルが結合されたバイオチップを洗浄するなどの後処理を行う必要がある。 これにより、蛍光検出法によれば、バイオチップのプローブをサンプルに結合させる混成化反応に対するリアルタイムモニタリングに多くの制約がある。 したがって、蛍光検出法を使用する混成化分析において、混成化過程に対する色々な条件を制御しての混成化反応の最適化が難しく、混成化反応が完了したか否かが分りにくい。

このように、蛍光検出を用いた発明としては、下記特許文献１に記載されているようなものがある。

本発明は、蛍光検出を通じたサンプル分析と混成化反応に対するリアルタイムモニタリングとが可能に構成されたバイオチップを提供する。

また、本発明は、蛍光検出を通じたサンプル分析を行なえるように形成されたバイオチップ上で混成化反応に対するリアルタイムモニタリングを可能にする装置を提供する。

また、本発明は、１つのバイオチップで蛍光検出法による精密な分析を提供すると同時に、バイオチップ上での混成化反応に対するリアルタイムモニタリングを可能にする方法を提供する。

前記課題を解決するために本発明は、透明基板と、前記透明基板上に形成されたものであって、蛍光物質を有するサンプルに結合されて蛍光検出法によってサンプル分析に用いられる分析用プローブを有する第１プローブ領域と、前記透明基板上に形成されたものであって、ＳＰＲ−検出法によって混成化反応のモニタリングに用いられるモニタリング用プローブを有する第２プローブ領域と、前記第２プローブ領域と前記透明基板との間に介在された金属薄膜と、を含むバイオチップを提供する。

前記課題を解決するために本発明は、また、バイオチップと結合してバイオチップ上に混成化反応を起こすチャンバと、バイオチップで表面プラズモン共鳴を起こすようにバイオチップの下部に光を提供するためのプリズムと、バイオチップから反射された光を検出する光検出器と、前記光検出器からの信号によって混成化反応の進行程度を分析して混成化条件を制御するプロセッサーと、を含むバイオチップの混成化反応モニタリング装置を提供する。

前記課題を解決するために本発明は、また、第１プローブ領域と第２プローブ領域とが透明基板上に各々形成されており、前記第２プローブ領域と前記透明基板との間に金属薄膜が形成されているバイオチップを提供する段階と、前記バイオチップをチャンバに配置し、前記チャンバ内にサンプルを供給することによって、混成化反応を進行する段階と、チャンバ内で混成化反応が進行する間に、ＳＰＲ−検出法を通じて第２プローブ領域上での混成化反応の進行による光吸収入射角の変化を検出する段階と、光吸収入射角の変化に基づいてバイオチップ上での混成化反応の進行程度を分析する段階と、混成化反応が完結された後、第１プローブ領域上の混成化反応結果を蛍光検出法によって分析する段階と、を含むバイオチップ上の混成化モニタリング方法を提供する。

本発明によれば、蛍光検出を通じたサンプル分析と混成化反応に対するリアルタイムモニタリングとが可能になる。

また、バイオチップ上で混成化反応に対するリアルタイムモニタリングが可能になる。

さらに、１つのバイオチップで蛍光検出法による精密な分析を提供すると同時に、バイオチップ上での混成化反応に対するリアルタイムモニタリングが可能になる。

蛍光検出法とＳＰＲ−検出法とをいずれも実行可能にするための本発明のバイオチップの構造を例示的に示す図面である。

本発明の一実施形態によるバイオチップの第２プローブ領域についての部分的な断面図である。

本発明の一実施形態によるバイオチップの第２プローブ領域についての部分的な断面図である。

本発明の一実施形態によるバイオチップで透明基板と第２プローブ領域との構造的な関係を概略的に示す断面図である。

本発明の一実施形態によるバイオチップで透明基板と第２プローブ領域との構造的な関係を概略的に示す断面図である。

本発明の一実施形態によるバイオチップで透明基板と第２プローブ領域との構造的な関係を概略的に示す断面図である。

本発明の一実施形態によるバイオチップ表面での第１プローブ領域と第２プローブ領域との配置を示す図面である。

本発明の一実施形態によるバイオチップ表面での第１プローブ領域と第２プローブ領域との配置を示す図面である。

図１に示されたバイオチップを利用したＳＰＲ−検出法の原理を説明する断面図である。

本発明の一実施形態によるモニタリング用プローブが金属薄膜上に導入される前のＳＰＲ現象による吸収角度を示す図面である。

本発明の一実施形態によるモニタリング用プローブが金属薄膜上に導入された後のＳＰＲ現象による吸収角度を示す図面である。

本発明の一実施形態によるモニタリング用プローブにターゲットが結合された後のＳＰＲ現象による吸収角度を示す図面である。

本発明の一実施形態によるモニタリング用プローブが金属薄膜上に導入される前、モニタリング用プローブが金属薄膜上に導入された後、及びモニタリング用プローブにターゲットサンプルが結合された後のＳＰＲ現象による吸収角度の変化を比較して示す図面である。

本発明の一実施形態による混成化反応モニタリング装置の構成を例示的に示す図面である。

本発明の他の実施形態による混成化反応モニタリング装置の構成を例示的に示す図面である。

本発明の一実施形態によるバイオチップ上の混成化反応のモニタリング方法を説明するフローチャートである。

以下、添付された図面を参照して、本発明の一実施形態によるバイオチップ、混成化反応をリアルタイムでモニタリングしうる装置及び混成化反応に対するリアルタイムモニタリングを可能にする方法について詳細に説明する。

本実施形態によるバイオチップは、蛍光検出法によってサンプルを分析するための領域と表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）を利用した検出法（以下、ＳＰＲ−検出法）によって混成化反応をモニタリングするための領域を同時に有するように形成される。 ＳＰＲ−検出法は、一般的にリアルタイムモニタリングには有用であるが、蛍光検出法に比べて感度が低く、比較的広いセンシング面積を必要とする。 このような理由で、ＤＮＡチップの分析のような極微量のサンプル分析のための用途としてはＳＰＲ−検出法が広く使われている。 本実施形態において、精密なサンプル分析には蛍光検出法を適用し、混成化反応モニタリングにはＳＰＲ−検出法を適用するようにバイオチップが構成される。 これにより、蛍光検出法の長所を維持しつつも、リアルタイムで混成化反応をモニタリングしうる。

このために、バイオチップは、蛍光検出法によってサンプルを分析するための領域とＳＰＲ−検出法によって混成化反応をモニタリングするための領域とを同時に有するように形成される。 図１は、このような蛍光検出法とＳＰＲ−検出法とをいずれも実行可能にするためのバイオチップ１０の構造を例示的に図示している。 図１を参照すれば、バイオチップ１０は、透明基板１１を有し、透明基板１１上には第１プローブ領域１５と第２プローブ領域１６とが各々形成されている。 例えば、第１プローブ領域１５は、サンプル分析に用いられる分析用プローブ（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｅ）を有する領域でありうる。 そして、第１プローブ領域１５内の相対的に小さな第２プローブ領域１６は、混成化反応のモニタリングに用いられるモニタリング用プローブを有する領域でありうる。 したがって、第１プローブ領域１５は、蛍光検出法によって分析され、第２プローブ領域１６はＳＰＲ−検出法によってモニタリングされる。

図２Ａ及び図２Ｂは、このような第２プローブ領域１６についての断面を示している。 図２Ａを参照すれば、透明基板１１上に金属薄膜１２が形成されており、その上にモニタリング用プローブ１４が配される。 金属薄膜１２は、電子の集団的な振動により表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を起こすために提供される。 金属薄膜１２としては、例えば、金（ｇｏｌｄ）のような材料を使用しうる。 モニタリング用プローブ１４は、その材料によって金属薄膜１２上に直接は形成され難いこともある。 この場合、図２Ｂに示されたように、金属薄膜１２とモニタリング用プローブ１４との間に透明な誘電体層１７をさらに介在させうる。 透明誘電体層１７として、例えば、二酸化硅素（ＳｉＯ _２ ）、ダイアモンド、ガラス状カーボン（ｇｌａｓｓｙ ｃａｒｂｏｎ）などを使用しうる。 ここで、透明誘電体層１７の厚さは、ＳＰＲ−検出に影響を与えないように、可能な限り薄い方が良い。 例えば、透明誘電体層１７の厚さは、約１μｍまたはそれ以下（例えば、１Å）でありうる。

図３Ａないし図３Ｃは、本実施形態によるバイオチップ１０で透明基板１１と第２プローブ領域１６との構造を概略的に示す断面図である。 図３Ａに示されたように、第２プローブ領域１６は、透明基板１１の表面上に突設されうる。 また、図３Ｂ及び図３Ｃに示されたように、透明基板１１の表面に溝を形成し、その溝内に第２プローブ領域１６を配しても良い。 この際、図３Ｂに示されたように、透明基板１１の表面と第２プローブ領域１６の表面とを同じ高さに形成し、または図３Ｃに図示されたように、第２プローブ領域１６を透明基板１１の表面内側に配しても良い。 このような配置は、設計によって自由に選択されうる。

本実施形態によれば、このような第２プローブ領域１６は、ＳＰＲ−検出法によってセンシング可能に、少なくとも約１μｍ×１μｍ程度またはそれ以上の大きさ（例えば１ｍｍ×３ｍｍ）を有しうる。 例えば、第２プローブ領域１６は、図１に示されたように、第１プローブ領域１５内に位置しうる。 しかし、他の実施形態によっては、図４Ａ及び図４Ｂに示されたように、第１プローブ領域１５の外部に第２プローブ領域１６を配しても良い。 バイオチップの製作過程でフォトリソグラフィー工程を使用する場合、バイオチップ１０の透明基板１１の表面には、マスクの整列のために金属からなる整列マークが配されるが、このような整列マークを第２プローブ領域１６の金属薄膜１２として使用しても良い。 または、第２プローブ領域１６をバイオチップ１０のための整列マークとして使用しても良い。 このために、第２プローブ領域１６は、多様な形態のパターンに形成しても良い。

前述したように、第１プローブ領域１５上の分析用プローブは、蛍光検出法によってサンプルを分析するための一般的なプローブでありうる。 例えば、バイオチップ１０がＤＮＡチップである場合、分析用プローブはＤＮＡオリゴマーであって、サンプルは人間から採取したオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）でありうる。 一方、第２プローブ領域１６のモニタリング用プローブは、第１プローブ領域１５上のＤＮＡオリゴマーを代表するように選択されうる。 一般的に、第１プローブ領域１５には分析の正確度を高めるために、同じ塩基配列を有する多数のＤＮＡオリゴマーが集合をなしており、相異なる塩基配列を有する多数の集合がアレイをなしている。 第２プローブ領域１６には、例えば、このような集合から各々１つずつ選択されたＤＮＡオリゴマーが配されうる。 または、その代りに、第１プローブ領域１５上の平均的なＤＮＡオリゴマーを代表するように、特殊に塩基配列が操作されたＤＮＡオリゴマーをモニタリング用プローブとして使用しても良い。 また、図１には、多数の第２プローブ領域１６が示されているが、それぞれの第２プローブ領域１６はいずれも同じものであるか、またはそれぞれの第２プローブ領域１６ごとに異なるモニタリング用プローブが配されたものでもありうる。

また、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブに結合されるサンプルが第１プローブ領域１５上の分析用プローブに結合されるサンプルと異なることもある。 例えば、第１プローブ領域１５上の分析用プローブは、人間から採取したサンプルと結合するＤＮＡオリゴマーである一方、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブは、ＳＰＲ−検出のために提供された別途のモニタリング用サンプルにのみ結合するオリゴマーである場合もある。

このような第２プローブ領域１６のモニタリング用プローブは、バイオチップ１０の製作直前に分析用プローブと共に、バイオチップ１０に同時に導入されて固定されうる。 しかし、混成化反応進行時にモニタリング用プローブがバイオチップ１０に導入されることもある。 これは自己組立法（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）の原理を利用するものである。 例えば、金属薄膜１２が金からなる場合に、チオール（ｔｈｉｏｌ）のような配位子は自ら金の表面に結合されうる。 したがって、モニタリング用プローブの端部にチオールのような配位子を結合してバイオチップ１０に提供すれば、モニタリング用プローブが自己組立法の原理によって第２プローブ領域１６に自ら結合されうる。 自己組立法の原理によって結合されうる金属の種類と配位子の種類は、多様に公知にされているので、それについての詳細な説明は省略する。

図５は、ＳＰＲ−検出法の原理を説明する断面図である。 図５を参照して、ＳＰＲ−検出法によって第２プローブ領域１６での混成化反応がモニタリングされる原理を説明する。

まず、表面プラズモンとは、金属薄膜と誘電体との境界面に沿って進行する表面電磁気波の一種である。 表面プラズモン共鳴現象は、金属薄膜表面で発生する電子の集団的な振動により発生することが知られている。 表面プラズモン共鳴を起こすための光学的な方法としては、屈折率の異なる二媒質の境界面に金属薄膜を積層し、前記境界面に全反射角より大きい角で光を入射する方法がある。 この場合、全反射が起き、二媒質の境界面で屈折率の低い媒質方向に非常に短い有効距離を有する消滅波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｗａｖｅ）が発生する。 この際、金属薄膜の厚さは、このような消滅波の有効距離より小さくなければならない。 例えば、金属薄膜の厚さは、約５０ｎｍ以下であることが望ましい。

図５を参照すれば、バイオチップ１０の透明基板１１の上面で第２プローブ領域１６内には金属薄膜１２が蒸着されている。 そして、透明基板１１の下部にはプリズム２０が配される。 図５には、便宜上、第２プローブ領域１６にのみ対応するように、プリズム２０が配されたことが示されている。 しかし、実際には、バイオチップ１０の透明基板１１の全域に対して、１つのプリズム２０のみが配されうる。 金属薄膜１２上には、サンプル溶液１３が流れることが図示されている。 このような構成で、プリズム２０の光入射面２０ａを通じてバイオチップ１０に光を照射すれば、透明基板１１と金属薄膜１２との界面で全反射が起きる。 全反射された光は、プリズム２０の光出射面２０ｂを通じて出射され、前記光出射面２０ｂに対向して配された光検出器２５に進む。 この際、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象により金属薄膜１２の上部にある物質の屈折率によって特定の入射角度で光吸収が発生する。 これを表面プラズモンが励起されたという。

図６Ａないし図６Ｃは、このようなＳＰＲ現象により発生する入射角度による吸光度グラフを示す。 例えば、図６Ａは、金属薄膜１２上にモニタリング用プローブ１４が導入される前の状態に対するＳＰＲ現象による吸収角度を示し、図６Ｂは、金属薄膜１２上にモニタリング用プローブ１４が導入された後の状態を示し、図６Ｃは、モニタリング用プローブ１４にターゲットサンプル１８が結合された後の状態を示す。 図６Ａの上部に示されているように、金属薄膜１２上にモニタリング用プローブ１４が導入されず、サンプル溶液１３のみが流れる状態では、図６Ａの下部にあるグラフのように角度θ _１でＳＰＲ現象による吸光が発生する。 ここで、図６Ａのグラフの横軸は角度を、縦軸は反射率を示す。 一方、図６Ｂの上部に示されているように、金属薄膜１２上にモニタリング用プローブ１４が導入されれば、屈折率の増加によって、図６Ｂの下部にあるグラフのように光吸収角度がθ _２にシフトされる。 そして、図６Ｃの上部に示されているように、モニタリング用プローブ１４にターゲットサンプル１８が結合されれば屈折率がさらに増加し、図６Ｃの下部にあるグラフのように、光吸収角度がθ _３にさらにシフトされる。 一般的に、モニタリング用プローブ１４にターゲットサンプル１８が結合される時、屈折率の変化量は、結合されたターゲットサンプル１８の量に比例する。 したがって、前述した光吸収角度のシフト程度を観察すれば、バイオチップ１０上で混成化反応がどの程度進行したかが容易に分かり、混成化反応の進行程度が定量化されうる。

図７は、図６Ａないし図６Ｃに示された吸光度グラフを比較して図示している。 図７で、グラフＡは、金属薄膜１２上にモニタリング用プローブ１４が導入される前の状態についてのＳＰＲ現象による吸光度を示し、グラフＢは、金属薄膜１２上にモニタリング用プローブ１４が導入された後の状態であり、グラフＣは、モニタリング用プローブ１４にターゲットサンプル１８が結合された後の状態である。 図７のグラフに示されているように、金属薄膜１２上で屈折率が増加するほど、グラフが右にシフトされる。 したがって、プリズム２０を通じて金属薄膜１２への入射光の入射角を変化させつつ、吸光度が最も高い（すなわち、反射度の最も低い）角度（θ _１ 〜θ _３ ）を観察すれば、混成化反応の進行程度がリアルタイムで分かる。 また他の側面で見る時、金属薄膜１２上で屈折率が増加するほど、特定角度（θ）での反射度がＲ _１からＲ _３に変化する。 したがって、プリズム２０を通じて金属薄膜１２に入射する光の入射角を固定させた状態で反射度を観察することによって（すなわち、光検出器２５に入射する反射光の強度を測定することによって）、混成化反応の進行程度がリアルタイムで分かる。 このような方式で、モニタリング用プローブ１４に結合されるターゲットサンプル１８の量をリアルタイムで定量的に分析することができる。

図８は、前述したバイオチップ１０上に混成化反応を起こし、混成化反応をモニタリングするための装置１００の一実施形態を例示的に図示している。 図８を参照すれば、前記混成化反応モニタリング装置１００は、バイオチップ１０と結合してバイオチップ１０上に混成化反応を起こすチャンバ３０、ＳＰＲ−検出法のためにバイオチップ１０の下部に光を提供するためのプリズム２０、チャンバ３０内の温度を調節するための温度調節器３５、バイオチップ１０から反射された光を検出する光検出器２５、チャンバ３０に提供されるサンプルの流量を調節するための流量調節器５０、及び光検出器２５からの信号によって混成化反応の進行程度を分析して流量調節器５０を制御するプロセッサー４０を含む。 また、図８には図示されていないが、チャンバ３０内にサンプルを攪拌するための攪拌器（ａｇｉｔａｔｏｒ）がさらに配されうる。 同様に、図８には示されていないが、混成化終了時、バイオチップ１０を洗浄した後、洗浄されたバイオチップ１０を乾燥させる乾燥器がチャンバ３０内にさらに配されうる。

チャンバ３０には、サンプルが供給される流入口３１とサンプルが排出される排出口３２とが各々形成されている。 チャンバ３０はバイオチップ１０の上部に結合されるように構成されうる。 この場合、サンプルの流出を防止するために、チャンバ３０はバイオチップ１０の上部に密着されて密封される。 または、バイオチップ１０がチャンバ３０の内部に装着されるようにチャンバ３０を構成することもできる。 この場合、光がチャンバ３０の下部を通じて出入り可能に透明なウィンドウ（図示せず）がチャンバ３０の下部に設置されうる。 このような構造で流入口３１を通じてチャンバ３０の内部にサンプルが供給されれば、バイオチップ１０上の対応するプローブにサンプルが結合される混成化反応が起こる。 この際、プリズム２０を通じてバイオチップ１０の下部に光を照射し、バイオチップ１０の下部から反射された光を光検出器２５が検出してＳＰＲ−検出法によって混成化反応の進行程度をモニタリングする。

図８を参照して、図示された混成化反応モニタリング装置１００で混成化反応をモニタリングする方法を説明する。 流入口３１を通じてチャンバ３０内にサンプルが供給されれば、バイオチップ１０上の対応するプローブにサンプルが結合する混成化反応が起こる。 この際、プロセッサー４０は、流量調節器５０を制御してチャンバ３０に流入されるサンプルの量を調節しうる。 また、プロセッサー４０は、温度調節器３５を制御してチャンバ３０内の反応温度を調節しうる。

一実施形態で、サンプルは、第１プローブ領域１５上の分析用プローブと第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブとをいずれも結合しうる。 ここで、第１プローブ領域１５上の分析用プローブは、蛍光検出法によってサンプルを分析するための一般的なプローブでありうる。 例えば、バイオチップ１０がＤＮＡチップである場合、分析用プローブはＤＮＡオリゴマーであって、サンプルは人間から採取したオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）でありうる。

一方、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブは、第１プローブ領域１５上のＤＮＡオリゴマーを代表するように選択されうる。 一般的に、第１プローブ領域１５には、分析の正確度を高めるために同じ塩基配列を有する多数のＤＮＡオリゴマーが集合をなしており、相異なる塩基配列を有する多数の集合がアレイをなしている。 第２プローブ領域１６には、例えば、このような集合から各々１つずつ選択されたＤＮＡオリゴマーが配されうる。 または、その代りに、第１プローブ領域１５上の平均的なＤＮＡオリゴマーを代表するように特殊に塩基配列が操作されたＤＮＡオリゴマーをモニタリング用プローブとして使用しても良い。 また、図１には、多数の第２プローブ領域１６が図示されているが、それぞれの第２プローブ領域１６がいずれも同じものであるか、またはそれぞれの第２プローブ領域１６ごとに相異なるモニタリング用プローブが配されたものでありうる。

他の実施形態で、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブを結合するサンプルは第１プローブ領域１５上の分析用プローブに結合されるサンプルと異なりうる。 この場合、チャンバ３０の流入口３１を通じて互いに異なる二種のサンプル、すなわち、分析対象になる実際サンプルと混成化反応をモニタリングするためにモニタリング用プローブにのみ結合されるモニタリング用サンプルが同時にチャンバ３０の内部に供給される。 ここで、第１プローブ領域１５上の分析用プローブは、例えば、人間から採取したオリゴヌクレオチドサンプルと結合するＤＮＡオリゴマーでありうる。 一方、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブは、モニタリング用サンプルと結合する別途のオリゴマーでありうる。 この際、モニタリング用サンプルは、ＳＰＲ現象による吸光が発生する入射角の変化を大きくするように、分子量の大きな材料を使用しうる。 すなわち、分析対象となる実際サンプルより相対的に分子量の大きな材料をモニタリング用サンプルとして使用することによって、モニタリング用サンプルがモニタリング用プローブに結合される時、屈折率変化をさらに大きくする。 これにより、図７に示されたグラフのシフト程度が大きくなり、さらに精密なＳＰＲ−検出が可能となる。 例えば、このようなモニタリング用サンプルとして金（ｇｏｌｄ）からなるナノ粒子、蛋白質、ポリマーなどと結合されたオリゴマーを使用しうる。

このような方式で混成化反応が進行している間に、プリズム２０を通じてバイオチップ１０に光を照射すれば、光は、第２プローブ領域１６にある金属薄膜１２と透明基板１１との間の界面で全反射されて光検出器２５に入射する。 この際、前述したように、ＳＰＲ現象が発生し、混成化反応の進行程度によって吸光が発生する入射角が変化する。 このような変化は、光検出器２５に入射する光の強度を測定することによって感知しうる。 プロセッサー４０は、このように測定された結果をあらかじめ得られた実験データと比較することによって、混成化反応の進行程度をリアルタイムで、そして定量的に分析しうる。

このために、例えば、第２プローブ領域１６に配列されたモニタリング用プローブの種類別に、吸光が発生する角度の変化と混成化反応の進行程度との相関関係に対するデータを実験を通じてあらかじめ蓄積しうる。 例えば、プロセッサー４０は、マイクロプロセッサー、コンピュータ、中央処理装置のような装置でありうる。 蓄積されたデータは、例えば、プロセッサー４０のメモリに保存されうる。 プロセッサー４０は、このように蓄積された相関関係についてのデータを参照することによって、混成化反応の進行程度を正確に計算しうる。 このような原理によって、プロセッサー４０は、温度調節器３５及び流量調節器４０を制御して混成化条件を変更し、反応温度及びサンプルの流量のような混成化反応に関連した色々な条件を変更させることによって、最適の混成化条件を探すこともできる。 このように得た最適の混成化条件についての情報を利用して、混成化反応が完了するまでの所要時間を短縮させうる。 次いで、混成化反応が完了すれば、公知の通常の方法によって蛍光検出法を利用してサンプルを分析しうる。

前述した本実施形態の方法によれば、蛍光検出法でサンプルを分析してサンプル分析の感度を高く維持しつつ、同時に混成化反応の進行程度をリアルタイムでモニタリングしうる。 したがって、混成化が完了すれば、直ちに反応を終結させうるために、混成化にかかる時間を最小化しうる。 また、混成化反応の進行程度をリアルタイムで定量的にモニタリングすることができるので、混成化反応を所望のレベルまで進行させ、多様な反応条件を変化させて混成化反応を最適化することもできる。

図９は、他の混成化反応モニタリング装置１００'を示している。 図９は、互いに分離された２つのチャンバ３０ａ、３０ｂ内で同じであるか、または相異なるターゲットサンプルを用いて混成化反応を起こし、モニタリングする実施形態に関する。 すなわち、図８の混成化反応モニタリング装置１００と比較する時、図９に示された混成化反応モニタリング装置１００'は互いに独立した２つのチャンバ３０ａ、３０ｂを有するという点で差がある。 図９を参照すれば、バイオチップ１０の下部にＳＰＲ−検出法のためのプリズム２０が配される。 そして、プローブが結合されたバイオチップ１０の上部には、互いに分離された２つのチャンバ３０ａ、３０ｂが各々結合される。 それぞれのチャンバ３０ａ、３０ｂには、サンプルが供給される流入口３１ａ、３１ｂとサンプルが排出される排出口３２ａ、３２ｂとが各々形成されている。 この際、２つのチャンバ３０ａ、３０ｂは、バイオチップ１０の上部に各々結合されうる。 その代りに、１つのチャンバ内にバイオチップ１０を装着し、その内部に隔膜を設けて、２つのチャンバ３０ａ、３０ｂに分離させうる。 この場合、バイオチップ１０の上面には、第１チャンバ３０ａと第２チャンバ３０ｂとに各々対応するように別個のプローブ領域１５、１６が形成される。 例えば、バイオチップ１０上の第１プローブ領域１５は、第１チャンバ３０ａと対応すべく形成され、蛍光検出法によって実際サンプルを分析するための一般的な分析用プローブを有しうる。 そして、第２プローブ領域１６は、第２チャンバ３０ｂと対応するように形成され、ＳＰＲ−検出法によって混成化反応をモニタリングするためのモニタリング用プローブを有しうる。

また、バイオチップ１０は、１つのチャンバ内に形成されても、２つのチャンバ、すなわち、第１及び第２チャンバ３０ａ、３０ｂに分離するための分離層が設けられても良い。 そのような実施形態で、第１及び第２プローブ領域１５、１６は、バイオチップ１０の上面上で第１及び第２チャンバ３０ａ、３０ｂと各々対応するように形成される。 例えば、バイオチップ１０上の第１プローブ領域１５は、第１チャンバ３０ａと対応するように形成され、蛍光検出法によってサンプルを分析するための一般的な分析用プローブを有する。 また、第２プローブ領域１６は、第２チャンバ３０ｂと対応するように形成され、ＳＰＲ検出法によって混成化反応をモニタリングするためのモニタリング用プローブを有しうる。

このような構造で、第１チャンバ３０ａと第２チャンバ３０ｂにはいずれも同じサンプルが提供されうる。 例えば、サンプルは、人間から採取したオリゴヌクレオチドでありうる。 この場合、第１プローブ領域１５上の分析用プローブはＤＮＡオリゴマーでありうる。 そして、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブは、前記第１プローブ領域１５上のＤＮＡオリゴマーを代表するように選択されうる。 例えば、第２プローブ領域１６は、第１プローブ領域１５にあるＤＮＡオリゴマー集合から各々１つずつ選択されたＤＮＡオリゴマーを有しても、または第１プローブ領域１５上の平均的なＤＮＡオリゴマーを代表するように、特殊に塩基配列が操作されたＤＮＡオリゴマーを有しても良い。 本実施形態によれば、第１チャンバ３０ａと第２チャンバ３０ｂとでいずれも同じサンプルに対する混成化反応が起こるが、第２チャンバ３０ｂに対するＳＰＲ−検出を通じて第１チャンバ３０ａでの混成化反応の進行程度を類推しうる。

他の実施形態で、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブが第１プローブ領域１５上の分析用プローブと完全に同じものでありうる。 この場合、第１チャンバ３０ａでの混成化反応の進行程度をさらに正確に類推しうる。 また、混成化反応の完了後に、第２プローブ領域１６も蛍光検出法によるサンプル分析の対象となりうる。

また、第１チャンバ３０ａと第２チャンバ３０ｂとに相異なる二種のサンプルが各々供給されうる。 例えば、第１チャンバ３０ａには分析対象となる実際サンプルが供給され、第２チャンバ３０ｂには混成化反応をモニタリングするために、モニタリング用プローブにのみ結合されるモニタリング用サンプルが供給されうる。 例えば、第１プローブ領域１５上の分析用プローブは、人間から採取したオリゴヌクレオチドサンプルと結合するＤＮＡオリゴマーでありうる。 一方、第２プローブ領域１６上のモニタリング用プローブは、モニタリング用サンプルと結合する別途のオリゴマーでありうる。 この場合、モニタリング用サンプルとしては、実際サンプルより分子量が相対的に大きな金ナノ粒子、蛋白質、ポリマーなどと結合させて分子量を増加させたオリゴマーを使用しうる。 これにより、前述したように、図７に示されたグラフのシフト精度が大きくなりつつ、さらに精密なＳＰＲ−検出が可能となる。

図１０は、前述したバイオチップ１０上の混成化反応をモニタリングする方法を順次に整理したフローチャートである。 図１０を参照すれば、まずサンプル分析に用いられる分析用プローブを有する第１プローブ領域１５と混成化モニタリングに用いられるモニタリング用プローブを有する第２プローブ領域１６とが透明基板１１上に各々形成されているバイオチップ１０を提供する（段階Ｓ１）。 ここで、図２Ａに示されたように、第２プローブ領域１６は、金属薄膜１２上に形成されている。 その後、図８または図９に示されたように、バイオチップ１０をチャンバ３０に配し、バイオチップ１０の下部にプリズム２０を配させる（段階Ｓ２）。 次いで、チャンバ３０の流入口３１を通じてチャンバ３０内にサンプルを供給することによって、混成化反応を始める（段階Ｓ３）。 この際、図８及び図９と関連して既に説明したように、第１プローブ領域１５の分析用プローブと第２プローブ領域１６のモニタリング用プローブには、同じサンプルが結合されるか、相異なるサンプルが結合されうる。

混成化反応が進行する間に、プリズム２０を通じてバイオチップ１０、特に第２プローブ領域１６に光を照射して、バイオチップ１０での混成化反応をリアルタイムでモニタリングしうる（段階Ｓ４）。 具体的に、第２プローブ領域１６に光を照射すれば、バイオチップ１０の金属薄膜１２と透明基板１１との間の界面でＳＰＲ現象が発生し、特定入射角度で吸光が発生する。 この際、光検出器２５を通じて反射光の強度を観察して、第２プローブ領域１６での混成化反応の進行による光吸収入射角の変化を検出しうる。 これにより、その検出された結果を以前にあらかじめ得たデータと比較することによって、バイオチップ１０、特に第１プローブ領域１５での混成化反応の進行程度を定量的に分析することができる（段階Ｓ５）。 分析結果によって、混成化反応が完了したならば（段階Ｓ６）、バイオチップ１０を取り出して、一般的な蛍光検出法によってサンプルを分析しうる（段階Ｓ９）。

混成化反応が完了していない場合には、続けてＳＰＲ−検出法によって混成化反応をモニタリングしつつ、混成化反応を進行させる。 この際、以前の実験を通じてあらかじめ得た最適の混成化条件についての情報を前述した分析結果と比較して、混成化条件が最適化されたか否かを確認しうる（段階Ｓ７）。 もし、最適の混成化条件が満たされていなければ、反応温度のような混成化条件を適切に変化させうる（段階Ｓ８）。

以上、本願発明の理解を助けるために多様な実施形態が説明され、添付された図面に図示された。 しかし、このような実施形態は、単に本発明を例示するためのものであり、技術的範囲の解釈は、これによって制限されるものではないという点を理解せねばならない。 そして、本発明は、図示及び説明された事項に限定されないという点を理解せねばならない。 これは、多様な他の変形が本技術分野で当業者によってなされうるためである。

１０ バイオチップ、
１１ 透明基板、
１２ 金属薄膜、
１３ サンプル溶液、
２０ プリズム、
２０ａ 光入射面、
２０ｂ 光出射面、
２５ 光検出器。