SYSTEME POUR LA DETECTION DE COMPLEXES D'HYBRIDATION DE SONDES AVEC DES LIGANDS SPECIFIQUES

SYSTEME POUR LA DETECTION DE COMPLEXES D ' HYBRIDATION DE SONDES AVEC DES LIGANDS SPECIFIQUES

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine de la détection de la présence de ligands d'intérêt dans des échantillons, à des fins d'application notamment dans le domaine de la recherche en biologie, y compris dans le domaine génomique, et dans le domaine du diagnostic médical et vétérinaire.

ART ANTERIEUR

Les biocapteurs constitués de supports sur lesquels sont immobilisées des composés sondes, telles que des sondes d'acides nucléiques sont utilisés de manière croissante dans les laboratoires de recherche et dans l'industrie. Ces biocapteurs constituent un outil très important d'analyse de la constitution qualitative et quantitative d'un échantillon en molécules d'ADN ou d'ARN. Classiquement, ces biocapteurs aussi désignés « puces à ADN » sont constitués d'un support solide sur la surface duquel une pluralité de sondes distinctes sont immobilisées dans un ordre prédéterminé, en général sous la forme d'un réseau à deux dimensions de « spots ». Ces biocapteurs sont principalement utilisés dans des procédés d'analyse d'expression de gènes, y compris d'analyse de la transcription de gènes, dans des procédés de synthèse d'acides nucléiques, dans des procédés de criblage de médicaments candidats, dans des procédés de séquençage d'acides nucléiques, ou encore dans des procédés de détection et d'analyse de mutations.

Les perfectionnements successifs apportés aux techniques de fabrication de ces biocapteurs ont permis de réaliser des biocapteurs comprenant plusieurs centaines de milliers de sondes distinctes. Certains biocapteurs représentent donc des outils d'analyse d'échantillons dont la capacité de détection peut couvrir la totalité d'un génome, y compris la totalité du génome humain.

Dans les procédés courants, les molécules d'intérêt, par exemple les molécules d'acide nucléique, contenues dans un échantillon à tester sont marquées avec une molécule détectable, par exemple un marqueur radioactif, un marqueur de type fluorochrome ou encore des particules métalliques tel que l'or colloïdal. Puis, le biocapteur est mis en contact avec l'échantillon à tester ce qui entraîne la formation éventuelle de complexes entre (i) certaines des sondes immobilisées sur la surface du support solide du biocapteur et (ii) des molécules d'intérêt susceptibles d'être contenues dans l'échantillon à tester. A titre illustratif, lorsque les sondes sont marquées par un fluorochrome, l'étape de détection est réalisée par illumination par balayage de chaque point de la surface du biocapteur, à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome, et la présence de complexes d'hybridation est détectée, en chaque point de surface, par mesure du signal de fluorescence, à la longueur d'onde d'émission dudit fluorochrome. Dans ce type de procédés, on utilise en général des systèmes de détection par microscopie de fluorescence à laser.

Les systèmes de lecture de biocapteurs à ADN actuellement utilisés sont satisfaisants dans de nombreuses applications. Toutefois, pour certaines applications, on a remarqué que la sélectivité ou la sensibilité des capteurs existants était insuffisante et nécessitait en conséquence d'être améliorée.

De plus, comme dans d'autres techniques utilisées de manière récurrente dans le temps et à grande échelle, il existe un besoin du public pour des procédés mettant en oeuvre des biocapteurs qui soient plus économiques que les procédés connus, ainsi que pour des biocapteurs eux-mêmes qui soient moins onéreux que les biocapteurs connus.

De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique pour des systèmes de lecture de biocapteurs, ou pour des biocapteurs, alternatifs ou améliorés par rapport aux systèmes connus.

RESUME DE L'INVENTION

II est fourni selon l'invention à la fois de nouveaux biocapteurs et de nouveaux systèmes de détection les utilisant, qui possèdent de nombreux avantages techniques par rapport aux biocapteurs et aux systèmes connus, comme cela sera détaillé plus loin dans la présente description. La présente invention a pour objet un système pour la détection de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des molécules ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit système comprenant : a) un biocapteur (10) pour la réalisation de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit biocapteur étant constitué d'un matériau support circulaire (1 1 ) comprenant une première et une seconde face et dont la première face comprend une surface de revêtement électro-conducteur (12) sur laquelle sont immobilisées une ou plusieurs sondes (13), ledit biocapteur comprenant, sur ladite première face, une marque électriquement détectable repérant une position fixée comme référence d'origine angulaire, b) un moyen (30) de mise en rotation du biocapteur (10) à une vitesse contrôlée, c) un capteur capacitif sans contact non vibrant (40), d) un moyen (50) pour le déplacement dudit capteur capacitif sans contact non vibrant (40) suivant l'axe radial du biocapteur (10), et e) un moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif sans contact non vibrant (40), ledit moyen de mesure (60) étant relié audit capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), et f) un moyen (80) permettant de maintenir sensiblement constante la distance séparant le capteur (40) de la surface du revêtement électroconducteur (12).

La présente invention est également relative à un biocapteur plan comprenant une première et une seconde face, et dans lequel : a) la première face est revêtue d'une couche de matériau électro-conducteur sur laquelle sont immobilisés un ou plusieurs acides nucléiques cibles, et b) la seconde face comprend un revêtement pour la lecture ou pour l'enregistrement optique de données. La présente invention concerne aussi un procédé pour la détection de complexes d'hybridation entre des sondes et des molécules ligands s'hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un biocapteur tel que défini ci-dessus, avec un échantillon à tester, pendant une durée suffisante à la formation de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur ledit biocapteur et des molécules ligand susceptibles d'être contenues dans ledit échantillon à tester, b) placer le biocapteur dans un système de détection tel que défini ci-dessus, et c) détecter les complexes d'hybridation éventuellement formés sur ledit biocapteur.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 illustre un biocapteur plan (10) sous la forme d'un disque sur la surface duquel sont immobilisées des sondes (13). (1 1 ) matériau support ; (12) revêtement conducteur ;

(13) sondes immobilisées ; (14) marquage à l'origine des angles ; (15) face inscriptible du biocapteur ; (16) demi face du biocapteur soumise à l'hybridation ; (17) demi face du biocapteur non soumise à l'hybridation

La Figure 2 illustre un mode de réalisation d'un système (20) pour la détection comprenant un biocapteur (10) et un capteur capacitif sans contact non vibrant (40). (21 ) bâtis ;

(22) blindage ; (30) système de déplacement du capteur à vitesse contrôlée ; (31 ) moteur d'entraînement ; (32) centrage et maintien mécanique du disque ; (50) système de déplacement du capteur ; (60) Moyen de mesure ; (70) liaison électro-conductrice ; (80) système de maintien du capteur ; (90) système de prise de contact électrique sur la surface du biocapteur, pour mise à la terre.

La Figure 3 illustre un mode de réalisation d'un capteur capacitif sans contact non vibrant. (41 ) face de coupe ; (42) tige métallique ; (43) cylindre de matière isolante ; (44) blindage ;

(50) système de déplacement du capteur comprenant : (51 ) chariot ; (52) diode laser de lecture- écriture : (53) vis sans fin ; (54) moteur ;

(80) système de maintien du capteur comprenant : (81 ) bras de levier ; (82) articulation ; (83) ressort ; (84) butée (vis écrou). La Figure 4 illustre un mode de réalisation du système (90) de prise de contact électrique sur la face du biocapteur. (91 ) capuchon métallique ; (92) contact graphité glissant ;

(93) ressort ; (94) potence ; (95) liaison filaire.

La Figure 5 illustre un moyen de mesure (60) comprenant : (40) capteur ; (61 ) amplificateur ampérométrique ; (62) convertisseur analogique numérique ; (63) calculateur numérique ; (64) filtrage ; (65) filtrage ; (66) carte électronique ; (70) moyen électro-conducteur. La Figure 6 représente un schéma illustrant les différentes étapes du procédé de fabrication d'un biocapteur selon l'invention. La figure 6A illustre le disque support de départ, qui consiste en un disque optique de type CD-ROM. Sur la figure 6A, la face pour l'enregistrement optique n'est pas visible. La figure 6B illustre un produit intermédiaire, dans lequel le matériau support du disque optique a été revêtu d'une couche de revêtement d'un premier matériau électroconducteur, sur lequel a été déposé une marque d'un second matériau électroconducteur, ladite marque matérialisant l'origine angulaire du biocapteur. La figure 6C illustre le biocapteur fini, avec la pluralité d'ensembles de sondes ou « spots » immobilisés à la surface du revêtement électroconducteur.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Le demandeur s'est attaché à mettre au point un nouveau biocapteur à et un nouveau système de lecture adapté à ce nouveau biocapteur, d'utilisation plus simple que les systèmes et les biocapteurs connus, et ayant un coût de fabrication ainsi qu'un coût d'utilisation réduits. Comme cela a déjà été mentionné précédemment, pour utiliser les systèmes de lecture de biocapteurs à sondes immobilisées connus, les techniques actuelles ont recours à une étape de détection par fluorescence, ou bien une étape de mesure d'un signal de radioactivité, des complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées et les molécules d'intérêt marquées. La réalisation d'une étape finale de détection des complexes d'hybridation rend obligatoire la mise en oeuvre d'une étape préalable de marquage par un composé détectable (fluorochrome, molécule radioactive, etc.) des molécules d'intérêt éventuellement présentes dans l'échantillon à tester.

Le demandeur a donc cherché à concevoir un nouveau biocapteur et un système de lecture adapté à ce nouveau biocapteur, qui permet d'éviter notamment le recours à une étape préalable de marquage des molécules d'intérêt contenues dans l'échantillon à tester, qu'il s'agisse d'un marquage par une molécule détectable fluorochrome ou par tout autre type de molécule détectable.

Après de longues recherches, le demandeur a conçu un nouveau biocapteur dont les caractéristiques générales le rendent compatible avec une variété de systèmes de lecture, adaptés à la détection des complexes d'hybridation entre des sondes immobilisées et des molécules d'intérêt. De plus, le demandeur a conçu un système de détection des complexes d'hybridation qui est spécifiquement adapté au nouveau capteur mis au point, comme cela est détaillé dans la présente description.

En particulier, il a été mis au point selon l'invention un biocapteur dont le support sur lequel sont immobilisées les sondes comprend un revêtement électro-conducteur.

On a montré selon l'invention que la présence, à la surface d'un biocapteur d'un type approprié, de complexes formés entre (i) des sondes immobilisées sur ladite surface, et (ii) des molécules ligands initialement contenues dans un échantillon à tester, peut être détectée par mesure du changement de potentiel électrique à la surface du biocapteur, ou bien par mesure du changement de la constante diélectrique à la surface du biocapteur, à l'aide d'un dispositif de mesure constitué d'un capteur capacitif sans contact et non vibrant.

On a aussi montré selon l'invention que, lorsque la surface du support solide possédant un revêtement électro-conducteur possède un potentiel électrique de surface de valeur V ₀ , défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant, la présence d'une sonde immobilisée sur ledit support porte le potentiel électrique de ladite surface à une valeur V ₁ , également défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant, et la présence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde immobilisée et un ligand porte le potentiel électrique de ladite surface à une valeur V ₂ , également défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant, On a montré selon l'invention que le changement local de potentiel pouvait être détecté à l'aide d'un capteur capacitif sans contact et non vibrant en déplacement relatif par rapport à la surface dudit biocapteur.

On a aussi montré que, avec la combinaison d'un capteur capacitif sans contact et non vibrant et d'un support électro-conducteur comme décrit ci-dessus, la permittivité diélectrique de l'espace localisé entre la tête de mesure du capteur et la surface électroconductrice du support varie selon que (i) ledit espace est constitué du fluide gazeux atmosphérique environnant, que (ii) ledit espace est au moins partiellement occupé par des sondes immobilisées sur le support ou que (iii) ledit espace est au moins partiellement occupé par des complexes d'hybridation entre des sondes immobilisées sur le support et des molécules ligand se liant auxdites sondes immobilisées.

Par « permittivité diélectrique », on entend la propriété physique qui rend compte de la réponse de l'espace localisé entre l'électrode de mesure du capteur et la surface électroconductrice du support de l'invention au champ électrique généré entre le capteur capacitif sans contact et non vibrant et la surface électroconductrice du support. Ainsi, il a été mis au point selon l'invention un biocapteur adapté à la détection de complexes d'hybridation entre des sondes cibles et des ligands se liant, de préférence spécifiquement, auxdites sondes cibles, consistant en un support solide circulaire plan comprenant une première et une seconde face, avec la première face comprenant à sa surface un revêtement électroconducteur, ladite première face comprenant également une pluralité de sondes, ou une pluralité d'ensembles de sondes, immobilisés à sa surface, les sondes, ou les ensembles de sondes, étant disposés sur ladite première face suivant des coordonnées polaires (p, θ).

Dans un biocapteur selon l'invention, la localisation d'une sonde déterminée, ou d'un ensemble déterminé de sondes, est définie par la combinaison de ses coordonnées polaires dans laquelle : (i) p est la coordonnée radiale, c'est à dire la distance de ladite sonde, ou dudit ensemble de sondes, par rapport au centre du support circulaire, suivant l'axe du rayon, et (ii) θ est la coordonnée angulaire, c'est à dire la mesure, dans le sens trigonométrique, de l'angle entre le point de localisation des sondes et la demi-droite d'angle 0°, encore appelée axe polaire, qui est préalablement fixé comme référence unique d'origine. Les caractéristiques détaillées du biocapteur sont spécifiées plus loin dans la présente description. Comme indiqué précédemment, la présente invention fournit aussi un système pour la détection de complexes d'hybridation entre des sondes et des ligands se liant, de préférence spécifiquement, auxdites sondes, ledit système étant adapté à la mise en oeuvre du biocapteur circulaire défini de manière générale ci-dessus. Avec le système de l'invention, la détection de la formation de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur le biocapteur et des ligands se liant auxdites sondes est réalisée de façon dynamique par un dispositif capteur unique, par mesure de la variation de l'intensité électrique du courant généré dans ledit capteur unique lorsque le biocapteur circulaire est en rotation, c'est à dire lorsque la surface du biocapteur est en déplacement relatif vis-à-vis de l'électrode, dudit capteur unique. Plus particulièrement, comme cela sera détaillé plus loin, le capteur unique qui équipe le système de détection ci-dessus consiste en un capteur capacitif sans contact non vibrant, qui permet la détection des modifications de potentiel électrique, des variations de charge électrique, des variations de moment dipolaire ou encore des variations de permittivité diélectrique, chacune de ces variations étant produites du fait de la présence, entre l'électrode dudit capteur unique et la surface du biocapteur, de sondes immobilisées sur le biocapteur, ou de complexes d'hybridation entre lesdites sondes immobilisées et des ligands spécifiques desdites sondes.

La présente invention a pour objet un système pour la détection de complexes d'hybridation entre (i) des sondes immobilisées sur un support et (ii) des molécules ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit système comprenant : a) un biocapteur (10) pour la réalisation de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit biocapteur (10) étant constitué d'un matériau support circulaire plan (1 1 ) comprenant une première et une seconde face et dont la première face comprend une surface de revêtement électro-conducteur (12) sur laquelle sont immobilisées une ou plusieurs sondes (13), ledit biocapteur comprenant, sur ladite première face, une marque électriquement détectable repérant la position fixée comme référence d'origine angulaire (14), b) un moyen (30) de mise en rotation du biocapteur (10) à une vitesse contrôlée, c) un capteur capacitif sans contact non vibrant (40), d) un moyen (50) pour le déplacement dudit capteur capacitif sans contact non vibrant

(40) suivant l'axe radial du biocapteur (10), et e) un moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif sans contact non vibrant (40), relié audit capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), et f) un moyen (80) permettant de maintenir sensiblement constante la distance séparant le capteur (40) de la surface du revêtement électroconducteur (12),

Dans certains modes de réalisation du système de détection ci-dessus, ledit système comprend aussi g) un moyen électroconducteur (95) permettant une mise à la terre de la surface du biocapteur (10) .En référence à la figure 4, ledit moyen électroconducteur (95) peut consister en un câble électrique (95) dont une première extrémité est reliée à la terre et dont une seconde extrémité est reliée électriquement, directement ou indirectement, au biocapteur (10).

Sur le mode de réalisation de la Figure 4, le câble électrique (95) est relié électriquement de manière indirecte au biocapteur (10), par l'intermédiaire d'un enchaînement de pièces électroconductrices électriquement reliées les unes aux autres, respectivement (i) une tige (92) en graphite en contact, d'une part avec l'une des extrémités du câble (95) et, d'autre part, avec un capuchon métallique (91 ) qui est posé sur l'axe central de rotation du biocapteur (10) et est en contact électrique avec ledit biocapteur (10). Dans le système représenté sur la Figure 4, le capuchon métallique (91 ) a une position fixe par rapport à la surface du biocapteur (10), c'est-à-dire que lorsque le biocapteur (10) est en rotation, ledit capuchon métallique est également en rotation, à une vitesse angulaire identique à la vitesse angulaire du biocapteur (10), donc sans déplacement relatif du capuchon (91 ) par rapport à la surface du biocapteur (10). Dans le système représenté sur la Figure 4, la tige électroconductrice (92) est simplement en contact avec le capuchon (91 ) et n'entre donc pas en rotation avec le capuchon (91 ). De préférence, le maintien du contact de la tige (92) avec la surface de la partie supérieure du capuchon (91 ) est assurée par la liaison mécanique de la tige (92) avec un moyen de poussée de ladite tige vers le bas, en général un ressort, ladite tige (92) coulissant, selon un axe perpendiculaire à la surface principale du biocapteur (10).

La seconde extrémité du moyen électroconducteur (95) peut être relié à la terre selon une diversité de manières connues de l'homme du métier. En référence à la Figure 4, la seconde extrémité du câble électroconducteur est reliée électriquement au châssis portant le système de détection de l'invention, par l'intermédiaire de la potence métallique (94) ledit châssis étant lui-même relié à la terre, la potence (95) et le châssis étant dans ce mode de réalisation tous les deux en métal. Selon d'autres modes de réalisation, le moyen électroconducteur (95) peut être relié directement à la terre par l'intermédiaire d'une prise de terre conventionnelle.

La mise à la terre de la surface électroconductrice du biocapteur (10) est avantageuse pour maintenir sensiblement constante la valeur du potentiel V ₀ au cours du temps d'utilisation du système de détection selon l'invention. Par « complexe d'hybridation », on entend selon l'invention le complexe formé entre une sonde immobilisée sur la surface (1 1 ) du biocapteur (10) et une ou plusieurs molécules ligand liée(s) de manière non covalente à ladite sonde. Dans un complexe d'hybridation au sens de l'invention, sont en général complexées une sonde avec une seule molécule ligand se liant spécifiquement à ladite sonde. La molécule ligand est en général liée à la sonde par des liaisons non covalentes faibles, ce qui englobe les liaisons hydrogène, les liaisons électrostatiques, les liaisons ioniques ou encore les forces de Van der Waals.

Par « ligand », on entend selon l'invention tout type de molécule ayant la capacité à se lier à une sonde par des liaisons non covalentes. La nature chimique d'un ligand peut être très variée et englobe notamment les acides nucléiques et les polypeptides. Lorsque la sonde consiste en un acide nucléique, le ligand consistera en général en un acide nucléique ayant une séquence au moins partiellement complémentaire à l'acide nucléique sonde avec lequel il possède la capacité à se lier. Dans d'autres cas, le ligand peut consister en un polypeptide, par exemple dans les modes de réalisation d'un système selon l'invention dans lesquels les sondes immobilisés à la surface du biocapteur consistent en des acides nucléiques aptamères, c'est-à- dire des acides nucléiques préalablement sélectionnés pour leur capacité de fixation sélective sur des polypeptides, par exemple par sélection selon la méthode Selex bien connue de l'homme du métier.

Par « sonde», on entend selon l'invention une molécule susceptible d'être immobilisée sur un support solide et qui possède la capacité à se lier, de préférence spécifiquement, de manière non covalente à une ou plusieurs autres molécules, appelées « ligands », pour former un complexe d'hybridation. Les molécules de sondes peuvent être de nature variée et englobent notamment des molécules polypeptidiques et des molécules d'acide nucléique. Les molécules de sondes englobent aussi des substances minérales ou organiques, autres que les polypeptides ou les acides nucléiques, possédant la capacité à se lier de manière non covalente à une ou plusieurs molécules ligand.

Par « acide nucléique », on entend selon l'invention des polymères comprenant des bases purine et pyrimidine, ce qui englobe les polyribonucléotides, y compris l'ARN, et les polydésoxyribonucléotides, y compris l'ADN. Les acides nucléiques englobent à la fois des molécules simple brin et des molécules double brin. Le système de détection de l'invention sera mieux compris au vu de la description de certains de ses modes de réalisation, en référence aux figures.

En référence à la figure 1 , le biocapteur plan de forme circulaire (10) comprend une première face (16) et une seconde face (17), dont seule la première face (16) est visible sur la figure. Le matériau support (1 1 ) est, sur la première face (16), recouvert au moins sur une partie de sa surface, et préférentiellement sur la quasi-totalité ou même sur la totalité de sa surface, d'un revêtement électroconducteur (12). Sur ladite première face (16), des sondes (13), ou des ensembles ou « spots » de sondes (13), sont immobilisés à la surface du support (1 1 ) et exposées à l'environnement extérieur. La localisation de chaque sonde (13), ou de chaque ensemble de sondes (13), est connue et est préférentiellement déterminée par ses coordonnées polaires (p, θ), étant entendu que les coordonnées polaires sont déterminées (i) pour p, en unités arbitraires de distance par rapport au centre du biocapteur circulaire, et (ii) pour θ, en unités arbitraires de mesure d'angle, par rapport à une marque de référence unique (14) définissant la demi-droite d'origine angulaire d'axe radial. La seconde face (17), non visible sur la figure 1 , est préférentiellement revêtue d'un matériau adapté à l'enregistrement et à lecture optique d'informations, du type des matériaux utilisés dans la fabrication des disques optiques connus, par exemple de disques optiques de type CD-ROM ou DVD-ROM.

A titre illustratif, les unités arbitraires utilisées pour la localisation de chaque sonde (13), ou de chaque ensemble de sondes (13), peut être (i) pour p, en micromètres et (ii) pour θ, en degrés d'arc. Sur le mode de réalisation du biocapteur de la figure 1 sont représentées simultanément une demi-face (16) soumise à l'hybridation et une demi-face (17) non soumise à l'hybridation. La demi-face (16) et la demi-face (17) ne présentent aucune différence de structure. La distinction entre la demi-face (16) et la demi-face (17) peut être faite seulement après l'étape d'hybridation, c'est-à-dire après l'étape de mise en contact du biocapteur (10) avec un échantillon susceptible de contenir un ou plusieurs ligands se fixant spécifiquement sur les sondes immobilisées. Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 1 , seule la moitié de la surface du biocapteur est mise en contact avec l'échantillon susceptible de contenir un ou plusieurs ligands. Par exemple, on immerge une première moitié (16) du biocapteur (10) dans l'échantillon, la seconde moitié (17) du biocapteur (10) restant émergée, par exemple en contact avec l'air. Après hybridation, seule la demi-face (16) du biocapteur (10) est susceptible de comprendre des complexes d'hybridation entre des sondes immobilisées et des ligands contenus dans l'échantillon.

En référence à la figure 2, le système de détection (20) est constitué d'une structure ou bâtis, qui peut être appelée aussi « châssis », sur laquelle sont implantés les moyens essentiels, y compris le capteur (40) capacitif sans contact non vibrant et le biocapteur (10). Le biocapteur (10), qui est amovible, est posé sur une platine rotative dont l'axe central se confond avec l'axe central du biocapteur (10) circulaire plan. La platine rotative, qui constitue le moyen de déplacement rotatif (30) à vitesse contrôlée du biocapteur (10) est reliée mécaniquement à un moteur à vitesse contrôlée variable, qui n'est pas représenté sur la figure. Un blindage (22) isole électriquement le biocapteur (10) par rapport à l'environnement extérieur. Sur la figure 2, la face supérieure du biocapteur (10) est la « première face » du biocapteur recouverte au moins partiellement d'un revêtement électroconducteur, sur lequel sont immobilisés les sondes ou les ensembles de sondes. Le capteur (40) capacitif sans contact non vibrant est solidaire d'un support de maintien (80) qui est mobile suivant un axe horizontal qui se confond avec l'axe radial du biocapteur (10). Un moyen (50) de déplacement du capteur (40) permet la translation linéaire contrôlée de l'ensemble support (80)/capteur (40). L'électrode du capteur (40) est située à une distance constante de la surface de revêtement électroconducteur du biocapteur (10), quelle que soit la position du capteur (40) le long de son axe de translation. Une diode laser de lecture ou d'enregistrement optique d'informations est disposée face à la seconde face du biocapteur (10) opposée à la première face. Le moyen (50) de déplacement du capteur (40) est conçu de manière à permettre une translation du capteur (40) et de la diode laser sur au moins une partie de l'axe du plan principal du biocapteur (10), respectivement du côté de la première et du côté de la seconde face du biocapteur (10). L'électrode du capteur (40) est reliée électriquement par la liaison (70) à un moyen de mesure (60) d'un signal électrique généré par le capteur (40). Enfin, le biocapteur (10) est placé à une valeur contrôlée de potentiel électrique par l'intermédiaire d'une liaison électrique (90) entre le biocapteur (10) et un générateur de tension non représenté sur la figure 2.

Dans les modes de réalisation préférés du système (20) de détection de l'invention, le capteur (40) capacitif sans contact non vibrant comprend une seule électrode, qui est disposée sur la partie supérieure du support (80), l'extrémité de ladite électrode, placée à une distance fixe de la surface de revêtement électroconducteur de la « première face » du biocapteur (10) et pouvant se translater sur au moins une partie de l'axe radial dudit biocapteur (40). C'est ce mode de réalisation du capteur (40) capacitif sans contact non vibrant qui est représenté en détail sur la figure 3.

La figure 3 représente une section verticale d'un mode de réalisation du capteur (40) capacitif non vibrant sans contact. Sur le mode de réalisation représenté sur la figure 3, l'électrode du capteur (40) comprend une tige métallique (42) dont l'extrémité orientée vers la surface du biocapteur (10) constitue une face de coupe (41 ), de section parallèle à l'axe de translation du capteur (40). La tige métallique (42) est incluse dans un cylindre de matériau isolant (43), lui-même électriquement isolé par rapport à l'environnement extérieur par une enveloppe de blindage (44) métallique. L'électrode du capteur (40) est reliée à un moyen de mesure du signal électrique généré dans celle-ci par l'intermédiaire d'une liaison électroconductrice (70) en contact avec l'extrémité de la tige métallique (42) opposée à l'extrémité (41 ). L'électrode du capteur (40) est solidaire d'un chariot (51 ), qui est mobile le long d'un axe qui se confond avec l'axe du plan principal du biocapteur (10). Le chariot (51 ) est équipé d'un système de maintien du capteur (40) comprenant respectivement (A) un bras de levier (81 ) mobile autour d'un axe transversal horizontal, perpendiculaire par rapport à l'axe de translation du chariot (51 ) par l'intermédiaire de l'articulation (82), et (B) un ressort de rappel (83) qui coopère avec une butée (84) de hauteur réglable, permettant de maintenir fixe la position de l'électrode lorsque le système est en fonctionnement. Le déplacement linéaire du chariot (51 ) le long de son axe est réalisé par la rotation d'une vis sans fin (53) qui est engagée dans l'axe équipé d'un pas de vis traversant la base du chariot (51 ), la vis sans fin (53) étant reliée mécaniquement à un moteur (54), par exemple un moteur pas-à-pas, grâce auquel l'extrémité (41 ) de l'électrode solidaire du chariot (51 ) peut prendre une position déterminée quelconque le long de l'axe parallèle à l'axe principal du biocapteur (10). Sur la base du chariot (51 ), face à l'extrémité (41 ) de l'électrode du capteur (40), est disposée une diode laser (52) pour la lecture ou l'écriture d'informations sur la « seconde face » du biocapteur (10) dans les modes de réalisation du système de détection dans lesquels la seconde face du biocapteur (10) consiste en un matériau pour la lecture ou l'écriture optique d'informations, du type de celui utilisé pour les disques optiques connus.

La figure 4 illustre une coupe verticale d'un détail du système de détection, dans laquelle est schématisée la prise de contact électrique équipant le système de détection de l'invention, permettant de fixer la valeur de potentiel de la surface de revêtement électroconducteur du biocapteur (10), par mise à la masse. Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 4, le système de prise de contact comprend une potence (94) qui est fixée à l'une de ses extrémités à l'embase du système de détection et dont l'autre extrémité est équipée de la combinaison de moyens permettant d'affecter à la surface du biocapteur (10) la valeur de potentiel électrique choisi. Cette combinaison de moyens comprend un capuchon métallique (91 ) cylindrique creux dont la partie creuse centrale est emboîtée dans l'axe du moyen de déplacement rotatif (30) du biocapteur (10) et dont les bords inférieurs sont en contact avec la surface de revêtement électroconducteur du biocapteur (10). Le capuchon cylindrique (91 ) est en contact avec une tige électroconductrice (92), de préférence en graphite, qui est mobile par translation verticale selon un axe radial du moyen de déplacement rotatif (30). Une première extrémité de la tige électroconductrice est en contact avec le capuchon métallique (91 ), l'extrémité opposée étant reliée, par l'intermédiaire d'une liaison électroconductrice, à un dispositif générateur de tension, qui n'est pas représenté sur la figure 4.

La figure 5 représente un schéma général des moyens constituant le moyen de mesure (60) auquel il a déjà été fait référence dans la description de la figure 2. Sur la figure 5, les différents éléments constitutifs du moyen de mesure (60) du système de détection sont représentés symboliquement par des boîtes. Le capteur (40) est relié à un amplificateur ampérométrique (61 ) par l'intermédiaire de la liaison électroconductrice (70). L'amplificateur ampérométrique (61 ) est relié électriquement à un moyen (62) de conversion du signal analogique provenant dudit amplificateur (61 ) en un signal numérique qui est transmis à un calculateur numérique (63), le signal numérique généré par le convertisseur (62) étant traité préalablement par des moyens (64, 65) de filtrage du signal. Dans certains modes de réalisation du moyen de mesure (60), l'ensemble constitué de l'amplificateur (61 ) et du convertisseur (62) est implanté sur une carte électronique (66) qui équipe le calculateur numérique (63). La mémoire du calculateur numérique (63) est chargée avec un ensemble d'instructions permettant de déterminer la présence de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur le biocapteur (10) et des molécules ligands, en tout point de la surface utile de la « première face » du biocapteur (10).

Dans un système de détection selon l'invention, la valeur de l'intensité du courant électrique « I » mesurée par le moyen de mesure (60) croît avec : - (i) la différence entre le potentiel V ₀ de la surface de revêtement (12) et le potentiel \Λ aux endroits de localisation des sondes,

- (ii) la différence entre le potentiel V ₀ de la surface de revêtement (12) et le potentiel V ₂ aux endroits de localisation des complexes d'hybridation (13),

- (iii) la différence entre le potentiel \Λ aux endroits de localisation des sondes et le potentiel V ₂ aux endroits de localisation des complexes d'hybridation (13), et

- (ii) la vitesse de déplacement relative du capteur capacitif (40) au-dessus de la surface de revêtement (12).

Plus précisément, dans le cas d'une mesure par détection de variations du potentiel de surface, ou de la permittivité diélectrique, l'extrémité de l'électrode de mesure du capteur capacitif plan (40) de surface « S » positionné à une distance « e » du support (12) a une capacité C ₀ , avec la relation (A) suivante :

C ₀ =ε ₀ .S/e (A), dans laquelle,

- C ₀ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40),

- ε ₀ signifie la valeur de permittivité diélectrique de l'air compris dans l'espace inter- électrodes, - S signifie la valeur de surface de l'électrode de mesure du capteur capacitif (40), et

- e signifie la valeur de distance inter-électrodes comme définie ci-dessus, c'est-à-dire la distance entre l'extrémité de l'électrode de mesure et la surface du matériau électroconducteur (12) du biocapteur (10). Dans ce cas, la charge électrique q ₀ du condensateur que constitue le capteur (40) peut être calculée selon la relation suivante (B) : q _o =C _o .V _o (B), dans laquelle :

- q ₀ signifie la charge électrique du capteur capacitif (40),

- C ₀ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), et - V ₀ signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10) défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.

Lorsque ledit capteur capacitif (40) est positionné à la même distance du biocapteur (10) au-dessus d'une partie de la surface de revêtement (12) sur laquelle sont immobilisées des sondes (13), la charge qi du capteur capacitif (40) de capacité Ci peut être calculée suivant la relation (C) suivante : (C), dans laquelle :

- qi signifie la charge électrique du capteur capacitif (40),

- Ci signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), et

- Vi signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10) sur laquelle sont immobilisées les sondes (13) et défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant..

La valeur de Ci est obtenue suivant la relation (D) suivante : (D), dans laquelle,

- C ₁ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), - E ₁ signifie la valeur de permittivité diélectrique globale de l'espace inter-électrodes,

- S signifie la valeur de surface de l'électrode du capteur capacitif (40), et

- e signifie la valeur de distance inter-électrodes entre le capteur capacitif (40) et la surface du support (12).

Lorsque ledit capteur capacitif (40) est positionné à la même distance du biocapteur (10) au-dessus d'une partie de la surface de revêtement (12) sur laquelle sont immobilisés des complexes d'hybridation entre des sondes et des molécules ligands (14), la charge q ₂ du capteur capacitif (40) de capacité C ₂ peut être calculée suivant la relation (E) suivante : q ₂ =C ₂ .V ₂ (E), dans laquelle :

- q ₂ signifie la charge électrique du capteur capacitif (40), - C ₂ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), et

- V ₂ signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10) recouverte de complexes d'hybridation (14), et défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.

La valeur de C ₂ est obtenue suivant la relation (F) suivante : C ₂ =ε ₂ .S/e (F), dans laquelle, - C ₂ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40),

- ε ₂ signifie la valeur de permittivité diélectrique globale de l'espace inter-électrodes,

- S signifie la valeur de surface de l'électrode du capteur capacitif (40), et [

- e signifie la valeur de distance inter-électrodes . Lorsque que le capteur capacitif (40) passe, en une durée « dt », d'une position « face au revêtement (12) nu » à une position « face au revêtement (12) sur lequel une sonde est immobilisée »(13), ledit capteur (40) est traversé par un courant de court-circuit d'intensité « I », qui peut être calculée suivante la relation (G) suivante :

I=(C ₁ V ₁ - C ₀ V ₀ ) /dx ^* dx/dt (G), dans laquelle : - 1 signifie la valeur d'intensité de courant traversant le capteur capacitif (40),

- C ₀ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40) « face au revêtement (12) nu »,

- C ₁ signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40) « face au revêtement (12) sur lequel une sonde est immobilisée » (13), - V ₀ signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10), en un point de surface sans sonde immobilisée, défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.

- V ₁ signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10), en un point de surface comprenant au moins une sonde immobilisée, défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.

- dx est la valeur de distance du déplacement effectué par l'échantillon sous la sonde pendant le tempd « dt », et

- dx/dt est la valeur de vitesse de déplacement D

Si la permittivité diélectrique de l'espace inter-électrodes ne varie pas au cours du déplacement, alors on a la relation (H) C ₁ =C ₀ qui reste constante et I peut être calculé selon la formule (J) suivante :

I= C(V ₁ - V ₀ ) /dx ^* dx/dt (J)

La mesure ci-dessus est une mesure de potentiel.

Si V ₁ =V ₀ reste constante et égale à V au cours du déplacement, mais que la permittivité diélectrique de l'espace inter-électrodes varie, alors on a la relation (K) suivante : l= (Ci . Co) V/dx ^* clx/clt. (K)

La mesure ci-dessus est une mesure de permittivité diélectrique. Lorsque que le capteur capacitif (40) passe, en une durée « dt », d'une position « face au revêtement (12) nu » à une position « face au revêtement (12) sur lequel un complexe d'hybridation est immobilisé » (14), les mêmes équations que ci-dessus peuvent être utilisées en remplaçant les paramètres «C _{1 ;} V ₁ " par les paramètres «C ₂ ,V ₂ ,», caractéristiques des valeurs de capacité et de potentiel en présence d'un complexe d'hybridation.

Si, l'hybridation d'une sonde avec une molécule ligand a provoqué une variation de capacité de la valeur C ₁ vers la valeur C ₂ , ou provoqué une variation de potentiel de la valeur V ₁ vers la valeur V ₂ , la comparaison des mesures de courant I obtenues avec et/ou sans complexe d'hybridation permet de détecter l'occurrence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et au moins une molécule ligand.

Il ressort également de ce qui précède que la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) croit proportionnellement avec la vitesse D de déplacement relatif dudit capteur, par rapport à la surface (12).

Par ailleurs, la vitesse D de déplacement relatif dudit capteur (40) est préférentiellement contrôlée ou connue à tout moment d'utilisation du système de l'invention, afin d'accroître la précision de discrimination, à une localisation donnée de la surface (1 1 ) du biocapteur (10), entre la présence d'une sonde immobilisée et la présence d'un complexe d'hybridation entre une sonde immobilisée et un ligand. Préférentiellement, la vitesse D de déplacement relatif du capteur capacitif (40) est sensiblement constante, ou mieux constante, durant la totalité du parcours dudit capteur (40) au-dessus de la surface (1 1 ).

Le biocapteur (10) étant circulaire, la vitesse D de déplacement relatif du capteur capacitif (40) au-dessus de la surface (1 1 ) peut être contrôlée de manière continue. Dans les modes d'utilisation du biocapteur (10) dans lesquels seule une partie de la surface (12) sur laquelle sont immobilisées les sondes (13), ledit biocapteur comprend, sur la surface (12), à la fois (i) des localisations avec le revêtement conducteur (12) nu au potentiel V ₀ , (ii) des localisations avec des sondes (13) immobilisées, au potentiel \Λ et (iii) des localisations avec des complexes d'hybridation entre les sondes (13) et des ligands de l'échantillon testé, au potentiel V ₂ .

De manière générale, le potentiel V ₀ est sensiblement constant avec le temps d'utilisation du biocapteur (10) dans le système de détection de l'invention. Le potentiel V ₀ peut être maintenu sensiblement constant grâce notamment au système de mise à la masse, ou de mise à la terre, dudit biocapteur grâce au moyen électroconducteur (95). Le potentiel \Λ est significativement différent du potentiel V ₀ et du potentiel V ₂ , du fait que, sur un biocapteur (10), les sondes (13) qui sont immobilisées sont en général de même nature chimique, par exemple des acides nucléiques ou des protéines. Lorsque les sondes (13) consistent en des acides nucléiques, lesdits acides nucléiques possèdent en général des longueurs et des compositions similaires et génèrent donc un potentiel Vi de valeur également similaire. Lorsque les sondes (13) consistent en des protéines ou des peptides, leur taille et leur composition peut être variable, ce qui entraîne un ensemble de valeurs de potentiel Vi distinctes, mais qui sont significativement différentes de V ₀ .

Le potentiel V ₂ est sensiblement constant, ou au moins significativement différent du potentiel V ₀ et du potentiel Vi, bien que les ligands susceptibles de se fixer sur les sondes (13) puissent être de nature et/ou de taille distinctes. Le potentiel V ₂ peut donc être variable, selon les ligands hybrides aux sondes, mais peut être dans tous les cas discriminé à la fois du potentiel V ₀ et d'une valeur de potentiel V ₁ .

Dans certains modes de réalisation de l'utilisation d'un système de détection selon l'invention, pour un biocapteur (10) donné, la valeur de potentiel V ₀ , et parfois la ou les valeur(s) de potentiel V ₁ , sont connues à l'avance. Dans ces modes de réalisation, le système de détection peut être mis en œuvre en immergeant la totalité de la surface (12) du biocapteur. Dans ces modes de réalisation, si toutes les sondes sont hybridées à des ligands, on mesure exclusivement des valeurs de potentiel V ₂ aux endroits de localisation des sondes (13), qui peuvent être distinguée des valeurs V ₀ et \Λ connues. Préférentiellement, le biocapteur (10) est un disque du type des disques optiques utilisés pour la fabrication des CD, des DVD, etc. Dans un tel mode de réalisation préféré, la surface (10) du biocapteur (10) consiste avantageusement en la face non enregistrée, ou non enregistrable, d'un disque optique. Dans ce mode de réalisation préféré, le moyen pour le déplacement du capteur capacitif (40) peut être du même type que celui des platines qui équipent les dispositifs de lecture ou d'enregistrement de disques optiques, à savoir que ledit moyen pour le déplacement comprend au moins la combinaison de :

(i) un moteur d'entraînement à vitesse contrôlée permettant le déplacement relatif du capteur (30) par rapport à la surface (12) du biocapteur, à une distance donnée du centre du biocapteur (10), selon le plan principal dudit biocapteur, et (ii) un moyen de déplacement radial du capteur (50) perpendiculairement à l'axe vertical du biocapteur (10), identique à celui de la tête de lecture ou d'enregistrement optique (52).

Un mode particulier de réalisation d'un tel moyen de déplacement est illustré sur les figures 2 et 3.

Dans certains modes de réalisation du système de l'invention, le revêtement électro- conducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un revêtement métallique. Ce revêtement métallique peut comprendre, ou consister en, un métal choisi par exemple parmi le fer, l'acier, l'acier inoxydable, l'or, le cuivre, le nickel, le chrome, l'aluminium, l'argent, le platine, le palladium ou un alliage d'une combinaison d'au moins deux de ces métaux. Dans d'autres aspects, le revêtement électro-conducteur peut comprendre, ou consister en, un oxyde métallique, par exemple un oxyde métallique choisi parmi le dioxyde de silicium, l'oxyde d'étain, l'oxyde d'étain dopé par le fluor, l'oxyde d'indium/étain, l'oxyde d'étain dopé par l'antimoine, l'oxyde de zinc dopé par l'aluminium, l'oxyde d'indium, l'oxyde de zinc, l'oxyde de zinc dopé par l'indium, le stannate de cadmium, l'oxyde de cadmium, l'oxyde de palladium, ainsi que les mélanges d'au moins deux des oxydes métalliques précités. Divers procédés de déposition d'un revêtement électro-conducteur sont connus depuis très longtemps par l'homme du métier.

Dans d'autres modes de réalisation du système selon l'invention, le revêtement électroconducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un revêtement polymère dans la masse duquel sont dispersées des particules métalliques. De tels matériaux polymères, ainsi que leurs procédés de fabrication et de déposition sont bien connus de l'homme du métier. Dans encore d'autres modes de réalisation du système selon l'invention, le revêtement électro-conducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un matériau polymère, par exemple un matériau polymère possédant des propriétés d'électro-conductivité du type de celles exigées pour des matériaux semi-conducteurs. On peut citer notamment les matériaux polymères électro-conducteurs formés à partir de thiophène, de 3-méthylthiophène, de 1 -benzothiophène, d'aniline ou encore de pyridine, bien connus de l'homme du métier, dont certains sont décrits dans la demande de brevet américain n ⁰ US 2004/0260016. On peut aussi citer les matériaux polymères particulièrement bien adaptés pour l'immobilisation de biomolécules, du type de ceux décrits notamment dans le brevet américain n ⁰ US 6,197,881 et dans la demande de brevet américain n ⁰ US 2006/0047067. De nombreuses méthodes d'immobilisation de sondes (13) à la surface de supports solides sont connues dans l'état de la technique. On peut citer par exemple les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques par adsorption à la surface de revêtement d'un alliage de palladium et d'oxyde de palladium, comme décrit par exemple par Millan et al. (1994, Anal Chem, Vol. 66 : 2943). On peut citer aussi l'immobilisation de dérivés thiolés d'acides nucléique sur un revêtement d'or, comme décrit par Mucic et al. (1996, Chem Commun, page 555). On peut aussi citer les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques sur une grande variété de revêtements métalliques, qui sont décrites dans la demande internationale PCT n ⁰ WO 2004/1 13872, pour la mise en oeuvre desquelles on a recours à l'utilisation de dérivés thiolés d'acides nucléiques. La figure 6 illustre un mode de réalisation d'un procédé de fabrication d'un biocapteur

(10) de l'invention, qui est détaillé par ailleurs dans les exemples.

Sur la partie supérieure de la figure 6, est représenté un disque optique connu, en l'occurrence un disque optique de type CD-RW, qui est utilisé comme produit de départ dans la fabrication d'un biocapteur (10) selon l'invention. Le disque optique de départ est d'abord soumis à une étape de métallisation de la « première face », qui peut être la face non inscriptible d'un disque optique du type CD-RW, comme représenté dans la partie médiane de la figure 6. Par exemple, dans cette première étape de traitement, la « première face » est soumise à un dépôt d'une couche d'or sur la totalité ou la quasi-totalité de sa surface. Préférentiellement, on procède à une étape ultérieure de dépôt d'une couche d'un second métal, par exemple de chrome, le revêtement par le second métal étant localisé selon au moins une demi-droite radiale au-dessus de la couche du premier métal. La ligne radiale de revêtement par le second métal est utilisée comme marque de référence de l'origine angulaire, pour le calcul des coordonnées polaires de chaque point de la surface du revêtement électroconducteur du biocapteur (10), et plus particulièrement pour l'expression des coordonnées de chacune des régions de la surface de revêtement électroconducteur sur lesquelles est ensuite immobilisée une sonde ou un ensemble de sondes. Puis, dans une troisième étape de traitement, chacune des sondes, ou chacun des ensembles de sondes, est greffé de manière covalente à la surface du revêtement électroconducteur à une localisation déterminée, comme représenté dans la partie inférieure de la figure 6, afin d'obtenir un biocapteur (10) prêt à l'emploi. Ainsi, dans le biocapteur (10) final représenté sur la partie inférieure de la figure 6, chaque sonde de structure connue, ou chaque ensemble de sondes de structure(s) connue(s), est immobilisé en un point de la surface du revêtement électroconducteur qui est connu et déterminé par ses coordonnées polaires par rapport (i) à l'origine p qui est l'axe central du disque et (ii) à l'origine radiale θ qui est la demi-droite radiale du second métal déposé. Dans des modes de réalisation préférés du système de détection de l'invention, les informations relatives (i) aux coordonnées de chaque sonde immobilisée, ou de chaque ensemble de sondes immobilisées, ainsi que, le cas échéant, (ii) les caractéristiques de structure de chaque sonde, par exemple les caractéristiques de séquence nucléotidique ou d'acides aminés, est enregistrée dans un format numérique sur la « seconde face » du biocapteur (10), qui est préférentiellement la surface optique de lecture ou d'écriture d'un disque optique de type connu.

En référence plus particulièrement à la figure 3, le capteur capacitif sans contact non vibrant (40) est constitué de la face de coupe (41 ) d'une tige métallique (42). Cette tige est sertie dans un cylindre de matière isolante (43). Cette matière isolante et une longueur importante de tige sont protégées par un blindage (44) mis au potentiel de la masse par le blindage de l'élément électro-conducteur (70). Un serrage permet de fixer rigidement le capteur à un support (81 ). Le moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) peut être de tout type connu. Le moyen de mesure (60) peut être notamment un dispositif amplificateur ampèrométrique analogique (61 ). Le moyen de mesure (60) peut aussi être suivi d'un convertisseur analogique/numérique (62), dans lequel le signal analogique de mesure est converti en un signal numérique qui peut ensuite être transmis à un dispositif de traitement numérique dudit signal (63), préférentiellement à un calculateur numérique. Le signal peut être filtré et traité avant (64) et/ou après (65) la conversion analogique numérique. La rapidité de la rotation du disque permet d'envisager de répéter les mesures et de les accumuler de façon à augmenter la valeur du rapport signal/bruit. Selon ce dernier mode de réalisation, le moyen de mesure (60) et de traitement de la mesure peuvent consister en une carte électronique (66) reliée à un calculateur numérique dans la mémoire duquel sont chargées les instructions de traitement du signal de mesure de l'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40).

Le moyen de mesure (60) est relié au capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), en général des fils électriques blindés ou des pistes électro-conductrices localisées dans un support électriquement isolant, voire un système de transmission électrique ou optique. Dans certains modes de réalisation d'un système de détection selon l'invention, ledit système comprend un dispositif de lecture ou d'enregistrement de disques optiques, par exemple un dispositif du type lecteur ou enregistreur de CDs ou de DVDs, auquel on a associé le capteur capacitif (40). Dans ces modes de réalisation, ledit système est avantageusement relié par un moyen électrique ou optique à un calculateur numérique qui comprend notamment : - des moyens de contrôle et de commande de la vitesse de déplacement relatif D du capteur capacitif (40) par rapport à la surface (12) du disque en rotation,

- des moyens de contrôle et de commande de la position du capteur capacitif (40) sur l'axe radial dudit disque,

- des moyens d'acquisition des données de mesure de l'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) à un instant donné, - facultativement, des moyens de stockage des données de position sur le disque et d'identité des acides nucléiques immobilisés sur le revêtement (12), et

- le cas échéant, des instructions logiques chargées dans la mémoire permettant d'informer l'utilisateur de l'identité de la ou des sondes immobilisées ayant formé des complexes d'hybridation avec des ligands.

De manière générale, les sondes sont immobilisées de manière ordonnée à la surface du revêtement (12). En référence aux modes de réalisation du système de détection dans lesquels les sondes consistent en des acides nucléiques, chaque acide nucléique, qui est caractérisé par une séquence nucléotidique unique, est immobilisé à une position connue de la surface de revêtement (12), laquelle position peut-être référencée comme un couple de coordonnées selon (i) un axe p et (ii) un angle θ en coordonnées polaires, la valeur de l'angle téta étant déterminé par rapport à une référence d'origine angulaire (14) identifiable ou détectable sur la surface du biocapteur (10). Ainsi, la collection de sondes immobilisées à la surface du revêtement (12) peut être décrite dans un tableau de données dans lequel une position unique (p,θ) est affectée à un acide nucléique structurellement identifié par sa séquence nucléotidique (SEQ ID N ⁰ ). Ce tableau pourra être utilisé pour réaliser une image graphique (cartographie) des données et des résultats, sous forme linéaire (variations du potentiel en fonction de l'angle θ pour chaque cercle ou spire du balayage), sous forme d'image 3D vue de dessus ou en perspective des variations de potentiel pour l'ensemble des valeurs de p et θ balayées, ou encore sous forme d'image 3D interprétée, par exemple symbolisant sur une image de la surface (1 1 ) du biocapteur (10) la position de chacune des sondes qui ont formé un complexe d'hybridation..

Les sondes distinctes immobilisés sur le revêtement (12), ou les ensembles distincts de sondes immobilisées sur le revêtement (12), sont préférentiellement ordonnés selon des pistes concentriques ou bien des pistes en spirales.

Dans la plupart des cas, les coordonnées (p,θ) d'une sonde donnée permettent de distinguer de manière univoque une sonde donnée, ou un ensemble donné de sondes, des autres sondes, ou des autres ensembles de sondes de séquences distinctes et localisés aux positions (p',θ') les plus adjacentes. Dans la pratique, à une position (p,θ) donnée sur la surface du revêtement (12) sont immobilisées une pluralité de sondes de séquence (A) donnée, comme c'est le cas pour les puces à ADN connues.

Le nombre total de molécules à la surface du biocapteur (10) dépend du nombre de molécules sonde de même séquence immobilisées à une position (p,θ). Préférentiellement, les molécules sonde de même séquence localisées à une position (p,θ) donnée sont immobilisées sous la forme d'une collection de grande densité de surface, aussi désignée par le terme « spot ».

En d'autres termes, la capacité d'utilisation du biocapteur (10) est liée à une combinaison de paramètres incluant (i) la surface dudit biocapteur (10) et (ii) la surface occupée par chaque « spot » de sondes immobilisées. On comprend aisément que la capacité d'utilisation d'un biocapteur (10) qui possède les dimensions d'un disque optique des types CD ou DVD couramment commercialisés, qui ont un diamètre d'environ 120 millimètres, est inférieure à la capacité d'utilisation d'un biocapteur (10) ayant un diamètre de 300 millimètres.

On précise que, de manière générale, le diamètre du biocapteur (10) peut varier de 20 millimètres à 300 millimètres. De manière générale, le nombre total de spots contenus dans un biocapteur est au moins égal au nombre de sondes distinctes (13).

Ainsi, le nombre de molécules sondes immobilisées sur la surface du revêtement (12) d'un biocapteur (10) peut être exprimé selon la formule suivante :

- N,otai est le nombre total de sondes ; et

- A1 , A2, ..., AX représentent les acides nucléiques de séquences nucléotidiques uniques A1 , A2, ..., AX ;

- X est un entier dont la valeur maximale est égal au nombre total d'acides nucléiques de séquences uniques contenus dans le biocapteur (10);

- an1 , an2, ..., anX représentent le nombre de molécules d'acides nucléiques identiques immobilisées sur le revêtement (12) du biocapteur (10) pour chacune des séquences A1 , A2, ..., AX respectivement et représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 100, avantageusement entre 0 et 50, et sont de préférence égaux à 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ;

De manière générale, la liste séquentielle des sondes immobilisées sur une spirale ou sur chaque cercle concentrique (selon la géométrie du dépôt) doit être connue, et le point de référence d'origine angulaire (θ=0) doit être matérialisé par un signal repérable sur le disque (14). Cette liste séquentielle peut être codée sur la face (15) du biocapteur (10) qui n'est pas utilisée pour l'immobilisation des sondes, et qui est désignée « seconde face » du biocapteur, par référence à la « première face » du biocapteur sur laquelle sont immobilisés les sondes.

Selon un mode préféré d'utilisation du système de détection de l'invention dans un procédé de détection de complexes d'hybridation entres des sondes et des ligands, on réalise une première phase de balayage du biocapteur (10) permettant d'atteindre toutes les valeurs de (p,θ), préalablement à une étape de mise en contact du biocapteur (10) avec l'échantillon à tester. Cette première étape de balayage de la première face du biocapteur (10) permet de mesurer les variations de « I » et de corréler ces variations à la liste séquentielle des spots, et ainsi attribuer à chaque spot (« i ») un couple de coordonnées (pi,θi). Ces informations de variation de la valeur de « I » associées aux coordonnées des spots sur la surface du biocapteur (10) peuvent être enregistrées sur la face inscriptible ou seconde face du biocapteur (10).

En particulier, dans certains modes de réalisation du système de détection selon l'invention, tout autre type d'information utile peut être codé sur la seconde face du disque. A titre illustratif, la seconde face (15) du biocapteur (10) peut contenir des données d'information incorporées dans la structure du disque elle-même, par exemple par pressage, gravure, ablation par irradiation laser, comme cela est connu dans l'état de la technique pour l'enregistrement de données sur un support de disque optique. Ces données d'information incorporées dans la structure de la seconde face du biocapteur (10) peuvent être détectées ou lues par des optiques laser, en particulier une diode laser spécialement dédiée (52), localisée dans le système positionné en face du revêtement de la seconde face (15) du biocapteur (10).

Dans les modes de réalisation particuliers décrits ci-dessus, le revêtement (15) de la seconde face du biocapteur (10) consiste en un revêtement classique pour un disque optique, bien connu dans l'art antérieur.

Dans ces modes de réalisation du système de détection selon l'invention, on peut utiliser, pour réaliser un biocapteur (10), un disque dont la seconde face est recouverte d'un revêtement classique de disque optique, du type des disques optiques CD-DA, CD-ROM, CD- R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-R, DVD+/-RW, DVD-RAM et autres types apparentés, connus dans l'état de la technique. Dans ces modes de réalisation, le système de détection de l'invention comprend aussi un dispositif de lecture ou d'enregistrement de données sur un disque optique, d'un type connu. Dans ces modes de réalisation, le système de l'invention comprend aussi préférentiellement des moyens de contrôle et de commande dudit dispositif de lecture ou d'enregistrement optique.

La présente invention est également relative à un biocapteur du type décrit ci-dessus, qui consiste en un biocapteur plan comprenant une première et une seconde face, et dans lequel : a) la première face est revêtue d'une couche de matériau électro-conducteur sur laquelle sont immobilisés une ou plusieurs sondes, et b) la seconde face comprend un revêtement pour la lecture ou pour l'enregistrement optique de données. Ledit biocapteur peut être utilisé avec une grande variété de systèmes de détection de complexes d'hybridation de sondes avec des ligands spécifiques.

Dans certains modes de réalisation, on utilise ledit biocapteur avec le système de détection comprenant un capteur capacitif sans contact non vibrant qui est décrit en détail dans la présente description. Dans d'autres modes de réalisation, ledit biocapteur peut être utilisé avec un système de détection ayant les mêmes caractéristiques que le système de détection qui est décrit en détail dans la présente description, mais dans lequel le capteur capacitif sans contact non vibrant est remplacé par un autre type de capteur connu de l'homme du métier.

Ainsi, le capteur peut être de tout type connu, y compris un capteur un capteur optique, un capteur capacitif vibrant, un capteur capacitif non vibrant, etc.

L'utilisation d'un capteur capacitif vibrant permet l'obtention d'une mesure électrique en chaque point du biocapteur (10).

L'utilisation d'un capteur capacitif non vibrant permet la mesure des variations du signal électrique d'un point à l'autre du biocapteur en rotation. On utilise préférentiellement un capteur de type capacitif non vibrant car il permet une acquisition du signal beaucoup plus rapide qu'avec les capteurs vibrants.

Les capteurs capacitifs non vibrants englobent les capteurs capacitifs constitués d'une électrode métallique en forme de disque plan, (ou de toute autre forme : sphère, cône...) de diamètre ajustable selon (i) la valeur de surface occupée sur la surface (12) par une sonde immobilisées ou un ensemble de sondes immobilisées ou « spot » et (ii) la distance minimale sur la surface (1 1 ) entre deux sondes immobilisées, ou deux ensembles de sondes immobilisées, étant entendu que ladite distance minimale peut varier en général de quelques millimètres (mm) à quelques centaines de micromètres (μm). La distance minimale sur la surface (12) entre deux sondes immobilisées, ou deux ensembles de sondes immobilisées, peut aussi être à l'échelle nanométrique. Dans ce cas les capteurs connus mis en œuvre peuvent être ceux des microscopes à Forces Atomiques ou à forces électrostatiques utilisables en mode non vibrant.

Dans certains modes de réalisation préférés, ledit biocapteur se présente sous la forme d'un disque plan. Préférentiellement, les dimensions dudit disque plan sont compatibles avec la lecture ou l'enregistrement de données par des systèmes et des formats connus de lecture ou d'enregistrement de disques optiques du type CD ou DVD.

La présente invention a également pour objet un procédé pour la détection de complexes d'hybridation entre des sondes et des molécules ligands s'hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un biocapteur (10) du type spécifié dans la présente description avec un échantillon à tester, pendant une durée suffisante à la formation de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur ledit biocapteur et des molécules ligands susceptibles d'être contenues dans ledit échantillon à tester, b) placer le biocapteur dans un système de détection selon l'invention, c) détecter les complexes d'hybridation éventuellement formés sur ledit biocapteur.

Sur le principe, un biocapteur selon l'invention est utilisé à l'étape a) dans des conditions proches ou identiques à celles qui sont mises en oeuvre pour l'utilisation d'une puce à ADN classique. Notamment, les conditions de mise en contact du biocapteur avec l'échantillon à tester sont déterminées avec les mêmes paramètres qu'avec un biocapteur à ADN conventionnel, y compris les paramètres de durée, de température d'hybridation, de force ionique et de concentration saline de la solution d'hybridation, etc. Egalement, à la fin de l'étape a), le biocapteur est soumis à une ou plusieurs étapes de lavage, dans des conditions aisément déterminées par l'homme du métier, afin d'éliminer les molécules contenues dans l'échantillon à tester qui n'ont pas formé de complexes d'hybridation avec les acides nucléiques immobilisés sur le biocapteur de l'invention.

A l'étape c), le biocapteur est placé sur une platine de « lecture » adaptée, c'est-à-dire le système de détection décrit précédemment, de manière à ce que la totalité de la surface dudit biocapteur sur laquelle sont immobilisés les acides nucléiques puisse être balayée par le capteur capacitif (40) du système selon l'invention. Un mode de réalisation particulier d'une telle platine de lecture est illustrée sur la figure 2.

A l'étape c), les moyens de contrôle et de commande de déplacement du capteur capacitif (40) permettent la réalisation d'une mesure de l'intensité « I » de courant traversant ledit capteur capacitif (40) sur une partie ou sur la totalité de la surface du revêtement (12) sur lequel sont immobilisés les acides nucléiques.

Dans les modes de réalisation préférés du procédé, du type de celui illustré sur la figure

5, le signal analogique de mesure de l'intensité « I » est converti en données numériques qui sont ensuite traitées par l'Unité Centrale de Traitement (CPU pour « Central Processing Unit ») d'un calculateur numérique, selon une suite d'instructions logiques stockées dans la mémoire dudit calculateur numérique.

Dans certains modes de réalisation du procédé, à chaque donnée de position (p,θ) du capteur capacitif (40) est associée la valeur correspondante d'intensité « I » mesurée à cette position. Des pics de valeur d'intensité « I » sont mesurés aux positions (p,θ) pour lesquels des complexes d'hybridation se sont formés.

Comme déjà mentionné précédemment dans la présente description, les données d'un tableau matriciel de données dans lequel une position unique (p,θ) est affectée à un acide nucléique structurellement identifié par sa séquence nucléotidique est préférentiellement stockée au préalable dans un moyen de stockage de données du calculateur numérique. Le cas échéant, lorsqu'un biocapteur (10) à deux faces fonctionnelles est utilisé pour la mise en oeuvre du procédé, le tableau matriciel de données peut être enregistré au préalable sur la seconde face du biocapteur qui possède un revêtement de lecture ou d'enregistrement optique.

Après l'opération de « lecture » du biocapteur, ou simultanément à l'opération de « lecture » du biocapteur, on génère un nouveau tableau matriciel de données comprenant trois colonnes et une pluralité de lignes et dont chaque ligne comprend respectivement :

- une première colonne contenant les coordonnées de position (p,θ) d'un acide nucléique donné,

- la seconde colonne comprend la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) à ladite position (p,θ) ,

- la troisième colonne comprend l'information de séquence nucléotidique dudit acide nucléique.

Dans certains modes de réalisation dudit tableau matriciel de données ci-dessus, ledit tableau comprend exclusivement les données relatives aux positions (p,θ) du biocapteur pour lesquelles la valeur mesurée d'intensité « I » est supérieure à une valeur seuil minimale.

La valeur seuil minimale de l'intensité « I » est la valeur minimale attendue d'intensité générée par la présence, à ladite position (p,θ) d'un complexe d'hybridation avec l'acide nucléique immobilisé correspondant. Dans ces modes de réalisation du procédé, le calculateur numérique peut fournir directement à l'utilisateur l'identité de chacun des acides nucléiques ayant formé un complexe d'hybridation avec une molécule ligand contenue dans l'échantillon testé.

Dans certains modes de réalisation, la valeur de potentiel V ₀ du biocapteur (10), ou la valeur d'intensité I ₀ correspondante, est stockée dans la mémoire du calculateur numérique, le cas échéant après lecture de l'information de la valeur V ₀ préalablement codée sur la seconde face dudit biocapteur qui possède un revêtement de lecture ou d'enregistrement optique.

Dans certains modes de réalisation, la valeur de potentiel \Λ du biocapteur (10), ou la valeur d'intensité I ₁ correspondante, est stockée dans la mémoire du calculateur numérique, le cas échéant après lecture de l'information de la valeur V ₁ préalablement codée sur la seconde face dudit biocapteur qui possède un revêtement de lecture ou d'enregistrement optique.

Dans certains modes de réalisation du procédé dans lesquels un biocapteur à deux faces fonctionnelles tel que précédemment décrit est mis en œuvre, les données générées à l'étape c) du procédé, y compris le cas échéant les données contenues dans le tableau matriciel décrit ci-dessus, peuvent être enregistrées sur la seconde face du biocapteur comprenant un revêtement pour la lecture et l'enregistrement optique.

Le procédé de détection selon l'invention peut être utilisé dans la totalité des domaines d'application des puces à ADN conventionnelles.

La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant y être limitée, aux exemples suivants.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé de fabrication d'un biocapteur (10) à deux faces fonctionnelles Les étapes principales du procédé de l'exemple 1 sont illustrées sur la figure 6.

Le disque CD-RW (10) propre est introduit dans une enceinte d'évaporation sous vide. Un dépôt d'or (12) est réalisé par évaporation thermique sur la face non inscriptible (1 1 ) du disque. Il s'étend du centre du disque jusques à la périphérie ou à son voisinage.

Un second dépôt est réalisé par évaporation thermique d'un autre métal, par exemple du Chrome sous forme d'un ou de plusieurs rayons voisins (14). Il servira à déterminer la position d'origine de mesure des angles de rotation. Pour cela, un cache est utilisé. L'ensemble du disque est alors rincé à l'eau pure.

Les sondes (13) sont déposées à la main ou par un robot sous forme de spots selon un arrangement prédéterminé (information 1 ). Ces sondes ont au préalable été thiolées afin de se fixer sur le support doré.

Après séchage, le dépôt est suivi d'une phase de rinçage.

Une première détection des variations de signal électrique est effectuée (information 2).

Les informations 1 et 2 sont gravées sur la face inscriptible du disque (15). Variante de réalisation du biocapteur (10) :

En raison du coût de la dorure, la couche métallique couvrant l'ensemble de la face non inscriptible du disque peut être réalisée en un autre métal, par exemple avec du chrome. Des plots et les rayons de repérage de la position angulaire 0 peuvent être réalisés en or.

Les spots de sondes thiolées seront alors déposés sur ces plots d'or.

Exemple 2 : Description détaillée d'un mode de réalisation du procédé de détection selon l'invention

Le biocapteur (10) préparé comme décrit dans l'exemple 1 est immergé pendant 4 heures dans une solution susceptible de contenir des molécules d'un ou plusieurs ligands d'intérêt, à température du laboratoire.

On réalise un rinçage, afin d'éliminer de la surface du biocapteur (10) les molécules qui n'ont pas formé de complexes d'hybridation avec les sondes immobilisées.

Après séchage, on réalise une étape de détection des variations de signal électrique (information 3) sur la totalité de la surface (1 1 ) du biocapteur (10) sur laquelle les sondes sont immobilisées. Les informations sont enregistrées sur la seconde face du biocapteur (10).

Les informations 1 , 2 et 3 sont comparées afin de corréler les données. Ni le trempage ni le rinçage n'affectent la face inscriptible du disque.

Variante de réalisation du biocapteur (10) et du procédé de détection : Afin de se prémunir contre une variation accidentelle du potentiel de l'électrode de mesure électrique, on réalise le dépôt des sondes sur une moitié (16) de la face non inscriptible du disque et on le répète symétriquement sur l'autre demi-face (17).

L'hybridation sera alors effectuée par trempage de la seule demi-face(16). Elle sera suivie d'un rinçage complet du disque, suivi d'un séchage.

Au cours de la lecture du signal électrique l'appareil fera ainsi l'acquisition dans les mêmes conditions expérimentales du signal lu sur les spots éventuellement hybrides de la demi- face (16) et sur les spots certainement non hybrides de la demi-face (17).

Exemple 3 : Description détaillée d'un mode de réalisation d'un système de détection selon l'invention

Le mode de réalisation particulier d'un système de détection selon l'invention qui est détaillé à l'exemple 3 est illustré notamment sur les figures 2 à 5.

La réalisation d'un système de détection peut être effectuée à partir d'un lecteur de CD / DVD.

La platine (21 ) consiste en une platine de lecteur de CD d'ordinateur, entraînée par un moteur (31 ), ladite platine étant déjà équipée à l'origine pour réaliser le centrage et le maintien mécanique du disque (32). Le chariot (51 ) portant la diode laser de lecture ou d'écriture (52) est entraîné par une vis sans fin (53) mise en mouvement par un moteur (54).

Une première adaptation consiste à faire porter par le chariot la sonde de mesure électrique (40) qui effectuera les mesures sur la face non inscriptible (12). Cela peut être réalisé en utilisant un bras de levier (81 ) solidaire du chariot (51 ). Pour permettre l'introduction du disque (10) sur le dispositif de centrage (32), ce bras de levier doit posséder une articulation

(82). Afin que la sonde portée par le bras de levier se repositionne toujours à une bonne distance de la face du disque (12), le bras de levier est rappelé par la traction d'un ressort (83) qui le met en contact avec une butée mécanique ajustable par un système de vis-écrou (84). La seconde adaptation vient du fait que le potentiel électrique de la face non inscriptible du disque (12) doit être fixé, par exemple à OV. Afin de prendre un contact électrique sur cette face du disque, le centreur de la platine (32) est recouvert d'un capuchon métallique (91 ) qui est mis en contact avec le dépôt métallique effectué sur le disque (12). Un contact graphité glissant

(92) est centré sur ce capuchon et légèrement pressé par un ressort (93). Une potence (94) solidaire du bâtis (21 ) du lecteur de CD maintient mécaniquement ce dispositif. Le contact glissant est maintenu à un potentiel fixe (ici OV) grâce à une liaison filaire (95).

La troisième adaptation vient du rayonnement électromagnétique des moteurs, qui doit être écranté par un blindage (22).