长寡核苷酸阵列

                           技术领域

本发明的技术领域是核酸阵列。

                           背景技术

核酸阵列在生物技术工业和相关领域中成为越来越重要的工具。多种核酸以 阵列或模式(pattern)的形式附着在固相载体表面上形成的核酸阵列具有广泛的用 途，包括药物筛选、核酸测序、突变分析等。差别基因表达的分析是核酸阵列的 一个重要应用，在该分析中比较不同细胞(通常为感兴趣的细胞和对照细胞)的基 因表达并且确定表达中的任何差异。在这种分析中，差异的存在表明进行比较的 细胞所表达的基因类别有差异。

在差别基因表达方法中，可将阵列用作与核酸“探针”片段结合的底物。之 后可从用于进行比较的至少两种不同细胞源，如健康器官和患病器官的类似细胞、 组织或器官中获得“靶”。然后使该靶与固定化的核酸“探针”片段杂交。然后 检测所得的杂交模式之间的差异，这种差异与两种来源的基因表达的差异有关。

在这种检测中所使用的阵列，其多种不同的物理参数可对检测结果产生显著 的影响。核酸阵列的一个可对检测结果的本质产生明显影响的物理参数是探针的 大小，即阵列中稳固地与固相载体表面结合的单个核酸探针的长度。目前常使用 两种不同类型的阵列：(1)cDNA阵列，在该阵列中使用全长或部分cDNA作为探 针；(2)寡核苷酸阵列，使用约8-25个核苷酸作为探针。

目前使用的cDNA探针中，基本上全长或其部分片段的双链cDNA稳固地结 合于固相载体如尼龙膜的表面上。cDNA阵列的优点包括高灵敏度，它的特征源 于cDNA探针与它的靶的高效率结合以及可对这种阵列使用的严格杂交和洗脱条 件。cDNA阵列的缺点包括难于大规模生产、重复性低等。

寡核苷酸阵列是目前使用的阵列之一，它使用寡核苷酸探针，每个探针的长 度约为8-35个核苷酸，通常为20-35个核苷酸。虽然这种阵列在大规模生产中更 容易，但是它也有缺点。与cDNA阵列相比这种阵列一个明显的缺点是它们对靶 核酸的灵敏度低。另一缺点是，在给定的步骤中不同探针对相同靶标在杂交效率 上的巨大变化，它的特征是对相同的靶需要使用多种寡核苷酸探针，而这种重复 显著地增加了生产这种阵列的成本。

因此，对新的阵列形式的发展保持着兴趣。特别感兴趣的是整合了cDNA阵 列的高灵敏度和寡核苷酸阵列的高生产效率的阵列形式的开发，而且，这种阵列 不会有上述cDNA和寡核苷酸阵列所具有的缺点。

                           发明概要

本发明提供了长的寡核苷酸阵列、制备这种阵列的方法以及它们在杂交实验 中的应用。该阵列的特征是阵列中至少有部分探针、通常是所有的探针是长寡核 苷酸，如长约50-120nt的寡核苷酸。最好对阵列中的每条长寡核苷酸探针进行选 择，使其在所处条件如严格杂交条件中的靶标结合效率高和非特异性结合低。在 许多实施例中，对特异性的探针寡核苷酸进行了选择，使它们对各自的靶标具有 基本上相同的杂交效率。本发明阵列可使用于多种用途，如差别基因表达分析。

                           附图的简短描述

图1用图方法表示了不同长度的寡核苷酸的杂交效率。

                             定义

本文所用术语“核酸”指由核苷酸组成的聚合物，如天然产生的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸以及它们的人工类似物，这种类似物与肽核酸一样也具有序列 特异性，也能参与Watson-Crick型杂交反应等。

本文所用术语“核糖核酸”指由核糖核苷酸组成的聚合物。

本文所用术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合 物。

本文所用术语“短寡核苷酸”指长约50-150个核苷酸、通常长约50-120个 核苷酸的单链核苷酸多聚体，如50-150个核苷酸、50-120个核苷酸等。

本文所用术语“多核苷酸”指由超过约150个核苷酸、最多约5000个核苷 酸组成的单链或双链聚合物。

术语“寡核苷酸探针组合物”指由阵列上对应于靶核酸的各个探针组成的核 酸组合物。因而，本发明阵列的寡核苷酸探针组合物是多种长寡核苷酸的核酸组 合物，其中，根据组成该探针组合物的长寡核苷酸，该组合物可以是同种的或异 种的，即探针组合物中的每条长寡核苷酸可以具有相同的序列，这样该探针组合 物是相同的，或者每个探针组合物由两种以上不同的长寡核苷酸组成，这样探针 组合物在序列上各不相同。    

术语“靶核酸”指针对于阵列上一种或多种相应的寡核苷酸探针组合物即探 针寡核苷酸位点的核酸。靶核酸可由阵列上一种或多种不同的寡核苷酸探针反映。 靶核酸是用阵列进行检测的样品中感兴趣的核酸，此处“感兴趣”指样品中靶标 的存在或缺乏提供了关于获得该样品的细胞的遗传特性的有用的信息，如唯一的 和确定的特征。同样，靶核酸不是多种不同细胞类型中存在的、其存在或缺乏不 能提供关于特殊的细胞遗传特性的特征性信息的管家基因或其它类型的基因。

术语“背景”或“背景信号强度”指来自带标记的靶标对阵列中底物成分的 非特异性结合的杂交信号。背景信号也可由阵列成分自身的固有荧光产生。单一 的背景信号可用于全阵列的计算，或者不同的背景信号可每一个靶核酸的计算。

术语”非特异性杂交“指靶核酸对阵列表面上的核酸如阵列表面上探测位点 的长寡核苷酸探针、阵列表面上对照位点的核酸等的非特异性结合或杂交，其中 靶标和探针基本上不互补。

                           特殊实施例的描述

本发明提供了长寡核苷酸阵列、制备这些阵列的方法和这些阵列在杂交实验 中的应用。本发明阵列的特征是阵列中至少有一部分或片段、一般有大多数或基 本上全部探针以及通常全部探针是长寡核苷酸，如长约50-120nt的寡核苷酸。最 好对阵列上的每一条长寡核苷酸进行选择，使阵列在处于如严格的条件下具有高 靶标结合效率和低非特异性杂交。在某些实施例中，该阵列还具有阵列上各不同 探针对各自靶标具有基本上相同的杂交效率的特征。在对本发明的进一步描述中， 首先总述此阵列。接着描述制备这些阵列的方法。之后给出可能使用本发明阵列 的代表性应用的综述。

在进一步描述本发明前，应理解本发明不受下面所述的具体实施例限制，可 在所附的权利要求的范围内对具体实施例作出修改。还应理解所使用的术语是用 于描述具体的实施例，而非限制性。本发明的范围由所附的权利要求确立。

在本说明书和所附的权利要求书中，单数形式的“一”和“这(个)”包括复 数形式，除非文中有清楚的表示。除非有其它的定义，否则本文所用的所有技术 的和科学的术语与本发明所属领域的普通技术人员所理解的相同。 本发明的阵列——总述

本发明阵列具有大量的稳固地与固相载体表面结合的探针位点。本发明阵列 的一个特征是阵列上至少有一部分探针位点、较佳基本上所有的探针位点是探针 寡核苷酸位点，其中，各探针寡核苷酸位点含有由多种特性的、通常已知其序列 的长寡核苷酸组成的寡核苷酸探针组合物，下文将给出更详细的描述。 本发明阵列的探针位点

如上所述，本发明的特征是探针位点的性质，即阵列上至少有一部分、通常 基本上所有的探针位点由长寡核苷酸的探测核酸组合物组成。基质表面上的各探 针位点由长寡核苷酸探针组成，其中，根据位点上长寡核苷酸探针的性质，该位 点可以是同种的或异种的，如美国专利申请09/417268中所述的，该申请的公开 纳入本文作为参考。该寡核苷酸探针组合物的一个特征是该探针组合物由长寡核 苷酸组成。因此，探针组合物中寡核苷酸探针的长度约为50-150nt，通常约为50- 120nt，更通常约为60-100nt，在许多较佳实施例中，该探针的长度约为65-85nt。 换言之，在各探针位点或组合物中，组成该探针位点或组合物的各单独探针的长 度在上述范围之内。

除了上述长度特征外，组成上述探针位点的长寡核苷酸探针通常具有本发明 以下许多较佳实施例一个或多个特征。组成本发明阵列的长寡核苷酸探针的另一 特征是通过选择它们的序列，使它们在严格的条件下与它们的互补靶标的结合效 率高。结合效率指阵列所处的杂交条件下探针结合到它的靶标的能力。换言之， 结合效率指在进行杂交实验后由给定探针和其靶标获得的双链产率(duplex yield)。在许多实施例中，阵列表面上具有高结合效率的探针与它们的靶标的结合 效率为0.1％，通常至少为0.5％，更通常至少为2％。

此外，通过选择长寡核苷酸探针的序列，以使该探针对严格条件下基本上不 与之互补的靶核酸具有低的非特异性杂交或非特异性结合，即不希望的交叉杂交。 使用BLAST程序及其默认设置进行测定，可认为靶标中与给定探针的同源性少 于60％、更通常少于50％、最通常少于40％的靶标是基本上不与给定探针互补 的靶标。在某些实施例中，具有低非特异性杂交特征并在本发明阵列中使用的寡 核苷酸探针是那些与不互补的核酸，即其它基本上不互补的靶标的杂交能力是它 们与与之互补的靶标的杂交能力的10％以下、通常5％以下、较佳1％以下的探 针。例如，在并肩杂交实验中，具有低非特异性杂交特征的探针是那些在与不含 有该探针的互补靶标的靶标组合物接触时，若产生，则所产生的信号是该相同探 针与含有其互补靶标的靶标组合物接触时所产生的信号的约10％以下、通常约3 ％以下、更通常约1％以下的探针。

此外，对给定位点的长寡核苷酸进行选择，使阵列上每一条长寡核苷酸探针 或至少其靶特异性序列与阵列上任何其它不同的独特的长寡核苷酸，即阵列上具 有不同碱基序列的任何其它寡核苷酸探针不同源。换言之，在严格的条件下(如下 面所定义的)，对应于第一靶标的探针组合物的每一条不同的寡核苷酸不与任何对 应于不同靶标的探针组合物的不同的独特的寡核苷酸，即呈现在阵列上的任何其 它寡核苷酸探针组合物的寡核苷酸交叉杂交，或者与其有相同的序列。因此，探 针组合物的每一条独特的寡核苷酸的有义或反义核苷酸序列与阵列中对应于不同 靶标的探针组合物中的任何其它不同的寡核苷酸的同源性小于90％，通常小于70 ％，更通常小于50％，其中，使用FASTA程序及其默认设置进行序列分析比较 确定同源性。探针组合物中独特寡核苷酸的序列不是在大量不同的基因(至少2种) 中发现的保守序列，其中，保守序列定义为至少有90％序列同一性的长约15-150 个核苷酸的序列，如上面所述测定序列同一性。

如下面所述进一步表征各探针组合物的寡核苷酸或至少这些寡核苷酸中与它 们的预定靶标互补的那一部分，即它们的靶特异性序列。首先，它们的GC含量 约为35-80％，通常约为40-70％。其次，它们基本上缺乏：(a)次级结构，如自 身互补的区域(如发夹结构)、由分子内杂交事件形成的结构；(b)长的均聚物链， 如多聚A链，即在任何给定的均聚物链中，邻接的相同核苷酸碱基数不超过5；(c) 富含重复基元的长链，如GAGAGAGA、GAAGAGAA等；(d)富含单嘌呤或单 嘧啶基元的长链；等等。

本发明的长寡核苷酸探针可仅由如上所述的靶特异性序列组成，如所设计的 或呈现的用来与其对应靶标杂交的序列，或者将本发明探针修改成含有一种或多 种非靶标互补功能区或区域，如在该探针的一个或两个末端存在这种功能区，它 们具有许多作用，包括与基质表面的连接、将所需的构象结构导入探针序列等。 一个可存在于本发明阵列的长寡核苷酸探针中的一个或两个末端的可任选的功能 区或区域是富含胸苷碱基的区域，如寡dT区域，其中，该区域中的核苷酸数可 以较高，但一般不超过约25个，通常不超过约20个，该区域中的核苷酸如果不 全部是则至少在相当大比例上含有胸苷碱基，其中，以数量比计，相当大比例指 至少约占该寡dT区域中所有核苷酸的50％、一般至少约占70％、更一般至少约 占90％。可使用下式描述本发明这个实施例的某些探针，即T富含区域是寡dT 功能区的探针：

                          Tn-Nm-Tk； 其中，

T是dTMP；

Nm是该探针的靶特异性序列，其中N是dTMP、dGMP、dCMP或dAMP中 的任何一个，m为50-100；

n和k独立地表示0-15，当存在n和/或k时，它们较佳为5-10。

在本发明又一实施例中，通常除了上述T富含功能区外，本发明探针还可含 有赋予该探针一所需的受限结构(constrained structure)的功能区，如赋予该探针一 固定的或具有受限构象的结构。在许多实施例中，探针含有侧接于靶特异性功能 区的任一端并能赋予该探针一发夹环结构的功能区，从而将该靶特异性序列控制 在受限或限定构象中，这使得使用时对对应靶标的结合特性提高。在这些实施例 中，该探针可以由下式描述：

                        Tn-Np-Nm-No-Tk 其中：

T是dTMP；

N是dTMP、dGMP、dCMP或dAMP；

m是50-100的整数；

n和k分别为0-15，其中，当n和/或k存在时较佳是5-10，在许多实施例中， k＝n＝5-10，更佳为10；

p和o独立表示5-20，通常为5-15，更通常约为10，在许多实施例中， p＝o＝5-15，较佳为10；

Nm是靶特异性序列；

No和Np是自身互补序列，如它们彼此互补，这样在杂交条件下该探针形成 发夹环结构，在该结构中，No和Np构成杆结构，靶特异性序列即Nm构成环结构。

由阵列上每个寡核苷酸探针位点组成的寡核苷酸探针组合物基本上、通常全 部没有非核酸物质，即该探针组合物不含有在细胞中发现的非核酸生物分子如蛋 白质、脂质和多糖，或者不由这些物质组成。换言之，阵列的寡核苷酸位点如果 不是全部则基本上没有非核酸细胞构建物。

该寡核苷酸探针可以是核酸如RNA、DNA，或者是核酸类似物如以一些方 式如通过修饰骨架、糖残基、碱基等与天然产生的核酸不同的核酸，如含有非天 然产生的杂环含氮碱基、肽核酸、密闭核酸(locked nucleic acid)〔见Singh&Wengel， Chem.Commun.(1998)1247-1248〕等。但是，在许多实施例中，核酸不被对连接 到阵列的基质表面是必需的功能试剂如氨基功能试剂、生物素等修饰。

由上述长寡核苷酸组成并呈现在阵列上的寡核苷酸探针位点可以是任何方便 的形状，但通常是环状、椭圆状、卵形或其它一些类似的弯曲形状。在使用该阵 列进行实验期间，各位点存在的寡核苷酸的总量或总质量将足以产生足够的杂交 和进行靶核酸的检测。通常，各位点中的寡核苷酸的总质量至少约为0.2ng，通常 至少约为0.5ng，更通常至少约为1ng，其中，总质量可以是100ng以上，但通常 不超过约20ng，更通常不超过约10ng。位点中所有的寡核苷酸的拷贝数将足以产 生足够的靶分子杂交位点，以产生可检测的信号，该拷贝数一般约为0.01-10fmol， 通常约为0.005-5fmol，更通常约为0.01-1fmol。对于由两种以上具有不同序列的 不同寡核苷酸组成的位点，各位点中不同寡核苷酸的摩尔比或拷贝数比可以大约 相等或不等，其中，当各位点中独特的寡核苷酸之比不相同时，该比值的大小一 般至少为2-5，当通常不超过10。对于全部是环状的位点，该位点的直径一般约 为10-5000μm，通常约为20-1000μm，更通常约为50-500μm。各位点的表面积至 少约为100μm2，通常至少约为200μm2，更通常至少约为400μm2，该表面积可能 在25mm2以上，总的来讲不超过约5mm2，通常不超过约1mm2。 阵列特征

本发明阵列的特征是大量上述位点稳固地与固相载体的表面结合。阵列上探 针位点的密度以及全部探针性和非探针性核酸位点的密度(下文将更详细地描述后 者)可以有很大的变化。本文所用术语核酸位点指阵列表面上由核酸组成的任何位 点，因此这类位点包括探针性核酸位点和非探针性核酸位点。固相载体表面上的 核酸位点至少约为5/cm2，通常至少约为10/cm2，可能在1000/cm2以上，但是在 许多实施例中，该值不超过约1000/cm2，并且在这些实施例中通常不超过约400/cm2 或400/cm2，而在某些实施例中不超过约300/cm2。这些位点可以以空间限制和物 理上可寻址的方式排列，以任何方便的模式交叉或覆盖于阵列表面上，如以形成 格栅的行和列排列、以圆形模式等，通常，位点的模式是在固相载体表面上交叉 形成格栅的形式。

在本发明阵列中，该模式的位点与固相载体的表面稳固地结合，其中，载体 可以是柔性的或刚性的载体。“稳固地结合”指在杂交和洗涤条件下位点上的寡 核苷酸维持与固相载体的相等位置。因而，可以在本领域熟练技术人员周知的技 术基础上使组成这些位点的寡核苷酸与载体表面以非共价或共价方式稳固地结 合。非共价结合的例子包括非特异性吸附、基于电子静电力的结合(如离子、离子 对相互作用)、疏水相互作用、氢键相互作用、通过特异性结合配体共价连接到载 体表面的特异性结合等。共价结合的例子包括位点寡核苷酸与刚性载体表面上的 功能性基团如-OH之间形成的共价键，其中，该功能性基团可以是天然产生的基 团，或者是以导入的连接基团呈现的基团。在许多较佳实施例中，阵列表面上组 成这些位点的核酸或至少探针性位点的长寡核苷酸与载体表面共价连接，如通过 探针上的部分(如胸苷碱基)和基质表面之间形成的共价连接等。

如上面所述，阵列存在于柔性或刚性基质上。柔性指载体能够弯曲、折叠或 进行类似的操作而不断裂。本发明柔性固相载体的固体物质例子包括膜、柔性塑 料膜等。刚性指载体是固体并且不容易弯曲，即载体是非柔性的。因此，本发明 阵列的刚性基质在实验条件下足以给存在于其上的聚合的靶标提供物理的支撑和 结构，尤其是在高通量处理条件下。此外，当本发明的刚性载体弯曲时，它们易 于断裂。

其上存在本发明阵列中的本发明模式的位点的固相载体可采取许多构型，从 单一的到复杂的，具体取决于该阵列的预期用途。因而，该基质可以是完全的片 状或盘状构型，如长方体或圆盘形。在许多实施例中，该基质是长方体横截面形， 长约10-200mm、一般约40-150mm、更一般长约75-125mm，宽约10-200mm、 一般约20-120mm、更一般宽约25-80mm，厚约0.01-5.0mm、一般约0.1-2mm、 更一般约0.2-1mm。因而，在一个代表性实施例中，该载体是微滴定板形式，大 小约为12×85mm。在另一代表性实施例中，该载体是标准显微镜载片，大小约 为25×75mm。

可使用许多材料制作本发明阵列的基质。理想的是，用来制作基质的材料在 杂交事件中具有低水平的非特异性结合。在许多情况中，使用对可见光和/或UV 透明的材料也是较佳的。对于柔软的基质，感兴趣的材料包括修饰的和未修饰的 尼龙、硝基纤维素、聚丙烯等，其中在此实施例中特别感兴趣的是尼龙膜及其衍 生物。对于刚性基质，感兴趣的特殊材料包括玻璃，塑料如聚四氟乙烯、聚丙烯、 聚苯乙烯、聚碳酸酯和它们的化合物等，金属如金、铂等，等等。还感兴趣的是 复合材料，如包了膜的玻璃或塑料，如尼龙或硝基纤维素等。

本发明阵列的基质含有至少一个存在该模式的位点的表面，该表面可以是光 滑的或基本上平坦，或者是不规则的，如凹下或凸起。可使用一种或多种不同的 化合物层修饰存在该模式的位点的表面，以所需的方式修改该表面的特性。这种 修饰层在存在时一般有单分子层厚度到约1mm厚，通常有单分子层厚度到约 0.1mm厚，更通常有单分子层厚度到0.001mm厚。感兴趣的修饰层包括无机层和 有机层，如金属、金属氧化物、聚合物、小有机分子等。感兴趣的聚合层包括肽 层、蛋白质层、聚核酸层或它们的类似物，如肽核酸等，多糖、磷脂、聚氨基甲 酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳撑硫化物、聚硅氧烷、 聚酰亚胺、聚乙酸酯、聚丙烯酰胺等，其中，该聚合物可以是杂聚物或均聚物， 可以具有或不具有分离的功能性部分连接在其上面，如共轭的。

基质上位点的总数可以改变，这将根据个人希望在其表面上含有不同寡核苷 酸探针位点(寡核苷酸探针组合物)的数目、以及非探针位点如对照位点、定向位 点、校准位点等的数目而变，同样也可根据可能使用本发明阵列的具体应用而改 变。通常，存在于该阵列表面上的模式将含有至少约10个不同的核酸位点，一般 至少含有约20个核酸位点，更一般约含有50个核酸位点，其中，核酸位点的数 目可以为10000以上，但通常不超过约5000个核酸位点，更通常不超过3000个， 在许多例子中不超过2000个。在某些实施例中，较佳的是每个不同的探针位点或 探针组合物以双份存在，即这样针对给定靶标阵列上将具有两份探针位点。在某 些实施例中，呈现于阵列表面上的各靶标仅仅由单一类型的寡核苷酸探针呈现。 换言之，阵列上针对给定的呈现于其上的靶标的所有寡核苷酸探针具有相同的序 列。在某些实施例中，位点的数目约为200-1200个。阵列中存在的探针位点的数 目一般占该阵列上核酸位点的总数的相当大比例，以数量计，在许多实施例中， 探针位点至少约占阵列中核酸位点总数的50％、一般至少约为80％、更一般至少 约为90％。同样，在许多实施例中，阵列上探针位点的总数约为50-20000，一般 约为100-10000，更一般约为200-5000。

在本发明的阵列中(尤其是那些设计使用在高通量应用的阵列，如高通量分析 应用)，该阵列可存在单一模式的寡核苷酸位点，或者该阵列可含有多种不同的寡 核苷酸位点模式，各模式如上所定义。当存在多种不同寡核苷酸位点模式时，这 些模式可以彼此相同，这样该阵列表面上含有两种或多种相同的寡核苷酸位点模 式；或者该寡核苷酸位点模式可以不同，如在其表面上存在两种或多种不同类型 靶核酸的阵列，比如具有与人基因相对应的位点模式和与鼠基因相对应的位点模 式的阵列。对于存在大量位点模式的阵列，不同位点模式的数目至少为2个，一 般至少为6个，更一般至少为24个或96个，其中，不同模式的数目一般不超过 384个。

对于在其表面上含有大量寡核苷酸位点模式的阵列，它较佳含有大量的反应 室，其中，各个室具有与寡核苷酸位点模式结合的底部表面和至少一面壁，通常 大量的壁围绕着底部表面。例如参见美国专利5545531，该专利的公开纳入本文 作为参考。在许多实施例中特别感兴趣的阵列是在其表面上有复制了24或96个 不同反应室的相同模式的位点交叉的阵列。

在阵列上位点的任何给定模式中，可以存在对应于给定靶标的单一位点，或 多种对应于相同靶标的不同位点，其中，当存在多种对应于相同靶标的不同位点 时，各位点上对应于相同靶标的探针组合物可以相同或不同。换言之，大量不同 的靶标呈现在该模式的位点中，各靶标可以对应于单一的位点或多种位点，其中， 对应于相同靶标的多种位点中的寡核苷酸探针组合物可以相同或不同。当阵列中 存在对应于相应靶标的多种(相同或不同组合物的)位点时，这些种类的位点的数 量至少约为2，可以为10，但一般不超过5。但是，如上面所述，在许多较佳实 施例中，任何给定的靶核酸仅由单一类型的探针位点呈现，它可能在阵列表面上 仅呈现一次或多次，如呈现两次、三次等。

呈现在阵列上的不同靶标的数目至少约为2，一般至少约为10，更一般至少 约为20，其中，在许多实施例中，呈现在阵列上的不同靶标如基因的数量至少约 为50，更一般至少约为100。呈现在阵列中的不同靶标的数目可以高达5000或更 高，但在许多实施例中一般不超过3000，更一般不超过2500。一个靶标，如果它 能与阵列上的一个或多个探针组合物杂交，则认为它被呈现在该阵列中。

本发明的另一特征是每条不同的长寡核苷酸探针对它们各自的靶标的相对结 合效率基本上相同，这样阵列上任何两种不同的长寡核苷酸探针对它们各自的靶 标的结合效率之间的差异不会超过约20倍，一般不超过约15倍，更一般不超过 约10倍，其中，在许多实施例中，结合效率之间的差异不超过约5倍，较佳不超 过约3倍。

在本发明某些较佳实施例中，阵列中含有长寡核苷酸探针组合物的各个探针 位点对应于相同的基因，即都具有一些共同特征的基因，或基于一些共同的特征 如器官、组织的种类或细胞来源、功能性角色、疾病关系等而划分在一起的基因。 在这个实施例中，对应于阵列上不同探针位点的各不同靶核酸是相同的类型，即 是相同类型的基因的编码序列。因此，本发明此实施例的阵列是个特殊的阵列类 型。本发明提供了许多特殊的阵列类型。感兴趣的特殊的阵列类型包括人、癌症、 凋亡、心血管、细胞周期、血液、小鼠、人应激、小鼠应激、致癌基因和肿瘤抑 制剂、细胞-细胞相互作用、细胞分裂素和其受体、大鼠、大鼠应激、血液、小鼠 应激、神经生物学等。

对于对应于基因的特殊类型或种类的寡核苷酸探针，类型或种类可指多种不 同的特征性特征，这些特征包括种类特异性基因，其中，感兴趣的特殊种类包括 真核生物(如小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类动物、人等)、功能特异性基因(这些基 因包括致癌基因、凋亡基因、细胞分裂素、受体、蛋白质激酶等)、对具体生物过 程特异的或涉及这些过程的基因(如凋亡、分化、应激反应、老化、增殖等)、细 胞机制基因(如细胞周期、信号传导、毒性化合物的代谢等)、与疾病相关的基因(如 涉及癌症、精神分裂症、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、病毒-宿主相互作用和 传染病等的基因)、位点特异性基因(其中，位点包括器官，如心脏、肝、前列腺、 肺等)、组织(如神经、肌肉、结缔组织等)、细胞(如轴突、淋巴细胞等)或亚细胞 位置(如细胞核、内质网、高尔基复合体、内涵体、溶酶体、过氧化物酶体、线粒 体、细胞质、细胞骨架、质膜、细胞外空间、染色体特异性基因)、随着时间而改 变表达水平的特殊基因(如在疾病的发展过程中以不同水平表达的基因，包括在前 列腺癌的发展期诱导或表达的前列腺基因)。

除了含有该寡核苷酸探针组合物的寡核苷酸位点(即寡核苷酸探针位点)外， 本发明阵列可以含有一种或多种额外的多核苷酸或核酸位点，这种位点不与上述 靶核酸对应，例如呈现在阵列是特殊类型的那些实施例的阵列上的基因类型或种 类的靶核酸。换言之，阵列可含有一种或多种非探针核酸位点，这些位点由非“独 特”寡核苷酸或多核苷酸，即普通的寡核苷酸或多核苷酸组成。例如，阵列中可 提供含有基因组DNA的位点，这些位点可用作取向标记。可以存在含有质粒和 噬菌体基因、从相同或另一物种得到的不表达也不与cDNA靶交叉杂交的基因等 的位点，并将其用作阴性对照。此外，可以存在含有与得自相同或另一物种的管 家基因或其它对照基因互补的大量寡核苷酸的位点，在使用阵列检测样品中杂交 信号强度的mRNA丰度和标准的归一化中使用该位点。阵列中还可存在取向位 点，这些位点被用来简化杂交模式的影像分析。其它类型的位点包括用于校准或 定量标准的位点、用于RNA模板(靶)完整性的对照、用于靶的制备效率措施(如 标记、纯化和杂交的效率)的对照等。后一类型的这些位点与寡核苷酸探针位点有 区别，即它们不是探针位点。     阵列制备

可采用任何方便的方法制备本发明阵列。制备本发明阵列的一个方法是，首 先合成各位点的寡核苷酸，接着将该寡核苷酸沉积到载体表面上作为位点。可采 用任何方便的方法制备该寡核苷酸，其中特别感兴趣的是使用亚磷酰胺的化学合 成方法或类似的方法，这些方法不使用聚合酶，将单个碱基依次加入，如固相自 动合成方法等，本领域熟练技术人员周知这些方法。

在确定探针组合物中的特殊寡核苷酸时，应选择能与靶核酸区域或基因的独 特序列杂交的寡核苷酸。可使用不同的方法选择与寡核苷酸探针杂交的基因的独 特区域。因而，人们可使用基于感兴趣基因的可获得性的任意方法。但是，也可 采用合理的设计方法替代基于感兴趣基因的可获得性的任意方法来选择用于杂交 阵列的最佳的序列。较佳的是，在下述标准的基础上选择制备寡核苷酸探针中所 选择的基因的区域。首先，选择作为靶特异性的序列应产生不与存在在阵列上、 不与该靶基因对应的其它位点的任何其它寡核苷酸探针发生交叉杂交或相同源的 寡核苷酸探针。第二，应选择与其它任何基因中的核苷酸序列的同源性低的寡核 苷酸探针的序列，而不论该基因是否存在于得自相同来源物种的阵列上。这样， 被避免的基因包括：高表达的基因产物、结构性RNA、用阵列进行检测的RNA 样品中发现的重复序列和载体中发现的序列。另一考虑是选择具有最少或没有次 级结构、具有进行最佳杂交但非特异性结合低的结构、具有相同或类似的热稳定 性和最佳杂交特征的序列。最后一个考虑是选择产生与其对应靶标有效地杂交并 且不发生大量的非特异性杂交事件的探针的探针序列。最后，阵列上所有的探针 序列较佳为与它们的对应探针的杂交效率基本上相同的序列，其中，任何两个探 针与它们的对应靶标之间的杂交效率的差异较佳不超过约10倍，更佳不超过约5 倍，最佳不超过约3倍。

可采用任何方便的方法设计或鉴别出符合上述标准的探针。一个代表性的方 法包括下述算法或步骤，这些规则或步骤是本发明的一部分。在选择本代表性算 法或步骤的探针时，首先在序列同源性研究算法(在未授权申请09/053375中有详 细描述，该申请的公开本文纳入作为参考)的基础上鉴别独特的基因特异性或靶特 异性序列(每个基因的一个或多个区域)。在这个步骤中，为了选择对即将呈现在 阵列上的各mRNA或靶标独特的mRNA片段，在GenBank中寻找所有在即将制 备的阵列上呈现的基因的序列和所有沉积的序列。独特的序列定义为至少不与阵 列上任何其它序列具有显著同源性的序列。例如，对鉴别合适的长80个碱基的独 特序列感兴趣的，可以选择与阵列上任何其它探针的任何连续40个碱基不具有超 过80％同源性的序列。这个步骤一般得到相对于鉴别用于各特异性靶标的可能序 列的原始种类减少了的候选探针序列。

在这些种类减少的候选序列中，使用筛选标准进行筛选，以排除不是最佳的 序列，在该步骤中被排除的序列包括：(a)具有强的次级结构或自身互补(例如长 发夹)的序列；(b)GC含量非常高(超过70％)或非常低(少于40％)的序列；(c)具 有长的(超过6个)相同连续碱基或长的富含一些基元、嘌呤或嘧啶或特殊碱基如 GAGAGAGA…、GAAGAGAA等的序列。这个步骤得到种类进一步减少的候选 探针序列。

下一步，选择具有类似的熔化温度或热力稳定性的序列，这种序列在与靶核 酸的杂交实验中具有类似的性能。感兴趣的是能参与形成双链、熔化温度超过65 ℃、一般至少约为75℃、更一般至少约为80℃的探针的鉴别。

本代表性设计步骤中的最后一步是，从余下的序列中选出具有低水平非特异 性杂交和与互补的靶分子具有类似的高效率杂交的序列。实施下列步骤实现这个 最后的选择：

1.使用上述步骤鉴别的针对各靶标的余下探针，可采用下述方法从实验上 表征其杂交效率和参与非特异性杂交事件的倾向性，这些余下的探针一般包括至 少1个可能的探针、通常至少有2个可能的探针，更通常有至少3个可能的探针。

2.首先，制备在最终的阵列上至少呈现一部分针对各靶标的候选探针的阵 列。例如，将已鉴别出的针对特殊的靶序列的3个候选探针连接到固相载体的表 面上，连同针对其它靶标的候选探针一起产生实验探针阵列。

3.接着，制备标准对照靶标组，其中，该组中各靶标与阵列中的一个探针 序列互补，并且该组中不同靶标构建物以类似或相同的量混合。对照靶标组中靶 标的数目一般少于阵列中探针的数目。通常，对照组中靶标的数目是阵列表面上 实验探针的50-90％，但可以是10-100％。因此，实验阵列上不是所有的探针序 列在靶标对照组中都有对应的或互补的的靶标。例如，对于已鉴别出针对10种不 同mRMNA靶标中每一种的3种候选探针，可制备具有30种不同寡核苷酸探针 的实验探针阵列。接着，生产包括对应于呈现在阵列上10种不同mRNA靶标中 的5种的对照组靶标核酸，其中，对照组包括与呈现在该对照组中5个不同mRNA 中的1个对应的各不同探针互补的靶标，即对照组包括15个不同的靶标——阵列 上对应于呈现在对照组中的5个不同mRNA的15个探针中的每一个有1个针对 它的靶标。(虽然使用对应于少于阵列上所有探针的靶标种类描述上述方法，这样 可以检测非特异性杂交，但是也可使用其它方法。例如，可使用一类对应于阵列 上所有的探针的靶标，其中，至少有一部分靶标与余下的部分不同，如在标记、 质量等方面不同。杂交后，可检测到杂交到各探针上的靶标，可测定针对其真正 靶标的探针的效率及其进行非特异性杂交的倾向性)。

4.在产生对照组的靶标后，在严格的条件下使该对照组与实验探针阵列杂 交，并检测杂交信号。使用在杂交溶液中具有对应的标记互补靶标的这些探针的 信号强度作为测定该探针的杂交效率的方法，以及针对不同靶标的不同候选探针 的杂交效率的差异。对于阵列上那些在对照组中没有互补的标记靶标序列的探针， 使用由这些探针中的每一条产生的杂交信号强度来确定表征这些探针的非特异性 杂交。

5.为了获得关于杂交效率以及针对阵列上候选探针的各个候选物的非特异 性杂交的水平的全面信息，使用一种或多种额外的靶核酸对照组重复进行上述步 骤。在此步骤中使用的不同的对照靶标组的数量一般至少为2个，更一般至少为 4个，最一般至少为10个。

6.从上述的步骤中，鉴别出满足下述标准的探针序列，将其用作本发明阵 列的长寡核苷酸探针。首先，鉴别出对它们的对应靶标的杂交效率高的候选探针。 在许多实施例中，鉴别出对它们各自靶标具有基本上相应的杂交效率的候选探针。 其中，如果任何两个探针对它们各自靶标的杂交效率的差异不超过10倍，则认为 这两个探针具有基本上相同的杂交效率，该差异小于约5倍并且常小于约3倍较 佳。在这些已鉴别的探针中，排除了具有显著的交叉杂交或非特异性杂交的探针， 其中，具有小于该探针和它的对应靶标之间的基因特异性杂交的水平的至少5倍、 更通常20倍、最通常50倍的非特异性杂交的探针在此步骤中被排除。换言之， 在上述杂交实验中，那些信号少于由探针和它们的互补靶标产生的信号的5倍、 一般至少少于20倍、更一般少于50倍的探针被排除，因为它们具有不可接受的 参与非特异性杂交事件的高倾向性。

使用上述算法或步骤设计存在于本发明阵列上的长寡核苷酸探针。如果在第 一轮选择用于特殊靶标的探针时没有鉴别出阵列候选探针，那么可重复进行步骤 1-6。一旦鉴别出该探针的设计或序列，可采用任何方便的方法合成长寡核苷酸探 针，如上面所述的用亚磷酰胺方法。

在合成本发明长寡核苷酸探针之后，使该探针稳固地连接在固相载体上。这 一部分的制备过程一般涉及探针如探针的溶液在基质的表面上的沉积，其中，沉 积过程可以与共价连接步骤一起进行，或者分开进行，这取决于探针怎样稳固地 连接到基质的表面上，如经由电子静电相互作用、共价键等。可采用任何方便的 方法将所制备的寡核苷酸存放到载体上，这些方法包括人工技术(如使用微型移液 管、喷墨、针头等)和自动方法。特别感兴趣的是自动定点设备的使用，如BioGrid Arrayer(Biorobotics)。

在需要时，可使用多种方法将该长寡核苷酸共价连接到基质的表面上。例如， 可将功能活性基团如氨基等导入寡核苷酸的5′或3′端，然后使这些导入的官能团 与基质上的活跃的表面基团反应，产生共价连接。在某些较佳的实施例中，使用 下述方法将该长寡核苷酸探针共价连接到基质的表面上。在此方法中，探针在变 性条件下共价连接到基质表面上。一般而言，制备各探针的变性组合物，然后将 其沉积基质的表面上。变性组合物指存在在组合物中的探针分子不具有次级结构， 如通过自身杂交或与组合物中的其它分子杂交。变性组合物一般是液态组合物， 可以是抑制互补的核苷酸碱基之间的形成氢键的任何组合物。因而，感兴趣的组 合物是那些包括变性剂如脲、甲酰胺、硫氰化钠等的组合物，以及高pH值(如 12-13.5、一般为12.5-13)或低(如1-4，一般为1-3)的溶液等。在许多较佳实施例 中，该组合物是长寡核苷酸的强碱性溶液，该组合物含有碱，如氢氧化钠、氢氧 化锂、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化四甲铵、氢氧化铵等，这些组合物的量足以 使该组合物具有高pH值，如12.5-13.0。组合物中长寡核苷酸的浓度一般约为 0.1-10μM，通常约为0.5-5μM。将变性组合物中的长寡核苷酸沉积到基质表面上 后，将该存放的探针暴露在足够波长(如250-350nm)的UV辐照中，以使该沉积的 探针与基质的表面交联。本方法使用的辐照波长一般约为50-1000摩焦耳，通常 约为100-500摩焦耳，暴露持续时间一般约为20-600秒，通常约为30-120秒。

采用上述共价连接方法产生长寡核苷酸探针与基质表面在探针的一个或多个 连接位点上的随机共价连接，如上面所述，通过在该寡核苷酸的一个或多个末端 加入寡dT区域可任选地增强这种连接。上述方法一个重要的特征是在本发明方 法中不使用天然产生的寡核苷酸上不存在的活性部分如氨基。因此，本发明方法 适合使用不含有天然产生的核酸上不存在的部分的寡核苷酸。

上述共价连接方法可使用多种不同类型的基质。因而，上述方法可使用固相 载体，如玻璃、塑料、膜如尼龙等。可修饰该表面，或不修饰。例如，尼龙表面 可以带中性电荷或正电荷，这些表面可从大量的商业来源获得。在许多实施例中 的玻璃表面被修饰，如被修饰成带有活性官能团如氨基、异硫氰酸苯酯等。 使用本发明阵列的方法

本发明阵列可使用在多种不同用途中，在这些用途中，感兴趣的是检测靶核 酸和阵列上的探针之间的一件或多件连接事件的发生，以及之后描述连接事件的 发生与样品中靶标的存在之间的联系。通常，在其量足够样品中的所有靶标与阵 列上存在的互补寡核苷酸结合的条件下，该设备将与怀疑含有靶标的样品接触。 通常样品是液体样品，通过将适当体积的该液体样品倒到阵列表面上而实现接触， 其中，可通过输送通道、直接接触、沉积等类似方法将样品倒入。 标记的靶标的产生

可采用本领域已知的方法产生靶标，可将mRNA标记并且直接用作靶标， 或将其转化成标记的cDNA靶标。或者，过量地与阵列上的探针互补的合成的标 记寡核苷酸靶标可与mRNA杂交，接着从杂交部分中分离出任何未结合的靶标或 分离出杂交的部分。然后将杂交的部分杂交到阵列上，以揭示获得该mRNA的细 胞来源的表达模式。一般地，直接使用化学的、光化学的或酶的活性标记化合物 如光生物素(Clontech，Palo Alto，CA)、Dig-Chem-Link(Boehringer)等非特异性地(随 机地)标记mRNA。在另一种方法中，可将mRNA的与探针互补的序列特异性地 标记。可使用额外的标记寡核苷酸(或类似物)与侧接探针互补序列或互补的探针 序列的靶序列的共价或非共价连接实现这种特异性的标记。可从非杂交部分中纯 化或分离出标记的寡核苷酸与mRNA的杂交部分，然后使其杂交到阵列上。通常， 产生标记的cDNA探针的方法包括寡核苷酸引物的使用。可以使用的引物包括如 PCT/US98/10561所述的寡dT、随机引物如随机六聚体和基因特异性引物，本文 纳入该申请的公开作为参考。

当使用基因特异性引物时，该基因特异性引物较佳是那些对应于阵列上不同 寡核苷酸位点的引物。因而，较佳使用针对存在于阵列上的各不同寡核苷酸的基 因特异性引物，这样如果该基因在所分析的特殊的细胞或组织中表达，那么标记 的靶标将从该基因的样品中产生。通过这种方法，如果阵列上特殊的基因在特殊 的样品中表达，则将产生适当的靶标并且接着可将其鉴别。对于阵列上的各靶标， 可使用单一的基因特异性引物或多种不同的基因特异性引物，当使用多种引物来 产生靶标时，其数目一般不超过约3。通常，在从模板核酸如mRNA中制备靶标 时，基因特异性靶标将杂交到该模板的下游区域，探针与该区域是同源的，如探 针是互补的或具有相同的序列。寡核苷酸探针序列到引物结合位点的距离一般不 超过约500nt，通常不超过约300nt，更通常不超过约200nt。但是，在某些实施 例中，该基因特异性引物可与寡核苷酸探针部分或全部互补。可通过PCR使用噬 菌体编码的RNA聚合酶转录dsDNA，将cDNA探针进一步扩增或者转化(线性扩 增)。参见PCT/US98/1056，本文纳入该申请的揭示作为参考。

在许多实施例中，在此步骤中产生的靶标是缺乏如由定向分子内相互作用如 氢键制备得到任何次级结构的线性靶标。但是，在某些实施例中，可能需要产生 受到构象限制的受限靶标，如在使用该靶标的杂交条件下形成发夹环结构的靶标。 产生发夹环结构的一个方法是使用含有除了酶促靶标产生步骤中的引导序列外还 有锚定序列的引物。引物的锚定功能区是该引导功能区的5′端，它是与远离靶标 合成期间产生的5′端的cDNA第一链的区域互补的功能区，其中，与锚互补的5′ 远端区域与cDNA的5′端足够远，这样cDNA形成了发夹环结构，在该结构中， 锚定序列与之互补的5′远端区域的锚定序列形成了其结构。一般选择引物的锚定 功能区的序列以提供一环结构，该环一般约为20-200nt，通常约为30-100nt，更 通常约为40-80nt。下式描述了用来产生这些引物的发夹环靶标：

                           5′-NxNp-3′ 其中

N是dGMP、dCMP、dAMP和dTMP；

p是12-35的整数，一般为15-30，更一般为18-25，这样Np是引物的引导 功能区，并且可以是如上述的基因特异性功能区，或者是寡dT功能区；

x是3-30的整数，一般为5-20，更一般为5-15，其中，Nx是锚定功能区， 与和作为靶标呈现的感兴趣mRNA互补的cDNA第一链的5′远端区域互补。

可采用大量不同的方法产生标记的靶核酸，如采用本领域所周知的方法，这 些方法一般依赖于使用该原始引物的标记靶标的酶促发生。可使用标记的引物产 生标记的靶标。或者，为了获得标记的靶标，可在第一链合成期间或酶促标记步 骤中掺入标记物。PCT/US98/10561中描述了产生标记靶标的的代表性方法，本文 纳入该申请的全文作为参考。 杂交和检测

如上面所述，在从感兴趣的组织或细胞中制备靶核酸之后，在杂交条件下使 该靶核酸与阵列接触，其中，可根据需要调整这些条件，以提供从所进行的具体 实验的角度看最佳的特异性水平。本领域熟练的技术人员周知合适的杂交条件， 在Maniatis等人(同上)和WO 95/21944中有综述。在许多实施例中特别感兴趣的 是杂交期间严格条件的采用，即从特异性探针-靶标杂交的速率、产率和稳定性以 及产生最少非特异性探针/靶标相互作用的角度看最优的条件的使用。本领域熟练 技术人员熟知严格条件。在本发明中，严格条件的一般特征为温度小于特征靶标 二聚体的熔化温度15-35℃、一般小于20-30℃，其中，熔化温度取决于多种参数， 如温度、缓冲组合物、探针和靶标的大小、探针和靶标的浓度等。因而，杂交的 温度一般约为55-70℃、通常约为60-68℃。在变性剂的存在下，该温度可以液为 35-45℃、一般约为37-42℃。严格条件可进一步表征为杂交缓冲液的存在，其中， 该缓冲液具有以下一种或多种特征：(a)具有高盐浓度，如3-6×SSC(或具有类似 浓度的其它盐类)；(b)存在去污剂，如SDS(0.1-20％)、triton X100(0.01-1％)、monidet NP40(0.1-5％)等；(c)其它添加剂，如EDTA(一般为0.1-1μM)、氯化四甲铵；(d)促 进剂，如PEG、硫酸葡聚糖(5-10％)、CTAB、SDS等；(e)变性剂，如甲酰胺、 脲等；等等。

在使用上述阵列分析得自两种或多种生理来源的标记靶核酸的种类差异时， 在某些实施例中，在杂交的条件下、较佳在严格杂交的条件下使各类标记的靶核 酸分别与相同的特征阵列接触或一起与相同的阵列接触，这样标记的靶核酸杂交 到基质表面上的互补探针上。在另外一些实施例中，如申请号为09/298361(本文 纳入该申请的公开作为参考)所述，使标记的靶核酸与可区分的标记的标准或对照 靶核酸混合，接着将此混合物杂交到阵列表面上。

对于所有靶序列都含有相同的标记物的情况，将使用针对各种生理来源的不 同阵列(其中，不同包括在不同时间使用相同阵列)。或者，当针对被检测的各不 同生理来源的靶标的标记不同和可区别时，出现在相同时间使用针对各不同靶标 种类的相同阵列的机会。本领域周知的可区别的标记物的例子包括：两种或多种 不同发射波长的荧光染料(如Cy3和Cy5)、两种或多种具有不同发射能量的同位 素(如32P和33P)、具有不同散射光谱的金或银颗粒、在不同处理条件下(如温度、 pH、另外的化学制剂的处理等)产生信号的标记物或者在处理后不同时间点产生 信号的标记物。使用用于信号产生的一种或多种酶考虑到在酶(碱性磷酸酶/过氧 化物酶)的不同基质特异性的基础上更大范围的可区别的标记物的使用。

在杂交后，通常通过洗涤从载体表面除去未杂交的标记核酸，获得杂交核酸 在基质表面上的模式。本领域熟练技术人员周知并且可使用多种洗涤液。

所得的标记核酸的杂交模式可能是可视的，或者采用多种方法可以检测到， 对靶核酸的特殊标记物选择特殊的检测方法，其中，代表性的检测方法包括闪烁 计数法、放射自显影、荧光测量、比色分析、光发射测量、光散射等。

在检测或目测后，可将杂交模式相互比较，以鉴别各模式之间的差异。对于 使用其各不同探针对应于已知基因的阵列的情况，任何差异可能与所比较的生理 来源中的特殊基因的差异表达有关。

阵列上适当对照的提供使得可进行更详细的分析，其中，对照针对杂交条件 的变化、交叉杂交、非特异性结合等。因而，如在较佳实施例中，如上面所述给 杂交阵列提供了标准对照。这些标准对照是以已知浓度加到样品中的与对照靶序 列互补的探针。当完全杂交条件差时，该标准对照将显示出反映杂交减少的较小 的信号。相反，当杂交条件好时，该制备对照将提供反映杂交增加的较强的信号。 从而，得自阵列中其它探针的信号对标准对照的信号的归一化提供了针对杂交条 件的变化的对照。还可使用标准对照来调整(如校正)产生于阵列质量、mRNA样 品质量、第一链合成的效率等的差异。通常，用从其它探针测量得到的信号除以 由标准对照产生的平均信号而获得归一化。归一化还可包括针对由于样品制备和 放大产生的变化而进行的校正。可通过用测得的信号除以从样品制备/放大对照探 针获得的平均信号而获得这种归一化。可将所得的值乘以一个常量值，以衡量该 结果。

在某些实施例中，标准对照对于杂交信号的有用的量化常常是不需要的。因 而，在已鉴别出最佳的探针的情况中，由所选择的最佳探针产生的平均杂交信号 提供了一个好的杂交核酸的浓度的定量测量。但是，出于其它目的如考虑到阵列 的质量、mRNA样品的质量等，在这些方法中仍可以使用标准对照。 有用性

在其它应用中，本发明方法可使用于差异基因表达分析。因而，人们可在(a)患 病或正常的组织，如肿瘤或正常组织；(b)不同组织或组织类型；(c)发育阶段； (d)对外部或内部刺激的应答；(e)对治疗的应答等的差异表达分析中使用本发明 方法。因此，本发明阵列可应用于用于药物发现、诊断和研究的大规模表达筛选 中，以及应用于研究特殊的活性剂对特殊细胞中基因的表达模式的影响，其中， 可使用这种信息来揭示药物毒性、致癌性等、环境监控、疾病研究等。 试剂盒

还提供了用于使用本发明设备进行分析结合实验的试剂盒，其中，用于进行 差别基因表达分析实验的试剂盒是较佳的。本发明这种试剂盒至少含有本发明阵 列。该试剂盒还可含有一种或多种额外的用于各种方法中的制剂，如可以是预先 混合或者是分开的用于产生靶核酸的引物、dNTP和/或rNTP；一种或多种独特标 记的dNTP和/或rNTP，如生物素化的或Cy3或Cy5标记的dNTP；具有不同散 射光谱的金或银颗粒；或者其它合成后标记的制剂，如化学上活跃的荧光染料衍 生物；酶，如反转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等；各种不同的缓冲介质， 如杂交和洗涤缓冲液；预制的探针阵列；标记的探针纯化制剂和组分，如旋转柱 等；信号产生和检测制剂，如链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联、化学发光物质或化学 发光基质等。

以阐述性而非限制性的方式给出下述实施例。

                             实施例

在下述实施例中，除非令有说明，否则所有的百分比都是重量百分比，所有 的溶剂混合物比都是体积比。 实施例1——32P-标记的杂交靶标的产生 步骤A.  cDNA合成/标记方法

下述10μl反应物将1μg合成的对照RNA转化成32P-标记的cDNA第一链。

对于各标记反应：

1.制备足够用于标记反应和1个额外反应的主要混合物，以确保足够的体 积。对于各10μl标记反应，混合下述试剂：

  2μl     5×第一链缓冲液(250μM Tris-HCl，pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl2)

  1μl     10×dNTP混合物(500μM dGTP，500μM dCTP，500μM dTTP，5μM dATP)

  4μl     [α-33P]dATP(Amersham，2500Ci/mmol，10mCi/ml)

  1μl     MMLV反转录酶(Amersham，200单位/μl)

  8μl     最终体积

2.在0.5ml PCR试管中混合下述物质：

  1μl(1μl)                 对照s64 RNA

  GGCCA   GGATACCAAA  GCCTTACAGG  ACTTCCTCCT

CAGTGTGCAG  ATGTGCCCAG  GTAATCGAGA  CACTTACTTT

CACCTGCTTC  AGACTCTGAA  GAGGCTAGAT  CGGAGGGATG

AGGCCACTGC  ACTCTGGTGG  AGGCTGGAGG  CCCAAACTAA

  GGGGTCACAT  GAAGATGCTC  TGTGGTCTCT  CCCCCTGTAC

  CTAGAAAGCT  ATTTGAGCTG  GATCCGTCCC  TCTGATCGTG

  ACGCCTTCCT  TGAAGAATTT  CGGACATCTC  TGCCAAAGTC

  TTGTGACCTG  TAGCTGCC(SEQ ID NO：01)

     1μl          基因特异性引物(0.2μM)

  CGGCCAGGATACCAAAGCCTTACAG(SEQ ID NO：02)

通过从对应于人DNA修补蛋白XRCC9(GB登记号U70310)的cDNA片段进 行T7转录合成上面所提供的对照s64 RNA，这在专利申请09/298361中有更详细 的描述，本文纳入该申请的公开作为参考。

3.加入ddH2O，使得最终体积为3μl。

4.混合该内容物，在微量离心机中稍微地旋转该试管。

5.将该试管培育在70℃预热的PCR热循环控制器中2分钟。

6.将热循环控制器温度降至50℃，培育2分钟。

7.在各反应试管中加入8μl主要混合物。

8.使用移液管轻微抽吸使试管中的内容物混合。

9.使试管在50℃PCR热循环控制器中培育20分钟。

10.加入1μl的10×终止混合物(0.1M EDTA，1mg/ml糖原)停止反应。 步骤B. 柱层析

为了纯化从未掺入32P标记的核苷酸和小cDNA片段得到的32P标记的 cDNA，对各试管进行下列操作：

1.从冰箱中取出CHROMA SPIN-200柱(CLONTECH)，使其在室温下温热 约1小时。上下翻转该柱几次，以使凝胶基质完全再悬浮。

注意：检查柱介质中的气泡。如果发现有气泡，则再翻转该柱，使柱缓冲液 (ddH2O)中的基质再悬浮。

2.去除该柱的底部帽，然后慢慢去除其顶部帽。

3.将柱放到1.5ml微离心管中。

4.通过自流作用使水流过柱，直到可看到柱基质中的凝胶珠。柱基质的顶 部应在该柱的0.75ml标记处。如果柱含有的介质不够，可使用其它柱中的介质将 该柱的基质体积调整到0.75ml标记处。

5.弃去收集的水，进行纯化。

6.仔细且慢慢地将样品放到凝胶床的平整表面的中心，在进行下一步骤前， 使样品完全被吸收到树脂床中。不要让任何样品沿着柱内壁流下。

7.加入25μl ddH2O，并使该溶液完全过柱。

8.加入200μl ddH2O，并使该缓冲液完全过柱，直到树脂床上没有液体。

9.将柱转移到干净的1.5ml微离心管中。

10.为了收集第一批组分，将100μl ddH2O加到柱中，并使该水完全过柱。

11.为了收集第二、三和四批组分，重复步骤9和10。

12.将含有组分1-4的试管放到闪光计数器用的空瓶子中(不要将闪光混合物 加到试管或瓶子中)，获得各片段的Cerenkov计数。在氚信道读取整个样品。

13.集中具有最高Cerekov计数的片段(一般为组分2和3)。减小柱和显示少 于峰值片段10％计数的组分(一般为片段1和4)。掺到峰值片段中的总掺入应为2-5 ×106cpm。 实施例2——Amynopropyl玻璃的制备

1.制备洗涤溶液：将200g NaOH溶解在600ml水中，将其体积补足1升(20 ％w/w)。在此溶液中加入1升乙醇，总体积为2升。由此制得10％NaOH在50％ EtOH之后偶感的溶液。在回转振动器中用此溶液过夜洗涤玻璃(载片放在格栅 中)。

2.将带有载片的格栅转移到装有MillliQ水的池中，在振动器中洗涤15-20 分钟，再重复此步骤一次。

3.将载片转移到装有丙酮的池中，在振动器中洗涤15-20分钟。再重复此步 骤一次。除去第一此洗涤用的丙酮，留下第二和第三次洗涤用的丙酮。(当再次进 行此步骤时，用原先第二次洗涤用的丙酮进行第一次洗涤、第三次洗涤用的丙酮 进行第二次洗涤，新的第三次洗涤用新的丙酮进行)。

4.提前制备5％的水在丙酮中的溶液(5％水-95％丙酮)。

5.在最后一次洗涤期间，制备0.5％的氨基丙基三乙氧基硅烷(Sigma，商品 号为A3648)在步骤4的丙酮-水混合物中的溶液。

6.将载片从最后丙酮洗液中转移出来，放到硅烷化溶液中，并在室温下在 环形振动器中培育2小时。

7.将载片转移到MilliQ水中，洗涤20分钟。

8.将载片转移到丙酮中，洗涤20分钟，重复此步骤2次。弃去这些丙酮洗 液。

9.使烘箱预热在110℃。

10.从最后的丙酮洗液中取出带有载片的格栅，并将其转移到预热的烘箱中。 由于在载片和格栅的表面上仍留有一些丙酮，所以气味相当强烈。在将载片放到 烘箱后应打开排气管，并在烘烤的第一个30分钟后可将其关闭。

11.使烘箱在110℃烘烤载片3小时，然后关闭或冷却至室温。过夜进行这 一步骤很方便。

12.烘烤后，使用“硫氰酸酯方法”可容易地印染载片。如果不立即进行该 印染，可将载片放置在干橱柜的干净盒子中。

下述步骤用于制备PDITC载片：

1.制备吡啶和二甲基甲酰胺的混合物(10％吡啶和90％DMF)。制备所需的 量即可。这种混合物不能保存。

2.在搅拌器中以0.1％的浓度(1g每升)将1，4-苯二异硫氰酸酯溶解在吡啶- DMF混合物中。按需制备此溶液，并且仅当进行下一步骤时才制备。这种溶液不 能保存。这种溶液的颜色是浅黄色-绿色。

3.将该溶液倒入槽中，并将带有氨基修饰的载片的格栅转移到该槽的溶液 中。用盖子盖住该槽，以低速度在环形振动器中振动2小时。

4.将带有载片的格栅转移到装有丙酮的槽中，在振动器中洗涤10-15分钟。 重复此步骤2次以上，每进行一次就将格栅转移到装有新的丙酮的槽中。

5.在最后一次洗涤后，立即将带有载片的格栅转移到真空环形中，在室温 下在真空中干燥20-30分钟。真空处理应尽可能地快。

6.将吡啶-DMF混合物以及丙酮洗液弃到可燃性废弃物容器中。

7.将用于储存的载片转移到干橱柜中。确信干橱柜中的干燥剂是好的(呈蓝 色)。 实施例3——寡核苷酸的打印

以100ng每微升的浓度将用于此实验的寡核苷酸溶解在0.1M NaOH中，并 将其印染在PDITC修饰的玻璃表面上。每个位点存放的DNA的量约为5ng。印 染后，在80℃烘烤载片2小时，然后进行UV交联(254nm UV灯)1分钟。 实施例4——阵列的制备

采用上述方法，制备具有表1上述特征的阵列。使用核酸自动合成器制备各 探针寡核苷酸。 阵列位置     探针                                探针序列     A1     s64_2  AC CTAGAAAGCT ATTTGAGCTG GATCCGTCCC TCTGATCGTG ACGCCTTCCT TGAAGAATTT  CGGACATCTC TGCCAAAGTC TTGTGACCTG TAGCTGCCA(NO：03)     A2     s64_2_90  AGAAAGCTATTTGAGCTGGATCCGTCCCTCTGATCGTGACGCCTTCCTTGAAGAATTTCGGACATC  TCTGCCAAAGTCTTGTGACCTGTA(SEQ ID NO：04)     A3     s64_2_80  AGCTATTTGAGCTGGATCCGTCCCTCTGATCGTGACGCCTTCCTTGAAGAATTTCGGACATCTCTG  CCAAAGTCTTGTGA(SEQ ID NO：05)     A4     s64_2_70  ATTTGAGCTGGATCCGTCCCTCTGATCGTGACGCCTTCCTTGAAGAATTTCGGACATCTCTGCCAA  AGTA(SEQ ID NO：06)     B1     s64_2_60  AGCTGGATCCGTCCCTCTGATCGTGACGCCTTCCTTGAAGAATTTCGGACATCTCTGCCA(SEQ  ID NO：07)     B2     s64_2_50  AATCCGTCCCTCTGATCGTGACGCCTTCCTTGAAGAATTTCGGACATCTA(SEQ ID NO：08)     C1     s26_2  AAACCCAGGA AAATACCAAA TCCAGATTTC TTTGAAGATC TGGAACCTTT CAGAATGACT  CCTTTTAGTG CTATTGGTTT GGAGCTGTGG TCCATGACCTA(SEQ ID NO：09)     C2     s26_2_90  AGGAAAATACCAAATCCAGATTTCTTTGAAGATCTGGAACCTTTCAGAATGACTCCTTTTAGTGCT  ATTGGTTTGGAGCTGTGGTCCATA(SEQ ID NO：10)     C3     s26_2_80  AATACCAAATCCAGATTTCTTTGAAGATCTGGAACCTTTCAGAATGACTCCTTTTAGTGCTATTGG  TTTGGAGCTGTGGA(SEQ ID NO：11)     C4     s26_2_70  AAAATCCAGATTTCITTGAAGATCTGGAACCTTTCAGAATGACTCCTTTTAGTGCTATTGGTTTGG  AGCA(SEQ ID NO：12)     D1     s26_2_60  ACAGATTTCTTTGAAGATCTGGAACCTTTCAGAATGACTCCTTTTAGTGCTATTGGTTTA(SEQ  ID NO：13)     D2     s26_2_50  ATTCTTTGAAGATCTGGAACCTTTCAGAATGACTCCTTTTAGTGCTATTA(SEQ ID NO：14)   A5和E5     c370_2  AGGGTCAGCTGATCTACGAGTCTGCCATCACCTGTGAGTACCTGGATGAAGCATACCCAGGGAAGA  AGCTGTTGCCGGATGACCCCTATGAGAAAGCTTG CA(SEQ ID NO：15)   A6和E6     c370_2_90  AAGCTGATCTACGAGTCTGCCATCACCTGTGAGTACCTGGATGAAGCATACCCAGGGAAGAAGCTG  TTGCCGGATGACCCCTATGAGAAA(SEQ ID NO：16)   A7和E7     c370_2_80  AATCTACGAGTCTGCCATCACCTGTGAGTACCTGGATGAAGCATACCCAGGGAAGAAGCTGTTGCC  GGATGACCCCTATA(SEQ ID NO：17)   A8和E8     c370_2_70  ACGAGTCTGC CATCACCTGT GAGTACCTGG ATGAAGCATA CCCAGGGAAG AAGCTGTTGC  CGGATGACCA(SEQ ID NO：18)   B5和F5     c370_2_60  ACTGCCATCACCTGTGAGTACCTGGATGAAGCATACCCAGGGAAGAAGCTGTTGCCGGAA(SEQ  ID NO：19)   B6和F6     c370_2_50  AATCACCTGTGAGTACCTGGATGAAGCATACCCAGGGAAGAAGCTGTTGA(SEQ ID NO：20)     G1     s91_3  AGGCCCCAAA TGGCTGGAAA TCTCGCCTAT TTAGGCATTC TACTCAGAAA AACCTTAAAA  ATTCACAAAT GTGTCAGAAG AGCCTTGATG TGGAAACCGA TA(SEQ ID NO：21)     G2     s91_3_90  ACAAATGGCTGGAAATCTCGCCTATTTAGGCATTCTACTCAGAAAAACCTTAAAAATTCACAAATG  TGTCAGAAGAGCCTTGATGTGGAA(SEQ ID NO：22)     G3     s91_3_80  AGGCTGGAAATCTCGCCTATTTAGGCATTCTACTCAGAAAAACCTTAAAAATTCACAAATGTGTCA  GAAGAGCCTTGATA(SEQ ID NO：23)     G4     s91_3_70  AGAAATCTCGCCTATTTAGGCATTCTACTCAGAAAAACCTTAAAAATTCACAAATGTGTCAGAAGA  GCCA(SEQ ID NO：24)     H1   s91_3_60  ACTCGCCTATTTAGGCATTCTACTCAGAAAAACCTTAAAAATTCACAAATGTGTCAGAAA(SEQ  ID NO：25)     H2   s91_3_50  ACTATTTAGGCATTCTACTCAGAAAAACCTTAAAAATTCACAAATGTGTA(SEQ ID NO：26)     E1   s97_4  ATAGGAGGGG TGAAGCCCAG CTGCTCATGA ACGAGTTTGA GTCAGCCAAG GGTGACTTTG  AGAAAGTGCT GGAAGTAAAC CCCCAGAATA AGGCTGCAAG A(SEQ ID NO：27)     E2   s97_4_90  AGGGGTGAAGCCCAGCTGCTCATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTGAGAAAGTGCTG  GAAGTAAACCCCCAGAATAAGGCA(SEQ ID NO：28)     E3   s97_4_80  AGAAGCCCAGCTGCTCATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTAGAAAGTGCTGGAAGTA  AACCCCCAGAATA(SEQ ID NO：29)     E4   s97_4_70  ACCAGCTGCTCATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTGAGAAAGTGCTGGAAGTAAACC  CCCA(SEQ ID NO：30)     F1   s97_4_60  ATGCTCATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTGAGAAAGTGCTGGAAGTAAAA(SEQ  ID NO：31)     F2   s97_4_50  ATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTGAGAAAGTGCTGGAAA(SEQ ID NO：32)     C5   s74_3  ATATGTAACT GAAGAAGGTG ACAGTCCTTT GGGTGACCAT GTGGGTTCTC TGTCAGAGAA  ATTAGCAGCA GTCGTCAATA ACCTAAATAC TGGGCAAGTG TA(SEQ ID NO：33)     C6   s74_3_90  AAACTGAAGAAGGTGACAGTCCTTTGGGTGACCATGTGGGTTCTCTGTCAGAGAAATTAGCAGCAG  TCGTCAATAACCTAAATACTGGGA(SEQ ID NO：34)     C7   s74_3_80  AAAGAAGGTGACAGTCCTTTGGGTGACCATGTGGGTTCTCTGTCAGAGAAATTAGCAGCAGTCGTC  AATAACCTAAATAA(SEQ ID NO：35)     C8   s74_3_70  AAGTGACAGTCCTTTGGGTGACCATGTGGGTTCTCTGTCAGAGAAATTAGCAGCAGTCGTCAATAA  CCTA(SEQ ID NO：36)     D5   s74_3_60  ACAGTCCTTTGGGTGACCATGTGGGTTCTCTGTCAGAGAAATTAGCAGCAGTCGTCAATA(SEQ  ID NO：37)     D6   s74_3_50  ACTTTGGGTGACCATGTGGGTTCTCTGTCAGAGAAATTAGCAGCAGTCGA(SEQ ID NO：38) 实施例5——33P标记的cDNA靶标与寡玻璃阵列的杂交

1.制备含有0.1％SDS的6×SSC缓冲液。

2.将印染有寡DNA的玻璃载片放到杂交室中，并加入2ml步骤1制备的溶 液。

3. 60℃预杂交30分钟。

4.使标记的cDNA探针(实施例1，约200μl，总计约2-5×106cpm)与10× 变性溶液(1M NaOH，10mM EDTA)的总体积(约22μl)的1/10混合，并在65℃培 育20分钟。然后加入5μl(1μg/μl)的人Cot-1 DNA和等体积(约225μl)的2×中性 溶液(1M NaHPO4，pH7.0)，继续在65℃培育10分钟。

5.将步骤4制备的混合物加到2ml步骤1制备的溶液中。确信两种溶液完 全混合。

6.倒掉预杂交溶液。用步骤5制备的溶液替换。

7. 60℃过夜杂交。

8.小心去除杂交溶液，将该溶液放到适当的容器中。将该玻璃载片放到装 有20ml洗涤液1(2×SSC，0.1％SDS)的洗涤室中。室温下连续搅拌的同时洗涤该 阵列10分钟。重复此操作4次。

9.室温下在连续搅拌的同时在20ml的洗涤液2(0.1×SSC，0.1％SDS)中另 外洗涤10分钟。

10.用镊子从容器中取出cDNA阵列，并振动该洗液。用蒸馏水清洗该阵列， 使其在空气中干燥。

11.在-70℃将该玻璃载片阵列暴露在带有强化屏的X射线膜中。或者使用 磷光计(Molecular Dynamics)。 实施例6——杂交效率实验

使用该阵列和上述方法，使用与各探针互补的32P标记的靶标检测实施例4 所述的阵列上不同长度的各探针的杂交效率。这个实验的结果表示在图1中。该 结果证明长度超过50nt的寡核苷酸探针的杂交效率有显著的提高。

从上述的讨论可明显地看出，本发明阵列在本领域中是个显著的进步。本发 明提供了探针阵列，在该阵列中，所有的探针对它们各自的靶标具有基本上相同 水平的高杂交效率，并且具有最低水平的非特异性杂交。因此，本发明阵列排除 了使用针对感兴趣的每一个靶标的多探针或使用针对每一个靶标的不配对对照探 针的需要，如果不需要其它的阵列形式，这些使用至少是需要的。此外，采用不 是以PCR为基础的方法也可容易地制备此阵列，该制备方法适合用于高通量的生 产。因此，本发明阵列组合了短寡核苷酸阵列的通量生产的益处和在cDNA阵列 中观察到的高特异性的益处。因此，本发明对本领域作出了显著的贡献。

在此说明书中所引用的所有的出版物和专利申请都被纳入本文作为参考，就 像特殊地或单独地指出各单独的出版物或专利申请被纳入作为参考一样。任何出 版物的引用都是其在申请日前的公开部分，而不应认为本发明承认由于现有的发 明而使得本发明不能在这些出版物之前被授权。虽然出于清楚理解的目的，本发 明的前面部分已以阐述和实施例的方式进行了一定程度的描述，但是对于本领域 熟练的技术人员来说，在不偏离所附的权利要求的精神和范围的情况下可对本发 明作出某些改动和修改，这是显而易见的。

                           序列表

                           序列表 <110>A.舍纳契克(Chenchik，Alex)

 A.穆尼什金(Munishkin，Alexander)

 P.西蒙年科(Simonenko，Peter) <120>长寡核苷酸阵列 <130>CLON-015WO <150>09/440829 <151>1999-11-15 <160>38 <170>FastSEQ for Windows Version 4.0 <210>1 <211>293 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>对照寡核苷酸 <400>1 ggccaggata ccaaagcctt acaggacttc ctcctcagtg tgcagatgtg cccaggtaat  60 cgagacactt actttcacct gcttcagact ctgaagaggc tagatcggag ggatgaggcc 120 actgcactct ggtggaggct ggaggcccaa actaaggggt cacatgaaga tgctctgtgg 180 tctctccccc tgtacctaga aagctatttg agctggatcc gtccctctga tcgtgacgcc 240 ttccttgaag aatttcggac atctctgcca aagtcttgtg acctgtagct gcc       293 <210>2 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>2 cggccaggat accaaagcct tacag                                       25 <210>3 <211>101 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>3 acctagaaag ctatttgagc tggatccgtc cctctgatcg tgacgccttc cttgaagaat 60 ttcggacatc tctgccaaag tcttgtgacc tgtagctgcc a           101 <210>4 <211>90 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>4 agaaagctat ttgagctgga tccgtccctc tgatcgtgac gccttccttg aagaatttcg 60 gacatctctg ccaaagtctt gtgacctgta                           90 <210>5 <211>80 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>5 agctatttga gctggatccg tccctctgat cgtgacgcct tccttgaaga atttcggaca 60 tctctgccaa agtcttgtga                      80 <210>6 <211>70 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>6 atttgagctg gatccgtccc tctgatcgtg acgccttcct tgaagaattt cggacatctc 60 tgccaaagta                                                        70 <210>7 <211>60 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>7 agctggatcc gtccctctga tcgtgacgcc ttccttgaag aatttcggac atctctgcca 60 <210>8 <211>50 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>8 aatccgtccc tctgatcgtg acgccttcct tgaagaattt cggacatcta      50 <210>9 <211>101 <212>DNA <213>个人序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>9 aaacccagga aaataccaaa tccagatttc tttgaagatc tggaaccttt cagaatgact 60 ccttttagtg ctattggttt ggagctgtgg tccatgacct a                   101 <210>10 <211>90 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成的寡核苷酸 <400>10 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