【０００１】
本出願は、２０００年１０月１１日に出願された米国仮出願番号６０／２３９，６６０号（これは、本明細書中に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、蛍光色素化合物、およびその結合体および使用に関する。 本発明はまた、改善された電気泳動移動度を有する蛍光ポリヌクレオチド結合体に関する。
【０００３】
（導入）
ポリヌクレオチドの複雑な混合物の分析は、多くの生物学的適用において重要である。 多くの状況下で、例えば、目的の標的ポリヌクレオチドを検出するため、異なる成分の相対量を決定するため、およびヌクレオチド配列情報を得るために、このような混合物の成分を分離することが必要である。
【０００４】
電気泳動は、ポリヌクレオチドを分析するための簡便な方法を提供する。 代表的には、ポリヌクレオチドは、電気泳動移動度の差異に起因して、長さに基づいて分離され得る。 例えば、架橋ポリアクリルアミドのようなマトリクス中で、ポリヌクレオチドは、代表的に、その架橋マトリクスによるサイズ依存性の妨害に起因して、ポリヌクレオチドの長さに反比例する速度で移動する。 遊離溶液中では、ポリヌクレオチドは、それらの実質的に同一の質量荷電比に起因して、実質的に同じ速度で移動する傾向があり、その結果、サイズのみに基づいて異なるポリヌクレオチドを識別することは困難である。 しかし、識別可能な電気泳動移動度は、異なる荷電／質量比を含むポリヌクレオチドを使用して（例えば、ポリヌクレオチド単独の荷電／質量比とは異なる荷電／質量比を有するポリマーまたは他の化学実体をこれらのポリマーに結合することによって）、遊離溶液中で得られ得る（例えば、米国特許第５，４７０，７０５号を参照のこと）。
【０００５】
異なるポリヌクレオチドは、長さまたは分子量に基づいて分離され得る場合、検出は、通常、単一の検出可能な標識（例えば、放射性同位体または蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ））を使用して達成され得る。 しかし、複雑な混合物中において、あるいは異なる配列のポリヌクレオチドが類似または同一の移動度を有する場合、異なるポリヌクレオチドを明確に識別するために、２以上の検出可能な標識を使用することが好ましい。
【０００６】
ＤＮＡ配列決定において、現在、２以上（通常４つ）の異なる蛍光標識を使用して、４つの標準的なヌクレオチド塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、またはそれらのアナログ）のうちの１つで終結する配列決定フラグメントを識別することが慣用的である。 このような標識は、通常、適切に標識された伸長プライマーを使用することによって（ダイ（色素）プライマー法）、または固有の標識を含む非伸長可能ヌクレオチドの存在下でプライマー伸長を行うことによって（サンガージデオキシターミネーター法）、配列決定フラグメントに導入される。 標識された生成物の電気泳動は、溶出時間またはバンド位置に基づいて検出され得るフラグメントのラダーを生じる。
【０００７】
架橋または非架橋マトリクス中の篩条件下で、短いポリヌクレオチドフラグメントは、長いフラグメントよりも迅速に移動する。 通常、フラグメントのバンド間の間隔および移動速度は、長さの増加に比例して段階的に減少する。 しかし、変則的な移動パターンは、尿素のような変性剤の存在下でさえ、フラグメント内の配列依存性の二次構造に起因して生じ得る。 例えば、ポリＧセグメントは、しばしば、これらの領域の配列決定を困難にする、バンドの圧縮を生じる。 この圧縮されたバンド領域は、しばしば、伸長反応においてｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰ（２'−デオキシイノシン−５'−三リン酸）または７−デアザ−ｄＧＴＰのようなヌクレオチドアナログを使用してか、または相補鎖を配列決定することによって、解明され得る。
【０００８】
変則的な移動パターンはまた、検出可能な標識を含むポリヌクレオチドフラグメントについて、ポリヌクレオチド中の標識と１以上の塩基との間の相互作用に起因して生じ得る。 このような相互作用は、その相互作用が配列依存性である場合に特に問題であり得、その結果、同じ長さを有する異なる配列のフラグメントが、有意に異なる移動度を有し得る。 この現象は、配列決定（特に、自動化配列決定法における）のために不都合であり得る。 従って、電気泳動能を改善するための標識された化合物およびその使用方法についての、必要性が存在する。
【０００９】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、以下の形態の色素標識核酸塩基を含む、結合体を提供する：（１）Ｂ−Ｌ−Ｄ（ここで、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌは、アニオン性リンカーであり、そしてＤは、少なくとも１つの蛍光色素を含む）または（２）Ｂ−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｄ２（ここで、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は、リンカーであり、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方がアニオン性リンカーであり、そしてＤ１およびＤ２は、蛍光ドナー／アクセプター対のメンバーであり、Ｄ１およびＤ２の一方が、第１の波長で光を吸収し得、そしてそれに応答して励起エネルギーを放出し得る、ドナー色素であり、そしてＤ１およびＤ２の他方が、そのドナー色素によって放出された励起エネルギーを吸収し得、そしてそれに応答して第２の波長で蛍光を発し得る、アクセプター色素である）。
【００１０】
各アニオン性リンカーは、１以上のアニオン基（例えば、スルホン酸部分、硫酸モノエステル、アニオン性ホスフェート、アニオン性ホスホネート、またはカルボン酸）を含み得る。 １つの実施形態において、Ｌ、Ｌ１またはＬ２は、リン酸ジエステル部分を含み、そのリン原子が、リンカー原子の鎖内（架橋位置）に位置するか、またはリンカー原子の鎖に結合された置換基（非架橋位置）であり得る。 別の実施形態において、リンカーは、モノアニオン性ホスホン酸エステルを含み、これは、リンカー鎖内に位置され得るか、またはリンカー鎖に結合され得る。 他の実施形態は、本明細書中にさらに記載される。
【００１１】
結合体が、形態Ｂ−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｄ２を有する実施形態において、Ｌ１およびＬ２の一方は、非アニオン性リンカーであり得る。 １つの実施形態において、Ｌ１がアニオン性リンカーであり、そしてＬ２が非アニオン性リンカーである。 例えば、Ｌ２が非アニオン性である場合、Ｄ１−Ｌ２−Ｄ２は、以下の構造（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含み得る：
（ａ） −Ｄ１−Ｒ ２１ Ｚ １ Ｃ（Ｏ）Ｒ ２２ Ｒ ２８ −Ｄ２
（ｂ） −Ｄ１−Ｒ ２８ Ｒ ２２ Ｃ（Ｏ）Ｚ １ Ｒ ２１ −Ｄ２
（ｃ） −Ｄ１−Ｒ ２８ Ｒ ２２ Ｒ ２８ −Ｄ２
ここで、Ｒ ２１は、Ｃ １ 〜Ｃ ５アルキルジイルであり、Ｚ １は、ＮＨ、ＳまたはＯであり、Ｒ ２２は、エテンジイル、エチンジイル、１，３−ブタジエンジイル、１，３−ブタジインジイル、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環または６員環、または少なくとも１つの不飽和結合を有する縮合環構造であり、そしてＲ ２８は、Ｄ１またはＤ２にＲ ２２を連結する結合またはスペーサー基（連結セグメントである。別の実施形態において、Ｌ１は、非アニオン性リンカーであり得、その例は、以下である：−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＮＨ−、−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ５ ＮＨ−、−Ｃ＝ＣＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ ２ ） ５ ＮＨ−、−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−、−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ −ＮＨ−、および−Ｃ≡Ｃ（ｐ−Ｃ ４ Ｈ ６ ）ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−。
【００１２】
本発明に従って使用される蛍光色素としては、本発明の目的に適切な任意の蛍光化合物が挙げられ得る。 代表的には、各色素は、第１の波長で光を吸収し、そしてそれに応答して第２の波長で光を放出する、結合体化された系、共鳴非局在化系、または芳香環系を含む。 例えば、色素は、キサンテン、ローダミン、ジベンゾローダミン、フルオレセイン、［８，９］ベンゾフェノキサジン、シアニン、フタロシアニン、スクアライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、またはボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）色素のような、種々のクラスの蛍光化合物のいずれかから独立して選択され得る。
【００１３】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される型の結合体を含む、標識されたヌクレオシド三リン酸を包含する。 １つの実施形態において、その標識されたヌクレオシド三リン酸は、３'伸長可能でない。 例えば、その標識されたヌクレシド三リン酸は、２'，３'−ジデオキシヌクレオチドまたは３'−フルオロ−２'，３'−ジデオキシヌクレオチドであり得る。 別の実施形態において、その標識されたヌクレシド三リン酸は、伸長可能であり、そして３'−ヒドロキシル基を含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、本明細書中に議論される型の結合体を含む、ポリヌクレオチドを包含する。 １つの実施形態において、その結合体は、ポリヌクレオチドの３'末端ヌクレオチドサブユニット中に位置し、そのサブユニットは、伸長可能であっても、伸長可能でなくてもよい。 別の実施形態において、その結合体は、非末端ヌクレオチドサブユニット上に位置する。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、異なる配列の複数のポリヌクレオチドを含む、混合物を提供し、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるような結合体を含む。 １つの実施形態において、その混合物は、異なる配列の少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、その各々は、異なる結合体を含み、その結合されたポリヌクレオチドが同定される。 別の実施形態において、その混合物は、４つのクラスのポリヌクレオチドを含み、ここで、各クラスのポリヌクレオチドは、異なるターミネーターサブユニット型で終結し、そのサブユニット型は、そのクラスのポリヌクレオチドを同定するために、別々の核酸塩基−色素結合体を含む。
【００１６】
本発明はまた、１以上のポリヌクレオチドを同定する方法を包含する。 その方法において、１以上の標識された異なる配列のポリヌクレオチドが形成され、各異なる配列のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるような、固有の結合体を含む。 その１以上の標識された異なる配列のポリヌクレオチドは、サイズに基づいて電気泳動によって分離され、そして１以上の異なる配列のポリヌクレオチドは、電気泳動移動度および蛍光特性に基づいて同定される。
【００１７】
本発明はまた、標識されたポリヌクレオチド鎖を形成する方法を提供し、この方法は、（ｉ）５'突出を有する相補的テンプレート鎖にハイブリダイズされた３'−伸長可能な鎖を含む、二重鎖ポリヌクレオチド、（ｉｉ）テンプレート依存性ポリメラーゼ酵素、および（ｉｉｉ）本明細書中に記載されるような結合体を含む、標識されたヌクレオシド三リン酸を、その結合体を含む標識されたポリヌクレオチドを形成するのに効果的な条件下で一緒に反応させる工程を包含する。 １つの実施形態において、その標識されたヌクレオシド三リン酸は、伸長可能でない。 別の実施形態において、その標識されたヌクレオシド三リン酸は、伸長可能である。
【００１８】
本発明はまた、標的ポリヌクレオチド配列を配列決定する方法を提供する。 この方法において、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な４つのクラスのポリヌクレオチドが、テンプレート依存性プライマー伸長によって形成され、ここで、各クラスのポリヌクレオチドは、異なるターミネーターサブユニット型で終結し、そのサブユニット型は、そのクラスのポリヌクレオチドを同定するために、別々の核酸塩基−色素結合体を含む。 得られたポリヌクレオチドは、サイズに基づいて分離されて移動パターンを獲得し、その移動パターンから、標的ポリヌクレオチド配列の配列が決定され得る。
【００１９】
本発明はまた、本発明の種々の方法を行うためのキットを提供する。 核酸配列決定において、そのキットは、本明細書中に記載される結合体を含む、少なくとも１つの標識されたヌクレオシド三リン酸を備える。 そのキットはまた、以下の成分の１以上を備え得る：３'伸長可能なプライマー、ポリメラーゼ酵素、結合体で標識されていない１以上の３'伸長可能なヌクレオチド、および／または緩衝化剤。 いくつかの実施形態において、そのキットは、伸長可能でない、少なくとも１つの標識されたヌクレオシド三リン酸を備える。 他の実施形態において、そのキットは、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧに相補的であり、その各々が、本明細書中に記載されるような別々の結合体を含む、４つの異なる標識されたヌクレオシド三リン酸を備える。 なお別の実施形態において、その標識されたヌクレオシド三リン酸ンは、伸長可能でない。 別の実施形態において、その標識されたヌクレオシド三リン酸は、伸長可能なリボヌクレオシド三リン酸である。 別の実施形態において、そのキットは、本明細書中に記載される結合体を含む、少なくとも１つの標識された伸長可能でないヌクレオシド三リン酸、および以下の成分の１以上を備える：３'伸長可能なプライマー、ポリメラーゼ酵素、および／または緩衝化剤。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、詳細な説明からより明らかとなる。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、種々の有利な特性を有する新規色素化合物および色素結合体に関する。 本発明は、蛍光核酸分析（例えば、自動化ＤＮＡ配列決定またはＲＮＡ配列決定、フラグメント分析、核酸増幅産物の検出、ハイブリダイゼーションアレイにおけるプローブハイブリダイゼーションの検出、診断試験など）の分野における一般適用を有する。 １つの局面において、本発明は、配列依存性の変則が減少または排除されるような、より一貫性のサイズ依存性電気泳動移動度を有するポリヌクレオチドを提供する。 本発明は、弱いピークシグナルが含まれるべきかまたは排除されるべきかを決定するため、および重複するピークが同じ長さのフラグメントを表すか否かを決定するために、均一なサイズ依存性の電気泳動移動度に依存する自動化配列決定方法における適用を見出す。 本発明はまた、３'色素標識配列決定フラグメントの形成を含む配列決定方法において有用である。 さらに、本発明は、ポリヌクレオチド同定のために絶対的または相対的な移動時間または移動距離に依存する、ポリヌクレオチドの検出方法および同定方法において使用され得る。
【００２２】
（Ｉ．定義）
他に記載されない限り、本明細書中で使用される以下の用語および句が、以下の意味を有することが意図される：
「アルキル」とは、親アルカン、アルケンまたはアルキンの単一の炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される、飽和または不飽和、分枝、直鎖または環状の一価の炭化水素ラジカルをいう。 代表的なアルキル基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：メチル；エチル（例えば、エタニル、エテニル、エチニル）；プロピル（例えば、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イル、シクロプロプ−２−エン−１−イル、プロプ−１−イン−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど）；ブチル（例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、２−メチル−プロパン−１−イル、２−メチル−プロパン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イルなど）；など。 特定の飽和のレベルが意図される場合、命名法「アルカニル」、「アルケニル」および／または「アルキニル」は、以下に定義されるように使用される。 好ましい実施形態において、アルキル基は、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキルである。
【００２３】
「アルカニル」とは、親アルカンの単一の炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される、飽和、分枝、直鎖または環状のアルキルラジカルをいう。 代表的なアルカニル基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：メタニル；エタニル；プロパニル（例えば、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル（イソプロピル）、シクロプロパン−１−イルなど）；ブタニル（例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−プロパン−１−イル（イソブチル）、２−メチル−プロパン−２−イル（ｔ−ブチル）、シクロブタン−１−イルなど）；など。 好ましい実施形態において、アルカニル基は、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルカニルである。
【００２４】
「アルケニル」とは、親アルケンの単一の炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和、分枝、直鎖または環状のアルキルラジカルをいう。 このラジカルは、二重結合について、シス立体構造またはトランス立体構造のいずれであってもよい。 代表的なアルケニル基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エテニル；プロペニル（例えば、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、プロプ−２−エン−２−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イル、シクロプロプ−２−エン−１−イル）；ブテニル（例えば、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イルなど）；など。 好ましい実施形態において、アルケニル基は、（Ｃ ２ 〜Ｃ ６ ）アルケニルである。
【００２５】
「アルキニル」とは、親アルキンの単一の炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、不飽和、分枝、直鎖または環状のアルキルラジカルをいう。 代表的なアルキニル基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない；エチニル；プロピニル（例えば、プロプ−１−イン−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど）；ブチニル（例えば、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イルなど）；など。 好ましい実施形態において、アルキニル基は、（Ｃ ２ 〜Ｃ ６ ）アルキニルである。
【００２６】
「アルキルジイル」とは、親アルカン、アルケンまたはアルキンの２つの異なる炭素原子の各々からの１つの水素原子の除去によって誘導されるか、あるいは親アルカン、アルケンまたはアルキンの単一の炭素原子からの２つの水素原子の除去によって誘導される、飽和または不飽和、分枝、直鎖または環状の二価の炭化水素ラジカルをいう。 ２つの一価のラジカル中心または二価のラジカル中心の各原子価は、同じまたは異なる原子と結合を形成し得る。 代表的なアルキルジイルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：メタンジイル；エチルジイル（例えば、エタン−１，１−ジイル、エタン−１，２−ジイル、エテン−１，１−ジイル、エテン−１，２−ジイル）；プロピルジイル（例えば、プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−２，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、シクロプロパン−１，１−ジイル、シクロプロパン−１，２−ジイル、プロプ−１−エン−１，１−ジイル、プロプ−１−エン−１，２−ジイル、プロプ−２−エン−１，２−ジイル、プロプ−１−エン−１，３−ジイル、シクロプロプ−１−エン−１，２−ジイル、シクロプロプ−２−エン−１，２−ジイル、シクロプロプ−２−エン−１，１−ジイル、プロプ−１−イン−１，３−ジイルなど）；ブチルジイル（例えば、ブタン−１，１−ジイル、ブタン−１，２−ジイル、ブタン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ブタン−２，２−ジイル、２−メチル−プロパン−１，１−ジイル、２−メチル−プロパン−１，２−ジイル、シクロブタン−１，１−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロブタン−１，３−ジイル、ブタ−１−エン−１，１−ジイル、ブタ−１−エン−１，２−ジイル、ブタ−１−エン−１，３−ジイル、ブタ−１−エン−１，４−ジイル、２−メチル−プロプ−１−エン−１，１−ジイル、２−メタニリデン−プロパン−１，１−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，１−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，２−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，３−ジイル、ブタ−１，３−ジエン−１，４−ジイル、シクロブタ−１−エン−１，２−ジイル、シクロブタ−１−エン−１，３−ジイル、シクロブタ−２−エン−１，２−ジイル、シクロブタ−１，３−ジエン−１，２−ジイル、シクロブタ−１，３−ジエン−１，３−ジイル、ブタ−１−イン−１，３−ジイル、ブタ−１−イン−１，４−ジイル、ブタ−１，３−ジイン−１，４−ジイルなど）；など。 特定の飽和のレベルが意図される場合、命名法アルカニルジイル、アルケニルジイルおよび／またはアルキニルジイルが使用される。 好ましい実施形態において、アルキルジイル基は、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキルジイルである。 ラジカル中心が末端炭素にある、飽和非環式アルカニルジイルラジカルもまた好ましい（例えば、メタンジイル（メタノ）；エタン−１，２−ジイル（エタノ）；プロパン−１，３−ジイル（プロパノ）；ブタン−１，４−ジイル（ブタノ）；など（以下に定義されるように、アルキレノとも呼ばれる）。
【００２７】
「アルキレノ」とは、親の直鎖アルカン、直鎖アルケン、または直鎖アルキンの２つの末端炭素原子の各々から１つの水素原子を除去することにより誘導される、２つの一価ラジカル中心を末端に有する、直鎖アルキルジイルラジカルを指す。 代表的アルキレノ基としては、メタノ；エチレノ（例えば、エタノ、エテノ、エチノ）；プロピレノ（例えば、プロパノ、プロプ［１］エノ、プロパ［１，２］ジエノ、プロプ［１］イノなど）；ブチレノ（例えば、ブタノ、ブト［１］エノ、ブト［２］エノ、ブタ［１，３］ジエノ、ブト［１］イノ、ブト［２］イノ、ブト［１，３］ジイノなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。 特定の飽和レベルが意図される場合、命名法アルカノ、アルケノ、および／またはアルキノが、使用される。 好ましい実施形態において、アルキレノ基は、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキレノである。
【００２８】
「ヘテロアルキル、ヘテロアルカニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルカニル、ヘテロアルキルジイル、およびヘテロアルキレノ」とは、１つ以上の炭素原子が各々独立して、同じであるかまたは異なるヘテロ原子基で置換されている、アルキルラジカル、アルカニルラジカル、アルケニルラジカル、アルキニルラジカル、アルキルジイルラジカル、およびアルキレノラジカルを、それぞれ指す。 これらのラジカルに含まれ得る代表的ヘテロ原子基としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｏ−Ｓ−、−ＮＲ'−、＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｏ）Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ'−、−ＰＨ−、−Ｐ（Ｏ） ２ −、−Ｏ−Ｐ（Ｏ） ２ −、−ＳＨ ２ −、−Ｓ（Ｏ） ２ −、−ＳｎＨ ２ −など（各Ｒ'は、本明細書中で規定される場合、独立して、水素、アルキル、アルカニル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロアリール−ヘテロアリールである）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「非環式ヘテロ原子架橋」とは、骨格原子がヘテロ原子のみである、二価架橋を指す。 代表的な非環式ヘテロ原子架橋としては、上記に列挙した種々のヘテロ原子基のいずれか（単独でかまたは組み合わせてかのいずれか）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「親芳香環系」とは、共役π電子系を有する、不飽和環式環系または不飽和多環式環系を指す。 特に「親芳香環系」の定義内に含まれるのは、１つ以上の環が芳香環であり、かつ１つ以上の環が飽和しているかまたは不飽和である、縮合環系（例えば、インダン、インデン、フェナレンなど）である。 代表的な親芳香環系としては、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン（ｈｅｘａｌｅｎｅ）、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレン（ｔｒｉｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
「アリール」とは、親芳香環系の１つの炭素原子からの１つの水素原子の除去により誘導される、一価芳香族炭化水素ラジカルを指す。 代表的なアリール基としては、アセアントリレンに由来するラジカル、アセナフチレンに由来するラジカル、アセフェナントリレンに由来するラジカル、アントラセンに由来するラジカル、アズレンに由来するラジカル、ベンゼンに由来するラジカル、クリセンに由来するラジカル、コロネンに由来するラジカル、フルオランテンに由来するラジカル、フルオレンに由来するラジカル、ヘキサセンに由来するラジカル、ヘキサフェンに由来するラジカル、ヘキサレンに由来するラジカル、ａｓ−インダセンに由来するラジカル、ｓ−インダセンに由来するラジカル、インダンに由来するラジカル、インデンに由来するラジカル、ナフタレンに由来するラジカル、オクタセンに由来するラジカル、オクタフェンに由来するラジカル、オクタレンに由来するラジカル、オバレンに由来するラジカル、ペンタ−２，４−ジエンに由来するラジカル、ペンタセンに由来するラジカル、ペンタレンに由来するラジカル、ペンタフェンに由来するラジカル、ペリレンに由来するラジカル、フェナレンに由来するラジカル、フェナントレンに由来するラジカル、ピセンに由来するラジカル、プレイアデンに由来するラジカル、ピレンに由来するラジカル、ピラントレンに由来するラジカル、ルビセンに由来するラジカル、トリフェニレンに由来するラジカル、トリナフタレンに由来するラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 好ましい実施形態において、そのアリール基は、（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）アリールであり、（Ｃ ５ 〜Ｃ １０ ）アリールが、なおより好ましい。 特に好ましいアリールは、フェニルおよびナフチルである。
【００３２】
「アリールジイル」とは、親芳香環系の２つの異なる炭素原子の各々からの１つの水素原子の除去によってか、または親芳香環系の１つの炭素原子からの２つの水素原子の除去によって誘導される、二価芳香族炭化水素ラジカルを指す。 その２つの一価ラジカル中心またはその二価中心の各々価は、同じ原子または異なる原子と結合を形成し得る。 代表的アリールジイル基としては、アセアントリレンに由来する二価ラジカル、アセナフチレンに由来する二価ラジカル、アセフェナントリレンに由来する二価ラジカル、アントラセンに由来する二価ラジカル、アズレンに由来する二価ラジカル、ベンゼンに由来する二価ラジカル、クリセンに由来する二価ラジカル、コロネンに由来する二価ラジカル、フルオランテンに由来する二価ラジカル、フルオレンに由来する二価ラジカル、ヘキサセンに由来する二価ラジカル、ヘキサフェンに由来する二価ラジカル、ヘキサレンに由来する二価ラジカル、ａｓ−インダセンに由来する二価ラジカル、ｓ−インダセンに由来する二価ラジカル、インダンに由来する二価ラジカル、インデンに由来する二価ラジカル、ナフタレンに由来する二価ラジカル、オクタセンに由来する二価ラジカル、オクタフェンに由来する二価ラジカル、オクタレンに由来する二価ラジカル、オバレンに由来する二価ラジカル、ペンタ−２，４−ジエンに由来する二価ラジカル、ペンタセンに由来する二価ラジカル、ペンタレンに由来する二価ラジカル、ペンタフェンに由来する二価ラジカル、ペリレンに由来する二価ラジカル、フェナレンに由来する二価ラジカル、フェナントレンに由来する二価ラジカル、ピセンに由来する二価ラジカル、プレイアデンに由来する二価ラジカル、ピレンに由来する二価ラジカル、ピラントレンに由来する二価ラジカル、ルビセンに由来する二価ラジカル、トリフェニレンに由来する二価ラジカル、トリナフタレンに由来する二価ラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 好ましい実施形態において、そのアリールジイル基は、（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）アリールジイルであり、（Ｃ ５ 〜Ｃ １０ ）アリールジイルが、なおより好ましい。 最も好ましいアリールジイル基は、ベンゼンに由来する二価ラジカルおよびナフタレンに由来する二価ラジカルであり、特に、フェナ−１，４−ジイル、ナフタ−２，６−ジイル、およびナフタ−２，７−ジイルである。
【００３３】
「アリーレノ」とは、親芳香環系の隣接する２つの炭素原子の各々からの１つの水素原子の除去により誘導される、隣接する２つの一価ラジカル中心を有する二価架橋ラジカルを指す。 アリーレノ架橋ラジカル（例えば、ベンゼノ）を親芳香環系（例えば、ベンゼン）に結合すると、縮合芳香環系（例えば、ナフタレン）が生じる。 その架橋は、生じた縮合環系への結合と一致する、最大数の非集積二重結合を有すると考えられる。 炭素原子を二重計数することを回避するために、隣接する２つの置換基が一緒になることによって、別の置換基を含む構造上にアリーレノ置換基が形成される場合、そのアリーレノ架橋の炭素原子は、その構造の架橋炭素原子にとって代わる。 例として、以下の構造【００３４】
【化１】
を考える。 ここで、Ｒ １は、単独である場合水素であり、またはＲ ２と一緒になる場合は（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）アリーレノであり；そしてＲ ２は、単独である場合水素であり、またはＲ １と一緒になる場合は（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）アリーレノである。
【００３５】
Ｒ
１およびＲ ２が各々水素である場合、生じる化合物は、ベンゼンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １がＣ ６アリーレノ（ベンゼノ）である場合、生じる化合物は、ナフタレンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １がＣ １０アリーレノ（ナフタレノ）である場合、生じる化合物は、アントラセンまたはフェナントレンである。 代表的アリーレノ基としては、アセアントリレノ、アセナフチレノ、アセフェナントリレノ、アントラセノ、アズレノ、ベンゼノ（ベンゾ）、クリセノ、コロネノ、フルオランテノ、フルオレノ、ヘキサセノ、ヘキサフェノ、ヘキサレノ、ａｓ−インダセノ、ｓ−インダセノ、インデノ、ナフタレノ（ナフト）、オクタセノ、オクタフェノ、オクタレノ、オバレノ、ペンタ−２，４−ジエノ、ペンタセノ、ペンタレノ、ペンタフェノ、ペリレノ、フェナレノ、フェナントレノ、ピセノ、プレイアデノ、ピレノ、ピラントレノ、ルビセノ、トリフェニレノ、トリナフタレノなどが挙げられるが、これらに限定されない。 特定の連結が意図される場合、（そのアリーレノ架橋の）関係する架橋炭素原子は、角型括弧内に示される。 例えば、［１，２］ベンゼノ（［１，２］ベンゾ）、［１，２］ナフタレノ、［２，３］ナフタレノなど。 従って、上記の例において、Ｒ ２と一緒になったＲ １が［２，３］ナフタレノである場合、生じる化合物は、アントラセンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １が［１，２］ナフタレノである場合、生じる化合物は、フェナントレンである。 好ましい実施形態において、そのアリーレノ基は、（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）アリーレノ基であり、（Ｃ ５ 〜Ｃ １０ ）アリーレノ基が、なおより好ましい。
【００３６】
「アリールアリール」とは、２つ以上の同一の親芳香環系または２つ以上の同一でない親芳香環系が単結合によって直接ともに結合されている環系の、１つの炭素原子から１つの水素原子を除去することにより誘導される、一価炭化水素ラジカルであり、そのような直接的環接合部の数は、関係する親芳香環系の数よりも１少ない。 代表的なアリールアリール基としては、ビフェニル、トリフェニル、フェニル−ナフチル、ビナフチル、ビフェニル−ナフチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 アリールアリール基を構成する炭素原子の数が特定される場合、その数は、各親芳香環を構成する炭素原子を指す。 例えば、（Ｃ
５ 〜Ｃ １４ ）アリールアリール基は、各芳香環が５個〜１４個の炭素を含むアリールアリール基（例えば、ビフェニル、トリフェニル、ビナフチル、フェニルナフチルなど）である。 好ましくは、アリールアリール基の各親芳香環系は、独立して、（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）芳香環系であり、より好ましくは（Ｃ ５ 〜Ｃ １０ ）芳香環系である。 また、その親芳香環系のすべてが同一であるアリールアリール基（例えば、ビフェニル、トリフェニル、ビナフチル、トリナフチルなど）も、好ましい。
【００３７】
「ビアリール」とは、単結合により直接一緒に結合された同一な２つの親芳香族系を有する、アリールアリールラジカルを指す。 代表的ビアリール基としては、ビフェニル、ビナフチル、ビアントラシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 好ましくは、その芳香環系は、（Ｃ
５ 〜Ｃ １４ ）芳香環であり、より好ましくは（Ｃ ５ 〜Ｃ １０ ）芳香環である。 特に好ましいビアリール基は、ビフェニルである。
【００３８】
「アリールアルキル」とは、炭素原子（代表的には、末端炭素原子またはｓｐ
３炭素原子）に結合した水素原子のうちの１つがアリールラジカルで置換されている、非環式アルキルラジカルを指す。 代表的なアリールアルキル基としては、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルメタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 特定のアルキル部分が意図される場合、命名法アリールアルカニル、アリールアルケニルおよび／またはアリールアルキニルが、使用される。 好ましい実施形態において、そのアリールアルキル基は、（Ｃ ６ 〜Ｃ ２０ ）アリールアルキルであり、例えば、アリールアルキル基のアルカニル部分、アルケニル部分、またはアルキニル部分は（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）であり、そしてアリール部分は（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）である。 特に好ましい実施形態において、そのアリールアルキル基は、（Ｃ ６ 〜Ｃ １３ ）であり、例えば、そのアリールアルキル基のアルカニル部分、アルケニル部分、またはアルキニル部分は（Ｃ １ 〜Ｃ ３ ）であり、そしてそのアリール部分は（Ｃ ５ 〜Ｃ １０ ）である。
【００３９】
「親複素環式芳香環系」とは、１つ以上の炭素原子（および関連する必要な任意の水素原子）が、各々独立して、同じヘテロ原子または異なるヘテロ原子で置換されている、親芳香環系を指す。 その炭素原子を置換するための代表的なヘテロ原子としては、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉなどが挙げられるが、これらに限定されない。 特に「親複素環式芳香環系」の定義内に含まれるのは、１つ以上の環が芳香族であり、かつその環のうちの１つ以上が飽和されているかまたは不飽和である、縮合環系（例えば、アルシンドール（ａｒｓｉｎｄｏｌｅ）、クロマン、クロメン、インドール、インドリン、キサンテンなど）である。 代表的な親複素環式芳香環系としては、アルシンドール、カルバゾール、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソオキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「ヘテロアリール」とは、親複素環式芳香環系の１つの原子から１つの水素を除去することにより誘導される、一価複素環式芳香族ラジカルを指す。 代表的なヘテロアリール基としては、アクリジンから誘導されるラジカル、アルシンドールから誘導されるラジカル、カルバゾールから誘導されるラジカル、β−カルボリンから誘導されるラジカル、クロマンから誘導されるラジカル、クロメンから誘導されるラジカル、シンノリンから誘導されるラジカル、フランから誘導されるラジカル、イミダゾールから誘導されるラジカル、インダゾールから誘導されるラジカル、インドールから誘導されるラジカル、インドリンから誘導されるラジカル、インドリジンから誘導されるラジカル、イソベンゾフランから誘導されるラジカル、イソクロメンから誘導されるラジカル、イソインドールから誘導されるラジカル、イソインドリンから誘導されるラジカル、イソキノリンから誘導されるラジカル、イソチアゾールから誘導されるラジカル、イソオキサゾールから誘導されるラジカル、ナフチリジンから誘導されるラジカル、オキサジアゾールから誘導されるラジカル、オキサゾールから誘導されるラジカル、ペリミジンから誘導されるラジカル、フェナントリジンから誘導されるラジカル、フェナントロリンから誘導されるラジカル、フェナジンから誘導されるラジカル、フタラジンから誘導されるラジカル、プテリジンから誘導されるラジカル、プリンから誘導されるラジカル、ピランから誘導されるラジカル、ピラジンから誘導されるラジカル、ピラゾールから誘導されるラジカル、ピリダジンから誘導されるラジカル、ピリジンから誘導されるラジカル、ピリミジンから誘導されるラジカル、ピロールから誘導されるラジカル、ピロリジンから誘導されるラジカル、キナゾリンから誘導されるラジカル、キノリンから誘導されるラジカル、キノリジンから誘導されるラジカル、キノキサリンから誘導されるラジカル、テトラゾールから誘導されるラジカル、チアジアゾールから誘導されるラジカル、チアゾールから誘導されるラジカル、チオフェンから誘導されるラジカル、トリアゾールから誘導されるラジカル、キサンテンから誘導されるラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 好ましい実施形態において、そのヘテロアリール基は、５〜１４員のヘテロアリールであり、５〜１０員のヘテロアリールが、特に好ましい。 最も好ましいヘテロアリールラジカルは、任意の環ヘテロ原子が窒素である親複素環式芳香環系（例えば、イミダゾール、インドール、インダゾール、イソインドール、ナフチリジン、プテリジン、イソキノリン、フタラジン、プリン、ピラゾール、ピラジン、ピリダジン、ピリジン、ピロール、キナゾリン、キノリンなど）から誘導されたヘテロアリールラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「ヘテロアリールジイル」とは、親複素環式芳香環系の異なる２つの原子の各々から１つの水素原子を除去することによってか、または親複素環式芳香環系の１つの原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される、二価複素環式芳香族ラジカルを指す。 その２つの一価ラジカル中心または１つの二価中心の各価は、同じ原子または異なる原子との結合を形成し得る。 代表的なヘテロアリールジイル基としては、アクリジンから誘導される二価ラジカル、アルシンドールから誘導される二価ラジカル、カルバゾールから誘導される二価ラジカル、β−カルボリンから誘導される二価ラジカル、クロマンから誘導される二価ラジカル、クロメンから誘導される二価ラジカル、シンノリンから誘導される二価ラジカル、フランから誘導される二価ラジカル、イミダゾールから誘導される二価ラジカル、インダゾールから誘導される二価ラジカル、インドールから誘導される二価ラジカル、インドリンから誘導される二価ラジカル、インドリジンから誘導される二価ラジカル、イソベンゾフランから誘導される二価ラジカル、イソクロメンから誘導される二価ラジカル、イソインドールから誘導される二価ラジカル、イソインドリンから誘導される二価ラジカル、イソキノリンから誘導される二価ラジカル、イソチアゾールから誘導される二価ラジカル、イソオキサゾールから誘導される二価ラジカル、ナフチリジンから誘導される二価ラジカル、オキサジアゾールから誘導される二価ラジカル、オキサゾールから誘導される二価ラジカル、ペリミジンから誘導される二価ラジカル、フェナントリジンから誘導される二価ラジカル、フェナントロリンから誘導される二価ラジカル、フェナジンから誘導される二価ラジカル、フタラジンから誘導される二価ラジカル、プテリジンから誘導される二価ラジカル、プリンから誘導される二価ラジカル、ピランから誘導される二価ラジカル、ピラジンから誘導される二価ラジカル、ピラゾールから誘導される二価ラジカル、ピリダジンから誘導される二価ラジカル、ピリジンから誘導される二価ラジカル、ピリミジンから誘導される二価ラジカル、ピロールから誘導される二価ラジカル、ピロリジンから誘導される二価ラジカル、キナゾリンから誘導される二価ラジカル、キノリンから誘導される二価ラジカル、キノリジンから誘導される二価ラジカル、キノキサリンから誘導される二価ラジカル、テトラゾールから誘導される二価ラジカル、チアジアゾールから誘導される二価ラジカル、チアゾールから誘導される二価ラジカル、チオフェンから誘導される二価ラジカル、トリアゾールから誘導される二価ラジカル、キサンテンから誘導される二価ラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 好ましい実施形態において、そのヘテロアリールジイル基は、５〜１４員のヘテロアリールジイルであり、５〜１０員のヘテロアリールジイルが、特に好ましい。 最も好ましいヘテロアリールジイル基は、任意の環ヘテロ原子が窒素である親複素環式芳香環系（例えば、イミダゾール、インドール、インダゾール、イソインドール、ナフチリジン、プテリジン、イソキノリン、フタラジン、プリン、ピラゾール、ピラジン、ピリダジン、ピリジン、ピロール、キナゾリン、キノリンなど）から誘導された二価ラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
「ヘテロアリーレノ」とは、親複素環式芳香環系の隣接する２つの原子の各々から１つの水素原子を除去することにより誘導される隣接する２つの一価ラジカル中心を有する、二価架橋ラジカルを指す。 親芳香環系（例えば、ベンゼン）にヘテロアリーレノ架橋ラジカル（例えば、ピリジノ）を結合させると、縮合複素環式芳香環系（例えば、キノリン）が生じる。 その架橋は、生じる縮合環系への結合と一致する、最大数の非集積二重結合を有すると考えられる。 環原子を二重計数することを回避するために、隣接する２つの置換基が一緒になることによって、別の置換基を含む構造上にヘテロアリーレノ置換基が形成される場合、そのヘテロアリーレノ架橋の環原子は、その構造の架橋環原子を置換する。 例として、以下の構造【００４３】
【化２】
を考える。 ここで、Ｒ
１は、単独である場合水素であり、またはＲ ２と一緒になる場合は５〜１４員のヘテロアリーレノであり；そしてＲ ２は、単独である場合水素であり、またはＲ １と一緒になる場合は５〜１４員のヘテロアリーレノである。
【００４４】
Ｒ
１およびＲ ２が各々水素である場合、生じる化合物は、ベンゼンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １が６員のヘテロアリーレノ（例えば、ピリジノ）である場合、生じる化合物は、イソキノリン、キノリン、またはキノリジンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １が１０員のヘテロアリーレノ（例えば、イソキノリン）である場合、生じる化合物は、例えば、アクリジンまたはフェナントリジンである。 代表的ヘテロアリーレノ基としては、アクリジノ、カルバゾロ、β−カルボリノ、クロメノ、シンノリノ、フラノ、イミダゾロ、インダゾレノ、インドレノ、インドリジノ、イソベンゾフラノ、イソクロメノ、イソインドレノ、イソキノリノ、イソチアゾレノ、イソオキサゾレノ、ナフチリジノ、オキサジアゾレノ、オキサゾレノ、ペリミジノ、フェナントリジノ、フェナントロリノ、フェナジノ、フタラジノ、プテリジノ、プリノ、ピラノ、ピラジノ、ピラゾレノ、ピリダジノ、ピリジノ、ピリミジノ、ピロレノ、ピロリジノ、キナゾリノ、キノリノ、キノリジノ、キノキサリノ、テトラゾレノ、チアジアゾレノ、チアゾレノ、チオフェノ、トリアゾレノ、キサンテノなどが挙げられるが、これらに限定されない。 特定の結合性が意図される場合、（そのヘテロアリーレノ架橋の）関与する架橋原子が、角型括弧内に示される（例えば、［１，２］ピリジノ、［２，３］ピリジノ、［３，４］ピリジノなど）。 従って、上記の例において、Ｒ ２と一緒になったＲ １が［１，２］ピリジノである場合、生じる化合物は、キノリジンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １が［２，３］ピリジノである場合、生じる化合物は、キノリンである。 Ｒ ２と一緒になったＲ １が［３，４］ピリジノである場合、生じる化合物は、イソキノリンである。 好ましい実施形態において、そのヘテロアリーレノ基は、５〜１４員のアリーレノであり、５〜１０員のヘテロアリーレノ基が、なおより好ましい。 最も好ましいヘテロアリーレノラジカルは、任意の環ヘテロ原子が窒素である親複素環式芳香環系から誘導されたヘテロアリーレノラジカル（例えば、イミダゾロ、インドロ、インダゾロ、イソインドロ、ナフチリジノ、プテリジノ、イソキノリノ、フタラジノ、プリノ、ピラゾロ、ピラジノ、ピリダジノ、ピリジノ、ピロロ、キナゾリノ、キノリノなど）である。
【００４５】
「ヘテロアリール−ヘテロアリール」とは、同一であるかまたは同一でない２つ以上の親複素環式芳香環系が単結合により直接一緒に結合している環系（その直接の環結合の数が、関与する親複素環式芳香環系の数より、１小さい）のうちの１つの原子から１つの水素原子を除去することにより誘導される、一価複素環式芳香族ラジカルを指す。 代表的なヘテロアリール−ヘテロアリール基としては、ビピリジル、トリピリジル、ピリジルプリニル、ビプリニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 環原子の数が特定される場合、その数は、各親複素環式芳香環系を構成する原子の数を指す。 例えば、５〜１４員のヘテロアリール−ヘテロアリールは、各親複素環式芳香環系が５〜１４個の原子を含むヘテロアリール−ヘテロアリール基（例えば、ビピリジル、トリピリジルなど）である。 好ましくは、各親複素環式芳香環系は、独立して、５〜１４員の複素環式芳香族であり、より好ましくは、５〜１０員の複素環式芳香族である。 また、親複素環式芳香環系すべてが同一である、ヘテロアリール−ヘテロアリール基も、好ましい。 最も好ましいヘテロアリール−ヘテロアリールラジカルは、任意の環ヘテロ原子が窒素である親複素環式芳香環系（例えば、イミダゾール、インドール、インダゾール、イソインドール、ナフチリジン、プテリジン、イソキノリン、フタラジン、プリン、ピラゾール、ピラジン、ピリダジン、ピリジン、ピロール、キナゾリン、キノリンなど）から各ヘテロアリール基が誘導された、ヘテロアリール−ヘテロアリールラジカルである。
【００４６】
「ビヘテロアリール」とは、単結合により直接一緒に結合した同じ２つの親複素環式芳香環系を有する、ヘテロアリール−ヘテロアリールラジカルを指す。 代表的なビヘテロアリール基としては、ビピリジル、ビプリニル、ビキノリニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 好ましくは、その複素環式芳香環系は、５〜１４員の複素環式芳香環であり、より好ましくは、５〜１０員の複素環式芳香環である。 最も好ましいビヘテロアリールラジカルは、任意の環ヘテロ原子が窒素である親複素環式芳香環系からヘテロアリール基が誘導された、ビヘテロアリールラジカル（例えば、ビイミダゾリル、ビインドリル、ビインダゾリル、ビイソインドリル、ビナフチリジニル、ビプテリジニル、ビイソキノリニル、ビナフタラジニル、ビプリニル、ビピラゾリル、ビピラジニル、ビピリダジニル、ビピリジニル、ビピロリル、ビキナゾリニル、ビキノリニルなど）である。
【００４７】
「ヘテロアリールアルキル」とは、炭素原子（代表的には、末端炭素原子またはｓｐ
３炭素原子）に結合した水素原子のうちの１つがヘテロアリールラジカルで置換されている、非環式アルキルラジカルを指す。 特定のアルキル部分が意図される場合、命名法ヘテロアリールアルカニル、ヘテロアリールアルケニル、および／またはヘテロアリールアルキニルが使用される。 好ましい実施形態において、そのヘテロアリールアルキル基は、６〜２０員のヘテロアリールアルキルであり、例えば、そのヘテロアールアルキルのアルカニル部分、アルケニル部分、またはアルキニル部分が１〜６員であり、かつそのヘテロアリール部分が５〜１４員のヘテロアリールである。 特に好ましい実施形態において、そのヘテロアリールアルキルは、６〜１３員のヘテロアリールアルキルであり、例えば、そのアルカニル部分、アルケニル部分、またはアルキニル部分が１〜３員であり、かつそのヘテロアリール部分が５〜１０員のヘテロアリールである。
【００４８】
「置換（置換された）」は、１つ以上の水素原子が各々独立して、同じ置換基または異なる置換基で置換された基をいう。 代表的な置換基としては、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ
− 、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ − 、＝Ｓ、−ＮＲＲ、＝ＮＲ、パーハロ（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキル、−ＣＸ ３ 、−ＣＦ ３ 、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ ２ 、＝Ｎ ２ 、−Ｎ ３ 、−Ｓ（Ｏ） ２ Ｏ − 、−Ｓ（Ｏ） ２ ＯＨ、−Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ − 、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲおよび−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（ここで、各Ｘは、独立してハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）であり、そして各Ｒは、独立して、本明細書中に規定されるような、水素、アルキル、アルカニル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルもしくはヘテロアリールヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスフェート、またはホスホネートである）が挙げられるが、これらに限定されない。 任意の特定の基を置換する実際の置換基は、置換される群の同一性に依存する。
【００４９】
「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログ（例えば、プリン、７−デアザプリン、またはピリミジン）とワトソン−クリック型水素結合を形成し得る窒素含有複素環式部分を意味する。 代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在する核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザ−８アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、イノシン、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、偽ウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、偽シチジン、偽イソシチジン、５−プロピニルシチジン、イソシチジン、イソグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ
６ −メチルグアニン、Ｎ ６ −メチル−アデニン、Ｏ ４ −メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、およびエテノアデニン（Ｆａｓｍａｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８５−３９４頁，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆ１（１９８９））。
【００５０】
「ヌクレオシド」は、リボース糖またはそのアナログのＣ−１'炭素に連結した核酸塩基を含む化合物を意味する。 リボースまたはアナログは、置換されていても置換されていなくてもよい。 置換されたリボース糖としては、１つ以上の炭素原子（好ましくは３'炭素原子）が１つ以上の同じまたは異なる置換基（例えば、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲまたはハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）（ここで、各Ｒ基は、独立して、−Ｈ、Ｃ
１ 〜Ｃ ６アルキルまたはＣ ３ 〜Ｃ ｌ４アリールである））で置換されたリボースが挙げられるが、これらに限定されない。 特に好ましいリボースは、リボース、２'−デオキシリボース、２'，３'−ジデオキシリボース、３'−ハロリボース（例えば、３'−フルオロリボースまたは３'−クロロリボース）および３'−アルキルリボースである。 代表的に、核酸塩基がＡまたはＧである場合、リボース糖は、核酸塩基のＮ ９位に結合される。 核酸塩基がＣ、ＴまたはＵである場合、ペントース糖が、核酸塩基のＮ １位に結合される（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，（１９９２））。 リボースアナログの例としては、例えば、アラビノース、２'−Ｏ−メチルリボース、およびロックド（ｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオチドアナログ（例えば、ＷＯ ９９／１４２２６）が挙げられるが、多くの他のアナログもまた、当該分野で公知である。
【００５１】
「ヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド内の独立したモノマーとしてか、またはサブユニットとしての、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。 ヌクレオチド三リン酸は、ときどき、特にリボース糖の構造的特徴を示すために、「ＮＴＰ」、「ｄＮＴＰ」（２'−デオキシペントース）、または「ｄｄＮＴＰ」（２'，３'−ジデオキシペントース）と記載される。 「ヌクレオチド５'三リン酸」は、５'位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいう。 三リン酸エステル基としては、リン酸の１つ以上の酸素原子の硫黄での置換が挙げられ得る（例えば、α−チオヌクレオチド５'三リン酸）。
【００５２】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（これらは、本明細書中において交換可能に使用される）は、天然のヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの線状ポリマーをいい、これらとしては、例えば、二本鎖および一本鎖の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、これらのα−アノマー形態などが挙げられる。 ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはそのアナログを完全に含み得るか、または２つ以上の異なるモノマー型のブロックもしくは混合物を含み得る。 通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結によって連結される。 しかし、非ホスホジエステル連結を含むポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた、意図される。 「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はまた、１つ以上の天然に存在しないモノマーおよび／またはサブユニット間連結を含むポリマー（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、核酸塩基が非アミド骨格窒素を介して結合されるアミド連結Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンサブユニットの骨格を含む、ポリマー））を含む。 Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）を参照のこと。 ポリヌクレオチドのサイズは、代表的に、数個のモノマー単位（例えば、８〜４０）〜数千個のモノマー単位の範囲である。 ポリヌクレオチドが配列の文字（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」によって示される場合はいつでも、他に記載されない限り、このヌクレオチドが左から右に５'−＞３'の順であり、そして「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がチミジンを示すことが、理解される。
【００５３】
「ヌクレオチドサブユニット」または「ポリヌクレオチドサブユニット」は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログ内の単一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログをいう。
【００５４】
「リン酸アナログ（ホスフェートアナログ）」は、リン酸のアナログをいい、ここで、１つ以上の酸素原子が、非酸素部分で置換されている。 例示的なリン酸アナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート）、ブロモホスホネートが挙げられる。
【００５５】
「リンカー」は、基材（例えば、オリゴヌクレオチド）に色素を連結させる部分、または一方の色素を他方の色素に連結する（例えば、ドナー色素をアクセプター色素に連結する）部分をいう。
【００５６】
「酵素的に組込み可能な」とは、ヌクレオチドが、鋳型依存的ポリメラーゼ酵素もしくは鋳型非依存的ポリメラーゼ酵素の作用を介して、ポリヌクレオチド鎖の末端（例えば、３'末端）に、またはポリヌクレオチド鎖のニックトランスレーションを介して内部に、酵素によって組込まれることが可能であることを意味する。 ヌクレオチド５'三リン酸は、酵素的に組込み可能なヌクレオチドの例である。
【００５７】
「酵素的に伸長可能な」または「３'伸長可能な」は、酵素作用によってヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに追加され得る、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味する。 ３'ヒドロキシル基を含むポリヌクレオチドは、酵素的に伸長可能なポリヌクレオチドの例である。
【００５８】
「ターミネーター」は、生じるポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドのそれ以降の取り込みを妨害し、それによってポリメラーゼ媒介伸長を停止させる、酵素的に組込み可能なヌクレオチドを意味する。 代表的なターミネーターは、３'−ヒドロキシル置換基を欠き、そしてターミネーターとしては、例えば、２'，３'−ジデオキシリボース、２'，３'−ジデヒドロリボース、および２'，３'−ジデオキシ−３'ハロリボース（例えば、３'−デオキシ−３'−フルオロ−リボースまたは２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロリボース）が挙げられる。 あるいは、２'，３'−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３'−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、および２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシルなどのリボフラノースアナログが、使用され得る（例えば、Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：１６７１−１６８６（１９８４）、およびＣｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら，ＦＥＢ．Ｌｅｔｔ．，１８３：２７５−２７８（１９８５）を参照のこと）。 ヌクレオチドターミネーターとしてはまた、リバーシブルヌクレオチドターミネーターが挙げられる（Ｍｅｔｚｋｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２０）：４２５９（１９９４））。
【００５９】
「伸長可能でない」または「３'伸長可能でない」とは、ターミネーターが、鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型依存的ＲＮＡポリメラーゼによって３'方向に伸長することができない、またはそのように伸張することが実質的にできないという事実をいう。
【００６０】
「スペクトルで分解可能な」とは、２つ以上の色素が、十分に異なり（すなわち、十分に非重複性である）、各色素によって生成される特有の蛍光シグナルに基づいて識別され得る発光バンドを有することを意味する。
【００６１】
一般的に、本開示中に言及される化合物が陽電荷を含もうと負電荷を含もうとも、このような化合物がまた陽電荷または負電荷の均衡をとる適切な対イオンによって達成され得ることは、理解されるべきである。 例示的な陽電荷の対イオンとしては、Ｈ
＋ 、ＮＨ ４ ＋ 、Ｎａ ＋ 、Ｋ ＋ 、Ｍｇ ２＋ 、トリアルキルアンモニウム（例えば、トリエチルアンモニウム）、テトラアルキルアンモニウム（例えば、テトラエチルアンモニウム）などが挙げられるが、これらに限定されない。 例示的な負電荷の対イオンとしては、例えば、カルボネート、ビカルボネート、アセテート、クロリド、およびホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。 同様に、特定の共鳴構造が本明細書中に示され得るが、このような構造は、全ての他の可能な共鳴構造を含むことが意図される。
【００６２】
（ＩＩ．結合体）
１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載される型の少なくとも１つの色素標識核酸塩基を含む組成物を提供する。 このような組成物としては、独立した分子としての核酸塩基−色素結合体だけでなく、このような結合体を含むヌクレオシド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドもまた含まれる。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明の色素標識核酸塩基は、Ｂ−Ｌ−Ｄの形態を有し、ここで、Ｂは核酸塩基であり、Ｌはアニオン性リンカーであり、そしてＤは蛍光色素である。
【００６４】
核酸塩基Ｂは、上の定義の節に示されるような、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログとワトソン−クリック水素結合を形成し得る任意の部分であり得る。 代表的に、Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、またはピリミジンヌクレオチド塩基のような窒素含有複素環式部分である。 特定の実施形態において、Ｂはウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、または７−デアザグアノシンである。 Ｂがプリンである場合、このリンカーは通常、プリンの８位に結合する。 Ｂが７−デアザプリンである場合、色素に対するこのリンカーは、通常、７−デアザプリンの７位に結合する。 Ｂがピリミジンである場合、このリンカーは、通常、ピリミジンの５位に結合する。
【００６５】
蛍光色素Ｄは、本発明の目的に適切な任意の蛍光色素であり得る。 代表的に、蛍光色素は、第１波長で光を吸収し、その吸収事象に応答して第２波長において蛍光を発光する、共鳴非局在システムまたは芳香族環システムを含む。 広範な種々のこのような色素分子が当該分野で公知である。 例えば、蛍光色素は、種々の型の蛍光化合物（例えば、キサンテン色素、ローダミン色素、フルオレセイン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素、スクアライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）色素およびボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）色素）のうちのいずれかから選択され得る。
【００６６】
１つの実施形態において、色素は、キサンテン型色素であり、これは、以下の型：
【００６７】
【化３】
の縮合三環系を含む。 この親キサンテン環は、置換されていなくても（すなわち、全置換基がＨである）、種々の同じまたは異なる置換基（例えば、以下に記載されるもの）のうちの１つ以上で置換されていてもよい。
【００６８】
１つの実施形態において、色素は、一般構造：
【００６９】
【化４】
を有する親キサンテン環を含む。 上記の親キサンテン環において、Ａ
１はＯＨまたはＮＨ ２であり、そしてＡ ２はＯまたはＮＨ ２ ＋である。 Ａ １がＯＨであり、かつＡ ２がＯである場合、親キサンテン環は、フルオレセイン型キサンテン環である。 Ａ １がＮＨ ２であり、かつＡ ２がＮＨ ２ ＋である場合、親キサンテン環は、ローダミン型キサンテン環である。 Ａ １がＮＨ ２であり、かつＡ ２がＯである場合、親キサンテン環は、ロードール（ｒｈｏｄｏｌ）型キサンテン環である。 上記の親キサンテン環において、Ａ １およびＡ ２の一方の窒素または両方の窒素（存在する場合）、ならびに／またはＣ１位、Ｃ２位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ８位およびＣ９位の炭素原子の１つ以上が、広範な種々の同じまたは異なる置換基で独立して置換され得る。 １つの実施形態において、代表的な置換基としては、−Ｘ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲＲ、パーハロ（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキル、−ＣＸ ３ 、−ＣＦ ３ 、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ ２ 、−Ｎ ３ 、−Ｓ（Ｏ） ２ Ｏ − 、−Ｓ（Ｏ） ２ ＯＨ、−Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ − 、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲおよび−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（ここで、各Ｘは、独立してハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）であり、そして各Ｒは、独立して、水素、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルカニル、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルケニル、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキニル、（Ｃ ５ 〜Ｃ ２０ ）アリール、（Ｃ ６ 〜Ｃ ２６ ）アリールアルキル、（Ｃ ５ 〜Ｃ ２０ ）アリールアリール、ヘテロアリール、６〜２６員のヘテロアリールアルキル、５〜２０員のヘテロアリール−ヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスフェート、またはホスホネートである）が挙げられるが、これらに限定されない。 さらに、Ｃ１置換基およびＣ２置換基ならびに／またはＣ７置換基およびＣ８置換基は、一緒になって、置換または非置換の、ブタ［１，３］ジエノ架橋または（Ｃ ５ 〜Ｃ ２０ ）アリールエノ架橋を形成し得る。 一般的に、親キサンテン環の蛍光を消光する傾向のない置換基が好ましいが、いくつかの実施形態において、消光置換基が望ましくあり得る。 親キサンテン環の蛍光を消光する傾向のある置換基は、電子吸引基（例えば、−ＮＯ ２ 、−Ｂｒ、および−Ｉ）である。 １つの実施形態において、Ｃ９は非置換である。 別の実施形態において、Ｃ９はフェニル基で置換される。 別の実施形態において、Ｃ９はフェニル以外の置換基で置換される。
【００７０】
Ａ
１がＮＨ ２であり、そして／またはＡ ２がＮＨ ２ ＋である場合、これらの窒素は、同じ窒素原子または隣接炭素原子を含む１つ以上の架橋（例えば、（Ｃ １ 〜Ｃ １２ ）アルキルジイル架橋、（Ｃ １ 〜Ｃ １２ ）アルキルエノ架橋、２〜１２員環のヘテロアルキルジイル架橋および／または２〜１２員環のヘテロアルキルエノ架橋）を含み得る。
【００７１】
炭素Ｃ１、炭素Ｃ２、炭素Ｃ４、炭素Ｃ５、炭素Ｃ７、炭素Ｃ８および炭素Ｃ９上の置換基ならびに／またはＣ３および／もしくはＣ６の窒素原子（存在する場合）のうちのいずれかはさらに、代表的に、−Ｘ、−Ｒ'、＝Ｏ、−ＯＲ'、−ＳＲ'、＝Ｓ、−ＮＲ'Ｒ'、＝ＮＲ'、−ＣＸ
３ 、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ ２ 、＝Ｎ ２ 、−Ｎ ３ 、−ＮＨＯＨ、−Ｓ（Ｏ） ２ Ｏ − 、−Ｓ（Ｏ） ２ ＯＨ、−Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ'、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ − ） ２ 、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ） ２ 、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ'、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｏ − 、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ'、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ'Ｒ'、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ'Ｒ'および−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ'Ｒ'（ここで、各Ｘは、独立して、ハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）であり、そして各Ｒ'は、独立して、水素、（Ｃ １ 〜Ｃ ６ ）アルキル、２〜６員環のヘテロアルキル、（Ｃ ５ 〜Ｃ １４ ）アリールまたはヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスフェート、またはホスホネートである）から選択される、同じまたは異なる置換基の１つ以上と置換され得る。
【００７２】
例示的な親キサンテン環としては、ローダミン型親キサンテン環およびフルオレセイン型親キサンテン環が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
１つの実施形態において、色素は、以下の環系：
【００７４】
【化５】
を含むローダミン型キサンテン色素を含む。 上記のローダミン型キサンテン環において、一方もしくは両方の窒素および／またはＣ１位、Ｃ２位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ７位、またはＣ８位の炭素のうちの１つ以上は、例えば、親キサンテン環について上記に記載したように、広範な種々の同じまたは異なる置換基で独立して置換され得る。 例示的なローダミン型キサンテン色素としては、米国特許第５，９３６，０８７号、同第５，７５０，４０９号、同第５，３６６，８６０号、同第５，２３１，１９１号、同第５，８４０，９９９号、同第５，８４７，１６２号、および同第６，０８０，８５２号（Ｌｅｅら）、ＰＣＴ公開ＷＯ ９７／３６９６０およびＷＯ ９９／２７０２０、Ｓａｕｅｒら、Ｊ． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５（３）：２４７−２６１（１９９５）、Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ，Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｓｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｓｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９３）、およびＬｅｅら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２４７１−２４８３（１９９２）に記載されるローダミン色素のキサンテン環が挙げられるが、これらに限定されない。 米国出願番号０９／３２５，２４３（１９９９年６月３日出願）に記載される伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ローダミン色素の伸長結合キサンテン環もまた、「ローダミン型キサンテン環」の定義内に含まれる。
【００７５】
別の実施形態において、色素は、構造：
【００７６】
【化６】
を有するフルオレセイン型親キサンテン環を含む。 上記のフルオレセイン型親キサンテン環において、Ｃ１位、Ｃ２位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ８位およびＣ９位の炭素の１つ以上が、親キサンテン環について上記で記載されるように、広範な種々の同じまたは異なる置換基で独立して置換され得る。 例示的なフルオレセイン型親キサンテン環としては、米国特許第４，４３９，３５６号、同第４，４８１，１３６号、同第５，１８８，９３４号、同第５，６５４，４４２号、および同第５，８４０，９９９号、ＷＯ ９９／１６８３２、およびＥＰ ０５０６８４に記載されるフルオレセイン色素のキサンテン環が挙げられるが、これらに限定されない。 米国特許第５，７５０，４０９号、同第５，０６６，５８０号に記載されるフルオレセイン色素の伸長キサンテン環もまた、「フルオレセイン型親キサンテン環」の定義内に含まれる。
【００７７】
別の実施形態において、この色素は、ローダミン系キサンテン環を含むローダミン色素を含み、ここで、Ｃ９炭素原子が、オルトカルボキシフェニル置換基（ペンダントフェニル基）で置換されている。 このような化合物はまた、本明細書中において、オルトカルボキシフルオレセインと称される。 ローダミン色素の特に好ましいサブセットは、４，７−ジクロロローダミンである。 代表的なローダミン色素としては、ローダミンＢ、５−カルボキシローダミン、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、４，７−ジクロロローダミンＸ（ｄＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミン６Ｇ、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、４，７−ジクロロローダミン１１０（ｄＲ１１０）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）および４，７−ジクロロテトラメチルローダミン（ｄＴＡＭＲＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。 さらなるローダミン色素は、例えば、米国特許第５，３６６，８６０号（Ｂｅｒｇｏｔら）、同第５，８４７，１６２号（Ｌｅｅら）、同第６，０１７，７１２号（Ｌｅｅら）、同第６，０２５，５０５号（Ｌｅｅら）、同第６，０８０，８５２号（Ｌｅｅら）、同第５，９３６，０８７号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，１１１，１１６号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，０５１，７１９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第５，７５０，４０９号、同第５，３６６，８６０号、同第５，２３１，１９１号、同第５，８４０，９９９号、ならびに同第５，８４７，１６２号、１９９９年６月３日に出願された米国特許出願番号０９／３２５，２４３、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３６９６０およびＷＯ９９／２７０２０、Ｓａｕｅｒら、１９９５、Ｊ． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５（３）；２４７−２６１、Ａｒｄｅｎ−Ｊａcｏｂ，１９９３，Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｚｓｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｓｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ、およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（１０）：２４７１−２４８３（１９９２）、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２８１６−２８２２（１９９７）、およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４５００−４５０４（１９９７）に見出され得る。 １つの実施形態において、この色素は、４，７−ジクロロオルトカルボキシローダミンである。
【００７８】
別の実施形態において、この色素は、フルオレセイン系キサンテン環を含むフルオレセイン色素を含み、ここで、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシフェニル置換基（ペンダントフェニル基）で置換されている。 フルオレセイン系色素の好ましいサブセットは、４，７−ジクロロフルオレセインである。 代表的なフルオレセイン色素としては、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。 さらなる代表的なフルオレセイン色素は、例えば、米国特許第５，７５０，４０９号、同第５，０６６，５８０号、同第４，４３９，３５６号、同第４，４８１，１３６号、同第５，１８８，９３４号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第５，６５４，４４２号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第６，００８，３７９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、および同第５，８４０，９９９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１６８３２、ならびにＥＰＯ公開０５０６８４に見出され得る。 １つの実施形態において、この色素は、４，７−ジクロロオルトカルボキシフルオレセインである。
【００７９】
他の実施形態において、この色素は、以下の参考文献およびそこに引用される参考文献に記載されるような、シアニン色素、フタロシアニン色素、スクアレン色素、またはｂｏｄｉｐｙ色素であり得る：特許第５，８６３，７２７号（Ｌｅｅら）、同第５，８００，９９６号（Ｌｅｅら）、同第５，９４５，５２６号（Ｌｅｅら）、同第６，０８０，８６８号（Ｌｅｅら）、同第５，４３６，１３４号（Ｈａｕｇｌａｎｄら）、米国第５，８６３，７５３号（Ｈａｕｇｌａｎｄら）、同第６，００５，１１３号（Ｗｕら）、およびＷＯ９６／０４４０５（Ｇｌａｚｅｒら）。
【００８０】
時々、−１または−２との記載が、特定の色素の略語の後に置かれる（例えば、ＨＥＸ−１）。 この「−１」および「−２」との記載は、特定の５−カルボキシ色素異性体または６−カルボキシ色素異性体が使用されていることを示す。 １異性体および２異性体は、Ｃ−８カラム、および１５％アセトニトリル／８５％ ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムから３５％アセトニトリル／６５％ ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムの勾配を利用する、逆相クロマトグラフィー分離システムにおける遊離色素の溶出の順序によって規定される（１異性体が２異性体の前に溶出する）。
【００８１】
アニオン性リンカーＬは、全体で負の電荷を有するよう設計される。 代表的に、この負の電荷は、そのリンカーにおける１つ以上の負に荷電した基によって提供される。 アニオン性リンカーが正に荷電した基（例えば、架橋しているかまたは架橋していないアミノ基）を有する場合、このリンカーはまた、十分な数の負に荷電した基を有して、このリンカーにおける負電荷の合計が、正電荷の合計を超えることを確実にしなければならない。 １つの実施形態において、このリンカーは、正に荷電した基を含まない。 このリンカーは、１、２、またはそれより大きい、正味の負電荷を含み得、これは、１つ、２つ、またはそれより多くの負に荷電した基によって提供され得る。 １つの実施形態において、このリンカーは、単一の負電荷を含む。 別の特定の実施形態において、このリンカーは、２の負電荷を含み、この電荷は、単一の基または２つの基によって提供され得る。 特定の実施形態において、ｐＨ９におけるリンカーの全体の電荷は、少なくとも−１、−２、−３、またはそれより大きくあり得る。 好ましくは、ｐＨ９におけるリンカーの全体的な電荷は、少なくとも−１である。 非限定的な例として、このようなアニオン性基としては、以下が挙げられる：リン酸モノエステル（−ＯＰＯ
３ ２− ）、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ − ）Ｏ−の形態（ここで、リンおよび２つの酸素原子が、リンカー鎖原子である）のホスホジエステル、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（ＯＲ）の形態（ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリールなどのマスキング基であり、そして最も左の酸素は、リンカー鎖に直接的または間接的に結合する）のホスホジエステル、−Ｙ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ − ）Ｏ−の形態（ここで、Ｙは、ＣＨ ２のようなアルキル炭素、エテン炭素、エチン炭素、またはベンゼン環炭素であり、そして好ましくは、ＣＨ ２であり、そしてＹ、リン原子、および右側の酸素原子は、リンカー鎖原子である）のホスホン酸モノエステル、−Ｙ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（ＯＲ）または−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（Ｚ）の形態（ここで、Ｙは記載されたとおりであり、そしてＲおよびＺは、各々、Ｒに関して規定されたようなマスキング基であるが、ホスホン酸モノエステルの原子はいずれも、リンカー鎖原子ではない）のホスホン酸モノエステル、硫酸モノエステル（−ＯＳＯ ３ − ）、スルホン酸（スルホネート、−ＳＯ ３ − ）、およびカルボン酸（カルボキシレート、−ＣＯ ２ − ）。 さらに、アニオン性基は、１０未満のｐＫ ａを有する基（例えば、ニトロフェノレート、チオレート、フェニルチオレート、フッ化アルキルアルコール（例えば、パーフルオロヒドロキシメチルまたはパーフルオロヒドロキシエチル）、スルホンイミド、およびスクアレート）を含み得る。
【００８２】
リンカー内のアニオン性基は、種々の様式で分類され得る。 第１に、アニオン性基は、アニオン性基がリンカー原子の鎖内にある（架橋アニオン性基）か、またはリンカー原子の鎖の外側にある（非架橋基）かに依存して、架橋基と非架橋基との間で分割され得る。 架橋アニオン性基の例は、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ
− ）Ｏ−の形態のホスホジエステル、および−ＣＨ ２ Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ − ）Ｏ−の形態のホスホン酸モノエステルである。 非架橋アニオン性基の例は、リン酸モノエステル（−ＯＰＯ ３ ２− ）、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ − ）ＯＲの形態（ここで、Ｒは、上記のように定義される）のホスホジエステル、リン酸（−ＰＯ ３ ２− ）、−ＣＨ ２ Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（ＯＲ）または−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（Ｚ）の形態（ここで、ＲおよびＺは、上記のように定義される）のリン酸モノエステル、硫酸モノエステル、スルホン酸、およびカルボン酸である。 従って、本発明は、１つ以上の架橋アニオン性基、１つ以上の二価アニオン性基、およびこれらの組み合わせを含むリンカーを意図する。
【００８３】
アニオン性基はまた、正味の形式電荷によって分類され得る。 ｐＨ９において単一の負電荷を提供する基の例としては、ホスホジエステル（架橋と非架橋との両方）、−ＣＨ
２ Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ − ）Ｏ−、−ＣＨ ２ Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（ＯＲ）、および−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ − ）（Ｚ）の形態のホスホン酸モノエステル、硫酸モノエステル、スルホン酸、およびカルボン酸が挙げられる。 ｐＨ９において二重の負電荷を提供する基の例としては、リン酸モノエステル（非架橋）、および（−ＣＨ ２ ＰＯ ３ ２− ）の形態のホスホン酸が挙げられる。 従って、本発明は、単一に荷電したアニオン性基、二重に荷電したアニオン性基、およびこれらの組み合わせを含むリンカーを意図する。
【００８４】
種々のアニオン性リンカーの任意のものが、使用され得る。 代表的に、ＢとＤとの間のリンカーは、約４〜約３０のリンカー鎖原子、そして代表的には、４〜２０のリンカー鎖原子のリンカー鎖長を有するが、より短いリンカーおよびより長いリンカーもまた、使用され得る。 いくつかの例示的なアニオン性リンカーは、添付の図面、および以下の実施例において調製される化合物に、示されている。
【００８５】
核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）ＢとリンカーＬとの間の連結は、この核酸塩基上の任意の適切な位置に位置し得る。 好ましくは、この核酸塩基上の結合部位は、相補的核酸塩基に対するその核酸塩基のＨ結合能力を妨害または排除しないように、選択される。 Ｂがプリン核酸塩基を含む場合、リンカーは、通常、このプリンのＮ−８位に結合する。 Ｂが７−デアザプリン核酸塩基を含む場合、リンカーは、通常、この７−デアザプリンのＮ−７位に結合する。 Ｂがピリミジン塩基を含む場合、リンカーは、このピリミジンのＣ−５位に結合する。 ヌクレオシドサブユニット、ヌクレオチドサブユニット、またはポリヌクレオチドサブユニットにおいて、プリンまたは７−デアザプリンは、通常、このプリンまたはデアザプリンのＮ−９位を介して糖部分に結合し、そしてピリミジンは、通常、このピリミジンのＮ−１位を介して糖部分に結合する。
【００８６】
リンカーが核酸塩基に結合する特定の実体は、本発明の目的に適切な任意の化学基であり得る。 種々の適切な化学基が公知である。 例えば、核酸塩基に共有結合するリンカーにおける末端化学基は、アセチレン部分（−Ｃ≡Ｃ−）であり得、そしてしばしば、プロパルギル部分（−Ｃ≡ＣＣＨ
２ −）である。 なぜなら、このような結合部分は、プライマー伸長のために使用される種々のポリメラーゼと特に適合性である傾向があるからである。 しかし、非アセチレン系化学基もまた、意図される。 核酸塩基への結合に適した末端基の例は、以下の例示的な参考文献において見出され得る：
【００８７】
【表１】
リンカーＬと色素部分Ｄとの間の結合は、色素部分における任意の適切な位置に、好ましくは、色素の蛍光特性が不利に影響を受けないように、位置し得る。 キサンテン系環については、リンカーは、任意の利用可能な炭素原子に結合し得るか、またはローダミン系キサンテン環における窒素原子の１つに結合し得る。 ローダミン色素またはフルオレセイン色素については、ペンダントフェニル環における置換位置もまた利用可能であり、特に、キサンテン環のＣ９に対してパラの位置（５位）、またはオルトカルボキシル基に対してパラの位置（６位）である。 さらに、リンカーが核酸塩基に結合される特定の化学基は、本発明の目的に適切な任意の化学基であり得る。 種々の化学基および種々の色素における結合点は、例えば、米国特許第５，６５４，４４２号および同第５，１８８，９３４号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第６，０２０，４８１号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第５，８００，９９６号（Ｌｅｅら）、同第６，０２５，５０５（Ｌｅｅら）、同第５，８２１，３５６号（Ｋｈａｎら）、同第５，７７０，７１６号（Ｋｈａｎら）、同第６，０８８，３７９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，０５１，７１９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，０９６，８７５号（Ｋｈａｎら）、同第６，０８０，８６８号（Ｌｅｅら）１９９９年６月３日に出願された米国特許出願番号０９／３２５，２４３（Ｌａｍら）、２０００年２月７日に出願された０９／４９８，７０２（Ｕｐａｄｈｙａら）、２０００年５月２日に出願された０９／５６４，４１７（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、ならびに１９９９年１１月３日に出願された０９／４３３，０９３（Ｌｅｅら）に見出され得る。 １つの好ましい実施形態において、Ｃ９フェニル基を含むキサンテン誘導体（例えば、ローダミン色素またはフルオレセイン色素）については、リンカーは、この色素に、５−カルボキシフェニル基（キサンテンＣ９炭素原子に対してパラ）または６−カルボキシフェニル基（キサンテンのＣ９炭素原子に対してメタ）を介して結合する。 別の好ましい実施形態において、キサンテン色素について一般に、リンカーは、好ましくは、このキサンテン環の４−炭素原子または５−炭素原子に結合する。 第３の好ましい実施形態において、ローダミン系キサンテン色素およびローダミン色素について、リンカーは、このキサンテン環の３−窒素原子または６−窒素原子に結合する。 本発明の結合体を形成するためのさらなるガイダンスは、本明細書中の実施例を参照して、以下に見出され得る。
【００８８】
本発明の色素標識核酸塩基はまた、Ｂ−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｄ２の形態を有し得、ここで、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方がアニオン性リンカーであるようなリンカーであり、そしてＤ１およびＤ２は、蛍光ドナー／アクセプター対のメンバーである。 １つの実施形態において、Ｄ１はドナー色素であり、そしてＤ２はアクセプター色素である。 別の実施形態において、Ｄ２はドナー色素であり、そしてＤ１はアクセプター色素である。 ドナー／アクセプター対に関して、ドナー色素およびアクセプター色素は、異なる（同一でない）スペクトル特性を有することが、理解される。 従って、ドナーおよびアクセプターは、同じ型の芳香族環構造を有し得る（例えば、ドナーとアクセプターとの両方がフルオレセイン色素である場合、または両方がローダミン色素である場合）が、各々における置換基の性質に起因して、異なるスペクトル特性が、ドナーおよびアクセプターに対して生じ得る。 ドナー色素は、アクセプター色素の蛍光発光の強度を、同じ条件下でドナー色素の非存在下で観察される強度に対して、増強するために効果的である。 この形態の結合体は、本明細書中において、「ＦＲＥＴプローブ」、「ＦＲＥＴ標識結合体」、またはＦＲＥＴ標識ヌクレオチドと称され得る。 なぜなら、ドナー色素の励起の際に、この結合体は、ドナーからアクセプターへの非放射性蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得、その結果、アクセプター色素が次いで、それに応答して、第２の波長で蛍光を発光し得るからである。
【００８９】
ドナー色素およびアクセプター色素は、任意の蛍光色素であり得、そして各々が、好ましくは、蛍光芳香族色素である。 例えば、ドナー色素およびアクセプター色素は、別々に考慮すると、キサンテン、ローダミン、ジベンゾローダミン、フルオレセイン、［８，９］ベンゾフェノキサジン、シアニン、フタロシアニン、スクアレン、またはｂｏｄｉｐｙ色素であり得る。 さらに、ドナー色素およびアクセプター色素は、各色素における種々の結合部位のいずれかを使用して、一緒に結合し得る。 例えば、Ｄ１がフルオレセインであり、そしてＤ２がローダミンである場合（これらの両方が、キサンテン環のＣ９に結合したペンダントフェニル基を含む）、Ｄ１は、そのキサンテン環を介して（好ましくは、Ｃ４を介して）、Ｄ２のペンダントフェニル基に（例えば、このペンダントフェニル基の５−カルボキシ基または６−カルボキシ基を介して）結合し得る。 これは、頭−尾配置と称される。 あるいは、この結合の位置は逆になり得、その結果、Ｄ２は、そのキサンテン環を介して、Ｄ１のペンダントフェニル環に結合する（頭−尾配置の別の例）。 他の代替において、Ｄ１およびＤ２は、例えば、それらのペンダントフェニル環を介して尾−尾で結合し得るか、またはそれらのキサンテン環を介して頭−頭で結合し得る。
【００９０】
上記のように、Ｌ１およびＬ２のうちの少なくとも一方は、アニオン性リンカーである。 このようなアニオン性リンカーの特性は、一般に、アニオン性リンカーＬとして上記で議論されている。
【００９１】
１つの実施形態において、Ｌ１は、アニオン性リンカーであり、そしてＬ２は、非アニオン性リンカーである。 Ｌ２について、種々の非アニオン性リンカーの任意のものが、Ｄ１をＤ２に結合するために使用され得る。 ドナー−アクセプター結合体を形成するための一般的な懸念は、例えば、米国特許第５，８６３，７２７号、同第５，８００，９９６号、同第５，９４５，５２６号、および同第６，００８，３７９号に議論されている。 １セットの実施形態において、Ｄ１−Ｌ２−Ｄ２は、以下の構造（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のうちの１つを含み得る：
（ａ）−Ｄ１−Ｒ
２１ Ｚ １ Ｃ（Ｏ）Ｒ ２２ Ｒ ２８ −Ｄ２
（ｂ）−Ｄ１−Ｒ
２８ Ｒ ２２ Ｃ（Ｏ）Ｚ １ Ｒ ２１ −Ｄ２
（ｃ）−Ｄ１−Ｒ
２８ Ｒ ２２ Ｒ ２８ −Ｄ２
ここで：Ｒ
２１は、Ｃ １ 〜Ｃ ５アルキルジイルであり、Ｚ １は、ＮＨ、Ｓ、またはＯであり、Ｒ ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、または少なくとも１つの不飽和結合もしくは縮合環構造を有する５員環もしくは６員環であり、そしてＲ ２８は、結合またはスペーサー基である。 このような色素間結合の詳細および例は、例えば、米国特許第５，８００，９９６号において見出され得る。 特定の実施形態において、Ｒ ２２は、エテンジイル、エテンジイル、１，３−ブタジエンジイル、または１，３−ブタジインジイルである。
【００９２】
別の実施形態において、Ｌ１は、非アニオン性リンカーであり、そしてＬ２は、アニオン性リンカーである。 この場合、種々の非アニオン性リンカーの任意のものが、ＢをＤ１に結合するために使用され得る。 例示的な非アニオン性リンカーの説明は、上記表１における参考文献において見出され得る。 例えば、Ｌ１は、以下の非限定的例の任意のものであり得るか、またはそれを含み得る：
−Ｃ≡ＣＣＨ
２ ＮＨ−
−Ｃ≡ＣＣＨ
２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−
−Ｃ≡ＣＣＨ
２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−
−Ｃ≡ＣＣＨ
２ ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ５ ＮＨ−
−Ｃ≡ＣＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ
２ ） ５ ＮＨ−
−Ｃ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ
２ ） ５ ＮＨ−
−Ｃ≡Ｃ−（ｐ−Ｃ
４ Ｈ ６ ）ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−
−Ｃ≡Ｃ−（ｐ−Ｃ
６ Ｈ ４ ）ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−
−Ｃ≡Ｃ−（ｐ−Ｃ
６ Ｈ ４ ）−（ｐ−Ｃ ６ Ｈ ４ ）−Ｃ≡Ｃ−
−Ｃ≡Ｃ−（ｐ−Ｃ
４ Ｈ ６ ）−
−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−
ここで、左側のエテンまたはエチン部分は、核酸塩基に結合し、そして右側の結合は、代表的に、色素に直接結合するか、またはカルボニル基を介して色素と間接的に結合する。 さらなる非アニオン性リンカーは、添付の図面における例示的な化合物に示される。
【００９３】
より一般的には、非アニオン性リンカーは、電荷が中性であるか、または正に荷電したもののいずれかであるリンカーを包含する。 電荷が中性のリンカーとは、ｐＨ７において、荷電した基を含まない（すなわち、６と８との間のｐＫａを有する荷電基を有さない）か、または正味０の電荷を提供するように相殺する、同数の正に荷電した基および負に荷電した基を含むかのいずれかであるリンカーをいう。 正に荷電したリンカーは、ｐＨ７において、正に荷電する（例えば、アンモニウムイオンまたはイミダゾールイオンの存在に起因する）。 好ましくは、非アニオン性リンカーは、電荷が中性のリンカーである。 好ましくは、電荷が中性のリンカーは、ｐＨ７において、荷電した基を含まない。
【００９４】
Ｌ１およびＬ２が両方、アニオン性リンカーである場合、Ｌ１およびＬ２の構造は、同一であるかまたは異なり得、そしてこのリンカーにおけるアニオン性の基もまた、同一であるかまたは異なり得る。 本発明による結合体構造に関するさらなるガイダンスは、以下に提供される。
【００９５】
本発明の化合物は、任意の適切な合成方法によって調製され得る。 代表的に、本発明の結合体は、モジュラーアプローチを使用して形成され、このアプローチにおいて、核酸塩基（これは、例えば、核酸塩基を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドの形態で、提供され得る）、第１の色素、第２の色素（存在する場合）、および１つ以上のリンカーまたはリンカー前駆体が、連続工程および／または並行工程において混合されて、所望の標識生成物を生成する。 いくつかの例示的なアプローチが、以下の実施例に記載されており、これらの実施例は、種々の長さおよび組成のリンカーを含む、いくつかの異なる色素標識ヌクレオチドの合成を記載する。
【００９６】
実施例１は、本発明によって、標識ヌクレオチドを調製するための合成方法を記載し、この標識ヌクレオチドは、（ｉ）アニオン性リンカーによって、７−デアザアデニン核酸塩基のＣ−８を介して結合される、第１の色素であって、このアニオン性リンカーは、リンカー原子の鎖内に、リン酸ジエステルを含む、第１の色素、および（ｉｉ）電荷が中性の（非アニオン性）リンカーによってこの第１の色素に結合した、第２の色素を含む。 核酸塩基と第１の色素との間のリンカーは、１３のリンカー鎖原子を含む。 第１の色素と第２の色素との間のリンカーは、１０のリンカー原子を含む。 この実施例において、二官能性リンカー部分７は、いくつかの工程で形成され、まず環状ホスホロアミダイト１をメチルグリコレート２と反応させ、次いで酸化して、ホスフェート化合物３を形成する。 メチル基をこのホスフェートから除去して４を生成し、そしてアミノ基およびカルボキシル基の脱保護によって化合物５を生成した後に、Ｆｍｏｃ保護基がアミンに結合されて、カルボン酸６を生成する。 このカルボン酸の、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）での活性化により、エステル７が生成する。 これは、用途の広いリンカーシントンである。 次いで、エステル７を７−アミノプロパルギル−７−デアザアデノシントリホスフェート８と反応させて、化合物９を形成する。 化合物９との反応のために、色素化合物１１を、ｐ−アミノメチル安息香酸をＦｍｏｃ酸クロリドと反応させてＦｍｏｃ保護されたｐ−アミノメチル安息香酸を形成することによって、調製した。 ＮＨＳでのこの安息香酸の活性化の後、ＮＨＳエステル生成物を４'−アミノメチル−６−カルボキシフルオレセインと反応させて、予測したアミド付加体を生成した。 次いで、６−カルボキシル基をＮＨＳと反応させて、色素化合物１１を生成した。 化合物１０および１１の反応により、付加体１２を生成し、ここで、アニオン性（リン酸含有）リンカーが、フルオレセイン色素と核酸塩基との間に完全に形成される。 Ｆｍｏｃ基の除去の後、得られた遊離アミン化合物１３をローダミンＮＨＳエステル１４と反応させて、色素標識ヌクレオチド１５を形成した。
【００９７】
実施例１において使用される化合物１０を調製するための代替的な方法は、実施例２において提供される。 この実施例は、リン酸モノエステルを含むリンカーシントン１９を、ヨウ素化核酸塩基（７−ヨード−デアザアデニン）を含むヌクレオシドとの反応のために調製する。 簡単には、３−アミノ−１−プロパイン１６を、メチルグリコレート２と反応させ、予想されるアミド生成物１７を形成する。 １７の環状ホスホロアミダイト１との反応に、リン酸トリエステル１８を生じる酸化が続く。 リン酸基の除去後、得られたホスホジエステル化合物１９を、ヨードヌクレオシド２０と反応させ、付加物２１を得る。 このヌクレオシドの５'−ヒドロキシ基を、亜リン酸オキシクロライドと反応させ、ジクロロ一リン酸２２を形成し、その後ピロリン酸を添加して、ヌクレオシド三リン酸２３を提供する。 末端アミン窒素由来のトリフルオロアセチル保護基は、シントン１０を提供する。
【００９８】
実施例４は、（ｉ）電荷が中性の（非アニオン性）リンカーによって７−デアザアデニン核酸塩基に結合された第１の色素、および（ｉｉ）モノアニオン性スルホン酸部分を含むアニオン性リンカーによって第１の色素に結合された第２の色素を含むＦＲＥＴ標識ヌクレオチドを調製するための合成方法の合成を記載する。 核酸塩基と第１の色素との間のリンカーは、５個のリンカー鎖原子を含む。 第１の色素と第２の色素との間のリンカーは、１０個のリンカー原子を含む。 実施例４に詳述されるように、ｐ−アミノメチル安息香酸２４は、硫酸と反応され、メタ硫酸産物２５を形成する。 Ｆｍｏｃ−スクシンイミドとの反応は、Ｆｍｏｃ保護されたアミン２６を生じ、次いでこれを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、ＮＨＳエステル２７を形成する。 ＮＨＳエステル２７との反応について、色素標識ヌクレオシド三リン酸３０は、アミノプロパルギル（ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｒｇｙｌ）ヌクレオシド三リン酸８を、色素中間体２８（トリフルオロアセチル保護４'−アミノメチル基および６−カルボキシ基のＮＨＳエステルを含むフルオレセイン色素）と反応させることによって調製し、色素標識ヌクレオチド２９を生じ、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）基の除去が続いてアミン化合物３０を生じる。 ＮＨＳエステル２７と化合物３０との反応は、Ｆｍｏｃ保護化合物３１を生じる。 Ｆｍｏｃ基の除去後、得られたアミン化合物３２を色素ＮＨＳエステル１４と反応させ、色素標識ヌクレオチド３３を得る。 第１の色素と第２の色素との間のリンカーは、リンカー鎖中のベンゼン部分に結合するスルホン酸基を含む。
【００９９】
実施例５において、ドナー−アクセプター対の第１の色素および第２の色素が、リン酸含有リンカーによって結合され、そしてこのドナー色素が電荷が中性のリンカーによって核酸塩基に結合される標識されたヌクレオチドを調製するためのプロトコルが記載される。 このヌクレオチド産物は、実施例１の産物とは異なる。 なぜなら、アニオン性リン酸リンカーは、第１の色素と核酸塩基との間に位置するからである。 実施例５の産物もまた、実施例４の産物と異なる。 なぜなら、２つの色素環のアニオン性リンカーは、リンカー鎖に結合したスルホン酸基ではなく、リンカー鎖中のリン酸モノエステルを含むからである。 この化合物はまた、いくつかのリンカーの長さにおいて異なる。
【０１００】
実施例５に詳述されるように、アミノプロパルギルヌクレオチド８を、色素ＮＨＳエステル１１と合わせ、Ｆｍｏｃ保護化合物３４を得る。 Ｆｍｏｃ基の除去後、得られたアミン３５を、エステル７と反応させ、Ｆｍｏｃ保護された色素標識ヌクレオチド３６を生成する。 Ｆｍｏｃ基の除去後、得られたアミン３７を、色素ＮＨＳエステル１４と反応させ、色素標識ヌクレオチド３８を得る。
【０１０１】
２つのアニオン性リンカーを含むＦＲＥＴ標識ヌクレオチドを調製するための方法が、実施例６に記載される。 詳細には、核酸塩基と第１の色素との間のアニオン性リンカーは、リン酸ジエステル部分を含み、そして第１の色素と第２の色素との間のアニオン性リンカーは、スルホン酸部分を含む。 実施例６において記載される方法において、ヌクレオチドアミン１０（実施例１および２）を、色素ＮＨＳエステル２８と反応させ、色素標識ヌクレオチド３９を形成し、ここで、色素およびヌクレオチドは、リン酸含有リンカーによって結合される。 Ｆｍｏｃ基の除去は、アミン化合物４０を生成し、これを、スルホン酸含有ＮＨＳエステル２７と反応させ、Ｆｍｏｃ保護化合物４１を得る。 Ｆｍｏｃ基の除去後、得られたアミン４２を、色素ＮＨＳエステル１４と反応させ、色素標識ヌクレオチド４３を得る。
【０１０２】
実施例７は、実施例１に記載される経路と比較して、実施例６由来の色素標識ヌクレオチド化合物４０を使用して、代替的な経路によってどのように本発明の結合体を形成し得るかを示す。 実施例１において、第１の色素と第２の色素との間の主要なリンカーシントンは、化合物１１の一部として提供され、これは、第１の色素（核酸塩基の結合のための）および第１の色素に結合するＦｍｏｃ保護リンカーシントンを含む。 実施例７の方法において、リンカーは、第２の色素に結合したリンカーシントンを含む化合物（４４）の一部として提供される。 この化合物を、色素標識ヌクレオチド４０と反応させ得、所望の生成物１５を得る。 従って、実施例７は、所望の場合、本発明の特定の化合物を合成するために、種々のシントンの結合の順序が、どのように変化し得るかを示す。
【０１０３】
実施例８Ａ〜８Ｂは、核酸塩基がシトシンであることを除き、実施例１の生成物と類似する２つのＦＲＥＴ標識ヌクレオチドを調製するための方法を記載する。 実施例８Ａにおいて、リンカーは、実施例１の生成物のリンカーと同じである。 実施例８Ｂにおいて、核酸塩基と第１の色素との間のリンカーは、プロパルギル基の後に挿入されたエトキシ基の包含に起因して、実施例８Ａにおける対応するリンカーよりも長い。
【０１０４】
実施例９、１０、および１１は、第１の色素と第２の色素との間の選択されたアニオン性リンカーを含むさらなるＦＲＥＴ標識核酸塩基（チミン）を作製する方法を記載する。 実施例９における方法は、２つの色素間のスルホン酸含有アニオン性リンカー、および第１の色素と核酸塩基との間の電荷が中性のリンカーを有する生成物６４を生じる。 実施例１０由来の生成物６９は、第１の色素と第２の色素との間にリン酸含有アニオン性リンカーを有する。 このアニオン性リンカーはまた、実施例９のリンカーよりも長い（１０リンカー鎖原子に対して１８リンカー鎖原子）。 実施例１１における方法は、核酸塩基が７−デアザグアノシンであり、そして結合した色素が異なることを除き、生成物６９と類似の生成物７７を生成する。
【０１０５】
形態Ｂ−Ｌ−Ｄのいくつかの例示的な色素標識結合体を調製するための方法が、実施例１２、１３および１８に提供される。 実施例１２Ａは、スルホン化されたベンゼン部分によって示されるような、スルホン酸基を含むアニオン性リンカーを有する色素標識結合体８２を調製するための方法を記載する。 実施例１２Ｂにおいて、色素標識結合体８５は、スルホン酸基およびリン酸基の両方を含む二価アニオン性リンカー（−２の正味の形式的な電荷）を有する。 実施例１３において、色素標識結合体９５は、リンカー鎖中のホスホジエステル部分を含むアニオン性リンカーを有する。
【０１０６】
実施例１８（図２２Ａおよび２２Ｂもまた参照のこと）は、リンカーの一部としてカルボキシベンゼン部分を有すると示されるように、カルボキシアニオン性基を含むリンカーを有する形態Ｂ−Ｌ−Ｄの結合体を形成する方法を提供する。 カルボン酸基はまた、適切なカルボキシル化リンカーシントンを調製することによって、他の様式でリンカー中に含まれ得ることが理解される。
【０１０７】
実施例１４、１５および１６は、ＦＲＥＴ標識結合体を調製するためのさらなる方法を提供し、ここで、核酸塩基および第１の色素は、アニオン性リンカーによって結合され、そしてドナーおよびアクセプター色素は、電荷が中性のリンカーによって結合される。 実施例１４および１６の核酸塩基は、７−デアザアデニンである。 実施例１５の核酸塩基は、７−デアザグアニンである。 実施例１４において、ホスホジエステル部分は、核酸塩基上の７−プロパルギル基に結合され、そしてリンカーの残りは、フルオレセイン色素の垂れ下がったフェニル環に結合するエチルアミノアシル基として提供される。 実施例１５において、ホスホジエステル部分は、７−プロパルギルフェニルプロピニル基によって核酸塩基に結合され、そしてリンカーの残りは、エチルアミノアシル部分として提供される。 実施例１６において、ホスホネートモノエステルは、メチルアシルアミノプロパルギル基によって核酸塩基に結合され、そしてリンカーの残りは、エチルアミノアシル部分として提供される。
【０１０８】
前述の実施例は、本発明に従う、広範な種々の色素標識核酸塩基化合物を示し、これらとしては、４つの異なる型の核酸塩基、異なる組成物および長さのリンカー、多数の異なる型の色素、およびそれらの種々の組み合わせが挙げられる。 形態Ｂ−Ｌ１−Ｄ１−Ｌ２−Ｄ２の結合体のいくつかの特定の例が記載され、ここで、Ｌ１、Ｌ２または両方が、種々の型および長さのアニオン性リンカーである。 形態Ｂ−Ｌ−Ｄの結合体の特定の例がまた提供され（実施例１２Ａ、１２Ｂ、および１３）、そして改変は、Ｌ１がアニオン性リンカーであるＦＲＥＴ対の実施例から直ちに明らかであるはずである。
【０１０９】
本発明はまた、本発明に従う、結合体を含むヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む。 本発明の特に好ましいヌクレオシド／ヌクレオチドは、以下の式：
【０１１０】
【化７】
によって示され、ここで、Ｗ
１は、ＯＨ、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ ２ 、Ｎ ３ 、またはＯＲであり、ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（例えば、ＯＣＨ ３またはＯＣＨ ２ ＣＨ ３ ）である；Ｗ ２は、ＯＨまたはポリメラーゼ媒介指向型プライマー伸長をブロックし得る基（例えば、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ ２ 、Ｎ ３ 、またはＯＲであり、ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（例えば、ＯＣＨ ３またはＯＣＨ ２ ＣＨ ３ ））である；Ｗ ３は、ＯＨ、またはその一リン酸アナログ、二リン酸アナログ、または三リン酸アナログであり；そしてＬＢ（標識された塩基）は、本発明の色素標識核酸塩基結合体を表す。 １つの実施形態において、Ｗ １はＯＨではない。 別の実施形態において、Ｗ ２はＯＨではなく、その結果、この化合物は、３'伸長可能ではない。 別の実施形態において、Ｗ １およびＷ ２は、Ｈ、Ｆ、およびＮＨ ２から選択される。 さらなる実施形態において、Ｗ １はＦでありそしてＷ ２はＨであり、Ｗ １はＨでありそしてＷ ２はＦであり、Ｗ １およびＷ ２は各々Ｆであるか、またはＷ １およびＷ ２は各々Ｈである。 さらに、前述の実施形態の各々について、Ｗ １単独、Ｗ ２単独、およびＷ １およびＷ ２の組み合わせについて、Ｗ ３は、ＯＨ、一リン酸、二リン酸、または三リン酸であり得ることが意図される。 ＬＢについて、例示的な核酸塩基としては、アデニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、シトシン、グアニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、チミン、ウラシル、およびイノシンが挙げられる。
【０１１１】
例えば、１つの特定の実施形態において、Ｗ
３が三リン酸である場合、本発明は、以下の式：
【０１１２】
【化８】
で示される構造を有するヌクレオチド三リン酸を含み、ここで、ＸはＨまたはＦである。 このようなターミネーターヌクレオチドおよび３'ＯＨ基を欠く上記の他のヌクレオチドは、蛍光検出を利用するＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法、およびまたミニ配列決定において鎖終結剤としての特定の適用を見出す。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明は、以下の式：
【０１１４】
【化９】
で示される構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸を含み、ここで、ＬＢは、上記の通りに定義される。 このような化合物は、３'伸長可能なヌクレオチドの例である。 この型の標識された２'−デオキシヌクレオチドは、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応およびニックトランスレーションにおいて）ポリメラーゼ伸長産物を標識するための試薬として特定の適用を見出す。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、以下の式：
【０１１６】
【化１０】
で示される構造を有するリボヌクレオチド三リン酸を含み、ここで、ＬＢは、上記に定義される通りである。 この型の標識されたヌクレオチドは、例えば、米国特許第５，９３９，２９２号（Ｇｅｌｆａｎｄら）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：９９４７−９９５９（１９８８）、およびＳｈａｗ，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：４４９５（１９９５）において議論されるように、切断可能なヌクレオチド間結合を有する不安定なヌクレオチドを利用する配列決定法のための試薬および配列決定法における試薬として特定の適用を見出す。
【０１１７】
本発明はまた、上に議論された型の１つ以上の異なる核酸塩基−色素結合体を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの混合物を提供する。 このようなポリヌクレオチドは、多数の重要な状況（例えば、ＤＮＡ配列決定、ライゲーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プローブハイブリダイゼーションアッセイ、および種々の他の配列の検出方法または定量方法）において有用である。
【０１１８】
色素含有ポリヌクレオチド（標識されたポリヌクレオチドとしてもまた本明細書中で称される）は、酵素的に（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、リガーゼ、または他の酵素（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２４章、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎおよび協同研究者（１９８１））を使用して）、または化学的合成によって（例えば、ホスホラミダイト法、亜リン酸−トリエステル法によって）合成されるかなどであり得る。 本発明の色素標識は、上記のような標識されたヌクレオチド三リン酸モノマーを利用する酵素合成の間、または標識された非ヌクレオシドまたはヌクレオシドホスホラミダイトを使用する化学合成の間に導入され得るか、あるいは合成に引き続き導入され得る。 標識されたポリヌクレオチドを形成するための例示的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）、米国特許第６，００８，３７９号（Ｂｅｎｓｏｎら）および本明細書中に引用される参考文献において見出され得る。
【０１１９】
一般的に、標識されたポリヌクレオチドが、酵素学的合成を使用して作製される場合、以下の手順が使用され得る。 オリゴヌクレオチドプリマーは、鋳型ＤＮＡ鎖中の相補的な配列にアニーリングされる。 デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物が添加され、ここで、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドは、本発明の核酸塩基−色素結合対を含む。 ポリメラーゼ酵素の存在下で、色素標識ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介鎖合成の間に標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みによって形成される。 代替的な酵素学的合成方法において、１つの代わりに、２つのプライマー（一方のプライマーは、＋鎖に相補的であり、他方のプライマーは、標的の鎖に相補的である）を使用され、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、そして反応温度は、変性温度と伸長温度との間でサイクルされ、それにより、ＰＣＲ（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））によって標的配列に対する標識された相補体を、指数関数的に合成する（増幅する）。
【０１２０】
標識されたポリヌクレオチドは、ホスホラミダイト方法のような任意の適切な方法を使用して化学的に合成され得る。 ホスホラミダイト方法によってポリヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細な説明は、他で提供される（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号および第４，４１５，７３２号、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：１−１７（１９８２）、Ｕｓｅｒｓ Ｍａｎｕａｌ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ａｎｄ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，６−１頁〜６−２２頁、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ Ｎｏ．９０１２３７（１９９１））。 標準的なホスホジエステル結合またはホスホジエステル結合アナログを含むポリヌクレオチドを作製するためのホスホラミダイト方法および他の合成方法の説明は、Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９０），およびＳ． Ａｇｒａｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９３）において見出される。
【０１２１】
ホスホラミダイト方法は、その効率的および迅速なカップリングおよび出発材料の安定性に起因して、好ましい方法である。 この合成は、固体支持体に結合したポリヌクレオチド鎖を増殖することによって行われ、その結果、過剰の試薬（これは、液相で存在する）は、ろ過によって容易に除去され、それにより、合成サイクル間の精製工程の必要性を排除する。
【０１２２】
（ＩＩＩ．方法）
本発明の核酸塩基−色素結合体は、蛍光検出を利用する任意の方法（特に、電気泳動によって十分に分離されない分析物の同時検出を必要とする方法）に適している。 本発明は特に、生化学的分離手順（例えば、電気泳動）に供されているポリヌクレオチドのクラスを検出するのに十分に適している。
【０１２３】
１つの局面において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチドを同定するための方法を提供する。 この方法は、１つ以上の標識された異なる配列のポリヌクレオチドを利用し、このポリヌクレオチドは、同じ長さまたは異なる長さを有し得、ここで、各異なる配列のポリヌクレオチドは、固有の核酸塩基−色素結合体を含む。 １つ以上の標識された異なる配列のポリヌクレオチドは、サイズに基づいて異なる配列のポリヌクレオチドを分離する電気泳動によって分離される。 次いで、各異なる配列のポリヌクレオチドは、その電気泳動の移動度および蛍光シグナルに基づいて同定され得る。
【０１２４】
これらのポリヌクレオチドは、各異なるポリヌクレオチドが電気泳動の移動度および蛍光シグナルの固有の組み合わせに基づいて同定可能であるという条件で、任意の適切な方法によって形成され得る。 例えば、２つの異なるポリヌクレオチドは、同一の色素部分を含み得るが、異なる電気泳動移動度を示し得る。 あるいは、２つの異なるポリヌクレオチドは、別個の（スペクトル分解可能な）蛍光シグナルを生成する異なる色素部分を含み得るが、同じ電気泳動移動度を示し得る。 別の例において、異なるポリヌクレオチドは、蛍光シグナルおよび移動度の両方において異なり得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、この方法は、異なる標識されたポリヌクレオチドが、（ｉ）複数の異なる標的配列、および（ｉｉ）標的配列に相補的な複数の異なるポリヌクレオチドとの反応によって形成される、複数の形式で使用され得る。 例えば、異なるポリヌクレオチドは、例えば、酵素作用による改変に起因して、ポリヌクレオチドサンプル中の相補的な標的配列にハイブリダイズした後、構造における変化を起こすように設計され得、これにより、同定を可能にする移動度および蛍光の固有の組み合わせを有する異なる標識されたポリヌクレオチドを生成する。 このような反応は、単一の反応混合物中で同時に行われ得るか、または電気泳動分離の前に合わせられ得る別々の反応混合物中で行われ得る。 このような標識されたポリヌクレオチドを生成するためのいくつかの例示的なアッセイ形式は、以下に考察される。
【０１２６】
Ｓａｎｇｅｒ型配列決定は、その配列が決定されるかまたは確認される一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを使用する、インビトロでＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を包含する。 合成は、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型にアニールする場所に基づいて規定の場所で開始される。 この合成反応は、連続するＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結される。 例示的な鎖終結ヌクレオチドアナログは、２'，３'−ジデオキシヌクレオシド５'−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）（これは、５'から３'へのＤＮＡ鎖の伸長に必要な３'−ＯＨ基を欠く）を含む。 適切な部分のｄＮＴＰ（２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸）および４つのｄｄＮＴＰが使用される場合、酵素触媒重合は、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位で、一部の鎖の集団において終結される。 標識されたｄｄＮＴＰが各反応に使用される場合、所望の配列は、高分解能電気泳動による分離の間または分離後に終結された鎖の蛍光シグナルの検出によって得られ得る。 鎖終結方法において、本発明の色素は、配列決定プライマーまたは終結ヌクレオチドのいずれかに結合し得る。
【０１２７】
「フラグメント分析」法または「遺伝子分析」法において、標識されたポリヌクレオチドフラグメントは、例えば、ポリヌクレオチドライゲーションまたはポリメラーゼ指向プライマー伸長によって、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを使用して、鋳型指向酵素学的合成を介して生成される。 次いで得られたフラグメントは、サイズ依存分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され、そして分離されたフラグメントは、例えば、レーザー誘導性蛍光によって検出される。 特定の実施形態において、多数のクラスのポリヌクレオチドが同時に分離され、そして異なるクラスが、スペクトル分解標識によって区別される。
【０１２８】
フラグメント分析方法（増幅フラグメント長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として公知）は、ＰＣＲによって増幅される増幅フラグメント長多型（すなわち、制限フラグメント長多型）に基づく。 種々のサイズのこれらの増幅フラグメントは、ファミリー系列における以下の変異遺伝子に対する連鎖マーカーとして働く。 この増幅フラグメントが染色体上の変異遺伝子に接近するほど、連鎖相関は高くなる。 多くの遺伝的障害についての遺伝子は同定されていないため、これらの連鎖マーカーは、疾患の危険性または父性を評価するのを助ける。 ＡｍｐＦＬＰ技術において、ポリヌクレオチドを、標識されたポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用することによって、またはＰＣＲにおいて標識されたヌクレオチド三リン酸を使用することによって、標識し得る。
【０１２９】
ニックトランスレーションとして公知の別のフラグメント分析方法において、二本鎖ＤＮＡ分子中の１つ以上の標識されていないヌクレオチドサブユニットは、標識されたサブユニットと置換される。 遊離の３'−ヒドロキシル基は、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）で処理することにより生じる「ニック」により、標識されていないＤＮＡ内で生成する。 このＤＮＡポリメラーゼＩは、次いで、このニックの３'ヒドロキシルへの１つ以上の標識されたヌクレオチドの付加を触媒する。 同時に、この酵素の５'から３'のエキソヌクレアーゼ活性は、このニックの５'ホスホリル末端から１つ以上のヌクレオチドサブユニットを除去し得る。 遊離の３'−ＯＨ基を有する新たなヌクレオチドは、除去されたヌクレオチドの位置に組み込まれ、そしてニックは３'方向に１ヌクレオチド単位だけずれる。 この３'シフトは、既存の標識されていないヌクレオチドの除去を伴って、ＤＮＡに対する新たな標識されたヌクレオチドの連続的な付加を生じる。 ニックトランスレーションされたポリヌクレオチドは、次いで、分離プロセス（例えば、電気泳動）を使用して分析され得る。
【０１３０】
別の代表的なフラグメント分析方法は、可変数のタンデム反復、すなわちＶＮＴＲに基づく。 ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接する複数のコピーを含む二本鎖ＤＮＡの領域であり、この反復単位の数は、（例えば、ヒトの）集団の異なるメンバー間で可変である。 ＶＮＴＲ座位の例は、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８およびＡｐｏ Ｂである。 ＶＮＴＲ法のサブセットは、ミクロサテライト反復、または短タンデム反復（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２〜４塩基）の反復配列により特徴付けられるタンデム反復の検出に基づく。 ヒトにおいて最も多量に散剤する反復性ＤＮＡファミリーは、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド反復ファミリー（（ＣＡ）ｎジヌクレオチド反復ファミリーとも呼ばれる）である。 ヒトゲノム中に、代表的には１ブロックあたり１５〜３０個の反復を有する、５０，０００〜１００，０００もの多くの（ＣＡ）ｎ反復領域が存在すると考えられる。 これらの反復領域の多くは、長さにおいて多型であり、従って有用な遺伝マーカーとして働き得る。 好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法において、標識を、色素標識ＰＣＲプライマーを使用することによって、ポリヌクレオチドフラグメントに導入する。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）として時折知られる別の例において、２つのポリヌクレオチド（プローブ対）（これらは標的配列における隣接領域に対して相補的である）を、ポリヌクレオチドの標的領域にハイブリダイズして、ニック二重構造を作製し、ここでこの２つのポリヌクレオチドの末端は互いに隣接している。 このハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブの末端が、標的中の値に対応するサブユニットと一致する（これと塩基対形成する）場合、２つのプローブを、ライゲーションによって（例えば、リガーゼで処理することによって）結合し得る。 次いで、このライゲーションされた産物を、検出し、標的配列の存在を立証する。 ライゲーション連鎖反応（またはライゲーション増幅反応）として公知のこのアプローチの改変において、ライゲーション産物は、第１の対由来のライゲーションされた産物に対して相補的なポリヌクレオチドプローブの第２の対についてのテンプレートとして働く。 プローブの２つの相補的な対の存在下における連続したサイクルの変性、再アニーリングおよびライゲーションを使用して、標的配列を指数関数的に増幅し、非常に少量の標的配列を、検出および／または増幅し得る。 このようなプロセスを実施するための例示的な条件（化学的ライゲーション様式を含む）は、米国特許第５，９６２，２２３号（Ｗｈｉｔｅｌｅｙら）、同第４，９８８，６１７号（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら）および同第５，４７６，９３０号（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら）、ならびに欧州特許公開ＥＰ２４６８６４Ａ（Ｃａｒｒら）、ＥＰ３３６７３１Ａ（Ｗａｌｌａｃｅ）およびＥＰ３２４６１６Ａ（Ｒｏｙｅｒら）に記載される。
【０１３２】
都合良くは、上記のいずれかのようなフラグメント分析法を、マルチプローブ様式で実施し得、このマルチプローブ様式では、サンプルは複数の異なるポリヌクレオチドプローブまたはプローブセットと反応し、これらのポリヌクレオチドプローブまたはプローブセットの各々は、異なる標的配列（例えば、遺伝子座亜の異なる対立遺伝子）および／または異なる座位に対して特異的である。 これらのプローブは、移動度および蛍光シグナルの独特の組み合わせを有するように設計され、異なる標的配列の存在の結果として、このアッセイにおいて生成される個々のプローブまたはプローブ産物の特異的な検出を可能にする。
【０１３３】
上記のフラグメント分析法において、標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動手順によって分離される。 核酸の電気泳動のための方法は、周知であり、そして例えば、ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８１），Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４），Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９、前出）、Ｐ． Ｄ． ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＪ． Ｃ． Ｃｏｌｂｕｒｎ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ． ，ＮＹ（１９９２）、ならびに米国特許第５，３７４，５２７号、同第５，６２４，８００号および／または同第５，５５２，０２８号に記載される。 代表的には、電気泳動マトリクスは、約２〜２０重量％、しばしば４〜８重量％の濃度（重量対容量）を有する架橋または非架橋のポリアクリルアミドを含む。 ＤＮＡ配列決定について、電気泳動マトリクスは、通常、尿素、ホルムアミドなどの様な変性剤を含む。 このようなマトリクスの形成について詳述された例示的な手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら「Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ９８％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｏｆ ７Ｍ Ｕｒｅａ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：２９９−３０５（１９８０），Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、前出）、およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
ＴＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｒｅｖ． Ａ，Ｊａｎｕａｒｙ １９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（ｐ／ｎ ９０３４３３），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により示される。 種々の適切な電気泳動媒体もまた、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他のメーカーから市販されており、これには例として、自動機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ「３７００」および「３１００」機器）で使用するための非架橋媒体が挙げられる。 特定の分離において用いられる最適な電位泳動条件（例えば、ポリマーの濃度、ｐＨ、温度、電圧、変性剤の濃度）は、多くの因子（分離される核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、これらの核酸が一本鎖であるか二本鎖であるか、および電気泳動によってその情報が求められるポリヌクレオチドの性質を含む）に依存する。 従って本発明の適用は、特定の分離のための条件を最適化するための標準的な予備試験を必要とする。
【０１３４】
電位泳動分離の間または後に、標識ポリヌクレオチドを、分離されたポリヌクレオチドの蛍光シグナルおよび移動時間（または移動距離）を記録することによって、またはそのポリヌクレオチドの相対蛍光および移動の順序のチャート（例えば、電気泳動クロマトグラフ）を作成することによって、検出または同定し得る。 このような検出を行うために、標識ポリヌクレオチドを、標準的な手段（例えば、高強度水銀放電ランプ、レーザーなど）によって照射し得る。 代表的には、この標識ポリヌクレオチドを、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザーまたは固相ダイオードレーザーにより生成されるレーザー光で照射する。 次いで、蛍光シグナルを、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、電荷結合デバイスなど）によって検出し得る。 代表的な電気泳動検出システムは、他の場所、例えば、米国特許第５，５４３，０２６号、同第５，２７４，２４０号、同第４，８７９，０１２号、同第５，０９１，６５２号および同第４，８１１，２１８号に記載される。
【０１３５】
図１９Ａ〜１９Ｂ、２０Ａ〜２０Ｂ、および２１Ａ〜２１Ｂは、本発明を支持する種々の結果を示す。 これらの結果を、米国特許第６，０９６，８７５号に記載される方法論に従って（プライマーが標識されていないこと以外は、実施例１２を参照のこと）、選択した色素標識ターミネーターの存在下におけるテンプレート依存型プライマー伸長によって調製したフラグメントを配列決定することにより得た。 プライマー伸長反応を、１つの型のターミネーターの存在下で行って、伸長フラグメントのラダーを作製した。 各研究における２つの伸長反応は、核酸塩基と色素との間、またはドナー色素とアクセプター色素との間に存在するリンカーのみが異なった。 詳細には、一方の反応混合物（Ａ）中のリンカーは、非アニオン性であり、一方、他方の反応混合物（Ｂ）中のリンカーは、代表的には、アニオン性リンカーである。
【０１３６】
図１９Ａおよび１９Ｂについて、２つのプライマー伸長反応を、ジデオキシグアノシン−５'−三リン酸（ｄｄＧＴＰ）の７−デアザアナログを使用して行った。 両方のターミネーターは、ただ１つの色素のみを含み、この色素は、米国特許第５，９３６，０８７号の図１４に記載されるタイプのジベンゾキサンテン色素であり、ここで、Ｒ
１は、ＣＨ ２ −ｐ−Ｃ ６ Ｈ ４であり、Ｒ ２は、プロピリジルであり、そして、ベンゾ基のＣ４およびＣ１０は、スルホン化されている。 この色素は、ジベンゾキサンテン環構造の１２窒素原子によって、７−デアザグアニン環のＣ７に結合されている。 図１９Ａについて、Ｌリンカーの構造は、Ｂ−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）−ｐ−Ｃ ６ Ｈ ４ ＣＨ ２ −Ｄであり、ここで、Ｂは、核酸塩基のＣ７を表し、Ｄは色素のＮ１２を表す。 図１９Ｂについて、Ｌリンカー構造は、Ｂ−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ ２ ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ｐ−Ｃ ６ Ｈ ４ ＣＨ ２ −Ｄであり、ここで、ＢおよびＤは、すぐ上で記載された通りである。
【０１３７】
図１９Ａの矢印は、左のピークおよび右のピークが横に隣接している中央のピークを示す。 左のフラグメントと中央のフラグメントの間の空間は、中央のフラグメントと右のフラグメントとの間の空間とほぼ等しいようであり、このことは、標的配列が、等しい数の介在サブユニットだけ互いに間隔のあいた３つのシトシンサブユニット（ｄｄＧターミネーターに対して相補的）を含むことを示唆している。 しかし、標的テンプレート（ｐＧＥＭ）の既知の配列に基づくと、この左のピークおよび中央のピークに対応するフラグメントの３'末端サブユニットは、３介在サブユニットだけ離れていることが知られており、一方、この中央のピークおよび右のピークに対応するフラグメントの３'末端サブユニットは、わずか１介在サブユニットだけ離れていることが知られている。 言い換えると、この中央のピークは、左のピークより４サブユニット長く、そして右のピークは、中央のピークよりわずか２サブユニットだけ長い。 従って、図１９Ａの観察されるプロフィールに基づくと、使用者は、正確な標的配列の決定において大きな困難性を有する。 例えば、プライマー伸長が４つのスペクトル分離可能なターミネーターの存在下で行われる場合、中央のピークは、異なるターミネーターを含むより長いかまたは短いフラグメントと同時に移動し得、それによりこのフラグメントの正確な順序が不明瞭になり、そしてこの配列情報が未確定となる。
【０１３８】
対照的に、図１９Ｂにおけるプロフィール（これは、本発明に従って、色素標識核酸塩基を使用して得た）は、３つのピークの間の推定空間を有する。 左のピークと中央のピークとの間の分離は、中央のピークと右のピークとの間の分離の二倍であり、それぞれ、左のピークと中央のピークとの間の４サブユニットの差、および中央のピークと右のピークとの間の２サブユニットの長さの差と一致する。 明確には、このプロフィールにより、使用者は、正確な標的配列を容易に決定し得る。 これらの結果は、色素標識核酸塩基中のアニオン性リンカーの使用が、フラグメントの長さと色素標識ポリヌクレオチドの電気泳動移動度との間の相関をどのように有意に改善し得るかということを例示する。
【０１３９】
図２０Ａおよび２０Ｂは、ジデオキシアデノシン−５'−三リン酸（ｄｄＡＴＰ）の２つの異なる７−デアザアナログを使用して得られた電気泳動プロフィールを示す。 この研究において、両方のターミネーターは、ドナー／アクセプター色素対を含み、ここで、Ｄ１は、５'アミノメチル基を含む６−カルボキシフルオレセインであり、Ｄ２は、本明細書中の実施例１で使用される５−カルボキシ−４，７−ジクロロローダミン色素と同じであった。 両方の結合体において、Ｄ１を、実施例１のＬ２リンカーを使用して、Ｄ２のペンダントフェニル環のＣ５に、４'アミノメチル基を介して結合する。 図２０Ａについて、ＢおよびＤ１を、実施例４のＬ１リンカー（−Ｃ≡ＣＣＨ
２ ＮＨＣ（Ｏ）−）により結合した。 図２０Ｂについて、ＢおよびＤ１を、式：Ｂ−Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）−ｐ−Ｃ ６ Ｈ ４ （ＳＯ ３ ）ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）−Ｄ１のＬ１リンカーにより結合し、ここで、ベンゼン環のスルホネート基は、アミノメチル基に対してオルト位である。
【０１４０】
図２０Ａの左側のウインドウにおけるプロフィールは、右側の４重線の４つのピークから分離された１つのピークを含む。 この四重線の隣接するピーク間のほぼ等しい間隔から、使用者は、おそらく、標的配列が４つの連続したチミジンサブユニットを含むと結論付ける。 しかし、このような結論は、誤りである。 なぜなら、標的配列は、三番目のチミジンサブユニットと４番目のチミジンサブユニットとの間にアデノシンサブユニットを実際に含むからである。 有意に改善されたプロフィールを有するプロフィールは、図２０Ｂの左側のウインドウに示される。 特に、４重線中の３番目のピークおよび４番目のピークは、これらのピークの２つのサブユニットの異なる長さと一致する距離だけ、離れている。
【０１４１】
図２０Ａおよび２０Ｂの右側のウインドウを参照すると、図２０Ａの右側のウインドウは、１、３、５、６、８および１０と番号付けられる接近して溶出するピークのセットを示す。 既知のテンプレート配列に基づくと、正確なターミネーター配列の読み取りは、５'−ＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡ−３'（３'−ＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴ−５'のテンプレート配列に対応する）である。 残念ながら、図２０Ａの右側のウインドウのピーク５および６は、１より多いピーク間隔だけ互いに離れており、その結果、使用者は、これら２つのピークは標的配列の介在サブユニットの存在に対応する介在フラグメントだけ離れていると結論付ける。 （１「ピーク間隔」とは、電気泳動クロマトグラムの選択した領域について、１ヌクレオチドだけ長さが異なる隣接するピーク間の平均間隔をいう。）各ピークは、ＤＮＡの特有の配列フラグメントに対応する。
【０１４２】
有意に改善された間隔を有するプロフィールは、図２０Ｂの右側のウインドウに示される。 この場合、ピーク５および６は、１ヌクレオチドサブユニットだけ長さが異なるフラグメントについて予測されるように、約１ピーク間隔だけ離れている。 全体的に、ピーク１と３と５と６と８と１０との間の間隔の改善は、標的配列のより正確な決定を可能にする。
【０１４３】
本発明の利点の別の例は、図２１Ａおよび２１Ｂに例示される。 この研究において、伸長反応を、ｄｄＡＴＰの７−デアザアナログを使用して行った。 両方のターミネーターは、ペンダントフェニル環のＣ５を介して７−デアザアデニン環のＣ７に結合されたフルオレセイン色素（米国特許第６，００８，３７９号の化合物３３）を含んだ。 図２１Ａについて、Ｌリンカーの構造は、Ｂ−Ｃ≡Ｃ−ｐ−Ｃ
６ Ｈ ４ −Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）−Ｄであり、ここで、Ｂは核酸塩基のＣ７を表し、そしてＤは色素のペンダントフェニル環のＣ５を表す。 図２１Ｂについて、Ｌリンカーの構造は、Ｂ−Ｃ≡Ｃ−ｐ−Ｃ ６ Ｈ ４ −Ｃ≡ＣＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ ２ ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）−Ｄであり、ここでＢおよびＤは、すぐ上で記載された通りである。
【０１４４】
図２１Ａは、左の一重線、中央の一重線および右の二重線からなる４つのピークを含むプロフィールを示す。 既知の標的配列から、この一重線は、４ピーク間隔だけ互いに離れているべきであり（標的配列中の３つの介在している非Ｔサブユニットの存在に起因する）、中央の一重線および二重線の左側のピークもまた、４ピーク間隔だけ離れているべきであり、そして二重線の２つのピークは、１ピーク間隔だけ互いに離れているべきである。 図２１Ａのプロフィールは、問題がある。 なぜなら、中央の一重線が、約３．５ピーク間隔だけ二重線の左側のメンバーから離れているからである。 しかし、図２１Ｂに示されるプロフィールにおいて、この間隔はより均一であり、その結果、中央の一重線および二重線の左側のピークは、４ピーク間隔だけ離れている。 従って、標的配列を、本発明に従って、図２１Ｂの色素標識ターミネーターを使用して、容易に決定し得る。
【０１４５】
上記の結果は、色素標識核酸塩基におけるアニオン性リンカーの使用が、フラグメント長と色素標識ポリヌクレオチドの電気泳動移動度との間の相関をどのように有意に改善し得るかを例示する。
【０１４６】
結論として、本発明は結合化合物を提供し、ここで色素および核酸塩基は、アニオン性リンカーによって結合されるか、またはエネルギー移動色素の場合、１つ以上のリンカーが、色素と核酸塩基との間および／またはエネルギー移動色素とアニオン性リンカーとの間に位置する。 このようなリンカーは、種々の異なる様式で使用され得、そして種々の異なるアニオン性基のいずれかを含み得、その結果、核酸塩基の塩基対形成特徴および色素の蛍光特性が保持される。 本発明の化合物は、検出のためにポリヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオシドおよびヌクレオチドにおいて有用である。 特に、本発明のポリヌクレオチド含有色素標識結合体は、電気泳動移動度において減少した配列依存性バリエーションを示す。 従って、本発明は、隣接するポリヌクレオチドのバンドの間の間隔がより大きく、減少したバンド圧縮を有する電気泳動分離パターンを提供し、ポリヌクレオチド長と電気泳動移動度との間のより一貫した均一な関係を導く。 さらに、本発明の核酸塩基色素結合体を含むヌクレオシド三リン酸は、このようなヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込んで標識ポリヌクレオチドを形成するために使用され得るポリメラーゼ酵素に対して良好な基質である。 これは、ターミネーターベースの配列決定法において有益である。 本発明の化合物が、配列決定フラグメントの３'末端に組み込まれる場合、電気泳動移動度の人為結果は、減少し、その結果、塩基コーリングの精度が改善され得る。
【０１４７】
（ＩＶ．キット）
本発明は、本発明の種々の方法を実施するためのキットを提供する。 核酸配列決定について、このキットは、本明細書中で記載される結合体を含む少なくとも１つの標識ヌクレオシド三リン酸を含む。 このキットはまた、以下の成分の１つ以上を含み得る：３'伸長プライマー、ポリメラーゼ酵素、結合体で標識されていない１つ以上の３'伸長ヌクレオチド、および／または緩衝剤。 いくつかの実施形態において、このキットは、非伸長性の少なくとも１つの標識ヌクレオシド三リン酸を含む。 他の実施形態において、このキットは、４つの異なる標識ヌクレオシド三リン酸を含み、これらのヌクレオシド三リン酸は、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧに対して相補的であり、これらのヌクレオシド三リン酸の各々は、本明細書中で記載されるような異なる結合体を含む。 さらに別の実施形態において、この標識ヌクレオシド三リン酸は、非伸長性である。 別の実施形態において、この標識ヌクレオシド三リン酸は、伸長性のリボヌクレオシド三リン酸である。 別の実施形態において、このキットは、本明細書中で記載される結合体を含む少なくとも１つの標識された非伸長性のヌクレオシド三リン酸、および以下の成分の１つ以上を含む：３'伸長プライマー、ポリメラーゼ酵素、および／または緩衝剤。
【０１４８】
本発明の操作は、本発明の種々の局面を例示する以下の非限定的な実施例の観点からさらに理解され得る。
【０１４９】
（実施例）
（材料および方法）
他に示さない限り、全ての試薬および無水溶媒を、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を、２５０μｍ層のシリカゲル６０−Ｆ２５４で予めコーティングしたアルミニウムプレート上で実施した。 化合物を、ＵＶ−ＶＩＳランプにより、および／またはＫ
２ ＭｎＯ ４水溶液で黒変させることにより位置決めした。 フラッシュカラムクロマトグラフィー精製を、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅシリカゲル６０Å（２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）を用いて実施した。 ＮＭＲスペクトルを、重水素化溶媒（内部Ｍｅ ４ Ｓｉ標準、δ０を有するＣＤＣｌ ３ 、ＣＨ ３ ＯＤ、およびＤ ２ Ｏ）中で記録した。 １ Ｈ ＮＭＲスペクトルを３００ＭＨｚで記録し、 １３ Ｃ ＮＭＲスペクトルを７５．７ＭＨｚ、 １９ Ｆ ＮＭＲスペクトルを２８２．２３ＭＨｚ、および ３１ Ｐ ＮＭＲスペクトルを１２１．４４ＭＨｚで記録した。 全ての場合、観察されたＮＭＲスペクトルは、示された構造と一致した。 報告される化合物について、満足のいく質量スペクトルもまた獲得した。
【０１５０】
陰イオン交換高性能クロマトグラフィー（ＡＥ−ＨＰＬＣ）を以下の通り実施した。 カラム：Ａｑｕａｐｏｒｅ
ＴＭ ＡＸ３００、７μｍ粒子サイズおよび２２０×４．６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。 勾配：２０分間にわたり、１．５ｍｌ／分で、４０％アセトニトリル：６０％トリエチルアンモニウムバイカーボネート（ＴＥＡＢ、０．１Ｍ）〜４０％アセトニトリル：６０％ＴＥＡＢ（１．５Ｍ）。 検出：２６０ｎｍまたは各々の色素化合物のλｍａｘでのＵＶ吸収。
【０１５１】
逆相高性能クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）を以下の通り実施した。 カラム：Ｓｐｈｅｒｉ−５ ＲＰ−Ｃ１８、５μｍ粒子サイズ、２２０×４．６ｍｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；勾配：２０分間にわたり、１．５ｍｌ／分で、９５％トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ、０．１Ｍ）：５％アセトニトリル〜５０％アセトニトリル：５０％ＴＥＡＡ、次いで５分間にわたり、１００％アセトニトリルまで。
【０１５２】
（実施例１）
（色素−ヌクレオチド結合体１５の合成）
メチルグリコレート２（４．５当量）を、Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ
ＴＭ １（１当量）（Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｃ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：３４２−３４８（１９８７）；米国特許第４，７５７，１５１号）に添加し、その後、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１当量）を添加した。 この混合物を、周囲温度で１時間攪拌した。 この反応が完了した（ＴＬＣ分析）後、この溶液を氷浴で冷却し、次いで３−クロロペルオキシ安息香酸（４当量）を含有する塩化メチレン溶液で処理した。 氷浴を取り除いた。 ３０分後、ＮａＨＳＯ ３ （１０％）の水溶液を添加した。 この混合物を酢酸エチルで希釈した。 有機層をＮａＨＳＯ ３ （１０％）、飽和ＮａＨＣＯ ３溶液で洗浄し、そしてＮａ ２ ＳＯ ４で乾燥した。 粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物３を得た。
【０１５３】
化合物３（３６ｍＭ、１当量）を含有するメチルエチルケトンの溶液に、ＮａＩ（１０当量）を添加した。 この混合溶液を、３時間加熱還流した。 溶媒を減圧下で除去し、ＮａＩと共に粗化合物４を得、これをさらに精製することなくこのまま使用した。
【０１５４】
粗化合物４（１当量）を、Ｈ
２ Ｏ：ＣＨ ３ ＯＨ（１：３）混合溶媒中のＬｉＯＨ（５当量）の０．３Ｍ溶液に溶解した。 この混合物を一晩攪拌した。 溶媒を除去して粗化合物５を得、次いでこれを、Ｎａ ２ ＣＯ ３ （５％）水溶液に溶解した。 Ｎ−（９−フルオレニルメトキシ−カルボニルオキシ）スクシンイミド（ＦｍｏｃＯＳｕ、１．５当量）を含有するＴＨＦを、一部で添加した。 この混合物を、周囲温度で３時間攪拌した。 粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物６を得た。
【０１５５】
化合物６（１当量）を酢酸エチル中に溶解し、そして得られた溶液をＨＣｌ（１０％）の水溶液で洗浄した。 有機層をＮａ
２ ＳＯ ４で乾燥した。 減圧下での濃縮により、黄色の油状物を得、これを無水ＣＨ ２ Ｃｌ ２中に溶解した。 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４当量）を添加した。 この溶液を氷浴で冷却し、次いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２当量）で処理した。 次いで、氷浴を取り除き、そして攪拌を２時間継続した（ＴＬＣ分析と共に）。 この反応が完了したら、酢酸エチルを添加し、そしてこの溶液をＨＣｌ（５％）の水溶液で洗浄した。 溶媒の除去により、化合物７を得た。
【０１５６】
ヌクレオシド三リン酸８（７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２'，３'−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５'−三リン酸、合成については、Ｈｏｂｂｓらによる米国特許第５，０４７，５１９号および同第５，１５１，５０７号を参照のこと）を含有する１００ｍＭ ＴＥＡ−バイカーボネート溶液（ｐＨ７．０）を乾固するまでエバポレートした。 乾燥した残渣を、２５０ｍＭのバイカーボネート溶液（ｐＨ９．０）に懸濁した。 化合物７を含有するＤＭＳＯの溶液を添加した。 １時間後、この反応混合物を、ＨＰＬＣ（ＡＸ−３００陰イオン交換）により精製した。 生成物の画分を収集し、乾固するまで濃縮し、そしてＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製して化合物９を得た。
【０１５７】
水酸化アンモニウム溶液（２８〜３０％）を乾燥した化合物９に添加した。 この溶液を２０分間かけて５５℃まで加熱した。 減圧下での濃縮により、粗化合物１０を得、これをＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製した。
【０１５８】
所望のＮ−Ｆｍｏｃ誘導体を形成するために、塩基の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのフルオレニルメトキシ−カルボニルオキシエステルとｐ−アミノメチル安息香酸のＨＣｌ塩（両方とも市販されている）を反応させることにより、ＮＨＳ−エステル色素中間体１１を調製した。 次いで、この生成物を、ＤＣＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、安息香酸のカルボキシル基のＮＨＳエステルを形成した。 次いで、このＮＨＳエステルを、４'−アミノメチル−６−カルボキシフルオレセイン（Ｍ．Ｔ．Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：８９−１０１（１９８７））と反応させて、所望の生成物を形成した。 次いで、この生成物を、ＤＣＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳ−エステル色素中間体１１を生成した。
【０１５９】
化合物１０を２５０ｍＭのバイカーボネート溶液（ｐＨ９．０）に懸濁した。 次いで、色素中間体１１を含有するＤＭＳＯ溶液を添加した。 この反応混合物を、周囲温度で２時間暗所に静置した。 ＨＰＬＣ（ＡＸ−３００陰イオン交換）により精製を行った。 収集した色素標識化合物１２を乾燥し、次いで、水酸化アンモニウム（２８〜３０％）中で５５℃にて２０分間加熱した。 減圧下での濃縮により粗化合物１３を得、これをＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製した。
【０１６０】
化合物１３を、２５０ｍＭのバイカーボネート溶液（ｐＨ９．０）に懸濁した。 次いで、色素１４（合成については、例えば、実施例１７または米国特許第５，８４７，１６２号を参照のこと）を含有するＤＭＳＯ溶液を添加した。 この反応混合物を、周囲温度で２時間暗所に静置した。 ＨＰＬＣ（ＡＸ−３００陰イオン交換、次いでＣ−１８逆相）により精製を行い、純粋なヌクレオチド−色素化合物１５を得た。 この化合物１５は、内部色素とヌクレオチドを連結しているリンカー原子の鎖中にリン酸ジエステル部分を含む。
【０１６１】
（実施例２）
（ヌクレオチド１０の代替の合成）
プロパルギルアミン１６（３−アミノ−１−プロピン、３．４当量）、ＤＭＡＰ（０．１当量）、およびメチルグリコレート２（１当量）の溶液を、２時間加熱還流した。 この反応溶液を周囲温度まで冷まし、そしてＨＣｌ（１０％）の水溶液に注いだ。 この溶液を酢酸エチルで抽出した。 減圧下での濃縮により、黄色固体として所望の化合物１７を得た。
【０１６２】
実施例１に記載される方法と同様の様式で、化合物１７（１当量）およびＡｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ
ＴＭ １（１当量）の反応、それに続くｍＣＰＢＡによる酸化により、化合物１８を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。 フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製後、ＮａＩ（１０当量）を用いた１８（１当量）のメチル基の脱保護により、化合物１９を得た。
【０１６３】
ヌクレオシド２０（７−ヨード−７−デアザアデノシン、１当量）を、ヨウ化銅（０．４当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．４当量）、およびトリエチルアミン（８当量）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下で、リンカーであるシントン１９（２当量）と４時間反応させた。 この反応物を濃縮し、そしてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ヌクレオシド２１を得た。
【０１６４】
オキシ塩化リン（６当量）をヌクレオシド２１（１当量）を、含有するトリメチルホスフェートに０℃にて添加し、対応するジクロロモノホスフェート２２を形成した。 この反応混合物を０℃にて２時間攪拌し、その後、ＤＭＦの存在下で、カニューレを通じて、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（１２当量）およびトリブチルアミン（２２当量）を含む別のフラスコに移した。 ０℃でさらに３０分後、この溶液をＴＥＡＢ緩衝液（１Ｍ）でクエンチした。 次いで、この溶液を周囲温度で一晩攪拌した。 ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製を行い、ヌクレオシド三リン酸２３を得た。 水酸化アンモニウム（２８〜３０％）を乾燥したヌクレオシド三リン酸２３に添加し、そして得られた溶液を周囲温度で１時間攪拌した。 減圧下での濃縮により、ヌクレオチド１０を得、これを０．１Ｍ ＴＥＡＢ溶液中で保存した。 ヌクレオチド１０を実施例１に記載されるように、化合物１５の合成に使用し得る。
【０１６５】
（実施例３）
（一般的なカップリング反応）
以下の実施例のために、以下の一般的な条件を使用した。 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキシル基（ＮＨＳエステル）とのアミノ基のカップリングに関与する反応のために、アミノ基を含有する化合物を、１００ｍＭ ＴＥＡ−バイカーボネート（ｐＨ７．０）に懸濁し、そして乾固するまでエバポレートした。 次いで、残渣を２５０ｍＭ バイカーボネートの溶液（ｐＨ９．０）に懸濁し、次いでＮＨＳエステルを含有する化合物の溶液を添加した。 １時間後、このカップリング反応混合物を、ＨＰＬＣ（ＡＸ−３００陰イオン交換）により精製した。 この生成物の画分を収集し、乾固するまで濃縮し、そしてＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）により精製した。
【０１６６】
トリフルオロ酢酸保護基の除去を、周囲温度での１時間の水酸化アンモニウム（２８〜３０％）処理により達成した。
【０１６７】
Ｆｍｏｃ基を、２８〜３０％水酸化アンモニウムの存在下で２０分間５５℃にて加熱することにより除去した。
【０１６８】
（実施例４）
（色素−ヌクレオチド結合体３３の合成）
アミノ安息香酸２４（１当量）を発煙硫酸に溶解し、そして得られた溶液を油浴中で１３０℃にて４時間加熱した。 粘性の溶液を氷中に注ぎ、次いで、濃縮した重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に中和した。 水性溶媒を減圧下で除去し、粗化合物２５を得、次いで、これを炭酸ナトリウム（５％）の水溶液中に溶解した。 この溶液に、ＦｍｏｃＯＳｕ（実施例１、１．５当量）を含有するＴＨＦを添加した。 この混合物を周囲温度で３時間攪拌した。 得られた粗化合物２６を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１６９】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、化合物２６（１当量）を含有する塩化メチレンのスラリー溶液に添加した。 この溶液を０℃まで冷却し、その後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２当量）を含有する塩化メチレンの溶液を添加した。 氷浴を取り除き、そして攪拌を２時間継続した。 この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして有機部分をＨＣｌ（５％）の水溶液で洗浄した。 精製されたＮＨＳエステル２７を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより獲得した。
【０１７０】
ヌクレオシド三リン酸８（実施例１）を、実施例３に一般的に記載される手順に従い、色素−ＮＨＳエステル２８（４'−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノメチル−６−カルボキシフルオレセイン）と反応させて、所望の色素標識ヌクレオチド２９を形成した。 結合体２９からのトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）保護基（実施例３）の除去によりアミン化合物３０を得た。 化合物３０とＮＨＳエステル２７との反応により、所望のＦｍｏｃ保護された化合物３１を得た。
【０１７１】
化合物３１からのＦｍｏｃ基の除去によりアミン３２を得た後、ローダミンＮＨＳエステル１４を添加し、ヌクレオチド−色素化合物３３を得た。 この化合物３３は、２つの色素間のリンカー鎖にスルホネート置換基を含む。
【０１７２】
（実施例５）
（色素−ヌクレオチド結合体３８の合成）
ヌクレオシド三リン酸８を、Ｆｍｏｃ保護されたフルオレセインＮＨＳエステル１１と反応させて、所望の生成物３４を得た。 Ｆｍｏｃ基を除去して脱保護されたアミノメチル化合物３５を得た後、Ｆｍｏｃ保護されたＮＨＳエステル７を３５と反応させて、Ｆｍｏｃ保護された化合物３６を得た。 Ｆｍｏｃ基の除去により、アミノエチルホスフェートエステル化合物３７を得、これをローダミンＮＨＳエステル１４と合わせてヌクレオチド−色素化合物３８を得た。
【０１７３】
（実施例６）
（色素−ヌクレオチド結合体４３の合成）
ヌクレオチド１０（実施例１）を、ＴＦＡ保護されたフルオレセインＮＨＳエステル２８と合わせて、所望の色素−ヌクレオチド結合体３９を得た。 ＴＦＡ保護基を除去した後、得られた脱保護された生成物４０をＮＨＳエステル２７と反応させ、Ｆｍｏｃ保護された結合体４１を得た。 Ｆｍｏｃ基の除去によりアミン４２を得、これをローダミンＮＨＳエステル１４（実施例１）と反応させて、ヌクレオチド−色素結合体４３を得た。 この結合体４３は、内部色素と核酸塩基との間のリンカー原子の鎖中にリン酸ジエステル部分を有し、そしてこの２つの色素の間のリンカーにスルホネート置換基を有した。
【０１７４】
（実施例７）
（色素−ヌクレオチド結合体１５の代替の経路）
ＮＨＳエステル４４（実施例１からの色素ＮＨＳエステル１４と実施例４からのｐ−アミノメチル安息香酸２４を反応させた後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで安息香酸を活性化することにより調製可能である）を、アミノ４０（実施例６）と合わせてヌクレオチド−色素結合体１５（実施例１）を得た。
【０１７５】
（実施例８）
（色素−ヌクレオチド結合体５１および５７の合成）
８Ａ． 実施例１に記載される手順を用いて、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２'，３'−ジデオキシシチジン−５'−三リン酸４５（合成については、Ｈｏｂｂｓら、前出を参照のこと）をＮＨＳエステル７（実施例１）と反応させて、Ｆｍｏｃ保護された中間体４６を得た。 Ｆｍｏｃ基の除去によりアミン４７を得、次いで、これをＮＨＳエステル１１（実施例１）と反応させて結合体４８を得た。 Ｆｍｏｃ保護基の除去によりアミン４９を得、次いで、これをローダミンＮＨＳエステル５０と反応させて（合成については、例えば、米国特許第５，８４７，１６２号を参照のこと）結合体５１を得た。
【０１７６】
８Ｂ． ヌクレオチド三リン酸４５の代わりに、５−（３−アミノエトキシ−１−プロピニル）−２'，３'−ジデオキシシチジン−５'−三リン酸５２を用いて、実施例８Ａのプロトコルを実施し（合成については、例えば、米国特許第５，８２１，３５６号を参照のこと）、結合体５７を得た。
【０１７７】
（実施例９）
（色素−ヌクレオチド結合体６４の合成）
実施例４に記載される合成スキームを用いて、ヌクレオチド８の代わりの５−（３−アミノエトキシ−１−プロピニル）−２'，３'−ジデオキシチミジン−５'−三リン酸５８（合成については、例えば、米国特許第５，８２１，３５６号を参照のこと）、色素−ＮＨＳエステル２８（前出）、リンカーＮＨＳエステル２７（前出）、および化合物１４の代わりの色素−ＮＨＳエステル６３（例えば、米国特許第６，０８０，８５２号に記載される方法に従って調製される）から、結合体６４を調製した。
【０１７８】
（実施例１０）
（色素−ヌクレオチド結合体６９の合成）
実施例５に記載される手順を用いて、ヌクレオチド８の代わりの５−（３−アミノエトキシ−１−プロピニル）−２'，３'−ジデオキシチミジン−５'−三リン酸５８（実施例９）、色素ＮＨＳエステル１１（前出）、ホスフェートリンカーシントン７（前出）、および化合物１４の代わりの色素ＮＨＳエステル６３（実施例９）から、結合体６９を調製した。
【０１７９】
（実施例１１）
（色素−ヌクレオチド結合体７７の合成）
実施例５に記載される手順を用いて、ヌクレオチド８の代わりの７−（３−アミノエトキシ−１−プロピニル）−２'，３'−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５'−三リン酸７０、色素ＮＨＳエステル７１（６−カルボキシフルオレセインの代わりに５−カルボキシフルオレセインを用いて、前出の化合物１１と同一方法で調製された）、ホスフェートリンカーシントン７（前出）、および化合物１４の代わりの色素ＮＨＳエステル７６（合成については、例えば、米国特許第５，８４７，１６２号を参照のこと）から、結合体７７を調製した。
【０１８０】
（実施例１２）
（色素−ヌクレオチド結合体８２および８５の合成）
１２Ａ。 実施例３に記載の方法を使用して、スルホネート含有リンカーシントン２７（前出）を、７−（３−アミノエトキシ−ｌ−プロピニル）−３'−フルオロ−２'，３'−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５'−トリホスフェート７８（例えば、合成について、例えば、米国特許第５，８２１，３５６号を参照のこと）に結合して、Ｆｍｏｃ保護化した生成物７９を得た。 このＦｍｏｃ基を除去した後に、得られたアミン８０を、ＮＨＳ活性化色素８１（合成について、例えば、米国特許第６，０５１，７１９号を参照のこと）と反応させて、スルホン化ベンゼンリンカーを含有する色素標識したヌクレオチド８２を生成した。
【０１８１】
１２Ｂ。 色素−ヌクレオチド結合体８５を、脱保護したアミン８０（実施例１２Ａ）をリン酸含有リンカーシントン７（前出）にカップリングすることによって、調製し、Ｆｍｏｃ保護化した生成物８３を得た。 Ｆｍｏｃ基除去した後に、得られたアミン８４をＮＨＳ活性化色素８１（実施例１２Ａ）に結合して、スルホン酸基とリン酸基の両方を含有した結合基を有した色素−ヌクレオチド結合体８５を得た。
【０１８２】
（実施例１３）
（色素−ヌクレオチド結合体９５の合成）
実施例１に記載した手順を使用して、メチル−４−（ヒドロキシメチル）ベンゾエート８６（１．３当量）、Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ
ＴＭ １（「実施例１、１当量）およびＤＭＡＰ（０．１当量）を一緒に反応させ、その後、ｍＣＰＢＡ（１．５当量）で酸化することによって、ホスホトリエステル８７を得た。ＮａＩ（１０当量）を使用して、このホスホトリエステル基からそのメチル基を除去することによって、ホスホジエステル８８を得、このホスホジエステル８８をＬｉＯＨ（６当量）で処理し、このメチル保護基およびトリフルオロアセチル保護基を除去し、アミノ酸リン酸ジエステル８９を生成した。そのアミノ基をＦｍｏｃＯＳｕで保護すること（実施例１）によって、化合物９０を得た。ＮＨＳエステル９１を、化合物９０をＤＣＣ（１．３当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３当量）で処理することによって、得た。ＮＨＳエステル９１を、ヌクレオチド７８（実施例１２Ａ）に添加して、Ｆｍｏｃ保護化化合物９２を形成した。Ｆｍｏｃ基を除去した後に、得られたアミン化合物９３を色素８１（実施例１２Ａ）にカップリングして、このリンカー鎖中にホスホジエステルを含む色素−ヌクレオチド結合体９５を与えた。
【０１８３】
（実施例１４）
（色素−ヌクレオチド結合体１０６の合成）
実施例２において記載された手順を使用して、プロパギルアルコール９６（３−プロピン−１−オール，１．５当量）、Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ
ＴＭ １（実施例１，１当量）、およびＤＭＡＰ（０．１当量）を一緒に反応させ、その後ｍＣＰＢＡ（１．５当量）で酸化して、ホスホトリエステル９７を得た。 ＮａＩ（１０当量）を使用してこのホスホトリエステル基からこのメチル基を除去することによって、プロパルギルトリフルオロアセチルアミノエチルホスホジエステル９８を得た。
【０１８４】
ホスホジエステル９８（１．５当量）を、ＤＭＦ中のＣｕＩ（０．４当量）、Ｐｄ［ＰＰｈ
３ ］ ４ （０．４当量），およびトリエチルアミン（８当量）の存在下で、７−ヨード−７−デアザアデノシン２０（１当量）と反応させて、ヌクレオシド生成物９９を得た。
【０１８５】
オキシ塩化リン酸（６当量）を、ヌクレオシド９９（１当量）と反応させて、ジクロロホスフェート中間体１００を形成した。 この中間体を、ピロリン酸トリブチルアンモニウム（１２当量）およびトリブチルアミン（２２当量）で処理して、その後、ＴＥＡＢ緩衝液（１Ｍ）で加水分解し、ヌクレオチド−５'トリホスフェート１０１を形成した。 ＴＦＡ基の除去を水酸化アンモニウムによって達成し、ヌクレオチドアミン１０２を得た。
【０１８６】
色素ＮＨＳエステル１１（実施例１）を、ＮａＨＣＯ
３緩衝液中のヌクレオチドアミン１０２に添加し、色素ヌクレオチド１０４を得た。 Ｆｍｏｃ基を除去した後に、この得られたアミン化合物１０５を色素ＮＨＳエステル１４（実施例１）とカップリングして、色素−ヌクレオチド結合体１０６を得た。
【０１８７】
（実施例１５）
（色素−ヌクレオチド結合体１２３の合成）
トリエチルシリルアセチレン１０８（３当量）を、ＤＭＦ中の、ＣｕＩ（０．０５当量）、Ｐｄ［ＰＰｈ
３ ］ ４ （０．０５当量）、およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で、４−ヨードフェノール１０７（１当量）にカップリングした。 この混合物を周囲温度で５時間攪拌し、その後、この混合物を減圧下で濃縮し、粗黒色油状物を得た。 この油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋なｐ−（トリエチルシリル）エチニルフェノール１０９を得た。
【０１８８】
ジクロロメタン中の化合物１０９の溶液に、トリフリック（ｔｒｉｆｌｉｃ）無水物（トリフルオロメタンスルホン酸無水物，１．２当量）およびトリエチルアミン（１．２当量）を−４０℃で加えた。 ３０分間後、この反応を水でクエンチし、そしてこの溶液をジクロロメタンで抽出した。 精製を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって達成して、トリフルオロメタンスルホンネート１１１を得た。
【０１８９】
プロパルギルアルコール１１０（１．１当量）を、ＤＭＦ中の、ＣｕＩ（０．１当量）、Ｐｄ［ＰＰｈ
３ ］ ４ （０．０５当量）、およびトリエチルアミン（２当量）の存在下で化合物１１１（１当量）に結合した。 この混合物を、６０℃で７時間攪拌し、そして次いで、減圧下で濃縮した。 フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製することによって、アルコール１１２を得た。
【０１９０】
アルコール１１２（１当量）、Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ
ＴＭ １（１当量）、およびＤＭＡＰ（０．１当量）を、上述の手順を使用して一緒に反応させ、その後、ｍＣＰＢＡ（１．２当量）で酸化して、ホスホトリエステル１１３を生成した。 ＮａＩ（１０当量）を使用して、リン酸トリエステル基からメチル基を除去することによって、ホスホジエステル１１４を生成した。
【０１９１】
０℃のテトラエチルヒドロフラン（ＴＨＦ）中の化合物１１４の溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム（１．５当量）を添加した。 ３０分後、この溶液を塩化アンモニウム水溶液（１０％）でクエンチし、そして、酢酸エチルで抽出した。 精製をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって達成して、リン酸含有リンカーシントン１１５を得た。
【０１９２】
化合物１１５（２当量）を、ＤＭＦ中の、Ｃｕｌ（０．４当量）、Ｐｄ［ＰＰｈ
３ ］ ４ （０．４当量）、およびトリエチルアミン（１０当量）の存在下で、ヌクレオシド１１６（７−ヨード−３'−フルオロ−２'，３'ジデオキシ−７−デアザグアノシン，１当量）（例えば、合成について、Ｈｏｂｂｓら（前出）を参照のこと）に結合し、ヌクレオシド１１７を得た。
【０１９３】
オキシ塩化リン（６当量）を、ヌクレオシド１１７（１当量）と反応させて、中間体１１８を形成し、この中間体１１８を、ピロリン酸トリブチルアンモニウム（１２当量）およびトリブチルアミン（２２当量）で処理し、その後、ＴＥＡＢ緩衝液（１Ｍ）で加水分解して、ヌクレオチド１１９を形成した。 そのＴＦＡ基の除去を、水酸化アンモニウムを使用して達成し、アミン１２０を得た。
【０１９４】
色素７１（前出）を、ＮａＨＣＯ
３緩衝液中のヌクレオチドアミン１２０に添加し、色素標識したヌクレオチド１２２（これらの実施例により、化合物１２１は存在しない）を得た。 そのＦｍｏｃ基を除去した後、この得られたアミン化合物１２３を、色素７６（実施例１１）とカップリングして、色素−ヌクレオチド結合体１２４を得た。
【０１９５】
（実施例１６）
（リン酸含有リンカーを有するヌクレオチド色素結合体１３７）
ヘキサン中のリチウム化（Ｌｉｔｈｉａｔｅｄ）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル１２５（これは、酢酸ｔｅｒｔ−ブチルおよびリチオＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（これは、Ｍ．Ｗ．Ｒａｔｈｋｅら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５：３０５０（１９７３）に従って調製した）から調製した）を、不活性雰囲気下で、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト１２６（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）のヘキサン溶液に滴下する。 この反応混合物を、水を用いて洗浄して塩を除去する。 この得られた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、体積を低減し、そしてホスホラミダイト１２７を、ヘキサンおよびジクロロメタンを用いる溶出を用いるシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって、単離する。
【０１９６】
ホスホラミダイト１２７を、乾燥アセトニトリル中に溶解し、そして不活性雰囲気下に置く。 その溶液に、１．２当量の２−（トリフルオロアセトアミド）エタノール１２８および１．２当量のテトラゾールのアセトニトリル溶液を添加する。 その生成物であるホスホナイト（ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｔｅ）１２９を、ヘキサンおよびジクロロメタンの溶出によるシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１９７】
ホスホナイト１２９を、乾燥ジクロロメタン中に溶解する。 この溶液に、ジクロロメタン中の１．５当量のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）を添加する。 完全な反応の後に、この過剰なＴＢＨＰを、水で洗浄することによって反応混合物から除去する。 この得られた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、体積を低減し、そしてこのホスホン酸ジエステル生成物１３０を、ヘキサンおよびジクロロメタンで溶出することによるシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって単離する。
【０１９８】
ホスホン酸ジエステル１３０を、ジクロロメタンに溶解し、そして２当量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加する。 この反応が完結した後に、この過剰のＴＦＡを、水を用いて洗浄する。 この得られた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、体積を低減し、そしてメタノールおよび酢酸を用いる溶出によるシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによってホスホン酸ジエステルカルボン酸１３１を単離する。
【０１９９】
ホスホン酸ジエステル１３１を、酢酸エチル中に溶解する。 この溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ，２当量）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，１．２当量）を添加する。 この反応が完結した後に、ジクロロヘキシル尿素を濾過によって除去し、そして過剰なＮＨＳを、水を用いる洗浄によって除去する。 この得られた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、そしてこのホスホン酸ＮＨＳエステル１３２を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー、ヘキサンおよびジクロロメタンで溶出することによって、単離した。
【０２００】
ホスホン酸ＮＨＳエステル１３２を、ＮａＨＣＯ
３緩衝液中のヌクレオチド８（実施例１）に添加して、ヌクレオチド１３３を得る。 そのシアノエチル基およびＴＦＡ基を水酸化アンモニウムで処理することによって除去した後に、この得られたヌクレオチドアミン１３４を、色素−ＮＨＳエステル１１（実施例１）にカップリングして、期待された色素標識ヌクレオチド１３５を得る。 このＦｍｏｃ基を除去し、そしてこのアミン生成物１３６を、色素ＮＨＳエステル１４（実施例１）と結合し、色素−ヌクレオチド結合体１３７を得る。
【０２０１】
（実施例１７）
（色素ＮＨＳエステル１４の合成）
二環式アミンｔ−Ｂｏｃエステル１４１（１２．８ｇ，４７ｍｍｏｌ，米国特許第５，６８８，８０８号）、１−ブロモ−３−クロロプロパン（２９．３ｇ，１８７ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（５６．４ｇ，３７６ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（７．９ｇｍ，９４ｍｍｏｌ）を、１５０ｍｌのＣＨ
３ ＣＮの中にて１８時間で一緒に還流した。 この混合物を室温まで冷却し、濾過し、そしてエバポレートした。 このフィルターケーキを３００ｍｌヘキサンで洗浄し、このフィルターケーキとその濾液を合わせ、そして、５０ｍｌの水で２回洗浄し、そして、５０ｍｌの飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。 この生成物を、ヘキサン／酢酸エチル：２０／１で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製して、三環式アミンピバル酸エステル（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅ ｐｉｖａｌａｔｅ ｅｓｔｅｒ）１４２（淡黄色油状物，９．５ｇｍ，３０ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。 １４２のエステル基を、１５ｍｌ水および１２０ｍｌのメタノール中の水酸化リチウム一水和物（２．６ｇ，６０ｍｍｏｌ）の溶液中で加水分解した。 １時間室温で攪拌した後に、この混合物を減圧下で濃縮し、３０ｍｌの１Ｍ ＨＣ１に溶解し、そして１００ｍｌのジエチルエステルで３回抽出した。 その合わせたエーテル抽出物を、５０ｍｌの２００ｍｌ（ｐＨ７）リン酸緩衝液で洗浄し、ＭｇＳＯ ４上で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して、三環式アミン１４３を褐色の固体として得た。 三環式アミン１４３および３，６−ジクロロ，４−イソプロピルカルボキシレートフタル酸無水物１４４を、トルエン中で還流し、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔアシル化生成物であるケトン１４５（最大吸光度（Ａｂｓ．ｍａｘ）４００ｎｍ）を得た。 還流で（活性化剤として）ホスホリルトリクロリド（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）およびクロロホルム中の１４３を用いた１４５の環化によって、色素イソプロピルカルボン酸エステル１４６を、イソプロピルカルボン酸の位置異性体の混合物として得た。 そのイソプロピル基の切断後、色素カルボン酸１４７を、（実施例１で使用し得る）ＮＨＳ−ローダミン色素１４に変換した。
【０２０２】
（実施例１８）
（色素−ヌクレオチド結合体２１１の合成）
メタノール（１５０ｍＬ）中の４−ブロモイソフタル酸２０１（ｌ０ｇ，４０．８ｍｍｏｌ）の溶液に、濃硫酸（３．５ｍｌ）を添加した。 この溶液混合物を還流温度で２４時間加熱した。 この反応が完結した後に、このメタノール溶媒を減圧下で除去した。 この残渣を、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ
３ ）を使用して塩基性にした。 この溶液を、酢酸エチルを用いて抽出した。 この抽出物を水で洗浄し、そして硫酸ナトリウム（Ｎａ ２ ＳＯ ４ ）で乾燥した。 溶媒の除去によって、油状物を得、この油状物を周囲温度で凝固した。 この固体を、メタノールおよびヘキサン（１：３）を２０ｍＬで、２回粉砕（ｔｉｔｕｒａｔｅ）して、８ｇ（９０％）の４−ブロモイソフタル酸ジメチルエステル２０２を得た： １ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ ３ ）δ３．９３（ｓ，３Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２０３】
無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）中の４−ブロモイソフタル酸ジメチルエステル２０２（２．９５ｇ，１０．８ｍｍｏｌ）の溶液に、シアン化銅（Ｉ）（１．２０ｇ，１３．５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。 このスラリー溶液を、還流温度で１時間加熱した。 この溶液を周囲温度まで冷却したときに、これを、０℃の３００ｍＬの塩化アンモニウム溶液（１０％）に注ぎ込んだ。 白色の沈殿物が生成した。 このスラリー溶液を周囲温度で３０分間攪拌した。 次いで、これを酢酸エチルで抽出した。 合わせたその抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。 溶媒を除去することによって、白色固体を得、この白色固体を冷エタノールで洗浄して、１．８９ｇ（８０％）の４−シアノイソフタル酸ジメチルエステル２０３を得た：
１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１ ３ ）δ３．９５（ｓ，３Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．７７（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２０４】
４−シアノイソフタル酸ジメチルエステル２０３（１．７０ｇ，７．７６ｍｍｏｌ）を、メタノール（１００ｍＬ）中に溶解し、次いで５０ｍＬの水の中の水酸化リチウム（２．０ｇ，４６．５ｍｍｏｌ）の水溶液で処理した。 この塩基性溶液を、周囲温度で１．５時間攪拌した。 次いで、これを１０％ＨＣｌ溶液に注いだ。 この溶液を、酢酸エチルで抽出し、この合わせた抽出物をＮａ
２ ＳＯ ４で乾燥した。 溶媒を除去することによって、定量的収量の４−シアノイソフタル酸２０４を得た： １ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ ３ ＯＤ）δ８．０１（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．７３（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２０５】
圧力フラスコ（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｌａｓｋ）を、４−シアノイソフタル酸２０４（１．４０ｇ，７．３３ｍｍｏｌ）、エタノール（ｌ００ｍＬ）、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（０．５０ｍｇ）、および濃ＨＣ１（１．５ｍＬ）で満たした。 この混合溶液を、５０ＰＳＩで一晩水素付加した。 その固体不純物を、濾過によって取り除いた。 溶媒を除去することによって、定量的収量の４−アミノメチルイソフタル酸２０５を得た：
１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ ３ ＯＤ）δ４．４６（ｓ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．７６（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２０６】
丸底フラスコを、４−アミノメチルイソフタル酸２０５，エタノール（２０ｍＬ）、メタノール（２０ｍＬ）、過剰のトリフルオロ酢酸エチル（２０ｍＬ）、およびトリエチルアミン（１０ｍＬ）で満たした。 この混合溶液を周囲温度で１時間攪拌した。 次いで、この混合溶液を塩酸溶液（１０％）に注ぎ込んだ。 この溶液を酢酸エチルで抽出した。 合わせたその抽出物を、Ｎａ
２ ＳＯ ４で乾燥した。 溶媒を除去することによって、化合物２０６（１．８ｇ）を得た： １ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ ３ ＯＤ）δ４．９（ｓ，２Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２０７】
１００ｍＬの丸底フラスコを、粗化合物２０６（ｌｇ，３．４３ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１ｇ，３．４３ｍｍｏｌ），およびジイソプロピルエチルアミン（１．３ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）で満たした。 この反応溶液を、溶液を周囲温度で３０分間攪拌した。 溶媒を減圧下で取り除いた。 この粗化合物に、５％ＨＣ１溶液を加え、そして、これを酢酸エチルで抽出した。 この合わせた有機抽出物をＮａ
２ ＳＯ ４で乾燥した。 溶離剤ＣＨ ２ Ｃ１ ２ ：ＣＨ ３ ＯＨ（１０：１）の後に、溶離剤ＣＨ ２ Ｃ１ ２ ：ＣＨ ３ ＯＨ（５：１）を用いて、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製を達成し、５００ｍｇ（３８％）の活性化エステル２０７を与えた： １ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１ ３ ＋１０％ＣＤ ３ ＯＤ）δ２．９３（ｓ，４Ｈ），４．８０（ｓ，２Ｈ），），７．６０（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．７．０（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）； １９ Ｆ ＮＭＲ−１７８ｐｐｍ（ｓ）。
【０２０８】
化合物２０８（これは、実施例９に記述した化合物５８と同じ化合物である）（１当量）を、最小量のホルムアミド中に溶解し、そして、ＤＭＳＯ中のリンカーシントン２０７溶液（７当量）（５μＬのＤＭＳＯ当たり１ｍｇの２０７）を添加して、その後ジイソプロピルエチルアミン（２０当量）を添加した。 このカップリング反応を１時間で周囲温度にて完結させた。 ＨＰＬＣ（ＡＸ−３００アニオン交換）によって精製を実施した。 回収したその化合物を、減圧下で乾燥し、そして、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）によって精製した。 この化合物を減圧下で乾燥し、次いで、水酸化アンモニウム（２８〜３０％）中で１５分間、５５℃にて加熱した。 次いで、これを乾燥し、そして、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相）によって精製して、ヌクレオチド２０９を得た。
【０２０９】
以下を、一般的な手順として使用し得、化合物２０９および活性エステル（例えば、色素のＮＨＳエステル（図２２Ｂにおいて「ＮＨＳ色素」として言及する））から色素結合体を生成し得る。 化合物２０９（１当量）を、２５０ｍＭの炭酸水素塩（ｐＨ９．０）の最小量の溶液に懸濁し、次いで、ＤＭＳＯ中の色素ＮＨＳエステル２１０（３当量）の溶液（１２μＬ当たり１ｍｇの色素ＮＨＳエステル）を添加した。 この反応混合物を、暗中にて、周囲温度で１時間静置く。 この生成物をアニオン交換ＨＰＬＣ（ＡＸ−３００）およびその後のＣ−１８逆相ＨＰＬＣによって精製して、純粋な色素標識ヌクレオチド２１１を獲得し得る。
【０２１０】
本明細書中で言及される、全ての刊行物および特許出願は、刊行物または特許出願の各々が、参考として援用されるために具体的にかつ個々に表示されるように参考として本明細書中において援用される。
【０２１１】
本発明は特定の例示的な実施形態および実施例に関して記述されているが、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに種々の改変および変更がなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図２】 図２は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図３】 図３は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図４】 図４は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図５】 図５は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図６】 図６は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図７】 図７は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図８】 図８は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図９】 図９は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１０】 図１０は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１１】 図１１は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１２】 図１２は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１３】 図１３は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１４】 図１４は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１５】 図１５は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１６】 図１６は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１７】 図１７は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１８】 図１８は、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図１９】 図１９Ａおよび１９Ｂは、第１のセットのターミネーター（ｄｄＧ）で終結する配列決定ラダーの電気泳動グラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）を示す。
【図２０】 図２０Ａおよび２０Ｂは、図１Ａおよび１Ｂにおけるターミネーターと異なる第２のセットのターミネーター（ｄｄＡ）で終結する配列決定ラダーの電気泳動グラムを示す。
【図２１】 図２１Ａおよび２１Ｂは、第３のセットのターミネーター（ｄｄＡ）で終結する配列決定ラダーの電気泳動グラムを示す。
【図２２Ａ】 図２２Ａは、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
【図２２Ｂ】 図２２Ｂは、本発明に従う種々の結合体を調製するための例示的な合成プロトコルを示す。
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