Its use for the formation of a multi-dimensional library of triazine compound and for affinity chromatography |
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申请号 | JP2005502337 | 申请日 | 2003-12-09 | 公开(公告)号 | JP4607760B2 | 公开(公告)日 | 2011-01-05 |
申请人 | プロメティック バイオサイエンシズ リミティド; | 发明人 | ジェイムズ バートン,スティーブン; クリストファー ピアソン,ジェイムズ; フセイン,アビド; | ||||
摘要 | A compound of the formula (I) wherein each Z is the same or different and is formula (a) or —Y wherein each X is the same or different and is a multivalent aminyl group or diaminyl-terminated spacer; each Y is the same or different aminyl group; and M is a support matrix. | ||||||
权利要求 | 下記式 各Zは、同じか又は異なり、そして、以下の: 各Xは、 独立に、アミン基によってトリアジン環に連結された、-NH-、及びジアミノアルカン、ジエチレントリアミン又はトリス(アミノエチル)アミンのスペーサーから選ばれ ; 各Yは、同じか又は異なるアミニル基であり;そして Mは支持マトリックスである。 } によ って表される 、支持体マトリックスに固定されたアフィニティーリガンドを含む化合物。 2以上のトリアジン環、及び3個の独立したY基を含む、請求項1に記載の化合物。 3以上のトリアジン環、及び4個の独立したY基を含む、請求項1に記載の化合物。 以下の式: 各 ZがYである、請求項 4に記載の化合物。 各Xが 、ジアミノアルカン スペーサーである 、請求項1〜 5のいずれか1項に記載の化合物。 各Yが、場合により置換された脂肪族及び芳香族一級アミンから独立して選ばれる、請求項1〜 6のいずれか1項に記載の化合物。 以下の式: 共通の支持体M上の、請求項1〜 8のいずれか1項に記載 の化合物のライブラリー。 請求項 9に記載のライブラリーの生成方法であって、中間体構造を一つ又は複数合成するステップ、上記構造をより小さな部分に分割するステップ、及び好適なその後の反応ステップを含む、前記方法。 ペプチド及びタンパク質の分離、単離、精製、特徴づけ、同定、定量又は発見のための、請求項1〜 8のいずれか1項に記載の化合物の使用。 タンパク質様物質の分離、精製、又は発見のための方法であって、上記物質を含む試料を、請求項1〜 8のいずれか1項に記載の化合物を用いるアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含む、前記方法。 上記タンパク質様物質が、天然又は組換えの供給源由来の融合タンパク質を含む、イムノグロブリン或いはそのサブクラス、断片、前駆体又は誘導体である、請求項 12に記載の方法。 請求項1〜 8のいずれか1項に記載の化合物 を用いて、生物学的化合物又は医薬化合物の調製物から 、毒性又は病原性の物質を含む 夾雑物を除去する 方法 。 |
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说明书全文 | 本発明は、トリアジン化合物及び多次元アフィニティーリガンドライブラリーの形成におけるその使用、そしてアフィニティーリガンドのマトリックスへの結合にも関する。 本発明はさらに、天然の、組換えの又はトランスジェニックタンパク質性物質の精製のためのリガンドの使用にも関する。 上記リガンドはまた、医療装置中でも使用されることができ、そして治療薬として使用されることもできる。 アフィニティークロマトグラフィーの原理は、分子認識の現象に基づく。 支持マトリックス上に固定化されたリガンドは、他の分子の混合物の存在下において、標的分子との特異的な可逆的相互作用を形成することができる。 該相互作用の性質は水素結合、静電気力、好ましい幾何学の結果としてのスタッキング又はホスト‐標的間の関係を支援する他のいずれかの側面である。 いったん標的に結合すると、リガンド‐標的の相互作用は、リガンド‐標的複合体をそのままに保ちつつ他の混入分子を混合物から除去することを可能とするのに十分に強力でなければならない。 しかしながら、結合は、局所的に導入された変化、例えば緩衝液の状態が相互作用に破壊をもたらし、今やその精製された形態にある標的分子を放出するように、十分に弱くなければならない。 今やタンパク質を有さない固定化リガンドは、続く精製のために再使用されることができる。 アフィニティーリガンドの望ましい性質は、化学的及び温度に対する安定性、並びに高い選択性である。 リガンドは、分子モデリングを使用することによって特別な標的分子に適合するように設計されることができ、又はコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって選択されることができる。 コンビナトリアルアプローチは、親水性、疎水性、荷電した又はされていない基を含む多様な化学分子、或いはそれらの混合物を取り込むように構築されることのできる多数のリガンドを与える。 コンビナトリアルライブラリーは、アミノ酸、カルボン酸及びアミンを含む商業的に入手可能な化合物を、支持マトリックスの表面上での直接の段階的合成によって取り込むことによって、好都合に合成されることができる。 或いは、リガンドは合成され、そして続いて支持マトリックスに結合されることができる。 塩化シアヌル、又は2,4,6‐トリクロロトリアジン(以後、トリアジンと称する)は、対称な分子である。 2,4,6‐三置換トリアジンは、塩化シアヌルとアミン化合物のような求核試薬との反応によって容易に生成されることができる。 トリアジン誘導体は、吸収剤として及び他の目的に有用である。 PCT国際特許出願公開第WO‐A‐97/10887号及び同第WO‐A‐00/67900号を参照のこと。 アフィニティーリガンドライブラリーは、架橋アガロースのような水酸基を有する支持体上に構築されることができる。 今日まで、アガロース上に構築されたトリアジンに基づくリガンドライブラリーのすべては、一置換されたトリアジン成分を有するか(PCT国際特許出願公開第WO‐A‐97/10887号を参照のこと)又はトリアジン基を取り込んでいる大環状の環を有する(同第WO‐A‐01/42228号を参照のこと)支持体を含むものである。 発明の要約 本発明は、単一のトリアジン環に基づくリガンドに比べて化学的多様性のより大きなそしてより選択性の亢進した大きなリガンドを提供するために有用なアフィニティーライブラリーが、2つ以上のトリアジン環を組み合わせて、一つのリガンド構造とすることによって得られることに基づく。 本発明によれば、新規化合物は以下の式I:
本発明の他の側面は、以下の式:
典型的には、本発明の化合物はマトリックスに固定されたアミンと塩化シアヌル、アミニル基Y、ジアミンX、塩化シアヌル、第二アミニル基Yそして第三アミニル基との連続的な反応によって作られる。 より一般的には、スペーサー(X)とそれに続くトリアジン核の相互作用的付加によって、スペーサー‐トリアジン基の交互の連鎖を有するリガンドを構築することが可能となる。 いかなる末端トリアジンの塩素原子もアミンによって置換されることができ、該アミンは、それ自体が多官能性であることができ、場合により配向性のある結合を容易にするために、ある官能基が保護基によってブロックされている。 多官能性アミンスペーサー基は、より綿密なリガンドの構築を可能とし、分岐した、アンテナ状の(antennary)、管状の、又は球状の構造へ導く。 さらに、リガンドのライブラリーは、共通の支持体M上で作成されることができる。 これは、本発明のさらなる側面を構成する。 本発明の化合物は、「多次元性」である。 次元の数は、異なる官能基Yの数に相当する。 (ライブラリーを含む)本発明の化合物は、ペプチド及びタンパク質の分離、単離、精製、特徴付け、同定、定量又は発見に使用されることができる。 特に、該化合物はタンパク質様物質の分離、精製、又は発見のために使用されることができ、それは、該物質を含む試料をアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含む。 タンパク質様物質は、イムノグロブリン或いはそのサブクラス、断片、前駆体又は誘導体であることができ、天然又は組換え由来の融合タンパク質を含む。 さらに、本発明の化合物は、毒性又は病原性を有する物質を含む混入物を生物学的化合物又は医薬化合物の調製物から除去するために使用されることができる。 それはまた、薬物発見のためにも使用されることができる。 発明の説明 本発明の化合物を製造するためには、アガロースのような支持体材料は、アミン基又はスペーサーXの結合を容易にする反応性の基を導入するために、エピクロロヒドリンのような活性化剤との制御された反応に供される。 導入された反応性の基の量は、好適なアッセイによって測定可能であり、μモル/安定化させたゲルのgの単位で表される。 過剰の溶媒は、アミンスペーサー基の結合前に吸引又は重力下でのろ過によって除去されることができる。 活性化されたアガロースは、スペーサー(X)を提供するアミンと最初に反応させられることができる。 少なくとも、Xは二価であって連結している。 Mをトリアジンに連結する場合、その結合価は少なくとも二価であって、アミンを含んでいる。 同様に、Xが二つのトリアジンを連結する場合、その結合価は少なくとも二価であり、アミンを含んでいなければならない。 典型的には、Xは最初は少なくともアンモニアのように一価、1,2‐ジアミノエタンのように二価、又はジエチレントリアミン若しくはトリス(アミノエチル)アミンのように三価である。 Xがその官能性を失うことなく、水酸基のような基によって置換されるかもしれないとしても、これが本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。 この最初の反応の生成物の例を以下の式:II、III、IV及びV: 導入されるアミノ基の数は、TNBSのようないずれかの好適なアッセイによって測定されることができ、そしてアミンのμモル/安定化させたゲルのgとして表される。 この段階で導入された各脂肪族アミンは、次に塩化シアヌルと反応させられる。 例えば、式IIの化合物は、反応させられて式VIのトリアジン‐活性化アガロースを生成する。 トリアジン‐活性化樹脂の総塩素含量は、アルカリ加水分解後に塩素イオンとして測定されることができる。 3Dライブラリー、すなわち、2つ以上のトリアジン基及び3つの独立して利用可能なY基を含む化合物、を作成するために、塩素原子の1つはアミンY 1によって置換される。 第二塩素原子は、任意の鎖長のジアミン、トリアミン又はテトラアミンであることのできる第二スペーサー(X 2 )によって置換される。 X 2は二価又は三価であることができる(例を上記に示す)。 トリアジン環への各アミン付加は、塩素イオンを除去し、これがアッセイされることができる。 結果は、安定化させたゲルのグラムあたりの放出された塩素イオンのμモルによって表されることができる。 活性化アッセイの結果=A;アミンアッセイの結果=B;1つの塩素イオンが除去される塩素アッセイの結果=C(i)として、出発物質の100%が変換すると、以下の: 第二のトリアジン置換ステップにより、以下の式VII: 3Dライブラリーにおいては、第二トリアジン核上の両塩素原子が順次アミンY 2及びY 3に置換されて、以下の式VIII: これらの構築ブロックから作られる他の構造の例を以下の式IX及びXに示す。 他のトリアジン及び多価スペーサー基は、式XI〜式XIIIに例示されるように、任意の数の独立して可変のアミン置換位置を有するリガンドの生成を可能とする。 式XI及びXIIは分岐の程度が異なるが、同程度の次元性を有する。 これは、部分的には式XIII中におけるさらなる分岐がXにおけるものであること、すなわち、2つの同一のトリアジン環がさらなるトリアジン上ではなくここに導入されること、を原因とする。 以下の実施例は本発明を例示するものである。 実施例1 エポキシド活性化:PuraBead6XLの試料(333g)を水(213mL)に懸濁し、10MのNaOH(26.6mL)と混合した。 混合物をオーバーヘッドスターラーを用いて34℃の一定温度となるまで攪拌した。 エピクロロヒドリン(24mL)を同じ分量で2回に分けて添加し、温度を40℃に上昇させた。 1時間後、スラリーをろ過し、水(10×350mL)で洗浄した。 洗浄された活性化樹脂に対するエポキシドアッセイは、23.3μモルのエポキシド/安定化させたゲルのgの置換レベルを示した。 実施例2 アミン活性化:実施例1において得られたエポキシ‐活性化ゲル(226g)を水(180mL)中に懸濁し、0.88アンモニア(45mL)で処理した。 反応混合物を40℃で一夜攪拌しておいた。 その後、ゲルをろ過し、水(10×500mL)で洗浄して、アミン活性化樹脂(約220g)を得た。 ゲルの一部分についてのTNBSアッセイは、23.2μモル/安定化させたゲルのgのアミンレベルを示した。 実施例3 トリアジン活性化:実施例2で製造したアミン‐活性化ゲル(200g)を1.0Mのリン酸カリウム緩衝液(200mL、pH7)で洗浄した。 安定化させたゲルをビーカーに移し、水(50mL)及び1.0Mリン酸カリウム緩衝液(50mL、pH7)と混合した。 混合物全体を1リッターの3つ首丸底フラスコに移した。 激しく攪拌しながらアセトン(100mL)を添加した。 フラスコを定常温度の0℃に冷却した。 冷アセトン(50mL)中の塩化シアヌル(5g)を側管から加えた。 1時間後に反応を停止し、フラスコ内容物を焼結漏斗に移した。 ジクロロトリアジンゲルを50%アセトン(1L)、水(1L)、50%アセトン(1L)及び水(2L)で洗浄して、トリアジン活性化樹脂(約200g)を得た。 塩素アッセイによって、総塩素イオン含量が46μモル/安定化させたゲルのgであると決定した。 実施例4 Y 1の置換:実施例3で製造されたジクロロトリアジンゲル(200g)を水(100mL)に懸濁し、10MのNaOH(4mL)で塩基性化した水(100mL)中のβ‐アラニン溶液(0.2M)で処理した。 反応容器を室温で1時間振とうし、その後、内容物をろ過し、50%DMF(5×125mL)及び水(10×125mL)で洗浄した。 実施例5 スペーサーX 2を付加するための第二の置換:実施例4で得られたY 1 −置換ゲルを水(100mL)に懸濁し、水(100mL)中のエチレンジアミン溶液(0.4M)で処理した。 反応容器を60℃で2日間、振とうした。 冷却後、得られたゲルを50%DMF(5×125mL)、水(5×125mL)、0.1MのHCl(5×125mL)、30%イソプロパノール/0.2MのNaOH(5×125mL)、及び水(10×125mL)で洗浄した。 ゲルの試料についてのTNBSアッセイは、26.7μモル/gのアミン置換を示した。 上清についての塩素アッセイは、27.2μモル/gの塩素放出を示した。 第二のトリアジンステップ:手順は、実施例3に記載した第一トリアジン活性化ステップと同じであった。 実施例6 Y 2の置換:実施例5の第二トリアジン結合ステップから得られたゲルを8個のボトルに量り分けて入れた(各ボトル12.5g)。 試料を50%DMF(6.25mL)中に懸濁した。 そして、各ボトルに選択されたアミンの溶液(0.2M、6.25mL)を入れた。 カルボン酸塩部分を含むアミン又は塩酸塩として得られたものを必要量の10M NaOHで塩基性化して、全体のpHを約9〜10とした。 試料を室温で1時間振とうした。 上清(100mL)を各ボトルから除去し、塩素イオンアッセイによって反応の進行を評価した。 表1は、第1のアミン置換後の塩素放出量を表す。 8つの中間体ゲルを50%DMF(5×12.5mL)及び水(10×12.5mL)で洗浄した。 実施例7 第二の置換Y 3 :これは、実施例5において行われた第二スペーサーアーム(X 2 )の置換を改変することによる方法の変化によって可能となった。 合成はマイクロスピンカラム中で直接行った。 或いは、96−ウエルのブロックも使用することができる。 実施例6において得られた8個の中間体(4.0g)のそれぞれを0.4%Tween-20(2mL)中に懸濁した。 第一の中間体(0.375mL)の懸濁液を8個のウエルからなる列に入れていった(1ウエルあたり0.375mL)。 その過程を第二の中間体について第二のウエルの列において繰り返し、すべての第一段階の中間体を各列に入れるまで同様に行った。 50%DMF中の最終段階の第1のアミン(Y 3 )の溶液(0.4M)を第一の列に対して直角方向のウエル中に入れ(1ウエルあたり0.125mL)、8個のウエルすべてに入るまで同様に行った。 この手順を、8の列すべてに選択された最終段階のアミン(Y 3 )を入れるまで繰り返した。 したがって、8×8配列の各ウエルは、個々に異なるリガンド構造を構成する。 Y 3の添加が完了したら、ライブラリーブロックを60℃のオーブン中で2日間振とうした。 取り出して冷却した(1時間)後、ブロックを深型ウエルマイクロタイタープレート中に流れ込むようにした。 集めたろ液をアッセイして塩素イオンの放出を測定し、こうして反応の程度を測定した。 ライブラリーブロックを50%DMF(2×1ml)、水(2×1ml)、0.1M HCl(2×1mL)、水(2×1ml)、0.2M NaOH/30%イソプロパノール(2×1mL)、水(2×1mL)及び20%エタノール(2×1mL)で洗浄した。 以下の表2中の結果は、ゲル1gあたりの放出された塩素のμモルで表された、第二の置換(Y 3 )後に得られた塩素放出データを示す。 得られたライブラリーを、多様な標的タンパク質に対する結合活性/親和性を試験するためにスクリーニングした。 以下の表3は、ヒト血漿において実施されたスクリーニングの詳細を示す。 先ず、2mLの25mMリン酸ナトリウムpH7.0をゲル床の一番上に加え、そしてこれが重力によってゲル中を流れ、その中の20%エタノールの保存液と交換することによって、エタノール保存液をライブラリーの各場所から洗い出した。 ヒト血漿をリン酸緩衝生理食塩水で1:20(v/v)に希釈し、2mLを各ゲルの一番上に加え、重力によってゲル中を流れるようにした。 各ライブラリー要素を流れ去ったフロースルー(FT)を個別に集めた。 2mLのリン酸ナトリウム緩衝液を同様の方法で加えることによって、各ゲル床を洗浄して未結合のタンパク質を除去し;各ライブラリー要素を流れ去った洗浄画分(W)を個別に集めた。 2つの溶出ステップのうちの結合タンパク質を除去するための第一のステップ(E1)においては、1mLの10mMリン酸ナトリウム/クエン酸、pH6.5をゲル床の一番上から加えて重力によって流れさせ、個別に集めた。 次に第一のステップで放出されなかったタンパク質を除去するための第二のステップ(E2)を適用し:1mLの50mMクエン酸を各ゲル床の一番上に加え、重力によって流れさせ、個別に集めた。 最後にすべてのゲル上の残留する混入物質を除去するための衛生化ステップ(San)を適用し:1mLの0.2M水酸化ナトリウム/30%イソプソパノールを各ゲル床の一番上に加え、重力によって流れさせ、個別に集めた。 各ステップにおいて放出されたタンパク質を、集めた溶出画分のそれぞれ:FT、W、E1、E2及びSanにおいてアッセイした。 結果を表3A〜Eに示す。 ライブラリーから集めた各画分を表2の格子ごとに表す。 数字は各ライブラリー要素から回収したタンパク質をμgで表す。 アミン(Y 1 、Y 2及びY 3 )の性質 3Dライブラリーの合成のために選ばれるアミンは、一級、二級、脂肪族、芳香族、複素環、アリール、キラル、荷電したもの又はこれらの組み合わせのいかなるものであってもよい。 反応条件は、選ばれるアミンの溶解度によって変化することができる。 溶媒は水、50%DMF及び純粋のDMFから選ばれる。 塩酸塩として又はカルボン酸塩部分を含むものとして得られるアミンはすべて、必要なモル量のNaOHで反応前に中和する。 上記の3Dライブラリーにおいて生成した親水性リガンドの例は、以下の式XIV: この場合、X 1はアンモニアに由来し;Y 1はβ‐アラニンに由来し;X 2は1,2‐ジアミノエタンに由来し;Y 2は3‐アミノ安息香酸に由来し;そして、Y 3は1‐(3‐アミノプロピル)モルホリンに由来する。 実施例8 この場合、X 1は1,2‐ジアミノエタンに由来し;Y 1はβ‐アラニンに由来し;X 2は1,2‐ジアミノエタンに由来し;Y 2は2‐アミノフェノールに由来し;そしてY 3は3‐アミノフェノールに由来する。 この実施例においては、式XVにより示される吸収剤がCEA(Kistler/Nitschmann法によって血漿から得られた沈殿Aからの清澄化された抽出物A)からのイムノグロブリンGの精製に使用される。 (アガロースに22ミリモル/gで負荷された)吸収剤をガラスのカラム(10mL)に充填し、カラム10個分の体積の25mMリン酸ナトリウム、pH7.0で平衡化し、そして(400mg以下のイムノグロブリンGを含む)CEAを負荷した。 そして、カラムを25mMリン酸ナトリウム、pH7.0(カラム5個分の体積)、次いでカラム5個分の体積の(クエン酸でpH6.5に平衡化した)10mMリン酸ナトリウムで洗浄した。 結合タンパク質を10mMクエン酸ナトリウム、pH3.0、次いで50mMのクエン酸で溶出した。 使用後、カラム10個分の体積の0.5M水酸化ナトリウムでカラムを衛生化した。 この吸収剤の結合能は、43.2mg/mLであることがわかり、そして(2つの溶出画分中に溶出した総タンパク質である)溶出能は32.8mg/mLであることがわかった。 第一の溶出は、約95%純度のIgGを含み、吸収剤の溶出能は27mg/mLであった。 実施例9 各ライブラリーについて、同一の第1のアミンY 1を64のライブラリー構成物に対して加え、(先の実施例に記載したとおり、)スペーサーアーム及びトリアジン付加のあとに付加した残りのアミンY 2及びY 3は、各ライブラリーを含む異なる64のゲルを表示する。 先の実施例において記載したように、塩素の放出及びTNBSアッセイを固相合成の各段階で実施した。 1〜12のライブラリーそれぞれのアミンY 1 、Y 2及びY 3を示す(表5)。 実施例9に記載の「ライブラリーのライブラリー」の合成からの例示的な3‐D構造は以下のとおりである。 実施例10 実施例11 これらの4つの樹脂を以下のように評価した。 比濁分析によって、未結合の(FT)及び溶出(E1及びE2)画分をアルファ‐1‐アンチトリプシンについてアッセイした。 結果を、これらの条件下でのこれらの物質についての計算した結合能(BC)及び溶出能(EC)とともに表8に示す。 実施例12 実施例3に記載したようにこの樹脂をトリクロロトリアジンと反応させてジクロロトリアジンゲルを生成した。 塩素レベルをアッセイし、12.5ミリモル/安定化させたゲルのgであることがわかった。 実施例4に記載のアミン付加と類似の方法で、トリプタミン溶液をジクロロトリアジンに添加することによって、第1のアミンY 1 (構造XI)を付加した。 塩素レベルは、5.4ミリモル/安定化させたゲルのgであった。 実施例5に記載のスペーサー付加と類似の方法で、エチレンジアミン溶液を添加することによって、スペーサーX 2 (構造XI)を取り込ませた。 TNBSアッセイは、アミンレベルが5.4ミリモル/安定化させたゲルのgであることを示した。 そして、最初(上記を参照のこと)と同様の条件を用いて、第二のトリクロロトリアジン付加を達成した。 塩素レベルは12.1ミリモル/安定化させたゲルであった。 実施例4に記載のアミン付加と類似の方法で、チラミン溶液をジクロロトリアジンに添加することによって、第2のアミンY 2 (構造XI)を付加した。 塩素レベルは、12.1ミリモル/安定化させたゲルのgであった。 実施例2に記載のスペーサー付加と類似の方法で、0.88アンモニアを添加することによって、スペーサーX 3 (構造XI)を取り込ませた。 生成物質についてTNBSアッセイを行った(5.7ミリモル/安定化させたゲルのg)。 その後、最初の2つと類似の条件を用いてトリクロロトリアジンの第三の付加を達成した。 塩素レベルは12.5マイクロモル/安定化させたゲルのgであった。 先のステップで得られたビス‐クロロ‐ビス‐トリアジンゲルを8個のボトルに量り分けて入れ、実施例6記載の方法と類似の方法で8個の異なるアミンと反応させ、アミンY 3 (構造XI)を取り込ませた。 これらの付加に関する塩素放出量(μモル/安定化させたゲルのg)を表9に示す。 上記の中間のアミンの付加後、8つのゲルのそれぞれを懸濁し、実施例7に記載したような8個のウエルの列に分ける。 8つの異なるアミンY 4を8列のウエルにわたって添加し、全部で64個の4重にアミン置換された異なる樹脂を生成した。 表10中の結果は、この最後の置換Y 4後に得られた塩素放出データを、ゲル1gあたりの放出された塩素のミリモルで示す。 例示的な4−D構造は以下のものである。 |