Novel reagent for labelling nucleic acid |
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| 申请号 | JP2001272569 | 申请日 | 2001-09-07 | 公开(公告)号 | JP2003012951A | 公开(公告)日 | 2003-01-15 |
| 申请人 | F Hoffmann La Roche Ag; エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー; | 发明人 | HEINDL DIETER DR; SAGNER GREGOR DR; MAERZ HERIBERT; VON DER ELTZ HERBERT; | ||||
| 摘要 | PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a labelling reagent which is used for synthesizing a labelled oligonucleotide, gives a label free from strong electron acceptor effects, and is stable during the synthesis of an oligonucleotide. SOLUTION: This reagent is represented by the structural formula [wherein M is a detectable label; L is a linker represented by -(CH2 )p - or -(CH2 )p -CO-NH-; Z is CH or N; S is a removable protective group; n and m are each independently a natural number of 1-15; and K is a phosphoamidite or K=-V-T (wherein T is a solid-phase carrier substance; and V is a linking group containing a cleavable bond)]. | ||||||
| 权利要求 | 【特許請求の範囲】 【請求項１】 構造【化１】 〔式中、 Mは、検出可能な標識であり、 Lは、構造-(CH 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、 Zは、CHまたはNのいずれかであり、 Sは、除去可能な保護基であり、 n、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数であり、 OKは、ホスホアミダイトまたはK=-VTのいずれかであり、ここで、Tは、固相担体物質であり、そしてVは、開裂可能な結合を含有する連結基である。 〕を有する標識試薬。 【請求項２】 構造【化２】 〔式中、 Mは、検出可能な標識であり、 Lは、構造-(CH 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、 Zは、CHまたはNのいずれかであり、 Sは、除去可能な保護基であり、 n、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数であり、 Tは、固相担体物質であり、そしてVは、開裂可能な結合を含有する連結基である。 〕を有する標識された反応性担体。 【請求項３】 構造【化３】 〔式中、 Mは、検出可能な標識であり、 Sは、除去可能な保護基であり、 n、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数であり、 Tは、固相担体物質であり、そしてVは、開裂可能な結合を含有する連結基である。 〕を有する標識された反応性担体であって、 Lが、構造-(CH 2 ) p -CO-NH- を有するリンカーを表わし、そしてpが1〜15の自然数であることを特徴とする、担体。 【請求項４】 前記担体物質が、規定された細孔サイズを有するガラス粒子からなることを特徴とする、請求項２または３に記載の担体。 【請求項５】 前記検出可能な標識Mが、蛍光染料、好ましくはフルオレセインであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の担体。 【請求項６】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の担体を製造するための、構造M-NH-CO-(CH 2 ) p -COOH 〔式中、pは1〜15の自然数を表わし、そしてMは検出可能な標識である。 〕を有する分子の使用。 【請求項７】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の担体を製造する方法であって、 a) 2個の反応性ヒドロキシル基と1個の反応性アミノ基とを含有する三官能性スペーサーを製造するステップ、 b) ヒドロキシル基に保護基を導入するステップ、 c) 請求項６に記載の分子のカルボン酸基を活性化エステルに変換するステップ、 d) 該活性化エステルを該三官能性スペーサーの反応性アミノ基にカップリングさせるステップ、 e) 遊離状態のままである該三官能性スペーサーのヒドロキシル基を前記担体物質にカップリングさせるステップ、 を含んでなる、方法。 【請求項８】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の担体を製造するための、構造【化４】 〔式中、 Zは、CHまたはNのいずれかであり、 Lは、構造-(CH 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーであり、そしてm、n、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数である。 〕を有する三官能性スペーサーの使用。 【請求項９】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の担体を製造する方法であって、 a) 請求項８に記載の三官能性スペーサーを製造するステップ、 b) ヒドロキシル基に保護基を導入するステップ、 c) 該三官能性スペーサーのカルボン酸基を活性化エステルに変換するステップ、 d) 遊離アミノ基を含有する検出可能な分子を、該活性エステルと該アミノ基との反応によりカップリングさせるステップ、 e) 遊離状態のままであるヒドロキシル基を前記担体物質にカップリングさせるステップ、 を含んでなる、方法。 【請求項１０】 3'標識された核酸を合成するための、 請求項２〜５のいずれか１項に記載の担体の使用。 【請求項１１】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の担体を利用して製造される3'標識された核酸分子。 【請求項１２】 部分構造-CH 2 -CO-NH-M 〔式中、Mは、蛍光染料のような検出可能な標識である。 〕を有する置換基を3'末端リボースの3'位に含有してなる核酸分子。 【請求項１３】 OKがホスホアミダイトであることを特徴とする、請求項１に記載の標識試薬。 【請求項１４】 前記検出可能な標識Mが、蛍光染料、 好ましくはフルオレセインであることを特徴とする、請求項１３に記載の標識試薬。 【請求項１５】 標識された核酸を合成するための、請求項１３または１４に記載の標識試薬の使用。 【請求項１６】 請求項１３または１４に記載の標識試薬を利用して製造される標識された核酸分子。 【請求項１７】 部分構造-CH 2 -CO-NH-M 〔式中、Mは、蛍光染料のような検出可能な標識である。 〕を有する置換基を含有してなる、請求項１６に記載の核酸分子。 |
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| 说明书全文 | 【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、合成により製造された核酸を標識する分野に関する。 【０００２】 【従来の技術】広範にわたる多種多様な分子生物学的および分子診断学的方法を実施するために、検出可能な標識を備えた合成(デオキシ)-オリゴヌクレオチドが必要である。 【０００３】合成(デオキシ)-オリゴヌクレオチドは、 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、 Zは、CHまたはNのいずれかであり、 Sは、除去可能な保護基であり、 n、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数であり、 OKは、ホスホアミダイトまたはK=-VTのいずれかであり、ここで、Tは、固相担体物質であり、そしてVは、開裂可能な結合を含有する連結基である。 〕を有する標識試薬に関する。 【００１４】従って、本発明は、このほかに、構造【化６】 〔式中、 Mは、検出可能な標識であり、 Lは、構造-(CH 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、 Zは、CHまたはNのいずれかであり、 n、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数であり、 Sは、除去可能な保護基であり、そしてTは、固相担体物質である。 〕を有する標識された反応性担体にも関する。 【００１５】リンカーLは、好ましくは、構造-(CH 2 ) p -CO-NH- 〔式中、pは、1〜15の自然数である。 〕を有する。 【００１６】規定された細孔サイズを有する多孔性のガラス粒子またはポリスチレン粒子が、通常、固相担体物質として用いられる。 除去可能な保護基Sは、通常、ジメトキシトリチル(DMT)、ピキシル、またはNPEOCのような光化学的に除去可能なニトロベンジル基である(Tetra
2 ) p -COOH 〔式中、pは1〜15の自然数を表わし、そしてMは検出可能な標識を表わす。 〕を有する分子の使用に関する。 【００１９】この合成は、好ましくは、以下のステップ: a) 2個の反応性ヒドロキシル基と1個の反応性アミノ基とを含有する三官能性スペーサーを製造するステップ、 b) ヒドロキシル基にDMTのような保護基を導入するステップ、 c) 上記の分子のカルボン酸基を活性化エステル、好ましくはN-ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換するステップ、 d) 活性化エステルを三官能性スペーサーの反応性アミノ基にカップリングさせるステップ、 e) 遊離状態のままである三官能性スペーサーのヒドロキシル基を担体物質にカップリングさせるステップ、 を含んでなる方法により行われる。 【００２０】このほか、本発明に係る反応性担体は、構造【化７】 〔式中、Lは、構造-(CH 2 ) p - または構造-(CH 2 ) p -CO-NH- を有するリンカーを表わし、そしてpは、1〜15の自然数である。 〕を有する三官能性スペーサーを用いて製造することもできる。 【００２１】そのような方法には、好ましくは、以下のステップ: a) 上記の三官能性スペーサーを製造するステップ、 b) ヒドロキシル基に保護基を導入するステップ、 c) 三官能性スペーサーのカルボン酸基を活性化させて活性化エステルを生成するステップ、 d) 活性エステルを検出可能な分子の遊離アミノ基と反応させるステップ、 e) 遊離状態のままであるヒドロキシル基を担体物質にカップリングさせるステップ、 が含まれる。 【００２２】本発明はさらに、(デオキシ)-オリゴヌクレオチドのような3'標識された核酸を合成するための本発明に係る反応性担体の使用と、本発明に係る担体を利用して合成した結果として3'末端に新しい化学構造を有する3'標識された核酸分子に関する。 本発明はまた、特に、部分構造-CH 2 -CO-NH-M 〔式中、Mは、蛍光染料のような検出可能な標識である。 〕を有する置換基を3'末端リボースの3'位に有してなる核酸分子に関する。 【００２３】本発明はまた、構造【化８】 〔式中、 Mは、検出可能な標識であり、 Lは、構造-(CH 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、 Zは、CHまたはNのいずれかであり、 Sは、除去可能な保護基であり、 n、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数であり、 OKは、ホスホアミダイトである。 〕を有するホスホアミダイトに関する。 【００２４】これに関連して、「ホスホアミダイト」という用語には、当業者にホスホアミダイトとして知られているすべての化合物が含まれるものと解釈される(Bea
2 -CO-NH-M〔式中、Mは、蛍光染料のような検出可能な標識を表わす。 〕を有する置換基が含まれている。 好ましい実施形態では、置換基は、標識された核酸の5'末端リボースの5'位に共有結合される。 【００２７】 【発明の実施の形態】本発明の範囲内において、使用される用語のいくつかは以下のように定義される。 【００２８】反応性基とは、好適な条件下で他の分子と反応して共有結合を形成することのできる分子の基を意味する。 反応性基の例は、ヒドロキシル基、アミノ基、
2 ) p -Z またはM-NH-CO-(CH 2 ) p -CO-NH-Z 〔式中、pは、1〜15の自然数である。 〕を有する。 【００４４】言い換えると、これは、標識MとリンカーL
2 ) p -COOH 〔式中、CH 2鎖の長さpは、少なくとも1、多くとも15である。 〕を有する分子に変換することができる。 カルボン酸残基を有するそのような化合物は、当業者に公知の条件下でN-ヒドロキシスクシンイミドとの反応によりN-
2 ) p - を有する固定された化合物が本発明に係る方法により生成される。 また、この化合物は、先に記載の有利な性質の結果として、特に、3'末端標識された核酸を合成するために使用することができる。 【００５６】b) 反応性カルボン酸基を含有する三官能性スペーサーから出発する本発明に係る担体の製造2個の遊離ヒドロキシル基と1個の遊離アミノ基とを含有する従来の三官能性スペーサーから出発して、最初に、
2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、それと同時に、m、n、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数である。 〕で表わされる化合物を製造する。 【００５７】以下の構造を有する化合物が好ましい。 【化１１】 〔式中、m、n、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数である。 〕 【００５８】好ましい方法として、中心窒素原子を有するスペーサー: 【化１２】 〔式中、m、n、およびpは、この場合にも、互いに独立して、2〜15の自然数である。 〕から出発することもできる。 nおよびm = 2である市販のビシンのような分子が特に有利である。 その理由は、中心N原子と2個の末端ヒドロキシル基との間に少なくとも2個のC原子が存在すると、そのような化合物の安定性に関して有利であるからである。 【００５９】次に、DMTのような保護基を反応性ヒドロキシル基の一つに導入することにより、後続の合成ステップ時にこの保護基が他の反応相手と反応できないようにする。 反応の終了時、1個の保護基だけを有する分子が、当業者に公知の分取カラムクロマトグラフィー法により単離される。 【００６０】続いて、遊離状態のままであるカルボン酸基を当業者に公知の条件下で活性化させる。 特に、トリホスゲンおよびDMFを用いて活性化することがとりわけ好適であることが実証された。 【００６１】更なる反応ステップでは、蛍光染料分子のような反応性アミノ基を含有する検出可能な分子を三官能性スペーサーにカップリングさせることができる。 このようにすると、a)のところに記載したように、ヒドロキシル基がジメトキシ-トリチルで保護され、中心原子がリンカーを介して標識基に連結され、しかも遊離ヒドロキシル基が含まれている三官能性スペーサーが生成される。 【００６２】最後に、遊離状態のままである三官能性スペーサーのヒドロキシル基が、a)のところに記載されている方法と類似した標準的な方法により通常はCPGである担体物質に固定される。 この場合にも、固定を行った後、遊離状態のままである担体物質の反応性基を、当業者に公知のいわゆるキャッピング反応により不活性化しなければならない。 【００６３】本発明のもう一つの実施形態では、標識試薬は非ヌクレオシド型ホスホアミダイトであってもよい。 【００６４】反応性担体を製造するための本発明の方法と同じように、最初のステップで、以下の一般式で表わされる中間生成物が調製される。 【化１３】 〔式中、Mは、検出可能な標識であり、そしてZは、CHまたはNのいずれかである。 Sは、除去可能な保護基を表わし、Lは、構造-(CH 2 ) p -または構造-(CH 2 ) p -CO-NH-を有するリンカーを表わし、そしてn、m、およびpは、互いに独立して、1〜15の自然数を表わす。 〕 【００６５】この実施形態では、保護基Sは、好ましくはジメトキシトリチルである。 標識に存在する可能性のある反応性基が保護基を備えている場合も同様に有利である。 【００６６】次に、こうした前駆体を、第二ステップにおいて、遊離状態のままであるヒドロキシル基の反応により公知の方法で本発明に係るホスホアミダイトに変換することができる(例えば、B. Meyer RB Methods in
2 -CO-NH-Mを含有する置換基を5'末端リボースの5'位に有するオリゴヌクレオチドが得られる。 【００６９】ホスホアミダイトにより導入された保護基を再び除去した後、古典的なオリゴヌクレオチド合成の一部分として、遊離ヒドロキシル基上で3'-5'方向に鎖伸長を行うことができる。 いわゆる内部「非塩基性部位」を含有する内部標識された核酸分子は、このようにして生成される。 【００７０】3'末端における標識化は、次の原理に従って行われる。 市販の3'-ホスフェート-CPG(例えば、Glen
2 -CO-NH-Mを含有する置換基を3'末端リボースの3'位に有するオリゴヌクレオチドが得られる。 【００７１】 【実施例】以下の実施例により本発明の特徴について更に説明する。 【００７２】 （実施例１） ジピバロイルフルオレセイ ン-NHSエステルの調製 A) ジピバロイルニトロフルオレセイン 【化１４】 ジクロロメタン100mlとピリジン8mlとジメチルホルムアミド6mlとの混合物に4-ニトロフルオレセイン(TCI 199)
B) ジピバロイルアミノフルオレセイン 【化１５】 ジピバロイルニトロフルオレセイン6.5g(11.9mmol)をジオキサン100mlに溶解させた。 次に、エタノール20mlに溶解されたパラジウム/活性炭(Merk 807104)650mgを添加し、振盪しながら水素を2.5時間送入した。 その後、
C) ジピバロイル-4-アミノグルタリルフル オレセイン 【化１６】 クロロホルム75mlにジピバロイルアミノフルオレセイン
D) ジピバロイル-4-アミノグルタリルフル オレセインNHSエステル 【化１７】 無水ジクロロメタン250ml(4.1mmol)にジピバロイル-4-
（実施例２） 三官能性スペーサーとして のDMT-Fmoc化合物の調製 A) N-Fmoc 1,3-ジヒドロキシ-2-アミノプロパン 【化１８】 Fmoc-NHS (Novabiochem. 01-63-001) 21.6g(64mmol)をジオキサン300mlに溶解させ、そしてセリノール(Aldric
B) N-Fmoc 1-ジメトキシトリチルオキシ 3 -ヒドロキシ-2-アミノプロパン 【化１９】 無水ピリジン55mlにジメトキシトリチルクロリド13.85g
C) 1-ジメトキシトリチルオキシ-3-ヒドロ キシ-2-アミノプロパン 【化２０】 N-Fmoc 1-ジメトキシトリチルオキシ-3-ヒドロキシ-2-
（実施例３） 本発明に係るフルオレセイ ンCPGの調製 A) 1-ジメトキシトリチルオキシ-3-ヒドロキシ-2-アミ ノプロパンを含有するグルタリルアミノ-ビスピバロイ ルフルオレセインNHSエステルの反応 【化２１】 （フルオレセインおよびDMTで置換された本発明の三官 能性スペーサーの調製）湿分を除去しながら、グルタリルアミノ-ビスピバロイルフルオレセインNHSエステル2.
B) スクシニル化 （フルオレセイン、DMT、および反応性カルボキシル基 で置換された三官能性スペーサーの調製） 【化２２】 Aから得られた生成物2.33g(2.3mmol)と無水コハク酸0.4
C) 下記の構造を有するフルオレセイン-CP Gの調製 （本発明に係るフルオレセイン-CPGの調製） 【化２３】 ステップB)から得られたスクシネート2.2g(2.0mmol)とN
D) トリチル除去を利用した充填量の検査 CPG物質4.37mgをDMT除去試薬(Roth 2257.2) 25ml中に懸濁させ、498nmにおける吸光度を測定した(A=0.51)。 ε 498nm DMT = 14300 (L*/mol*cm) 計算結果は以下の通りであった。 14.3 (L*mmol -1 *cm -1 )*25ml*A 498nm /重量(mg) = μmol/
（実施例４） 本発明に係るフルオレセイ ン-CPGの調製 A) ジメトキシトリチル-ビシン 【化２４】 ピリジン50mlにジメトキシトリチルクロリド3.38g(10mm
B) N-(2-ヒドロキシエチル)-N (2-ジメト キシトリチルオキシエチル)-5-(2-アミノ-エチルカルボ キサミド)-ビスピバロイルフルオレセイン 【化２５】 ビストリクロロメチルカーボネート(トリホスゲン) 0.5
（実施例５） 3'標識されたフルオレセイ ン27量体オリゴヌクレオチドの合成および精製 DNA自動合成機(Applied Biosystems, model ABI 392-0
2 Tr]ib 2 G d 、[(Me
2 Tr]bz 6 A d 、[(MeO) 2 Tr]bz 4 C d 、[(MeO) 2 Tr]T d )を合成に使用した。 【００９４】オリゴマー合成は、DNA合成機で常用されるホスホアミダイトプロトコルに準拠してトリチル・オフ・モードで行った。 25%NH 3 /H 2 Oを用いてオリゴヌクレオチドを開裂または脱保護した(55℃で8時間)。 精製するために、MonoQ(5.0×50mmカラム、Amersham Pharmaci
【図面の簡単な説明】 【図１】3'末端にフルオレセイン標識を有する本発明により合成されたオリゴヌクレオチドのHPLCクロマトグラムを示す図である。 【図２】本発明により合成された同じオリゴヌクレオチドの質量スペクトルを示す図である。 フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０９Ｂ 69/10 Ｃ０９Ｂ 69/10 Ｂ ４Ｊ００１ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ディーター ハインデル ドイツ連邦共和国 ディー−82327 ツテ ツィンク ワルドシュミットシュトラーセ １ (72)発明者 グレゴール サグナー ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペン ツェベルグ マイチェルベックシュトラー セ 16 (72)発明者 ヘリベルト マーツ ドイツ連邦共和国 ディー−82396 パエ ハル スターンシュトラーセ ６ (72)発明者 ヘルベルト フォン ダー エルツ ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ワイ ルハイム イン ダー アオ 21 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FB07 FB12 4B024 AA20 CA05 FA10 HA19 4C057 AA17 DD02 MM04 4H006 AA03 AB80 AB99 BJ50 BN10 BP10 BP30 BU32 BV24 4H056 BA02 BB05 BB14 BC01 BD01 BF08F BF22 FA08 4J001 DA01 DD20 EA12 GE02 |
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