Method of binding to the chemically modified nucleic acids and nucleic acid of the solid support

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） １． 発明の技術分野 本発明は、ゲノムの広範囲にわたる遺伝子マッピングおよび遺伝子の発現研究などの領域において結合させた核酸試料に対する科学的研究または日常的な試験を行うために核酸を固体支持体に固定するための非常に関連した一連の化合物、
装置、および固定化技術に関する方法を特許請求する。

【０００２】 ２． 先行技術 生化学分野における研究の大部分は、核酸（特に、デオキシリボ核酸、すなわち、ＤＮＡ）が関与する研究に向いている。 ＤＮＡは、溶液（すなわち、水系溶液）状態に置かれた場合に加水分解などで分解しやすい水溶性化合物である。 明らかなことではあるが、このために、ＤＮＡが関与する研究はいずれも期待通りにならず、従って、ＤＮＡが関与する正確で信頼性の高い研究には、ＤＮＡの一体性が保証される方法または装置が必要である。 ＤＮＡの研究を容易にするために、多くの場合、ＤＮＡを、ガラスの平滑なシートなどの固体表面に固定または固定化することは望ましい。 このような方法で所定の位置に固定されると、ＤＮ
Ａは容易に操作することができる（すなわち、他の物質と反応させることができる）。 ＤＮＡが長鎖であると考えられる場合、ＤＮＡの固定化は、鎖の一方の端が固体支持体に固定され、その結果、鎖の残り部分が修飾されず、特定の研究に依存するさらなる反応を自由に受けることを意味する。 実際、これは、ＤＮＡが関与する実験研究を行うために広く使用されている方法である。

【０００３】 ＤＮＡを固体支持体に固定化することに伴う大きな問題は、おそらくは、（実際に固体支持体に結合している比較的小さな部分を除いて）ＤＮＡを変化させることなく、いかにしてＤＮＡを固定化するかということそのものである。 使用される固体支持体はどれも本質的に不活性でなければならないから、これは非常に難しい問題である。 すなわち、固体支持体は、ＤＮＡを固体支持体に単に固定化すること以外にＤＮＡと反応してはならない。 ガラスは、安価で非常に不活性であるので特に好適な固体支持体である。 現在、現行の正統な慣行は、固体支持体（例えば、ガラスの表面）を、ＤＮＡの一方の端がその表面に結合できるように、最初に処理または誘導体化しなければならないことである。 これを行うための技術が多数存在する。

【０００４】 残念なことに、ガラスのそれ以外の点で不活性な表面を誘導体化することによって、ＤＮＡが関与する実験研究の結果を混乱させ得る様々な問題が生じている。 １つの問題は、ガラス表面を誘導体化することによって、正味の正の静電気電荷がガラス表面に生じることである。 ＤＮＡは（正味の）負の電荷を帯びているので、他のＤＮＡ（または研究の後期で使用されるが、ガラス表面に意図的に固定されないＤＮＡ）が（非特異的な静電気的引力によって）ガラス表面に付着しやすい。 すなわち、（二本鎖よりもむしろ）一本鎖のＤＮＡであるＤＮＡ「プローブ」が、多くの場合、固体支持体に固定されたＤＮＡ一本鎖のアレイと接触させられる。 プローブは既知のヌクレオチド配列を有し、かつ特定の一本鎖ＤＮＡ
は相補鎖に優先的に結合するので、プローブが反応する特定の固定化された鎖によって、以前には知られていない固定化された鎖のヌクレオチド配列が明らかにされる。 しかし、このタイプの簡便な実験（プローブ研究）は、誘導体化された（従って、静電気的に帯電した）ガラス表面にプローブが静電気的に付着することによってひどく混乱させられる。 例えば、プローブは、多くの場合、その存在が通常の放射線検出器で検出できるように放射性標識されている。 従って、検出器により示されるガラス表面におけるプローブの位置によって、（事前に知られ、指定されている）ガラス表面におけるその特定の位置に固定化されているＤＮ
Ａ鎖の化学的同一性または配列が明らかにされる。 しかし、放射線検出器は、固体支持体に固定されたＤＮＡの相補鎖に化学的に結合したプローブと、（ＤＮＡ
鎖に対してではなく）ガラス表面に単に静電気的に付着したプローブとを識別することができない。

【０００５】 第２に、誘導体化された表面は、「スプレッディング」として知られていることが生じる。 スプレッディングは、誘導体化されたときに固体支持体表面が親水性になるために生じる。 その結果、（固体支持体に固定化されることが望ましい）ＤＮＡを固体支持体の表面と接触させた場合、ＤＮＡは、離れた「スポット」
で留まるのではなく広がる。 理想的には、ＤＮＡを、離れた「スポット」で留まるようにしなければならない。 なぜなら、放射性標識プローブが特定のスポットまたは別のスポットで検出されるかどうかによって、科学者は、プローブがあちこちの固定化されたＤＮＡと反応したことを推定するかどうかを決定するからである。 スプレッディングは、アレイ密度（すなわち、１つの固体支持体上に配列させることができる種々の核酸試料の数）に対する大きな制約である。 従って、
スプレッディングを縮小し、従って、アレイ密度を大きくする何らかの手段が非常に望ましい。

【０００６】 核酸試料を結合させるガラス表面を調製するために使用されている１つの非常に一般的な物質は、ポリ−Ｌ−リシンである。 例えば、デリシ（ＤｅＲｉｓｉ）
ら、ヒトのガンにおける遺伝子の発現パターンを分析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用、１４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４５７（１９９６）
；シャロン（Ｓｈａｌｏｎ）ら、２色蛍光プローブハイブリダイゼーションを使用する複雑なＤＮＡ試料を分析するためのＤＮＡマイクロアレイシステム、６、
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６３９（１９９６）；およびシェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、相補的ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現パターンの定量的モニターリング、２７０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、４６７（１９９５）を参照のこと。 事前に誘導体化されたガラス支持体の他のタイプが市販されている（例えば、シリル化された顕微鏡スライドガラス）。 例えば、シェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、並行的なヒトゲノム分析：１０００遺伝子のマイクロアレイ型発現モニターリング、９３、Ｐ
． Ｎ． Ａ． Ｓ． １０６１４（１９９６）を参照のこと。

【０００７】 多数の他の表面コーティングが開示されている。 例えば、米国特許第５，６３
０，９３２号（承継人：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）は、走査トンネル顕微鏡法で使用されるプローブ（白金）チップのコーティングを開示している。 多数の手段が、表面をコーティングするために開示されているが、Ｓｉ（ＯＣＨ ₃ ）ＣＨ ₂ Ｉが注目される。 米国特許第５，６１０，２８７号（
承継人：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｏｌ）は、固体表面を塩またはカチオン性界面活性剤でコーティングして、核酸をその表面に非共有結合的に結合させることを開示している。 米国特許第５，０２４，９３３号（承継人：Ｅｎｚｏ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ）は、天然に存在するイガイの接着性タンパク質の単離物で固体支持体をコーティングすることを開示している。 米国特許第４，９３７，１８８号（承継人：Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、酵素の基質として作用する分子鎖を介して酵素を固体支持体に共有結合させることを開示している。 米国特許第４，８１８，６８１号（承継人：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ）は、ヌクレオシドの複素環部分を介してヌクレオシドホスフェートで固体支持体をコーティングすることを開示している。 この場合、核酸は、
次いで、酵素的に結合させることによって固体支持体に固定化される。 米国特許第４，８０６，６３１号（承継人：Ｍｉｌｅｓ）は、ナイロン表面のアミン基の部分的な加溶媒分解によって（例えば、アルキル化基で処理することによって）
ナイロンの固体支持体を活性化することを開示している。

【０００８】 この問題に対する別の取り組みには、固体支持体および固定化しようとする核酸の両方を誘導体化することが含まれる。 例えば、米国特許第５，６４１，６３
０号（承継人：ＡｍｇｅｎおよびＡｂｂｏｔｔ）は、結合させようとする核酸が同様に結合する複合化剤に結合する別の複合化剤で固体支持体をコーティングすることを開示している。 米国特許第５，５５４，７４４号（承継人：Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｎ）は、固体支持体をジイソプロピルカルボジイミドおよび酸触媒と接触させること、およびヌクレオシドを固定化するためのスクシニル化ヌクレオシドを開示している。 米国特許第５，５１４，７８５号（承継人：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）は、固体支持体を、好ましくは一級アミンおよび二級アミンでコーティングし、その後、塩化シアヌルを使用して核酸を活性化することを開示している。 米国特許第５，２１５，８８２号（承継人：Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、固定化しようとする核酸を一級アミンまたは等価物で修飾し、その後、修飾された核酸を還元剤の存在下で固体支持体（支持体は遊離のアルデヒド基を有しなければならない）と反応させることを開示している。

【０００９】 最後に、核酸を固体支持体物質に固定化するという問題に対する第３の取り組みには、新規な固体支持体を作製することが含まれる。 例えば、米国特許第５，
０５５，４２９号、同第５，００８，２２０号、同第４，９６３，４３６号、同第４，８２６，７９０号および同第４，８２６，７８９号（承継人：ＥＣＣ イｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を参照のこと。 これらは、アルミノケイ酸塩物質から作られる固体支持体を開示している。

【００１０】 核酸試料を固定する前にガラス表面（の全体）を誘導体化することの上記欠点のために、固体支持体に対して、直接、核酸試料を合成することを含むいくつかの方法が開発されている。 例えば、ハシア（Ｈａｃｉａ）ら、高密度オリゴヌクレオチドアレイおよび２色蛍光分析を使用するＢＲＣＡ１におけるヘテロ接合変異の検出、１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４４１（１９９６）；ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）ら、高密度オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションによる発現のモニターリング、１４、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６７５（１９９６）；マスコス（Ｍａｓｋｏｓ）およびサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ガラス支持体でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチド合成用の新規なリンカーおよびインサイチュで合成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性、２０ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６７９（１９９２）（およびその引用参考文献、特に、５〜１１）を参照のこと。

【００１１】 繰り返すが、現在、生化学分野における一般的な考えは、核酸を固体表面に効果的に固定化するために、固体支持体は、最初に誘導体化しなければならず、すなわち、化学的に不安定にしなければならず、そうすることによって、次に、核酸を固体支持体と反応させることができることである。 さらに、エポキシドは発ガン性であると知られている。 すなわち、エポキシドは、核酸（特に、ＤＮＡ）
に損傷を与えることが知られている。

【００１２】 従って、生化学分野における現在の知識水準とは全く逆に、今回提示された本発明は、修飾または誘導体化が行われていないガラス表面に核酸が容易に接着するように修飾されたＤＮＡ（より一般的には、核酸）を開示し、特許請求する。
詳細には、本発明は、修飾されていない固体支持体に容易に固定されるエポキシド修飾された核酸（特に、ＤＮＡ）を開示し、特許請求する。

【００１３】 （発明の開示） 本発明の目的の１つは、その後の生化学的研究が可能であるように固体表面に接着する修飾された核酸である。

【００１４】 従って、本発明の１つの側面により、環状エーテル基およびアルコキシシラン基の２つの極めて重要な官能基を含有する部分に共有結合した核酸を含む修飾された核酸が特許請求される。 本発明の他の側面により、上記の修飾された核酸を調製するための方法が特許請求される。

【００１５】 さらに、本発明の別の側面により、ガラスまたは他の不活性な表面を含む高密度マイクロアレイであって、多数の高度に区別される修飾型ＤＮＡ試料のスポットをその表面にプリントすることによって作製される高密度マイクロアレイが特許請求される。

【００１６】 本発明の別の側面により、核酸およびハロゲン化シランから調製される別の修飾された核酸が特許請求される。

【００１７】 本発明のさらに別の側面により、核酸を臭素化部分と反応させ、その後、アミン化シランと反応することによって調製される別の修飾された核酸が特許請求される。

【００１８】 本発明の別の側面により、上記の高密度マイクロアレイのプリントを可能にする装置が特許請求される。

【００１９】 本発明のさらに別の側面により、試料密度および検出感度を最適化するために、当業者が固体表面の静電特性を調節させることができる修飾されたシランが特許請求される。

【００２０】 本発明は、先行技術を上回る多数の利点を有する。 そのような利点の多くは、
典型的には通常のガラスである固体表面が非常に化学的に不活性のままであるという事実から得られる。 従って、ガラスに付着するプローブ（または他の反応物）の前記の問題は、「スプレッディング」と同様に完全に除かれる。 最大の結果は、特に、現在の技術水準の誘導体化された固体支持体と比較して、はるかにより大きな検出感度である。

【００２１】 さらに、固体支持体に固定化される核酸は容易に誘導体化される。 本発明のエポキシド誘導体の反応は簡単に実施することができ、穏和な条件のもとで生じる。 反応速度は速く、平衡は非常に有利である。 さらに、本発明のエポキシド修飾された核酸は、本質的には永久的に安定であり、従って、後で使用するために調製して保存することができる。 さらに、より具体的な利点が、本発明の特定の実施形態が議論されている下記に開示される。

【００２２】 他の目的、特徴および利点ならびにさらなる目的、特徴および利点は、開示の目的で示される本発明の現時点での好ましい実施形態の下記の説明から、添付された図面と組み合わせた場合に明らかである。

【００２３】 図面は必ずしも縮尺が合っていない。 本発明のいくつかの特徴は一定の割合で誇張されている場合があり、あるいは明快化および簡略化のために概略的な形式で示されている場合がある。

【００２４】 （好適な態様の詳細な説明） 様々な代替および改変を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中に開示された本発明に対して行い得ることは、当業者には容易に理解される。

【００２５】 本発明の骨子は、固定化しようとする核酸の化学的修飾である。 この化学的に修飾された核酸は、次いで、ガラス表面などの固体支持体に対して容易に反応する。 これにより核酸は固定化される。 再度ではあるが、これは、核酸自体ではなく、むしろ固体支持体の修飾を教示する先行技術に対する直接的な否定である。

【００２６】 本発明の修飾された核酸は、ヒドロキシル基を有する様々な固体表面に容易に接着する。 これらには、石英ガラス、雲母、アルミナ（Ａｌ ₂ Ｏ ₃ ）、チタニア（ＴｉＯ ₂ ）、ＳｎＯ ₂ 、ＲｕＯ ₂ 、ＰｔＯ ₂ 、ならびに多数の他の金属酸化物の表面が含まれるが、これらに限定されない。

【００２７】 一群の実施形態において、本発明の化学的に修飾された核酸は、環状エーテル基およびアルコキシシラン基の２つの極めて重要な官能基を有する化合物でそのように修飾される。 核酸を環状エーテルと反応させ、次いで、新たに修飾された核酸を、それ以外の点では不活性なガラス表面と接触させると、その表面でアルコキシシラン基がガラス表面のＳｉ−ＯＨ基と反応する。

【００２８】 別の異なる種類の実施形態において、本発明の化学的に修飾された核酸は、アミノ基およびアルコキシシラン基の２つの極めて重要な官能基を有する化合物でそのように修飾される。 核酸をアミノ基と反応させ、次いで、新たに修飾された核酸を、それ以外の点では不活性なガラス表面と接触させると、その表面でアルコキシシラン基がガラス表面のＳｉ−ＯＨ基と反応する。

【００２９】 さらに別の異なる種類の実施形態において、核酸は、ハロゲン化シラン化合物と反応させることによって修飾される。 さらに別の種類の実施形態において、核酸は、アミン含有シランおよび臭素化された核酸との最終的な反応を含む２段階プロセスによって誘導体化される。

【００３０】 他の実施形態は、本発明の先の実施形態の修飾された核酸を利用する高密度マイクロアレイの調製および最適化に関する。

【００３１】 実施例１ ３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランを使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の一形態を記載する。 化学的修飾の目的は、誘導体化されていない固体表面に核酸を容易に固定させることができることである。 本実施例において、核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、図１に従って、３
−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）との反応によって修飾される。 ＧＰＴＳは、実際には、（修飾されていない）ＤＮＡ試料をその後で接触させて固定化するガラス表面を誘導体化するために以前から使用されている。 しかし、ＧＰＴＳの使用は、これとは反対の目的のためである。 すなわち、誘導体化されていないガラス表面に対するその後の結合のためにＤＮＡを修飾することは、以前には開示も示唆もされていない。 さらに、エポキシド基を含有しているために、ＧＰＴＳはインビボでＤＮＡを損傷することが知られている。 これらの理由のために、ＤＮＡを誘導体化するためにＧＰＴＳを使用することは、実際には先行技術によって思いとどまらされている。

【００３２】 概略的に記載すると、核酸を固体支持体に固定することは、本質的には２工程からなる。 最初の工程において、核酸をＧＰＴＳ分子のエポキシド端と反応させ、第２の工程において、ガラス表面を反対側の端（すなわち、ＧＰＴＳで修飾された核酸のシラン端）と反応させ、それによって、核酸は、誘導体化されていないガラス表面に固定される。 全体の反応は迅速であり、好ましい平衡を特徴とし、最少量の安価な試薬を使用する非常に穏和な条件のもとで生じる。 多数の方法が反応のどちらかの工程を行うために存在することは極めて明らかであるが、好ましい方法を本実施例および下記の実施例において示す。

【００３３】 図１に示されているように、環状エーテルおよびアルコキシシランを有する化学化合物（この場合、それぞれ、エチレンオキシドおよびトリメトキシシラン）
は化合物の２つの端を構成する。 ２つの端は、炭素が４個のエーテルリンカーで連結されている。 示される化合物は、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（すなわち、ＧＰＴＳ）である。 最初の工程において、ＤＮＡを、好ましくは９．５よりも高い塩基性ｐＨでＧＰＴＳと反応させて、修飾されたＤＮＡを得る。 次いで、この修飾されたＤＮＡを、誘導体化していないガラス（または他のシラノール含有）表面と中性ｐＨで反応させる。 このようにして、ＤＮＡがガラス表面に固定化される。 最初の工程において、環状エーテル官能基がＤＮＡと反応する。 再度ではあるが、環状エーテルは、ＧＰＴＳの場合のようにエチレンオキシドである必要はない。 しかし、小さな環が、比較的非反応性であるエーテル官能基の反応性を大きくするために好ましい。

【００３４】 誘導体化されたＤＮＡに導く最初の反応は、ＤＮＡのリボース環の５位炭素が関与すると考えられる開環反応である。 この誘導体化されたＤＮＡは極めて安定であり、実際に使用されるまでの長期間にわたって保存することができる。 誘導体化されたＤＮＡをガラス表面に固定化する第２の反応は、ガラス表面においてＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が生成する単純な置換反応であり、ＧＰＴＳ分子からのアルコキシ基の脱離反応である。

【００３５】 実施例２ ３−アミノプロピルトリエトキシシランを使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の別の好ましい形態を記載する。 化学的修飾の目的は、誘導体化されていない固体表面に核酸を容易に固定させることができることである。 本実施例において、核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、図２に従って、３−アミノプロピルトリメトキシシランとの反応によって修飾される。
実施例１の場合のように、核酸を固体支持体に固定することは、本質的には２工程からなる。 最初の工程において、核酸を３−アミノプロピルトリメトキシシラン分子のエポキシド端と反応させる。 第２工程において、ガラス表面を、反対側の端（すなわち、３−アミノプロピルトリメトキシシランで修飾された核酸のシラン端）と反応させる。 それによって、核酸は、誘導体化されていないガラス表面に固定化される。

【００３６】 実施例１の場合のように、全体の反応は迅速であり、好ましい平衡を特徴とし、最少量の安価な試薬を使用する非常に穏和な条件のもとで生じる。 多数の方法が反応のどちらかの工程を行うために存在することは極めて明らかであるが、好ましい方法を本実施例および下記の実施例において示す。

【００３７】 図２に示されているように、アミノ基およびアルコキシシランを有する化学化合物（この場合、それぞれ、−ＮＨ ₂およびトリエトキシシラン）は化合物の２
つの端を構成する。 ２つの端はプロピル結合によってつながっている。 示される化合物は、３−アミノプロピルトリエトキシシランである。 最初の工程において、ＤＮＡを、好ましくは重亜硫酸ナトリウムの存在下、中性ｐＨで３−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させる。

【００３８】 誘導体化されたＤＮＡに導く最初の反応は、核酸のシトシン残基のアミノ基転移反応である。 実施例１の場合のように、誘導体化されたＤＮＡをガラス表面に固定化する第２の反応は、ガラス表面においてＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が生成する単純な置換反応であり、ＧＰＴＳ分子からのアルコキシ基の脱離反応である。

【００３９】 実施例３ 高密度マイクロアレイの調製 実施例１および２に記載される修飾された核酸などの本発明の修飾された核酸が調製されると、その後、そのような修飾された核酸を利用することができる。
再度ではあるが、このような修飾された核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、誘導体化されていない表面に修飾されたＤＮＡを単に接触させることによってガラス表面に固定化することができる。 この重要性は、特に、スプレッディング（固定化しようとするＤＮＡの所望する部位からの移動）および非特異的なプローブ付着（正味の負電荷のＤＮＡが引き寄せられる表面での正味の正の静電電荷を生じさせるガラス表面の誘導体化によって生じる）が本質的になくなることである。

【００４０】 これらの利点によって、非常に望ましい極端に高密度のマイクロアレイの作製が可能になる。 例えば、スプレッディングがなくなり、プローブ付着が効果的になくなるために、１つの小さなガラス表面は、実際上、試験すべき数千のＤＮＡ
試料を含有することができる。 この場合、そのそれぞれは、顕微鏡レベルの大きさであり、すべてが１つのガラス表面に固定化されている。 実際、ガラス表面に置かれた５０ミクロンよりも小さい多数の単一試料スポットからなるマイクロアレイを組み立てることができる。

【００４１】 多数のＤＮＡ試料からなるこのタイプの高密度マイクロアレイはまた、本発明に従って容易に組み立てることもできる。 修飾されたＤＮＡを、実際の使用に先立って、（例えば、実施例１および２に従って）良好に調製することができる。
このような化学的に修飾されたＤＮＡ試料は、その後、例えば格子様式で、誘導体化されていないガラスシートに容易に「印刷」され得る「ＤＮＡチップ」の類似体である。 図３には、本発明のＤＮＡチップを使用するそのような高密度マイクロアレイを調製するための装置の１つの実施形態が例示されている。 １つの好ましい実施形態において、この装置は、多数の安価な市販の毛細管マイクロピペットから作製される。 好ましくは１０ｃｍのマイクロピペットであるが、他の大きさも当然に使用される。 図３に示されているように、１０ｃｍのマイクロピペットはそれぞれ、一方の端を先細り状にするために引っ張られる。 マイクロピペットは六方最充填配列で配列させられ、正方形のフレームによって結束される。
マイクロピペットは互いに接着され、フレーム内の安定なユニットを形成することができる。 先細り端（図３Ｂ）は切断され、研磨されて光学的平坦にされる。

【００４２】 マイクロアレイを調製するために、装置のチップが、（本発明に従って化学的に修飾された）試験すべきＤＮＡ試料を含有する多ウエル容器に浸漬される。 従って、そのウエルは装置のマイクロピペットとともに整列される。 チップをウエルと接触させたとき、少量の各ＤＮＡ試料が、単なる毛細管作用によって、特定のウエルに対応するマイクロピペット内に入る。 スポットのサイズは、先細り端の大きさによって慎重に制御することができる。 この装置および本発明のＤＮＡ
チップを使用して、数千の試料を、同時に、そして高価なロボット工学を必要とすることなく狭い領域に配列させることができる。 実際、本発明の（ＤＮＡチップおよびピペット装置を含む）方法は、高速度のスポット用ロボットを使用する方法よりもさらに効率的であることが示されている。 最後に、本発明の化合物、
方法および装置は、市販される充填済みキットに容易に組み入れられる。

【００４３】 本発明の高密度マイクロアレイはまた、上記の先行技術の節に開示されたマイクロアレイシステムなどの先行技術のマイクロアレイシステムに容易に組み込むこともできる。 これらの方法、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびシャロン（Ｓｈａｌｏｎ）ら（２色蛍光プローブハイブリダイゼーションを使用する複雑なＤＮＡ試料を分析するためのＤＮＡマイクロアレイシステム、６、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６３９，１９９６）によって記載される方法は、参照により本出願において取り込まれる。 シャロン（Ｓｈａｌｏｎ
）らの方法において、ＤＮＡ試料のマイクロアレイをガラス基板上に作製すること、複雑な蛍光標識プローブとのハイブリダイゼーションによってそれらをプローブすること、およびレーザー走査顕微鏡を使用して、ハイブリダイゼーションを示す蛍光シグナルを検出することを含むマイクロアレイシステムが、ＤＮＡ試料を分析するために提供されている。 同様に、サージェント（Ｓａｒｇｅｎｔ）
ら（米国特許第５，６０１，９８２号）は、走査トンネル顕微鏡法で核酸を走査することを含む、ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法および装置を開示している。

【００４４】 実施例４ ハロゲン化シランを使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の別の形態を記載する。 再度ではあるが、ここで開示され特許請求される化学的修飾の目的は、誘導体化されていない固体表面（例えば、通常は石英ガラス）に核酸を容易に固定させることができることである。 図４に従って、本発明による修飾された核酸は、修飾されていない核酸を、ほぼ中性ｐＨのもとで、好適なシラン化合物と反応させることによって調製される。 図４の「Ｘ」は任意のハロゲン化物を示し得るが、好ましくは、Ｃｌ
、ＢｒまたはＩを示し；Ｒ ₁ 、Ｒ ₂およびＲ ₃は同一または異なっていてもよく、−−ＯＣＨ ₃および−−ＯＣ ₂ Ｈ ₅を含む。 特に、好ましい実施形態において、図４の矢印の左側に示されるハロゲン化シランは、８−ブロモオクチルトリクロロシラン、８−ブロモオクチルトリメトキシシラン、４−クロロブチルメチルジクロロシラン、および３−ヨードプロピルトリメトキシシランである。

【００４５】 図４に示される変換反応は、下記のように行われた。 ハロゲン化シランをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に約３０ｍＭの濃度で溶解した。 次に、３〜１０μ
ｇの核酸を１００μｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。 次いで、１〜３μｇの３０ｍＭハロゲン化シランを加えて、溶液を十分に混合し、
約３７℃で約３時間反応させた（あるいは、周囲温度で一晩反応させることができる）。 反応後、所望する生成物（すなわち、修飾された核酸）をエタノール沈澱で精製し、次いで修飾された核酸を水に溶解する。

【００４６】 実施例５ スポット密度／サイズの制御 本出願を通して議論されているように、本発明の１つの特定の利点は、研究者が、核酸研究を行うための非常に高密度なマイクロアレイを調製できることである。 本実施例は、本発明による高密度マイクロアレイの調製が開示された実施例３に関連して最も良く理解される。 本実施例では、本発明に従って、固体支持体における個々の核酸「スポット」のサイズを制御するために強化された方法が開示される。

【００４７】 小さなスポットサイズは、高密度マイクロアレイに関連して、より高い試料密度（すなわち、単位面積あたり、より多くの試料）および優れた検出感度を可能にする（シグナルがほとんど拡散しないからである）。 従来の固体支持体システムでは、当業者は極めて重大なジレンマに直面している。 （本明細書に記載される実験で使用されるタイプの）通常の清浄な石英ガラス表面は、非常に親水性である。 従って、核酸試料は、ガラス表面に置かれた場合には自然に広がりやすい。 再度ではあるが、これは望ましくない。 スプレッディングを軽減するために、
当業者は、例えば、表面を疎水性薬剤で前処理するか、または表面を単に脱水することのいずれかによって表面がより疎水性になるように処理することができる。 自然のことではあるが、このような選択肢はいずれも、ガラス表面のシラン修飾核酸に対する反応性を低下させる。

【００４８】 本実施例で議論される本発明の一群の実施形態において、当業者はこのジレンマから解放される。 より詳細に記載すると、本発明の別のタイプのシランを使用することによって、スプレッディングをなくすことができ、その上、修飾された核酸に対する表面の反応性を維持することができる。 例えば、加水分解後におけるこのようなシランの１つの極めて一般的な実施形態は、疎水性基で連結されたＳｉ（ＯＨ） ₃をそれぞれの端に含有する。 図６を参照のこと。 任意の様々な疎水性リンカーを使用することができる。 特に好ましい実施形態には、１，６−ビス−トリクロロシリルヘキサン、１，８−ビス−トリクロロシリルオクタン、１
，６−ビス−メトキシシリルヘキサン、および１，４−ビス−トリメトキシシリルエチルベンゼンが含まれる。 従って、本発明のこれらの実施形態により、シランの一方の端は表面に結合するが、もう一方の端は修飾された核酸に対する反応性を有したままである。 疎水性リンカーにより、疎水性が表面に付与される。 従って、当業者は、表面の静電特性（疎水性対親水性）を容易に調節させ得る方法を容易に理解することができる。 例えば、リンカーの鎖長を調節して疎水性を制御することができ、表面の反応性を、表面と接触するシランの量を調節することによって制御することができる。

【００４９】 本発明のこの側面に従って固体支持体を調節するために、ガラス表面を、ドラフト内で、約２時間、３Ｍ ＨＣｌ中でゆっくり煮沸することによって清浄化した。 次に、表面を脱イオン水でリンスし、次いで、使用できるまで０．１Ｍ Ｈ
Ｃｌ中で保管した。 使用できるようになった場合、表面を再蒸留脱イオン水でリンスし、存在する酸を除き、次いで無水エタノールでリンスした。 次に、表面を、直ちに、０．０００５％〜０．００２％の本発明のこの側面の二官能性シランを含有するエタノール溶液に移した。 次いで、表面を室温で約４８時間処理した。 次いで、表面をエタノールでリンスし、風乾した。 最後に、使用できるまで、
ガラス表面を無塵環境で保管した。

【００５０】 実施例６ アミン含有シラン化合物を使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の別の形態を記載する。 この一群の実施形態において、修飾された核酸は、未処理の核酸をアミン含有シランと反応することによって調製される。 実践的に、アミン含有シランによる核酸の誘導体化は２工程からなる：（１）核酸のハロゲン化（または、示されるように、臭素化）
（図５ａ、５ｂ）；および（２）ハロゲン化された核酸の誘導体化（図５ｃ）。
図５ａ、５ｂに示されているように、反応は、Ｎ−ブロモスクシンイミドの存在下、穏和なｐＨ条件下で進行し得る。 これらの反応変数のいずれかを変更することによって、当業者たる生化学者は反応速度を制御することができる。 また、図５ａ、５ｂによって明らかであるように、反応は、通常、ｐＨに依存してグアニン塩基またはシトシン塩基で生じる。 すなわち、中性からわずかに塩基性のｐＨ
はグアニン残基での反応に有利であり、より塩基性のｐＨはシトシン残基での反応に有利である。

【００５１】 少し異なる反応プロトコルが、好ましくは、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであるかに依存して使用される。 ＤＮＡの場合、５μｇのＤＮＡを１００μｌの０．１
ＭのＮａＨＣＯ ₃に溶解し、ｐＨを約９．５にした。 この溶液を氷上で約５分間保つ。 同時に、濃度が約１０ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド溶液を新しく調製し、これも氷上で冷却した。 次に、１μｌのＮ−ブロモスクシンイミド溶液をＤ
ＮＡ溶液に加える。 次いで、溶液を（渦が巻くまで）激しく攪拌した。 次いで、
反応を氷上で約１５分間進行させた。 次に、ｐＨが約９．５〜１２の０．５Ｍアミノシラン溶液の１０μｌを臭素活性化ＤＮＡ溶液に加えた。 この新しい混合物を６５℃で約２時間反応させた。 最後に、シランで修飾されたＤＮＡを、当該技術分野でよく知られている方法で精製した。 好ましくは、エタノール沈澱で精製される。

【００５２】 類似するが、少し異なるプロトコルを使用した。 ５μｇのＲＮＡを１００μｌ
の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、ｐＨを約７．５にした。 この溶液を氷上で約５分間保つ。 同時に、濃度が約１０ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド溶液を新しく調製し、これも氷上で冷却した。 次に、１μｌのＮ−ブロモスクシンイミド溶液をＤＮＡ溶液に加える。 次いで、溶液を（渦が巻くまで）激しく攪拌した。 次いで、反応を氷上で約１５分間進行させた。 次に、ｐＨが約８．０の１Ｍアミノシラン溶液の１０μｌを臭素活性化ＤＮＡ溶液に加えた。 この新しい混合物を４
５℃で約２時間反応させた。 最後に、シランで修飾されたＤＮＡを、当該技術分野でよく知られている方法で精製した。 好ましくは、エタノール沈澱で精製される。

【００５３】 これらの実施形態において、下記のシランがこのような理由で利用することができる：

【化４】

【化５】

【００５４】 当業者であれば、本発明の対象を実施し、言及されている目的および利点ならびにその固有的なそれらを得るために本発明を十分に適合させることを容易に理解するであろう。 化学的に修飾された核酸、その固体支持体への結合は、本明細書中に記載されている配列、方法、手順、アッセイ、分子、装置および特定の化合物とともに、現時点での好ましい実施形態を表し、例示であり、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではない。 本発明の精神に包含され、かつ請求項の範囲によって規定される、本発明における変化および他の使用が当業者には考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、核酸（この場合、ＤＮＡ）と３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランとのカップリング反応、その後の新しく修飾されたＤＮＡと固体支持体（この場合、ガラス表面）との反応を示す。 最終反応生成物、すなわち、固定化ＤＮＡを下段に示す。

【図２】 図２は、核酸（この場合、ＤＮＡ）と３−アミノプロピルトリエトキシシランとのカップリング反応、その後の新しく修飾されたＤＮＡと固体支持体（この場合、ガラス表面）との反応を示す。 最終反応生成物、すなわち、固定化ＤＮＡを下段に示す。

【図３】 図３は、高密度マイクロアレイを作製するための装置を示す。 上面図（図３Ａ
）および側面図（図３Ｂ）をともに示す。

【図４】 図４は、ハロゲン含有シラン化合物のアルキル化による核酸のシラン処理を示す。

【図５】 図５ａは、アミン含有シラン化合物を使用する核酸のシラン処理における最初の工程を示す。 この場合、反応は、中性ｐＨおよびわずかに塩基性ｐＨにおいてグアニン塩基で優先的に生じる。 図５ｂは、アミン含有シラン化合物を使用する核酸のシラン処理における最初の工程を示す。 この場合、反応は、より塩基性ｐＨにおいてシトシン塩基で優先的に生じる。 図５ｃは、アミン含有シラン化合物を使用する核酸のシラン処理における第２
で最終の工程を示す。

【図６】 図６は、本発明の１つの実施形態の概略図であり、疎水性リンカーによるシランリンカーを示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】

₁ 、Ｒ

₂およびＲ

₃は、−Ｈ、−ＣＨ

₃ 、−ＯＣＨ

₃および−ＯＣ

₂

Ｈ

₅からなる群より選択されるが、Ｒ

₁ 、Ｒ

₂またはＲ

₃の少なくとも１つは−

ＯＣＨ

₃または−ＯＣ

₂ Ｈ

₃のいずれかである） からなる群より選択される請求項１６の修飾された核酸。

【化２】

₃ 、−−Ｃ

₂ Ｈ

₅および−Ｃ

₃ Ｈ

₇からなる群より選択され； Ｒ

₁およびＲ

₂は同一または異なって、−Ｈ、−−ＣＨ

₃ 、−−Ｃ

₂ Ｈ

₅ 、−−

ＯＣＨ

₃ 、−−ＯＣ

₂ Ｈ

₅ 、−Ｃ

₃ Ｈ

₇および−ＯＣ

₃ Ｈ

₇からなる群より選択され；ならびに Ｘ連結基は、少なくとも部分的な脂肪族鎖を含む）を有する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された核酸。

【化３】

₁ 、Ｒ

₂およびＲ

₃は同一または異なって、−ＯＣＨ

₃ 、−ＯＣ

₂ Ｈ

₅ 、−ＯＣ

₃ Ｈ

₇および−Ｃｌからなる群より選択され； Ｘは、前記核酸を前記化合物に連結するために化学的に好適な部分である）を有する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された核酸。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA09 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 HA07 HA09 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR55 QR84 QS34 QX02 QX07 4C057 AA18 BB05 NN10