Carbohydrate skeleton compound and library

【発明の詳細な説明】 炭水化物骨格化合物及びライブラリー 発明の背景 本出願は、1997年５月29日出願の仮出願番号第60/047,946号に優先権を主張する。 発明の分野本発明は、そのライブラリーを含む炭水化物-ベースの「骨格」分子の構築に関する。 かかる化合物及びライブラリーは、治療に関連する重要な生体分子標的に結合し得る新規配位子をスクリーニングするのに使用することができる。 関連する技術生体標的上の特定の受容体に結合する配位子の種類が殆ど知られていないとき、また公知の薬作用発生団に同様に結合する新規化合物を識別するのが望ましいとき、一次スクリーニングライブラリー(primary screening library)は新種の薬剤の識別に有用である。 構造情報はライブラリーの基本設計に対して殆ど役に立たないため、一次スクリーニングライブラリーから活性化合物を識別する公算は、構築され且つスクリーニングされ得る化合物の数と関連する。 従って、一次スクリーニングライブラリーの設計計画は、所与の分子系に多くの構造的変型を作れなければならず、且つ多様な重要な構造を利用できなければならない。 「骨格(scaffold)」分子系は、一次スクリーニングライブラリーの構築に好都合なアプローチである。 骨格-ベースのライブラリーでは特定の分子系は鋳型(テンプレート)、即ち、骨格として利用され、その際ライブラリー化合物を画定するために種々の化学的または生物学的付加物が付けられる。 さらに炭水化物はコンフォメーション的に剛直性であり、高度に官能基化できるので、これらの分子は一次スクリーニングライブラリー構築用の理想の鋳型であり得るだろう。 一連の化合物の構築において炭水化物を使用する従来のアプローチは、オリゴ糖模擬物(mimetics)または単糖類ペプチド模擬物の構築に向けられていると便宜的に特徴付けられる。 最初のアプローチの例としては、例えば、オリゴ糖(例えば、三糖類)ライブラリー用のランダムグリコシル化方法がある[Kanie，O.ら.,( 1995)]。 ヌクレオチドまたはペプチド結合を介して炭水化物分子を結合させるオリゴ糖合成の種々の変形例[Nicolaou,K.ら.,(1995);Suhara,Y.ら.,(1996)]では、固相支持体上にオリゴ糖模擬物を構築できそうである[Mueller，C.,ら.,(1995 )，PCT国際公開第96/27379号]。 C-二糖類及びC-三糖類のライブラリーも記載されていた[Armstrong，R.ら.,(1994);Sutherlin，D.ら.,(1996)]。 炭水化物鋳型を使用する化合物の合成法へのアプローチでは、その上に種々の所望の配位子(官能基)が付いた骨格として単糖類幹(backbone)を利用する。 このアプローチは、ペプチド模擬物と一般的に参照される標的ペプチド類の構造類似物の研究でしばしば使用されている[Hirschmann，R.,ら.,(1996);Hirschmann，R .ら.,(1992);Hirschmann，R.ら.,(1993)参照]。 炭水化物分子のアノマー炭素原子にアリル基を結合させ、C-グリコシド結合体を構築させるこのようなアプローチの例は、PCT国際公開第96/36627号に記載されている。 炭水化物骨格を構築するこの試みのさらなる改良としては、いわゆる「ペプチド模擬物(peptidomimetics)」の構築用の基礎的要素として「糖アミノ酸」の使用がある[von Roedem，E.,ら.,(1996)]。 この後者のアプローチには、炭水化物環上のカルボン酸基に１つ以上のアミノ酸を結合させることが挙げられる。 アミノ酸は炭水化物環上のアミノ基にも結合される。 このアプローチは、念入りに作られ得る２個の官能基を保持する炭水化物骨格に限定されている。 ライブラリーが二糖類、三糖類及びアミノ酸の複合糖質を含む広範な非-ペプチジルアプローチは、PCT国際公開第95/03315号の主題である。 この分野に於ける最近の重大な進歩は、C-グリコシドグリコペプチドライブラリーの構築にUgi多成分縮合(multi-component condensation:MCC)反応を適用することであった[Ugi，I.,(1982)]。 これらの方法に従って、ネオマイシンBから誘導された二糖類C-グリコシドがC-グリコシドペプチド類のライブラリーを製造するのに使用されてきた[Park，W.ら.,(1996)]。 Ugi反応は、開裂時にアシルアミノアミド類を製造するために固相アミン樹脂上でも実施されてきた[Sutherlin ，D.ら.,(1996)]。 後者の反応では、C-グリコシル化アミノ酸類似体の形成時に単糖類アルデヒドを使用する。 しかしながら、この文献のライブラリー化合物はたった一つの位置で官能基化した糖類からなる。 組み合せ化学ライブラリーを構築するための多成分縮合法が再考されてきた[Armstrong,R.,ら.,(1996)]。 炭水化物鋳型をベースとする多様な化学構造の構築に関しては、単糖類単位の剛直幹由来の豊富な一連の官能基を表示するのが望ましい。 このようなアプローチは、化学構造の非常に多様化された三次元配列を与える多くの化合物を提供できなければならない。 実際、多くの関連化合物の構築に対する炭水化物-ベースのアプローチは、他の鋳型で利用可能なものよりもより多くの特徴的な多様性を可能にするだろう。 これらの化合物の構築での能率及び速度の理由から、少なくとも一部がオートメ化された方法により生成物を組み合わせて合成することができるのも望ましい。 この構想は、本明細書中、炭水化物-ベースの普遍的な薬作用発生団マッピングライブラリーの構築を導くものとして参照する。 発明の概要 本発明は、以下の構造：

（式中、NPは、アミノ、保護化アミノまたは固体支持体に結合したアミノを表し；pは、0または1であり；Ｘは、COOH、COOR

₁ 、CH

₃またはCH

₂ OR

₂であり；YはCH

₂ O R

₃ 、NHR

₄若しくはOR

₄であるか、YとOR

₆とは結合して6-員の環式アセタールを形成し；Zは、O、NHまたはＳであり；R

₁はアルキル、アリールまたはアラルキルであり；R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆は独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アラルカノイル、アロイルまたはヒドロキシル保護基であり；mは0または1であり；及びnは1または2であり；但し、YがNHR

₄であるとき、R

₄

は水素ではなく；ZがNHまたはSであるとき、R

₅は水素ではなく；nが1であるとき、mは0であり；pが1であるとき、XはCH

₂ OR

₂またはCH

₃ではなく、YはCH

₂ OR

₃ではなく；XがCH

₂ OR

₂またはCH

₃であるとき、YはCH

₂ OR

₃ではなく；XがCOOHであるとき、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆

のいずれもCOOHにより置換されず；XがCOOHでないとき、R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のちょうど一つがちょうど１個のCOOHにより置換され；R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の一つが水素であるとき、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の４つは水素ではなく、R

₁ 、 R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のいずれもがヒドロキシル置換基を保持せず；R

₁ 、R

₂ 、R

₃

、R

₄ 、R

₅及びR

₆の一つがヒドロキシル置換基を保持するとき、R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、 R

₅及びR

₆の５つはヒドロキシル置換基を保持せず、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のいずれもが水素ではなく；OR

₂ 、OR

₃ 、OR

₄ 、OR

₅及びOR

₆のいずれもがヒドロキシルまたは保護化ヒドロキシル基でないとき、R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の一つ以上はヒドロキシル置換基または保護化ヒドロキシル置換基を保持する)の化合物に関する。 本発明は、化合物のライブラリーにも関し、ライブラリー中の各化合物は、以下の構造： ｛式中、XはOまたはSであり；A

₁は、末端アミノを介して結合したα-アミノ酸の残基、2〜10個のα-アミノ酸由来の残基を含み、末端アミノを介して結合したペプチド残基、R

₁ O、R

₁ S、R

₁ 、R

₁ NHまたはR

₁ N-アルキルであり；A

₂は、末端カルボキシルを介して結合したα-アミノ酸残基、2〜10個のα-アミノ酸の残基を含み、末端カルボキシルを介して結合したペプチド残基、R

₂ SO

₂ 、R

₂ NHCO、R

₂ OP(O)(O R

₆ )、R

₂ P(O)(OR

₆ )またはR

₂であるか、A

₂ 、A

₃及びNは組合わさって窒素ヘテロ環を形成し；A

₃がA

₂及びNと組み合わないときA

₃は水素であり;A

₄はOR

₄ 、NHR

₄ 、CH

₂

OR

₄またはCH

₃であり；A

₅はO、NHまたはN-アルキルであり；p、q及びrは独立して０または１であり；Y

₁及びY

₂は独立してOまたはCH

₂であり；L

₁及びL

₂のそれぞれは独立して、二官能性アルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アロイルまたはアラルカノイル基であり；L

₃は単結合、CH

₂ 、カルボニル、OP(O)(OR

₇ ) 、NHP(O)(OR

₇ )、P(O)(OR

₇ )または ［式中、WはO、NH、N-アルキルまたはSであり；ZはNH、OまたはSである］であり；R

₁ 、R

₂及びR

₃は独立してアルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アロイル、アラルカノイル、複素環、複素環-アルキル、複素環-アルキル-カルボニルまたは複素環-カルボニルであり；R

₄ 、R

₅ 、R

₆及びR

₇は、独立して水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アロイル、アラルカノイル、複素環、複素環-アルキル、複素環-アルキル-カルボニルまたは複素環-カルボニルであり；mは0または1であり；nは1または2であり； 但し、nが1のとき、mは0であり；A

₅がNHまたはN-アルキルであるとき、L

₃はNHP( O)(OR

₇ )ではなく；L

₃が単結合、CH

₂またはカルボニルであり、rが0であり、A

₅がOであるとき、R

₃は8個未満の炭素原子を有するアリールでも８個未満の炭素原子を有するアラルキルでも、３個未満の炭素原子を有するアルキルでもなく；L

₃がカルボニルであり、rが0であり、A

₅がNHであるとき、R

₃は3個未満の炭素原子を有するアルキルではない}を有する。 さらに本発明は、(a)遊離カルボキシル基、遊離または保護化ヒドロキシル基及び保護化アミノ基を保持する単糖類を提供し；(b)任意の順で、(i)置換基A

₁を生成するために単糖類の遊離カルボキシル基を反応させ；(ii)置換基R

₃ L

₃ A

₅を形成するために前記遊離ヒドロキシル基と反応し得る化合物と単糖類の遊離ヒドロキシルとを反応させ；(iii)遊離アミノ基を提供するために保護化アミノ基を脱保護化し、置換基A

₂を生成するためにアミノ基と反応し得る化合物と遊離アミノ基とを反応させる、各段階を実施することを含む、化合物のライブラリーを製造する方法に関する。 発明の詳細な説明

定義 「アルキル」なる用語は、単結合または多重結合により接続した1〜20個の炭素原子を有する非環式または非芳香族環式基を指す。 アルキル基は、ハロ、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、COOH、アロイルオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルカノイルアミド、アルキルスルホニル、アロイル、CONH

₂ 、CONH-アルキルまたはCON(アルキル)

₂ 、COO-アラルキル、COO-アリールまたはCOO-アルキルの一つ以上により置換されていてもよい。 「アリール」なる用語は、単結合により接続されているか融合していてもよい1〜4個の環及び6〜20個の炭素原子を有する非-複素環式芳香族化合物から誘導された基を指す。 アリール基は、アルキル、アラルキル、複素環、ハロ、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アロイルオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルカノイルアミド、アルキルスルホニル、アロイル、COO-アルキル、COO-アラルキル、COO-アリール、CONH

₂ 、CONH-アルキルまたはCON(アルキル)

₂の一つ以上により置換されていてもよい。 「アラルキル」なる用語は、アリール基により置換されているアルキル基を指す。 「複素環」なる用語は、単結合により接続されているか融合していてもよい1〜4個の環を有する複素環式化合物から誘導された基を指し；前記化合物は、炭素、窒素、酸素、硫黄またはリンであってもよい3〜2 0個の環原子を有する。 複素環式基は、アルキル、アリール、アラルキル、ハロ、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、 アリールオキシ、アラルキルオキシ、アロイルオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルカノイルアミド、アルキルスルホニル、アロイル、COO-アルキル、COO-アラルキル、COO- アリール、CONH

₂ 、CONH-アルキルまたはCON(アルキル)

₂の一つ以上により置換されていてもよい。 「アルコキシ」、「アリールオキシ」及び「アラルキルオキシ」 なる用語は、アルキル、アリールまたはアラルキル基にそれぞれ酸素原子を結合させて誘導される基を指す。 「アルカノイル」、「アロイル」及び「アラルカノイル(aralkanoyl)」なる用語は、アルキル、アリールまたはアラルキル基にそれぞれカルボニルを結合させて誘導される基を指す。 「保護化ヒドロキシル」なる用語は、例えば、均質触媒還元または水素化物還元などの非-酸性条件または非-塩基性条件下で容易に除去して遊離ヒドロキシルを生成し得る基を指す。 還元により除去可能な保護基の例としては、アリルオキシカルボニル(alloc)、アリル及びトリクロロエチルオキシカルボニル(troc)がある。 普遍的な薬作用発生団マッピングライブラリーを製造するための炭水化物の潜在性を調査するために、薬作用発生団のキラル分子評価に必要な最小要件を提供するには、それぞれの骨格に３つの多様化部位が望ましい。 望ましい３つの特色は、カルボン酸部分、遊離または保護化ヒドロキシル基及びアミノまたは保護化アミノ基を含む骨格設計により得られる。 この官能基の三つ組(triad)は、固相合成段階の数を最小化しながら、迅速な組み合わせ合成に必要な化学選択性(che moselectivity)をもたらし分子の多様性を最大化する。 本発明の単糖類骨格化合物は、以下の構造： [NPは、アミノ、保護化アミノまたは固体支持体に結合したアミノを表し；pは、 0または1であり；Xは、COOH、COOR

₁ 、CH

₃またはCH

₂ OR

₂であり；YはCH

₂ OR

₃ 、NHR

₄

若しくはOR

₄であるか、YとOR

₆とは結合して6-員の環式アセタールを形成し；Zは、O、NHまたはSであり；R

₁はアルキル、アリールまたはアラルキルであり；R

₂ 、 R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆は独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アラルカノイル、アロイルまたはヒドロキシル保護基であり；mは0または1であり；及びnは1または2であり； 但し、YがNHR

₄であるとき、R

₄は水素ではなく；ZがNHまたはSであるとき、R

₅は水素ではなく；nが１であるとき、mは0であり；pが1であるとき、XはCH

₂ OR

₂またはCH

₃ではなく、YはCH

₂ OR

₃ではなく；XがCH

₂ OR

₂またはCH

₃であるとき、YはCH

₂ OR

₃ではなく；XがCOOHであるとき、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のいずれもCOOHにより置換されず；XがCOOHでないとき、R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のちょうど一つがちょうど１個のCOOHにより置換され；R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の一つが水素であるとき、 R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の４つは水素ではなく、R

₁ 、 R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のいずれもがヒドロキシル置換基を保持せず；R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の一つがヒドロキシル置換基を保持するとき、R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、 R

₅及びR

₆の５つはヒドロキシル置換基を保持せず、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆のいずれもが水素ではなく；OR

₂ 、OR

₃ 、OR

₄ 、OR

₅及びOR

₆のいずれもがヒドロキシルまたは保護化ヒドロキシル基でないとき、R

₁ 、R

₂ 、R

₃ 、R

₄ 、R

₅及びR

₆の一つ以上はヒドロキシル置換基または保護化ヒドロキシル置換基を保持する]を有する。 従って、単糖類骨格化合物は、環に１個の炭素原子を有し、１個の遊離または保護化ヒドロキシル基、１個の遊離カルボン酸基及び１個のアミノまたは保護化アミノ基を保持する5-または6-員環である。 アミノまたは保護化アミノ基は、単糖類環炭素に直接結合してもよいし、CH

₂置換基を介して結合してもよい。 ヒドロキシルまたは保護化ヒドロキシル及びカルボン酸基は、単糖類環炭素または環に結合した任意の置換基に結合してもよい。 骨格化合物は遊離ヒドロキシル基と１つ以上の保護化ヒドロキシル基をいずれも有し得るが、1個以下の遊離ヒドロキシル基を有する。 好ましくは骨格化合物は、6-員環を有し、即ち、nは2であり、アミノ基は保護されている。 m=n-1、即ち、骨格化合物が6-員環を有するときにR

₅ Oが存在するのがさらに好ましい。 アミノ基の好適な保護基は、酸若しくは塩基による処理、触媒作用による還元、または光に暴露することにより容易に除去されるものである。 好適な保護化アミノ基としてはアジド基が挙げられる。 好ましい保護基は、例えば、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフルオロアセトアミド、フタルイミド、テトラクロロフタルイミド及びアリルオキシカルボニルを含む塩基-不安定性保護基である。 最も好ましい保護基はFmocである。 単糖類骨格化合物は、アミノ及びカルボキシル基を保持する市販の単糖類から製造することができる。 例えば、市販の原料源から直ちに得られる好適な前駆体は、グルコサミン、マンノサミン及びガラクトサミンの2-アミノ、5-カルボン酸誘導体である。 これらの特定の位置異性体(regioisomer)のN-Fmoc-ブロック化誘導体としては、以下に示したものがある。 本発明の組み合わせライブラリーの多様性は、上記単糖類骨格をアミノ酸に結合させることにより得られる骨格化合物を考察することにより示される。 かくして、単一ヘキソース骨格(例えば、グルコース)がその2-及び6-炭素原子位置のそれぞれで単一天然α-アミノ酸(20種類の可能性)に結合しているときは何時でも、400種類の化合物のライブラリーが得られる。 上記ヘキソースの３つ全てを骨格鋳型として使用するときは何時でも、1200種類の化合物のライブラリーが可能である。 さらに、軸及び赤道位置のいずれもが利用可能であるため、単糖類のアノマ−C-1位置における立体化学によりライブラリーの構築でさらに変形することができる。 かくして、糖の6-位置が酸化してカルボキシルになり、2-位置がアミノ基により占められている、グルコース、マンノース及びガラクトース並びに20種類の天然アミノ酸から構築されたジペプチジルライブラリーに関しては、24 00種類の化合物のライブラリーが可能である。 天然アミノ酸及び単糖類から構築した上記ライブラリーに加えて、非-天然の位置異性体も構築することができる。 例えば、アミノ基がヘキソース環の2-位置に提供されるときは何時でも、単一カルボキシル基が1、3または4位置に提供され得る。 従って、上記した2400種類の骨格生成物に加えて7200種類の化合物が可能である。 同様に、アミノ基がヘキソース環のC-1位置に配置され、カルボキシル基が環の任意の残りの４つの位置に配置されているときは何時でも、9600種類の化合物が可能である。 アミノ基が環のC-3、C-4またはC-6位置に配置され、カルボキシル基が環の非占有部位に配置されているときは何時でも、同数の化合物が得られる。 全部で48,000(5×9,600)種類のジアミノ酸ヘキソース骨格生成物が、アミン基及びカルボキシル基と個別に多様化させたヘキソースから得ることができる。 本明細書中に記載したように、糖類の環に結合し得る他の官能基を考慮すると、本発明のライブラリーによって無限の化合物の可能性が網羅される。 グルコース鋳型上の幾つかの位置異性体だけを示すN-ブロック化アミノグルクロン酸骨格分子の幾つかの例を以下に示す。 内在アミノ官能基はすぐに理解できるだろう。 反応性カルボキシル基はヘキソース環に直接、または環のヒドロキシル基にリンカー、例えば、酢酸基または二官能性酸(例えば、蓚酸またはp-安息香酸)を介して結合することができる。 これらの骨格を合成するのに使用することができる反応については、既に記載した[例えば、

Synthesis ，12:1095(1991);

JACS ，107:7788(1985);

JACS ，107:7762(1985);J

．

Chem．

Soc.，Chem．

Comm. ，24 25(1995)参照]。 先の議論は、天然α-アミノ酸で骨格分子を官能基化することが中心であった。 しかしながら、非-天然または改質アミノ酸を天然α-アミノ酸の代わりに使用することができる。 さらに、骨格上の配位子は、N-誘導化ウレアまたはUgi多成分縮合(MCC)反応の生成物であり得る。 アミン、アルデヒド、カルボン酸及びイソシアニドの反応を含むUgi縮合を使用して単糖類骨格化合物に配位子を結合させることがでできる。 例えば、反応のアミン成分は固体支持体に結合したアミンにより提供することができ、単糖類はカルボン酸基を保持することができる。 或いは、単糖類はアミン基を保持することができ、カルボン酸基は別の分子によって提供することができる。 どちらの場合に於いても、Ugi縮合生成物は、糖に結合したα-アシルアミノアミドである。 本発明の最も好ましい態様において、単糖類骨格は、以下に示される構造

1及 び

2のいずれかである。 骨格

1及び

2の合成をスキーム１及び２に概説する。 スキーム1に示されているように、骨格

1は８段階でD-グルコサミン塩酸塩

3から製造した。 炭酸ナトリウム水溶液中の

3とベンジルクロロホーメートとの反応により、所望のベンジルオキシカルボニル(Cbz)保護化グルコサミンが得られ、これをHCl/ジオキサン-MeOHで処理するとα-メチルグルコシド

4が得られた。 イソプロピリデンケタールとしてのC-4-及びC-6ヒドロキシルの保護、続いてC-3-ヒドロキシルでのメチル化により中間体

5が得られた。 p-トルエンスルホン酸(TsOH)によるケタールの除去、続いて第１級アルコールの選択的TEMPO酸化により、グルクロン酸

6が得られた。 Cb z保護基を除去し、塩基不安定性Fmoc基で置換すると、目的の骨格

1が得られた。 アミノ保護基における変化は、固相化学と適合させるのに必要であった。

1の製造の詳細については実施例１に示す。

スキーム１ 骨格

2は、スキーム２に示すように７段階で市販のβ-メチル-D-グルコシド

7から製造した。 過剰の過ヨウ素酸ナトリウムと

7との反応及び得られたジアルデヒドとニトロメタンとの縮合により、3-ニトロ糖

8が得られた。 ベンジリデンアセタールの形成、続いてC-2ヒドロキシルでのアシル化により、中間体

9が得られた。 ニトロ基の還元とベンジリデンの除去を同時に行い、続いてアミノ基保護を実施すると、Fmoc-アミノジオール

10が得られた。 C-6ヒドロキシル基の選択的酸化によりグルクロン酸骨格

2が得られた。 この製造の詳細については実施例２に示す。

スキーム２ 骨格化合物を３つの反応性部位、即ち、ヒドロキシル、カルボン酸及びアミノまたは保護化アミノ基で官能基化し、化合物のライブラリーを製造した。 ライブラリーの各化合物は、構造： {式中、XはOまたはSであり；A

₁は、末端アミノを介して結合したα-アミノ酸の残基、2〜10個のα-アミノ酸由来の残基を含み、末端アミノを介して結合したペプチド残基、R

₁ O、R

₁ S、R

₁ 、R

₁ NHまたはR

₁ N-アルキルであり；A

₂は、末端カルボキシルを介して結合したα-アミノ酸残基、2〜10個のα-アミノ酸の残基を含み、末端カルボキシルを介して結合したペプチド残基、R

₂ SO

₂ 、R

₂ NHCO 、R

₂ OP(O)(OR

₆ )、R

₂ P(O)(OR

₆ )またはR

₂であるか、A

₂ 、A

₃及びNは組合わさって窒素ヘテロ環を形成し；A

₃がA

₂及びNと組み合わないときA

₃は水素であり；A

₄はOR

₄

、NHR

₄ 、CH

₂ OR

₄またはCH

₃であり；A

₅はO、NHまたはN-アルキルであり；p、q及びrは独立して0または1であり；Y

₁及びY

₂は独立してOまたはCH

₂であり；L

₁及びL

₂

のそれぞれは独立して、二官能性アルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アロイルまたはアラルカノイル基であり；L

₃は単結合、CH

₂ 、カルボニル、O P(O)(OR

₇ )、NHP(O)(OR

₇ )、P(O)(OR

₇ )または ［式中、WはO、NH、N-アルキルまたはSであり；ZはNH、OまたはSである］であり；R

₁ 、R

₂及びR

₃は独立してアルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アロイル、アラルカノイル、複素環、複素環-アルキル、複素環-アルキル-カルボニルまたは複素環-カルボニルであり；R

₄ 、R

₅ 、R

₆及びR

₇は、独立して水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルカノイル、アロイル、アラルカノイル、複素環、複素環-アルキル、複素環-アルキル-カルボニルまたは複素環-カルボニルであり；mは0または1であり；nは1または2であり； 但し、nが1のとき、mは0であり；A

₅がNHまたはN-アルキルであるとき、L

₃はNHP( O)(OR

₇ )ではなく；L

₃が単結合、CH

₂またはカルボニルであり、rが0であり、A

₅がOであるとき、R

₃は8個未満の炭素原子を有するアリールでも8個未満の炭素原子を有するアラルキルでも、3個未満の炭素原子を有するアルキルでもなく；L

₃がカルボニルであり、rが0であり、A

₅がNHであるとき、R

₃は3個末満の炭素原子を有するアルキルではない}を有する。 存在する場合には、ライブラリー化合物の二官能性基Y

₁ L

₁及びL

₂ Y

₂は、骨格化合物から誘導してもよく、その場合、カルボン酸またはヒドロキシル基はそれぞれ単糖類環炭素に直接結合せず、単糖類環炭素に結合した基Y

₁ L

₁またはL

₂ Y

₂上で置換されている。 基Y

₁ L

₁は二官能性分子(例えば、ジカルボン酸)の反応から誘導してもよく、その場合、Y

₁はOであり、L

₁は二官能性アルカノイルであり、二官能性アルカノイルのカルボニル炭素はY

₁に結合し、他方はCOA

₁基に接続し、ヒドロキシル基は単糖類環原子上で直接置換されている。 基R

₃ L

₃ A

₅は骨格分子のヒドロキシル基の反応から誘導する。 ヒドロキシルが求核性試薬として反応して脱離基を置換するか、イソシアネートなどの不飽和化合物に添加するとき、A

₅は酸素である。 或いは、ヒドロキシルがアミノ基により置換されたとき、A

₅はNHまたはN-アルキルである。 好適なアミノ酸は上記天然または非天然アミノ酸である。 天然アミノ酸は市販されている。 幾つかの非天然アミノ酸も市販されているが、市販の出発物質から、好ましくはエナンチオマー過剰(enantiomeric excess)で製造するのが望ましい。 非天然アミノ酸への一般的なアプローチはについては最近報告があった[Pet asis,N.ら.,

JACS ，119:445(1997)]。 天然、非天然及び改質アミノ酸は、カルボジイミドまたは酸無水物の存在下で、アミン-置換糖類にそのC-末端を介して結合することができる。 或いは、これらは同様にカルボキシル-置換糖類にそのN- 末端を介して結合することができる。 単糖類骨格分子に対するエステル結合は、固体支持体に結合した配位子分子により提供されるようなアルコールと単糖類骨格上のカルボン酸基とを反応させることにより、直接形成される。 或いは、エステル結合は、標準的なエステル化条件下、カルボン酸配位子と単糖類骨格の遊離ヒドロキシルとを反応させることによって形成することができる。 エステル結合は、酸無水物またはアシルハライドと単糖類骨格とを反応させることによっても形成することができる。 エステルは、一段合成でアルデヒド及びイソニトリルとカルボン酸との反応を引き起こすMC C反応(例えば、Passerini反応)によっても製造することができる。 カルボン酸成分は単糖類により好都合に提供される。 単糖類骨格上のアミノ基とカルボン酸基を保持する化合物との間のアミド結合、または単糖類骨格上のカルボン酸基とアミノ基を保持する化合物との間のアミド結合は、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)または無水物の存在下で、カルボン酸基とアミノ基とを反応させることにより都合良く形成される。 第２級アミノ結合は、還元性アルキル化条件下で、アルデヒドまたはケトンと単糖類骨格上のアミノ基とを反応させることにより形成することができる。 好ましいアルデヒドとしては、n-ブチルアルデヒド及び置換アルキル化合物、例えば、 3-メチルチオプロピオンアルデヒド；脂環式アルデヒド類、例えば、シクロヘキサンカルボキサルデヒド(cyclohexanecarboxaldehyde)；アリールアルデヒド類、例えば、ベンズアルデヒド、4-ニトロベンズアルデヒド及びピリジン-2-カルボキサルデヒド；ヘテロ原子-置換脂環式アルデヒド類、例えば、N-ホルミルモルホリン；及びアルカリールアルデヒド類、例えば、2-フェニルプロピオンアルデヒドがある。 スルホンアミド結合は、ハロゲン化スルホニル(例えば、塩化スルホニル)とアミンとを反応させることにより形成することができる。 置換及び非置換アリールスルホニルクロリド類、例えば、1-ナフタレンスルホニルクロリド、4-ブロモベンゼンスルホニルクロリド、p-トルエンスルホニルクロリド及びN-アセチルスルファニリルクロリドが特に好ましい。 多くのアルコール反応は、単糖類の遊離ヒドロキシルと所望の有機成分とを接続させるのに有用である。 例えば、アルキルエステル結合は、糖分子上の遊離ヒドロキシル基をアルキル化することにより、例えば、塩基の存在下で糖とハロゲン化アルキルとを反応させることにより形成する。 アリールエステルは、Mistun obu反応条件下で、遊離ヒドロキシル基を保持する単糖類と所望のフェノールとを反応させることにより形成することができる[Mitsunobu，O.,ら.，

JACS 、94:6 79(1972)]。 カルバメート結合は、糖の遊離ヒドロキシル基とイソシアネートとを反応させることにより形成する。 同様に、ウレア結合は、糖の遊離アミノ基とイソシアネートとを反応させることにより形成する。 カーボネート結合は、塩基の存在下、ハロホーメートのエステル(例えば、クロロホーメートエステル)と単糖類の遊離ヒドロキシルとを反応させることにより形成することができる。 単糖類に対するホスホネートまたはホスフェート結合は、これをホスホン酸エステルまたはホスホルアミジテ(phosphoramidite)と反応させ、続いて酸化してホスホネートまたはホスフェートを得ることができる[例えば、Campbell，D.,ら.,

JACS ，117，5381-5382(1995);Hebert，N.,ら.，

Tett.Lett. ，35:9509-9512(19 94);Beaucage，S.,ら.，

Tett

．

Lett. ，22:1859-1862(1981)参照]。 ホスホルアミジテ試薬の例としては、クロロ-メトキシ-N,N-ジイソプロピルホスホルアミジテまたはクロロ-シアノエトキシ-N,N-ジイソプロピルホスホルアミジテが挙げられる。 ライブラリー化合物は、A

₁がα-アミノ酸の残基または2〜10個のα-アミノ酸の残基を含むペプチド残基であるヘキソース類が好ましい。 rは0、A

₅はO、L

₃

はイソシアネートから誘導したカルバモイル基であるのが好ましい。 qが0であり、A

₂はR

₂であるのがさらに好ましい。 本発明はまた、前記化合物のライブラリーを調製する方法に関する。 本方法は下記の工程を含む： （ａ）遊離カルボキシル基、遊離または保護されたヒドロキシル基および保護されたアミノ基を保有する単糖類を用意し； （ｂ）下記の工程を任意の順序で実施する： （ｉ）単糖類の遊離カルボキシル基を反応させて置換基Ａ

₁を生成させる工程； （ｉｉ）単糖類の遊離ヒドロキシル基を、その遊離ヒドロキシル基と反応して置換基Ｒ

₃ Ｌ

₃ Ａ

₅を形成しうる化合物と反応させる工程； （ｉｉｉ）保護されたアミノ基を脱保護して遊離アミノ基を生成させ、そしてこの遊離アミノ基を、アミノ基と反応して置換基Ａ

₂を形成しうる化合物と反応させる工程。 ヒドロキシル基が保護されている場合、置換基Ｒ

₃ Ｌ

₃ Ａ

₅を形成する反応の直前にその保護基を除去する。 本発明の１態様において、Ａ

₅はＯであり、遊離ヒドロキシル基は化合物Ｒ

₃ Ｍ と反応して置換基Ｒ

₃ Ｌ

₃ Ｏを形成する；ここでＭはＮ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−アルキル、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ

₇ ）Ｇ、ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＲ

₇ ）Ｇ、Ｐ（ Ｏ）（ＯＲ

₇ ）Ｇ、ＯＣＯＧ、ＳＣＯＧ、ＣＯＧ、ＧまたはＣＨ

₂ Ｇであり、Ｇは脱離基である。 脱離基Ｇは、遊離ヒドロキシル基で容易に置換できる任意の基である。 適切な脱離基には、ハロ、アリールスルホニルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、アルカノイルオキシ、アロイルオキシ、ヒドロキシ、アルコキシおよびアリールオキシが含まれるが、これらに限定されない。 好ましくは、Ｒ

₃ ＭはイソシアナートＲ

₃ ＮＣＯであり、これは遊離ヒドロキシル基と反応してカルバメートＬ

₃ Ｏ（ ＷはＯ、ＺはＮＨである）を形成する。 本発明の他の態様において、Ａ

₅はＮＨまたはＮ−アルキルであり、骨格（ｓ ｃａｆｆｏｌｄ）分子のヒドロキシル基は、脱離基（たとえばトシラート、トリフラート、メシラートまたはハライド）に変換することにより、または活性化剤（たとえばミトノブ（Ｍｉｔｓｏｎｏｂｕ）試薬ＰＰｈ

₃ −ＣＣｌ

₄ ）により活性化され、続いてこの活性ヒドロキシルは求核性の第一級または第二級アミンで置換される。 本発明の好ましい態様においては、工程（ｉ）が最初に実施され、続いて工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）がこの順序で実施される。 骨格は支持体上の末端アミノ基を有する基を介してポリマー支持体に結合していること、およびこのポリマー支持体は本方法に用いる溶媒に不溶性の固体支持体であることも好ましい。 他のポリマー支持体には、それらをある種の溶媒に可溶性にする組成および分子量をもつポリマーが含まれる。 これにより反応を溶液中で実施し、その後、結合生成物を沈殿させることができる。 そのようなポリマー支持体の一例は、市販のポリエチレングリコールである。 好ましくは、単糖類のカルボキシル基は末端アミノ基をもつ遊離基またはポリマーに結合した基と反応する。 より好ましくは、カルボキシル基はアミノ酸またはペプチドの末端アミノ基と反応して、アミド結合ＣＯＡ

₁を形成する。 アミノ酸またはペプチドがその末端カルボキシル基を介してポリマー支持体に結合し、 かつその末端アミノ基を介して骨格分子上のカルボキシル基と反応してアミド結合ＣＯＡ

₁を形成するのが、最も好ましい。 あるいは骨格は、骨格上のアミノ基と支持体上の反応性基（たとえばカルボン酸、無水カルボン酸、イソシアナート、アルデヒドまたはハロゲン化スルホニル）との反応によりポリマー支持体に結合してもよい。 好ましくは、単糖類の保護されたアミノ基を脱保護し、次いでカルボン酸と反応させてアミド結合Ａ

₂ Ｎを形成する。 ここでＡ

₂はＲ

₂ 、すなわちアルカノイル、アロイル、アラルカノイル、複素環−アルキル−カルボニル、または複素環− カルボニルである。 本発明に用いるのに適した固体支持体には、大部分の合成ポリマー樹脂（好ましくはシート、ビーズの形のもの）、たとえばポリスチレン、ポリオレフィン、 ポリメタクリル酸メチルなどの樹脂、その誘導体およびそのコポリマーが含まれる。 種々の程度の架橋を含むポリマーも有用である。 好ましい固体支持体は、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、すなわちポリスチレンの１％ジビニルベンゼンコポリマー、またはテンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ、商標）、すなわちポリエチレングリコールグラフトしたポリスチレン樹脂（ノバビオケムから入手、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）である。 一般に、適切なポリマー支持体は大部分の有機溶媒に不溶性であるが、ある程度は膨潤性である。 さらに他の固体支持体は、ガラス、セラミックまたは金属性物質およびそれらの表面からなっていてもよい。 いかなる固体支持体も、選択した分子残基が固体支持体の表面に結合または固着しうるように、本反応に関与しうる官能基を含むことが重要である。 そのような官能基は一般に、ハライド、不飽和基、カルボン酸、ヒドロキシル、アミン、エステル、チオール、シリルオキシ、アザ、オキソなどを伴う。 固相上で合成されたライブラリー化合物の結合およびその後の放出を容易にするために、結合基（ｌｉｎｋｅｒ）を使用できる。 そのような結合基は当技術分野で周知であり、ポリアミノ、ポリカルボン酸、ポリエステル、ポリハロ、ポリヒドロキシ、ポリ不飽和基、またはその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。 結合基は、ライブラリーに結合した化合物またはそれらの製造もしくは操作に際し用いる試薬に有害な影響を与えない特定の条件下で、不安定（ｌａｂ ｉｌｅ）であることが好ましい。 より好ましくは、結合基は酸不安定であるか、 または光不安定である。 望ましい結合基には、ハロトリチル部分、骨格分子を固体支持体に結合させるアミン連結ポリスチレン、リンク（Ｒｉｎｋ）（ノバビオケム）、またはα−ハロ、α−メチルフェナシル部分が含まれる。 結合基は、骨格分子を固体支持体に共有結合させるために使用できる。 一般に共有結合は、アミン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アセトアミド、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、スルホナートまたはスルフェート結合を介してもよい。 注文生産による樹脂結合基、たとえばアミノ酸を支持する結合基を、ノバビオケムから入手できる。 本発明方法の他の態様においては、“セイフティー・キャッチ（ｓａｆｅｔｙ −ｃａｔｃｈ）”結合基を用いてライブラリー化合物を製造できる。 このタイプの結合基を用いて骨格を樹脂に結合させることができるが、加水分解により除去される従来の結合基と異なり、この結合基は求核試薬で置換することにより除去される。 この求核試薬はライブラリー化合物上の３つの官能基の１つの一部になり、ライブラリーの官能基をより多様化できる。 セイフティー・キャッチ結合基の使用および調製は、Backes and Ellman,J.Am.Chem.Soc.,1994,Vol.116,p.1117 1;およびBackes et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,Vol.118,p.3055に記載されている。 たとえば、セイフティー・キャッチ結合基を介して固体支持体に結合したアミノ酸またはペプチドに、遊離カルボン酸基を介して骨格を結合させる場合、このアミノ酸またはペプチド置換基をさらに官能化するために、結合基をアミンまたはチオール化合物で置換し、これにより最終置換基Ａ

₁を生成させることができる。 セイフティー・キャッチ結合基を保有する樹脂を用いてライブラリーを調製する方法を実施例７に示す。 あるいは、骨格がカルボン酸および結合基を介して支持体に直接結合している場合、結合基をアミンまたはチオール化合物で置換すると、これがＡ

₁置換基になる。 本発明のライブラリー化合物は、自動化ロボット法でアレイ化パラレル合成(a rrayed parallel synthesis)により製造するのが好ましい。 たとえばテカン（Te can、商標、スイス）ジェネシス(Genesis)液体操作システム、テカン樹脂ディスペンサー、およびサバント(Savant)遠心蒸発器を使用できる。 あるいは、IRORI AccuTag（登録商標）−１００高周波タグ付き固相合成システムを用いて、ディレクティッドソーティング(directed sorting)を伴う混合およびスプリット方式で化合物を製造できる。 IRORI AccuTag-100システムの使用が好ましい。 骨格生成物は一般に精製せずに使用され、その調製物中の生成物の量は液体クロマトグラフィーおよび質量分析などの標準法で定量される。 生成物の定量分析は、母プレートから娘マルチウェルプレートを調製し、それらの娘プレートのうちの１つを分析試験用にすることにより行うのが好都合である。 スクリーニング試験に適した閾値は、骨格生成物の純度＞８５％である。 ただし試料純度を高めるために望ましいならば、各種の精製技術を採用できる。 数例を挙げれば、これらの精製技術には、フラッシュクロマトグラフィー、溶液相“共有スカベンジャー(covalent scavenger)”方式、ポリマー支持クエンチング、および樹脂捕獲が含まれる。 本発明のライブラリーの化合物を、後記実施例８に記載する、当業者に周知のルーティン法で、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。 たとえばこれらの化合物をウイルス性、細菌性または真菌性因子に対する抗感染活性についてスクリーニングすることができる。 代表的ターゲットには、スタヒロコッカス属(Staphylococcus)およびストレプトコッカス属(Streptococcus)の菌株が含まれる。 本発明化合物の活性は、一般にターゲットの増殖を促進すると認められる条件下で、各化合物を生物学的ターゲットと接触させることによりスクリーニングできる。 次いで数時間または数日にわたって観察して、ターゲットの増殖が阻害されたか否かを判定する。 阻害のサインはその化合物がターゲットに対し正の活性をもつことを示す。 たとえば微生物の増殖速度が停滞するか、または低下したという所見は、その化合物が抗微生物活性をもつことを示す。 スクリーニングは、 微生物におけるペプチドグリカン合成を直接アッセイすることによっても実施できる。 本発明の最も好ましい態様においては、式３、４および５に例示し、それぞれ実施例３、４および５に詳述した固相化学を用いて、それぞれの骨格上の３つのコンビナトリアル部位に化学的多様性を導入する。 固相化学工程数を最小限にするために、予め結合した多様性要素(diversity element)を介して骨格を固体支持体に結合させたとき、第１の多様化工程が行われた。 その結果、各グリコカルボン酸は、アミノ酸官能化されたカルボキシトリチル−テンタゲル樹脂の遊離アミンに結合して、骨格官能化樹脂

１２および

１３を与えた。 式４および５においては、固体方式の効率を証明するために、イソシアン酸イソプロピル、２，４− ジメトキシ安息香酸、および４−ニトロ安息香酸を用いた。 遊離ヒドロキシル部位でのカルバメート形成に続いて、脱保護されたアミン部位でのアミド形成により、目的の樹脂結合した三官能化骨格が生成した。 骨格

２については、Ｃ−２のアセテート保護基を除去するために追加工程が必要であった。 生成物はすべて、 １０％ＴＦＡにより固体支持体から開裂された。 三官能化骨格

１５および

１８が、それぞれ１００％および７０％の収率で得られた。 ＬＣ／ＭＳ分析により、これらの生成物の純度は＞９０％であることが示された。 それぞれの骨格の脱保護されたアミン部位において、尿素形成、スルホンアミド形成および還元アルキル化が固相で効率的に起きる。

式３

式４

式５ 骨格

１および

２に基づくライブラリーは、ＩＲＯＲＩ ＡｃｃｕＴａｇ（登録商標）−１００高周波タグ付き固相合成システム、およびディレクティッドソーティング−スプリットープール法を用いて、個別の化合物類として製造された。 ライブラリーの構築ブロックを式６に記載し、ライブラリー合成の詳細を実施例６に示す。 骨格

１および

２をそれぞれ８種類のアミノ酸官能化トリチル−テンタゲル樹脂に結合させた。 次いでそれぞれの骨格−アミノ酸樹脂を用い、６種類のイソシアナートおよび８種類のカルボン酸との反応により、４８メンバーのサブライブラリーを調製した。 アミノ酸構築ブロックのうち数種類は、酸不安定保護基を含有していた。 これらの保護基を、固体支持体からの最終生成物の開裂と同時に除去した。 ４８メンバーのサブライブラリーが合計１６調製された。 ＬＣ／ ＭＳによりライブラリーを分析して、ライブラリー生成物の約９０％が＞８０％ の純度で得られたことが示された。

式６ 式６のライブラリーの構築ブロックは下記のものであった： ＡＡは下記のアミノ酸に由来する：Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ 、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ−Ｖａｌ； Ｒ

₁はイソシアナートＲ

₁ ＮＣＯに由来し、ここでＲ

₁はシクロヘキシル、３− アセチルフェニル、３−（トリフルオロメチル）フェニル、４−クロロ−３−（ トリフルオロメチル）フェニル、４−（トリフルオロメチルオキシ）フェニル、 ３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニルである； Ｒ

₂は酸Ｒ

₂ ＣＯ

₂ Ｈに由来し、ここでＲ

₂は３−（２−チエニル）プロピル、シクロヘキシル、メチル、３−テトラヒドロフリル、４−ビフェニリル、２，４− ジメトキシフェニル、３−ピリジルおよびフェニルである。 以下の実施例は本発明を説明するものであって、限定するものではない。

実施例

一般的手順他に述べない限り、反応は室温において行った。 固相合成を手動で行い、振とう又は磁気撹拌によって、反応を攪拌した。 確立された手順に従って、適当な乾燥剤からアルゴン下での蒸留によって溶媒を乾燥させた。 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）(低アミン含量)、２０％ピペリジン／ＤＭＦ及び［Ｏ−（７ −アザベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート］(ＨＡＴＵ)は、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅｓ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。 全ての樹脂はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａ ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した、全てのアミノ酸誘導体はＬ−アミノ酸であった。 実施例１：メチル ２−デオキシ−２−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシ−カルボニル）−３−Ｏ−メチルーα−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（１） （ａ）メチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（４） 水（５５０ｍｌ）中のＤ−グルコサミン塩酸塩３（１１１．２ｇ，０．５１６ モル）の溶液に、飽和炭酸ナトリウム水溶液（５５０ｍｌ）を加えた。 得られた溶液を４℃に冷却して、ベンジルクロロホルメート（８０．０ｇ，０．４６９モル）を滴加した。 この反応混合物を４℃において３時間撹拌した。 反応混合物を室温に温度上昇させて、水（５００ｍｌ）を加えた。 固体生成物を濾過によって単離して、水(２ｘ５００ｍｌ)、メタノール（５００ｍｌ）及びジエチルエーテル（２ｘ５００ｍｌ）によって連続的に洗浄した。 乾燥後に、粗生成物（９７． ５ｇ，０．３１１モル、６６％収率）を次の工程にさらに精製せずに用いた。 無水メタノール（３．９リットル）中の上記粗生成物（７２．３ｇ，０．２３ １モル）の加熱した（６６℃）溶液に、ジオキサン中の塩化水素の溶液（４．０ Ｍ，２３１ｍｌ、０．９２５モル）を滴加した。 反応混合物を６０℃において１ ６時間攪拌した。 反応混合物を室温に冷却させ、飽和炭酸カリウム溶液（６０４ ｇ）を加えた。 生じた固体を濾過によって取り出した。 濾液を減圧下で蒸発させた。 生成物を再結晶によって水から単離した。 粗生成物（５６．９ｇ，０．１７ ４モル、７５％収率）を、さらに精製せずに、次の工程に用いた。 （ｂ）メチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−４，６−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコピラノシド（５） 無水ＤＭＦ（２５０ｍｌ）中のメチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− ２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド４（５５．８ｇ，０．１７０モル）の溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（１７７ｇ，１．７０モル）とｐ−トルエンスルホン酸（５．６ｇ，０．０６２モル）とを加えた。 反応混合物を室温において４時間攪拌した。 酢酸エチル（５００ｍｌ）と、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５０ｍｌ）と、水（５００ｍｌ）とを加えた。 有機層を分離し、水で洗浄し(４ｘ２５０ｍｌ)、乾燥し(Ｎａ

₂ ＳＯ

₄ )、濃縮した。 粗生成物（５０．５ｇ ，０．１３８モル，７５％収率）を、さらに精製することなく次の工程で用いた。 無水ＴＨＦ（１２６ｍｌ）中の上記製造メチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−デオキシ−４，６−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコピラノシド（１０．０ｇ，０．０２５２モル）の溶液に、水素化ナトリウム（０．７２ｇ， ０．０３モル）を加えた。 反応混合物を室温において２０分間攪拌し、ヨウ化メチル（１．６ｍｌ，０．０２５７モル）を加えた。 反応混合物を室温において１ 時間攪拌し、再びヨウ化メチル（０．８ｍｌ，０．０１２９モル）を加えた。 室温において３０分間撹拌後、さらなる０．５当量のＭｅＩを加え、１０分間撹拌した。 次に、酢酸エチル（２５０ｍｌ）と、水（１００ｍｌ）とを加え、有機層を飽和ブラインで洗浄し、乾燥し(Ｎａ

₂ ＳＯ

₄ )、濃縮した。 残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン ３：７〜４：６）によって精製し、 固体（８．０ｇ，０．０２１モル，７７％収率）を製造した。 （ｃ）メチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（６） メタノール（１００ｍｌ）中のメチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− ２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−４，６−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコピラノシド５（８．０ｇ，０．０２１モル）の溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸（ ０．４ｇ，０．００２１モル）を加えた。 反応混合物を室温において３時間攪拌し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−９００（塩基性）イオン交換樹脂（Ａｌｄｒ ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）１１．３ｍｌ を加えた。 樹脂を濾過によって取り出し、濾液を減圧下で濃縮した。 粗生成物（ ７．４７ｇ，定量的収率）を、さらに精製することなく次の工程に用いた。 ジクロロメタン（４５ｍｌ）中のメチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４．９３ｇ，０ ．０１４モル）とＴＥＭＰＯ（０．０２２６ｇ，０．１４ミリモル）との冷却した（０℃）溶液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２８．７ｍｌ）中の、臭化カリウム（０．０１７５ｇ，０．１４７ミリモル）と塩化テトラブチルアンモニウム（０．０１９５ｇ，０．０７ミリモル）とを加えた。 次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．６３４Ｍ，５７．５ｍｌ）と、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１ ６．４３ｍｌ）と、飽和ブライン（３０．８１ｍｌ）との溶液を３０分間滴加した。 水（１６０ｍｌ）とジクロロメタン（７５ｍｌ）とを加え、水層を分離し、 ２ＭＨＣｌで酸性化した。 水溶液を酢酸エチル（３ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。 一緒にした有機層を乾燥させ(Ｎａ

₂ ＳＯ

₄ )、減圧下で濃縮した。 粗生成物（４ｇ ，０．０１０６モル，７８％収率）を、さらに精製することなく次の工程で用いた。 （ｄ）メチル ２−デオキシ−２−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシ−カルボニル）−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（１） エタノール（５０ｍｌ）中のメチル−２−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２ −デオキシ−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸６（０．５２ ｇ，１．４６ミリモル）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％Ｐｄ，０．５０ｇ）を加えた。 反応混合物をＰａｒｒ水素化装置において４０ｐｓｉｇで２４時間振とうした。 ０．２μｍ膜フィルターに通しての濾過によって、Ｐｄ触媒を除去した。 濾液を減圧下で濃縮した。 粗生成物（０．２８ｇ，１．２７ミリモル、８７％収率）を次の工程にさらに精製せずに用いた。 ５０％ジオキサン水溶液（１２ｍｌ）中のメチル−２−アミノ−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（０．２８ｇ，１．２７ ミリモル）と炭酸水素ナトリウム（０．２１ｇ，２．５０ミリモル）とジイソプロピルエチルアミン（０．３３ｇ，２．５６ミリモル）との溶液に，９−フルオレニルメチルクロロホルメート（０．３３ｇ，１．２８ミリモル）を加えた。 ジオキサンを加えて，溶解を完成させた。 反応混合物を室温において１時間撹拌して、２Ｍ ＨＣｌによって酸性化した。 酢酸エチル（５０ｍｌ）を加えて、有機層を乾燥させ(Ｎａ

₂ ＳＯ

₄ )、減圧下で濃縮した。 生成物（０．５３ｇ，１．２０ ミリモル）が９４％収率で得られた。 実施例２：２−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−３−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ−１−β−Ｏ−メチル−グルクロン酸（２） （ａ）３−デオキシ−３−ニトロ−１−β−Ｏ−メチル−グルコピラノシド（８ ） 水（２６０ｍｌ）中の過ヨウ素酸ナトリウム（２２．０３ｇ，１０３ミリモル）の撹拌溶液に、０℃において、β−メチルグルコピラノシド７（１０ｇ，５１ ．５ミリモル）を数回に分けて１０分間にわたって加えた。 氷浴を除去し、得られた溶液を室温において３時間攪拌した。 エタノール（３５０ｍｌ）を加えて、 混合物をその量の２５％に真空下で濃縮した。 さらにエタノールを加えて、ヨウ酸ナトリウムを沈殿させて、これを濾過によって除去した。 濾液の回転蒸発はヨウ酸ナトリウムをさらに沈殿させて、これを濾過によって除去した。 もはやヨウ酸ナトリウムが沈殿しなくなるまで、この処置を続けた。 次に、得られたアルデヒドをメタノール（５０ｍｌ）中に溶解して、濃縮し(２ｘ)、高真空下で乾燥させ、さらに精製せずに用いた。 無水メタノール（７５ｍｌ）中のジアルデヒドの溶液に、ニトロメタン（２． ８２ｍｌ，５２．５ミリモル）を加えて、混合物を０℃に冷却した。 無水メタノール（９Ｏｍｌ）中のナトリウムメトキシド（２．９３ｇ，５１．５ミリモル） の溶液を滴下ロートから滴加した。 添加が終了したならば、氷浴を除去して、黄色溶液を室温で３時間攪拌した。 次に、反応混合物をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０Ｈ

⁺樹脂（１００ｍｌ）に注ぎ、20分間攪拌した。 この液体を新しいＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０Ｈ

⁺樹脂のカラムに通し、使用した樹脂をメタノール（３ｘ８０ｍｌ）で洗浄した。 カラムをメタノール（５ ｘ６０ｍｌ）で洗浄し、すべての洗液を一緒にし、真空濃縮し、橙色油状物を得た。 酢酸エチルを加えて磨砕し、回転蒸発によって濃縮し、黄橙色固体を得た。 この工程を２回繰り返し、固体を濾過によって回収した。 酢酸エチルを用いて加熱することによる再結晶化によって白色固体（５．９４９ｇ，２６．７ミリモル，５２％）を得た。 （ｂ）２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−デオキシ−３−ニトロ−１−β−Ｏ−メチルグルコピラノシド（９） 無水ＤＭＦ（３８ｍｌ）中の３−ニトロ糖（８）(５．８８５ｇ，２６．２５ ミリモル)の溶液に、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（７．８８ｍｌ，５ ２．５ミリモル）とｐ−トルエンスルホン酸（０．３ｇ，１．６ミリモル）とを加えた。 反応混合物を１６時間還流加熱（６５℃油浴温度）し、次に室温に冷却し、酢酸エチル（２５０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ ｍｌ）及び飽和ブライン（７５ｍｌ）で洗浄した。 有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空濃縮し、淡黄色油状物を得た。 エーテル/ヘキサンを加えて磨砕し、 白色固体を得て、これを濾過し、高真空下で乾燥した(５．７４ｇ，１８．４６ ミリモル，７０％)。 無水酢酸（３０ｍｌ）中の上記白色固体（３．６５ｇ，１１．７３ミリモル） の懸濁液に、ピリジン（１５ｍｌ）を０℃において滴加した。 混合物を０℃において２時間撹拌し、次に氷水（７５ｍｌ）に注ぎ、ＤＣＭ（３ｘ７５ｍｌ）で抽出した。 有機洗液を一緒にし、５％ＨＣｌ水溶液（ｐＨ５）(５０ｍｌ)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）及び水（７５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空濃縮し、白色固体（３．５９ｇ，１０．２ミリモル，８７％）を得た。 （ｃ）２−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−３−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−１−β−Ｏ−メチルグルコピラノシド（１０） 氷酢酸（１２０ｍｌ）及びメタノール（３５０ｍｌ）中の糖（９）(４．１８ ｇ，１１．８３ミリモル）の懸濁液を１０分間ソニケートし、糖を溶解した。 炭素付き２０％水酸化パラジウム（湿Ｄｅｇｕｓｓａ型）(０．２８ｇ/ミリモル基質，３．３１ｇ)を加え、混合物を水素雰囲気（４５ｐｓｉＨ

₂ ）下で１６時間振とうした。 反応混合物をセライトを通して濾過し、パラジウムをメタノール（２ ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、濾液を蒸発させて、トルエン（２ｘ５０ｍｌ）で共蒸発させて、淡色油状物を得、これを高真空下で乾燥させた。 生じた泡状物を無水ＴＨＦ（１２０ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（４．５３ｍｌ， ２６．０３ミリモル）及びＮ−（９Ｈ−フルオレン−２−イルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＦｍｏｃＯＮＳｕ）(４．３９ｇ，１３．０１ミリモル）で処理した。 反応を室温において２０時間撹拌し、次に溶媒を回転蒸発によって除去した。 生じた残渣を酢酸エチルに懸濁し、塩酸水溶液（ｐＨ５．５） (２ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空濃縮し、透明色油状物を得、これをエーテルを加えて磨砕し、淡黄色固体（４．３０３ｇ，〜９．４１ミリモル，８０％）を得た。 （ｄ）２−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−３−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ−１−β−Ｏ−メチルグルクロン酸（２） ジクロロメタン（２３ｍｌ）中の糖（１０）(１．８ｇ，３．９４ミリモル)の懸濁液に、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰ Ｏ）(１モル％，０．０３９４ミリモル，６ｍｇ）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７．９ｍｌ）中の塩化テトラブチルアンモニウム（５モル％，０． １９７ミリモル，５５ｍｇ）と臭化カリウム（１０モル％，０．３９４ミリモル，４７ｍｇ）との予め形成した混合物を加えた。 反応混合物を氷浴中で冷却し、 激しく撹拌した。 次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．６３４Ｍ溶液の１５．６ｍ ｌ，９．８５ミリモル）と、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４．７ｍｌ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（７．９ｍｌ）との溶液を滴下ロートを通して〜４５分間滴加した。 反応を０℃においてさらに１時間撹拌し、次に分液ロートに移し、 水（１００ｍｌ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した。 一緒にした有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、淡黄色固体を得た。 エーテル/酢酸エチルから再結晶して、淡黄色固体として生成物を得、これを高真空下で乾燥した(１．５ｇ， ３．１８ミリモル，８０％)。 実施例３：Ｆｍｏｃ−ロイシン−Ｎｏｖａｓｙｎ−ＴＧＴの糖スカッホルド（sc affold）(１)による誘導体化 商業的に入手可能なＦｍｏｃ−ロイシン−Ｎｏｖａｓｙｎ−ＴＧＴ（製造者の置換 ０．２１ミリモル/ｇ、３．５ｇ、０．７０ミリモル）をＤＭＦ（３Ｏｍ ｌ）中で予め膨張させた。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄し(３ｘ)、次に２０％ピペリジン/ＤＭＦと共に３０分間振とうした。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄した( ４ｘ)。 濾過した樹脂に、スカッホルド１（ＤＭＦ中の０．１３３Ｍ溶液の１０ ．５ｍｌ、１．４ミリモル）と、ＨＡＴＵ（ＤＭＦ中の０．１３３Ｍ溶液の１０ ．５ｍｌ、１．４ミリモル）と、ＤＩＰＥＡ（ＤＭＦ中の０．１３３Ｍ溶液の１ ０．５ｍｌ、１．４ミリモル）とを加え、この懸濁液を室温において２０時間振とうした。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで(４ｘ)、ＥｔＯＡｃで(４ｘ)、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で(４ｘ)洗浄し、次に五酸化リン上で真空乾燥して、２−Ｆｍｏｃ−アミノグルコース−スカッホルド結合固体サポート１２を得た。 樹脂１２の２００ｍｇサンプルを１０％ＴＦＡ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって〜１時間切断させた。 切断混合物をＰｒ ｅｐｓｅｐ

^TM固相抽出カラムを通して濾過し、樹脂を１０％ＴＦＡ/ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂

で洗浄した。 濾液をトルエンと共に減圧下で共蒸発させることによって、所望の生成物を白色固体（３２ｍｇ）として得た。 ２−[Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ]−２−デオキシ−１，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラヌロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ (１２からの樹脂切断生成物)。 エレクトロスプレー Ｌ． Ｃ−Ｍ． Ｓ.，Ｃ

₂₉ Ｈ

₃₆ Ｎ

₂ Ｏ

₉計算値５５６，実測値５５７（＋veイオン），５５５(−veイオン). 実施例４：イソプロピルイソシアネートによるカルバメート形成 樹脂１２（１．２ｇ，０．２５ミリモル）を無水ＤＭＦ（２５ｍｌ）中で膨張させ、濾過し、無水ＤＭＦで洗浄（１ｘ）した。 イソプロピルイソシアネート（ 無水ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液の２５ｍｌ）と触媒量のＣｕ（Ｉ）Ｃｌとを加えた後に、樹脂を室温において３時間撹拌した。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで(４ｘ)、Ｅ ｔＯＡｃで(４ｘ)、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で(４ｘ)洗浄し、Ｐ

₂ Ｏ

₅上で真空乾燥して、所望の固体サポート１４を得た。 樹脂の１８０ｍｇを前に記載したように１０％ＴＦ Ａ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって切断させて、白色固体として２９ｍｇ得た。 ２−[Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ］−２−デオキシ−４−Ｏ−（イソプロピルカルバモイル）−１，３−ジ−Ｏ−メチル−α− Ｄ−グルコピラノシドウロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ(１４からの樹脂切断生成物) 。 エレクトロスプレーＬ． Ｃ−Ｍ． Ｓ． Ｃ

₃₃ Ｈ

₄₃ Ｎ

₃ Ｏ

₁₀計算値６４１，実測値６４２（＋veイオン），６４０(−veイオン). ４−ニトロ安息香酸によるアミド形成及び固体サポートからの切断 樹脂１４（０．２３ｇ，０．０４８ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍｌ）中で膨張させ、濾過し、ＤＭＦで洗浄（２ｘ）し、次に２０％ピペリジン/ＤＭＦ（１０ ｍｌ）と共に３０分間処理した。 生じた樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄し(４ｘ)、 次に４−ニトロ安息香酸(ＤＭＦ中の０．０３Ｍ溶液の３ｍl)、ＨＡＴＵ（ＤＭ Ｆ中の０．０３Ｍ溶液の３ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ（ＤＭＦ中の０．０３Ｍ溶液の３ｍｌ）で処理し、生じた懸濁液を室温において２０時間振とうした。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで(４ｘ)、ＥｔＯＡｃで(４ｘ)、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で（４ｘ）洗浄し、次にＰ

₂ Ｏ

₅上で真空乾燥して、固体サポートを得た。 樹脂を前に記載したように１ ０％ＴＦＡ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって切断させて、三官能化スカッホルド１５を白色固体（３３ｍｇ）として得た。 ２−[４−ニトロフェニルカルボニル(アミノ)]−２−デオキシ−４−Ｏ−(イソプロピルカルバメート)−１，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドウロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ(１５)。 エレクトロスプレー Ｌ． Ｃ−Ｍ． Ｓ.，Ｃ

₂₅ Ｈ

₃₆ Ｎ

₄ Ｏ

₁₁計算値５６８，実測値５６９（＋veイオン），５６７(−veイオン). 実施例５：Ｆｍｏｃ−ロイシン−Ｎｏｖａｓｙｎ−ＴＧＴのスカッホルド（２ ）による誘導体化 商業的に入手可能なＦｍｏｃ−ロイシン−Ｎｏｖａｓｙｎ−ＴＧＴ（製造者の置換 ０．２１ミリモル/ｇ、３．３ｇ、０．７０ミリモル）をＤＭＦ（３０ｍ ｌ）中で予め膨張させた。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄し(３ｘ)、次に２０％ピペリジン/ＤＭＦと共に３０分間振とうした。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄した( ４ｘ)。 濾過した樹脂に、スカッホルド２（ＤＭＦ中の０．１３３Ｍ溶液の１０ ．５ｍｌ、１．４ミリモル）と、ＨＡＴＵ（ＤＭＦ中の０．１３３Ｍ溶液の１０ ．５ｍｌ、１．４ミリモル）と、ＤＩＰＥＡ（ＤＭＦ中の０．１３３Ｍ溶液の１ ０．５ｍｌ、１．４ミリモル）とを加え、この懸濁液を室温において２０時間振とうした。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで(４ｘ)、ＥｔＯＡｃで(４ｘ)、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で（４ｘ）洗浄し、次にＰ

₂ Ｏ

₅上で真空乾燥して、３−Ｆｍｏｃ−アミノグルコース−スカッホルド２−結合固体サポート１３を得た。 樹脂の２００ｍｇサンプルを前に記載したように１０％ＴＦＡ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって切断させて、白色固体の２６ｍｇを得た。 ２−Ｏ−アセチル−３−［Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル） アミノ］−３−デオキシ−１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ(１３からの樹脂切断生成物)。 エレクトロスプレー Ｌ． Ｃ−Ｍ． Ｓ.，Ｃ

₃₀ Ｈ

₃₆ Ｎ

₂ Ｏ

₁₀計算値５８４，実測値５８５（＋veイオン），５８３(−veイオン). イソプロピルイソシアネートによるカルバメート形成 樹脂１３（１．６ｇ，０．３４ミリモル）を無水ＤＭＦ（２５ｍｌ）中で膨張させ、濾過し、無水ＤＭＦで洗浄（１ｘ）した。 イソプロピルイソシアネート（ 無水ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液の３０ｍｌ）と触媒量のＣｕ（Ｉ）Ｃｌとを加えた後に、樹脂を室温において３時間撹拌した。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで(４ｘ)、Ｅ ｔＯＡｃで(４ｘ)、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で（４ｘ）洗浄し、Ｐ

₂ Ｏ

₅上で真空乾燥して、所望の固体サポート１６を得た。 樹脂の１５５ｍｇを前に記載したように１０％Ｔ ＦＡ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって切断させて、白色固体３１ｍｇを得た。 ２−Ｏ−アセチル−３−[Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル） アミノ]−３−デオキシ−４−Ｏ−（イソプロピルカルバモイル）−１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ(１６からの樹脂切断生成物)。 エレクトロスプレーＬ． Ｃ−Ｍ． Ｓ． Ｃ

₃₄ Ｈ

₄₃ Ｎ

₃ Ｏ

₁₁計算値６６９，実測値６７０（＋veイオン），６６８(−veイオン). ２，４−ジメトキシ安息香酸によるアミド形成 樹脂１６（０．５２ｇ，０．１１ミリモル）をＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨張させ、濾過し、ＤＭＦで洗浄（２ｘ）し、次に２０％ピペリジン/ＤＭＦ（１５ｍ ｌ）と共に３０分間処理した。 この樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄し(４ｘ)、次に２，４−ジメトキシ安息香酸(ＤＭＦ中の０．０３Ｍ溶液の５ｍｌ)、ＨＡＴＵ（ ＤＭＦ中の０．０３Ｍ溶液の５ｍｌ)及びＤＩＰＥＡ（ＤＭＦ中の０．０３Ｍ溶液の５ｍｌ）で処理し、懸濁液を室温において２０時間振とうした。 樹脂を濾過し、ＤＭＦで(４ｘ)、ＴＨＦで(４ｘ)、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で（４ｘ）洗浄し、次にＰ

₂

Ｏ

₅上で真空乾燥して、アミド官能化固体サポートを得た。 樹脂１８０ｍｇを前に記載したように１０％ＴＦＡ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって切断させて、白色固体３７ ｍｇを得た。 ２−Ｏ−アセチル−３−[Ｎ（２，４−ジメトキシフェニルカルボニル）アミノ]−３−デオキシ−４−Ｏ−（イソプロピルカルバモイル）−１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ(１７からの樹脂切断生成物)。 エレクトロスプレー Ｌ． Ｃ−Ｍ． Ｓ.，Ｃ

₂₈ Ｈ

₄₁ Ｎ

₃ Ｏ

₁₂計算値６１１，実測値６１２（＋ｖｅイオン）,６１０(−veイオン). アセテート保護基の切断及び固体サポートからの取り出し 樹脂１７（０．２５ｇ，０．０５３ミリモル）をＴＨＦ−ＭｅＯＨ(１：１)( ５ｍｌ)中で１５分間膨張させ、濾過し、水酸化リチウム（ＴＨＦ−ＭｅＯＨ中の０．１Ｍ溶液の５ｍｌ）を加えた。 懸濁液を室温において５時間撹拌し、濾過し、ＴＨＦ−ＭｅＯＨ（１：１）で(４ｘ)、ＴＨＦで(２ｘ)、ＭｅＯＨで(２ｘ) 、ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂で（４ｘ）洗浄し、脱保護樹脂１７を得た。 樹脂を前に記載したように１０％ＴＦＡ／ＣＨ

₂ Ｃｌ

₂によって切断させて、生成物１８を油状白色固体（２１ｍｇ）として得た。 ３−[Ｎ−（２，４−ジメトキシフェニルカルボニル）アミノ］−３−デオキシ−４−Ｏ−（イソプロピルカルバモイル）−１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロンアミド−Ｌｅｕ−ＯＨ(１８)。 エレクトロスプレー Ｌ． Ｃ−Ｍ． Ｓ.，Ｃ

₂₆ Ｈ

₃₉ Ｎ

₃ Ｏ

₁₁計算値５６９，実測値５７０（＋veイオン），５６８(−veイオン). 実施例６：ライブラリー合成 スキーム６において記載したライブラリーを、"ダイレクテッド ソーティング(directed sorting)"スプリット−プール法を用いたＩＲＯＲＩ ＡｃｃｕＴ ａｇ（登録商標）−１００無線周波数タッギング固相合成系（Ｉｒｏｒｉ Ｑｕ ａｎｔｕｍ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから入手可能）を用いて合成した。 ３３０μｌ ＭｉｃｒｏＫａｎｓ（登録商標）をライブラリー合成のために用いた。 ３０ｍｇのスカッホルド官能化樹脂(樹脂負荷：０ ．２ミリモル/ｇ)をＴｅｃａｎ樹脂分配ロボットを用いて各ＭｉｃｒｏＫａｎ（ 登録商標）に入れた。 ライブラリー合成のための全ての合成手順は化合物１５及び１８の合成に関して述べた通りであった。 全ての反応は、細口平底反応容器において実施し、オービタルシェーカー(orbital shaker)上で撹拌した。 Ｍｉｃｒ ｏＫａｎを個々の試験管に選別し、切断カクテルで処理することによって生成物を個々の存在として得た。 生じた生成物含有溶液を４８深穴マイクロタイタープレートに移し、溶媒をＳａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ ｖａｃ（登録商標）ＳＣ２１ ０Ａ上で除去した。 約３〜４ｍｇの各ライブラリー生成物が得られた。 ライブラリー生成物分析 ライブラリー化合物の分析をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２００ ＨＰＬＣ、 Ａｌｌｔｅｃｈ ５００ 蒸発光散乱検出器及びＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａ Ｐ１１００質量分析計から成るＨＰＬＣ/ＭＳ系上で行った。 ＨＰＬＣにＰｈｅ ｎｏｍｅｎｅｘからのＣｏｌｕｍｂｕｓ Ｃ８（５μｍ）カラム（４．６ｘ２５ ０ｍｍ）を備えた。 化合物を５０ｍＭのＮＨ

₄ ＯＡｃ水溶液（ｐＨ＝５）とメタノールとの混合物で溶出した。 メタノール濃度を線状勾配を用いて６０％から９ ０％まで変化させた。 流速度１ｍｌ/分を用いた。 質量スペクトルをＩｏｎＳｐ ｒａｙイオン化を用いて正及び負の両方のイオンモードで記録した。 実施例７：セイフティー−キャッチ（Ｓａｆｅｔｙ−Ｃａｔｃｈ）樹脂上でのライブラリー調製 １）２０ｍｇの４−スルファミルブチリル セイフティー−キャッチ樹脂（Ｎ ｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＵＳＡから入手）を、ＴＥＣＡＮミニ−プレップ分配ロボットによって各缶に分配する。 ２）ＤＭＦ中の０．１Ｍベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ｐｙＢＯＰ）及び０．１５Ｍジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下のＦｍｏｃ保護アミノ酸の０．１Ｍ 溶液中で缶を反応させることによって樹脂に第１アミノ酸を加える。 缶をオービタルシェーカー上で室温において一晩撹拌する。 ３）缶をＤＭＦで４回、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で４回洗浄した後、第１アミノ酸の負荷を、他のスカッホルドに関して記載したような測光的Ｆｍｏｃ測定によってチェックすべきである。 ４）次に、缶をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで３０分間処理した後に、再び缶をＤＭＦで４回洗浄する。 ５）必要な場合には、工程２〜４を繰り返すことによって、追加のアミノ酸を樹脂にカップリングさせることができる。 ６）分子の完全なペプチド部分が形成され、末端アミン官能性が脱保護されたならば、０．０２Ｍ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１， ３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及び０．０２ＭＤＩＰＥＡの存在下でＤＭＦ中の必要な糖スカッホルドの０．０２Ｍ 溶液によって、缶を処理する。 振とうを１２時間行って、この反応工程を確実に完了させる。 ７）次に、缶をＤＭＦで４回、ＴＨＦで５回洗浄する。 ８）次に、糖スカッホルドを上述した同じ方法で作製する。 ９）組み合わせ作製が完了したならば、ＴＦＡ切断工程の前に、缶をＴＨＦで４回、ＴＨＦ中の５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１回、ＴＨＦで４回、１− メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）で２回洗浄する。 １０）次に、０．１Ｍ ＤＩＰＥＡの存在下、ＮＭＰ中のヨードアセトニトリルの０．５Ｍ溶液で室温において２４時間処理する。 １１）次に、缶をＮＭＰで４回、ＴＨＦで４回洗浄してから、最終の切断のためのＩＲＯＲＩ切断ステーションに缶を選別する。 この最終工程は一般に、ＴＨ Ｆ中の求核試薬（アミン、アンモニア、水酸化物又はチオール）の０．１５Ｍ溶液の２．５ｍｌを各缶に別々に加えることによって行う。 １２）溶媒及び求核試薬を簡単に蒸発させて、マイクロタイタープレートに生成物を残すことによる精製が可能であるように、揮発性求核試薬を一般に用いる。 蒸発プロセスは、他の処置に関して記載したように、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅ ｄｖａｃ（登録商標）において行う。 実施例８：生物学的活性に関するスクリーニング手順 本発明のライブラリー化合物による細菌阻害の分析を実施するために次の手順を行うことができる。

細菌． 全ての微生物は、阻害分析における培地の影響を最小にするために、ユニバーサルリッチ培地(universal rich media)において成長させる。 全ての細菌は、０．１％Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＣＡＡ）(Ｄｉｆｃｏ)を補充したＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｕｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅ ｔｒｏｉｔ，ＭＩ）において成長することを実証する。 次の微生物を一次スクリーニングに用いる： Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（ＡＴＣＣ ４９６２４） Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ ２９２１２） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ ２９２１３） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １２２ ２８） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＡＴＣＣ ４９１５０ ） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ２５９２２） Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｎｉｔｒａｔｕｓ（ＡＴＣＣ ４３４９８） 細菌は、凍結グリセロールストックから１．５％Ｂａｃｔｏ−寒天（Ｄｉｆｃ ｏ）を含有するＢＨＩ/ＣＡＡプレートに、単離のためにストリークする。 各菌株からの単離したコロニーを用いて、５ｍｌのＢＨＩ/ＣＡＡ培地に接種し、３ ７℃において振とうしながら一晩成長させる。 例外は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ菌株を用い、これを振とうしないで３７℃においてキャンドルジャー中で成長させることである。 一晩成長後、微生物を１：１００に希釈し、初期から中期−対数成長（early to mid-logarithimic growth）(ＯＤ

₆₀₀約０．５)に到達するまで、インキュベートする。 細胞を、５０℃において維持した０．７％寒天を含有するＢＨＩ/ＣＡＡにおいて１００倍希釈して、約５ｘ１０

⁵コロニー形成単位（ＣＦＵ）/ｍｌの細胞密度にする。 寒天スラリーを、９６−穴プレートの寸法を有する８６ｍｍ ｘ １２８ｍｍ分析プレート(Ｎｕｎｃ)に注ぎ、これを少なくとも３０分間固体化させる。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株を、寒天を含まないＢＨＩ/ＣＡＡ培地中で希釈し、９６−穴分析プレートの各穴に２００μ ｌずつ等分する。

試験化合物試験化合物を滅菌２０％ＤＭＳＯ/水中に可溶化して、約１〜５ ｍｇ/ｍｌの濃度にし、数個の滅菌”娘”プレートに無菌下で等分し、−２０℃ において凍結させる。 娘プレートは、分析の直前に室温又は３７℃において解凍する。

菌叢分析滅菌９６−穴プレート複製デバイス（Ｂｏｅｋｅｌ）を娘プレートに挿入し、これを用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを含有する９６−穴プレート又は細菌で包理された寒天プレートのいずれかに、試験化合物を分配する。 レプリケーターにより、寒天を穿孔し、寒天表面への損傷を防ぐためにレプリケーターを垂直に取り出す。 阻害帯の外観を、３７℃における１５〜２４時間成長後にモニターする。 同様に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ阻害は、２４〜４８時間成長後に９６−穴プレートの穴において観察可能な濁りがないことによってモニターする。 抗生物質標準の希釈物を含有する対照プレートは、各微生物による各分析の時点においてランする。 対照抗生物質は、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，Ｖａ ｎｃｏｍｙｃｉｎ及びＭｏｅｎｏｍｙｃｉｎである。 対照サンプルは、９６−穴アレイにおいて２通りに等分する。 各抗生物質を８つの連続２倍希釈物において試験する。 抗生物質濃度は、１０ｍｇ/ｍｌから０．００１ｍｇ/ｍｌまで変化させる。

ＭＩＣ分析菌叢分析における推定の活性をさらにスクリーニングして、影響を受けた各微生物に関する各化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定する。 試験化合物を２０％ＤＭＳＯ/水において連続的に希釈し、９６−穴プレートに５μ ｌの量で加える。 上記のように成長させ、寒天を含まないブロス中で希釈した各細菌を、希釈した化合物に２００μｌの量で加える。 ＭＩＣ分析における各化合物に対して用いる濃度の範囲は、菌叢分析における阻害帯の大きさによって意味される効力に基づく。 各化合物を１：４０から抗菌効果を軽減するために必要な最大希釈度までの範囲の５種類の連続希釈度において試験する。 細菌成長に対する試験化合物の効果を３７℃における１８時間の成長後に、６００ｎｍにおける培地の濁度の決定又は目視検査によって測定する。 ＭＩＣは、細菌成長を完全に阻害するために必要な化合物の最低濃度として定義される。

ペプチドグリカン合成分析 ． Ｍｉｒｅｌｍａｎ等［

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ

ｙ １５：１７８１−１７９０(１９７６)]によって述べられ、Ａｌｌｅｎ等［

ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．

Ｌｅｔｔ． ９８：１０９−１１６(１９９２)] によって改変された分析から、ペプチドグリカン合成分析を適用する。 Ｅ． ｃｏ ｌｉ（ＡＴＣＣ＃２３２２６）をＭｉｒｅｌｍａｎ等（１９７６）と、Ｍａａｓ とＰｅｌｚｅｒ[

Ａｒｃｈ．

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ，１３０：３０１−３０６(１ ９−)]に従ってエーテルによって透過性を高めて、外因的に加えた放射能標識された及び放射能標識されない細胞壁先駆体に細菌細胞壁を透過させる。 ＵＤＰムラミル−ペンタペプチド(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｇ ｌ ｕ−メソ−ジアミノピメリル−Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ)のスクリーニング量を、公開された分取ＨＰＬＣ方法［Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈ及びＨｏｌｔｊｅ，

ＦＥ

ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．

Ｌｅｔｔ． ７８：２５３−２５８(１９９１)］及び分析ＨＰＬＣ方法［Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈ等，

Ｊ．

Ｇｅｎ．

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ

．

Ｌｅｔｔ． １５３：１４９９−１５０６(１９８９)］に従って、Ｂ． ｃｅｒｅ ｕｓ（ＡＴＣＣ＃１１７７８）の水性抽出物から沸騰することによって単離する。 細菌タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄの方法［

Ａｎａｌ．

Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２ ：２４８(１９７６)］によって測定する。 重合分析は９６−穴フィルター底プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧＦ／Ｃ− ｃａｔ．＃ ＭＡＦＣ ＮＯＢ １０）において行う。 Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓ ｉｓ １５０ロボットを全ての逐次液体処理工程に関してプログラムする。 １０ ０μｌの最終分析量中に、各穴は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)；５０ｍ Ｍ ＮＨ

₄ Ｃｌ；２０ｍＭ ＭｇＳＯ

₄・７Ｈ

₂ Ｏ；１０ｍＭ ＡＴＰ(ニナトリウム塩)；０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール；０．１５ｍＭ Ｄ−アスパラギン酸；０．００１ｍＭ ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−［

¹⁴ Ｃ−］−Ｄ−グルコサミン(ＤｕＰｏｎｔ／Ｎ．Ｅ．Ｎ．−２６５−３０７ｍＣｉ／ミリモル)；０．０５ ｍＭ ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド、１００μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び５００μｇ／穴 エーテル処理細菌タンパク質を含有する。 新規な試験化合物を１０％ＤＭＳＯ／水中で可溶化して、１０μｇ／ｍｌの最終分析濃度においてスクリーニングする。 放射能標識し、単離したネイティブ・ペンタペプチドを例外として、残りの全ての生化学物質はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ又はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入する。 分析バッファー(１０μｌ)、ＡＴＰ(２０μｌ)、ＵＤＰペンタペプチド（１０ μｌ）及び

¹⁴ Ｃ−ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２０μｌ）を全ての穴に加え、その後に試験化合物、参考標準又はバッファー・ビヒクル（２０μｌ）を加える。 次に、分析バッファー中に調製した細菌タンパク質の２０μｌアリコートを各穴に加えることによって、反応を開始する。 プレートを被覆し、３０秒間混合してから、３７℃において１２０分間インキュベートする。 氷冷２０％ＴＣＡ（１００μ ｌ）を各穴に加えて、プレートを穏やかに混合し(６０秒間)、次に３０分間冷却し(４℃)、全てのペプチドグリカンを確実に沈殿させる。 プレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅマニホルド上で真空濾過下に置き、濾過して、 ２００μｌ／穴の１０％ＴＣＡによって３〜４回洗浄した。 Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ シンチレーション・カクテル（３０μｌ／穴）を加えて、プレートを一晩インキュベートしてから、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ中でカウントする。 ペプチドグリカン中への

¹⁴ Ｃ−標識の組み込みの阻害％を、対照（総組み込み）穴と、放射能標識の組み込みを完全に阻害する、３００μｇ／ｍｌのバンコマイシン又は１００μｇ／ｍｌのライブラリー化合物を含有するバックグラウンド（ブランク）穴とから算出する。 全ての穴は通常＜２０％だけ変化する、二通りに配列する。 参考標準に関する濃度−反応曲線を各プレート上に陽性対照として配列させる。 上記実施例は本発明のある一定の好ましい実施態様の説明を目的とする。 しかし、発明の明白な添加及び改変が当業者に自明であることを理解すべきである。 本発明は請求の範囲に定義された以外には、制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ