Detection of target compounds using nucleic acid ligands

【発明の詳細な説明】 核酸リガンドを用いる標的化合物の検出法発明の分野 本明細書には、検出分子として核酸リガンドを用いて物質中の標的化合物の存在を決定する方法が記載されている。 具体的には、物質をブロット法で用いられるような固体支持体マトリックスに結合させ、核酸リガンドの標的分子に対するアフィニティーおよび特異性を用いて標的分子の検出を行なう。 この核酸リガンドの同定および調製に本明細書で用いられる方法は、指数濃縮によるリガンドの体系的発生(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)の頭字語であるＳＥＬＥＸと呼ばれる。 本発明は、生物学的流体、細胞培地および工業上の過程の流体のような物質中の標的化合物の存在を確認することができる各種の標的に結合する高アフィニティー核酸リガンドを包含し、更にその物質に見出だされる標的の絶対量を決定することも包含する。 物質を、あるやり方でブロット法で用いられるような固体支持体マトリックスに結合させる。 本発明の方法は、様々な物質から標的化合物を分離するのにも用いられる。 特に好ましい標的化合物は、タンパク質である。 ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＳＨ）に対する核酸リガンドを用いて、様々な物質中の同種の標的化合物を検出する分析法が開示される。 発明の背景標的分子に極めて特異的に結合する核酸分子のイン・ビトロ発生法が、開発されている。 ＳＥＬＥＸ結合化学工程と呼ばれる指数濃縮によるリガンドの体系的発生であるこの方法は、「指数濃縮によるリガンドの体系的発生」という表題の現在は放棄されている米国特許出願連続番号第０７／５３６，４２８号明細書、 「核酸リガンド」という表題の現在は米国特許第５，４７５，０９６号である１ ９９１年６月１０日出願の米国特許出願連続番号第０７／７１４，１３１号明細書、「核酸リガンドの同定法」という表題の現在は米国特許第５，２７０，１６ ３号である１９９２年８月１７日出願の米国特許出願連続番号第０７／９３１， ４７３号明細書（ＷＯ９１／１９８１３号明細書も参照されたい）に記載されており、前記特許明細書の内容は参考として本明細書に具体的に引用される。 本明細書ではまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶこれらの出願明細書のそれぞれには、任意の所望な標的分子に対する核酸リガンドの基本的に新規な製造法が記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一般的選択法を用いる結合、分離および増幅の段階的繰返しにより、実質的に任意の結合アフィニティーおよび選択性の所望な基準を達成することを包含する。 核酸、 好ましくはランダム化した配列のセグメントを含んでなる核酸の混合物から出発すると、ＳＥＬＥＸ法は、結合に適した条件下で混合物を標的と接触させ、未結合核酸を標的分子に特異的に結合している核酸から分離し、核酸−標的複合体を解離させ、この核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮した混合物を生成させ、次いで標的分子に対する極めて特異的な高アフィニティー核酸リガンドを生成するのに所望なだけの多くのサイクル数で結合、分離、解離および増幅の段階を繰返す段階を含んでいる。 基本的なＳＥＬＥＸ法は、多数の特定の目的を達成するために変更されてきた。 例えば、１９９２年１０月１４日出願の「構造に基づいた核酸の選択法」と題する米国特許出願連続番号第０７／９６０，０９３号明細書には、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ法を用いて、曲がったＤＮＡのような特異的な構造上の特徴を有する核酸分子を選択することが記載されている。 １９９３年９月１７ 日出願の「核酸リガンドの光選択」と題する米国特許出願連続番号第０８／１２ ３，９３５号明細書には、標的分子と結合しおよび／または光架橋しおよび／または光不活性化することができる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸを基本とする方法が記載されている。 １９９３年１０月７日出願の「テオフィリンとカフェインとを識別する高アフィニティー核酸リガンド」と題する米国特許出願連続番号第０８／１３４，０２８号明細書には、対向ＳＥＬＥ Ｘと題する密接に関連した分子同士を識別することができる高特異的核酸リガンドの同定法が記載されている。 １９９３年１０月２５日出願の「指数濃縮によるリガンドの体系的発生：溶液ＳＥＬＥＸ」と題する米国特許出願連続番号第０８／１ ４３，５６４号明細書には標的分子に対して高および低アフィニティーを有するオリゴヌクレオチド同士を高効率的に分離するＳＥＬＥＸに基づいた方法が記載されている。 １９９２年１０月２１日出願の現在は米国特許第５，４９６，９３ ８号として発行されている「ＨＩＶ−ＲＴおよびＨＩＶ−１ Ｒｅｖに対する核酸リガンド」と題する米国特許出願連続番号第０７／９６4，６２４号明細書には、ＳＥＬＥＸ工程を行なった後に改良核酸リガンドを得る方法が記載されている。 １９９５年３月８日出願の「指数濃縮によるリガンドの体系的発生：化学Ｓ ＥＬＥＸ」と題する米国特許出願連続番号第０８／４００，４４０号明細書には、リガンドをその標的に共有結合する方法が記載されている。 ＳＥＬＥＸ方法は、向上したイン・ビボ安定性や向上した送達特性のような向上した特性をリガンドに付与する改良されたヌクレオチドを含む高アフィニティー核酸リガンドの同定を包含する。 このような変更の例としては、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基位置における化学的置換が挙げられる。 修飾されたヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸにより同定した核酸リガンドは、１９９ ３年９月８日出願の「修飾ヌクレオチドを含む高アフィニティー核酸リガンド」 と題するピリミジンの５−および２'−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている米国特許出願連続番号第０８／ １１７，９９１号明細書に記載されている。 上記の米国特許出願連続番号第０８ ／１３４，０２８号明細書には、２'−アミノ（２'−ＮＨ ₂ ）、２'−フルオロ（２'−Ｆ）および／または２'−Ｏ−メチル（２'−ＯＭｅ）で修飾された１個以上のヌクレオチドを含む高特異的核酸リガンドが記載されている。 １９９ ４年６月２２日出願の「分子内親核置換反応による既知および新規の２'修飾ヌクレオチドの新規な製造法」と題する米国特許出願連続番号第０８／２６４，０ ２９号明細書には、様々な２'−修飾ヌクレオチドの製造法が記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、１９９４年８月２日出願の「指数濃縮によるリガンドの体系的発生：キメラＳＥＬＥＸ」と題する米国特許出願連続番号第０８／２８４，０ ６３号明細書および１９９４年４月２８日出願の「指数濃縮によるリガンドの体系的発生：混合ＳＥＬＥＸ」と題する米国特許出願連続番号第０８／２３４，９ ９７号明細書にそれぞれ記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位との組み合わせを包含する。 これらの出願明細書により、オリゴヌクレオチドの広汎な形状および他の特性、および効率的な増幅および複製特性を、他の分子の所望な特性と組み合わせることができる。 基本的ＳＥＬＥＸ法の変法を記載している上記の特許出願明細書のそれぞれは、そっくり本明細書に参考として引用される。 ＳＥＬＥＸ法が有力な方法であることは明らかである。 ＳＥＬＥＸ法によって得た核酸リガンドは、多くの性能で作用する能力を有する。 核酸リガンドが有する性能の一つは、標的化合物に特異的に結合する能力である。 ＳＥＬＥＸ法によって誘導されたリガンドは、１９９５年６月７日出願の「エンザイム・リンクト・オリゴヌクレオチド・アッセイ(Enzyme Linked Oligonucleotide Assays)ＥＬＯＮＡＳ」と題する米国特許出願連続番号第０８ ／４８７，４２５号明細書、および１９９５年６月７日出願の「フロー・サイトメトリーにおける核酸リガンドの使用」と題する米国特許出願連続番号第０８／ ４７９，７２９号明細書に記載されているように、他の診断用途に用いられており、これらの特許明細書の内容は、そのまま参考として本明細書に引用される。 特異的および高アフィニティー分子認識は、診断目的にとって重要である。 最近まで、標的を認識する分子の操作は、主としてタンパク質に限定されていた。 特異的標的を認識するタンパク質分子は、典型的には抗体として生じた。 その結果、抗体は、現在用いられている分析および分離法の開発に中心的な役割を与えられてきた。 主として抗体を用いる方法としては、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩ ＳＡｓ）、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー診断法、ブロッティング法、蛍光異方性、膜検定法、バイオセンサーなどの免疫測定検定法が挙げられる。 免疫測定検定法は、多価標的または抗原、すなわち同時に２個以上の抗体と複合体形成を行なうことができる抗原性物質に特に適することが見出だされている。 このような検定法では、典型的には試験を行なう流体に不溶性の固体支持体に結合した一定量の未標識抗体と、固相抗体、抗原および標識抗体の間に形成された三元複合体の検出および／または定量的評価を行なうことができる酵素または放射性同位体のような標識を有する一定量の可溶性抗体が用いられる。 免疫測定検定法に関する詳細は、米国特許第４，４８６，５３０号明細書に提供されている。 ブロッティング法は、現在はＨＩＶやＣ型肝炎のような様々な疾患状態の確認診断法試験として用いられている。 ブロッティング法は、研究室でも頻繁に用いられる。 免疫ブロットは、物質が特定の標的を含んでいるかどうかを決定するための高感度の免疫検定法である。 近年、免疫ブロットは、診断法および検討手段としても同様に用いられてきている。 通常は、抗原は、抗体に化学結合した検出酵素または放射能、蛍光などの検出可能な特性を有するある種の他の種によって抗原に特異的な抗体を用いて検出される。 典型的には、目的の標的化合物を含む可能性があるまたは可能のない物質を固体支持体に付着させる。 マトリックス結合した物質を、抗体と接触させる。 洗浄した後、検出系は、この物質と抗体との間に相互作用が起きているかどうかを示す。 この検出系は、当業者に知られている任意の検出系であることができ、酵素に結合した核酸リガンド、放射能標識した核酸リガンド、酵素に結合した二次抗体または万能抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、および化学発光検出系を挙げることができるが、これらに限定されない。 タンパク質−核酸相互作用の分析における主な進歩は、１９８０年に起こり、 Brown et al． (Nucl．Acids Res.，（1980）8:1-20)は標識したＤＮＡを、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによって分離してニトロセルロースに移したタンパク質に結合することによってタンパク質−ＤＮＡ相互作用を検出する方法を確立した（サウスウェスタンブロッティング」）。 この手順は、 ¹²⁵ Ｉで標識したRaus肉腫ウイルスＲＮＡに結合するタンパク質を明らかにすることによるタンパク質−ＲＮＡ結合（「ノースウェスタンブロッティング」）に敷衍された。 これらの相互作用は遺伝子発現の翻訳制御に重要であるが、特異的タンパク質と成熟ｍＲＮＡとの間の相互作用を検出するためのノースウェスタンブロッティングの応用例は僅かしかない。 一般化したタンパク質−ｍＲＮＡ相互作用を検出するためのノースウェスタンブロッティング法の使用例は更に少ない。 これの一つの理由は、ノースウェスタンブロッティング法は、数百または数千のタンパク質の個数に関するＲＮＡ −結合タンパク質について探索するためのこの方法の応用は、通常はバックグラウンドが高く、再現性に欠けるため混乱するので、更に一般化した方法での応用は困難である。 抗体の他に、オリゴヌクレオチドも、別のやり方であるが、診断法に用いられている。 オリゴヌクレオチドプローブの配列情報を用いて、サザンブロッティング、インシトゥ(in situ)ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた増幅のような手法でゲノム相補的塩基配列を特異的に標的設定する。 しかしながら、オリゴヌクレオチドに蓄えられたこれらの工程情報は、核酸分子および天然に存在する核酸と結合するタンパク質を検出するのにだけ一般的に用いられる。 核酸の情報内容（線状配列）は、主としてワトソン／クリック塩基対に依存しており、ＤＮＡとＲＮＡまたは配列特異的核酸結合タンパク質を識別することができるだけである。 現在のところ、オリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチド結合タンパク質の検出のためだけにウェスタン・ブロッティング形式（ノースウェスタンブロット、上記）で用いられている。 特異的オリゴヌクレオチドプローブは、配列特異的または配列に依存しない核酸結合タンパク質を特異的に検出するのに用いられる(Chan et al．(1993)BBRC 191:18-25)。 今日までに知られている診断用核酸およびほとんどの抗体は、それぞれ核酸またはタンパク質内の線状エピトープを認識することが知られている。 ほとんどの抗体は、恐らくは抗原提示細胞によるペプチド断片の提示により、タンパク質内の線状エピトープを認識することが知られている。 しかしながら、ＳＥＬＥＸ法では、完全なタンパク質にアフィニティーを有するオリゴヌクレオチド中で次第に濃縮されたオリゴヌクレオチドのプールに、完全なタンパク質が繰返し提示される。 従って、ＳＥＬＥＸにより誘導されるオリゴヌクレオチドリガンドは、立体配座的エピトープ(conformational epitopes)を認識する傾向がある。 構造内容（三次元構造）によっては、核酸リガンドを任意の種類の標的についての診断目的に用いることができる。 ＳＥＬＥＸ法の以前には、核酸の構造内容は本質的には理解されておらず、核酸の構造上の適応性を診断法に利用する方法はなかった。 ブロット型診断検定法は以前は抗体認識によって変化すると考えられていたが、この方法における核酸リガンドの使用は、これまでのところ明らかにされていない。 オリゴヌクレオチドの三次元構造に蓄えられたリガンド結合情報は、通常は核酸を結合する機能を示さないタンパク質標的などの物質中の標的分子の検出に有用である。 本発明は、同種の標的化合物に高アフィニティーで結合するオリゴヌクレオチドをマトリックス結合標的検出法における抗体の代わりに用いることができることを明らかにする。 更に具体的には、ヒトＶＥＧＦ、ｈＣＧおよびｈＴＳＨに高アフィニティーで結合するＳＥＬＥＸにより誘導されたオリゴヌクレオチドをウェスタン・ブロット法の抗体の代わりに用いることができる。 発明の概要本発明は、物質を固体支持体に結合し、核酸リガンドを用いて標的化合物がこの物質に含まれているかどうかを決定する、新規な診断法を包含する。 本発明の好ましい方法は、核酸リガンドを用いるブロッティングの方法を包含する。 更に具体的には、本発明は、新規な核酸リガンドを検出分子として用いるブロッティング法を包含する。 本発明は、標的化合物を含む可能性のある物質における前記標的化合物の存在を検出する方法であって、ａ） 前記標的化合物を含む可能性のある物質を固体支持体に付着させ、ｂ） 前記物質を、前記標的化合物に対する核酸リガンドに暴露し、前記核酸リガンドが前記標的化合物に結合して、核酸リガンド：標的化合物複合体を形成し、ｃ） 前記核酸リガンド：標的化合物複合体を検出することを特徴とする、方法を提供する。 更に具体的には、本発明の核酸リガンドに基づいた方法は、ＶＥＧＦ、ｈＣＧ およびｈＴＳＨの検出に有用である。 図面の簡単な説明図１は、ＳＥＬＥＸにより誘導されたオリゴヌクレオチドＮＸ−２４４（配列番号：１）はＶＥＧＦ ₁₆₅を認識するが、ＶＥＧＦ ₁₂₁は認識しないことを示すタンパク質ブロット法の結果を表す。 タンパク質ブロットは、ＮＸ−２４４またはモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を検出プローブとして用いた。 レーン１および３ はＶＥＧＦ ₁₆₅ １５０ｎｇを含み、レーン２および４はＶＥＧＦ ₁₂₁を含む。 キロダルトンでのタンパク質分子量マーカーの位置が示されている。 図２は、全細胞の細菌溶解物の１０ｍｇの分量を、ヒトＶＥＧＦ ₁₆₅の減少濃度を加えたタンパク質ブロット法の結果を表す。 細菌抽出物に加えたヒトＶＥＧ Ｆ ₁₆₅の量を、各レーンの最上部にナノグラムで示す。 キロダルトンでのタンパク質分子量マーカーの位置を、左に示す。 図３は、Personal Densitometer（２０分暴露）で読み取ったときの、密度対図２に示したブロットから得たＶＥＧＦ ₁₆₅濃度のプロットを表す。 フィルム上の密度は、加えたＶＥＧＦ ₁₆₅の量に比例する。 従って、この手法を用いて、複雑な混合物中のＶＥＧＦ濃度を定量することができる。 図４は、ｈＴＳＨに対する核酸リガンドはｈＴＳＨを認識するが、選択されたオリゴヌクレオチドプールは認識しないことを示すタンパク質ブロット法の結果を表す。 図５は、ｈＴＳＨの入力濃度の関数としてのｈＴＳＨドットブロットのシグナルのホスホルイメージャー定量(phosphorimager quantitation)を表す。 図６は、雄尿試料に様々な量のｈＣＧを加え、ｈＣＧに対する放射能標識した核酸リガンドによって検出するドットブロット法の結果を表す。 図７は、放射能標識した核酸リガンドがブロット法におけるｈＣＧの濃度と相関するときの放射能標識した核酸リガンドの定量を表す。 図８は、コントロール尿と妊娠した雌の尿のｈＣＧドットブロット法の結果を表す。 図９は、ＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドアフィニティーカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質ブロット分析の結果を表す。 発明の詳細な説明本願は、免疫ブロットプロトコールのような任意のマトリックスに結合した標的検出プロトコールにおける各種の標的に対する高アフィニティー核酸リガンドの使用を説明する。 核酸リガンドは、本明細書では、標的化合物に対して特異的結合アフィニティーを有する天然に存在しない核酸として定義され、この標的化合物は、主としてワトソン／クリック塩基対または三重ら旋結合によって変化する機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、核酸リガンドは標的化合物によって結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。 好ましい態様では、核酸リガンドは一本鎖の核酸リガンドである。 好ましい態様では、核酸リガンドは、ＳＥＬＥＸ法として知られる方法により同定される。 ＳＥＬＥＸ法は、現在は放棄された「指数濃縮によるリガンドの体系的発生」と題する米国特許出願連続番号第０７／５３６，４２８号明細書であり、１９９１年６月１０日出願の「核酸リガンド」と題する米国特許出願連続番号第０７／７１４，１３１号であって、現在は米国特許第５，４７５，０９６号明細書、１９９２年８月１７日出願の「核酸リガンドの同定法」と題する米国特許出願連続番号第０７／９３１，４７３号であって、現在の米国特許第５，２７ ０，１６３号明細書（ＷＯ９１／１９８１３号明細書も参照されたい）に記載されている。 これらの特許明細書の内容は、具体的に本明細書に参考として引用され、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願明細書と呼ばれる。 ＳＥＬＥＸ法は、その最も基本的な形態では、 １）異なる配列の候補混合物を調製する。 候補混合物は、一般に固定配列の領域（すなわち、候補混合物の一員が同じ位置に同じ配列）および無作為化配列の領域を含む。 固定配列領域は、（ａ）下記の増幅段階を補助し、（ｂ）標的に結合することが知られている配列を模し、または（ｃ）候補混合物における核酸の所定の構造配列の濃度を高める目的で選択される。 無作為化配列は、完全に無作為化し（すなわち、任意の位置に塩基を見出だす確率が１／４）、または部分的にだけ無作為化（例えば、任意の位置に塩基を見出だす確率を０〜１００％の任意の水準に選択することができる）することができる。 ２）候補混合物を、標的と候補混合物の一員との間の結合に好ましい条件下で選択された標的と接触させる。 これらの状況では、標的と候補混合物の核酸との間の相互作用は、標的とこの標的に最強のアフィニティーを有する核酸との間に核酸−標的対を形成するものとして考えることができる。 ３）標的に対して最高のアフィニティーを有する核酸を、標的に余りアフィニティーを持たない核酸から分離する。 最高のアフィニティーを有する核酸に相当する配列が極めて少数だけである（かつ場合によっては核酸の１分子だけである） ため、通常は分離基準を設定して、候補混合物中の核酸の有意量（約５〜５０％ ）がそれぞれ分離段階中に保持されるようにするのが望ましい。 ４）次に、分離中に標的に比較的高アフィニティーを有するものとして選択される核酸を増幅して、標的に比較的高アフィニティーを有する核酸濃度の高い新規な候補混合物を生成する。 ５）前記の分離および増幅段階を繰返すことによって、新たに形成された候補混合物は、ユニーク配列含量がますます少なくなり、標的に対する核酸の平均的アフィニティー度は一般的に増加する。 極端な場合には、ＳＥＬＥＸ法は、標的分子に対して最高のアフィニティーを有する元の候補混合物からの核酸を表すユニーク核酸を１個または少数含む候補混合物を生じる。 ＳＥＬＥＸ特許出願には、この方法について極めて詳細に記載され、詳細に述べられている。 この方法で用いることができる標的、候補混合物内の核酸の分離法、および分離した核酸を増幅して濃縮した候補混合物を生成する方法が包含される。 ＳＥＬＥＸ特許出願には、多数の標的種に対して得られたリガンド、例えばタンパク質が核酸結合タンパク質である、および核酸結合タンパク質でない、 両方のタンパク質標的も記載されている。 ＳＥＬＥＸ特許出願には、多数の治療および診断上の使用を含む核酸リガンドの多くの使用が記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、標的分子の高アフィニティーリガンドを提供する。 これは、 核酸研究の分野で前例のない唯一の業績である。 ＳＥＬＥＸにより誘導された核酸リガンドのアフィニティーは、構造的にずっと大きなモノクローナル抗体で見られるのと同一範囲にあることが多い。 １態様では、核酸リガンドは、（１）標的に対して所望な効果を達成することができる方法で標的に結合し、（２）所望な効果を得るためできるだけ小さく、 （３）できるだけ安定であり、かつ（４）選択された標的に対して特異的なリガンドであることが好ましい。 ほとんどの場合に、核酸リガンドが標的に対して最高の可能なアフィニティーを有するのが好ましい。 最近まで、分子認識が可能なバイオポリマーのデザインや生産は、主としてタンパク質（抗体）に限られていた。 しかしながら、ＳＥＬＥＸ法は、高アフィニティーおよび特異性を有する標的分子を認識する核酸配列の同定を行なうことができる。 この方法は、モノクローナル抗体の生成より速く、抗体を生成するのに必要な動物の使用を必要としない。 高アフィニティーリガンドの配列が一旦同定されれば、この材料を多量に化学的に合成することができる。 これは、抗体産生細胞系の加工および貯蔵に比較して明確な利点である。 更に、容易には免疫原性とはならない標的に対して特異的かつ高アフィニティー核酸リガンドを生成させることができる。 このことにより、この診断用途から得ることができる情報の種類に新たな次元が加わる。 明らかに、これまでは良好な診断検定法の主題となることがなかった標的化合物を、この新たな方法を用いて検出することができる。 本発明の核酸リガンドは、抗体に対して更に利点を提供する。 核酸リガンドは、１９９３年１０月７日出願の「テオフィリンとカフェインとを識別する高アフィニティー核酸リガンド」と題する米国特許出願連続番号第０８／１３４，０２ ８号明細書に記載されている通常の抗体によって示される特異性より標的化合物に対する大きな特異性を有することができ、前記特許明細書の内容は、参考として本明細書に引用される。 抗体は一般的に複数の結合部位を有するが、その内の２個だけが標的化合物にとって特異的であり、核酸リガンドの分子全体を標的化合物の結合に利用することができる。 本発明の核酸リガンドを同定して、単一の特異的結合部位を含むように調製することができる。 従って、核酸リガンドをイムノアッセイに用いるときには、非皮膚化合物の非特異的結合は、潜在的にずっと少なくなる。 これにより、標的化合物の存在について一層信頼性のある検出シグナルが提供される。 本発明の最大の利点の一つは、既知配列の比較的小さなオリゴヌクレオチドを多くの実験室で容易に複製することができ、抗体とは異なり、同一の結合特性を有することである。更に、オリゴヌクレオチドを容易に修飾して、ビオチンだけでなく、他の同様に有用な残基、例えばフルオレセインのような蛍光色素、リン３２（ ³² Ｐ）、コレステロールまたはジゴキシゲニンのようなステロイド、およびペプチドを含むようににすることができる。様々な修飾により、検出残基を選択することができる。とりわけ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのようなリポーター酵素に直接オリゴヌクレオチドを共有または非共有結合することができる。イムノアッセイで核酸リガンドを用いる追加の利点は、ある種の標的化合物が核酸リガンドに結合するが、抗体には結合しないことである。このような化合物の例は、大きなタンパク質に接合してマウスやウサギで免疫応答をイリシット（ illicit）することができないグルコースのような小分子、およびエピネフリン、ノルエピネフリンおよびα−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸（クラミジア生物に特異的な三糖類）のようなカテコールアミンである。更に、核酸リガンドは、大きさが（抗体に比較して）小さいため、細胞内染色に有効であることが期待され、すなわち核酸リガンドを細胞レベルでの標的分子の発現を検出するのに用いることができる。本発明は、標的化合物を含む可能性のある物質における前記標的化合物の存在を検出する方法であって、ａ） 前記標的化合物を含む可能性のある物質を固体支持体に付着させ、ｂ） 前記物質を、前記標的化合物に対する核酸リガンドに暴露し、前記核酸リガンドが前記標的化合物に結合して、核酸リガンド：標的化合物複合体を形成し、ｃ） 前記核酸リガンド：標的化合物複合体を検出することを含む、方法を提供する。本発明は、あらゆる固相またはマトリックス結合した検出系に適用される。 Ａ． 固体支持体への物質の付着ポリアクリルアミドゲル電気泳動、タンパク質電気ブロッティング、および免疫検出の手法が組み合って、複雑なタンパク質混合物のような物質の分析および特性決定の極めて強力で感受性の高い方法を提供する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（一次および二次元ＰＡＧＥ）は、様々な物質の分析および特性決定のための最も広汎に用いられている手法の一つである。ゲルは直接染色することができ、タンパク質のような物質成分は、様々な異なる方法によって可視化することができる。物質の電気泳動による移動、例えばＰＡＧＥによって分離されたタンパク質の固定膜の表面への移動により、様々な試薬やプローブへ一層接近しやすくなる。本発明において、移動した物質を、核酸リガンドで検査する。このような材料の分析としては、放射能標識または酵素に接合した核酸リガンドまたは二次抗体によって可視化することができる核酸リガンドの使用によって固定した抗原の同定および特性決定が挙げられる。核酸リガンドが膜に固定されると、それらは選択されたタンパク質によるプロービングによって同定および特性決定することはできない。この手法の限界は、膜に結合したタンパク質が変性すると、元のタンパク質に含まれる同一の配座および構造決定基を最早含まないことがあるということである。任意の適当な固体支持体が、本発明で有用である。本発明の固体支持体としては、膜、帯電紙、ナイロン、ビーズ、または実質的にあらゆる他の種類の固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない。数種類の移動膜が、現在利用可能である。最も普通に用いられる支持体である標準的なニトロセルロースの他に、数社では、合成支持体で浸漬したニトロセルロースであって、性能を変更することなく耐久性および柔軟性を向上させるものを提供している。ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜は、Millipore（ベットフォード、マサチューセッツ）からImmobilonという商品名で発売されている。そのタンパク質結合容量はニトロセルロースより若干低いが、それは機械的強度が高く、また多くの有機溶媒とも相溶性である。これにより、クーマジーブルーでタンパク質を直接染色することができ、移動したタンパク質の直接的アミノ酸組成および配列を、次の核酸リガンドについての使用を妨げることなく、分析することができる。多種多様な移動法が開発されてきた。しかしながら、最適移動および次の特異的タンパク質の膜への結合の条件は、経験的に決定しなければならず、異なるタンパク質試料で変化する可能性がある。多くのパラメーターがタンパク質移動の効率に影響し、それらのほとんどは容易に操作することができる。幾つかの種類の移動単位は、市販されている。 Bio-Rad Transblot単位（リッチモンド、カリフォルニア）Hoefer単位（サンフランシスコ、カリフォルニア）、およびElectroblot装置（E．C．Apparatus Corp．、セント・ピータースバーグ、フロリダ）では、それぞれ実験当たり４〜６リットルの緩衝液が必要であり、タンパク質を効率的かつ再現性よく移動するのに日常的に用いられている。緩衝液組成の選択は、選択されるゲルおよび膜の種類によって変化する。ある方法では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むトリス−グリシンｐＨ８． ３緩衝液が記載されている。再循環する氷冷した高イオン強度緩衝液の補助を用いて、ゲルが移動の際にメタノールの非存在下で膨潤して、膜上のタンパク質を余り分割できなくするのを防止する。タンパク質の電気泳動によるニトロセルロースへの移動の様々な変法が報告されているが、移動溶液からアルコールを省いた手順が一般に最適である。アルコールの非存在下ではＳＤＳは速やかにタンパク質から除去されないので、洗剤に結合したタンパク質は総て最初は負に帯電し、一層定量的なタンパク質の移動が行なわれる。更に、アルコールまたは他の試薬は分子を変更または修飾する可能性があり、従って幾つかの抗原決定基を破壊することがある。最初にTowbin et al． (Proc．Nat．Acad．Sci．USA（1979）76:4350)によって記載され、 Anderson et al． (Electrophoresis（1982）3:135)によって改良された方法は、 ニトロセルロース(Bio-Rad)またはＰＶＤＦ(Millipore)への効率的かつ再現性のあるタンパク質移動を生じる。この手順は、物質、通常はタンパク質のＳＤＳ− ＰＡＧＥ分離を行なうことを包含する（一次または二次元分離、フルサイズまたはミニゲル）。通常は、予備染色した分子量マーカーを包含することが好ましく、電気泳動の際のそれらの分離、およびそれらの電気泳動による膜への移動の効率を目視により監視することができる。様々なこれらの標準が、現在市販されている。当業者に知られている総てのブロット法が、本発明に適用可能である。 Ｂ． 核酸リガンドへの物質の暴露固定された物質は、核酸リガンドに暴露して、標的化合物：核酸リガンド複合体を形成しなければならない。標的化合物抗原の核酸リガンドによる検出の手順は、免疫検出の当業者に知られているほとんどの手法と適合する。簡単にいえば、この手順は、下記のように記載することができ、またはその変法を含むことができる。本発明は、ＰＶＤＧまたはニトロセルロース膜と適合性である。非脂肪性の乾燥乳の３〜５％溶液、ウシ血清アルブミンなどは、ほとんどの非特異的結合部位を効率的にブロックする。しかしながら、含まれている炭水化物が、炭水化物決定基を認識する核酸リガンドの結合を妨害することがある。他のよく見られるブロッキング試薬としては、ＰＶＰ−４０（ポリビニルピロリドン、平均分子量＝ ４０，０００）およびTween 20のような非イオン性洗剤が挙げられる。タンパク質移動を完了した直後に、膜を（タンパク質側を上にして）皿に入れて、１００ 〜１５０ｍｌのブロッキング溶液でインキュベーションし、回転または振盪台上で室温で６〜２４時間攪拌する。次いで、膜を１００〜１５０ｍｌのＴＢＳ／アジドで２回それぞれ２０分間洗浄する。核酸リガンドを、膜をちょうど完全に被覆する容積のブロッキング溶液に溶解する。核酸リガンドの量は、核酸リガンドアフィニティーによって変化し、２０ｍｌからの範囲であることができる（ブロッキング溶液６０ｍｌ中で１〜１０ｍｌ）。核酸リガンド溶液を膜に加えて、激しく攪拌しながら約６時間インキュベーションする。具体的なインキュベーション時間は、核酸リガンドの力価および性状によって減少させることができる。 Ｃ． 標的化合物：核酸リガンド複合体の検出標的化合物：核酸リガンド複合体が一旦形成されたならば、複合体を検出しなければならない。核酸リガンドは、一連の既知の化合物の一つを含んでなることができる検出系を含んでなる。検出系としては、酵素、蛍光体、放射能標識、抗体などの使用を挙げることができる。各種の検出系は、当業者には周知である。好ましい態様では、核酸リガンドは酵素を含むこともある。酵素または蛍光体のような適当な検出残基の核酸リガンドへの付着は問題ではなく、幾つかの場合には、蛍光体をリガンド自身の化学合成の際に付着させることができる。生物発光および化学発光物質の使用により、１０ ^-15 〜１０ ^-19 Ｍの範囲の標的化合物濃度を検出することができる。この検定法の感度は、核酸リガンドがアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に付着するときには、生物発光または化学発光を用いて更に増加させることができる。もう一つの態様では、検出系は、核酸リガンド：標的化合物複合体の一部である核酸リガンドのＰＣＲ増幅であることができる。 ＰＣＲ増幅法は、当業者には周知である。この態様では、増幅に用いられるＰＣＲプライマーは、各種の検出残基またはリポーター分子を含んでなることもできる。リポーター分子は、酵素、ビオチンまたは他の既知のリポーター基であることができる。標的化合物または抗原は、酵素と接合した核酸リガンドを用いて移動膜上で直接可視化することができる。この方法に最もよく用いられる酵素である、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼは着色生成物を形成し、膜の目視検査によって検出することができる。この種の試薬の高感受性は、利点と不利な点の両方を有する。結果は迅速に得られるが、極端に感度の高い検出法を用いると、特にバックグラウンドの染色レベルが高いときには、混乱することがある。シグナル対ノイズ非が低すぎるかまたはタンパク質の最適量が膜上に固定されず、所望な情報を得ることができないときには、膜は容易に再プローブしたり、ストリッピングすることはできない。しかしながら、放射能標識を用いると、オートラジオグラフィー暴露の時間を変化させて、最適シグナルを得ることができ、膜を容易に再プローブすることができ、バックグラウンドシグナルの蓄積は、酵素接合検出で可能なものより少ない。しかしながら、検出速度が最優先の問題であることが多いので、酵素接合プロトコールが選択された方法となることがある。本発明のもう一つの態様では、ゲルシフトアッセイを含む核酸リガンド：タンパク質ブロットが挙げられる。ゲルシフトアッセイは、核酸−タンパク質相互作用の解析のための強力な方法である。このアッセイ自身は、簡単である。核酸とタンパク質を互いに混合し、溶液をポリアクリルアミドにより電気泳動に付し、 次にゲルを通常は放射能標識した核酸のオートラジオグラフィーによって核酸について分析する。タンパク質の核酸への結合により、遊離の核酸とは異なる電気泳動移動度を有する複合体を生成することができる。一般に、複合体の移動度は未結合核酸リガンドと比較して遅く、従ってゲル遅延と呼ばれることが多い。しかしながら、環状核酸物質（典型的には、２００〜４００ｂｐのミニ環）では、 核酸リガンド：タンパク質複合体は、遊離の核酸リガンドより速やかに移動することができる。遊離の核酸リガンドから複合体の分離、従って複合体の検出は、 様々な因子によって変化する。これらは、それぞれの系について実験的に決定しなければならない。しかしながら、容易に分析を行なうことができるとは、最適条件を速やかに見出だすことができることを意味する。核酸リガンド：タンパク質複合体の電気泳動移動度に影響する因子としては、タンパク質および核酸リガンドの分子量、電気泳動緩衝液のイオン強度およびｐＨ、ゲルマトリックスの濃度、および温度が挙げられる。ゲルシフトアッセイで具体化される原理は、遊離核酸リガンドと核酸リガンド： タンパク質複合体のゲルマトリックスへの侵入により、２種の物理的分離を生じることである。次の電気泳動では、タンパク質は遊離核酸リガンドの移動度と差異を作ることができず、結合した核酸リガンドがタンパク質と結合したマーカーであれば、それは特徴的な移動度を有することになる。ゲルマトリックスは、核酸リガンドから離れたタンパク質の核酸を妨げることによって複合体を安定化することができるが、複合体は可逆的に解離した後、ゲル内で再会合することができることが示されている。しかしながら、結合した核酸リガンドが電気泳動中にタンパク質から解離しても、実験の開始時に遊離であった核酸リガンドを「取り戻す」ことはできない。従って、この方法は、ゲルへの侵入の時点に結合および遊離核酸リガンドの平衡を「凍結する」可能性を有する。それぞれの種の濃度を、次に決定することができる。この種のアッセイでは、タンパク質の核酸リガンドへの結合の平衡定数、および相互作用の速度論を生じることができ、後者は核酸リガンドをタンパク質と混合した後の様々な時点での試料を分析することによって得ることができる。本発明の好ましい使用は、生理学的条件の臨床診断のための物質の試料中の標的化合物の検出である。この物質は、通常は、目的とする標的化合物を含む可能性がある、またはない生物学的材料である。このような生物学的材料としては、 血液、血漿、血清、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、および浸軟組織が挙げられる。標的化合物は、典型的には細菌、真菌、ウイルス、植物または動物供給源から誘導されたタンパク質、炭水化物または脂質である。本発明の免疫ブロットは、ヒトおよび獣医診断薬に有用である。本発明の免疫ブロットで分析することができる他の試料としては、食品および環境排出物、例えば廃液が挙げられる。例１では、ＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドを用いて、ウェスタン・ブロット法における天然では核酸に結合しない因子であるｈＶＥＧＦを信頼性よく検出することができることを示す。例２では、ＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドが、ブロット法の全細胞の細菌溶解物の混合物におけるｈＶＥＧＦを検出することができることを示す。例３および４では、ＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドが、ドットブロット法におけるｈＴＳＨおよびｈＣＧをそれぞれ検出することができることを示す。例５では、ＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドを、実際のタンパク質分析に適用することができることを示す。 例１ ブロット法における精製ｈＶＥＧＦの検出この例では、ＳＥＬＥＸによって誘導されたオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質ブロット法における天然では核酸に結合しない因子であるｈＶＥＧＦを信頼性よく検出することができることを示す。 ＶＥＧＦは、強力な内皮細胞マイトジェンおよび血管新生因子である。固形腫瘍成長および傷の治癒などの正常および異常な生理学的工程には血管新生が必要である。実際に、抗ＶＥＧＦ抗体の投与により、腫瘍の成長をイン・ビボで阻害することができる。正常および病理生理学的状態でのＶＥＧＦ濃度は現在研究中であるが、ほとんどの状況下でのその分布および生成の知識は未だ極めて限られている。本明細書で記載されるアッセイは、フルオレセインをタグとしたＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドであって、１４０ｐＭのＫｄのヒトＶＥＧＦ （配列番号：１）に結合するものからなる検出試薬を用いて行なった。このオリゴヌクレオチドＮＸ−２４４を修飾して、ヌクレアーゼ耐性とした（Green et al.(1995)Chemistry & Biology 2:683-695、本明細書に参考として引用される） 。アルカリホスファターゼと接合した抗フルオレセインｆａｂ断片と最終的にインキュベーションした後、化学発光アルカリホスファターゼ検出系または着色染料検出系を用いてシグナルを生成した。分子量標準（Bio-Rad）とｈＶＥＧＦ ₁₆₅およびｈＶＥＧＦ ₁₂₁の試料１５０ｎ ｇを、１ｍｍ厚みの１２％トリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Novex、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて分割した。電気泳動を１２ ５ボルトで９０分間行なった。次に、分割したタンパク質をImmobilon-P膜（Millipore Corp．、ベッドフォード、マサチューセッツ）に移した。 NOVEXウェスタン移動装置を用いて、製造業者(Novex Inc.)の指示に従って４０ボルトで移動を２時間進行させた。移動緩衝液は、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭ グリシン、２０％メタノール、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３からなった。膜を、 ＴＢＳ中Superblock Blocking緩衝液(Pierce Chemical Company)を用いて、室温で一晩ブロックした。翌日、膜を、ＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体（クローン２６５０３．１１）の０．５ｍｇ／ｍｌ溶液、またはフルオレセインをタグした核酸リガンド対ＶＥＧＦ、ＮＸ−２４４（配列番号：１）の１ｍｇ／ ｍｌ溶液を含む洗浄緩衝液（上記参照）中で２時間インキュベーションした。次に、膜を、洗浄緩衝液１０ｍｌで３回洗浄した。適当な検出試薬を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と接合したウサギ抗マウス抗体(Pierce Chemical Co.)の洗浄緩衝液中で１：１０００倍に希釈したもの、またはＡＰ接合抗フルオレセインＦＡＢ断片の洗浄緩衝液(Boehringer Mannheim)の洗浄緩衝液中で１：１００ ０倍に希釈したものを加えた。室温で１時間インキュベーションした後、膜を上記と同様に洗浄した後、脱イオン水１０ｍｌで更に２回洗浄した。最後に、 Western Blue基質１０ｍｌ０加えた（Promega Corp．、マジソン、ウィスコンシン）。所望な強度で、水で濯いで発色を停止した。膜を乾燥して、写真撮影をした。図１に示されるように、ブロットをモノクローナル抗体でプローブしたときには、両形態のＶＥＧＦを検出することができた。しかしながら、ブロットをＮＸ −２４４でプローブしたときには、ＶＥＧＦ ₁₆₅だけが検出された。従って、これらの結果は、ＳＥＬＥＸによって誘導されたオリゴヌクレオチドをウェスタン・ブロット法に用いることができ、オリゴヌクレオチドの特異性はモノクローナル抗体の特異性に対して相補性となることができることを示す。同様なタンパク質ブロッティング実験では、電気泳動の前に１０ｍＭをジチオトレイトールを用いて二量体を減少させると、ＮＸ−２４４は一本鎖ＶＥＧＦ ₁₆₅も検出できなかった（データは図示せず）。 例２ ブロット法における細菌の全細胞タンパク質溶解物へ添加したｈＶＥＧＦの検出この例では、各種の量のＶＥＧＦ ₁₆₅をE． coliの全細胞溶解物の１０ｍｇ分量に加えた。これらの複合タンパク質混合物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割し、電気泳動によって膜に移動し、異なるＳＥＬＥＸによって誘導された核酸リガンドを用い（ＮＸ−２９５）（配列番号：２）、化学発光検出系を用いてフィルムを露出したことを除き、例１に記載したのと同様にしてブロッティングした。ヒトＶＥＧＦ ₁₆₅試料を１００ｎｇ〜０．７５ｎｇの範囲の様々な濃度でアセトンで沈澱した全E． coli細胞溶解物１０ｍｇに加え、８０℃で５分間加熱した。タンパク質混合物を、１ｍｍ厚みの１２％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル(Novex)を用いて、分子量マーカー(Novex)と共に分割した。電気泳動を１ ２５ボルト／ゲルで１．５時間行なった。分割したタンパク質をImmobilon-P膜に、移動緩衝液中でＳＤＳを含まないこと以外は前記と同様にして３０ボルトで２時間移動した。膜を、１×ＴＢＳ、２ｇ／Ｌ ＢＳＡ、１００ｍｇ／Ｌ酵母ｔ ＲＮＡ、および０．０５％Tween 20を含む緩衝液中で室温で５分間ブロックした後、インキュベーション緩衝液（１×ＴＢＳ、２ｇ／Ｌ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ Ｌ酵母ｔＲＮＡ、および０．０５％Tween 20）で１回濯いだ。 ＮＸ−２９５をインキュベーション緩衝液に溶解２ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍを加え、室温で１時間インキュベーションした。次いで、ブロットを、インキュベーション緩衝液で４回洗浄した（それぞれ３０秒）。 Fluorx-AP（アルカリホスファターゼ接合抗フルオレセイン抗体、Novex，Inc．）をインキュベーション緩衝液で１：２０００倍に希釈したものを加え、室温で３０分間インキュベーションした。次に、膜を前記と同様にして洗浄した後、Milli-Q水を用いて２回の追加洗浄工程を行なった。膜の最終的な５分間のインキュベーションを、ＤＥＡ緩衝液（１％ｗ／ｖジエタノールアミンｐＨ１０、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２％ナトリウムアジド、および１％ｗ／ｖＣＳＰＤ）中で行なった。このインキュベーションの後、 膜をプラスチックラップで包み、フィルム（Bio-Max，Kodak）に１０分間露出した。フィルムを現像した後、デンシトメトリーをPersonal Densitometer(Molecu lar Dynamics)を用いて製造業者の指示に従って行なった。データをGraphPad Pr ism(GraphPad Prism Software)を用いて、１個の部位に結合するハイパーボーラモデルに当てはめた。この分析の結果を、図２に示す。オリゴヌクレオチドＮＸ−２９５は、この複合体混合物でＶＥＧＦを検出できることは明らかであった。オリゴヌクレオチドは幾つかの細菌タンパク質に結合したが、これは膜上でｈＶＥＧＦ濃度を定量する能力に影響を与えなかった。このような非特異的結合は、抗体についても同様に見られることがあった。図３は、図２に示したフィルムのデンシトメトリー走査の結果を示す。この曲線の形状は、典型的な飽和結合等温線であり、レーンにおける１ｎｇ程度の少量のＣＥＧＦを検出することができた。 例３ ドットブロット法を用いるｈＴＳＨの検出ドットブロット法を用いて、固有のｈＴＳＨを、シグナルとしてｈＴＳＨに対する放射能標識した核酸リガンドを用いて検出した。 ｈＴＳＨは、甲状腺ホルモンの合成を刺激する糖質ホルモンである。血清ｈＴＳＨ濃度の測定は、甲状腺機能冗進症および甲状腺機能低下症のような下垂体および甲状腺異常の診断に重要である。 ＳＥＬＥＸによって誘導された核酸リガンドであって、１９９５年６月７日出願の「絨毛性ゴナドトロピンホルモンおよび関連の糖タンパク質ホルモンに対する高アフィニティーオリゴヌクレオチドリガンド」と題する米国特許出願連続番号第０８／４８８，４０２号明細書（参考として本明細書に引用）に記載の方法でｈＴＳＨに結合するリガンドＴ−１５（配列番号：３）は、ブロット法において検出試薬として作用することができる。リガンドＴ−１５は、ｈＴＳＨとのその相互作用について２．５ｎＭのＫｄを有する高アフィニティーリガンドである。リガンドＴ−１５のｈＴＳＨに対する特異性は、特に競合ｔＲＮＡの存在下では、ｈＣＧ、ｈＬＳおよびｈＦＳＨに高アフィニティーで結合することができないことによって示されている。これらの結果は、糖質ホルモンファミリーの密接に関連した一員に対してアフィニティーを有するリガンドに対して特異的な対選択を取り込まない直接選択条件下で得た。材料および方法の多くは、例１で用いたのと同様である。デオキシオリゴヌクレオチドは、標準的なシアノエチルホスホルアミダイト化学によって合成した。 ２'−ＮＨ ₂ −修飾ＵＴＰおよびＣＴＰは、既知の方法によって合成した。 ｈＴ ＳＨ（Ｍ _T ＝２７，７００、９ＩＵ（国際単位）／ｍｇは、Becton Dickinson、 リサーチ・トライアングル・パーク、ノース・カロライナ）から入手した。 ｈＴＳＨに高アフィニティーで結合するＲＮＡリガンドを用いて、ドットブロット法におけるｈＴＳＨの存在を検出した。 ＲＮＡリガンドは、１９９５年６月７日出願の「絨毛性ゴナドトロピンホルモンおよび関連の糖タンパク質ホルモンに対する高アフィニティーオリゴヌクレオチドリガンド」と題する米国特許出願連続番号第０８／４８８，４０２号明細書（参考として本明細書に引用）に記載の方法で同定した。 ＲＮＡリガンドはＴ−１５と命名され、下記の配列を有した。 ５'−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧＡＵＧＵＵＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＵＣ ＣＧＡＣＧＧＣＧＵＡＡＣＣＵＵＧＣＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＣＣ ＣＧＡ−３'（配列番号：３）。総てのシトシンおよびウリジンは、２'−位でＯＨ基の代わりにＮＨ ₂基で修飾されていた。 ｈＴＳＨを、０．１％ｈＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＴＥＭ緩衝液（３００ｍｌ）に懸濁し、吸引しながら、予め湿潤させたニトロセルロースフィルター（０．４５ ミクロン、BioRad）に適用した。ゲル精製した内部標識した核酸リガンドＴ−１ ５（配列番号：３）を次にＴＥＭ緩衝液（０．２ピコモル／ｍｌ）５０ｍｌ中でブロットに適用し、緩やかに濾過した。フィルターを直ちに同一緩衝液中０．５ Ｍ尿素３００ｍｌで３回洗浄した。ブロットを乾燥して、ホスホルイメージャーおよびオートラジオグラフィーによって分析した。ニトロセルロース膜上にブロットした様々な濃度のｈＴＳＨ（８００ｎＭ（１ ７７ｍＩＵ／ｍｌ）〜５０ｎＭ（１１ｍＩＵ／ｍｌ））が放射能標識した核酸リガンドによって検出された結果を、図４に示す。 ｈＴＳＨの非存在下で（しかし緩衝液中ｈＳＡを用いて）ニトロセルロースフィルターに対するＲＮＡのバックグラウンド結合の極めて低いレベルは、結合緩衝液中０．５M尿素でブロットを洗浄することによって達成された。この段階はほとんどの非特異的結合を除去したが、リガンドＴ−１５のｈＴＳＨへの特異的結合はほとんど影響されないままであった。ホスホルイメージャーによる、ｈＴＳＨの入力濃度の関数としてのシグナルの定量を、図５に示す。放射能標識した未選択のランダム配列プールで得られた放射性シグナル（コントロールとして使用）は、ブロット上のｈＴＳＨの量と相関しなかった（図４および５）。しかしながら、アフィニティー選択した放射能標識したリガンドＴ−１５では、ブロット上の放射性シグナルは、用いたｈＴＳＨの濃度と相関した。放射性シグナルと１００ｍＩＵ／ｍｌまでの量には、線状関係があり、シグナルは、この濃度以上で飽和する。 例４ ドットブロット法を用いるｈＣＧの検出この例は、ｈＣＧに対する核酸リガンドが免疫ブロット法における抗体を置換することができることを示す。 ｈＣＧに結合するＳＥＬＥＸによって誘導される核酸リガンドである、リガンドＨ−４２（配列番号：４）は、１９９５年６月７ 日出願の「絨毛性ゴナドトロピンホルモンおよび関連の糖タンパク質ホルモンに対する高アフィニティーオリゴヌクレオチドリガンド」と題する米国特許出願連続番号第０８／４８８，４０２号明細書（参考として本明細書に引用）に記載の方法で、ブロット法における検出試薬として作用することができる。試験尿（妊婦から得た）およびコントロール尿（男性から得た）試料を、０．２ｍｍポリスルホンフィルター(Gelman Sciences)を介して予備濾過して、粒状物質を除去した。様々な濃度までコントロール尿に懸濁したｈＣＧ（３００ｍｌ）を、真空下で予備湿潤化したニトロセルロースフィルター（BioRad製）にブロットした。次に、ｈＣＧに対する放射能標識した核酸リガンドＨ−４２ＲＮＡ（配列番号：４ ）（１ピコモル／ｍｌ）をブロットに加え、濾過した。ブロットを、直ちにＴＥ Ｍ緩衝液３００ｍｌで２回洗浄した。ブロットを乾燥し、オートラジオグラフィーおよびホスホルイメージャー(Fuji)によって分析した。予備検討では、抗−ｈＣＧ抗体を最初にニトロセルロースに適用してｈＣＧを捕捉し、次に放射能標識したＲＮＡを持ちいてホルモンを検出した。このような抗−ｈＣＧ抗体は、ｈＣＧを緩衝液に懸濁するときにだけ必要であった。しかしながら、尿中のｈＣＧを用いたときには、抗体の存在下および非存在下で有意な差はなかった。これは、膜上にｈＣＧを有効に保持する非特異的キャリヤーとして作用する尿中の他のタンパク質の存在によるものと考えることができる。図６ は、様々な量のｈＣＧを男性尿試料（コントロール尿）に加え、放射能標識したＨ４２ＲＮＡによって検出したドットブロット法の結果を示す。図７に示されるように、ブロット上の放射能の定量は、保持された放射能標識したＲＮＡの量がｈＣＧの濃度と相関することを示している。シグナルは、高濃度のｈＣＧで飽和する（＞５００ｎＭ）。 １，９ｎＭのｈＣＧ濃度でも、バックグラウンドレベルを上回るシグナルが検出された。コントロールの男性尿（ブロット１〜３）と比較して、妊婦から得た尿（試験尿）は、ＲＮＡドットブロット法において明確なシグナル（ブロット４〜６）を与えた（図８）。コントロールブロットにおけるバックグラウンドレベルを上回るシグナルの欠如（緩衝液単独と比較して）は、 選択されたＲＮＡリガンドのｈＣＧに対する高特異性を示す。この分析法では、 しかしながら、放射性シグナルの強度は、ＲＮＡを懸濁する緩衝液の塩濃度に敏感である。低塩ＴＥＳＭ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．１Ｍｍ ＥＤＴ Ａ，１００Ｍｍ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ （ｐＨ６．０））に懸濁したＲＮＡは、標準的ＰＢＳ緩衝液に懸濁したものより高いシグナルを与えた。 例５ ＬＳ−Ｒｇの精製を行なうためのＳＥＬＥＸによって誘導された核酸リガンドタ ンパク質ブロット法の使用この例では、ＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドタンパク質ブロッティング法を実際のタンパク質分析に応用することができることを示す。この例では、ＳＥＬＥＸによって誘導された核酸リガンド、並びに抗体を用いて、組換え融合タンパク質、Ｌ−セレクチンレセプターグロブリン（ＬＳ−Ｒｇ）の精製を行なった。 ＬＳ−Ｒｇは、ヒトＩｇＧ１重鎖のヒンジＣＨ１およびＣＨ２ドメインのアミノ末端に融合したヒトＬ−セレクチンの細胞外ドメインからなっている。このタンパク質は、天竺ネズミ卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現され、分泌される。本明細書に記載の分析は、ＳＥＬＥＸ法によって誘導されたＬ−セレクチンＤ ＮＡ核酸リガンドアフィニティーカラムにＣＨＯ−細胞でコンディショニングした１０％ＦＢＳを含む培地１００ｍｌで加えることによって行なった。 ＳＥＬＥ Ｘ法によって誘導されたＬ−セレクチンＤＮＡ核酸リガンド、５'−ＢＧＣＧＧ ＴＡＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧＣＧＣ−３'（ 配列番号：５）は、Operon Technologies Inc.から得られ、「Ｂ」は５'−末端に結合したビオチンを示す。このＳＥＬＥＸ法によって誘導された核酸リガンドは、１９９５年６月７日出願の「レクチンに対する高アフィニティー核酸リガンド」と題する米国特許出願連続番号第０８／４７９，７２４号明細書に記載のＬＤ２０１（配列番号：６）の修飾体であり、前記特許明細書の内容は本明細書にその全体を参考として引用される。実験は、室温で１．１ミリグラムアプタマー(aptamer)／ｍｌ樹脂の密度を有する１ｍｌ（０．５ｃｍ×５ｃｍ）カラムを用いて室温で行なった。用いた流速は０．７５ｍｌ／分（２３０ｃｍ／時、線形流速）であった。添加を完了したならば、吸光度がベースラインに戻るまで、カラムをダルベッコのＰＢＳで洗浄した。カラムを次に線形グラディエント（０ｍ Ｍ〜５０ｍＭ、１０分）で溶出した。精製の進行を分析するため、カラム充填物（Ｌ）、フロー・スルー（Ｆ／Ｔ） および溶出画分（Ｅ）からの総タンパク質の１μｇを４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドグラディエントゲル上で分割し、これを総タンパク質について染色し、またはタンパク質ブロッティング分析のために用いて、ＬＳ−Ｒｇの分布を決定した（図９Ａ〜９Ｄ）。図９Ａ〜９Ｄのレーンは、右側に示した各マーカー（キロダルトン）についての大きさと共に分子量マーカーを含む。溶出画分における主要な種（図９Ａ〜９Ｄのレーン３）は、ＬＳ−Ｒｇタンパク質である。 アフィニティーカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析クーマジー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＬＳ−Ｒｇについて予想された分子量の単一バンドだけを溶出画分（図９Ａ）で検出することができた。 １μ ｇの総タンパク質を用いて銀染色分析を行なったところ、多数の低レベルの混入物が認められた（図９Ｂ）。 アフィニティーカラム画分のタンパク質ブロット分析 Ｌ−セレクチンに特異的なモノクローナル抗体ＤＲＥＧ５６（図９Ｃ）またはＳＥＬＥＸ法によって誘導されたＬ−セレクチンに特異的なＤＮＡ核酸リガンド（配列番号：５）（図９Ｄ）を検出試薬として用いるタンパク質ブロット分析により、同様な結果を得た。いずれの手法でも、クーマジーおよび銀染色したＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ分析（上記参照）によって同定した溶出画分中の主要なタンパク質はＬＳ−Ｒｇであることを示していた。いずれの方法でも、カラム充填物またはフロー・スルー画分のＬＳ−Ｒｇを検出することはできなかった。ヒトＬ−セレクチンに特異的な抗体ＤＲＥＧ５６（ＬＥＣＡＭ−１）を、 Endogen、ケンブリッジ、マサチューセッツから得た。分子量標準(Novex)およびタンパク質試料を、１ｍｍ厚みのトリス−グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４〜１２％アクリルアミドグラディエントゲル、Novex、サンデイエゴ、 カリフォルニア）を用いて分割した。電気泳動を１５０ボルトで９０分間行なった。ブロットに対して、分割したタンパク質を電気泳動によってImmunobilon-P 膜（Millipore Corp．、ベッドフォード、マサチューセッツ）に移した。移動は、Novexウェスタン移動装置を用いて、製造業者の指示に従って４０ボルトで２ 時間行なった。移動緩衝液は、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、 ２０％メタノール、ｐＨ８．３からなった。膜を、ＴＢＳ中Superlock緩衝液（Pierce Chemical Company、ロックフォード、イリノイ）で室温で一晩ブロックした。翌日に、膜を、Ｌ−セレクチン特異的ネズミモノクローナル抗体（ＤＲ ＥＧ５６）の１ｍｇ／ｍｌ溶液またはビオチンをタグとしたヒトＬ−セレクチン核酸リガンド（配列番号：５）の１．６ｍｇ／ｍｌを含むＳＨＭＣＫ＋緩衝液［２０ｍＭHepes，ｐＨ７．３５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ ｍＭ ＣａＣｌ ₂ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ 、０．５ｇ／Ｌカゼイン（I-block， Tropix）および０．０５％Tween 20（Bio-Rad Laboratories，Inc.、ハーキュルス、カリフォルニア）］中で２時間インキュベーションした。次に、膜を、ＳＨ ＭＣＫ＋緩衝液１０ｍｌで３回洗浄した。適当な検出試薬、ＡＰ−接合ウサギ抗マウス抗体(Pierce Chemical Co.)のＳＨＭＣＫ＋緩衝液での１：１０００倍希釈液、またはＡＰ−接合ストレプトアビシン(Tropix)のＳＨＭＣＫ＋緩衝液での１：１０００希釈液を加えた。室温で１時間インキュベーションした後、膜を前期と同様に洗浄した後、脱イオン水で更に２回洗浄した。最後に、ウェスタン・ ブルー基質１０ｍｌ(Promega Corp.、マジソン、ウィスコンシン)を加えた。所望なシグナル強度で、膜を脱イオン水で洗浄して、色現像を停止した。 ＤＲＥＧ ５６抗体を用いるタンパク質ブロット分析は、溶出画分に３個の特異的バンドの存在を示したが、ＬＳ−Ｒｇは、充填物およびカラムフロー・スルー画分には検出されなかった（図９Ｃ）。ビオチン化したＳＥＬＸ法によって誘導されたＤＮ Ａ−核酸リガンド（配列番号：５）を用いるタンパク質ブロットでは、同様な結果を示した（図９Ｄ）。両タンパク質ブロット分析によって検出された主要なバンドは、クーマジー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定された主要なバンドに相当した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ゴールド，ラリー アメリカ合衆国80302 コロラド州ボール ダー，フィフス ストリート 1033