Non-labeled assay implementation method using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor

優先権
本出願は以下の米国出願の一部継続出願である：出願番号１０／２３７，６４１（２００２年９月９日出願；本願は２００２年８月２６日出願の出願番号１０／２２７，９０８（発明の名称：アミン化学表面活性化方法およびプラスティック比色共鳴バイオセンサーの試験法）および２００２年６月２６日出願の出願番号１０／１８０，３７４（発明の名称：比色共鳴バイオセンサーマイクロアレイ読取装置）の一部継続出願である）、および出願番号１０／１８０，６４７（２００２年６月２６日出願）（発明の名称：比色共鳴バイオセンサーマイクロタイタープレート読取装置）（本願は２００２年１月２８日出願の出願番号１０／０５９，０６０および２００２年１月２８日出願の出願番号１０／０５８，６２６（本出願は２００１年８月１５日出願の出願番号０９／９３０，３５２の一部継続出願である；この出願は２０００年１０月３０日出願の米国仮出願番号６０／２４４，３１２、２００１年４月１２日出願の仮出願番号６０／２８３，３１４、および２００１年７月３日出願の仮出願番号６０／３０３，０２８の恩典を主張するものである）；これらすべての出願はその全文を参照により本発明の一部とする。

技術分野
本発明は生体分子の相互作用を検出する方法に関する。 当該検出は標識を使用せずに実施可能であり、大量処理方式で実施することができる。 本発明はまた光学装置にも関係する。

ヒトゲノム配列決定の終了とともに、次の大きな分子生物学のチャレンジの一つは、ＤＮＡがコードする多くのタンパク質標的が、他のタンパク質、小型分子医薬候補、および大型宿主の酵素およびインヒビターとどのように相互作用するのかを理解することであろう。 例えば以下を参照：Pandey & Mann, "Proteomics to study genes and genomes （遺伝子およびゲノム研究のプロテオミクス），” Nature, 405, p.837-846, 2000; Leigh Anderson et al., "Proteomics: applications in basic and applied biology （プロテオミクス：基礎および応用生物学での適用），” Current Opinion in Biotechnology, 11, p.408-412, 2000; Patterson, "Proteomics: the industrialization of protein chemistry （プロテオミクス：タンパク質化学の工業化），" Current Opinion in Biotechnology, 11, p.413-418, 2000; MacBeath & Schreiber, "Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination （高性能機能判定用マイクロアレイとしてタンパク質をプリント），" Science, 289, p.1760-1763, 2000; De Wikit, et al., "Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions （抗体−抗原相互作用の高性能スクリーニング用抗体アレイ），" Nature Biotechnology, 18, p.989-994, 2000。 この目的のため、多くの異なる生体分子相互作用を高感度で同時に定量する能力を有する手段は、医薬の発見、プロテオミクス、および診断学に適用し得るであろう。 さらに、広範な用途を見出すためのこれらの手段は、使用が簡単であり、保有または操作において低価格であり、広範囲の分析対象に適用できなければならない；分析対象とは、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、小型タンパク質、抗体、および場合によっては全細胞である。

バイオセンサーは、オリゴヌクレオチド、抗体−抗原相互作用、ホルモン−レセプター相互作用、および酵素−基質相互作用などの様々な生体分子複合体を検出するために開発された。 一般に、バイオセンサーは２つの構成成分、すなわち、高特異的認識要素および該分子の認識事象を定量可能なシグナルに変換するトランスデューサーからなる。 シグナル変換は多くの方法により達成し得る；例えば、蛍光、干渉分析(Jenison et al., "Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon （光学的被覆シリコン上での核酸の干渉にもとづく検出），" Nature Biotechnology, 19, p.62-65; Lin et al., "A porous silicon-based optical interferometric bioscensor （多孔性シリコンベースの光干渉分析バイオセンサー），” Science, 278, p.840-843, 1997)、および重量法(A. Cunningham, Bioanalytical Sensors （生物分析センサー）,John Wiley & Sons (1998))。

光学に基づく変換法の内、分析対象の蛍光化合物による標識を必要としない直接法は、アッセイが比較的簡単であること、また小型分子と容易に標識されないタンパク質との相互作用を検討することが可能であることのため、興味の対象となる。 直接光学法とは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）(Jordan & Corn, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurement of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surface （化学修飾金表面上に静電気的に吸着させたバイオポリマーの表面プラズモン共鳴イメージング測定），” Anal. Chem., 69: 1449-1456 (1997))、回折格子カプラ(Morhard et al., "Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by optical diffraction （光回折による細胞検出用マイクロパターンにおける抗体の固定化），” Sensors and Actuators B, 70, p.232-242, 2000)、エリプソメトリー(Jin et al., "A biosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interaction （生体分子相互作用の可視化用のイメージングエリプソメトリーにもとづくバイオセンサー概念），” Analytical Biochemistry, 232, p.69-72, 1995)、エバネッセント波装置(Huber et al., "Direct optical immunosensing (sensitivity and selectivity)(直接光免疫検出），” Sensors and Actuators B, 6, p.122-126, 1992)、および反射光測定(Brecht & Gauglitz, "Optical probes and transducers （光プローブとトランスデューサー），” Biosensors and Bioelectonics, 10, p.923-936, 1995)などである。 これら検出法の理論的に予測される検出限界は決定されており、診断学的に適切な濃度範囲まで下げ得ることが実験的に確認されている。 しかし、これまでこれらの方法では、ハイスループット生体分子相互作用分析にもっともよく使用されるマイクロタイタープレートベースの、またはマイクロアレイベースの基盤と容易に調和する方式で、いずれのタイプの標識もなしに高感度のアッセイを実施し得る、市販品として利用可能なハイスループットの装置はまだ得られていない。 従って、これらのゴールを達成し得る方法が当該技術分野において必要とされている。

一態様において、本発明は比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器を提供する。 比色共鳴反射光バイオセンサーは容器の内部表面を構成する。 １種以上の特異結合物質は、比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器の内面上、２ヶ所以上の異なる位置に固定化する。 該容器はマイクロタイターウエル、試験管、ペトリ皿または微量液体チャネルでありうる。

本発明のもう一つの態様は、１個以上のマイクロタイターウエルを含んでなるマイクロタイタープレートを提供し、ここで、１個以上のマイクロタイターウエルの底面は比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる。 １種以上の特異結合物質は各マイクロタイターウエルの底面上の２ヶ所以上の異なる位置に固定化する。

本発明のなおもう一つの態様は、１種以上のタイプの細胞の１種以上の特異結合物質への結合を検出する方法を提供する。 該方法は１種以上のタイプの細胞を容器の内面に加えることを含み、ここで、該容器の内面は比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなり、比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器の内面には、２ヶ所以上の異なる位置に１種以上の特異結合物質が固定化されている。 該容器に光を照射し、１つ以上のピーク波長値（ＰＷＶ）を各異なる位置について測定する。 １種以上の細胞が１種以上の特異結合物質に結合した場合、ＰＷＶは１種以上の細胞が結合した異なる位置でシフトする。 該容器はマイクロタイターウエル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿または微量液体チャネルであり得る。 該１種以上の特異結合物質は比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器の内面の異なる位置のアレイに配置し得る。 該異なる位置は直径約５０〜５００ミクロンのスポットのアレイを規定する。 １種以上の特異結合物質は、比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器の内面上に、物理的吸着、化学結合、電気化学的結合、静電気的結合、疎水性結合および親水性結合からなる群より選択される方法により固定化し得る。 １種以上の特異結合物質は、核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ溶液、ＲＮＡ溶液、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド溶液、コンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物を含む溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ'） ₂フラグメント、Ｆｖフラグメント、小型有機分子、細胞、ウイルス、バクテリア、ポリマーおよび生物サンプルからなる群より選択される。

本発明のさらにもう一つの態様は、１種以上の細胞の１種以上の特異結合物質への結合を検出する方法を提供する。 該方法は１種以上の特異結合物質を容器の内面上の２ヶ所以上の異なる位置に固定化することを含み、ここで、該容器の内面は比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる。 該容器を光で照射する。 １つ以上のピーク波長値（ＰＷＶ）を各異なる位置について測定する。 １種以上の細胞を容器の内面に加える。 該容器を光で照射する。 １つ以上のピーク波長値（ＰＷＶ）を各異なる位置について測定する。 細胞を加える前に測定したＰＷＶを細胞を加えた後に測定したＰＷＶと比較する。 １種以上の細胞が特異結合物質に結合すると、ＰＷＶは細胞が結合した異なる位置でシフトする。

図面の簡単な説明
図１Ａは、光がバイオセンサーの底部を照射したとして示した場合のバイオセンサーの断面図を示す；ただし、光は上方または下方のいずれからもバイオセンサーを照射し得る。 図１Ｂは、光がバイオセンサーの底部を照射したとして示した場合のバイオセンサーの模式図を示す；ただし、光は上方または下方のいずれからもバイオセンサーを照射し得る。

図２は、本発明の方法および組成物に従って作製される一次元回折格子を含む比色共鳴反射光バイオセンサーの一態様を示す。

図３は、四角（図３Ａ）または孔（図３Ｂ）の角型グリッドを含む回折格子を示す。

図４は、正弦波的に変化する回折格子の輪郭を利用するバイオセンサー断面の輪郭を示す。

図５は、１セットの同心リングからなる共鳴反射または透過フィルター構造を示す。

図６は、図５の同心円形構造に近似するが、照射ビームを特定のグリッド位置の中心に置く必要のない六方グリッドの孔（または六方グリッドの標柱）を含む共鳴反射または透過フィルター構造を示す。

図７は、タンパク質単層などの吸着された物質が三次元回折格子を含むバイオセンサーの反射波長をどのように増加させるかを示す模式図である。

図８は、３つのタイプの表面活性化化学（アミン、アルデヒド、およびニッケル）を示す；ここでは種々のタイプの生体分子レセプターをバイオセンサーに共有結合により接着させるために、相当する化学リンカー分子を使用し得る。

図９は、バイオセンサー表面上で検出されたＤＮＡまたは検出されたタンパク質などの結合パートナーの集団を増幅するために使用し得る方法を示す。

図１０は、検出ビームの入射角の関数としてのバイオセンサーの共鳴波長を示す。

図１１は、照射するファイバーとバイオセンサーからの反射光を集めるファイバーを２つ組み合わせたファイバーの使用例を示す。

図１２は、照射光と反射光をバイオセンサーへの共通の平行化光路に分配することの可能なビームスプリッターの使用例を示す。

図１３は、検出システムの模式図を示す。

図１４は、生化学物質のインビボ検出用ファイバープローブの先端に存在するバイオセンサーの一例を示す。

図１５は、ＰＢＳに溶解し、次いでバイオセンサー上で乾燥させたＢＳＡの濃度に対するピーク共鳴波長の依存性を示す。

図１６ＡはＮＨ ₂表面化学で活性化し、ビオチンレセプター分子に結合したバイオセンサーについて種々濃度でストレプトアビジンを検出した結果を示す。 図１６Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図１７Ａはヤギ抗体レセプター分子を用いる抗ヤギＩｇＧの検出用アッセイを示す。 検出表面をＢＳＡブロックすることで、バイオセンサー上に取り込まれたＢＳＡの質量により、明らかに測定可能なバックグランドシグナルを生じる。 抗ヤギＩｇＧの６６ｎＭ濃度は、バックグランドシグナルを超えて容易に測定される。 図１７Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図１８Ａは抗ヒトＩｇＧインターフェロン・ガンマ（ＩＮＦ−ガンマ）レセプター分子および神経増殖因子（ＮＧＦ）陰性対照を用いるＩＮＦ−ガンマの非標識ＥＬＩＳＡアッセイ法を示す。 図１８Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図１９Ａは５−アミノ酸ペプチド（ＭＷ＝８６０）の検出と、引き続く酵素カスパーゼ−３を用いるｐＮＡ標識（ＭＷ＝１３０）の切断を示す。 図１９Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図２０Ａは３つの別個のタンパク質層の結合を連続的にモニターした際の液体中の共鳴ピークを示す。 図２０Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図２１Ａは図２１に示したデータから数学的に決定した終末点の共鳴頻度を示す。 図２１Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図２２ＡはＩｇＧ結合の動力学的結合を測定したものを示す。 図２２Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図２３Ａはバイオセンサー表面から結合タンパク質を切断するプロテアーゼを動力学的に測定したものを示す。 図２３Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図２４は、試験溶液のピーク共鳴波長のプロットを示す。 アビジン溶液はアビジン＋ＢＳＡ溶液およびアビジン＋ｂ−ＢＳＡ溶液に比較するための基線対照として採用した。 アビジンにＢＳＡを加えても、２つのタンパク質が相互作用するとは期待されないので、共鳴波長の増加はほんのわずかなものとなる。 しかし、ビオチンとアビジンは非常に強く結合するので（Ｋｄ＝１０ ^-15 Ｍ）、アビジン＋ｂ−ＢＳＡ溶液はより大きな結合タンパク質複合体を含むであろう。 従って、アビジン＋ｂ−ＢＳＡ溶液のピーク共鳴波長値はアビジン＋ＢＳＡに比べて大きなシフトを提供する。

図２５は、センサー表面にＮＨ ₂ 、ＮＨ ₂ ＋（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、およびＮＨ ₂ ＋（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン）分子を付着させることにより記録した、固定化化学官能基をもたないセンサーを対照とするＰＷＶシフトを示す。 誤差バーは７個のマイクロタイタープレートウエルについて記録したＰＷＶシフトの標準偏差を示す。 このデータはセンサーが清浄表面と固定化ＮＨ ₂をもつ表面とを識別し得ること、またＮＨＳ−ＰＥＧ（分子量約２０００ダルトン）分子の付加を明瞭に識別することを示している。 ＮＨＳ−ＰＥＧおよびＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン（分子量約３４００ダルトン）を固定化した表面の差も測定可能である。

図２６Ａ−Ｃは、種々濃度の抗ビオチンＩｇＧ（０〜８０ｍｇ／ｍｌ）に接触させ、２０分間インキュベートしたときのＰＷＶシフト応答をバイオセンサーに対する時間関数として示す。 ＮＨＳ−ＰＥＧ表面（図２６Ｂ）の応答は最低であるが、他方、アミン活性化表面（図２６Ａ）は高濃度の抗ビオチンＩｇＧとの非特異的相互作用が低レベルであることを示している。 ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン表面（図２６Ｃ）は、抗ビオチンＩｇＧとの強力な特異的相互作用が、接触した抗ビオチンＩｇＧの濃度に比例して強いＰＷＶシフトを生じることを示している。

図２７は、図２６の抗ビオチンＩｇＧ濃度の関数としてプロットした図２６Ｃから２０分後のＰＷＶシフトの大きさを示す。 ＩｇＧ濃度と測定したＰＷＶシフトとの間には大まかな直線の相関が認められ、最低濃度のＩｇＧ溶液（１．２５ｍｇ／ｍｌ、８．３３ｎＭ）は陰性対照ＰＢＳ溶液を超えて明らかに測定可能である。

図２８は、比色共鳴反射光バイオセンサー上で生育した軟骨細胞を利用する細胞形態学アッセイの結果を示す。 該細胞はアッセイ全般でバイオセンサーの表面に付着させたままで観察した；軟骨細胞を含むバイオセンサーウエルに２ｍｇ／ｍｌのトリプシンを添加することで観察されるＰＷＶの低下は、軟骨細胞の形態の変化を物語っている。

図２９は、腎臓腫瘍細胞を用いる細胞接着アッセイの結果を示す。 バイオセンサーの表面で生育した腎臓腫瘍細胞を含む６個のバイオセンサーウエルにトリプシンを加えた。 ３段階のトリプシン濃度のそれぞれについて２個のウエルは２回の繰り返し用サンプルとして利用した。 トリプシンの添加により、ＰＷＶの低下が観察され、センサー表面から細胞が脱離したことを示す。

図３０は、バイオセンサーの角走査システムの一例を示す。

図３１は、マイクロアレイとして使用するバイオセンサーの一例を示す。

図３２Ａ−Ｂは、比色共鳴反射バイオセンサーを組み込んだ２つのバイオセンサー方式を示す。 図３２Ａはマイクロタイタープレートに組み込んだバイオセンサーを示す。 図３２Ｂはマイクロアレイスライド方式のバイオセンサーを示す。

図３３は、高濃度および高能率でアッセイを実施するためのバイオセンサープラットホームを用いる複数アレイのアレイ概念図を示す。

図３４Ａはストレプアビジンレセプター層の付着により引き起こされる測定共鳴波長シフトと、引き続くビオチニル化ＩｇＧの検出を示す。 図３４Ｂはバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

図３５Ａは比色共鳴反射バイオセンサーマイクロアレイ上の、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、およびヒトＩｇＧのスポットを示す。 図３５Ｂは抗ヒトＩｇＧをセンサー表面上に流した結果を示すが、ヒトＩｇＧと抗ヒトＩｇＧ間のより大きな結合を示している。

図３６Ａはセンサー表面上に固定化したポリＴについて、ポリＴ、ポリＡおよびＴ７プロモーターで固定化したオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション親和度の差を示す。 図３６Ｂは終末点データを誤差バーとともに示す。

図３７は、特異性の一例を示すが、これによりタンパク質−ＤＮＡの相互作用、この場合はＴ７−プロモーターＤＮＡとＴ７ＲＮＡポリメラーゼ間の相互作用が検出できる。

図３８は、細胞−タンパク質相互作用アッセイの模式図を示す。

図３９は、細胞−タンパク質相互作用アッセイの結果を示す。

比色共鳴反射光バイオセンサーは、蛍光タグ標識、比色標識または他の如何なるタイプのタグもしくは標識をも使用せずに、バイオセンサー表面上での生化学的相互作用の測定を可能とする。 バイオセンサー表面は平行白色光で照射したときに、狭い波長帯のみを反射するように設計した光学構造を含む。 狭い波長帯は波長「ピーク」と記述される。 「ピーク波長値」（ＰＷＶ）は、生体物質などの物質がバイオセンサー表面上に付着するか、またはそこから除去された場合に変化する。 読み取り装置は、平行白色光でバイオセンサー表面上の異なる位置を照射して平行反射光を集めるために使用する。 集めた光はＰＷＶを決定する波長分光計に集める。

バイオセンサー構造物は、標準的な使い捨て実験室器具、例えば、マイクロタイタープレートなどに、底部未処理マイクロタイタープレートカートリッジの底部に構造物を（バイオセンサー面を上向きにして）結合させることにより組み込むことができる。 バイオセンサーを共通の実験室方式のカートリッジに組み込むことは、ミキサー、インキュベーター、および液体分散装置など、既存のマイクロタイタープレート処理装置に適合し得るため望ましい。

本開示に規定されるアッセイ方法それぞれの機能的な利点は、比色共鳴反射バイオセンサーの性質から生じるものである。 第一に、標識を使用することなしに生化学的相互作用を測定する。 第二に、多くの相互作用を同時にモニターし得る。 第三に、平行して行うアッセイを分離し液体を閉じこめるために、標準的マイクロタイタープレートにバイオセンサーを組み込む。

ゲノミクス、プロテオミクス、医薬化合物スクリーニング、および臨床診断応用のために現在実施されている主要なアッセイ法では、一般に、蛍光または比色化学標識を研究対象の分子に付着させるため、これらを容易に目視することができる。 標識の付着はアッセイの複雑さを増し、コンホメーションの改変またはエピトープの遮蔽によって分子の機能を変化させる可能性があるので、様々な無標識バイオセンサー技法が出現しつつある。 無標識検出の現象論としては、検出される分子に対し高い親和性をもつレセプター分子で活性化される表面上の、質量、マイクロ波透過線特性、微小片持ち梁（カンチレバー）の偏向、または光学密度などの変化を測定することが挙げられる。 無標識バイオセンサー技法は、製造と包装に費用のかからない方式で高検出感度と高検出平行度を提供する能力において、広範に市場で受入れられることに制限があった。 例えば、バッチ式の写真平板、エッチングおよび蒸着法で半導体またはガラスウエハー上に作り上げるバイオセンサーは、そのバイオセンサーの面積が大量の平行アッセイを含ませるに十分な大きさとするならば、それを製造・包装するために高価なものとなる。 同様に、アレイに個々のバイオセンサーを電気的に接続する必要のある場合は、包装費用およびバイオセンサーを液体に接触させる上での適合性という難しい問題が生じる。

定義
比色共鳴反射光バイオセンサー：
「比色共鳴反射光バイオセンサー」は、本明細書ではバイオセンサーとも称するが、本明細書ではサブ波長構造化表面（ＳＷＳ）バイオセンサーおよび表面レリーフ体積回折（ＳＲＶＤ）バイオセンサーと定義する。 例えば以下を参照：米国特許出願第１０／０５９，０６０、標題「共鳴反射マイクロアレイ」および米国出願番号１０／１８０，３７４および米国出願番号１０／１８０，６４７。

全特異結合物質：
「全特異結合物質」とは、本明細書にて使用する場合、実質的に対象分子の全体をいい、例えば、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面から全特異結合物質を切断し、実質的に完全な天然の特異結合物質を生じる。

マイクロタイタープレート：
「マイクロタイタープレート」とは、本明細書にて使用する場合、２、６、８、２４、４８、９６、３８４、１５３６または３４５６ウエル方式、または他の数のウエルを有するマイクロタイタープレートまたはマルチウエルプレートと定義する。

テスト試薬：
「テスト試薬」とは、本明細書にて使用する場合、任意の酵素または化学物質およびその溶液をいう。 酵素の例は、制限されるものではないが、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、リアーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、リガーゼ、キナーゼおよびホスファターゼである。 酵素、化学物質およびその溶液に加えて、「テスト試薬」はそのバッファーブランクをもいう。 バッファーブランクは他の列挙したテスト試薬に加えるべきものと同一の組成の試薬または溶液をいい、酵素成分は除いたものである。

半透過性内部スリーブ：
「半透過性内部スリーブ」は、あるいは本明細書では「インサート」または「スリーブ」ともいうが、細胞増殖を支持し得る多孔性材料と定義する。 半透過性内部スリーブはスリーブ表面で増殖した細胞から分泌、放出、または放散されるタンパク質またはその他の分子に対しては透過性であるが、全細胞に対しては非透過性である。 半透過性内部スリーブは一般に、分泌、放出あるいは放散された成分ががスリーブを介して遊離拡散し得るよう、特異結合物質が結合するバイオセンサーの表面から、またはバイオセンサー表面上の増殖培地もしくはバッファー表面から短い距離に保持される。 半透過性内部スリーブは、マイクロタイタープレートのウエル内にまたはウエルなしでも、上記定義のように、いずれのタイプの比色共鳴反射光バイオセンサー上にも置くことができる。

バイオセンサーの表面、またはバイオセンサー表面上の増殖培地もしくはバッファーの表面と「接触を維持する」半透過性内部スリーブは、本明細書において以下のように定義される；（１）スリーブはバイオセンサーの表面にきわめて接近しているが、直接物理的に接触しないように設置される；（２）スリーブはバイオセンサー表面上に位置するバッファーまたは増殖培地の表面と物理的に接触するように設置される；または（３）半透過性内部スリーブを介して細胞から分泌、放出あるいは放散される分子の拡散が容易であるような、好ましくは阻害されないような方法で設置または接続される。 「接触を維持する」とは「バイオセンサー表面に隣接」して位置させること、または取り付けることをいう。

半透過性内部スリーブとして使用される材料のタイプは、例えば、テレフタル酸ポリエチレン（ＰＥＴ）またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）など、市販品として入手可能な細胞培養インサート（ＢＤファルコン、ミリポア）内で使用される材料でよい。

阻害活性：
「阻害活性」とは、別の分子が触媒活性を発揮するのを遅らせるか、または停止させる分子または化合物の能力と本明細書では定義する。 例えば、プロテアーゼの阻害活性を有する化合物は、プロテアーゼがタンパク質を切断するのを阻害する。 かかる阻害活性は触媒分子「に対抗して」発揮される。 「阻害活性」はまた、結合パートナーが特異的結合物質に結合するのを実質的に阻害するか、または一部阻害する分子または化合物の能力をも意味する。

核酸：
「核酸」は３'，５'−ホスホジエステル結合により連結されている天然もしくは非天然のヌクレオチドまたはその誘導体の一本鎖または二本鎖ポリマーと本明細書では定義する。

オリゴヌクレオチド：
「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合により連結されている天然もしくは非天然のヌクレオチドまたはその誘導体の一本鎖または二本鎖ポリマー配列と本明細書では定義する。 「オリゴヌクレオチド」は一般に、長さが約２０塩基以下の短鎖ポリヌクレオチドをいい、その数を超えるものは優先的にポリヌクレオチドという。

タンパク質：
「タンパク質」とは特定の配列でペプチド結合により連結されている天然もしくは非天然アミノ酸またはその誘導体の線状ポリマーと本明細書では定義する。

ペプチド：
「ペプチド」とは加水分解によりアミノ酸を生じ、タンパク質の基礎となるビルディングブロックを形成する一群の分子の任意のものと本明細書では定義する。 一般に、短鎖ポリペプチドまたはタンパク質フラグメントをいう。

コンビナトリアル化学ライブラリー：
「コンビナトリアル化学ライブラリー」とは、成分となるビルディングブロック材料の組み合わせから種々の方法で生じる多様な分子のセットと本明細書では定義する。

細胞膜：
「細胞膜」とは、細胞の外部制限脂質二層膜と本明細書では定義する。

組織：
「組織」とは細胞、多くの場合は混合型の細胞の一群であって、通常細胞外マトリックスにより一緒に保持されて特定の機能を遂行する細胞と本明細書では定義される。 また、より一般的な意味で、「組織」は共通の因子から生じる細胞型の生物学的分類をいう；例えば、結合組織では共通の特徴はその機能にあり、上皮組織では共通の因子は組織化のパターンである。

レセプター：
「レセプター（受容体）」は、より可動性のもの（リガンド）に高い特異性で結合または応答する膜結合性または膜封入性の分子と本明細書では定義する。

リガンド：
「リガンド」とは別の分子に結合する分子と本明細書では定義する。 通常の用法においては、ホルモンまたは神経伝達物質などの、レセプターに結合する可溶性分子である。 また、本明細書における「結合物質」に類似している。

サイトカイン：
「サイトカイン」は細胞が放出するタンパク質であって、他の細胞の挙動に影響するタンパク質と本明細書では定義する。 「ホルモン」に類似しているが、この用語はインターロイキン、リンホカインおよび数種の関連するシグナル伝達分子、例えば、ＴＮＦおよびインターフェロンなどに対する一般的単語として使用される傾向にある。

ケモカイン：
「ケモカイン」は白血球の走化性を刺激する小型分泌タンパク質と本明細書では定義する。

細胞外マトリックス物質：
「細胞外マトリックス物質」は細胞が産生し、周囲の媒質に分泌するが、通常は動物組織の非細胞部分に適用される物質と本明細書では定義する。

抗原：
「抗原」は免疫応答を誘発する物質と本明細書では定義する。 抗原決定基はエピトープと呼ばれ、担体分子の環境におけるエピトープ（同じ分子の任意の一部であり得る；例えば、ボツリスム神経毒Ａ（単一分子）は３つの異なるエピトープを有する。参照：Mullaney et al., Infect Immun 2001 Oct; 69(10): 6511-4)は、担体分子を抗原として活性にする。 通常、抗原は動物にとって外来物であり、そこで免疫反応を生じる。

ポリクローナル抗体：
「ポリクローナル抗体」は、全動物におけるように、Ｂリンパ球の数種のクローンが産生する抗体と本明細書では定義する。 通常、免疫された動物において生じた抗体をいう。

モノクローナル抗体：
「モノクローナル抗体」は、身体内であるか、培養におけるかを問わず、単一のクローン起源を有する細胞株と本明細書では定義する。 モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞の単一クローンにより産生され、従って、単一種の抗体分子である。

一本鎖抗体（Ｓｃｆｖ）：
「一本鎖抗体（Ｓｃｆｖ）」とは組換え融合タンパク質であって、軽鎖および重鎖（ＶｈおよびＶｌ）の２つの抗原結合領域が連結ペプチドにより連結されているものと本明細書では定義する。 連結ペプチドは、異種生物における軽鎖および重鎖両方の同等の発現を可能とし、該タンパク質を安定化する。

Ｆ（Ａｂ）フラグメント：
「Ｆ（Ａｂ）フラグメント」は、パパイン処理により調製される免疫グロブリンのフラグメントと本明細書では定義する。 Ｆａｂ フラグメントは１本の軽鎖がジスルフィド結合を介して重鎖の一部に連結したものからなり、１つの抗原結合部位を含む。 それらは一価の抗体と見なされる。

Ｆ（Ａｂ'）２フラグメント：
「Ｆ（Ａｂ'）２フラグメント」は、免疫グロブリン分子のＮ−末端のペプシン攻撃部位をペプシン加水分解することにより得られる約９０ｋＤａのタンパク質フラグメントと本明細書では定義する。 Ｆａｂとそれにジスルフィド結合によりつながるＦｃフラグメントの短い区分を含む。

Ｆｖフラグメント：
「Ｆｖフラグメント」は免疫グロブリン分子のＦａｂフラグメントのＮ−端部分であって、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変部分からなるものと本明細書では定義する。

小型有機分子：
「小型有機分子」とは、上に定義した有機分子（例えばポリペプチド）の一つとして他に分類されない小さい炭素含有分子と本明細書では定義する。

サブ波長構造化表面（ＳＷＳ）バイオセンサー
本発明の一態様において、サブ波長構造化表面（ＳＷＳ）は、特異結合物質または結合パートナーまたは両方など、生物物質の相互作用を高感度で追跡するために使用し得る特定波長でのシャープな光共鳴反射を創出するために使用する。 比色共鳴反射回折格子表面は特異結合物質の表面結合プラットホームとして作用する。

サブ波長構造化表面は薄膜コーティングの効果を模倣し得る回折光学の一般的ではないタイプのものである。 (Peng & Morris, "Resonant scattering from two-dimensional gratings （二次元格子からの共鳴散乱），” J. Opt. Soc. Am. A, Vol.13, No.5, p.993, May 1996; Magnusson & Wang, "New principle for optical filters （光学フィルターの新しい原理）”， Appl. Phys. Lett.,61, No.9, p.1022, August, 1992; Peng & Morris, "Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional graings （二次元格子からの回折における共鳴異常の実験的証明），” Optics Letters, Vol.21, No.8, p.549, April, 1996)。 ＳＷＳ構造は一次元、二次元、または三次元の格子を含み、その格子周期は入射光の波長に比較して小さく、その結果、反射および透過ゼロ次以外の回折次数は伝搬が許されない。 ＳＷＳ表面の狭帯域フィルターは、基板層と格子溝を覆う被覆層との間にサンドイッチされた格子を含むことができる。 任意に、被覆層は使用しなくてもよい。 格子領域の屈折有効指数が基板または被覆層より大きい場合、導波管を創出する。 フィルターを適切に設計した場合、入射光は導波管を通り、漏れモードとして伝搬される。 格子構造は狭帯域の波長で選択的に光を結びつけ導波管に送る。 光は非常に短い距離（１０〜１００マイクロメートルのオーダー）のみを伝播され、散乱され、前後に伝達されたゼロ次光と結合する。 高感度カップリング条件は反射放射スペクトル上に共鳴格子効果を生じ、その結果、狭帯域の反射または透過波長を生じる。 格子の深さおよび周期は共鳴格子効果の波長よりも小さい。

この構造の反射または透過色は、特異結合物質または結合パートナーまたはその両方などの分子が、被覆層の上面または格子表面に付加することにより変調することができる。 付加分子はその構造を介して入射放射の光路長を増加させ、その結果、最大反射または透過が起こる波長を変更させる。

一態様において、バイオセンサーは、白色光で照射した場合に単一の波長または狭帯域の波長のみを反射するように設計する。 特異結合物質がバイオセンサーの表面に付着した場合、反射波長は格子内で結合した光の光路の変化によりシフトする。 バイオセンサー表面に特異結合物質を結合させることにより、相補的結合パートナー分子を、如何なるタイプの蛍光プローブ、粒子標識または如何なる他のタイプの標識をも使用せずに検出し得る。 この検出技法では、例えば、結合するタンパク質の約０．１ｎｍの厚さの変化を分析することが可能であり、液に浸漬したバイオセンサー表面または乾燥表面いずれでも実施し得る。

検出システムは、例えば、正常の入射角でバイオセンサーの小さなスポットを照射する、例えば、ファイバー光プローブを通す光源、および、例えば、正常入射角で第二ファイバー光プローブを通る反射光を集める分光計からなる。 励起／検出システムとバイオセンサー表面との間に物理的接触が起こらないので、特別の結合プリズムを必要とせず、このバイオセンサーは一般に使用されるアッセイプラットホーム、例えば、マイクロタイタープレートおよびマイクロアレイスライドなどに容易に適合させることができる。 単一分光計の読み取りは数ミリ秒で実施可能であり、従って、バイオセンサー表面上で平行して起こる大量の分子相互作用を迅速に測定し、実時間で反応速度をモニターすることが可能である。

この技法は、大量の生体分子相互作用を平行して測定する場合、とりわけ、分子の標識が研究中に該分子の機能を変化させるかまたは阻害するであろう場合に利用するのに適している。 タンパク質標的についての医薬化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング、およびプロテオミクスのためのタンパク質−タンパク質相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、本発明の組成物と方法により提供される感受性と処理能力を必要とする応用例である。

図１Ａおよび１Ｂは比色共鳴反射回折格子バイオセンサーの一例を図示したものである。 図１において、ｎ _substrateは基板材料を表す。 ｎ ₂は光格子の屈折率を表す。 ｎ ₁は任意の被覆層を表す。 ｎ _bioは１つ以上の特異結合物質の屈折率を表す。 ｔ ₁は一次、二次または三次元格子構造上の任意被覆層の厚さを表す。 ｔ ₂は格子の厚さを表す。 ｔ _bioは１つ以上の特異結合物質の層の厚さを表す。 一態様においては、ｎ２＜ｎ１（図１Ａ参照）である。 層の厚さ（すなわち、被覆層、１つ以上の特異結合物質、または光格子）は、最上面の付加分子に対する共鳴波長感度を達成するように選択する。 格子周期は所望の波長での共鳴を達成するように選択する。

ＳＷＳバイオセンサーは高屈折率材料からなる光格子、格子を支持する基板層、および基板層の逆の格子表面に固定した１つ以上の特異結合物質を含む。 任意に、被覆層は格子表面を被覆してもよい。 本発明により作製された光格子は高屈折率の絶縁薄膜で被覆するが、該薄膜は、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、および窒化ケイ素などの材料から構成し得る。 光学的特長をもつ格子の断面輪郭は、周期的に繰り返される機能、例えば、「方形波」を含むことができる。 光格子はまた、線形、方形、円形、楕円形、三角形、台形、正弦波形、卵形、長方形、および六角形からなる群より選択される形状の繰り返しパターンを含むことができる。 本発明のバイオセンサーはまた、例えば、高屈折率材料で被覆したプラスティックまたはエポキシからなる光格子を含むことができる。

センサーの特性
線状格子（すなわち、一次元格子）は、照射光の偏光が格子周期に垂直に方向付けられている場合に共鳴の特性をもつ。 一態様である任意の被覆層をもつ線状格子構造の模式図を図２に示す。 比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、二次元格子、例えば、円孔（図３Ｂ参照）または四角孔（図３Ａ参照）の六角形アレイを含むことができる。 その他の形状も同様に使用し得る。 線形格子は同じピッチ（すなわち、高低屈折率の領域間の距離）、周期、層厚、および六角形整列格子としての物質の性質を有する。 しかし、光は共鳴により光学構造にカップリングさせるためには、格子線に垂直に偏光させなければならない。 従って、線状格子に垂直の偏光軸となる偏光フィルターを照射源とバイオセンサー表面の間に挿入しなければならない。 照射光源の小さな部分のみが正しく偏光されるため、六角形格子に比べて、等価量の共鳴反射光を集めるために、より長い集積時間が要求される。

光格子はまた、例えば、「階段状」の外形を含み得る。 その場合、単一の固定した高さの高屈折率領域が低屈折率被覆層に埋め込まれる。 高低屈折率の交互の領域がバイオセンサー最上面に平行の光導波管を提供する。

高屈折率物質が階段状ではないが、側方位置で変わる共鳴バイオセンサーとすることもできる。 図４は二次元格子の高屈折率物質ｎ ₂が正弦波的に高さの変わる輪郭を示す。 特定波長での共鳴反射を生じるために、正弦波の周期は等価の階段状構造の周期に一致する。 正弦波的に変化する構造とそのバイオセンサーとしての機能性の共鳴効果は、ＧＳＯＬＶＥＲ（グレイティング・ソルバー・デベロープメント・カンパニー、アレン、テキサス、ＵＳＡ）コンピューターモデルにより証明されている。

本発明のバイオセンサーはさらに基板層の反対側の光格子表面に被覆層を含むことができる。 被覆層が存在する場合、１種以上の特異結合物質が格子の反対側の被覆層表面に固定化される。 好ましくは、被覆層は格子を構成する材料よりも低い屈折率をもつ材料を含んでなる。 被覆層は、例えば、ガラス（スピン・オン・ガラス（ＳＯＧ）を含む）、エポキシ、またはプラスティックから構成され得る。

例えば、バイオセンサーの屈折率の要件に合致する種々のポリマーを被覆層に使用し得る。 ＳＯＧは、その好適な屈折率、取り扱い易さ、および豊富なガラス表面活性化技法により特異結合物質で活性化され易いことなどのため、使用することができる。 バイオセンサー表面の平面性が特定のシステム構築に問題とならない場合、ＳｉＮ／ガラスの格子構造はそのまま検出面として使用することができ、その活性化はガラス表面と同じ手段を用いて実施し得る。

共鳴反射はまた光格子上の平坦化被覆層がなくても得ることができる。 例えば、バイオセンサーは高屈折率材料の構造化薄膜層で被覆した基板のみを含み得る。 平坦化被覆層を使用せずとも、周辺の媒体（空気または水など）が格子を満たす。 従って、特異結合物質は、上部表面のみではなく、特異結合物質に接触する光格子の全面でバイオセンサーに固定化される。

一般に、本発明のバイオセンサーはすべての偏光角の光を含む白色光で照射する。 バイオセンサー格子の繰り返しという特徴に対する偏光角の方向が共鳴波長を決定する。 例えば、「線状格子」（すなわち、一次元格子）バイオセンサーは線と空隙の繰り返しのセットからなり、別個の共鳴反射を生じ得る２つの光学偏光を有する。 線に対して垂直に偏光する光は「ｓ−偏光」と呼ばれ、線に平行に偏光する光は「ｐ−偏光」と呼ばれる。 入射光のｓおよびｐ成分は両方ともフィルター未通過の照射ビーム中に同時に存在し、それぞれが別個の共鳴シグナルを生じる。 バイオセンサーは一般に一方の偏光（ｓ−偏光）のみの性質を最適化するように設計することが可能であり、非最適化偏光は偏光フィルターにより容易に除去される。

すべての偏光角が同じ共鳴反射スペクトルを生じるように偏光依存性を除去するためには、共中心型リングのセットからなる交互のバイオセンサー構造を使用することができる。 この構造において、各共中心型リングの内径および外径の差は格子周期の約２分の１に等しい。 連続する各リングは、前のリングの内径よりも約１格子周期大きな内径を有する。 共中心型リングパターンは単一のセンサー位置を包含するように広がる；例えば、アレイスポットまたはマイクロタイタープレートウエルなどである。 それぞれ別個のマイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウエルは、それを中心にした個々の共中心型リングパターンを有する。 例えば図５を参照。 かかる構造物の偏光方向はすべて同じ断面輪郭を有する。 共中心型リング構造は中心に向かって正確に照射され、偏光の独立性を保持し得るようにしなければならない。 共中心型リング構造の格子周期は、共鳴反射光の波長よりも小さい。 格子周期は約０．０１ミクロンないし約１ミクロンである。 格子の深さは約０．０１ないし約１ミクロンである。

もう一つの態様において、孔または標柱のアレイは上記の共中心型サークル構造に近似させて配置し、照射ビームをグリッドの特定位置に集中させる必要のないようにする。 例えば図６を参照。 かかるアレイのパターンは、３方向から同じ角度で表面に入射する３本のレーザービームの光干渉により自動的に生じる。 このパターンにおいて、孔（または標柱）は図６に示すように、最密の六角形のアレイの角に中心を置く。 孔または標柱はまた各六角形の中心にある。 かかる孔または標柱の六角形グリッドは、同じ断面の輪郭を「見る」３つの偏光方向を有する。 従って、六角形グリッド構造はいずれの偏光角の光を用いても等価の共鳴反射スペクトルを提供する。 従って、不所望の反射シグナル成分を除くために、偏光フィルターを必要としない。 孔または標柱の周期は約０．０１ミクロンないし約１ミクロンであり、その深さまたは高さは約０．０１ミクロンないし約１ミクロンである。

本発明方法を使用して製造し得るもう一つの格子は、体積表面−レリーフ体積回析格子（ＳＲＶＤ格子）であり、三次元格子ともいう。 ＳＲＶＤ格子は、広帯域光波長で照射したときに、特定の狭帯域光波長で優先的に反射する表面を有する。 特異結合物質および／または結合パートナーをＳＲＶＤ格子に固定化し、ＳＲＶＤバイオセンサーを生産した場合、反射する狭帯域光波長がシフトする。 薄膜干渉フィルターおよびブラッグ(Bragg)反射体などの一次元表面は、狭い範囲の反射または透過波長を広帯域励起源から選択し得るが、しかし、特異結合物質および／または結合パートナーなどの付加物をその上部表面に沈着させると、共鳴波長ではなく共鳴線幅に変化が起こるだけである。 それに対し、ＳＲＶＤバイオセンサーは、特異結合物質および／または結合パートナーなどの物質を該表面に付加すると、反射波長を変化させる能力を有する。 レリーフ体積回折構造の深さと周期はバイオセンサーから反射される光の共鳴波長よりも小さい。

三次元表面−レリーフ体積回折格子は、例えば、三次元位相量子化段丘表面レリーフパターン（その溝のパターンは階段状ピラミッドに似ている）でもよい。 かかる格子を広域帯放射ビームで照射した場合、光は周囲の媒体の屈折率の２倍の階段格子面間隔とした波長で、等しい空間の段丘から整然と反射される。 所定の波長の光は半波長異なる階段から共鳴して回折または反射され、その帯域幅は階段数に逆比例する。

三次元位相量子化段丘表面レリーフパターンの例は、階段状ピラミッドに似たパターンである。 それぞれの逆位ピラミッドは直径約１ミクロンであり、好ましくは、各逆位ピラミッドは直径約０．５ないし約５ミクロンであり、例えば、約１ミクロンを含む。 ピラミッド構造は、約１５０〜２００ミクロンの直径をもつ典型的なマイクロアレイスポットが数百の階段ピラミッド構造を組み込めるように密に詰めることができる。 該レリーフ体積回折構造は約０．１ないし約１ミクロンの周期と約０．１ないし約１ミクロンの深さを有する。 図７は特異結合物質または結合パートナーが表面に吸着されるかどうかを判定するために、（１つのマイクロアレイスポットについて単一ピラミッドで表される数百のピラミッドを取り込む全マイクロアレイスポットを有する）個々のマイクロアレイ位置がどのようにして光学的に真偽をただし得るかを示す。 バイオセンサーを白色光で照射した場合、有意な結合物質のないピラミッド構造は、ピラミッド構造の階段の高さにより決定される波長を反射する。 結合パートナーまたは特異結合物質などの高屈折率物質が反射金属表面に取り込まれると、段丘階段構造から反射される波長は変更されて、より長い波長にシフトする。 段丘階段構造から反射される色は、ＳＲＶＤバイオセンサーのシート材料の第一表面に被覆される反射材料の屈折率の２倍の段の高さとして理論的に与えられる。 反射材料は、例えば、銀、アルミニウム、または金である。

上記のように、１種以上の特異結合物質をＳＲＶＤバイオセンサーの反射材料に固定化する。 １種以上の特異結合物質は、上記のように、反射材料上の１種以上の異なる位置のアレイに配列し得る。

ＳＲＶＤバイオセンサーからの反射光の波長は狭い帯幅に限定されるため、該表面の光学的特性の非常に小さな変化が、反射波長スペクトルで容易に観察される変化として現れる。 狭い反射帯幅は、平坦表面上の反射スペクトル法に比較して表面吸着感度に有利となる。

ＳＲＶＤバイオセンサーは、広帯域の光波長で照射した場合に第一単一光波長で優先的に光を反射し、反射面に１種以上の特異結合物質が固定化されると第二単一光波長で光を反射する。 第二光波長での反射は光干渉で生じる。 ＳＲＶＤバイオセンサーはまた１種以上の特異結合物質がそれぞれの結合パートナーに結合した場合、光干渉により、第三の単一光波長で光を反射する。

反射色の読み取りは、顕微鏡対物レンズの焦点を個々のマイクロアレイスポットに絞り、反射スペクトルを読み取ることにより連続的に実施するか、または平行して、例えば、マイクロアレイの反射画像を高分解カラーＣＣＤカメラに投影することにより実施する。

本発明の一態様においては、光学装置が提供される。 光学装置は本発明のバイオセンサーに類似の構造を含んでなる。 しかし、光学装置は格子上に固定化した１種以上の特異結合物質を含まない。 光学装置は、例えば、狭帯域光フィルターとして使用し得る。

特異結合物質および結合パートナー
１種以上の特異結合物質が一次、二次もしくは三次元格子に、または存在する場合には被覆層に、例えば、物理吸着により、または化学結合により固定化する。 特異結合物質とは、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ溶液、ＲＮＡ溶液、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド溶液、コンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物を含む溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ'） ₂フラグメント、Ｆｖフラグメント、小型有機分子、細胞、ウイルス、バクテリア、ポリマーまたは生物サンプルである。 生物サンプルとは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸管分泌物、組織または腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、喀痰、のう胞液、羊水、脳脊髄液、腹水、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙液、または前立腺液である。 該ポリマーは、ヒドロゲル、デキストラン、ポリアミノ酸およびその誘導体からなる群から選択される、１分子あたり複数の活性部位をもつ長鎖分子であり、例えば、ポリリジン（ポリ−ｌ−リジンおよびポリ−ｄ−リジンを含む）、ポリ−ｐｈｅ−リジンおよびポリ−ｇｌｕ―リジンを含む。

好ましくは、１種以上の特異結合物質は、バイオセンサー上の１つ以上の異なる位置のアレイに配列される。 特異結合物質のアレイは、本発明のバイオセンサーの表面上に１種以上の特異結合物質を含んでなり、その結果、表面は多くの異なる位置を含み、各々は異なる特異結合物質をもつか、または異なる量の特異結合物質をもつ。 例えば、配列は１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００個の異なる位置を含み得る。 かかるバイオセンサー表面をアレイと呼ぶが、その理由は１種以上の特異結合物質が一般にｘ−ｙ座標において通常のグリッドパターンに展開するからである。 しかし、本発明のアレイは正常または異常なパターンのいずれかのタイプに展開した１種以上の特異結合物質を含むことができる。 例えば、異なる位置は１種以上の特異結合物質のスポットのアレイを規定することができる。 アレイスポットは直径が約５０ないし約５００ミクロンであり得る。 アレイスポットはまた直径が約１５０ないし約２００ミクロンであり得る。 １種以上の特異結合物質はその特異結合パートナーに結合し得る。

本発明のバイオセンサー上のアレイは、１種以上の特異結合物質の微量液滴を、例えば、格子または被覆層表面に位置するｘ−ｙグリッド上に配置することにより創出し得る。 バイオセンサーを１種以上の結合パートナーを含む試験サンプルに接触させる場合、結合パートナーは、結合パートナーに高い親和性を有する特異結合物質を含んでなるマイクロアレイ上の異なる位置に優先的に吸着される。 異なる位置の一部はその表面に結合パートナーを集めるが、他の位置は集めない。

特異結合物質は、本発明バイオセンサーの表面に付加した結合パートナーに特異的に結合する。 特異結合物質はその結合パートナーに特異的に結合するが、バイオセンサー表面に付加した他の結合パートナーには実質的に結合しない。 例えば、特異結合物質が抗体であり、その結合パートナーが特定の抗原である場合、該抗体は特定の抗原に特異的に結合するが、他の抗原には実質的に結合しない。 結合パートナーは、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ溶液、ＲＮＡ溶液、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド溶液、コンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物を含む溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ'） ₂フラグメント、Ｆｖフラグメント、小型有機分子、細胞、ウイルス、バクテリア、ポリマーまたは生物サンプルであり得る。 生物サンプルとは、例えば、血液、血漿、血清、胃腸管分泌物、組織または腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、喀痰、のう胞液、羊水、脳脊髄液、腹水、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙液、または前立腺液でありうる。

本発明アレイの一例は核酸アレイであり、このアレイではアレイ内の各異なる位置が、異なる核酸分子を含む。 この態様において、核酸マイクロアレイ内のスポットは、テストサンプル中の逆鎖の核酸との相補性化学結合を検出する。

マイクロタイタープレートが生化学アッセイで使用される最も一般的なフォーマットであるが、マイクロアレイは、貴重な試薬の容量を最小化しながら一度に測定し得る生化学相互作用の数を最大化する手段と見なされるようになってきている。 マイクロアレイ・スポッターを用いて本発明のバイオセンサーに特異結合物質を加えることにより、特異結合物質の密度を１０，０００／ｉｎ ²とすることができる。 単一のマイクロアレイ位置を調べるために照射ビームを集中することにより、バイオセンサーは無標識マイクロアレイ読み取りシステムとして使用し得る。

さらにマイクロアレイとマイクロタイタープレート態様の双方を組み合わせて、１種以上の特異結合物質をセンサー表面上の１つ以上の異なる位置のアレイに配列するようにすることができる；当該表面はマイクロタイタープレートの１つ以上のウエル内にあり、マイクロタイタープレートの１つ以上の表面、好ましくは底部表面を含む。 特異結合物質のアレイは、マイクロタイタープレートウエル内のセンサー表面上に１種以上の特異結合物質を含み、表面が１つ以上の異なる位置を含むようにする；それぞれは異なる特異結合物質を含むか、または異なる量の特異結合物質を含む。 例えば、１アレイが１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００の異なる位置を含み得る。 従って、マイクロタイタープレート態様の各ウエルは、その内部にマイクロタイタープレート態様の他のウエルから分離された１つ以上の異なる位置のアレイを有し得る。 この態様は本発明の１個のマイクロタイタープレート上で、各個別のウエルについて１種以上のサンプルで、多数の異なるサンプルを処理することを可能とする。 いずれか１つのウエル内の１つまたは複数のアレイは、同じマイクロタイタープレートのいずれか他のマイクロタイターウエルに見出される１つまたは複数のアレイと同一であっても異なっていてもよい。

１種以上の特異結合物質の固定化
１種以上の特異結合物質のバイオセンサー上への固定化は、特異結合物質が洗浄操作により洗い流されないように、またテストサンプル中の結合パートナーへのその結合をバイオセンサー表面が妨げないように実施する。 数種の異なるタイプの表面化学戦略が、例えば、種々のタイプのマイクロアレイおよびバイオセンサーで使用されるガラスに特異結合物質を共有結合付着させるために実行されている。 これらと同じ方法は本発明のバイオセンサーに容易に適合させ得る。 １種以上の特異結合物質を結合するための正当な官能基を含むようにするバイオセンサー表面の調製は、バイオセンサー製造法の不可欠の部分である。

１種以上の特異結合物質は、物理吸着（すなわち、化学的リンカーを使用しない）によるか、または化学結合（すなわち、化学リンカーの使用による）ならびに電気化学結合、静電気結合、疎水性結合および親水性結合により、バイオセンサー表面に付着させ得る。 化学結合はバイオセンサー表面に特異結合物質をより強く付着させることが可能であり、表面結合分子の明確な方向とコンホメーションを提供し得る。

特異結合物質と本発明バイオセンサーとの化学結合のいくつかの例を下記実施例２に示してある。 他のタイプの化学結合は、例えば、以下の官能基を介する結合である：アミノ基、アルデヒド基、ニッケル基、酸基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸エステル基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基。 これらの表面は図８に示すように、数種の異なるタイプの化学リンカーをバイオセンサー表面に付着させるために使用し得る。 例えば、アミン表面は数種のタイプのリンカー分子を付着させるために使用し得るが、一方、アルデヒド表面はさらなるリンカーなしに、直接タンパク質を結合させるために使用し得る。 ニッケル表面は組み込まれたヒスチジン（「ｈｉｓ」）タグ標識を有する分子を結合させるために使用し得る。 ニッケル活性化表面をもつ「ｈｉｓ−標識」分子の検出は当該技術分野において周知である(Whitesides, Anal. Chem. 68, 490 (1996))。

プラスティック、エポキシ、または高屈折率材料への特異結合物質の固定化は、本質的にガラスに対する固定化について記載したのと同様に実施し得る。 しかし、酸洗浄工程は、かかる処置が特異結合物質を固定化した材料を損傷する場合には割愛し得る。

約０．１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度の結合パートナーを検出するためには、バイオセンサーに結合した結合パートナーをバイオセンサー表面のさらなる層に増幅し変換することが好ましい。 バイオセンサー上に付着して増加した質量は、増大した光路長の結果として容易に検出することができる。 より大きな質量をバイオセンサー表面に取り込ませることにより、該表面上の結合パートナーの光学密度も増大し、結果として、付加質量なしに生じる場合よりもより大きく共鳴波長をシフトする。 質量の付加は、例えば、酵素的に、「サンドイッチ」アッセイにより、または種々のサイズおよび組成の適切に接合したビーズまたはポリマーの形状でバイオセンサー表面に質量を直接加えることにより、実施することができる。 この原理は他のタイプの光バイオセンサーが、質量増幅せずに達成される感度限界を超える１５００Ｘ以上の感度増大を説明するために利用された。 例えば以下を参照：Jenison et al., "Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon （光学的被覆シリコン上の核酸標的の干渉に基づく検出），” Nature Biotechnology, 19: 62-65, 2001。

一例として、図９ＡはＮＨ ₂ −活性化バイオセンサー表面が、該表面に固定化した一本鎖ＤＮＡ捕捉プローブを含んでなる特異結合物質を有し得ることを示す。 捕捉プローブはその相補性標的結合パートナーと選択的に相互作用する。 この結合パートナーは、「検出体」分子に結合する配列またはタグ標識を含むように設計することができる。 図９Ａに示すように、検出体分子は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対するリンカーを含むことができ、適切な酵素に接触したとき、検出体分子が存在する場合にのみバイオセンサー上に追加の物質を選択的に付着させる。 かかる手法は、例えば、３００オングストロームの検出可能な生体物質を、２〜３分以内にバイオセンサーに付加させ得る。

「サンドイッチ」法もまた検出感度を高めるために使用し得る。 この方法では、大分子量の分子が低分子量分子の存在を増幅するために使用し得る。 例えば、分子量約０．１ｋＤａないし約２０ｋＤａを有する結合パートナーは、図９Ｂに示すように、例えば、スクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジル−ジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＴ）、またはジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ヒスチジン、またはビオチン分子で標識し得る。 タグ標識がビオチンである場合、ビオチン分子は分子量約６０ｋＤａのストレプトアビジンと強力に結合する。 ビオチン／ストレプトアビジン相互作用は高特異性であるため、小さな結合パートナーによってのみ生じるシグナルを６０倍増幅する。

検出感度は化学的に誘導化した小粒子を使用することによりさらに増強し得る。 直径約３〜３００ｎｍのコロイド金、種々のプラスティック、またはガラスで作られた「ナノ粒子」は、結合パートナーに選択的にそれらを共有結合させることの可能な分子種で被覆することができる。 例えば、図９Ｃに示すように、ストレプトアビジンで共有結合被覆したナノ粒子は、バイオセンサー表面にビオチン標識結合パートナーの可視性を高めるために使用し得る。 ストレプトアビジン分子はそれ自体分子量６０ｋＤａを有するが、誘導化ビーズは、例えば、６０ＫＤａなど、任意のサイズの分子量とすることもできる。 大型ビーズの結合は、バイオセンサー表面上の光学密度に大きな変化を生じ、容易に測定可能なシグナルを生じる。 この方法は感度分解能に約１０００倍の増強をもたらし得る。

液体収容容器
本発明の回折格子は内部表面、例えば、液体収容容器の底部面を含み得る。 液体収容容器は、例えば、マイクロタイタープレートウエル、試験管、ペトリ皿、または微量液チャネルなどである。 本発明の一態様は、いかなるタイプのマイクロタイタープレートにも組み込み得るバイオセンサーである。 例えば、バイオセンサーはマイクロタイタープレートの底部面に、図３２Ａおよび３２Ｂに示すように、共鳴反射面上に反応容器の壁を組み上げることにより組み込むことができ、その結果、各反応「スポット」は個々のテストサンプルに接触し得る。 従って、各個別のマイクロタイタープレートウエルは、別個の反応容器として作用する。 従って、個別の化学反応は、隣り合ったウエル内で反応液が混じり合うことなく起こり、化学的に異なるテスト溶液は個別のウエルに割り当てることができる。

底部未処理マイクロタイタープレートの底部面に本発明のバイオセンサーまたは格子を付着させるために、数種の方法を使用し得るが、例えば、粘着性付着、超音波溶接、およびレーザー溶接などがある。

医薬のハイスループットスクリーニング・ラボラトリー、分子生物学研究所、および診断アッセイラボラトリー用の最も一般的なアッセイフォーマットは、マイクロタイタープレートである。 このプレートは、グリッドに配置される約２、６、８、２４、４８、９６、３８４、１５３６または３４５６個の個別の反応容器を含み得る標準サイズのプラスティックカートリッジである。 これらプレートの標準の機構的形状により、液体分配、ロボット式プレート処理、および検出システムは、この共通のフォーマットで作業できるように設計する。 本発明のバイオセンサーは標準マイクロタイタープレートの底面に組み込むことができる。 例えば図３２Ａを参照。 バイオセンサー表面は大きな面積に仕立てることが可能であり、また読み取りシステムがバイオセンサー表面と物理的に接触しないので、任意の数の個々のバイオセンサー面積が規定可能であり、これは照射光の焦点分解能によって、またバイオセンサー表面を横切る照射／検出プローブを走査するｘ−ｙステージによって制限されるだけである。

バイオセンサーの使用方法
本発明のバイオセンサーは１種または多数の特異結合物質／結合パートナー相互作用を平行して研究するために使用し得る。 １種以上の特異結合物質のそれぞれの結合パートナーに対する結合は、標識を使用することなく、１種以上の結合パートナーを表面に固定化した１種以上の特異結合物質を有するバイオセンサーに加えることにより検出し得る。 バイオセンサーを光照射し、反射波長の最大値または透過光波長の最小値をバイオセンサーから検出する。 １種以上の特異結合物質がそれぞれの結合パートナーに結合した場合には、反射光波長は、１種以上の特異結合物質がそれぞれの結合パートナーに結合していない場合の状況に比較して、シフトする。 バイオセンサーが１種以上の特異結合物質を含む１種以上の異なる位置のアレイで被覆される場合、反射光波長での最大値または透過光波長での最小値が、バイオセンサーの各異なる位置から検出される。

本発明の一態様において、様々の特異結合物質、例えば、抗体が本発明のバイオセンサー上にアレイ様式で固定化し得る。 例えば図３１を参照。 次いでバイオセンサーをタンパク質などの結合パートナーを含んでなる対象のテストサンプルと接触させる。 バイオセンサー上に固定化した抗体に特異的に結合するタンパク質のみがバイオセンサーに結合して残る。 かかる方法は本質的に酵素結合免疫吸着検定法の大規模化法である；しかし、酵素または蛍光標識の使用を必要としない。 ハイスループットへの応用のために、バイオセンサーは複数のアレイの一つに配列し得る；この場合、特異結合物質のアレイを含んでなる数個のバイオセンサーは、１つのアレイに配列する。 例えば図３３を参照。 かかる複数のアレイの一つは、例えば、一度に多くのアッセイを遂行するために、マイクロタイタープレートに浸すことができる。 もう一つの態様において、バイオセンサーは生化学物質のインビボ検出のためのファイバープローブの先端に存在し得る。 図１４を参照。

酵素活性は、１種以上の特異結合物質を固定化したバイオセンサーに１種以上の酵素を加えることにより検出し得る。 バイオセンサーを洗浄し、光で照射する。 反射光波長はバイオセンサーから検出される。 １種以上の酵素がバイオセンサーの１種以上の特異結合物質を酵素活性により、例えば、特異結合物質の全部または一部をバイオセンサーの表面から切断することにより、変化させると、反射光の波長がシフトする。 本発明のもう一つの態様は、比色共鳴反射光バイオセンサー表面からの、１種以上の全特異結合物質の切断検出方法である。 該方法は、比色共鳴反射光バイオセンサー表面に、１種以上の結合物質を異なる位置に固定化し、異なる位置のＰＷＶを検出し、１種以上の切断分子を加え、異なる位置のＰＷＶを検出し、そして当初のＰＷＶとその次のＰＷＶを比較することを含む。 １種以上の全特異結合物質の切断が検出され、ピーク波長値（ＰＷＶ）はバイオセンサーに結合する特異結合物質の相対的測定値である。 切断分子は別の分子を切断し得る分子である。 例えば、切断分子はプロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、リアーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、リガーゼ、キナーゼおよびホスファターゼなどの酵素である。

比色共鳴反射光バイオセンサーは、マイクロタイターウエル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿または微量液チャネルの内面を含むことができる。 特異結合物質の固定化は、例えば、以下の官能基に結合することにより行うことができる：ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸エステル基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基。 さらに、特異結合物質は比色共鳴反射光バイオセンサー表面に、物理吸着、化学結合、電気化学結合、静電気結合、疎水性結合または親水性結合を介して固定化する。

１種以上の特異結合物質は、バイオセンサー表面の１つ以上の異なる位置のアレイに配列する。 １つ以上の異なる位置は、直径約５０〜５００ミクロン、または約１５０〜２００ミクロンのマイクロアレイのスポットを規定することができる。

上記の方法は、比色共鳴反射光バイオセンサー表面からの１種以上の全特異結合物質の切断検出方法であり、別途のステップも含み得る。 １種以上の特異結合物質は、マイクロタイタープレートウエル内のアレイを規定する１つ以上の異なる位置に固定化しうる。 マイクロアレイを規定する１つ以上の異なる位置は、比色共鳴反射光バイオセンサー表面に位置し、これがさらにウエルの内面を構成する。 ＰＷＶはウエル内の１つ以上の異なる位置について検出する。 １種以上の切断する分子をウエルに加える。 ウエル内の１つ以上の異なる位置についてのＰＷＶ検出を実施する。 当初のＰＷＶとその次のＰＷＶを比較する。 ウエル内の１つ以上の異なる位置で、１種以上の全特異結合物質の切断を検出する。 ピーク波長値（ＰＷＶ）はバイオセンサーに結合する特異結合物質の相対的測定値である。

本発明のもう一つの態様は、分子がどのように効果的に酵素または結合パートナーの活性を阻害するか（すなわち、分子の「阻害活性」）を検出する方法を提供する。 一態様において、１種以上の特異結合物質が付着しているバイオセンサーに、阻害活性を有する疑いのある１種以上の分子を加え、次いで特異結合物質に作用することの分かっている１種以上の酵素を加える。 例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、リアーゼ、ペプチダーゼ、ヒドラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、または特異結合物質に検出可能な変化を生じるその他のタイプの酵素である。 該酵素は特異結合パートナーに、例えば、実質的に全単一結合物質または単一結合物質の一部を該バイオセンサーから切除することにより、作用することができる。 バイオセンサーに固定化した１種以上の特異結合物質に結合することの知られる１種以上の結合パートナーをバイオセンサーに加えることもできる。

阻害活性をもたない分子では、酵素活性が減弱せずに存在し得る；実質的に完全な阻害活性をもつ分子は、実質的に完全に反応を停止させる；また、部分的に阻害する分子は部分的に反応を停止させる。 さらに、阻害活性をもたない分子は結合パートナーがその特異結合物質に結合することを許容する。 部分的に阻害する分子は、その特異結合物質パートナーに対し、結合パートナーの部分的または弱い結合を可能とする。 阻害活性を有する分子は、その特異結合パートナーに対する結合パートナーの結合を阻害する。 従って、該方法は、酵素または結合パートナーに対し１種以上の分子の阻害活性を検出する技法を提供する。

１つ以上の異なる位置のＰＷＶを検出した後、阻害活性をもつ疑いのある１種以上の分子を１つ以上の異なる位置に加え、次いで１種以上の酵素または結合パートナーをその異なる位置に加える。 １つ以上の異なる位置のＰＷＶを検出し、当初のＰＷＶと比較する。 あるいは、阻害活性を有する疑いのある１種以上の分子を１種以上の酵素または結合パートナーと混合し、それを一緒に該１つ以上の異なる位置に加え得る。 上記の当初ＰＷＶが上記の次のＰＷＶに関して減少または増加するとき、その値は、（１）酵素により変化する結合物質の割合またはバイオセンサー表面からバイオセンサーに結合した結合パートナーの量の相対的測定値；または（２）阻害活性を有する疑いのある１種以上の分子の相対的有効性の測定値である。

酵素または結合パートナーに対する１種以上の分子の阻害活性を検出する上記の方法は、別途のステップも含み得る。 例えば、１種以上の特異結合物質は、マイクロタイタープレートのウエルまたは他の液体収容器具内のアレイを規定する１つ以上の異なる位置に固定化し得る。 アレイを規定する１つ以上の異なる位置は、ウエルの内面を構成する比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に位置する。 ウエル内の１つ以上の異なる位置についてのＰＷＶの検出に続いて、阻害活性を有する疑いのある１種以上の分子をウエルに加える。 １種以上の酵素または結合パートナーをウエルに加え、ウエル内の１つ以上の異なる位置についてＰＷＶを検出する。 当初のＰＷＶを引き続くＰＷＶと比較し、ウエル内の各異なる位置での酵素または結合パートナーに対する１種以上の分子の阻害活性を明らかにする。 あるいは、阻害活性を有する疑いのある１種以上の分子を１種以上の酵素または結合パートナーと混合し、一緒にウエルに加えることができる。

さらに、テストサンプル、例えば、結合パートナーを含む細胞溶解質を本発明のバイオセンサーに加え、次いで未結合物質を洗浄除去することができる。 バイオセンサーに結合する結合パートナーをバイオセンサーから溶離し、例えば、マススペクトル法により同定することができる。 任意に、ファージＤＮＡ提示ライブラリーを本発明のバイオセンサーに加え、次いで未結合物質を洗浄除去してもよい。 バイオセンサーに結合した個々のファージ粒子を単離し、次いでこれらファージ粒子の挿入片の配列を決定し、結合パートナーの種類を判定することができる。

本発明のもう一つの態様では、細胞転移および走化性を検出する方法が提供される。 とりわけ、細胞はウエル内またはアレイフォーマットにおいて、比色共鳴反射光バイオセンサーの一端で増殖可能である。 細胞を含むバイオセンサーの一端は、半透過膜を使用し、走化性物質を容れる他端から任意に隔離することができる。 次いで、画像化分光計、または代替法として、バイオセンサーの多数の位置から読み取るために移動し得る光ファイバープローブから構成される検出システムを使用して細胞の位置を検出し、次に、細胞転移速度を計算することができる。

本発明のさらなる態様では、細胞増殖パターンの変化を検出する方法が提供される。 簡単に説明すると、細胞は比色共鳴反射光バイオセンサー上で増殖し得る；ＰＷＶを検出する；テスト試薬を細胞に加える；ＰＷＶを検出する；そして当初のＰＷＶを次のＰＷＶと比較する；この場合、当初のＰＷＶと引き続くＰＷＶとの差が細胞増殖パターンの変化を物語る。 ＰＷＶの差は細胞増殖パターンの変化と相関する。

細胞増殖パターンの変化は、細胞形態学、細胞接着、細胞転移、細胞増殖および細胞死からなる群より選択し得る。 １つのタイプの原核細胞もしくは真核細胞または２つ以上のタイプの真核細胞または原核細胞をバイオセンサー上で増殖することができる。 バイオセンサーはマイクロタイターウエル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿および微量液体チャネルからなる群より選択される容器の内面を構成し得る。

本発明のさらなる態様においては、比色共鳴反射光バイオセンサーと接触して保持される半透過性内部スリーブ内で増殖する細胞から放出される分子の検出方法が提供される。 半透過性内部スリーブとは、例えば、取り外し可能な多孔性の、または取り外しできない多孔性の挿入片であり、バイオセンサー表面と接触するか、または接近して保持され、ここで、該スリーブはその表面で培養された細胞が分泌する分子を透過することができるが、全細胞を透過することはできない。 スリーブは、本発明のバイオセンサーがウエルまたは他の容器の内面を構成する場合、マイクロタイタープレートまたは他の容器のウエルに適合させることができる。

本方法は以下の工程を含む：比色共鳴反射光バイオセンサー表面の１つ以上の異なる位置に１種以上の特異結合物質を固定化し；１つ以上の異なる位置のＰＷＶを検出し；比色共鳴反射光バイオセンサーと１つ以上の異なる位置で接触を保持する半透過膜内部スリーブで細胞を増殖させ；１つ以上の異なる位置のＰＷＶを検出し；そして当初のＰＷＶとその後のＰＷＶを比較する。 比色共鳴反射光バイオセンサーとの接触を保持した半透過膜内部スリーブで増殖した細胞から放出される分子と１種以上の特異結合物質との結合を検出する。 さらに、当初のＰＷＶはバイオセンサーに結合する特異結合物質の相対測定値であり、当初のＰＷＶとその後のＰＷＶとの差は、特異結合物質に結合する半透過膜内部スリーブで増殖する細胞から放出される分子の相対測定値である。 半透過膜内部スリーブは取り外し可能な多孔性挿入片または取り外しできない多孔性挿入片である。

比色共鳴反射光バイオセンサーとの接触を保持した半透過膜内部スリーブで増殖する細胞から放出される分子を検出する上記の方法は、別途のステップも含み得る。 例えば、１種以上の結合物質は、マイクロタイタープレートウエル内のアレイを規定する１つ以上の異なる位置に固定化し得る；この場合、比色共鳴反射光バイオセンサーはウエルの内面を構成する。 該ウエル内のアレイを規定する１つ以上の異なる位置についてＰＷＶを検出した後、該ウエルと接触を維持する半透過膜内部スリーブにて細胞を増殖させる。 最終工程は、ウエル内の１つ以上の異なる位置についてＰＷＶを検出し、そして当初のＰＷＶとその後のＰＷＶとを比較することである。 当初のＰＷＶとその後のＰＷＶとの差は、比色共鳴反射光バイオセンサー表面上、ウエル内の１つ以上の異なる位置で固定化した１種以上の特異結合物質に対して、ウエル内の半透過膜内部スリーブ上で増殖する細胞から分泌される１種以上の分子の相対的結合を示す。

特異結合物質に対する結合パートナーの結合を検出する能力、任意に次いで実質的に全体かまたは部分的に結合した特異結合物質をバイオセンサーの１つ以上の異なる位置から除去するのを検出する能力は、本発明の重要な側面である。 本発明のバイオセンサーは反射光波長のシフトを測定することにより、アレイを規定する１つ以上の異なる位置に結合するサンプルから結合パートナーの量を検出し定量することも可能である。 例えば、１つ以上の異なる位置における波長のシフトを、他の異なる位置での陽性および陰性対象と比較し、結合する特異結合物質の量を決定することができる。 重要なことに、かかる１つ以上の異なる位置はバイオセンサー表面で整列させることが可能であり、該バイオセンサーは約２、６、８、２４、４８、９６、３８４、１５３６または３４５６ウエルのマイクロタイタープレートなどの容器の内面を構成することができる。 一例として、９６個のバイオセンサーが把持固定器具に付着されており、各バイオセンサーが約１００の異なる位置を含んでなる場合、約９６００の生化学アッセイを同時に実施し得る。

それ故、表面プラズモン共鳴、共鳴ミラー、および導波管バイオセンサー用のアッセイと違って、記載した方法では共鳴光バイオセンサー表面上で何千もの個々の結合反応を同時に生じさせることができる。 本技法は、多数の生体分子相互作用を平行して測定する場合の適用に明らかに有用であり、とりわけ、分子標識が研究対象の分子の官能性を変化させたり、阻害したりする場合に有用である。 タンパク質標的を含む医薬化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング、およびプロテオミクス用のタンパク質−タンパク質相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、この方法のもたらす感度と処理能力を必要とする適用例である。

検出システム
検出システムはバイオセンサー、バイオセンサーに光を当てる光源、およびバイオセンサーが反射する光を検出する検出器を含むことができる。 一態様においては、所定の閾値を超える陽性結果のみが検出を作動させるフィルターを適用することにより、読み取り装置を単純化することができる。

光源はバイオセンサーをその上部表面（すなわち、１種以上の特異結合物質を固定化した表面）またはその底面から照射することができる。 本発明のバイオセンサーの各異なる位置で共鳴波長のシフトを測定することにより、異なるどの位置に結合パートナーが結合したかを決定することができる。 シフトの度合いは、テストサンプルにおける結合パートナーの量、および１種以上の特異結合物質とテストサンプル中の結合パートナーとの化学親和性を決定するために使用することができる。

バイオセンサーは２回照射し得る。 第一の測定では、バイオセンサー上に固定化した１種以上の特異結合物質をもつバイオセンサーアレイの１つ以上の異なる位置の反射スペクトルを測定する。 第二の測定では、１種以上の結合パートナーをバイオセンサーに加えた後の反射スペクトルを測定する。 これら２回の測定間のピーク波長における差は、バイオセンサーに、またはバイオセンサーの１つ以上の異なる位置に特異的に結合した結合パートナーの量の測定である。 この照射方法では、ピーク共鳴波長にわずかな変化をもつ領域を生じ得るバイオセンサー表面の小さな不均一性を制御することができる。 この方法ではまたバイオセンサーに固定化した特異結合物質の変化する濃度または分子量を制御することができる。

コンピューターシミュレーションは、ピーク共鳴波長と照射入射角間の予測される依存性を判定するために使用し得る。 図１に示すバイオセンサーは説明を目的とするものである。 選択された基板はガラス（ｎ _substrate ＝１．５０）であった。 格子は周期５１０ｎｍおよび充填率５６．２％（すなわち、表面の５６．２％が窒化シリコン四角形で被覆されており、残りは四角形間の領域である）をもつ窒化シリコン四角形の光学パターン（ｔ ₂ ＝１８０ｎｍ、ｎ ₂ ＝２．０１（ｎ＝屈折率）、ｋ ₂ ＝０．００１（ｋ＝吸収率））である。 窒化シリコン四角形間の領域には低屈折率物質を充填する。 また、同じ物質で四角形を被覆し、均一な上部平面を提供する。 このシミュレーションのために、ガラス層を選択し（ｎ ₁ ＝１．４０）、窒化シリコン四角形をｔ ₂ ＝１００ｎｍでカバーする。

波長関数としての反射強度は、厳密カップル波分析と様相分析のハイブリッドを用いる完全３次元ベクトルコードを利用するＧＳＯＬＶＥＲソフトウエアを使用し、モデルとした。 ＧＳＯＬＶＥＲは任意の複合体格子構造の平面波照射から、回折場および回折効率を計算する。 照射はいずれの入射角でも、またいずれの偏光でもよい。

図１０はピーク共鳴波長の照射入射角に対する依存性をプロットする。 このシミュレーションは光入射角と測定したピーク波長間に強い相関性のあることを示す。 この結果は、照射ビームのコリメーションおよび照射ビームと反射ビーム間の整列が、測定する共鳴ピーク線幅に直接影響することを暗示する。 照射ビームのコリメーションが乏しい場合には、一定幅の照射角でバイオセンサー上に入射し、純粋に平行とした光が入射した場合よりも幅の広い共鳴ピークが測定される。

バイオセンサーの低感度限界がピーク最大値を決める能力に関係するので、狭共鳴ピークを測定することが重要である。 それ故、該バイオセンサーを有する平行化照射システムの使用が最高の可能な感度を提供する。

バイオセンサー表面を照射し、反射光を集める１タイプの検出システムは、例えば、光源に結合する６本の照射光ファイバーと分光計につながる１本の集光光ファイバーを含むプローブである。 ファイバーの本数は重要ではなく、いずれの本数の照射または集光ファイバーも可能である。 ファイバーは束ねて配列し、集光ファイバーは束の中心にあるように、また６本の照射ファイバーが取り囲むようにする。 ファイバー束の先端は集光レンズに接続し、照射光をバイオセンサー表面に集める。

このプローブ配列において、照射および集光ファイバーは並列する。 それ故、平行化レンズがバイオセンサー表面に正確に光を集めるように調節すれば、６個の明瞭に限定された円形の照射領域と、中心の暗部領域が観察される。 バイオセンサーは光を散乱せずに、平行ビームを反射するので、光は集光ファイバーに入射せず、共鳴シグナルは観察されない。 ６本の照射領域が中心領域に重なり合うまで平行レンズの焦点をぼかすことによってのみ、いずれの光もが集光ファイバーに反射される。 焦点のぼけたわずかに非平行化光のみがシグナルを生じるので、バイオセンサーは単一の入射角では照射されず、ある幅の入射角で照射される。 入射角の範囲は図１０に示すような依存性のために共鳴波長の混合となる。 従って、他の場合で可能であるよりもより幅の広い共鳴ピークが測定される。

それ故、照射および集光ファイバープローブは空間的に同じ光路を共有することが望ましい。 照射および集光光路を同じ場所に配置するために、数種の方法が使用し得る。 例えば、１本の照射ファイバーはバイオセンサーに光を当てる光源にその第一端で接続し、また１本の集光ファイバーはバイオセンサーから反射される光を検出する検出計にその第一端で接続し、それぞれはそれらの第二端で照射器および集光器の両方として活動し得る第三のファイバープローブに接続する。 第三のファイバープローブは正常な入射角でバイオセンサーに方位を合わせ、逆伝播する照射および反射光シグナルを支える。 かかる検出システムの一例を図１１に示す。

もう一つの検出法は、単一照射ファイバー（光源に接続する）を集光ファイバー（検出器に接続する）に対し、９０度の角度で方向付けることの可能なビームスプリッターを使用することを含む。 光は照射ファイバープローブを介してビームスプリッター（バイオセンサーに光を当てる）に当てる。 反射光はビームスプリッター（集光ファイバープローブに光を差し向ける）に逆行する。 かかる検出装置の例を図１２に示す。 ビームスプリッターは、照射光と反射光がビームスプリッターとバイオセンサー間の共通の光路を共有することを可能とし、その結果、完全に平行化した光を焦点のぼやけなしに使用することができる。

角度走査
本発明の検出システムは、バイオセンサー表面の平行化白色光照射と反射ビームの共鳴ピークの分光測定に基づくものである。 バイオセンサー表面上の分子結合はピーク波長値のシフトにより示されるが、波長の増大は分子吸収の増大に対応する。

理論的モデル化および実験データに示すように、共鳴ピーク波長は検出光ビームの入射角に強く依存する。 図１０はこの依存性を本発明のバイオセンサーをモデルとして描く。 共鳴ピーク波長が角度に依存するため、入射白色光は十分に平行化する必要がある。 光ビームの角度分散は共鳴ピークを広げ、バイオセンサー検出感度を低下させる。 さらに、分光測定からのシグナルの質は、光源力と検出計の感度に依存する。 高いシグナル／ノイズ比を得るために、各検出位置について過度に長い積算時間が必要となり、その結果、バイオセンサープレートを読み取る全体の時間が長くなる。 波長可変レーザー源を格子共鳴検出に使用し得るが、高価である。

本発明の一態様において、これらの欠点にはバイオセンサーの照射にレーザービーム、および反射ビームパワーの測定に光検出計を使用することにより対処する。 走査ミラー装置を用いてレーザービームの入射角を変え、光学システムを用いて入射レーザービームの平行性を維持する。 例えば以下を参照：”Optical Scanning (光走査)" General F. Marchall ed., Marcel Dekker (1991)。 いずれのタイプのレーザー走査も使用し得る。 例えば、１秒間に約２本線ないし約１，０００本線の速度で走査線を生じ得る走査装置が本発明において有用である。 本発明の一態様において、走査装置は１秒間あたり約５０本線ないし３００本線を走査する。

一態様において、反射光ビームはレーザー走査光学システムの一部を通過し、単一光検出計により測定される。 レーザー光源は、例えば、７８０ｎｍ、７８５ｎｍ、８１０ｎｍ、または８３０ｎｍの波長をもつダイオードレーザーでよい。 このようなレーザーダイオードは１５０ｍＷまでのパワーレベルで容易に利用可能であり、それらの波長は高感度のＳｉホトダイオードに相当する。 従って、検出計はホトダイオードバイオセンサーに基づくものでもよい。 かかる検出システムを図１３に示す。 光源（３００）は光をスキャナ装置（４００）に供給し、それがその光を光学システム（５００）に差し向ける。 光学システム（５００）は光をバイオセンサー（６００）に差し向ける。 光はバイオセンサー（６００）から光学システム（５００）に反射され、そこでは光を光シグナル検出計（７００）に差し向ける。 検出システムの一態様を図３０に示す；図３０は走査ミラーがその角度位置を変化させると、表面上のレーザービームの入射角は、名目上ミラー角変位の２倍変化することを示す。 走査ミラー装置は約２Ｈｚから約１２０Ｈｚまでの周波数と、約１０度から約２０度の機械的走査角度で操作する線形検流計である。 この例では、一回の走査が約１０ミリ秒以内に終了し得る。 共鳴検流計または多角スキャナも使用し得る。 図３０に示す例は角度走査用単一光学システムを含む。 それはそれらの間に共通の焦点をもつ一対のレンズからなる。 光学システムはレーザーの平行化と反射光ビームの集光に最適な性能を発揮するように設計される。

角度分解能は検流計の規格および反射光サンプリング頻度に依存する。 検流計の分解能が３０秒角であるとすると、機械的相当するバイオセンサー角度走査の分解能は６０秒角、すなわち、０．０１７度である。 さらに、サンプリング速度が１００ｋサンプル／秒、１０ミリ秒以内に２０度と仮定する。 結果として、量子化工程は１０００サンプルについて２０度、すなわち、１サンプルあたり０．０２度である。 この例において、０．２度の共鳴ピーク幅は、ペンおよびモリス(Peng and Morris, "Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings （二次元格子からの回折における共鳴異形の実験的証明）”， Opitics Lett., 21: 549 (1996))が示すように、１０のデータポイントによりカバーされ、その各々が検出システムの分解能に相当する。

かかる検出システムの利点は以下の通りである：レーザービームによる入射光のすぐれた平行性、レーザーダイオードの高ビーム力による高シグナル／ノイズ比、分光計に代わる単一要素光検出計による低価格、および角度走査による共鳴ピークの高分解能。

ファイバー・プローブ・バイオセンサー
本発明のバイオセンサーは、マルチモード光ファイバープローブの先端に存在し得る。 この光ファイバープローブは、例えば、心臓動脈疾患、癌、炎症、および敗血症などの疾患および症状の生物マーカーのインビボ検出を可能とする。 単一のバイオセンサー要素（例えば、数百の格子周期を含む）は、光ファイバープローブの先端に組込むか、またはガラス基板から組立て、光ファイバープローブの先端に付着させる。 図１４を参照。 単一のファイバーを用いて照射を行い、共鳴反射シグナルを測定する。

例えば、図１１に示した構造に類似のファイバープローブ構造を用いて、照射ファイバーと検出ファイバーを、先端にバイオセンサーを埋め込むか、または付着させた１本の逆伝播ファイバーに結合することができる。 光ファイバープローブは哺乳動物の体内、例えば、人体に挿入する。 プローブを体内に挿入する間に、照射と反射シグナルの検出が起こり得る。

以下は例示を目的としてのみ提供するものであり、広い意味で上に記載した本発明の範囲を限定しようとするものではない。 本明細書の開示に引用した文献はすべて参照により本明細書の一部とする。

固定化タンパク質の検出
生体分子をバイオセンサーの表面で定量するその能力を証明するために、様々な濃度でＨ ₂ Ｏに溶かしたＢＳＡの液滴を、図１に示したように、バイオセンサーに加えた。 ３μｌの液滴を風乾し、少量のＢＳＡを直径約２ｍｍの領域に分布させる。 各バイオセンサー位置のピーク共鳴波長を、液滴沈着の前後で測定し、そのピーク波長シフトを記録した。 図３４を参照。

１種以上の特異結合物質の固定化
比色共鳴反射バイオセンサーのアミン官能基をもつ表面を活性化するために、以下のプロトコールを用いた。 アミン基は、引き続く数種のリンカー分子の共有結合のために、一般的な目的の表面として使用することができる。

本発明のガラス基板バイオセンサーをピラニア腐食液（７０／３０％（ｖ／ｖ）濃硫酸／３０％過酸化水素）に１２時間浸漬して清浄化する。 バイオセンサーを水で完全に洗った。 該バイオセンサーを３％３−アミノプロピルトリエトキシシラン／乾燥アセトン溶液に１分間浸し、乾燥アセトンで洗い、風乾した。 あるいは、バイオセンサーを１０％３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ピアース）／エタノール（アルドリッチ）溶液に１分間浸漬し、次いで、エタノールで簡単に洗浄する。 次いで活性化したセンサーを７０℃で１０分間乾燥した。 次いで、バイオセンサーを水洗した。

バイオセンサー表面上のアミノ基の存在を証明するために、準定量法を使用する。 アミノ官能化バイオセンサーの各バッチからの１つのバイオセンサーを５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）５ｍＬで簡単に洗浄する。 次いで、バイオセンサーを、０．１ｍＭスルホ−スクシニミジル−４−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−ブチレート（ｓ−ＳＤＴＢ、ピアース、ロックフォード、イリノイ）を含む５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）５ｍＬに浸し、３０分間激しく振盪する。 ｓ−ＳＤＴＢ溶液はｓ−ＳＤＴＢ３．０ｍｇをＤＭＦ１ｍＬに溶かし、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）で５０ｍＬに希釈することにより調製する。 ３０分間インキュベーションした後、バイオセンサーを２０ｍＬのｄｄＨ ₂ Ｏで３回洗い、次いで、３０％過塩素酸５ｍＬで処理する。 オレンジ色の溶液となることは、バイオセンサーが成功裏にアミンで誘導化されたことを示している；未処理ガラスバイオセンサーについては色の変化が観察されない。

過塩素酸処理後、上記の手法に従い、該溶液の４９５ｎｍでの吸光度を、該表面上のアミン基定量の指標として使用する。 １セットの実験で、シグマスライド、セル−アソシエート(Cel-Associate)スライド、および自家製バイオセンサースライドの吸光度は、それぞれ０．６２７、０．６４７、および０．７２８であった。 このことはバイオセンサー表面のＮＨ ₂活性化のレベルが、市販のマイクロアレイ・ガラススライドの活性化に匹敵することを示している。

バイオセンサーをアミンで活性化する上記プロトコールに従い、リンカー分子をバイオセンサーに付着させることができる。 架橋剤を選択する場合、反応性基の選択性、スペーサーアームの長さ、溶解性、および切断性などの問題を考慮すべきである。 このリンカー分子は、結合パートナーの特異的認識に使用される特異結合物質に結合する。 一例として、以下のプロトコールを用い、ビオチン・リンカー分子をアミン活性化バイオセンサーに結合した。

アミン被覆バイオセンサーをビオチンで活性化するプロトコール
アミン被覆バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ８．０）で３回洗う。 スルホ−スクシニミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、ピアース、ロックフォード、イリノイ）／ＰＢＳバッファー（ｐＨ８）溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ濃度）を調製する。 スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液２ｍｌを各アミン被覆バイオセンサーに加え、室温で３０分間インキュベートする。 バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ８．０）で３回洗う。 スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン・リンカーの分子量は５５６．５８であり、長さは２２．４Åである。 得られるバイオセンサーはアビジンまたはストレプトアビジンの捕捉に使用し得る。

アミン被覆バイオセンサーをアルデヒドで活性化するプロトコール
２．５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液、０．０５％アジ化ナトリウム、０．１％水素化シアノホウ素ナトリウム、ｐＨ７．０を調製する。 スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液２ｍｌを各アミン被覆バイオセンサーに加え、室温で３０分間インキュベートする。 バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗う。 グルタルアルデヒド・リンカーの分子量は１００．１１である。 得られるバイオセンサーはタンパク質と他のアミン含有分子とを結合するために使用し得る。 反応はシッフ塩基の形成を経て進行し、次の還元的アミノ化で安定な第二級アミン結合を生じる。 １実験において、本発明者が作製した被覆アルデヒドスライドは市販のアルデヒドスライド（セル−アソシエート）に比較した場合、本発明者が作製したスライド上のストレプトアビジンおよび高ウサギＩｇＧに１０倍高い結合が観察された。

アミン被覆バイオセンサーをＮＨＳで活性化するプロトコール
２５ｍＭ炭酸Ｎ，Ｎ'−ジスクシニミジル（ＤＳＣ、シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）／炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）を調製した。 ＤＳＣ溶液２ｍｌを各アミン被覆バイオセンサーに加え、室温で２時間インキュベートした。 バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ８．５）で３回洗浄した。 ＤＳＣリンカーの分子量は２５６．１７であった。 得られるバイオセンサーはヒドロキシル−またはアミン−含有分子に結合させるために使用する。 このリンカーは利用可能な最小のホモ生体機能性ＮＨＳエステル架橋試薬の一つである。

上記のプロトコールに加えて、多くのさらなる表面活性化と分子リンカーの技法が、異なるタイプの生体分子についてアッセイの実施を最適化するものとして報告されている。 これらの内、最も共通のものはアミン表面、アルデヒド表面、およびニッケル表面である。 この活性化表面は、表１に示すように、数種の異なるタイプの化学リンカーをバイオセンサー表面に付着させるために使用することができる。 アミン表面を用いて数種のリンカー分子を付着させるが、一方、アルデヒド表面は、さらなるリンカーなしに直接タンパク質を結合させるために使用する。 ニッケル表面は組込まれたヒスチジン（“ｈｉｓ”）タグを有する分子を結合させるために専ら使用する。 ニッケル活性化表面上の「ｈｉｓ−タグ標識」分子の検出は周知である(Sigal et al., Anal. Chem. 68, 490 (1996))。 表１はバイオセンサーを調製し、使用するために用いられる工程の結果の一例、および表面活性化化学、化学リンカー分子、特異結合物質および結合パートナー分子に利用可能な様々の選択肢を示す。 ＨＲＰまたはストレプトアビジンなどの大型分子での増幅を介して、また分子の結合に利用し得る表面積を拡大するためにデキストランまたはＴＳＰＳなどのポリマー物質の使用を介して、検出シグナルを増強する機会も存在する。

ＩｇＧアッセイ
生化学的結合検出の最初の証明として、バイオセンサーを実施例２に記載のアミノ表面化学により活性化し、次いでビオチンリンカー分子を付着させることにより調製するアッセイを実施した。 ビオチンリンカーは、ＰＢＳ中、５０μｇ／ｍｌ濃度のストレプトアビジン溶液に室温で２〜４時間接触させることにより、ストレプトアビジン・レセプター分子を特異的に相互作用させ、効果的にその表面に結合させるために使用する。 ストレプトアビジン・レセプターはいずれのビオチン化タンパク質をもバイオセンサー表面に結合させることができる。 この実施例３では、３μｌ液滴のビオチン化抗ヒトＩｇＧ／リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）を、バイオセンサー表面上４つの個別の位置に、２００μｇ／ｍｌの濃度で置いた。 この溶液をバイオセンサー上で３０分間インキュベートさせ、その後ＰＢＳで十分にすすいだ。 ４つの位置のピーク共鳴波長を、ビオチン活性化後、ストレプトアビジン・レセプター添加後、およびａｈ−ＩｇＧ結合後に測定した。 図３４は、ストレプトアビジンとａｈ−ＩｇＧ添加後に、共に共鳴波長の明瞭に測定可能な増大を生じることを示す。

ビオチン／ストレプトアビジン・アッセイ
ビオチン・レセプター層により結合するストレプトアビジンを検出するために、一連のアッセイを実施した。 すでに記載したように、バイオセンサーを先ずアミン化学で活性化し、次いで、ＮＨＳ−ビオチン・リンカー層を付着させた。 次に、３μｌ液滴のストレプトアビジン／ＰＢＳを種々の濃度でバイオセンサーに加えた。 バイオセンサー表面上、液滴を３０分間インキュベートし、ＰＢＳで十分に洗い、ＤＩ水ですすいだ。 ストレプトアビジン結合の前後に、ピーク共鳴波長を測定した；共鳴波長のシフトを図１６に示す。 ピーク波長とストレプトアビジン濃度との間に直線の相関性が観察された；この事例で測定された最低のストレプトアビジン濃度は０．２μｇ／ｍｌであった。 この濃度は３．３ｎＭのモル濃度に相当する。

タンパク質−タンパク質結合アッセイ
タンパク質−タンパク質相互作用の検出を証明するためにアッセイを実施した。 すでに記載したように、バイオセンサーをアミン化学とＮＨＳ−ビオチンリンカー層により活性化した。 ヤギ抗ビオチン抗体レセプター層は、バイオセンサーを５０μｇ／ｍｌ濃度のＰＢＳ溶液に室温で６０分間接触させ、次いでＰＢＳで洗浄し、ＤＩ水ですすぐことによりビオチン層に付着させた。 バイオセンサー表面上での非特異タンパク質と未結合ビオチンとの相互作用を防止するために、バイオセンサー表面を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液に３０分間接触させた。 この工程の意図は、不所望のタンパク質がバイオセンサーと相互作用するのを「遮断」することにある。 図１７に示すように、有意量のＢＳＡがレセプター層に取り込まれ、誘発されるピーク波長の増大によって示される。 遮断後、３μｌ液滴の種々濃度の抗ヒツジＩｇＧをバイオセンサー表面上の個別の位置に加えた。 液滴を３０分間インキュベートし、ＤＩ水ですすいだ。 バイオセンサーピーク共鳴波長を遮断前、遮断後、レセプター層結合後、および各スポットについての抗ヤギＩｇＧ検出後に測定した。 図１７は１０μｇ／ｍｌ濃度の抗ヤギＩｇＧが容易に測定可能な波長シフトを生じることを示す。

非標識ＥＬＩＳＡアッセイ
バイオセンサーアレイプラットホームのもう一つの応用は、酵素標識とその後の着色色素を生成させる酵素特異基質との相互作用を必要とせずに、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を遂行するその能力である。 図１８は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をＩＦＮ−γ抗体レセプター分子で検出するためにバイオセンサーを調製した実験結果を示す。 該レセプター分子はＳＭＰＴリンカー分子（ピアース・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ）でＮＨ ₂活性化バイオセンサー表面に共有結合で付着させた。 ＮＨ ₂ 、ＳＭＰＴ、および抗ヒトＩＦＮ−γレセプター分子を適用した際のピーク共鳴波長シフトを、図１８に示すように、バイオセンサー表面上２ヶ所の隣接する位置について測定した。 ２ヶ所を２種類の異なるタンパク質のＰＢＳ溶液に１００μｇ／ｍｌの濃度で接触させた。 第一位置はＩＦＮ−γに接触させたが、このものはレセプター分子と結合すると予測される。 一方、第二の位置は神経成長因子（ＮＧＦ）に接触させたが、このものはレセプターと結合しないと予測される。 ３０分間のインキュベーションの後、バイオセンサーを底部から照射することにより測定した；その間、上面は液中に浸漬したままとした。 ＩＦＮ−γに接触した位置は波長シフト０．２９ｎｍを示した；一方、ＮＧＦに接触した位置の波長シフトはわずかに０．１４ｎｍであった。 従って、本バイオセンサーにより、いかなるタイプの酵素標識も、または色生成酵素反応も使用することなく、異なる種類のタンパク質を含む溶液間を識別し得た。

プロテアーゼ・インヒビター・アッセイ（カスパーゼ−３）
カスパーゼ−３プロテアーゼ・インヒビター・アッセイは、医薬化合物スクリーニングに関連する実験環境において、小型分子の存在および切断を測定するバイオセンサーの能力を証明するために実施した。

カスパーゼ（システイン要求アスパルテートプロテアーゼ）は細胞死を仲介するプロテアーゼの一系列であり、アポトーシスの過程で重要である。 カスパーゼ３、エフェクター・カスパーゼは、殆どの既知のカスパーゼ関連基質を選択的に切断し得るために、最も研究された哺乳動物カスパーゼである。 カスパーゼ３アッセイは、カスパーゼ３により４−アミノ酸ペプチド基質、ＮＨＳ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ―Ｖａｌ−Ａｓｐ・ｐ−ニトロアニリド（ＮＨＳ−ＧＤＥＶＤ−ｐＮＡ）を加水分解し、ｐＮＡ部分を放出させることに基づく。
カスパーゼ３
(NHS-GDEVD-pNA)―――――→(NHS-GDEVD)+pNA

ＧＤＥＶＤのＮ−末端に付着したＮＨＳ分子は、ＮＨＳ−ＧＤＥＶＤ−ｐＮＡ複合体を表面からある方向に配置した複合体のｐＮＡ部分をもつバイオセンサーに共有結合させることのできる反応性末端基を提供する。 この方法で付着させたカスパーゼ−３はその基質切断部位に最もよく接近する。

バイオセンサーは、３：１ Ｈ ₂ ＳＯ ₄・Ｈ ₂ Ｏ ₂溶液中で（室温、１時間）切断し、次いでシラン化（２％シラン／乾燥アセトン、３０秒）し、ポリ−ｐｈｅ−リジン（ＰＰＬ）層（１００μｇ／ｍｌのＰＰＬ／ＰＢＳ、０．５Ｍ−ＮａＣｌによりｐＨ６．０、１０時間）を付着させることにより調製した。 ＮＨＳ−ＧＤＥＶＤ−ｐＮＡ複合体は、バイオセンサーを１０ｍＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ８．０、室温、１時間）に接触させることにより付着させた。 マイクロウエル・チャンバーはバイオセンサー表面を被って封印し、ｐＮＡの切断は１００μｌのカスパーゼ−３／１ｘ酵素バッファー（１００ｎｇ／ｍｌ、室温、９０分）を加えることにより実施した。 カスパーゼ３溶液に接触した後、バイオセンサーをＰＢＳで洗った。 分光光度計を用いる別セットの実験を用い、バイオセンサー表面に対する該複合体の接着と、表面結合複合体からのｐＮＡ分子除去のためのカスパーゼ−３の機能的活性を確認した。

バイオセンサーのピーク共鳴周波数は、ＮＨＳ−ＧＤＥＶＤ−ｐＮＡ複合体の付着前、複合体（ＭＷ＝８６０Ｄａ）の付着後、およびカスパーゼ３によるｐＮＡ（ＭＷ＝１３６）の切断後に測定した。 図１９に示すように、ペプチド分子の付着は、その後のｐＮＡの除去同様に、明瞭に測定し得る。 Δλ＝０．０１６ｎｍのｐＮＡ除去シグナルは、０．００３ｎｍの最小の検出可能ピーク波長シフトよりも５．３ｘ高い。 加えた分子量と引き算した分子量の比（８６０Ｄａ／１３６Ｄａ＝６．３２）は、加えた物質と引き算した物質について観察されるピーク波長シフトの比（０．０８２ｎｍ／０．０１６ｎｍ＝５．１４）と非常によく一致する。

この実験の結果は、バイオセンサーが標識することなく小型のペプチド（この場合、５−マー）の測定を可能とし、酵素の活性を介して、分子の１３０Ｄａ部分の除去を検出することも可能であることを確認するものである。

タンパク質−タンパク質結合アッセイの反応速度
本発明のバイオセンサーは、液体に浸漬している間の時間関数として連続的に探査し得るので、バイオセンサーは両方の終末点検出実験を遂行し、生化学的反応についての反応速度情報を得るために利用し得る。 一例として、図２０は、バイオセンサー表面に種々の結合パートナーを連続的に加える過程において、単一のバイオセンサー位置を連続的に測定する実験結果を示す。 実験の全過程で、検出プローブがバイオセンサー基板の背面からバイオセンサーを照射する一方、生化学を器具上面で実施する。 測定したバイオセンサー位置の周囲はゴムガスケットで封印し、加えた試薬の範囲が限定されるようにした；測定はすべてバイオセンサー上面がバッファー溶液に浸漬した状態で実施した。 最初の洗浄後、バイオセンサーをＮＨ ₂およびＮＨＳ−ビオチン・リンカー分子で活性化した。 図２０に示すように、数種の異なる濃度（１、１０、１００、１０００μｇ／ｍｌ）のヤギα−ビオチン抗体を連続的にバイオセンサーに加え、ピーク共鳴波長をモニターしながら３０分間インキュベートする。 最高濃度のα−ビオチンＩｇＧを加えた後、数種の濃度（０．１、１、１０、および１００μｇ／ｍｌ）のα−ヤギＩｇＧを加えることにより、第二層のタンパク質をバイオセンサー表面に結合させた。 再び、各溶液をバイオセンサー上で３０分インキュベートしながら、共鳴ピークを連続的にモニターした。 図２０は各インキュベーション周期の終末で、共鳴ピークが如何により大きな波長にシフトしたかを示す。

図２１は図２０からの最終共鳴ピーク遷移の速度論的結合曲線を示し、その場合、１００μｇ／ｍｌのα−ヤギＩｇＧをバイオセンサーに加える。 該曲線は速度論的結合実験について一般に観察されるタイプのプロフィールを提示する；この場合、基礎周波数からの急速な増大が当初観察され、次いで応答が次第に飽和となる。 このタイプの反応プロフィールは実験で測定された遷移すべてについて観察された。 図２２はＩｇＧ結合の速度論的結合測定を示す。

酵素活性によるバイオセンサー表面からの物質の除去も容易に観察される。 上記実験（ヤギ抗ビオチンＩｇＧおよび抗ヤギＩｇＧの２種のタンパク質コーティングによる）からのバイオセンサーを１ｍｇ／ｍｌ濃度でプロテアーゼ・ペプシンに接触させると、酵素が両方のＩｇＧ分子を解離し、バイオセンサー表面からそれらを除去する。 図２３に示すように、結合した分子の表面からの除去は時間関数として観察することができる。

プロテオミクス用途
本発明のバイオセンサーは、プロテオミクス適用のために使用し得る。 バイオセンサーアレイは、例えば、タンパク質またはファージ提示ライブラリーを含んでなる結合パートナーの混合物を含むテストサンプルに接触でき、次いでバイオセンサー表面をすすいで未結合物質のすべてを除去する。 バイオセンサーは光学的にプローブし、バイオセンサー表面のどの異なる位置が最大の結合度を示しているのかを決定し、結合物質の定量的測定値を決定する。 次に、バイオセンサーを少量（例：＜５０マイクロリットル）一定容量の液体をバイオセンサー表面に接触させ得る「フローセル」に容れる。 一方の電極を活性化し、選択したバイオセンサーアレイの異なる位置のみから結合した物質を溶出するようにする。 結合した物質はフローセル液内で希釈されることになる。 フローセル液はバイオセンサー表面から吸出し、マイクロタイタープレートまたは何らかの他の容器に貯蔵する。 フローセル液はフレッシュな溶液と置換え、新しいバイオセンサー電極を活性化し、結合した結合パートナーを溶出する。 この工程は、対象のバイオセンサーの異なる位置すべてが溶出され、個別の容器に集まるまで繰り返す。 もしテストサンプル液がタンパク質混合物を含んでいるならば、個々の容器内のタンパク質含量はエレクトロスプレー・タンデム質量分析などの技法により分析し得る。 もし該サンプル液がファージ提示ライブラリーを含んでいるならば、個々の容器内のファージクローンは、宿主株細菌とのインキュベーション、濃度増幅、および関連ライブラリーＤＮＡ配列を通して同定し得る。

均一系アッセイの証明
ＳＷＳバイオセンサーはその表面と接触する均一系液体の光学濃度を検出し、Δｎ＝４×１０ ^-5という小さな差の屈折率をもつ液体を判別し得る。 ２種の遊離の非相互作用タンパク質を含む溶液は、２種類の結合した相互作用タンパク質を含む溶液と異なる屈折率を有するので、ＳＷＳバイオセンサーは、タンパク質−タンパク質相互作用が溶液中で起こる場合に、いかなる種類の粒子タグまたは化学的標識もなしに測定し得る。

３種のテスト溶液を比較用に調製した：
１． アビジン／リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）（１０μｇ／ｍｌ）
２． アビジン（１０μｇ／ｍｌ）＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１０μｇ／ｍｌ）／ＰＢＳ
３． アビジン（１０μｇ／ｍｌ）＋ビオチン化ＢＳＡ（ｂ−ＢＳＡ）（１０μｇ／ｍｌ）／ＰＢＳ

交差バイオセンサーバイアスの可能性を除去するために、すべての測定に単一のＳＷＳバイオセンサーを使用した。 各テスト溶液のサンプル２００μｌをバイオセンサーに加え、１０分間平衡化させた後、ＳＷＳバイオセンサーピーク共鳴波長値を測定した。 サンプル間でバイオセンサーをＰＢＳで完全に洗った。

テスト溶液についてのピーク共鳴波長値を図２４にプロットする。 アビジン溶液は、アビジン＋ＢＳＡ溶液およびアビジン＋ｂ−ＢＳＡ溶液に比較するために基線対照として用いた。 アビジンにＢＳＡを加えても、この２つのタンパク質は相互作用しないと予測されるため、生じる共鳴波長の増大はきわめて小さい。 しかし、ビオチンとアビジンは強く結合する（Ｋｄ＝１０ ^-15 Ｍ）ので、アビジン＋ｂ−ＢＳＡ溶液はより大きな結合タンパク質複合体を含む。 従って、アビジン＋ｂ−ＢＳＡ溶液のピーク共鳴波長値は、アビジン＋ＢＳＡに比較して大きなシフトを与える。

ＢＳＡ（ＭＷ＝６６ＫＤａ）およびｂ−ＢＳＡ（ＭＷ＝６８ＫＤａ）間の分子量の差は、極端に小さい。 従って、非相互作用タンパク質（アビジン＋ＢＳＡ）を含む溶液と相互作用タンパク質（アビジン＋ｂ−ＢＳＡ）間で測定される差は、２つの分子間の結合相互作用における差にのみ寄与する。 結合した分子複合体は、結合した複合体を含まない溶液とは異なる光学的屈折率をもつ溶液を生じる。 光学的屈折率の変化はＳＷＳバイオセンサーにより測定される。

マイクロタイタープレートアッセイ
マイクロタイタープレートの内面を構成する比色共鳴反射光バイオセンサー上の生化学的結合検出の証明として、以下のアッセイを実施した。 この研究に選択されたタンパク質−タンパク質系は、特異結合物質としてバイオセンサー表面に固定化したビオチンを用いる抗ビオチンＩｇＧ抗体の検出であった。 それ故、バイオセンサー表面上のビオチンの固定化プロトコールは、アミン表面基とビオチン間の媒介物として作用する二官能性ポリエチレングリコール−Ｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ−ＰＥＧ）リンカー分子（シェアーウオーター(Shearwater)ポリマー、インク）を利用するものとして開発した。 ＮＨＳ−ＰＥＧ分子は、ＮＨＳが優先的にアミン活性化表面に結合し、表面から正しい位置に適応する分子のＰＥＧ部分を生じ得るように特別に設計する。 ＮＨＳ−ＰＥＧリンカー分子は、ビオチン分子をバイオセンサー表面から僅かな距離はなし、そのコンホメーションを維持し、その結果、他の分子に対する親和性を維持し得るように働く。 ＰＥＧはまたバイオセンサーにタンパク質が非特異的に結合するのを防止するためにも働く。

マイクロタイタープレートの底部にアミン活性化バイオセンサーシートを付着させた後、個々のマイクロタイターウエルは、抗ビオチンＩｇＧ検出用の十分な実験対照を提供するために、３種の異なる表面官能基により調製した。 最初に、アミン活性化表面についてさらに修飾することなく検討した。 アミン活性化表面は非特異的にタンパク質を結合させると予測されるが、親和性は高くない。 二番目に、ＮＨＳ−ＰＥＧ二官能性リンカー分子をもつマイクロタイターウエルを調製した。 ＮＨＳ−ＰＥＧ分子はタンパク質を結合しない表面を提供すると予測される。 三番目に、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン・リンカー分子をもつマイクロタイターウエル分子を調製した。 ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン分子は抗ビオチンＩｇＧに強力に結合すると予測される。

アミン被覆バイオセンサーをビオチンで活性化するために、２ｍｌのＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン（シェアーウオーター）／ＴＰＢＳ（リン酸バッファー溶液中０．０１％トゥイーン^TM ２０の対照バッファー溶液、ｐＨ８）溶液を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でバイオセンサー表面に加え、３７℃で１時間インキュベートした。 同じ手法を用い、ビオチンなしのＮＨＳ−ＰＥＧ（シェアーウオーター）分子を付着させた。 購入した試薬類はすべて包装品をそのまま使用した。

バイオセンサーの操作性を証明するために、タンパク質−抗体親和性アッセイを実施した。 ３種の別個のバイオセンサー表面状態のマトリックス（ＮＨ ₂ 、ＮＨＳ−ＰＥＧ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン）を調製し、７濃度のヤギ抗ビオチンＩｇＧ（シグマ）に接触した。 同時に測定した合計２１ウエルについて、各マトリックス位置を個別のマイクロタイタープレートウエル内で測定した。 ＮＨＳ−ＰＥＧウエルはタンパク質を結合しないと予測されるので、テストサンプルの屈折率の影響およびアッセイ途上での環境温度変化などの共通の方式の影響をキャンセルするために、対照としてそれらを提供する。

図２５はバイオセンサー表面にＮＨ ₂ 、ＮＨ ₂ ＋（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、およびＮＨ ₂ ＋（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン）分子を付着させることにより記録した、固定化化学官能基をもたないバイオセンサーを対照とするＰＷＶシフトを示す。 誤差バーは７つのマイクロタイタープレートウエルで記録したＰＷＶシフトの標準偏差を示す。 このデータは、バイオセンサーが清浄表面と固定化ＮＨ ₂をもつ表面とを識別し得ること、またＮＨＳ−ＰＥＧ（ＭＷ＝２０００Ｄａ）分子の付加を明瞭に検出することを示している。 ＮＨＳ−ＰＥＧおよびＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン（ＭＷ＝３４００Ｄａ）を固定化した表面の差も測定可能である。

図２６Ａ〜Ｃは、種々濃度の抗ビオチンＩｇＧ（０〜８０ｍｇ／ｍｌ）に接触させ、２０分間インキュベートしたときのＰＷＶシフト応答をバイオセンサーに対する時間関数として示す。 ＮＨＳ−ＰＥＧ表面（図２６Ｂ）の応答は最低であるが、他方、アミン活性化表面（図２６Ａ）は高濃度の抗ビオチンＩｇＧとの非特異的相互作用が低レベルであることを示している。 ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン表面（図２６Ｃ）は、抗ビオチンＩｇＧとの強力な特異的相互作用が、接触した抗ビオチンＩｇＧの濃度に比例して強いＰＷＶシフトを生じることを示している。

図２６Ｃから２０分後のＰＷＶシフトの大きさは、図２５において抗ビオチンＩｇＧ濃度の関数としてプロットされる。 ＩｇＧ濃度と測定したＰＷＶシフト間には大まかな直線的相関性が観察され、最低濃度のＩｇＧ溶液（１．２５μｇ／ｍｌ、８．３３ｎＭ）は、陰性対照のＰＢＳ溶液を超えて、明らかに測定可能である。

酵素活性を介してのバイオセンサー表面からの物質の除去を図２７に示す。 バイオセンサーを１ｍｇ／ｍｌ濃度のプロテアーゼペプシン（容量＝１００μｌ）に接触させると、該酵素がヤギ抗ビオチンＩｇＧと抗ヤギＩｇＧ両方を解離し、バイオセンサー表面からそれらを除去する。 表面に対する結合分子の除去は時間の関数として観察し得る。

比色共鳴反射光バイオセンサー上での増殖細胞（９６穴マイクロタイタープレート）
マイクロタイタープレートの内面を構成する比色共鳴反射光バイオセンサーは、培養播種前に無菌化した。 無菌化はバイオセンサーをバイオセーフティフードに容れ、該マイクロタイタープレートと保護箱をＵＶ光に１２〜４８時間、より好ましくは約１６〜３６時間、さらにより好ましくは１８〜３０時間、そして最も好ましくは約２４時間、露光することにより実施した。 細胞は軟骨細胞増殖培地（セル・アプリケーション・インク）で増殖した軟骨細胞およびＲＰＭＩ（シグマ）にて増殖したＨＥＫヒト腎臓腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）の生培養物から収穫した。 １×１０ ⁵ないし１×１０ ⁶個の細胞を各９６ウエルに加え、マイクロタイタープレートを保護箱に容れて、ＣＯ ₂インキュベーター中、３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。

バイオセンサー位置での細胞増殖は、比色共鳴反射光バイオセンサー表面のピーク波長を介して検出するか、またはより一般的にはレンズに基づく光学、もしくは電子工学に基づく電荷結合素子（ＣＣＤ）技法を利用する顕微鏡、デジタルカメラ、通常のカメラ、または他の倍増型もしくは非倍増型の可視化装置を用いてモニターすることができる。

比色共鳴反射光バイオセンサー上での細胞の形態学的変化の検出
細胞の形態学的変化は、マイクロタイタープレートの内面を構成する比色共鳴反射光バイオセンサーを利用して検出した。 軟骨細胞を実施例１２に従って１０〜９０％コンフルエントの単層に増殖した。 この細胞単層をハンクス培地（シグマ）などの塩平衡バッファーで洗い、洗浄またはハンクス培地などの塩平衡培地と細胞を１０分間インキュベートすることで、単層の安定性について試験した。 バイオセンサー位置の単層安定性は、いずれの位置についても、洗浄またはインキュベーション工程の前、間、または後にピーク波長値を検出することにより評価することができる。

０．２５％トリプシン／トリス−ＥＤＴＡを室温に加温して、ピーク波長値を検出しながらバイオセンサーウエルに加えた。 ブランク対照は細胞を増殖しないものを利用した。 図２８に見ることができるように、反応の進行は１２分間追跡した。 細胞はアッセイの全過程、バイオセンサー表面に付着したままであることが観察された；軟骨細胞を容れたバイオセンサーウエルに２ｍｇ／ｍｌのトリプシンを加えることで観察されるＰＷＶの低下は、軟骨細胞形態学が変化したことを意味している。 対照（軟骨細胞なし）ウエルはトリプシンの添加に有意な応答を示した。

図２９は腎臓腫瘍細胞を用いる細胞接着アッセイの結果を示す。 バイオセンサー表面上で増殖した腎臓腫瘍細胞を容れた６つのバイオセンサーウエルにトリプシンを加えた。 ２つのウエルは３種のトリプシン濃度それぞれについての重複サンプルとして利用した。 トリプシンの添加により、ＰＷＶの低下が観察される；これはバイオセンサー表面から細胞脱離したことを示している。

一次細胞株および腫瘍細胞株の両方が、マイクロタイタープレートウエル内の比色共鳴反射光バイオセンサー表面上で良好に増殖することが観察され、真核細胞は非常に安定なＰＷＶを生成することが観察された。

比色共鳴反射光バイオセンサーとの接触を維持した半透過性内部スリーブにおいて増殖する細胞から放出される分子の検出
細胞から分泌、放出またはさもなくば排出される分子は、マイクロタイタープレートウエルの内面を構成する比色共鳴反射光バイオセンサーを利用し、検出し得る。 インターロイキン−１に対する抗体をマイクロタイタープレートウエル内の比色共鳴反射光バイオセンサー表面に固定化した。 半透過性内部スリーブをウエルに挿入し、次いで、マウスマクロファージ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０１９）およびＲＰＭＩ１６４０増殖培地（シグマ）を容れた。 実施例１２の方法に従い、バイオセンサー表面の数ヶ所で比色共鳴反射光ＰＷＶを検出しながら、細胞を増殖させた。 リポ多糖体（シグマ）を用いてインターロイキン−１の産生を刺激した場合、インターロイキン−１がマクロファージ細胞から分泌され、半透過性内部スリーブを通って拡散し、バイオセンサー表面上に固定したインターロイキン−１抗体に結合するに従い、時間と共にＰＷＶの増大が認められた。

比色共鳴反射光バイオセンサー上でのタンパク質マイクロアレイの証明
比色共鳴反射光バイオセンサーは、アレイフォーマットでアッセイを実施し得る；本実施例では、異なるタイプのＩｇＧ内での示差結合親和性の検出能力を説明する。

本実施例では、バイオセンサーシートを１インチ×２インチの長方形に切断する。 センサーは疎水性ＴａＯ表面からなり、これにそれぞれ１ｍｇ／ｍｌのウサギ−ＩｇＧ、ニワトリ−ＩｇＧ、ヤギ−ＩｇＧ、およびヒト−ＩｇＧ（すべてシグマからのＩｇＧ）を、４００μｍスポット形成ループをもつアフィメトリックス(Affymetrix)ＧＭＳピン／ループ・スポッターによりスポットする。 総計７スポットずつ４列を作り（図３５Ａを参照）、第１列はウサギ−ＩｇＧ；第２列はニワトリ−ＩｇＧ；第３列はヤギ−ＩｇＧ；および第４列はヒトＩｇＧとする。 スポット形成後、ＩｇＧを室温で３０分間インキュベートする。 引き続き、ジョビン・イボン(Jobin Yvon)高分解画像化分光計からなるＳＲＵマイクロアレイ・スキャナを用いて、得られるデータを走査する；これを図３５Ａに示す。

スポット形成後、１ｍｇ／ｍｌのゼラチン（シグマ）をブロック剤として表面に流し、結合剤（抗ヒト−ＩｇＧ）が非スポット領域に非特異的に結合するのを防止する。 マイクロアレイスライド全体をＰＢＳ中で３回、各回１０秒間すすぎ、次いでＨ ₂ Ｏで３回、各回１０秒間すすぐ。 次いで、得られるマイクロアレイをＳＲＵマイクロアレイ・スキャナで走査する。 最後に、１００μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧを表面全体に流し、室温で３０分間インキュベートし、次いで上に示したのと同じＰＢＳリンス手法によりすすぐ。 得られる結合相互作用物を含むマイクロアレイをＳＲＵマイクロアレイ・スキャナでもう一度走査する。 この最終走査と遮断後に実施した走査間の差は、マイクロアレイ上の各スポットに結合した物質の量を示す（図３５Ｂを参照）。 特に、ヒトＩｇＧと抗ヒトＩｇＧとの間の高度の親和性は、図３５Ｂの最下列に相当する強力な応答で明らかである。 さらに、図３５Ｂにおける強度スケール０．０４ｎｍ／強度計数値で、マイクロアレイ・システムにより観察される０．８ｎｍから１．０ｎｍ波長シフトの結合結果は、ウエルによるアッセイでの観察と一致する。

比色共鳴反射光バイオセンサー上のＤＮＡ−ＤＮＡ結合相互作用の証明
比色共鳴反射光バイオセンサー上のハイブリダイセーション事象の検出を証明するために、固定化したチミン１８塩基のオリゴヌクレオチド配列（ポリ−Ｔ）にハイブリッド形成するアデニン１８塩基のオリゴヌクレオチド配列（ポリ−Ａ）を用い、バイオセンサーシートに結合した底部無処理９６穴プレートを用いて実験を行った。 ポリ−Ａ配列は、その３'−末端に付着したＣｙ−５標識を有し、蛍光による結合のバリデーションが可能である。

具体的には、疎水性ＴａＯ最上層をもつバイオセンサーを先ずポリ−フェニルアラニン−リジン（ＰＰＬ）（シグマ）で被覆した；バイオセンサーは底部無処理ポリスチレン９６穴マイクロタイタープレート（グレイナー(Greiner)）に結合させた。 ハイブリダイゼーション・バッファー溶液は３Ｘ ＳＳＣバッファー（シグマ）からなり、０．１％ＳＤＳ（シグマ）が創出された。 引き続き、９ウエル（３ウエルごとの３組）を利用し、それぞれ三重測定により３種の異なる分析対象を試験した。 具体的には、ウエルの第１セットおよび第２セットに、１０ｍＭポリ−Ｔ（オリゴスＥｔｃ．インク）／水を加えた。 第３セットのウエルには、Ｔ７プロモーター領域（ニューイングランド・バイオラボ）からのＤＮＡを固定化した。 固定化後、ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、先ずすべてのウエルをすすぎ、その後、ハイブリダイゼーションバッファーを第１セットのウエルに加え、ベースライン応答曲線を得た。 第２セットのウエルには、ポリ−Ａ（Ｃｙ−５標識含有）を加えて固定化ポリ−Ｔおよびポリ−Ａ間のハイブリダイゼーションを誘発させた。 第３セットのウエルでは、固定化Ｔ７ＤＮＡにポリ−Ａ（Ｃｙ−５含有）を加えて、非特異結合を生成させた。

図３６はこれらの実験結果を要約する。 図３６Ａでは、ポリ−Ｔ、ポリ−Ａ、およびＴ７−プロモーターから生じる結合量をグラフとしてプロットしたものを示す。 この同じデータを誤差バーと共に図３６Ｂに最終点としてプロットする。 該バイオセンサーはポリ−Ｔとポリ−Ａ間の特異的ハイブリダイゼーションを測定し得ること、またかかる強力な相互作用を弱い非特異的相互作用から識別し得ることが、これらのプロットから明らかである。

比色共鳴反射光バイオセンサー上のタンパク質−ＤＮＡ相互作用の証明
さらにもう一つの実験においては、タンパク質とＤＮＡ間の相互作用を検出するために比色共鳴反射光バイオセンサーを利用する能力を証明する。 この場合、Ｔ７プロモーターＤＮＡとＴ７ＲＮＡポリメラーゼ間の相互作用を説明用として使用した。

底部未処理９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレート（グレイナー）の底部に結合したＴａＯ被覆バイオセンサーを用い、ポリ−フェニルアラニン−リジン（ＰＰＬ）（シグマ）を使用して先ずセンサー表面を被覆した。 詳細には、１２ウエルをＰＰＬで被覆した；試験すべき４種の分析対象それぞれに３ウエルを使用。

第１セットのウエルでは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）（シグマ）を加えた。 第２セットのウエルでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラボ）用の反応バッファーを加えた。 第３セットのウエルでは、Ｔ７−プロモーターＤＮＡ（ニューイングランド・バイオラボ）を先ず固定化し、次いで、反応バッファー（ニューイングランド・バイオラボ）にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。 第４セットのウエルには、Ｔ７−プロモーターＤＮＡを固定化し、次いで、反応バッファーを加えた。 原則として、Ｔ７反応バッファーは、Ｔ７ＤＮＡおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの両方が存在しない限り、非特異的応答のみを与えるはずである。 図３７に示すように、これは事実上この例であった。 特に、１７５番目の時間段階で、バッファーの影響を除くために洗浄手技が行われることに注目されたい；この洗浄に続いて、Ｔ７プロモーターＤＮＡとＴ７ＲＮＡポリメラーゼ両方を含むウエルにおいてのみタンパク質−ＤＮＡ相互作用が起こることは明らかである。

細胞−タンパク質相互作用および他の細胞相互作用を検討するための現行技法は、多くのステップ、例えば、放射性同位体または蛍光標識、洗浄、ブロッキング、および検出などを必要とすることがあるため、時間浪費であり、労働集約的である。 例えば表２を参照。 細胞−タンパク質相互作用および他の細胞相互作用を検討するための現行技法はまた、相当量の高価な試薬を使用することがある。 本発明は常套の方法よりも速く、常套の方法よりも使用する試薬が少ない細胞相互作用を判定するための組成物と方法を提供する。

本方法および組成物は、特異結合物質に対する細胞の特異性、例えば、タンパク質、細胞の移動、細胞走化性、特異結合物質−細胞相互作用、細胞−細胞外マトリックス相互作用、および細胞−細胞相互作用などを同定するための非標識、簡単、ハイスループットのアッセイ法を提供する。

本発明の一態様において、該方法および組成物は細胞アッセイにおいて有意に試薬類の使用を削減することができる。 試薬の使用はマイクロタイタープレートによる全ウエルアッセイと比較して、少なくとも１００倍は削減し得る。 さらに重要なことは、本発明の簡単な画像細胞アッセイが、現行の時間浪費的労働集約型細胞移動アッセイおよび細胞走化性アッセイに置換わり得ることであり、はるかに正確で再現性のあることである。

比色共鳴反射光バイオセンサー技法は、生体分子と生物細胞がバイオセンサー表面と相互作用することによるため、光学的性質の変化に非常に高感度である。 この特徴は生物学での適用、例えば、細胞表面レセプターまたは細胞表面マーカーなどの細胞表面に結合する生体分子と生体分子間など、生体分子同士の相互作用を研究するなどの適用におけるこれらバイオセンサーにとって、大きな利点を提供する。 比色共鳴反射光バイオセンサー技法は生体相互作用を直接検出するので、蛍光標識、放射性同位体標識、または酵素および生物学的モチーフなどの生物学的タグ標識を必要としない。 比色共鳴反射光バイオセンサー細胞付着アッセイは、細胞表面上で分子とその相対物間の相互作用を直接検出する新規方法を提供する。 比色共鳴反射光バイオセンサー細胞付着アッセイの原理は、細胞表面上固定化した標的分子とその相対物間の親和性結合が、その相互作用を検出し得るバイオセンサー表面と細胞とを相互作用させることにある。

本発明の一態様では、比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器を提供する；その場合、比色共鳴反射光バイオセンサーは該容器の内面を構成する。 例えば、比色共鳴反射光バイオセンサーは該容器の底面を構成し得る。 ２つまたはそれ以上の特異結合物質など、１つ以上の特異結合物質を、比色共鳴反射光バイオセンサーを含む容器の内面上の２ヶ所以上の異なる位置に固定化する。 ２ヶ所以上の異なる位置には異なる量の１つの特異結合物質が存在し得る。 容器は、例えば、マイクロタイターウエル、試験管、ペトリ皿または微量液チャネルを包含し得る。 本発明の一態様は、１個以上のマイクロタイターウエルを含んでなるマイクロタイタープレートを提供し、その場合、１個以上のマイクロタイターウエルの底面は比色共鳴反射光バイオセンサーを含む。 １種以上の特異結合物質は各マイクロタイターウエル底面の２ヶ所以上の異なる位置に固定化し得る。

本発明は、１種以上の特異結合物質に対する１種以上のタイプの細胞の結合を検出する方法を提供する。 本発明の一態様において、１種以上のタイプの細胞は容器の内面に添加する。 いずれのタイプの細胞も使用し得るが、例えば、原核細胞、真核細胞、人工的細胞、細胞膜または人工的細胞膜がある。 該細胞は、例えば、培養における付着細胞として、または培養における浮遊細胞として増殖し得る。 該容器の内面は比色共鳴反射光バイオセンサーを構成し、その場合の２種以上の特異結合物質は、比色共鳴反射光バイオセンサーを構成する容器の内面上、２ヶ所以上の異なる位置に固定化する。 該容器を光照射し、各異なる位置についての１つ以上のピーク波長値（ＰＷＶ）を検出する。 ピーク波長値（ＰＷＶ）はバイオセンサーに結合する結合物質および／または細胞の相対的測定値である。 １つ以上の細胞が特異結合物質に結合した場合、ＰＷＶは１つ以上の細胞が結合する異なる位置でシフトする。 ＰＷＶは、例えば、特異結合物質が結合していないバイオセンサーの部分、または特異結合物質のみが結合したバイオセンサーの部分、または所定の基線ＰＷＶに比較してシフトする。

１種以上の特異結合物質は、例えば、比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器の内面上、異なる位置のアレイに配列することができる。 異なる位置は直径が約５０〜５００ミクロンのアレイスポットを規定し得る。 １種以上の特異結合物質は容器の内面上に無作為に配列し得る。 １種以上の特異結合物質は、比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなる容器の内面に、例えば、物理吸着、化学的結合、電気化学結合、静電気結合、疎水性結合および親水性結合などにより、固定化することができる。

本発明のもう一つの態様では、１種以上の細胞の特異結合物質への結合を検出する方法を提供する。 該方法は、２種以上の特異結合物質などの１種以上の特異結合物質を、容器の内面の２ヶ所以上の異なる位置に固定化し、ここで、容器の内面は比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでおり、次いで該容器を光照射することを含む。 各異なる位置について１つ以上のピーク波長値を決定する。 １つ以上の細胞を容器の内面に加える。 容器を光照射し、各異なる位置について１つ以上のピーク波長値を検出する。 ピーク波長を比較する。 １種以上の細胞が特異結合物質に結合している場合、ＰＷＶは特異結合物質が結合する異なる位置でシフトする。

実施例においては、内面として線形格子比色共鳴反射光バイオセンサーを含んでなるマイクロタイターウエルは、バイオセンサー表面に固定した１μｌの抗ヒトＣＤ３および１μｌの抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体を有していた。 図３８および図３９を参照。 マイクロタイターウエルを走査し、被覆した抗体を分析した。 図３９を参照。 ジャーカット(Jurkat)細胞（１×１０ ⁵ ）をバイオセンサー表面と２０分間インキュベーションした後、マイクロタイターウエルを走査し、細胞付着パターンを図３９に示すように観察した。

本アッセイは、ジャーカット細胞が９６穴マイクロプレートバイオセンサーからのウエル内部をａｈＣＤ３で被覆した異なる位置と相互作用すること、また抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体をもつ異なる位置からは検出可能なシグナルを観察しなかったことを明瞭に証明した。 これらの細胞付着アッセイを用いて、例えば、細胞接着、移動、走化性、および侵入に関わる分子を同定することができる。 本アッセイはまた、例えば、細胞接着、移動、走化性、および細胞侵入を調節する細胞表面分子を同定するためにも使用し得る。 さらに、これらのアッセイ法は細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、および細胞−分子相互作用を研究する新しい手段を提供する。 競合細胞付着アッセイ法は、細胞相互作用に関わる分子を特異的に標的とする化合物を同定するための医用薬物スクリーニングの新しい手段を提供し得る。

バイオセンサーの断面図および模式図を示す。

本発明の方法および組成物に従って作製される一次元回折格子を含む比色共鳴反射光バイオセンサーの一態様を示す。

四角または孔の角型グリッドを含む回折格子を示す。

正弦波的に変化する回折格子の輪郭を利用するバイオセンサー断面の輪郭を示す。

１セットの同心リングからなる共鳴反射または透過フィルター構造を示す。

図５の同心円形構造に近似するが、照射ビームを特定のグリッド位置の中心に置く必要のない六方グリッドの孔（または六方グリッドの標柱）を含む共鳴反射または透過フィルター構造を示す。

タンパク質単層などの吸着された物質が三次元回折格子を含むバイオセンサーの反射波長をどのように増加させるかを示す模式図である。

３つのタイプの表面活性化化学（アミン、アルデヒド、およびニッケル）を示す；ここでは種々のタイプの生体分子レセプターをバイオセンサーに共有結合により接着させるために、相当する化学リンカー分子を使用し得る。

バイオセンサー表面上で検出されたＤＮＡまたは検出されたタンパク質などの結合パートナーの集団を増幅するために使用し得る方法を示す。

検出ビームの入射角の関数としてのバイオセンサーの共鳴波長を示す。

照射するファイバーとバイオセンサーからの反射光を集めるファイバーを２つ組み合わせたファイバーの使用例を示す。

照射光と反射光をバイオセンサーへの共通の平行化光路に分配することの可能なビームスプリッターの使用例を示す。

検出システムの模式図を示す。

生化学物質のインビボ検出用ファイバープローブの先端に存在するバイオセンサーの一例を示す。

ＰＢＳに溶解し、次いでバイオセンサー上で乾燥させたＢＳＡの濃度に対するピーク共鳴波長の依存性を示す。

バイオセンサーによりストレプトアビジンを検出した結果およびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

ヤギ抗体レセプター分子を用いる抗ヤギＩｇＧの検出用アッセイおよびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

ＩＮＦ−ガンマの非標識ＥＬＩＳＡアッセイ法およびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

５−アミノ酸ペプチド（ＭＷ＝８６０）の検出と、引き続く酵素カスパーゼ−３を用いるｐＮＡ標識（ＭＷ＝１３０）の切断、ならびにバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

３つの別個のタンパク質層の結合を連続的にモニターした際の液体中の共鳴ピークおよびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

データから数学的に決定した終末点の共鳴頻度およびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

ＩｇＧ結合の動力学的結合の測定およびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

バイオセンサー表面から結合タンパク質を切断するプロテアーゼの動力学的な測定およびバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

試験溶液のピーク共鳴波長のプロットを示す。

固定化化学官能基をもたないセンサーを対照とするＰＷＶシフトを示す。

ＰＷＶシフト応答をバイオセンサーに対する時間関数として示す。

図２６Ｃから２０分後のＰＷＶシフトの大きさを示す。

比色共鳴反射光バイオセンサー上で生育した軟骨細胞を利用する細胞形態学アッセイの結果を示す。

腎臓腫瘍細胞を用いる細胞接着アッセイの結果を示す。

バイオセンサーの角走査システムの一例を示す。

マイクロアレイとして使用するバイオセンサーの一例を示す。

比色共鳴反射バイオセンサーを組み込んだ２つのバイオセンサー方式を示す。

高濃度および高能率でアッセイを実施するためのバイオセンサープラットホームを用いる複数アレイのアレイ概念図を示す。

ストレプアビジンレセプター層の付着により引き起こされる測定共鳴波長シフトと、引き続くビオチニル化ＩｇＧの検出ならびにバイオセンサーに結合した分子を図示したものである。

比色共鳴反射バイオセンサーマイクロアレイ上の、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、およびヒトＩｇＧのスポットを示す。

抗ヒトＩｇＧをセンサー表面上に流した結果を示す。

センサー表面上に固定化したポリＴについて、ポリＴ、ポリＡおよびＴ７プロモーターで固定化したオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション親和度の差を示す。

終末点データを誤差バーとともに示す。

特異性の一例を示す。

細胞−タンパク質相互作用アッセイの模式図を示す。

細胞−タンパク質相互作用アッセイの結果を示す。

符号の説明

１００ 光源 ２００ スキャナ ３００ 光学システム ４００ バイオセンサー ５００ シグナル検出計