【発明の詳細な説明】 【０００１】 【従来の技術】 本発明は、化学反応であることが多い段階的反応を用いて構築される生成物を含む種類の試薬、および合成経路および／又は使用される試薬を追跡する関連するタグ残基(associated tag moieties)に関する。 生成物はオリゴマーであることが多く、タグはオリゴマー中の少なくとも１つのモノマー残基(monomer resid
ue)のアイデンティティーおよび位置を規定する。 この様な試薬は、単純な標識分析物より生ずることが可能な情報に比べ、より多くの情報を生ずることができるアッセイ法において有用である。 この様な試薬のセットおよびライブラリーは、組合せ化学により創製することができ、そして例えば生物学的活性に関する大量の化合物のスクリーニングに有益である。 発明による好ましいシステムでは、
中性分子の、例えば光解裂の様な解裂により、マススペクトロメトリーによる分析に供される正に荷電したタグ基が生成される。 【０００２】 ＷＯ９５／０４１６０は： ａ）少なくとも２つの分析物残基を含む分析体成分を含み、そして ｂ）マススペクトロメトリーによる検出に適した１またはそれ以上のレポーター基を含むタグ成分にあって、レポーター基が分析残基を指定し、タグ成分の各位置にあるレポーター基が分析成分の限定位置にある分析残基を指定する様に選択されるタグ成分に結合している試薬を記述している。 それぞれが異なる分析体成分を含んでいるこの様な試薬の多くは、標的基質を含むアッセイ法にて使用できる試薬のライブラリーを提供する。 タグ成分の分析は、標的基質に結合した分析体部分の性質を示す。 【０００３】 ＷＯ９４／０８０５１は、それぞれがビーズに結合した全オリゴマーのライブラリーを同時に作成するのに用いるシステムを記述している。 分割および混合工程により製造された各ビーズは、それぞれユニークな化学的生成物を担持しており、またこのことは同一合成経路を通過した各ビーズに共通する。 プロセス中の各ポイントにおいて、では２つのカップリング工程が用いられる：一方の工程はシントン又はリガンドに作用する；もう一工程はこれもビーズ上に担持されるタグの構造を変える。 タグはビーズが経てきた工程を同定するよう設計される。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】 本発明の目的は、支持体上に合成され得、及びその支持体へ固定された状態または分離された状態で用い得る標識化合物のセット又はライブラリーを提供することである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】 発明の一つの側面において、支持体および標識のセットの使用により、標識化合物のセットを製造する方法を提供することであり、その方法には以下の工程が含まれる： ａ）支持体をロットに分割すること、支持体の各ロット上で異なる化学反応を実施し、支持体のそのロットを修飾するか、又は支持体のそのロットに化学残基(c
hemical moiety)を結合させること、支持体の各ロットの画分に異なる標識によるタグ付けをすること、及び支持体の該ロットを組み合わせることを含む少なくとも１の第１工程又は中間工程、並びに ｂ）支持体をロットに分割すること、支持体の各ロット上にて異なる化学反応を実施し、支持体のそのロットを修飾するか、又は支持体のそのロットに化学残基を結合させること、支持体の各ロットの画分に異なる標識によるタグ付けをすることにより、別の工程において支持体に結合した化学残基に各々異なる標識を結合させ、その化学残基と共に支持体より分離可能な標識化合物を形成し、及び支持体の該ロットを組み合わせることを含む、少なくとも１の中間工程または最終工程。 【０００６】 上記方法は、後に組み合わされるロットに繰り返し分割される。 支持体は相当量の支持体、例えばフラットシートまたはシリコンチップ、あるいは例えば異なる化学反応を実施するために領域にマスキングすることで分割されるマイクロタイタープレートであろう。 支持体は幾つかの溶媒に可溶性であり、その他の溶媒には可溶性でなく、そして例えば沈殿または溶解によりロットに分割され又は組み合わされるポリマー材料であり得る。 通常、支持体は、例えばピン又は繊維のような粒子、又は毛細管であり、好ましくはビーズである。 分裂および混合戦略による組合せ化学の実施のための誘導化ビーズは市販されており、本発明に利用できる。 好ましい微粒子支持体は、解裂可能なリンカーを有するビーズを含み、
各々の解裂可能なリンカーには、規定される化学的方法、例えばオリゴマー合成のための１個の基、および標識のためのもう一つの基が含まれる。 このことは、
合成終了時において、例えば、オリゴマーのような標識化化学生成物を溶液中に回収できることを意味する。 【０００７】 発明の方法は、少なくとも１の工程ａ）および少なくとも１の工程ｂ）を実施することを含み、通常は合計で少なくとも３工程を行うことを含む。 各工程は、
通常は化学反応であるが、必ずしもそれである必要はない反応を実施することを含む。 これら反応の１例は、保護基を除去し第一級アミンまたはヒドロキシまたはカルボン酸基を残すものであろう。 通常、化学反応は支持体への化学残基の結合を含む。 化学残基は通常は有機化学基、例えばＷＯ９４／０８０５１記載の如くの基である。 連続する化学残基は別のリンカーを介して支持体に結合してもよいが、より一般的には、連続する化学残基は相互に結合し支持体より延伸する鎖を形成する。 好ましくは、化学残基はオリゴマー鎖を形成する様形成されたモノマーユニットである。 【０００８】 本発明の好ましい方法では、標識化合物のセットはｎ ｓ標識オリゴマーのライブラリである。 ここで、ｎは異なるモノマーユニットの数であり、ｓは各標識オリゴマー中のモノマーユニットの数であり、工程ａ）は支持体の各ロットに対し異なるモノマーユニットを結合させるために１回実施され、そして工程ｂ）はｓ
−１回実施される。 【０００９】 オリゴマーは例えばオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチドである。 オリゴマーがオリゴヌクレオチド又は類似体の場合、一般にｎは４である。 オリゴマーがオリゴペプチドの場合、天然のアミノ酸のみ使用する場合にはｎは一般に約２０
である。 しかし発明の原理は、他の重合可能なモノマーより形成された他のオリゴマーにも等しく適用され得る。 ｓの値は重要ではなく、典型的には２〜１００
であり、例えば３〜２０またはそれ以上である。 【００１０】 各工程においてタグが付けられる各々のロットの画分は、一般には５０％未満である。 好ましくは各支持体の各ロットの０．２５％ないし２５％が、各工程にて異なる標識によりタグ付けされる。 好ましくは、支持体は解裂可能なリンカーを有し、各解裂可能なリンカーは。 化学反応、例えば化学合成に適した基を少なくとも１個、および標識化に適したもう一つの基を有する。 好ましくは、得られた各標識化合物は、単一の標識と少なくとも１個の化学残基を含む。 【００１１】 本発明の方法には、ｎ×ｓ個以下の異なる標識を含むセットの使用が含まれる。 標識体の性質は重要ではないが、各異なる標識は、標識の検出に用いられる分析的手段により区別可能であることが、発明の好ましい特徴である。 標識として利用される基は、一般に使用されている保護基（例えばヌクレオチドシントン中の５'又は３'−保護を提供するＤＭＴ基）に比べ、オリゴマー合成に含まれる酸性（又は他の化学的）処理に対し極めて安定でなければならない。 好ましい標識体は、解裂、例えばマススペクトロメトリーによる分析に適した中性分子の光解裂、により荷電基、好ましくは正に荷電した基が生ずるものである。 そのような好ましい標識の例は、以下に述べる。 【００１２】 好ましい実施形態では、分裂と混合戦略には、３個の腕−１つは解裂可能な結合を介した固体支持体へ結合するためのもの；１つは化学生成物、例えばオリゴマーの合成を開始するためのもの、そして三番目は、タグの結合の為ためのものである腕を持つ、解裂可能なリンカーを保持する固体支持体を必要とする。 シントンおよびタグモノマーの結合のための部位は、除去可能な基により随意保護されるだろう。 このプロセスは粒子状固体支持体上でのオリゴマー合成により例示できる。 【００１３】 合成経路の各ステージでは、まず支持体の粒子が組み合わされ、混合され、ｎ
個のロットに分けられ（ここで、ｎは、異なるモノマーの数であり、天然ヌクレオチドの場合、４である）、次いで、各モノマーは支持体の１つのロット上の部位に結合する。 次に、加えられたばかりのモノマーおよび配列中のその位置を代表するユニークなタグが、最終オリゴマー中のモノマーの数にほぼ対応するだけ支持体の画分に結合される。 あるいは、タグは、それが代表するモノマーの後ではなく前、あるいは同時に支持体の画分に結合されてもよい。 部分的結合は様々な方法にて達成できるだろう。 例えば、（ｉ）その部分の保護基を部分的に除去する；（ｉｉ）終了画分に結合を実施する；（ｉｉｉ）支持体の画分を除去し、
画分をプールに戻す前に結合を終了する。 結合工程が進むにつれ、オリゴマーは１回毎に１ユニット伸長し、タグが１回毎に１個加わる。 最終結果は、各粒子上の分子の混合体であり；各分子はオリゴマーにおけるモノマーの同一配列を有するが、ｓ−ｍｅｒの１／ｓの画分はｓ結合工程の何れかにおいて加えられたタグを有するだろう。 【００１４】 本実施形態の例は添付図面の図１に示されている。 Ａはそれぞれ２個の腕を持つ解裂可能リンカーで誘導されたビーズ形状の固体支持体が描写されている。 Ｂ
には、各リンカーの２本の腕の一本がスクシンイミジル置換基を持つトリチル基と反応している。 Ｃでは、各リンカーのもう一つの腕が図Ｇに示されたヌクレオチド残基と反応している；そしてＮＨＳ基の一部は標識体Ｒ 1により置換されている。 Ｄでは、ダイマー鎖ＧＴの形成によりオリゴヌクレオチド合成が継続されている；そしてＮＨＳ基の第２部分が第２標識Ｒ 2により置換されている。 Ｅでは、オリゴヌクレオチド合成は鎖ＧＴＴの形成により継続されている；そしてＮ
ＨＳ基の第３部分が標識Ｒ 3により置換されている。 Ｆではビーズのアンモニア分解により、それぞれが異なるタグに結合した、同一配列中のオリゴヌクレオチドのプールが生じる。 Ｇでは、光分解がマススペクトロメトリーによる分析に適した、３種類の誘導化トリチル基を分離する。 分裂および混合法は、何れかのビーズに結合したオリゴヌクレオチドは全て同一のｓ−ｍｅｒの配列を有すること、ならびにビーズが、ｓ個の異なる評せ引きの合計を保持し、それぞれの標識がオリゴマーの１モノマー残基の位置と特性を示すことを保証する。 【００１５】 部分的結合の別の方法は、伸長工程毎に、例えば、オリゴマーのような化学的化合物のフラクションの伸長を、安定なタグ基によりキャップするものである。
例えば、オリゴヌクレオチド合成の場合、結合試薬は、マスタグとして以下に記す安定したトリチル基の一つにより保護された少量のホスホアミダイト(phospho
ramidite)を含むことができる。 伸長は、所望する塩基を持つ主要部と、塩基の特性および位置をマーキングする対応するタグを持つ小画分を生ずるだろう。 【００１６】 本実施形態の例は添付図面の図２に描写されている。 オリゴヌクレオチド合成は誘導化ビーズ上で実施されＡ、合成の第１、第２、および第３ステージはＢ、
ＣおよびＤに示される。 各４種類のホスホアミダイト試薬は、極めて酸安定なＮ
ＨＳ−置換トリチル基を有するキャッピングホスホアミダイトの小画分であって、オリゴマーの長さに依存して、好ましくは１／ｓより少ない小画分を含む。 合成の各ステージの後、全ての取り込まれたＮＨＳ基はアミンと反応させられ、それにより標識が結合する。 より長いオリゴヌクレオチドの合成の場合には、ｏ−
メチルホスホルアミダイトを利用することでアミノ化反応の反復に耐える様にできる。 Ｂ、ＣおよびＤにて使用される３種類の標識体は、図２中Ｒ 1 、Ｒ 2およびＲ 3として表されている。 合成終了時、オリゴヌクレオチドはアンモニア処理により脱保護されるが、ビーズには結合したままである。 即ち、各ビーズは同一配列を持つ複数のｓ−ｍｅｒのオリゴマーを、それぞれがオリゴマーのモノマー単位の特性と位置を示す合計ｓ種類の置換トリチル標識と共に保持している。 ビーズはアッセイ法に利用される。 その後、ビーズの光分解により、マススペクトロスコピーによる検出に適した電荷を持つ置換トリチル成分Ｅが生じる。 あるいは、標識化オリゴヌクレオチドは液中に放出できる。 【００１７】 別の態様では本発明は、標識化合物のセットを提供し、そのセットの化合物の分子が、その分子の成分の特性および／又は位置を特定する単一の標識体によるタグが付され、そして同一化合物の別分子に別の標識体がタグ付されている。 標識化合物のセットは、放出可能に固体支持体、例えばビーズに結合されるか、又は液中に共に混合され得る。 【００１８】 本発明による別の態様は、ここに規定された如くの標識化合物の複数のセットを含むライブラリー、例えばｎが異なるモノマーユニットの数であり、ｓが各標識化合物内のモノマーユニットの数である、ｎ s個の標識オリゴマーのライブラリーである。 【００１９】 別の態様（例えば図２に図示された様な）では、本発明は、同じ配列を有する異なるオリゴマー分子を有するオリゴマー分子を、その表面に担持する固体支持体を含む試薬を提供する。 前記オリゴマー分子には、いくつかのより短いオリゴマー分子が含まれ、１のより短いオリゴマー分子には、そのオリゴマー分子のモノマーユニットの特性及び位置を特定する標識が含まれる。 ライブラリーは、固体支持体が好ましくはビーズである複数の該試薬より構成される。 【００２０】 ここで使用される標識の好ましい特徴は： ・それらは、調製法に使用される化学的手段、および生じた化学的化合物の切り出し、例えば固体支持体からのオリゴマーの切り出しに用いられる化学的手段に対し安定である結合により固定されなければならない。 【００２１】 ・それらは、各化学残基または反応がユニークにタグ付けされることにより、
それらの検出に利用される分析的手段によりｎ×ｓ個の標識体を区別することができる特性を有していなければならない。 以下の実施例に示すように、３６種類のタグモノマーを利用することで２６２１４４種類全てのノナヌクレオチドを特異的にコードすることができることが分かる。 この数は、下記トリチル誘導体を用い容易に達成できる。 あるいは、好ましさに於いて劣るが、９−ｍｅｒの同一数は、１８種類のバイナリータグにより、又はＷＯ９４／０８０５１記載の様な９種類のタグのユニークな組合せによってさえもコードすることができる。 【００２２】 ・親分子からの解裂に際して、例えば光解裂、酸性条件を利用した化学的解裂、酵素的方法のような解裂に際して、それらはマススペクトロメトリーによる分析に適した、中性分子または好ましくは、荷電したイオンのいずれにかの安定種を生じなければならない。 マススペクトロメトリーは分析の好ましい方法であり、数百の標識体の同時検出が可能である。 中性分子の光解裂による、好ましくは荷電基を生成するこの特性は、マトリックス添加を必要とすることなくイオンが気相内に持ち込まれることを保証する。 従って、マトリックスを加えた場合に必要とされる「ホットスポット」を探す必要は無い。 更にマトリックスが存在しないことで、オリゴヌクレオチド連結の様な別の生化学的プロセスも可能になる。
酸を含むような特定の解裂方法では、マトリックスの添加は検出感度を上げ得る。 【００２３】 これらの基準を考慮すると、発明による好ましい標識は、式中のＲ 1 、Ｒ 2およびＲ 3が同一または異なるものであり、かつそれぞれが置換または非置換型の縮合環状芳香族基又は単環である、式Ｒ 1 Ｒ 2 Ｒ 3 Ｃ−の基である。 これらはトリチル（トリフェニルメチル）系の基である。 その他の可能な標識には、トロポニウムおよびＷＯ９７／２７３３１に考察されるものが含まれる。 トリチル基は、マススペクトロメーター内のレーザー照射により容易に解裂されるという所望される特性を有している。 トリチル基の検出感度は、正に荷電したカルボニウムイオンが安定であることから高い。 この感度が、例えばトリチル標識分子が表面に共有結合的に結合される場合に結果として分子単層中に十分な量のトリチル基が存在するといった多くの利点を提供する。 【００２４】 好ましくは、Ｒ 1 、Ｒ 2およびＲ 3の少なくとも１つが、非置換型、又はカルボン酸、スルフォン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第１級、第２
級、あるいは第３級アミノ、１級又は２級アミド、無水物、ハロゲン化カルボニル又は活性化エステルにより置換されたＣ 1 〜Ｃ 20アルコキシ又はヒドロカルビルより選択される置換基を有する。 これら置換基の水素原子は、重水素またはフッ素の様なハロゲンにより部分的または全体的に置換されるだろう；これによりマススペクトロメトリーによる分析の利用可能域が改善される。 【００２５】 好ましくは、Ｒ 1 、Ｒ 2およびＲ 3それぞれはアリールであり、より好ましくはフェニルである。 置換基は芳香族（例えばフェニル）環の何れの位置にも存在できるが、パラ置換基が都合よく、好ましい。 置換基が存在することで、トリチル（又はその他の）基に望まれる物理的又は化学的特性を付与するだろう。 例えば電子求引性基がオルトまたはパラ位置にあると、酸加水分解に対するトリチル基の安定性が増す。 置換基の存在は、トリチル（又はその他）の基の式量を変更し、マススペクトロメトリーによる検出と識別を容易にする。 非放射活性同位元素置換基はこの目的に好適であり、例えば１、２または３重水素分子を含む小アルキル基である。 好ましい置換基はアミン又はアミド基である。 下表１に示すように、各種分子量を有する多数のアミンが市販されており、また識別し得る式量を有する置換トリチル基の提供に利用できる。 【００２６】 市販の多くのアミンの質量は５０〜２５０Ｄａの範囲にある。 幾つかの応用では、数百までの質量のタグを有することが望まれる。 ＴＯＦ−マススペクトロメトリーによりタグを解像するためには、少なくとも４Ｄａのタグの質量の差があれば十分でることが分かっている。 従って、アミンの上限域では約５０種類のタグを生ずるに過ぎない。 アミンの同一プールを利用してこの量を増やすために、
トリチル基当たり２又は４、あるいはそれ以上のアミド置換基さえ取り込むことが可能であり、そしてそれは以下実験欄に例示される。 【００２７】 システムの原理は添付図面の図３に図示されている。 ＡではオリゴヌクレオチドはＣＰＧ支持体上に合成される。 Ｂでは、オリゴヌクレオチドの５'−ヒドロキシ基はＮＨＳ−置換トリチル基により置換されている。 Ｃでは、式中のＲが式量を特徴付けるアミド基ＮＨＲが導入されている。 Ｄでは標識化されたオリゴヌクレオチドはアッセイ法での利用を目的とし溶液中に放出される。 Ｅでは、ＮＨ
Ｒ−置換トリチル基は光分解により蒸発させられ、マススペクトロメトリーにより検出された。 【００２８】 上記マススペクトロメトリー標識は様々な他の生化学的方法および操作に有用である。 即ち、別の態様によれば、本発明は、核酸決定方法を提供する。 この方法は、標識オリゴヌクレオチドまたは核酸を提供し、解裂により標識を除去し、
マススペクトロメトリーに供される荷電種を供与することを含む。 好ましくは、
配列決定または配列差の分析の様な核酸解析は、標識体が上記の如くである標識プライマーおよび／又は標識された鎖延長ヌクレオチド、および／又は標識化された鎖停止ヌクレオチド類似体を利用し、実施される。 【００２９】 別の態様では、本発明は、標識プローブを２つの画分であって、その一方が決定されたものに分離する方法を提供する。 前記標識プローブは、解裂によってマススペクトロメトリー分析に適した荷電種を供する結合により標識に結合するリガンドを含む。 本発明には更に、それぞれが解裂によってマススペクトロメトリー分析に適した荷電種を供する結合により標識に結合するリガンドを含むプローブであり、かつ各種プローブが異なるラベルを有するプローブのライブラリーが含まれる。 好ましくは、標識は上記したものである。 【００３０】 特定の標識は、それ自体が本発明による新規化合物と認識される。 これらは、
式Ｒ 1 Ｒ 2 Ｒ 3 Ｙの化合物である；式中Ｙは、例えばチオール、アルコール又はアミン基の様な求核基による置換に適した、例えばハロゲン又はトシレートの様な脱離基であり；そしてＲ 1 、Ｒ 2およびＲ 3は上記に同じである。 但し、Ｒ 1 、Ｒ 2
およびＲ 3は一緒に、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基のようなカップリングに適した少なくとも２個の反応基および／又は少なくとも２個のアミン基を保持する。 【００３１】 更に、発明者はレーザー脱着イオン化型マススペクトロメトリー(laser desor
ption ionisation mass spectrometry)の標的表面として使用するための、使い捨て型ガラス製インサート(insert)を製造した。 ガラス製標的はガラス表面上に直接スポットされ乾燥したサンプルの分析に使用できるだろう。 ガラス標的はまた、化学的に活性化でき、既存の方法を使った核酸またはその他の化合物の固定用個体支持体として利用できるだろう。 ガラス標的上に分離され、局在化した相補的核酸、かさのあるタグ付きオリゴヌクレオチド又はその他化合物はレーザー脱着イオン化型マススペクトロメトリーによる分析に直接供される。 固体支持体を利用する利点の一つは、連続検出用マススペクトロメトリーに直接導入でき、
不要なサンプル液操作を避けることができることである。 ポリプロピレンの様な有機重合性表面はガラスの代替に成り得るだろう。 【００３２】 ガラスへ化合物を直接固定するために開発された表面化学を利用し、レーザー脱着イオン化型マススペクトロメトリー又はマトリックス支援レーザー脱着イオン化型マススペクトロメトリーに適した標的にこれら化合物を直接固定化することができるだろう。 核酸の結合については、例えば３−メルカプトプロピルシラン誘導化（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９９）又はアミン誘導化（Ｂｅａｔｔｌｅら、
１９９５；Ｃｈｅｎら、１９９９）がある。 ガラス製インサートは通常のインサートに比べ安価であり、かつ完全に使い捨て可能である。 マススペクトロメトリーの性能に影響しない（以下実施例４を参照）。 【００３３】 本発明は更にレーザー脱着イオン化マススペクトロメトリーの標的としての使用に適したインサートにあって、分析のための固定化化合物を保持している標的ガラス表面を持つインサートを提供する。 【００３４】 本発明は更に、マススペクトロメーターおよびガラス製の標的表面を有するレーザー脱着マススペクトロメトリーの標的としての利用に適したインサート供給物を含むキットを提供する。 【００３５】 本発明の好ましい実施形態では、核酸を分析するシステムは以下を含む： ・分析に適した標的又は標的を捕捉するプローブとして機能する核酸の列を含む個体支持体； ・マススペクトロメトリーによる分析に好ましい成分がタグ付けされたオリゴヌクレオチド試薬 ・タグ付けされたオリゴヌクレオチドと標的との間の特異的相互作用を可能にする生化学的操作に適した試薬および装置 ・マススペクトロメーター内にサンプルを導入する手段 ・マススペクトロメーター。 【００３６】 本発明のより好ましい実施形態では、固体支持体上の核酸を解析するのに適したシステムは以下を含む： ・分析に適した標的として作用するか、又は標的を捕捉するプローブとして作用する核酸の並びを保持する固体支持体； ・マススペクトロメトリーによる分析に好ましい残基でタグ付けされたオリゴヌクレオチド試薬； ・固体支持体表面で行われるタグ付けされたオリゴヌクレオチドと標的との間の特異的相互作用を可能にする生化学的操作に適した試薬および装置 ・マススペクトロメーター内にサンプルを導入する手段 ・マススペクトロメーター。 【００３７】 発明の更に好ましい実施形態では、核酸を解析用自動化装置は以下を含む： ・マススペクトロメトリーによる解析に好ましい残基でタグ付けされたオリゴヌクレオチド試薬 ・マススペクトロメーター ・分析を行うコンピューター ・マススペクトラムを解釈するソフトウエアー。 【００３８】 コンピュータープログラムは、マススペクトロメトリーによるオリゴヌクレオチド配列決定の為に提供される。 オリゴヌクレオチド内の各塩基および塩基位置にはユニークなマスタグ(mass
tag)により関連付けられている。 【００３９】 長さｓのオリゴヌクレオチドの場合、４ s個の可能なオリゴヌクレオチドを全て識別するには４ｓ個のタグが必要とされる。 注意深くタグを選択することで、全てのタグが十分に異なる質量を有する様になり、マススペクトラム分析に際してタグの割付の不確実性を回避できる。 各タグの化学式は既知であり、従って各タグの単一同位体の質量を計算することができる。 【００４０】 タグ内の元素の同位体量も既知であることから、各タグの全ての同位体変種の完全な質量分布および各々のタグの有り全ての同位体変種の存在も計算することができる。 使用されるタグに関しては、タグの主要な重同位体は13 Ｃの存在によるものであり、典型的な同位体存在比分布は、同位体質量がそれぞれ４００．２２８、４
０１．２３１および４０２．２３４である、相対同位体比７３：２２：３のＣ 27 Ｈ 30 Ｏ 2 Ｎに関するものである。 これらの存在度分布はマススペクトラム中のタグの存在を特徴付けるものであり、スペクトラム中のその他の特性からタグを識別するのに役立つ。 【００４１】 塩素や臭素の様な元素の質量タグへの利用は、これら元素が炭素とは大きく異なる同位体存在比分布を持つことから、タグの検出と同定に更に役立つ； 35 Ｃｌ： 37 Ｃｌに関する存在比は７６：２４ 78 Ｂｒ、 81 Ｂｒのそれは５１：４９である。 【００４２】 従って、これら元素を含む質量タグは、それぞれ特徴的な同位体分布を有している。 一般に、化学的「ノイズ」のバックグランドに対して同定を容易にするための特徴的な質量のセットを持つタグを設計することが目的となる。 【００４３】 各スペクトラム中に質量スタンダードが含まれることで、スペクトラムの質量軸が計算可能になる。 タグ質量域内およびいずれかの領域端部に質量スタンダードを利用することで、この領域での正確な質量測定が保証される。 可能な質量の完全なセットを表すイオンがしばしばマススペクトラム中に見られ、これらは理想的なキャリブレーションセットを表す。 【００４４】 プログラムは、各タグ中の元素の既知質量および同位体存在比を利用して同位体存在比分布と質量タグに対応する同位体質量を計算する様に書かれている。 この情報は、タグ付きオリゴヌクレオチド内への利用に適した、利用可能な全ての質量タグについて計算されている。 【００４５】 第２プログラムはこの情報を利用して質量タグの存在を決定し、それによりオリゴヌクレオチドにより作られたマススペクトラム中の配列を決定し、更に以下の如く作動する。 オリゴヌクレオチド中の各塩基の位置に関しては、４種類の可能なタグ（それらの同位体変種も含む）の質量に対応するマススペクトラムの４
領域を検証し、期待されるタグスペクトルと比較される。 比較は、スペクトルのピーク位置の同定および大きさ、ならびに潜在的タグの位置および大きさとの差、によるか、あるいは実験的スペクトラムと潜在的タグより予測されるスペクトラムとの差の平方の合計を測定することの何れかにて行われる。 いずれのケースでも、４種類のタグは選択された測定法によって等級付けされ、最善のタグを用いてそれら塩基位置に塩基が割り付けられる。 【００４６】 より強力な方法は、可能な各オリゴヌクレオチドを順番に検証し、上記方法により全ｓタグ領域について適合度を調べ、次にこの結果に基づいてオリゴヌクレオチド配列を等級付けする方法である。 【００４７】 【実施例】 実験 コアのトリチル構造を有するフェニル環における様々な置換基を有する一連の化合物を作成した。 これらの化合物の内のいくつかは、新規であると思われ、そして本発明の別の態様を形成する。 関与した化学は、付随の図面の図４に例示される。 化合物およびそれらの特性は、以下のとおりである。 【００４８】 図４ ａ． ＳＯＣｌ 2 、還流。 ｂ． ２−アミノ−２−メチルプロパノール−１、２．
５当量。 ｃ． 臭化フェニルマグネシウム。 ｄ． ８０％ＡｃＯＨ、４８時間。 ｅ．
ＮＨＳ、ＤＣＣ。 ｆ． ＡｃＣｌ、トルエン、還流。 ｇ． グリニャール合成。 ３は、ベンゾフェノンおよび４−ブロモフェニルオキサゾリンから選択的に合成される。 【００４９】 （例１） Ｎ−スクシンイミジル−４−［ビス−（４−メトキシフェニル）−クロロメチル］−ベンゾエート（１）を、報告された手段（１，２）によって合成した。 Ｎ−スクシンイミジル−４−［（４−メトキシジフェニル）−クロロメチル］
−ベンゾエート（２）を、４−メトキシベンゾフェノンを、４，４'−ジメトキシベンゾフェノンの代わりにグリニャール合成に使用した以外は、報告された手段（１，２）によって合成した。 1 H-NMR(CDCl 3 , δ, md): 7.95-6.8(m, 13H, ar
om.), 3.8(s, 3H, OCH 3 ), 2.88(s, 4H, NHS). Mass-spectrum, TOF(マトリックスなし):(MI+H + )。 【００５０】 Ｎ−スクシンイミジル−４−［ビス−（フェニル）−クロロメチル］−ベンゾエート（３）を、ベンゾフェノンを、４，４'−ジメトキシベンゾフェノンの代わりにグリニャール合成に使用した以外は、報告された手段（１，２）によって合成した。 1 H-NMR(CDCl 3 , δ, md): 8.0-6.8(m, 14H, arom.), 2.88(s, 4H, NHS
). Mass-spectrum, TOF(マトリックスなし):(MI+H + )。 【００５１】 ２−（４−ブロモフェニル）−４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリンから得られるグリニャール試薬の形成は、アクチベータとしてＲＥＤ−Ａｌ（登録商標）（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用する場合でさえ、むしろ信頼できず、そして再生不可能である。 市販で入手可能なグリニャール試薬（アルドリッチ）の利点を得るために、発明者らは、４−カルボキシベンゾフェノンから出発して、オキサゾリル保護４−カルボキシベンゾフェノン（４）を合成した。 グリニャール反応に続いて、連続段階は、化合物１−３について使用されるものに類似した。 【００５２】 ２−（４−ベンゾフェニル）−４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリン（４
）。 ４−ベンゾイル安息香酸（５０ｇ、ミリモル）を、３時間、３００ｍｌの塩化チオニル中で還流させ、蒸散させ（生成物は、油状物から結晶化する）、そしてその後、トルエンで蒸散させた（２×３０ｍｌ）。 残渣を、２５４ｍｌの乾燥塩化メチレンに溶解させた。 この氷冷却溶液に、１５０ｍｌの乾燥塩化メチレン中の４６ｇ（２．５当量）の２−アミノ−２−メチルプロパノール−１を２時間、滴加した。 その溶液を、室温で一夜攪拌させ、そして沈殿物を、塩化メチレンで数回洗浄した。 混合画分を、蒸散させ、注意深く３５０ｍｌの塩化チオニルに溶解させ、そして４時間還流させた。 反応混合液を、１／３まで蒸散させ、２Ｌ
の乾燥エーテルに注ぎ、そして４℃で一夜静置させた。 塩酸化物の沈殿物を、１
０℃で、１Ｌの水に溶解させ、そして３００ｍｌの５Ｍ ＫＯＨを、攪拌しながらそれに添加した。 混合液を、クロロホルム（３×３５０ｍｌ）で抽出させ、有機層をＣａＣｌ 2上で乾燥させ、そして蒸散させた。 結晶生成物を、トルエンから得た。 ４２ｇ（７５％）白色結晶性固体、融点８１℃。 1 H-NMR(CDCl 3 , δ, md
): 8.2-7.2(m, 9H, arom.), 4.18(s, 2H, CH 2 ), 1.45(s, 6H, CH 3 ). Mass-spect
rum, MALDI-TOF: 279.091(MI), 302.085(MI+Na + ), 319.656(MI+K + )。 【００５３】 主な市販で入手可能なアミンの質量は、５０〜２５０Ｄａの範囲に入る。 ある種の用途については、数百までの質量のタグを有することが望ましい。 ＴＯＦ質量スペクトロメーターでタグの分割は、多量のタグの間で少なくとも４Ｄａの差異で十分であることが分かった。 したがって、上記範囲のアミンは、約５０の異なるタグを得ることができるのみである。 同じ保存のアミンを使用してこの量を増加するために、発明者らは、２つの活性化カルボキシル基（６）を有する別のトリチル基本の化合物を合成し、そしてアミンとの反応でそれは、２つのアミド結合を形成し、したがって例えば（２）と比べるとき他の一連の質量タグを得た。 追加の質量の増加は、例えば、（８）を使用することによってトリチル・コアまでさらにいっそうアミンを付着させることによって達成できる。 【００５４】 ４，４'−［ビス−（２−（４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリル））］
−４''−メトキシトリタノール（５）。 ヨウ素で活性化された１．５ｇのマグネシウム分岐点に、１５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１５．３４ｇ（ミリモル）のブロモフェニルオキサゾリンおよび１滴のＲＥＤ−Ａ１（登録商標）を、攪拌しながら添加し、そして混合液を、３時間還流させ、室温まで冷却し、そして４０ｍ
ｌの乾燥ＴＨＦ中の４．６４ｇ（ミリモル）のメチル４−メトキシベンゾエートを滴加した。 混合液を、６時間、穏やかに還流し、室温まで冷却し、そして１０
ｍｌの水を、攪拌しながら添加した。 有機層を、注意深く分取し、そして残渣を、少量のＴＨＦで数回洗浄した。 合せた有機画分を、蒸散させ、そして精製（フラッシュ−クロマトグラフィー）して、１１．４ｇ（８４％）の明るい黄色の固体を得た。 Mass-spectrum, MALDI-TOF: 467.545(MI-OH), 484.869(MI), 1 H-NMR(
CDCl 3 , δ, md): 7.95-6.75(m, 12H, arom.), 4.12(s, 4H, CH 2 ), 3.78(s, 3H,
OCH 3 ), 1.37(s, 12H, CH 3 )。 【００５５】 ４，４'−［ビス−（２−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４''−メトキシトリチルクロリド（６）。２５０ｍｌの８０％酢酸中の５（１０ｇ、ミリモル）の溶液を、４８時間、７２℃で保持し、蒸散させ、そしてその後水（２×５
０ｍｌ）で蒸散させた。 生成物を、７５ｍｌの５０％ＥｔＯＨ／水に溶解させ、
３時間還流させ、そして１／３まで蒸散させた。 その後、混合液を、１００ｍｌ
の水に溶解させ、そして３Ｍ ＨＣｌでｐＨ１〜２まで酸性化させた。 沈殿物を、クロロホルムに溶解させ、乾燥（Ｎａ 2 ＳＯ 4 ）させ、そして乾固するまで蒸散させ、そしてさらに真空で一夜乾燥させた。 得られたジカルボン酸を、１００ｍ
ｌの乾燥ＴＨＦに溶解させた。 ８．５ｇ（ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、そして混合液を０℃に冷却させた。 ２０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（８．５ｇ、ミリモル）を攪拌しながら滴加した。 反応混合液を、０℃で１時間、そして室温で一夜攪拌した。 ジシクロヘキシルウレアを濾取し、そして有機層を、乾固するまで蒸散させ、そして精製（フラッシュ−クロマトグラフィー）して、８．５ｇ（％）の白黄色−白色の固形物を得た。 Mass-spectrum, MALDI-TOF: 554.703(MI+OH), 570.794(MI). 1 H-NMR(CDCl 3 δ, md): 8.2-6.75(m, 12H, arom.), 3.81(s, 3H, OCH 3 ), 2.9(s, 8H, CH 2 )。 【００５６】 ＡｃＣｌ／トルエン中で、３時間攪拌することによって、この化合物を、対応のトリチルクロリドに変換させた。 その後、反応混合液を、１／３まで蒸散させた。 ２／３の量のトルエンを添加し、混合液を、再度１／３まで蒸散させ、そしてさらに精製することなしに使用した。 【００５７】 オリゴヌクレオチド合成（図４）の間にタグ付け部分を導入するために、我々は、プロパンジオール構造に基づいて非ヌクレオシドホスホルアミダイトシントン７を合成し、そしてそれは、標準Ａ、Ｃ、ＧおよびＴホスホルアミダイトに類似する反応性を供した。 ＭＭＴｒ（ＮＨＳ）Ｃｌは、ＤＭＴｒＣｌおよびＤＭＴ
ｒ（ＮＨＳ）Ｃｌの両方と比較して反応性が減少されていることを示し、そして低温でトリチル化反応を行って、過剰のプロパンジオールと活性化カルボキシル基の間のエステル結合の形成を防止する（データは示さず）ことは、７を合成する場合、重要である。 ホスホルアミダイト７は、室温で、少なくとも２日間、アセトニトリル溶液中で安定であった。 【００５８】 Ｏ 1 −｛［４−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−１，３−プロパンジオール。 【００５９】 トリチル化段階は、触媒なしに一夜０℃で、ピリジン中で行った以外は、公表された手段（４）によって標記化合物を合成した。 フラッシュ−クロマトグラフィーの後、５５％の収量を示すモノ保護プロパンジオールを、白色発泡体として得た。 【００６０】 Mass spectrum, MALDI-TOF(α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸): 488.76(MI). 1 H
-NMR(CDCl 3 , δ, md): 8.15-6.8(m, 13H, arom.), 3.8(s, 3H, OCH 3 ), 3.79(t,
2H, CH 2 OH), 3.28(t, 2H, J=6Hz, MMTr(NHS)OCH 2 ), 2.9(s, 4H, スクシンイミド
), 1.89(quin. 2H, CH 2 CH 2 CH 2 )。 【００６１】 Ｏ 1 ｛［４−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝
−Ｏ 3 −（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィニル）
−１，３−プロパンジオール（７）。 【００６２】 モノ保護プロパンジオールの亜リン酸化を、（４）に記述されるとおり行って、７０％の収率で白色発泡体として標記ホスホルアミダイトを得た。 31 P-NMR(CD
Cl 3 , δ, md): 144.512. Mass-spectrum, MALDI-TOF(ジヒドロキシ安息香酸): 6
89.934(MI)。 【００６３】 トリチル基本タグの分析。 化合物１、２、３および６の０．１Ｍ溶液をＴＨＦ
／ジオキサン（１：１）の混合液中で製造した。 １１０μｌのこれらの溶液を４
０μｌ（６の場合、８０μｌ）の様々なアミン（表１）の０．５−１Ｍ溶液と混合した。 その後、直接的に、または様々の組合せで混合した場合のいずれかで、
マトリックスを用いて、あるいはなしで混合液を分析した。 【００６４】 質量−タグのための前駆体としてこれらの修飾されたトリチルブロックを評価するために、化合物１および２を使用して、５'−保護チミジンを合成した。 ２
００μｌのおのおののトリチル化化合物を、対応の量のアミン溶液と混合させ、
そしてそれを５分間反応させることによって、これらのヌクレオシドの、およびさらにＴＨＦ中のＨＯ形態（トリタノール）での化合物３および６の０．１Ｍ溶液を、ＴＨＦまたはジオキサン中のアミンの０．５−１Ｍ溶液（モノ−ＨＮＳ−
基本化合物についてアミンの５当量、および６について１０当量）と反応させた。 その後、１μｌのこれらの混合物を、サンプル標的プレート上に塗布し、それを乾燥させることによって、反応混合液を、分子イオンの形成を防止するマトリックスなしの質量スペクトルによって分析した。 典型的結果は、表１に表される。 全てのトリチル誘導体については、最強のシグナルを示めす化合物を選択し、
そして全てを混合し、１μｌの混合液を標的プレートに塗布することによって、
混合液として分析した。 マトリックスを用いて、またはなしの両方で、素晴らしい結果が達成された。 【００６５】 全ての合成されたトリチルブロックを、対応する５'−チミジレートの２−５
％ＴｓＯＨまたはＨＣｌＯ 4で処理すること、および飽和ジカルボン酸ナトリウムで急冷した後生成物をＴＬＣ分析することによって、酸不安定性について試験した。 予測されるとおり、ＤＭＴｒ、ＭＭＴｒおよびＴｒの間の安定性において約１桁の規模の差があった。 対応するＮＨＳ−誘導体は、安定な場合の約２倍であった。 すなわち、安定性は、ＤＭＴｒ＜ＤＭＴｒ（ＮＨＳ）＜ＭＭＴｒ＜ＭＭ
Ｔｒ（ＮＨＳ）＜Ｔｒ＜Ｔｒ（ＮＨＳ） 【００６６】 オリゴヌクレオチド合成におけるタグとして使用するために、トリチル基は、
（ＭＡ）ＬＤＩ−ＴＯＦ分析で明らかに高い強度のシグナルを示すに違いなかった。 それは、オリゴヌクレオチド合成で５'−ＤＭＴｒ基を除去するのに使用される数段階の酸性処理にも耐える、すなわち関与した他の保護基と直交であるに違いなかった。 （ＮＨＳ−基は、オリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定である、実施例２参照）。 ＭＭＴｒ（ＮＨＳ）基は、これらの要求の両方の適するものとして好ましい。 それは、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸の２倍希釈標準溶液および減少された脱保護時間を用いて、オリゴヌクレオチド合成での少なくとも５〜８サイクルの酸性脱保護の後、一次水酸基に付着したままであった。
分析については、同じ溶液中の３−４％ＴＦＡを用いて、それは、容易に放出された（〜１〜３分）。 【００６７】 【表１】 【００６８】 【表２−１】 【００６９】 【表２−２】 【００７０】 （例２） オリゴヌクレオチド三量体５'−ＧＡＡ−３'を、標準３'−ホスホルアミダイトを用いて１μモル規模の合成でＰＥＧグラフト化ラップビーズ上で直接合成した。 その後、そのビーズを、今回は、７と１６の様々のアミンを用い、したがって、２５６の様々な７−ｍｅｒのライブラリーを生成しながら、図２に概略されるとおりスプリット・アンド・ミッスクス攻略法にしたがって、さらに４段階のオリゴヌクレオチド合成にかけた。 アンモニア脱保護の後、ビーズを洗浄し、
そして以下に記述されるとおり０．０５μモルの５'−Ｃｙ５−ＴＴＣ． ＣＡＧ
． Ｔ（１０）および５'−Ｃｙ５−ＴＴＣ． ＴＡＴ． Ｔ（１１）にハイブリッド形成した。 【００７１】 オリゴヌクレオチド合成の前に、約３〜６モル％の７を、標準Ａ、Ｃ、ＧおよびＴホスホルアミダイトと混合した。 全塩基に５％添加剤として７を使用して合成された８−ｍｅｒのライブラリーについて、オリゴヌクレオチド合成の段階収量が約９９％であると仮定すると、全長のオリゴヌクレオチドに占有されたビーズの全部位の約６０％を示した。 最初のタグの濃度（全ての当初の部位の５％）
は、最後のタグ（残りの６０％の部位の５％）のものより約２倍大きく、そしてそれは、さらに、同じ混合液中のそれらの全てを検出することを可能にする。 ４
−カラムＡＢ１装置でオリゴヌクレオチド合成を行った。 各酸化段階の後、カラムを除去し、そして様々のアミンで処理した。 特定の塩基／位置のコード化のために使用されるべきタグの質量を選択するとき、特定の原理は使用されなかった。 しかし、特に、基本型（すなわち、全Ａｓは、４００から５００Ｄａまでの範囲にあるタグによってコードされ、全Ｃｓは、５００〜６００Ｄａの間隔にあるタグによってコードされる等）のいずれかをコードするのに、特定の質量範囲が使用できるか、または一方、その塩基の位置は、決定因子（すなわち、位置番号１、または３'−末端（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）は、４００〜４２０Ｄａまでの範囲にある質量タグによってコードされ、位置番号２は、４２０〜４４０Ｄａによってコードされる）でありえた。 【００７２】 Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによってビーズを選択した。 ラップ−ビースのサイズ（〜０．３ｍｍ）は、その保存物から裸眼で見ることができる陽性で確認されるビースの手動の除去に対処する。 小さなビーズについては、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）のような自動的方法を使用することができるかもしれない。 選択ビーズを、脱トリチル化し、そして放出されたタグの混合物を、質量スペクトルによって分析した。 【００７３】 オリゴヌクレオチド合成での脱トリチル化段階の間、ＭＭＴｒ基本タグをコードする徐々の損失のあらゆる問題を排除するために、５'−Ｆｍｏｃ−保護攻略法も使用され、したがって、一緒に酸性条件を使用することを省いた。 各酸化段階の後、カラムを、合成装置から取除き、そしてそのビースを、対応のアミンで処理し、アセトニトリルで洗浄し、その後、アセトニトリル中の０．１Ｍ ＤＢ
Ｕで処理して、Ｆｍｏｃ−保護を除去した。 この攻略法を使用して合成された９
−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドをコードするタグを、（ＭＡ）ＬＤ１−ＴＯＦ分析を用いて検出した。 長い配列については、５'−Ｆｍｏｃ保護ヌクレオチドの３'−メチルホスホルアミダイトを、シアノエトキシホスホルアミダイトの代わりに好ましく使用して、アミンおよびＤＢＵで処理するためにＣＮＥＴ基の不順な損失を防止できた。 【００７４】 オリゴヌクレオチド合成。 製造業者のプロトコールに従って、市販で入手可能な標準Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、ＰＡＣ、フルオレセインおよびＣｙ５ホスホルアミダイトを用いてオリゴヌクレオチド合成を行った。 【００７５】 コンビナトリアルライブラリーの合成。 ホスホルアミダイト７を、３〜６モル％の総量のホスホルアミダイトまで標準Ａ、Ｃ、ＧおよびＴホスホルアミダイトに添加した。 ３５−４０ｍｇ（約２５００ビーズ）のＲａｐｐ テンタゲルマクロビーズを、４つのポリプロピレンＤＮＡ合成カラム（１μモル規模、グレン・
リサーチ、米国）の各々に載せた。 ホスホルアミダイト混合液を用いて、１μモル規模でオリゴヌクレオチド合成を行った：製造業者のプロトコールに従って、
Ａ＋７、Ｃ＋７およびＴ＋７。 しかし、カラムに対する脱保護試薬（塩化メチレンでそれの元の濃度の５０％まで希釈した）の供給を、連続の待機段階（１０秒）と、酸の別の部分（１０秒）を伴い１０〜１５秒まで減少させた。 そのカラムのアセトニトリル洗浄を通した連続で、全ＤＭＴＲ＋が放出されることを確認した。 各脱トリチル化段階の前に、カラムを、自動制御態様を用いてアセトニトリルで洗浄し、そしてその後、１分間、１ｍｌシリンジを用いて対応のアミン（アミンの安定性によって、ジオキサン／ＴＨＦ中の０．３−０．５ｍｌの０．５−
１Ｍ溶液）で処理した。 その後、カラムを、アセトニトリルで過度に洗浄し、そして１５分間、真空で乾燥させた。 その後、全カラムから得たビーズを、円筒形チャンバー（ピエロ（Ｐｉｅｒｏｒ））で０．３ｍｌ反応バイアル中に一緒に合せ、混合し、そしてその後、再度アセトニトリル中のビーズの懸濁液（１容積のビーズ当たり約１容積の溶媒）を、１ｍｌエフェンドルフチップを用いてピペットで採取することによって４つの部分に分けた。 その後ビーズを洗浄し、乾燥させ、５５℃で１．５ｍｌの濃縮アンモニア中で１４時間脱保護し、その後、蒸留水で数回洗浄し、乾燥させ、そして４℃で保存した。 【００７６】 コンビナトリアルライブラリーおよび脱トリチル化のハイブリダイゼーション。 ビーズを、４ｍｌバイアル中の１．５ｍｌの３．５ＭのＴＭＡ緩衝液（５１）
中で５'−Ｃｙ５標識７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド５'−ＴＴＣ． ＣＡＧ． Ｔ
（１０）および５'−ＴＴＣ． ＴＡＴ． Ｔ（１１）にハイブリッド形成させ、それを、一夜、８℃でスパイラミックス１０装置で回転させた。 その後、ビーズを、同じ温度でＴＭＡ緩衝液で５回洗浄し、７．５×５ｃｍ顕微鏡スライドの表面に移し、そして余分の緩衝液を、ティッシュペーパーで吸取ることにより除去した。 その後、着色またはさもなければ同定されたビーズを、ピンセットで除去（
通常、約３０〜５０ビーズ）し、水、アセトンで洗浄し、乾燥させた。 標準Ｄｅ
ｂｌｏｋ溶液（クルアケム；ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸）中のトリフルオロ酢酸の３−４％（ｖ／ｖ）溶液０．０８〜０．１ｍｌでビーズを３〜４分間、処理することによって、トリチルタグを切断した。 アセトンまたはメタノールで数回、上清を蒸散させて、酸を除去し、そして残渣を、（ＭＡ）ＬＤＩ−ＴＯ
Ｆによって分析した。 素晴らしい品質の結果が得られた。 【００７７】 （例３） チオール化オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ生成物を金の単層上に固定するのに先に使用された（例えば、Ｈｅｇｎｅｒら）。 付着は、金とチオール基の間の結合による。 この化学反応を使用して、チオール結合を介して、質量スペクトルメトリー標的プレートの金メッキ表面上に任意の遺伝子または任意の遺伝子の領域を固定することが可能である。 【００７８】 この実施例は、質量スペクトルメトリー標的プレートの金メッキ表面上にＰＣ
Ｒ生成物を固定化することを例示する；対のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびリゲーション、その内の１つは、遺伝子座を規定し、そして他方は、推定対立遺伝子を規定する。 その対立遺伝子は、質量スペクトルメトリーによってトリチルタグ（類）を検出することによって特徴づけられる。 示された実施例は、推定標的領域としてＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡを使用する。 【００７９】 ＰＣＲおよび固定化（図５） ２２５塩基対のＰＣＲ生成物を、２つのオリゴヌクレオチドプライマー； Ａ１ ５'ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ３'−；Ｂ１ ５'ＡＡＧＧＧ
ＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧ３'−を用いてＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡから増幅させた。 Ａ１を、従来のホスホルアミダイト化学を使用して５'末端に１７原子リンカー分子、およびチオール基を添加して合成した（図参照）。 チオール基を、
２００倍過剰のＤＴＴで活性化させ、そして５ｎｇの生成物を、金標的プレート上にスポット付けした。 １００％湿度で、一夜のインキュベーションが、ＰＣＲ
生成物を固定化するのに十分であった。 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
でそのプレートを浮遊させることによって、過剰テンプレートを、除去した。 【００８０】 ハイブリダイゼーションおよびリゲーション（図６） 遺伝子座Ｃ１−５'ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３'を規定するオリゴヌクレオチドを、５'末端に結合したホスフェートで合成した。 オリゴヌクレオチドを規定する２つの推定対立遺伝子を合成した、Ｄ１は、ジメトキシトリチルでタグ付けされ、そしてＤ２は、モノメトキシトリチルでタグ付けされたそれらの５'末端でのみ異なるＤ１およびＤ２−５'ＣＡＣＧＡＣＧＴＴ３'である。 従来のホスホルアミダイト化学を用いて、両方のオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＰＣＲ増幅生成物に完全に相補的であった。 【００８１】 リゲーションおよびハイブリダイゼーションは、一夜、１００％湿度で、４６
℃（ＨｏｕｓｂｙおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、１９９８年）であり、そしてオリゴヌクレオチドＣ１およびＤ１および／またはＤ２の飽和濃度下であった。 リゲーションについては、リゲーションにおけるその高温最適性と、基質オリゴヌクレオチドの３'末端についての差別化の程度が高いので、熱安定性ＤＮＡリガーゼＴｔｈを使用した。 残渣の未結合オリゴヌクレオチドを洗浄により除去した。 【００８２】 質量スペクトロメーター分析 モノメトキシトリチル（ＭＭＴ、質量２７２）の質量スペクトルは、結合生成物からＭＭＴを切断することを明らかに例示した。 イオン化を補助するのにマトリックスは使用されなかった。 対照サンプルは、２７２で検出可能なピークがなかったことを示した。 【００８３】 タグ付けオリゴヌクレオチドとしてジメトキシトリチルを使用する同じ例は、
ＤＭＴも十分に「フライする(flies)」こと、および３０３質量単位でピークを示すことを例示する。 誘導されたＴ残渣は、記述されるとおりアミン化ＤＭＴおよびＭＭＴ誘導体と結合した。 ＤＭＴタグＴ残渣の選択を、一緒に混合し、そして質量スペクトロメトリーによって分析した（図７参照）。 【００８４】 （例４） レーザー脱離イオン化質量スペクトロメトリーのための標的表面として使用するための使い捨てガラス製挿入物を、１ｍｍの普通のナトリウムガラスから製造し、長方形４５ｍｍ×４６ｍｍに切断し、そして切断エッジをはすに切った。 標準金メッキ金属挿入物（パーキン・エルマー／パーセプティブ・バイオシステムズ部品番号ＶＥＳ５０３ ４０５）は、組立て前にガラス挿入物の逆に位置配向マーキングに対するテンプレートとして使用しうる。 挿入物を、使い捨てサンプルプレート支持体（パーキン・エルマー／パーセプティブ・バイオシステムズ（
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）部品番号ＶＥＳ７００ ３１４）に保持させた。 サンプル支持体の４つの小売の栓を除去し、ガラス挿入物を、後ろから上部長方形枠に載せ、そしてサンプル支持体を再組立した。 分析用のサンプルは、現存の方法を用いて行いうる。 パーキン・エルマー／パーセプティブ・バイオシステムズの商標「ボエジャー（Ｖｏｙａ
ｇｅｒ）」 TMバイオスペクトロメトリーTM・ワークステーションソフトウエア・
バージョン４．０３は、サンプルをプレート上に正確に配置するのに使用でき、
そして現存の方法を用いて分析を行った。 【００８５】 図８に示される質量スペクトルは、ガラス標的に対する製造業者推奨の質量較正混合液の使用によって得られた。 その混合液（パーキン・エルマー／パーセプティブ・バイオシステムズ部品番号２−３２４３−００−０００）は、３つのペプチドｄｅｓ−ａｒｇ１−ブラディキニン、アングロテンシン１およびｇｌｕ１
−フィブリノペプチドＢを包含する。 標準法を用いて、分析を行った。 単独にプロトン化したイオンの理論的質量は、それぞれ、９０４．４６８１Ｄａ、１２９
６．６８５３Ｄａおよび１５７０．６７７４Ｄａである。 【００８６】 （例５） ポリプロピレン ポリプロピレンの表面で直接的なオリゴヌクレオチドのｉｎ ｓｉｔｕ合成は、詳細に記述された（Ｍａｔｓｏｎら、１９９４年；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９
９４年）。 特定の短い（１０〜２０塩基）配列の表面合成は、標的配列を捕捉するのに使用されうる。 いったん捕捉されると、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、捕捉された標的配列とハイブリッド形成されうる。 質量タグ付けオリゴヌクレオチドの連続リゲーションは、質量スペクトロメトリーで使用して、対立遺伝子を規定する。 質量スペクトロメトリーは、実施例４で記述されたものに類似の方法で使い捨てサンプルプレート支持体にポリプロピレン配列を確保することによって可能になった。 【００８７】 通常のホスホルアミダイトＤＮＡ合成の終わりにＤＭＴ左「オン」を有する９
−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、一片のポリプロピレンの上にスポット（２０
００ピコモル）付けした。 マトリックスなしのレーザー脱離／イオン化時間のフライト質量スペクトロメトリーが、３０９．３質量単位でピークを表した。 質量が高度に観察されたのは、使い捨て標的プレートの後ろに置かれるべきポリプロピレン（ストリップ）標的のためであり、それにより、イオン飛行距離を増やすためである。 プレートは、質量スペクトロメトリーのために確保されるポリプロピレンストリップを保持するのに使用された。 【００８８】 （例６） エポキシシラン化学 実施例４に記述されるとおり質量分光分析用のガラス製標的を作成する。 表面は、エポキシシラン（Ｂｅａｔｔｉｅら、１９９５年）で処理することによって活性化され、そして標的ＤＮＡは、３'または５'末端のいずれかで末端アミンで合成される。 ５μＭのアミン化オリゴヌクレオチドを、活性化ガラス製プレートの表面にスポット付けし、そして２時間から一夜放置した。 表面を、６０℃で、Ｈ 2 Ｏで、室温で１０ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ９．２）で洗浄し、続いて熱水で２回洗浄した。 32 Ｐ放射性アイソトープで標識したプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、３Ｍ ＴＭＡＣ、６０ｍＭトリス（ｐＨ７
． ５）、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％ＳＤＳ中で１時間、続いて同じ緩衝液で１時間洗浄する。 ハイブリダイゼーション効率の分析は、リン光測定分析によって測定でき、そしてタグ付オリゴヌクレオチドの質量分光光度測定分析が対立遺伝子を決定する。 【００８９】 イソチオシアネート化学 この方法は、先に記述された（ＷｅｉｌｅｒおよびＨｏｈｅｉｓｅｌ、１９９
７年）。 これらの実験の目的については、ガラス製標的プレートは、１０％Ｎａ
ＯＨで一夜浸漬し、続いてＨ 2 Ｏおよびメタノールで洗浄することによって、シラン化する。 その後、プレートを、メタノール中の３％アミノプロピルトリメトキシシラン中で超音波処理し、続いて水、続いてメタノールで洗浄する。 その後、プレートを、窒素中におき、そして１５分間、１１０℃で焼付ける。 【００９０】 アミン化オリゴヌクレオチドの固定のために、フェニレンジイソチコシアネート（ＰＤＩＴＣ）によってプレートを活性化させる（ＷｅｉｌｅｒおよびＨｏｈ
ｅｉｓｅｌ、１９９７年）。 ５'または３'アミンで標的オリゴヌクレオチドを合成する。 室温で、２時間、０．００１ＭのＮａＯＨ、０．１〜１．０μＭオリゴヌクレオチド中で標的ＤＮＡの固定化を行う。 １時間、３×ＳＳＰＥおよび０
． ５％ＳＤＳ中で32 Ｐ放射性標識した相補的プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、続いて、同じ緩衝液中で洗浄し、そして連続ホスホルイメージャー分析する。 タグ付オリゴヌクレオチドのリゲーションおよび質量分光光度分析が、対立遺伝子を決定する。 【００９１】 メルカプトシラン修飾ガラス表面 メルカプトシラン修飾ガラス表面を誘導するためのこの方法は、先に記述されている（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９９年）。 簡便には、ガラス製標的プレートは、
２５％水酸化アンモニウムナトリウム中で一夜洗浄され、１０分間、水で洗浄し、続いて無水エタノールで簡便に洗浄する。 シラン化については、ガラス製プレートを、３０分間、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）の１％溶液、９５％エタノール、１６ｍＭ酢酸（ｐＨ４．５）で浸漬する。 最終的に、プレートを、９５％エタノール／１６ｍＭ酢酸（ｐＨ４．５）で洗浄し、そして２時間、１５０℃で真空オーブンで乾燥させる。 【００９２】 標的ＤＮＡを、チオール／ジスルフィド交換反応を介して固定化する。 チオール基は、標準ホスホルアミダイト化学を用いて任意のオリゴヌクレオチドの５'
末端に容易に加えることができる。 一般に、チオール化オリゴヌクレオチドである場合、５００ｍＭのＮａＨＣＯ 3 （ｐＨ９．０）中の１０μＭを、２時間、一夜まで活性化メルカプトシラン表面にスポット付けする。 その後、その表面を、
ＴＮＴｗ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄する。 【００９３】 ４０塩基の５'チオール化オリゴヌクレオチドは、メルカプトシラン化ガラス製標的に固定された。 ３２ Ｐ放射性標識した１７塩基の相補的プローブ配列のハイブリダイゼーションは、ほとんどバックグランドハイブリダイゼーションなしの相補的標的配列に非常に特異性があることを示した。 【００９４】 （例７） ポリリシン ２７−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、ポリリシンで前処理したガラス製質量スペクトロメトリー標的に付着させた。 非特異的血およびグリニャールを阻害する処理の後、高い効率を示す相補的１４−ｍｅｒの特異的ハイブリダイゼーションが、成功裏に例示された。 【００９５】 ガラス製ＭＳ標的（実施例４に記述された）を、清浄し、そしてポリリシン溶液（シグマＰ８９２０）で処理し、続いて以下に記述される一般の手段で処理した。 【００９６】 １． スライドラックの上にスライドを載せる。 ラックをチャンバーに入れる。 ２． 清浄溶液を作成する。 ２８０ｍＬのｄｄＨ 2 Ｏ中に７０ｇのＮａＯＨを溶解させる。 ４２０ｍｌの９５％エタノールを添加する。 総量は、７００ｍｌ（＝
２×３５０ｍｌ）である。 完全に混合するまで攪拌する。 溶液が曇りを残す場合、透明になるまでｄｄＨ 2 Ｏを加える。 【００９７】 ３． スライドと共にチャンバーに溶液を注ぐ。 ガラス製蓋でチャンバーを覆う。 ２時間、軌道振蘯器で混合する。 スライドが透明になったら、それらを、できる限り少ない空気に曝すべきである。 塵粒子は、被覆および印刷に干渉する。 ４． ｄｄＨ 2 Ｏで充填した新たなチャンバーにラックを移す。 ラックを上げ下げすることによって激しく洗浄する。 ｄｄＨ 2 Ｏで４回繰返し洗浄する。 それは、ＮａＯＨ−エタノールの全ての軌跡を除去するために重要である。 【００９８】 ５． ポリリシン溶液を製造する。 ５６０ｍｌ水中の７０ｍｌポリ−Ｌ−リシン＋７０ｍｌ組織培養ＰＢＳ。 プラスチック製勾配シリンダーおよびビーカーを使用する。 ６． ポリリシン溶液にスライドを移し、そして１５分−１時間、振蘯させる。 ７． ｄｄＨ 2 Ｏで充填した新たなチャンバーにラックを移行させる。 ５回上げ下げして、洗浄する。 【００９９】 ３つのオリゴヌクレオチドを、標準法を使用して作成した。 １ａ ５'Ｃｙ−ＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣ ＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧ ＴＴＴＣＴＧ
Ａ ３' １ｂ ５' ＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣ ＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧ ＴＴＴＣＴＧ
Ａ ３' ２ ５'Ｃｙ−ＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴ ＣＴＧＴ ３' 【０１００】 オリゴ１ａは、蛍光シアニン染料で標識され、オリゴ１ｂは、未標識の同じ配列である。 オリゴ２も、標識されたシアニンであり、そしてオリゴ１ａおよび１
ｂの塩基１１から２４までに対する配列に相補的である。 【０１０１】 オリゴ１ａおよび１ｂの２倍の連続希釈を、５００ｎｇ／μｌから１ｎｇ／μ
ｌまでの脱イオン化蒸留水中で作成した。 各機希釈の２つの二重１μｌスポットを、ガラス標的に載せ、そして空気で乾燥させた。 ガラス標識を、処理して、以下に記述される一般手段に続いて非特異的ＤＮＡ結合を阻害する。 【０１０２】 １． スライドラックに配列を載せる。 軌道振蘯器で十分にスライドチャンバーを空にさせる。 ２． 遮断溶液を作成する。 ３２５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノン中に５
． ５ｇの無水コハク酸を溶解させる。 無水コハク酸を溶解させた直後に、２５ｍ
ｌホウ酸ナトリウムを加える。 【０１０３】 ３． ホウ酸ナトリウム溶液を混合した直後、空のスライドチャンバーに溶液を注ぐ。 スライドラックを溶液に数回突っ込む。 軌道振蘯器で、１５〜２０分間混合する。 同時に、〜７００ｍｌ水（スライドラックを覆うのに十分である）を、
２リットルのビーカー中で９５℃まで加熱する。 ４．２分間、スライドラックを９５℃の水に穏やかに突っ込む。 ５．９５％エタノール中にスライドラックを５回突っ込む。 【０１０４】 蛍光を、ＳＴＯＲＭ８６０蛍光読取機を用いて走査し、そして記録して、オリゴ１ａの付着を確認した。 同じ配列の未標識オリゴ１ｂの付着が、推論される。 【０１０５】 ハイブリダイゼーション溶液（４×ＳＳＣ、０．２５％ＳＤＳ、２４０ピコモルのオリゴ２）を、総量５２μｌで作成し、２分間沸騰させ、ガラス標的に載せ、そして未処理ガラス標的で被覆した。 ハイブリダイゼーションは、室温で３×
ＳＳＣを含む湿潤チャンバー中で８時間、進行させた。 その後、標的を２×ＳＳ
Ｃで３回洗浄し、脱イオン化蒸留水で簡便に洗浄し、そして空気で乾燥させた。
固定化された未標識の相補的配列オリゴ１ｂへの標識オリゴ２の付着は、蛍光走査によって確認された。 【０１０６】 データ 非特異的結合を阻害する処理に続いて、結合オリゴ１ａの蛍光を、５００ｎｇ
／μｌから検出した。 ハイブリダイゼーション後、結合オリゴ２の蛍光は、５０
０ｎｇ／μｌから１ｎｇ／μｌまでの希釈の完全な範囲を越えて検出された。 非特異的バックグランド蛍光は、許容しうる。 【０１０７】 （例８） 溶液実験 タグ付オリゴヌクレオチドのテンプレートＤＮＡへのリゲーションを試験するために、溶液実験を行った。 ９塩基のオリゴヌクレオチドは、タグ付けされているか、またはいなかった。 適合したオリゴヌクレオチドは、４１３．５単位の質量タグを示し、そしてミスマッチオリゴヌクレオチドは、４０２単位の質量タグを示した。 １７塩基プライマーを、リゲーション処理を指示するのに使用した。
反応は、各９−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの組合せから構成された。 テンプレートとタグ付オリゴヌクレオチドの濃度は、１２０ｆモルであった一方で、１７
塩基プライマーは、６０ｆモルの濃度にあった。 プライマーを、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２ Ｐで放射性標識した。 各反応液は、５０単位のサーモムスサモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡリガーゼを含み、そして３７℃または４６℃のいずれかで、４時間、インキュベートした。 反応液を、ホルムアミドでスポット付けし、そして生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。 【０１０８】 生じた結合バンドは、ゲルから削り、そしてＤＮＡを、３７℃で、一夜、高塩分緩衝液中でのインキュベーションによって溶出させた。 その後、ＤＮＡを精製し、そしてマトリックスなしの質量分光光度計によって分析した。 生じた４１３
． ５の質量は、完全に相補的なオリゴヌクレオチドＮのリゲーションに使用された質量タグに対応した。 ４０２質量単位で、オリゴヌクレオチドＭのミスマッチ配列に対応する検出可能なピークはなかった。 これは、リゲーション配列が、最近適合したオリゴヌクレオチドに非常に特異的であること、したがって、その手段が、高い処理量の遺伝子型に適合性があることの確認がされる。 【０１０９】 （例９） 要約 ガラススライドを、乾燥トルエン中で（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシランでシラン化させた。 その後、末端チオール官能基を、２，２'−ジピリジルジスルフィドと反応させて、ピリジルジスルフィド結合を形成させた。 末端ホスホロチオエート基でその５'−末端に修飾した４３−ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドを、修飾スライドに付着させた。 【０１１０】 未処理ガラススライドを、６時間、乾燥トルエン中の５％（ｖ／ｖ）（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシランの溶液に漬けた。 スライドを、乾燥トルエン、続いてエタノールで洗浄した。 スライドを、イソプロパノール中の２，２
'−ジピリジル・ジスルフィドの６．６６ｇ／ｌの溶液に連続して一夜漬けた。
最後に、スライドを、イソプロパノールで洗浄し、空気乾燥させた。 【０１１１】 そのオリゴヌクレオチドは、配列： ５'−ｐ（ｓ）−ＴＴＴ ＴＡＧ ＣＡＡ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＣ Ｃ ３' （ｐ（ｓ）＝末端チオホスフェートである） を示した。 【０１１２】 ４０μＭ、２０μＭ、８μＭおよび４μＭのオリゴヌクレオチド溶液を、水中で作成した。 【０１１３】 各希釈の２０μｌに、２０μｌの０．８Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４）、２０μ
ｌエチレングリコールおよび４０μｌの水を添加した。 【０１１４】 最終濃度は、１０μＭ、５μＭ、２μＭおよび１μＭであった。 【０１１５】 【表３】 【０１１６】 １μオリゴヌクレオチド溶液を各スポットに使用した。 スライドを、１８時間、室温で保持し、水、続いてイソプロパノールで洗浄し、そして乾燥させた。 【０１１７】 （例１０） Ｏ 1 −｛［４−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−５−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（２）。 周囲温度で、ピリジン（２５ｍｌ）中のＮ−スクシンイミジル−４−［ビス−（フェニル）−クロロメチル］−ベンゾエート（１）（０．８ｇ、１．７ミリモル）の溶液を、固形物として少量で添加された過剰の６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（０．９１ｇ、４．２５ミリモル）で処理した。 得られる溶液を、窒素の雰囲気下で、周囲温度で一夜攪拌した。 その後、溶媒を真空下で除去して、光沢のある黄色油状物として得た。 フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（５：
１ ジクロロメタン−酢酸エチル）は、白色発泡体として標記化合物をもたらした。 収量＝０．３９ｇ（３５％）。 δ(300MHz, CDCl 3 ) 8.02(2H, d, アリール),
7.61(2H, d, アリール), 7.39-7.20(9H, m, アリール), 6.82(2H, d, アリール
), 6.27(1H, br, アミド), 3.78(3H, s, OCH 3 ), 3.32(2H, m), 3.03(2H, m), 2.
87(4H, s, スクシミジル), 1.62-1.49(6H, m), 1.42-1.21(6H, m): IR(film) ν
3345, 1770, 1730, 1708 cm -1 ; MS(ES+) 644(M+H 2 O )+ 。 【０１１８】 Ｏ 1 −｛［４−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（３）を、上に記述される手段を用いて、Ｎ−スクシンイミジル−４−［（４−メトキシジフェニル）−クロロメチル］−ベンゾエート（４）（１．２ｇ、２．５ミリモル）および６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（１．３３ｇ、６．２５
ミリモル）から製造した。 収量＝白色発泡体として１．０２ｇ（６２％）。 δ H (
300MHz, CDCl 3 ) 8.02(2H, d, アリール), 7.61(2H, d, アリール), 7.24(4H, d,
アリール), 6.81(4H, d, アリール), 6.26(1H, br, アミド), 3.78(6H, s, OCH 3 ×2), 3.32(2H, m), 3.02(2H, m), 2.86(4H, s, スクシンイミジル), 1.6-1.5(
7H, m), 1.36-1.21(5H, m); IR(film) ν 3400, 1770, 1740, 1708 cm -1 : MS(ES
+) 697(M+MeCN )+ 。 【０１１９】 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−
６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（５）。 アセトニトリル（５
ｍｌ）中のＯ 1 −｛［４−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（０．３９ｇ、
０．６３ミリモル）の溶液を、過剰の混ざりのないｎ−ブチルアミン（０．１８
ｇ、２．５ミリモル、０．２５ｍｌ）で処理した。 窒素の雰囲気下で、周囲温度で一夜溶液を攪拌した。 その後、溶媒を、真空下で除去し、そして残渣を、酢酸エチルおよび水の間に分配した。 有機層を分離し、Ｎａ 2 ＳＯ 4上で乾燥させ、そして濾過した。 濾液の濃縮で、継続して結晶化する透明な油状物を得た。 収量＝
０．３５ｇ（９６％）。 【０１２０】 δ H (300MHz, CDCl 3 ) 7.64(2H, d, アリール), 7.49(2H, d, アリール), 7.38(
2H, d, アリール), 7.27-7.20(5H, m, アリール), 6.4(1H, br, アミド), 6.13(
1H, br, アミド), 3.77(3H, s, OCH 3 ), 3.41(2H, m), 3.29(2H, m), 3.02(2H, m
), 1.57-1.50(7H, m), 1.38-1.21(5H, m), 0.91(3H, t, CH 3 (CH 2 ) 3 N); IR(film)
ν 3303, 3083, 1707, 1637, 1543, 1508 cm -1 。 【０１２１】 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（６）を、上に記述される手段を用いて、Ｏ １ −｛［４−（スクシンイミジルカルボキシ）］−４'
，４”−ジメトキシトリチル｝−６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（０．６ｇ、０．７６ミリモル）およびブチルアミン（０．２２ｇ、３．０
ミリモル、０．３ｍｌ）から製造した。 収量＝透明な油状物として０．４５ｇ（
９５％）。 【０１２２】 δ H (300MHz, CDCl 3 ) 7.64(2H, m, アリール), 7.49(1H, d, アリール), 7.35(
1H, d, アリール), 7.34-7.27(3H, m, アリール), 7.13(2H, d, アリール), 6.7
9(4H, m, アリール), 6.36(1H, br, アミド), 6.05(1H, br, アミド), 3.77(6H,
s, OCH 3 ×2), 3.63(1H, m), 3.46-3.28(6H, m), 1.55(7H, m), 1.37(4H, m), 0
.91(4H, m); IR(film) ν 3301, 3033, 1708, 1637, 1544, 1508 cm -1 。 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−
６−アミノ−１−ヘキサノール（７）。 メタノール（５ｍｌ）中のＯ 1 −｛［４
−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（０．３５ｇ、０．６ミリモル）の溶液を、
周囲温度で、０．８８ｓｐｇのアンモニア水溶液（１ｍｌ）で処理した。 その溶液を一夜攪拌し、そしてその後、溶媒を真空下で除去した。 薄層クロマトグラフィー（４：１ ジクロロメタン−酢酸エチル）による分析は、アミノ基（ニンヒドリン）およびトリチル残基（アニスアルデヒド／酸）の存在について試験するときに、陽性の結果を示す新規で極性のある材料の存在を示した。 粗材料は、さらなる精製なしに使用された。 【０１２３】 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−アミノ−１−ヘキサノール（８）を、上に記述される手段を用いて、Ｏ １ −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−トリフルオロアセトアミド−１−ヘキサノール（０．４５ｇ、０．
７ミリモル）およびアンモニア水溶液（１ｍｌ）から製造した。 【０１２４】 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−
６−スクシンアミド−１−ヘキサノール（９）。 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−６−アミノ−１−ヘキサノール（
〜０．３ミリモル）を、周囲温度で、無水ピリジン（５ｍｌ）に溶解させた。 その後、無水コハク酸（０．０７ｇ、０．７ミリモル）を添加し、そして生じた溶液を、２時間、周囲温度で攪拌させた。 その後、溶媒を真空下で除去し、そして残渣を、ｔｌｃ（４：１ ジクロロメタン−酢酸エチル）によって分析した。 新しい材料を観察し（Ｒ f ０．３）、そしてそれは、トリチル残基（アニスアルデヒド／酸）について試験したときに陽性を示したが、しかし、アミン（ニンヒドリン）の存在について試験したときには陽性を示さなかった。 粗生成物は、さらに精製することなしに使用した。 【０１２５】 Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−スクシンアミド−１−ヘキサノール（１０）を、上に記述される手段を用いて、Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−アミノ−１−ヘキサノール（〜０．３５ミリモル）および無水コハク酸（０．０９ｇ、０．９ミリモル）から製造した。 生成物は、さらなる精製なしに使用された。 【０１２６】 Ｎ−スクシンイミジル｛Ｏ 1 −［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−
メトキシトリチル｝−６−スクシンアミド−１−ヘキサノエート（１１）。 アセトニトリル中のＯ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'−メトキシトリチル｝−６−スクシンアミド−１−ヘキサノールおよびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレートの溶液を、周囲温度で攪拌しながら、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピル）エチルアミンで処理した。 ２時間攪拌した後、溶媒を真空下で除去し、そして残渣を、
フラッシュカラムクロマトグラフィー（９８：２ ジクロロメタン−メタノール）に掛けた。 部分的に精製された生成物を得て、その後、それは、分取薄層クロマトグラフィーを用い、そして９：１ジクロロメタン−メタノールで溶出して純化させた。 そのプレートを、十分に乾燥させ、その後、再度溶出させた。 ｔｌｃ
上のトリチル活性材料に対応するバンドを取り出し、９：１ジクロロメタン−メタノールで粉砕した。 シリカを濾取し、そして濾液を真空下で濃縮させて、少量の標記化合物を得た。 収量＝１０ｍｇ。 【０１２７】 δ H (300MHz, d 3 -MeCN) 7.68(2H, d, アリール), 7.49(2H, d, アリール), 7.4
2(2H, d, アリール), 7.33-7.23(5H, m, アリール), 7.1(1H, br, アミド), 6.8
6(2H, d, アリール), 6.6(1H, br, アミド), 3.75(3H, δ, OCH 3 ), 3.34-3.27(2
H, m), 3.10(2H, m), 2.99(2H, m), 2.56(4H, s), 2.55-2.38(4H, m), 1.56-1.4
9(3H, m), 1.40-1.29(7H, m), 1.21(1H, m), 0.91(3H, t, CH 3 (CH 2 ) 3 N)。 【０１２８】 Ｎ−スクシンイミジル｛Ｏ 1 −［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，
４”−ジメトキシトリチル｝−６−スクシンアミド−１−ヘキサノエート（１２
）を、Ｏ 1 −｛［４−（ブチルアミドカルボキシ）］−４'，４”−ジメトキシトリチル｝−６−スクシンアミド−１−ヘキサノール（〜０．３ミリモル）、Ｏ
−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム・
テトラフルオロボレート（０．２７ｇ、０．９１ミリモル）およびＮ，Ｎ−（ジイソプロピル）エチルアミン（０．２４ｇ、１．９ミリモル、０．３３ｍｌ）から製造された。 生成物を不純で得た。 収量＝０．０４５ｇ。 【０１２９】 上記化合物の両方を、ジクロロメタン中の希釈溶液を製造し、その後過剰のｎ
−ブチルアミンを添加することによって活性エステルの存在について試験した。
反応液を、ｔｌｃ（９：１ジクロロメタン−メタノール）によって実験し、そして両方の場合に、出発材料をよりいっそう極性を示す生成物に完全に変換することを示した。 アミノヌクレオチド誘導体との活性化エステルの反応は、類似のアミド結合生成物の形成を生じることが予想されえた。 【０１３０】 【化１】 【０１３１】 （例１１） ６−Ｎ−トリチルアミノスクシンイミジルヘキサノエート 【化２】 【０１３２】 Ｎ−トリチルアミノカプロン酸（２１４ｍｇ、０．５７ミリモル）、ジクロロヘキシルカルボジイミド（１５４ｍｇ、０．７５ミリモル）、４−Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２１ｍｇ、０．１７ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８６ｍｇ、０．７５ミリモル）を乾燥ジオキサン（５ｍｌ）に溶解させた。 反応混合液を、室温で、一夜攪拌させた。 ジシクロヘキシルウレアを濾取し、そして濾液を乾固するまで蒸散させ、そしてフラッシュ・クロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタンまでのジクロロメタンの濃度勾配）によって精製した。 光沢のある黄色発泡体を単離した（２７０ｍｇ、９８％）。 【０１３３】 1 H NMR(CDCl 3 , δ, md): 7.46-7.08(m, 15H, arom), 2.74(s, 4H, スクシンイミド), 2.53(t, 2H, NH- CH 2 ), 2.06(t, 2H, CO CH 2 ), 1.86-1.16(m, 6H, 3×CH 2 )
。 Mass spectrum(Electrospray, +ve mode) 471.53[M+H] + , 243.28[トリチル] +
。 【０１３４】 ５−（アリル−３−ビスカプロミジル−１５−Ｎ−トリチルアミノ）−２'−
デオキシウリジン−５'−トリホスフェート 【化３】 【０１３５】 ５−（アリル−３−カプロミジル−９−アミノ）−２'−デオキシウリジン−
５'−トリホスフェート（５００μｌの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で２．５ｍ
ｇ）を、マイクロスターラー棒を有するエフェンドルフに注入した。 アセトニトリルを添加（１２５μｌ）し、その後６−Ｎ−トリチルアミノスクシンイミジルヘキサノエート（４５μｌアセトニトリル中６ｍｇ）を添加し、続いてさらにアセトニトリル（４５μｌ）を添加した。 反応混合液が、最初に濁り、その後さらに攪拌で透明になる室温で、溶液を攪拌させた。 ５時間の攪拌の後、反応混合液を、濃縮ゾーンを有するシリカ分取プレート（５：４：１プロパン−２−オール：アンモニア：水）上で精製した。 生成物を含むシリカをプレート上から擦り取り、そして同じ溶出系で抽出し、蒸散し、５０：５０アセトニトリル：水に再溶解させ、そして生綿栓を通して濾過させた。 溶液を、微細な白色粉末になるまで蒸散させた。 精製の後のＴＬＣでは、生成物が、出発トリホスフェートより高い流出量であり、そしてアニスアルデヒドで強力に加熱するときに茶色に染まる（
糖の指標である）ことが示された。 【０１３６】 Mass spectrum(Electrospray, + ve mode) 1014.11[M+Na] + , 243.28[トリチル
] + . (- ve mode) 990.35[MH] - , 910.18[MH 2 PO 3 ] - 。 【０１３７】 ビオチン、ハプテン、染料および金属キレート剤のようなアリルアミノ−ｄＵ
ｔｐの接合体は、ポリメラーゼによる取込みのための基質として文献に報告された。 【０１３８】 （例１２） 大要 ハイブリッド形成第三オリゴを介して固形支持体上で質量タグ付オリゴヌクレオチドを固定した相補的ＤＮＡ配列に結合させるシステムが、記述される。 そのシステムは、酵素的成分としてＴｔｈＤＮＡリガーゼを使用し、そしてそれは、
ハイブリッド形成「プローブ」オリゴ上へのＤＭＴ修飾オリゴ（「レポーター」
配列）のリゲーションを触媒する。 溶液に使用されるプローブオリゴは、全ての操作および検出を通して固形支持体に付着されたままである繋がれた「テンプレート」オリゴへのハイブリダイゼーションによって起源を探り出される。 プローブまたはレポーターオリゴのいずれでもないハイブリダイゼーションは、それらの長さが短いので上昇した温度で起こるが、一貫して高いＴｍを示す結合生成物は、洗浄温度が上がったときに保有される。 リゲーションの成功は、固定されたテンプレート上の対応の塩基に対するレポーターでの３'塩基の正しいミスマッチ検出による。 Ｔｔｈリガーゼは、この位置でミスマッチ塩基の存在下で反応を触媒しない。 【０１３９】 付着化学 オリゴは、多様な入手可能で開発された化学を用いて、誘導されたガラス表面に特異的に付着された。 末端５'アミノ基を有するオリゴは、イソチオシアネートとエポキシド誘導ガラスの接合体に使用された一方で、チオール修飾オリゴは、メルカプトプロピルシランおよびピリジルジスルフィド法を用いて固定された。 この後者の方法は、この報告で記述された実験の主題である。 ハイブリダイゼーション実験 以下のオリゴ配列が使用された。 【０１４０】 ５'ＴＴＴＴＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴ
ＴＴＣＴＧＡＧＡＣＣ ３'（鋳型） ＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡ
ＡＡＧＡＣ＊（質量タグを有するレポーター） （プローブ） 【０１４１】 プローブおよびレポーターオリゴは、それぞれ、４２および２６℃のＴｍ値を示し、両方を、２２℃の実験温度でアニールさせた。 高温での連続洗浄は、１５
−ｍｅｒのプローブについてチャート図１で例示される、アニールされたプライマーの量を減少させ、そして最大の減少は、オリゴのＴｍの領域で生じる。 このパターンは、分析されたオリゴの両方の濃度（８および６μＭ）に一致する。 これは、ハイブリダイゼーションが、高濃度のテンプレートについて生じる優れたシグナル対ノイズ比を示す、プローブとテンプレートとの間の相互作用の一次態様であることを示す。 【０１４２】 チャート２では、テンプレート沈着濃度が下げられたときに、シグナル強度での減少が示される。 低いテンプレート濃度で、ハイブリダイゼーション強度が一致しないようなピリジルジスルフィド付着化学で考慮すべき変化がある。 【０１４３】 同じテンプレート上へのプローブとレポーターオリゴの両方のリゲーションおよび質量スペクトロメトリーによる検出の表示を計数する。 【０１４４】 【表４】 【０１４５】 チャート１．１５マーのプローブオリゴを付着テンプレートにアニールする上での緊縮洗浄が増加した影響（条件 １×Ｔｔｈリゲーション緩衝液、０．１％Ｓ
ＤＳ） 【表５】 【０１４６】 チャート２． 標識プローブのハイブリダイゼーション・シグナルにおける増加は、付着テンプレート濃度に比例する。 （１×Ｔｔｈリゲーション緩衝液中でのサンプル洗浄、２２℃で０．１％ＳＤＳ）。 【０１４７】 【表６】 【０１４８】 【図面の簡単な説明】 添付図面は参照を目的としており、 【図１】 図１は液中に於いてオリゴヌクレオチドに結合されるトリチルをベースとした質量タグを利用したコーディング法の図である。 【図２】 図２は、ビーズに結合された質量タグとオリゴヌクレオチドを用いた、トリチルをベースとした質量タグを利用したコーディング法の図である。 【図３】 図３は、ＭＭＴ−タグ付きオリゴヌクレオチドの合成、および検出を示す図である。 【図４】 図４は各種トリチルをベースとした質量タグの合成を示す。 【図５】 図５は、ハイブリダイゼーションおよびリゲーション前のＰＣＲおよび固定化法を示す図である。 【図６】 図６は、ハイブリダイゼーションおよびリゲーション前のＰＣＲおよび固定化法を示す図である。 【図７】 図７は以下の条件にて得られるマススペクトラムである。 【図８】 図８は以下の条件にて得られるマススペクトラムである。 【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書 【提出日】平成１２年７月３１日（２０００．７．３１） 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項１ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正２】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項１１ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正３】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項１５ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正４】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項１９ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正５】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項３１ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正６】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項３２ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正７】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項３３ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正８】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項４５ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正９】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項４６ 【補正方法】変更 【補正内容】 【手続補正１０】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】請求項５１ 【補正方法】変更 【補正内容】 ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 シュチェピノフ、ミハイル・セルゲービッ チ イギリス国、オーエックス３・０ピーエ ヌ、オックスフォードシャー、オックスフ ォード、オールド・マーストン、バーン ズ・ハイ ８ (72)発明者 ハウズビー、ジョン・ニコラス イギリス国、オーエックス15・５エヌキュ ー、オックスフォードシャー、バンベリ ー、フック・ノートン、ハイ・ストリー ト、ガゼボ・コテージ（番地なし) (72)発明者 ハミルトン、アラン・ルイス イギリス国、エイチピー６・６エスエイ チ、バッキンガムシャー、リトル・チャル フォント、チャーチ・グローブ 15、アッ シュダウン (72)発明者 エルダー、ジョン・ケネス イギリス国、オーエックス５・２エーワ イ、オックスフォードシャー、オックスフ ォード、キドリントン、セント・メアリー ズ・クローズ 14 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB15 FB20 4B024 AA11 CA09 HA12 4B029 AA21 BB20 CC03 CC13 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QR62 QR83 QS25 QS34 QS36 QS39 QX07 |
