用于利用变性功能在微阵列中活性杂交的方法 |
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| 申请号 | CN201180033342.8 | 申请日 | 2011-06-01 | 公开(公告)号 | CN102971412A | 公开(公告)日 | 2013-03-13 |
| 申请人 | 罗伯特·博世有限公司; | 发明人 | M.施图姆贝尔; M.多布; J.鲁普; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种用于在微阵列中活性杂交的方法，其中准备的样品被 泵 送通过变性单元并且紧接着通过与所述变性单元在空间上分开的、具有微阵列的反应区域，从而使得此前经过变性的、 反应性 样品成分在所述反应单元中发生杂交。 | ||||||
| 权利要求 | 1. 用于在微阵列（5）的至少一个探针上活性杂交的方法，其包括以下步骤: |
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| 说明书全文 | 用于利用变性功能在微阵列中活性杂交的方法技术领域[0001] 本发明涉及一种用于利用分离的变性功能活性杂交的方法。 背景技术[0002] 微阵列作为现代分子生物学的研究体系而已知。而其允许以少量的生物样品材料进行数以千计的单个检验的平行分析。与之相应地，已确立了不同形式的微阵列，所述微阵列按照其相互作用的类型分类。属于此的一方面是基于核酸的微阵列，所述微阵列例如用于检验生物体的特定基因的DNA，mRNA或者rRNA。为此，将与mRNA互补的PCR产品的cDNA、寡核苷酸或者片段印在基板材料（“斑点微阵列”）上。在“寡核苷酸微阵列”中，将合成制成的寡核苷酸施加到例如玻璃基板上。在基板上作为探针起作用的寡核苷酸在该基板上在最小的空间上形成尽可能大的信息密度-类似于计算机芯片，从而也习惯将微阵列称作“基因芯片”或者“生物芯片”。 [0004] 在微生物学中使用微阵列时，将来自通常经过加工和预处理的样品的生物分子供给到微阵列上，在此在各位置（“斑点”）上发生特定的结合反应，所述结合反应随后给出关于在样品中某种分子，例如DNA片段的存在的信息。该结合反应的前提在于DNA或者RNA以单链存在，从而事前的变性步骤是不可避免的。在一般先进的自动化中，存在大量方法，在设备单元内部进行尽可能多的分析单个步骤，以节省时间和成本。此外使用了微型泵，利用所述微型泵在设备单元内运输极少量的样品量，对此参见文献例如US 2004/0141856A1。 [0005] 另一方面，微阵列的探针上的实际结合过程或杂交可能需要数小时，因为颗粒的运动遵循布朗分子运动，并且因此仅缓慢进行。此外，仅仅一部分存在于样品中的目标分子由此到达各自的捕获器结构，也就是说探针。 发明内容[0006] 本发明的目的在于提供一种方法，即该方法包括：生物分子的变性，例如将以双链存在的核酸熔解为单链；以及将经变性的生物分子结合到微阵列的探针上，并且加速原本的杂交，而不对分析的灵敏度产生负面的损害。 [0007] 因而本发明的主题为用于在微阵列的至少一个探针上活性杂交的方法，所述方法包括以下几个步骤：a）准备具有反应成分的样品液体， b）将样品液体导入到具有泵区段中，所述泵区段具有：至少一个泵单元；至少一个温度受控的变性单元；和至少一个与变性单元在空间上分离的温度受控的、带有至少一个微阵列的反应区域， c）泵送所述样品液体， d）在所述变性单元中对所述样品液体的反应成分进行变性，并且 e）在所述反应区域中的微阵列的至少一个探针上杂交经变性的成分。 [0008] 在微阵列上的杂交一般通过在样品液体中生物分子的扩散运动来发生。所述扩散运动可以借助振摇或振动样品液体进行。对此，已知各种系统，例如Bio Micro Systems ®Inc. 的MauMixer。相对于此，按照本发明的方法提供了决定性的优点，即通过样品液体的泵运动支持所述扩散过程。通过泵送可以产生均匀的、受控的样品液体流，所述样品液体流使得在探针上保留有总是足够数量的待结合的粒子。因此，如在扩散控制的过程中总是存在的待结合的粒子的贫乏将被克服。具有微阵列的反应区域既可以由样品液体直接流入，又可以布置在反应室内。然而在任何情况下都必须确保在微阵列的一个或者多个探针上的均匀的、受控的流。此外，所述反应区域可以配备有多个微阵列，在所述微阵列上分别布置有一个或者多个探针。 [0009] 在实施方式之一中，将所述泵区段布置为循环回路，这附加地支持了微阵列的探针上的均匀的、受控的样品液体流。泵送速度如此设计，即样品以几毫米/分钟在反应区域中流动。这支持了在其他情况下受扩散限制的杂交反应。例如核酸在约54℃时进行杂交反应。 [0010] 其他积极的效果通过以下方式产生，即变性单元与反应区域在空间上分开，从而使得首先能够实施单链的变性。在核酸的情况下，将用于将双链熔解成单链的样品液体导引到更高温度（例如94℃）的范围内。核酸作为单链在样品中的存在是用于随后布置的反应区域中的微阵列（杂交）的探针上的紧接着的结合的前提。通过增加可支配的单链分子来改善在微阵列的斑点上的结合反应的速度以及灵敏度。在下述情况下情况如此：所述泵区段构造为圆形，并且将已经重新或者一直仍然以双链分子存在的核酸循环地输送给重新的变性和接下来的杂交。因此，尚未结合的分子能够在下一轮中结合到微阵列的探针上。 [0011] 在每种情况中，通过本方法会推迟生物分子的结合平衡，并且提高分析的敏感度，从而还能实现在样品量中的少量生物分子的检验。 [0012] 变性单元与反应区域空间上的分离使得能够对各自反应的优化条件进行调整。在此，尤其是针对各生物分子的最佳的温度的调整具有决定性的意义。例如选择至少90℃，优选94至98℃的温度范围用于核酸的变性。对于核酸的杂交反应而言，反应区域中的温度保持在例如54℃。重要的是，在任何情况下在所述变性单元和反应区域中能够分别进行温度调控。 [0013] 在另一种实施方式中，在变性单元的生物分子的变性和反应区域中的杂交之间设有冷却步骤，从而使得能够确保经过变性的生物分子以最佳的温度进入到反应区域中。可借助相应设计的冷却段进行冷却。 [0014] 对于变性单元和/或杂交单元的温度调节可使用不同的方法（例如电阻加热器，红外加热器，热风鼓风机和/或珀耳帖元件）。因为在反应区域中的杂交一般在较低的温度下进行，因此必须确保当来自泵区段的样品量流入到反应区域中时具有所期望的目标温度。因而所述反应区域具有可靠的温度调控，并且必要时可完全像变性单元一样调节温度。 [0015] 因为杂交反应与变性反应相比一般在较低的温度下进行，因而样品冷却到一定的杂交温度非常重要。在第一温度范围中，使所述生物分子变性并且分解或熔解。利用相对于第一温度范围的更低的第二温度范围，确保了微阵列的探针上的杂交，并且借助经过优化的温度调控进行监测。 [0016] 除了多组件系统形式的构造，所述方法尤其有利地作为芯片上的实验室系统得以实现，所述芯片上的实验室系统例如由特定的聚合体成型为基板基材。在此，通过不同的泵能够实现泵功能的转化。集成在芯片上的微型泵尤其适用于在本方法中的应用，例如微型膜片泵或者微型蠕动泵。作为外部驱动的泵，例如可以使用注射泵或者蠕动泵。例如在DE10 2008 002 336 A1中描述这类泵，并且属于现有技术。 [0017] 在另一种实施方式中，将所述变性单元和所述泵送单元成型为结构单元。在此通过可加热的泵进行温度控制。 [0018] 对此替代的是，所述变性单元作为回形通道存在，所述回形通道可以加热到用于变性所必要的温度。在这样的构造上，尤其是样品在循环回路内部充分的混合是有利的。通过与此相关的、改善的样品的均一性也改善了原本的杂交反应。所述回形通道优选具有微结构，从而也能够实现这些在芯片上的实验室系统中的组件。 [0019] 在另一种实施方式中，所述反应区域与第二泵区段连接，通过所述第二泵区段，能够将需要用于杂交的反应液体和/或清洗液体输送给反应区域。在一种特别的实施方式中，所述附加的泵区段具有用于将变性单元与杂交单元分开的阀。替代地，对于反应必要的物质也可以通过中央泵区段输送给所述方法。然而在任何情况下至少布置一个相应的流入口或者入口和一个相应的出口，通过所述入口和出口既可以输送或者说排出样品液体也可以输送或者说排出反应液体和/或清洗液体。 [0021] 根据本发明的方法的其他优点和有利的实施方案通过附图进行说明，并在接下来的描述中进行解释。在此要注意的是，所述附图仅具有描述性的特性，并且其意图并不在于将本发明限定在某种形式中。在附图中使用以下附图标记：1:泵单元 2:流体连接部 3:变性单元 4:反应区域 5:微阵列 6:入口 7:出口 8:基板基材。 [0022] 附图1和2说明了按照本发明的方法。这两个图分别示出：附图1（图1）是用于实施所述方法的装置的示意图，其包括以循环回路布置的、具有变性单元和反应区域的泵区段，所述变性单元构造为回形通道，所述反应区域包括微阵列。 [0023] 附图1（图2）是用于实施所述方法的装置的示意图，其中示出了作为芯片上的实验室系统的构造，其中所述以循环回路布置的泵区段包括泵单元、变性单元和反应区域。 具体实施方式[0024] 附图1示出了用于实现按照本发明的方法的可能的构造。反应区域4连同包含在其中的微阵列5通过流体连接部2与泵区段连接，在所述泵区段中样品液体借助泵单元1在环路中泵送，这通过在附图中心的说明流动方向的箭头表征。回形通道或者说曲折通道（Mäanderkanal）用作变性单元3。在此将所述样品液体加热到对于各生物分子优化的温度范围，从而使得其发生变性。随后在第二温度范围中，在反应区域4中的微阵列5的探针上进行原本的杂交反应。在泵单元1中必要时可以将所述样品液体调整到第三温度范围。 [0025] 附图2示出了用于实施按照本发明的方法的、作为芯片上的实验室系统的装置的示意图。所述系统包括基板基材8，在所述基板基材上布置有用于样品液体以及必要的试剂和清洗液体的入口6和出口7。通过流体连接部2利用泵单元1将样品引入到泵区段中。变性单元3在微型尺寸上成型为回形通道。所述变性单元连接到具有原本的微阵列5的反应区域4，其用于对变性的生物分子进行杂交。在芯片上的实验室系统中，所述泵单元1、变性单元3和反应区域4也受到各自的温度调控和/或温度调节。 |
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