진화 및 합리적 설계의 조합에 의해 수득된 １,２―프로판디올의 생산을 위한 신규한 미생물 {NEW MICRO-ORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF 1,2-PROPANEDIOL OBTAINED BY A COMBINATION OF EVOLUTION AND RATIONAL DESIGN}
본 발명은 1,2-프로판디올을 생산하는 미생물을 제조하기 위한 진화 및 합리적 설계를 조합한 신규한 방법, 그에 의해 수득되는 미생물, 및 1,2-프로판디올의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다. C3 디알콜인 1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜은 널리 사용되는 화학물질이다. 이는 불포화 폴리에스테르 수지, 액체 세제, 냉각제, 부동제 및 비행기용 제빙액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은 1993-1994년부터, 프로필렌 유도체보다 독성이 강한 것으로 알려져 있는 에틸렌 유도체의 대체물로서 점증적으로 사용되었다. 현재, 1,2-프로판디올은 다량의 물이 소모되는 프로필렌 옥시드 수화 공정을 이용한 화학적 방법에 의해 제조된다. 프로필렌 옥시드는 2가지 공정, 즉 에피클로르히드린을 이용한 공정 및 히드로퍼옥시드를 이용한 공정 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 두 경로 모두에서 독성이 높은 물질이 사용된다. 또한, 히드로퍼옥시드 경로는 tert-부탄올 및 1-페닐 에탄올과 같은 부산물을 생성한다. 프로필렌의 제조가 유익하기 위해서는 이들 부산물이 유용해야 한다. 일반적으로, 화학적 경로에서는 라세미 1,2-프로판디올이 생성되며, 두 입체이성질체, 즉 (R)1,2-프로판디올 및 (S)1,2-프로판디올은 각각, 특정 용도에 유익하다 (예를 들어, 특수 화학물질 및 의약품을 위한 키랄 출발 물질). 1,2-프로판디올의 화학적 제조 방법의 단점은 생물학적 합성법을 매력적인 대체법으로 만든다. 하기 2가지 경로는 당으로부터 미생물에 의해 1,2-프로판디올을 천연적으로 생산하는 것을 특징으로 한다. 제1 경로에서, 6-데옥시 당 (예를 들어, L-람노스 또는 L-푸코스)은 디히드록시아세톤 포스페이트 및 (S)-락트알데히드로 분해되고, 이는 추가로 (S)-1,2-프로판디올로 환원될 수 있다 (문헌 [Badia et al., 1985]). 이 경로는 이. 콜라이 ( E. coli )에서 실용적이지만, 데옥시헥소스의 상승된 비용으로 인해 경제적으로 가능한 공정을 달성할 수 없다. 제2 경로는, 당분해 (glycolysis) 경로 및 이어서 메틸글리옥살 경로를 통한 통상적인 당 (예를 들어, 글루코스 또는 크실로스)의 물질대사이다. 디히드록시아세톤 포스페이트는 메틸글리옥살로 전환되고, 이는 락트알데히드 또는 아세톨로 환원될 수 있다. 이후, 상기 두 화합물은 2차 환원 반응을 통해 1,2-프로판디올을 생성할 수 있다. 이러한 경로는 (R)-1,2-프로판디올의 천연 생산자, 예컨대 클로스트리듐 스페노이데스 ( Clostridium sphenoides ) 및 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰 ( Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum )에 의해 이용된다. 클로스트리듐 스페노이데스는 포스페이트 제한 조건 하에 1.58 g/L의 역가로 1,2-프로판디올을 생성하는 데 사용되었다 (문헌 [Tran Din and Gottschalk, 1985]). 또한, 1,2-프로판디올의 제조를 위해 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰이 연구되었다 (문헌 [Cameron and Cooney, 1986]; [Sanchez-Rivera et al., 1987]). 얻어진 최대 성과는 9 g/L의 역가 및 글루코스 1 g 당 0.2 g의 수율이었다. 그러나, 상기 유기체에 의해 얻어지는 성과의 개선은 이용가능한 유전자 도구의 부족으로 인해 제한되는 경향이 있다.
카메론(Cameron) 등 (1998)은 당을 1,2-프로판디올로 전환시키는 물질대사 조작을 위한 플랫폼(platform)으로서 이. 콜라이의 용도를 조사해왔다. 그들의 이론상 분석은 실제 생산 수율의 상한이 (성장을 위한 질량 균형 및 에너지 생산을 고려하였을때) 배양 조건에 따라 현저하게 상이함을 보여주었다. 혐기성 조건 하에서는, 환원된 보조인자를 재활용하기 위해 부산물로서 아세테이트가 생산될 것이고, 최대 수율은 글루코스 1 몰당 1,2-프로판디올 1 몰로 제한될 것이다 (0.42 g/g). 호기성 조건 하에서는, 최종 전자 수용체로서 산소를 이용하는 호흡 사슬에 의해 보조인자의 재활용이 보장될 것이고, 부산물의 생산없이 1,2-프로판디올을 생산하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 수율은 최대 1.42 몰/몰 (0.6 g/g)에 달할 수 있다. 1,2-프로판디올의 최대 역가를 고려하여, 카메론 등은 생성물과 부산물 독성에 대한 그의 의존 관계를 논의하였다. 1,2-프로판디올은 1,3-프로판디올에 비해 독성이 현저히 낮고, 이. 콜라이는 1,2-프로판디올 100 g/l로 0.5 h -1 의 잔여 성장 속도를 나타낸다. 성장이 억제되는 것은 성장을 매우 억제시키는 것으로 알려진 부산물 아세테이트로 인한 것으로 여겨진다. 1,2-프로판디올을 높은 역가 및 수율로 생산하기 위한 혐기성 공정의 개발에 있어서는 아세테이트 문제가 다루어져야 할 것이다. 아세테이트를 덜 억제성이고 동일계내에서 쉽게 제거되는 아세톤으로 전환시키는 것은 이미 제안되어 있다 (WO 2005/073364). 카메론 그룹 (카메론 등, 1998, 알타라스(Altaras)와 카메론, 1999, 알타라스와 카메론, 2000) 및 베네트 그룹 (후앙(Huang) 등, 1999, 베리오스-리베라(Berrios-Rivera) 등, 2003)은 단일 탄소 공급원을 사용하는 1,2-프로판디올 생산자를 얻기 위해 이. 콜라이의 유전자 변형에 대한 여러 연구를 수행하였다. 이들 연구는 한편으로는 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올의 경로에서의 하나 또는 수 개의 효소적 활성의 발현에, 그리고 다른 한편으로는 숙주 균주에서의 NADH 및 탄소 소모 경로의 제거에 의존한다. 카메론 그룹이 얻은 최상의 결과는 혐기성 플라스크 배양시 소모된 글루코스 1 g 당 0.2 g의 수율로 1,2-프로판디올 1.4 g/l가 생성된 것이다. 혐기성 유가식 (fed-batch) 발효기에 대해 외삽하여 추론할 경우, 카메론 등의 이론상 평가와는 다르게 글루코스로부터 0.19 g/g의 수율로 1,2-프로판디올 4.5 g/l가 생산되었다. 이러한 성과는 락테이트 데히드로게나제 (ldhA)를 코딩하는 유전자가 결여된 균주에서 이. 콜라이의 메틸글리옥살 신타제 유전자 (mgs), 이. 콜라이의 글리세롤 데히드로게나제 유전자 (gldA) 및 이. 콜라이의 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제 유전자 (fucO)의 과발현에 의해 얻어진다. 동일한 접근법으로 얻었지만 역가 및 수율이 낮은 결과가 또한 특허 US 6,087,140, US 6,303,352 및 WO 98/37204에 기술되어 있다. 베네트 그룹은 또한, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰( Clostridium acetobutylicum )으로부터의 mgs 유전자 및 이. 콜라이로부터의 gldA 유전자의 과발현을 위해 ldhA를 결여시킨 이. 콜라이 숙주 균주를 사용하였다. 혐기성 조건 하에서의 플라스크 배양으로 역가는 1.3 g/l 및 수율은 0.12 g/g이었고, 미호기성 배양으로 역가는 1.4 g/l 및 수율은 0.13 g/g이었다. 1,2-프로판디올을 생산하는 균주를 얻기 위한 대안적인 방법은 "최초 균주"를 더 나은 특성을 갖는 목적하는 화합물을 생산하는 "진화된 균주"의 상태로 진화시키는 것이다. 이 방법은 먼저 2종의 유전자, 즉 tpiA와, 메틸글리옥살을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 1종의 유전자의 감쇠에 의해 변형된 미생물의 자연 진화에 기초한다. 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 tpiA 유전자를 감쇠시키는 목적은 이 효소에 의해 정상적으로 상호전환되는 글리세르알데히드-3-포스페이트 (GA3P)와 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 시작되는 2 가지의 물질대사 가지(branch)를 분리시키기 위함이다. DHPA로부터 1,2-프로판디올까지의 경로는 환원된 보조인자 (NADH)를 소모하는 "환원 가지"일 것이나, GA3P로부터 아세테이트로의 물질대사는 NADH와 세포의 성장을 위한 에너지를 생산하는 "산화 가지"일 것이다. 기능성 tpiA 유전자가 없으면, 세포에서의 물질대사가 "잠기고", 균주의 성장, 1,2-프로판디올의 생산 및 아세테이트의 생산이 밀접하게 연결된다. 적절한 성장 배지에서의 선택 압력 하에서, 이러한 최초 균주는 그에 의한 1,2-프로판디올의 생산이 개선된 상태로 진화될 것이다. 1,2-프로판디올의 생산을 위한 미생물의 "진화된 균주"를 얻기 위한 이와 같은 절차가 특허출원 WO 2005/073364에 기재되어 있다. 이러한 진화 과정 및 후속 발효 단계는 혐기성 조건 하에서 우세하게 이루어진다. 이 기술은 종래 기술에 비해 분명 개선된 것이다. 1.8 g/l의 1,2-프로판디올 역가가 얻어졌으며, 소모된 글루코스 g 당 수율은 0.35 그램으로, 카메론 등의 이론상 결과에 근접하였다. 본 발명의 목적은 진화 및 그에 이어 진화된 균주의 합리적인 유전자 조작에 의해 1,2-프로판디올 생산자 균주를 개선시키는 것이다. 특별한 특징은 진화된 tpiA 마이너스 균주에서 기능성 tpiA 유전자를 재구축하는 것이다. 이러한 변형은 1,2-프로판디올의 생산을 개선시킨다. <발명의 간단한 설명> 본 발명은 진화 및 탄소 공급원으로부터 1,2-프로판디올을 생산하는 미생물 균주의 제조를 위한 합리적 설계를 조합한 신규한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 이하의 단계를 포함한다: - 최초 균주의 진화를 촉진시키기 위해, tpiA 유전자의 발현 및 메틸글리옥살을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 1종 이상의 유전자 (예컨대, gloA, aldA, aldB)의 발현을 감쇠시킨 최초 박테리아 균주를 적절한 성장 배지에서 선택 압력 하에 성장시키는 단계, - 1,2 프로판디올 생산율이 증가된 (20％ 이상 증가된) 진화된 균주를 선택 및 단리하는 단계, - 상기 진화된 균주에서 기능성 tpiA 유전자를 재구축하는 단계. 본 발명의 일 측면에서, 원치않는 부산물의 합성은 피루베이트로부터 락테이 트의 합성에 관여하는 효소 (ldhA), 포르메이트의 합성에 관여하는 효소 (pflA, pflB), 에탄올의 합성에 관여하는 효소 (adhE)를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것에 의해 감쇠시킨다. 본 발명의 다른 측면에서는, edd 또는 eda 유전자를 결실시키거나 또는 둘 다를 결실시켜 엔트너-두도로프 (Entner-Doudoroff) 경로를 제거한다. 유익하게는, 1,2-프로판디올의 생합성 경로에서 더 많은 NADH가 환원 단계에 이용되도록 arcA 및 ndh 중에서 선택된 1종 이상의 유전자를 감쇠시킨다. 1,2-프로판디올을 제조하는데 사용되는 미생물은 박테리아, 효모 및 진균 중에서 선택되지만, 주로 에셰리키아 콜라이 ( Escherichia coli ) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 종에서 선택된다. 본 발명은 또한 부산물없이 최상의 가능한 수율로 탄소 공급원의 1,2-프로판디올로의 전환을 최적화하기 위해 추가로 유전적으로 변형될 수 있는, 상기와 같이 얻어진 진화된 균주에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면에서는, 이용가능한 글리세르알데히드 3 포스페이트의 일부를 1,2-프로판디올을 합성하는 방향으로 재설정하기 위해 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나제 활성을 감소시킨다. 본 발명의 다른 측면에서는, galP에 의해 코딩된 것과 같은 포스포에놀피루베이트 (PEP)에 의존하지 않는 당 도입을 이용하거나 또는 당-포스포트랜스퍼라제 시스템에 더 많은 PEP를 제공함으로써 당 도입 효율을 증가시킨다. 이는 피루베이트 키나제 (pykA 및 pykF 유전자에 의해 코딩됨)와 같은 PEP를 소모하는 경로를 제거하고/하거나, 예를 들어 PEP 신타제를 코딩하는 ppsA 유전자를 과발현시키는 것에 의해 PEP의 합성을 촉진시킴으로써 얻어진다. 부가적으로, 피루베이트를 아세틸-CoA 로 전환시키는 효소를 혐기성 조건 하에서 발견되는 고농도의 NADH에 내성을 갖게 하는 것이 유익하다. 이는 lpd 유전자에서의 특정 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다. 유익하게는, 1종 이상의 ackA, pta, poxB 유전자를 감쇠시켜 부산물 아세테이트의 합성을 방지한다. 본 발명은 또한 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 성장시킨 상기의 진화된 그리고 임의로는 유전적으로 변형된 이. 콜라이 균주를 이용하여, 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에서 최적의 수율로 1,2-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 단일 또는 복합 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 성장시킨 상기의 진화된 그리고 임의로는 유전적으로 변형된 씨. 아세토부틸리쿰 균주를 이용하여, 혐기성 조건 하에서 최적의 수율로 1,2-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 후속하여 본 발명의 방법에 따라 생산된 1,2 프로판디올을 회수하고, 임의로 정제한다.
본 명세서에 포함되어 그 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명을 예시하며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명한다. 도 1은 탄수화물로부터의 1,2-프로판디올 생산 시스템 개발에 있어서 중추 물질대사의 유전자 조작을 도시한다.
본원에서 사용된 하기 용어는 청구의 범위 및 명세서의 해석을 위해 사용될 수 있다. 용어 "균주"는 종의 유전자 변이체를 의미한다. 즉, 용어 "미생물 균주"란 특정 미생물 종의 유전자 변이체를 의미한다. 임의의 균주에 대해 주어진 특성은 상응하는 미생물에도 또한 적용되며 그 역도 그러하다. 본 발명에 따르면, 용어 "배양", "성장" 및 "발효"는 상호 교환적으로 사용되며 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서의 박테리아의 성장을 의미한다. 본 발명에 따르면, 용어 "탄소 공급원"은 미생물의 정상적인 성장을 지원하기 위해 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하며, 6탄당, 5탄당, 단당류, 이당류, 올리고당류, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "적절한 성장 배지"는 미생물의 성장을 위해 개조되고 원하는 진화를 촉진하는 방식으로 설계된, 공지의 분자적 조성의 배지를 의미한다. 본 발명에 따른 진화 과정은 개선된 생산 특성을 나타내는 진화된 미생물의 제조를 위한 과정으로, 다음과 같은 단계를 포함한다: a) 최초 균주의 세포를 적절한 배지에서 성장시킬 경우 목적으로 하는 방향으로만 진화가 이루어지는, 물질대사가 "잠긴" 최초 균주를 얻기 위해 미생물을 변형시키는 단계, b) 최초 균주가 진화되도록 상기의 적절한 배지 상에서 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에 위와 같이 얻어진 최초 균주를 성장시키는 단계, c) 목적하는 화합물에 대한 개선된 생산 특성을 나타내는, 이들 특정한 조건 하에서 성장할 수 있는 "진화된 균주"를 선택하는 단계. 이러한 진화 과정은 동일한 출원인에 의해 2004년 2월 17일자로 출원된 특허 출원 WO 2004/076659 및 2005년 1월 12일자로 출원된 특허 출원 WO 2005/073364에 광범위하게 기재되어 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "선택"은 배양 배지에 보유되어 있는 미생물 균주만이 선택 압력 조건 하에서 더 나은 적응도를 나타내는 것인 과정을 의미한다. 전형적으로, 최적의 균주는 그들의 경쟁자들보다 더 빨리 성장하며 따라서 선택된다. 군집 중에서 미생물의 특정한 진화된 균주를 선택하는 간단한 방법은 군집을 연속 배양물 중에서 성장시키고, 여기서 느리게 성장하는 균주를 배양물로부터 최종적으로 용출시키는 것으로 이루어진다. 이것은 선택을 위한 유일한 예가 아니며, 당업자에게 공지되어 있는 다른 선택 방법도 적용할 수 있다. 용어 "단리"는 특정 유전적 변형을 나타내는 개별 균주를 상이한 유전적 특성을 나타내는 균주 군집으로부터 분리시키는 과정을 의미한다. 이는 진화기 이후의 생물량을 샘플링하고 그것을 페트리 디쉬에 스프레딩하여 단일의 콜로니를 단리함으로써 행한다. 용어 "1,2-프로판디올 생산율"은 g/l/h로 표현되는 생산율을 의미하며, 다음과 같이 계산한다: 배지에서 생산된 1,2-프로판디올의 농도 (g/l) / 이러한 생산에 필요한 시간 (시) 부가적으로, 생물량을 고려하여, g/g/h로 표현되는 특정 생산율을 다음과 같이 계산할 수 있다: 배지에서 생산된 1,2-프로판디올의 농도 (g/l) / 배지에서 생산된 생물량의 농도 (g/l) / 이러한 생산에 필요한 시간 (h) 생물량의 농도는 분광광도계 판독을 이용하여, 예를 들어 600 nm에서 발효액의 흡광도를 측정하거나, 또는 정해진 용량의 발효액을 건조시킨 후에 세포의 건조 중량을 측정하여 판단한다. 생산된 1,2-프로판디올의 양은 최신 프로토콜에 따라 컬럼을 개조한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정한다. 본 발명에서, 진화된 균주는 다음과 같은 특성에 대해 선택된다: 증가된 글루코스 섭취율 및 개선된 1,2 프로판디올 생산율. 이어서, 이와 같은 특성을 나타내는 균주를 단리하고, 유익하게는 최상의 생산자를 동정하는 방식으로 서로 비교하여 단리한다. g/l/h로 표현되는 글루코스 섭취율은 다음과 같이 계산한다: 배양으로 소모된 글루코스의 농도 (g/l) / 이러한 소모에 필요한 시간 (h) 상기한 바와 같이, 배지에서의 생물량의 농도를 고려하여 특정 글루코스 섭취율을 계산할 수 있다. 글루코스 섭취율과 1,2 프로판디올 생산율은 밀접한 관련이 있다. 글루코스의 소모가 증가되면, 글루코스 물질대사로부터 생성물의 생산이 같은 비율로 증가된다. 선택 및 단리 이후에, 최상의 진화된 균주는 최초 균주의 섭취에 비해 약 20％ 초과의 글루코스 섭취를 나타내고, 바람직하게는 약 30％ 초과, 보다 바람직하게는 50％ 초과의 글루코스 섭취를 나타낸다. 증가된 1,2 프로판디올 생산율은 최초 균주의 생산율에 비해 약 20％를 초과하며, 바람직하게는 약 30％ 초과, 보다 바람직하게는 약 50％를 초과한다. tpiA 유전자는 DHAP 및 GA3P의 상호전환을 촉매하는 "트리오스 포스페이트 이소머라제" 효소를 코딩한다 (도 1 참조). 이 유전자를 감쇠키는 목적은 진화가 최대 효율의 1,2-프로판디올 생산을 가능하게 하는 방향으로 이루어지도록 세포의 물질대사를 조작하기 위함이다. 본 발명에 따르면, 용어 "유전자 발현의 감쇠"는 유전자의 발현을 부분적으로 또는 완전히 억제하여 "감쇠시키는" 것을 의미한다. 이러한 발현의 억제는 유전자 발현의 저해, 유전자의 활성화 메카니즘의 억제, 유전자 발현을 위해 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부의 결실, 또는 유전자 코딩 영역의 결실일 수 있다. 바람직하게는, 유전자의 감쇠는 본질적으로 그 유전자의 완전한 결실로서, 유전자는 본 발명에 따른 균주의 동정, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선택 마커 유전자에 의해 대체될 수 있다. 유전자는 문헌 [Datsenko, KA & Wanner, BL (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645]에 기재되어 있는 상동 재조합 기술에 의해 바람직하게 불활성화된다. 그 밖의 방법들을 이하에 기술한다. 용어 "발현"은 유전자의 생성물인 상응하는 단백질을 산출시키는 유전자 서열의 전사 및 판독을 말한다. 용어 "진화된 균주에서의 기능성 tpiA 유전자의 재구축"이란 진화 과정 이후에 선택된 진화된 균주에 기능성 tpiA 유전자를 도입하여 이를 변형시키는 것을 의미하고; 이는 상동 재조합을 통해 감쇠된 유전자의 복제물을 야생형 기능성 복제물로 대체한 다음 최초 균주에서 측정되는 활성과 유사한 트리오스 포스페이트 이소머라제 활성을 복구시키거나, 또는 상이한 염색체좌에 기능성 tpiA 유전자를 도입하거나, 플라스미드에 기능성 tpiA 유전자를 도입하여 달성할 수 있다. 이와 같은 복구는 1,2-프로판디올의 생산을 위하여 트리오스 포스페이트 이소머라제의 작용을 통해 GA3P가 DHAP로 부분적으로 재활용되게 함으로써 글루코스로부터의 1,2-프로판디올의 생산 수율을 1 몰/몰 보다 더 크게 할 수 있다. 메틸글리옥살 (2-옥소 프로파날)을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 1종 이상의 유전자의 발현을 감쇠시키는 목적은 메틸글리옥살이 락테이트로 전환되는 것을 저해하여, 존재하는 메틸글리옥살이 세포 기관에 의해 1,2-프로판디올의 합성을 위해 본질적으로 사용되도록 하기 위함이다. 메틸글리옥살을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 유전자는 특히: - 글리옥살라제를 코딩하는 유전자, 예를 들어 메틸글리옥살로부터 락토일 글루타티온의 합성을 촉매하는 글리옥살라제 I을 코딩하는 gloA 유전자; - ((S) 락트알데히드로부터 (S) 락테이트의 합성을 촉매하는) 락트알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 aldA 및 aldB 유전자이다. 이들 유전자의 1종 이상의 발현을 최초 균주에서 유익하게 감쇠시킨다 (또는 유전자를 완전히 결실시킨다). 바람직하게는 gloA 유전자를 결실시킨다. NADH로서 환원 당량을 소모하여 1,2-프로판디올 생합성 경로와 경쟁하는 천연 글루코스 발효 루트를 억제하는 것으로 이루어진 부가적인 변형을 최초 균주에 유익하게 행한다. 특히, 피루베이트로부터 락테이트의 합성을 촉매하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 ldhA 유전자의 발현 및 아세틸-CoA로부터 에탄올의 합성을 촉매하는 알콜-알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 adhE 유전자의 발현을 감쇠시키는 것이 유익하다. 이와 유사하게, 미생물이 피루베이트 데히드로게나제 복합체를 이용하게 하여 피루베이트로부터 아세틸-CoA 및 NADH를 생산하게 하는 것이 가능하다. 이는 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 pflA 및 pflB 유전자의 발현을 감쇠시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 엔트너-두도로프 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 edd 및 eda 유전자 중 1종 이상을 감쇠시키는 것은 1,2-프로판디올 합성 경로를 우회할 수 있는 글루코스가 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트로 직접 물질대사되는 것을 방지하는데 또한 유용하다. 혐기성 또는 미호기성 조건 하에서, 전구체를 1,2-프로판디올로 환원시키는데 있어서 NADH의 이용률이 유익하게 증가된다. 이는 광역 조절자 ArcA (arcA 유전자에 의해 코딩됨)에 의해 매개되는 트리카르복실산 회로에 대한 억제를 완화시키는 것에 의해 얻어진다. 세포에서의 NADH 농도는 또한 ndh 유전자에 의해 코딩되는 NADH 데히드로게나제 II를 불활성화시키는 것에 의해 증가될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, arcA 및 ndh 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감쇠시킨다. 바람직하게는, 최초 균주를 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택한다. 보다 바람직하게는, 최초 균주를 엔테로박테리아세아 ( Enterobacteriaceae ), 바실라세아 ( Bacillaceae ), 클로스트리디아세아 ( Clostridiaceae ), 스트렙토마이세타세아 ( Streptomycetaceae ) 및 코리네박테리아세아 ( Corynebacteriaceae )로 이루어진 군으로부터 선택한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 최초 균주는 에셰리키아 콜라이 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰이다. 수득가능한 진화된 균주, 및 상기한 과정에 의해 얻어지는 것과 같은 진화된 균주 역시 본 발명의 대상이 된다. 이러한 진화된 균주에서, 특정 유전자의 발현을 변형시키는 것, 즉 유전자의 발현을 증가 또는 감쇠시키는 것이 유익하다. 이러한 변형은 1,2-프로판디올 생산 성능을 개선시킨다. 관심 유전자를 과발현시키기 위해, 당업자는 예를 들어 다음과 같은 상이한 방법들을 알고 있다: - 내생적 프로모터를 보다 강한 프로모터로 대체. - 상기 관심 유전자를 운반하는 발현 벡터를 미생물로 도입. - 관심 유전자의 추가 복제물을 염색체로 도입. 당업자는 DNA를 박테리아 균주으로 도입하기 위한 몇몇 기술들을 알고 있다. 바람직한 기술로 전기 천공법이 있고, 이는 당업자들에게 널리 알려져 있다. 유전자의 발현을 감쇠시키기 위한 상이한 방법들이 당업자에게 공지되어 있고, 이를 이하에 설명한다. 본 발명의 특정 실시양태에서는, 당분해의 말미에서의 유동량을 감소시키고, DHAP 및 최종적으로 1,2-프로판디올을 합성하는 방향으로 재설정하기 위해 (도 1 참조) 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH) 활성을 감쇠시킴으로써 진화된 균주를 변형시킨다. 이와 같이 감소된 활성은 특히 gapA 유전자의 발현의 감쇠를 통해 얻어질 수 있다. 용어 "효소의 활성의 감쇠"란 관심 효소의 활성이 임의의 변형 이전의 진화된 균주에서 관찰되는 활성에 비해 감소된 것을 말한다. 당업자는 이러한 결과를 얻기 위한 많은 방법들을 알고 있으며, 그 예는 다음과 같다: - 돌연변이를 유전자에 도입하여 이 유전자의 발현 수준 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킨다. - 유전자의 천연 프로모터를 낮은 강도의 프로모터로 대체하여 저수준의 발현을 일으킨다. - 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소를 사용한다. - 발현이 전혀 필요하지 않다면, 그 유전자를 결실시킨다. 유익하게는, 진화된 균주에서 당 도입 효율을 증가시킨다. GAPDH 반응에서 탄소 유동량이 50％를 초과하여 감소되도록 gapA 유전자의 발현을 강력하게 감쇠시키는 것은 도입되는 글루코스 1 몰당 1 몰 미만의 포스포에놀피루베이트 (PEP)가 합성되게 할 것이다. 통상적으로 세포에의 단일 당의 도입을 보장하는 당-포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)은 인산화 반응과 연결되어 글루코스-6-포스페이트를 제공한다. 이 반응에 필요한 인산염은 PEP가 피루베이트로 전환되는 것에 의해 제공된다. 따라서, 글리세르알데히드-3-포스페이트를 통한 유동량을 감소시켜 생산되는 PEP의 양을 줄이는 것은 당 도입을 감소시킨다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 당은 포스포에놀피루베이트 이용률에 의존하지 않는 당 도입 시스템에 의해 미생물에 도입될 수 있다. 인산화에 관여하지 않는 galP 유전자에 의해 코딩되는 갈락토스-양성자 공동수송체 (symporter)가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 도입된 글루코스는 glk 유전자에 의해 코딩되는 글루코스 키나제에 의해 인산화되어야 한다. 상기 경로를 촉진하기 위해서는, galP 및 glk로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다. 그 결과, PTS가 없어도 무방해지며 (dispensable), 이는 ptsH, ptsI 또는 crr로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감쇠시킴으로써 제거될 수 있다. 본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, PTS의 효율은 대사물질인 PEP의 이용률을 증가시킴으로써 증가된다. gapA 활성의 감쇠 및 피루베이트로의 하위 탄소 유동량의 감쇠로 인해 본 발명의 변형 균주에서의 PEP 양이 제한될 수 있으며, 이에 따라 세포로 수송되는 글루코스의 양이 감소된다. 미생물 균주에서 PEP의 이용률을 증가시키기 위해 이용될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. 특히, 한 방법은 PEP → 피루베이트 반응을 감쇠시키는 것이다. 우선적으로는, 피루베이트 키나제 효소를 코딩하는 pykA 및 pykF로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 상기 균주에서 감쇠시켜 상기 결과를 달성한다. PEP의 이용률을 증가시키기 위한 또다른 방법은 포스포에놀피루베이트 신타제 효소의 활성을 증가시킴으로써, 포스포에놀피루베이트 신타제가 촉매하는 피루베이트 → PEP 반응을 촉진하는 것이다. 상기 효소는 ppsA 유전자에 의해 코딩된다. 따라서, 우선적으로는 미생물에서, ppsA 유전자의 발현을 증가시킨다. 상기 두 변형은 미생물에서 동시에 존재할 수 있다. 특히 혐기성 또는 미호기성 조건 하에서, 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 피루베이트 데히드로게나제 복합체 (PDC)가 NADH에 의한 저해에 덜 민감한 것이 유익하다. 용어 "덜 민감한"이란 문헌 WO 2005/073364에서 이미 입증된 바와 같이, 변형되지 않은 효소의 민감성에 대해 상대적으로 정의된다. 특히, 그러한 특성은 효소의 단백질 서열에서 알라닌 55가 발린으로 대체되도록 (PDC의 리포아미드 데히드로게나제 서브유닛을 코딩하는) lpd 유전자에 특정 돌연변이를 도입하는 것에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 다른 특정 실시양태에서는, 부산물 아세테이트의 합성을 방지한다. 충분한 호기성 조건 하에서, 환원된 보조인자 NADH는 산소에 의한 호흡 사슬을 통해 최종 전자 수용체로서 NAD + 로 우세하게 산화된다. 따라서, 부산물 (예를 들어, 아세테이트)의 합성이 강제되지 않는다. 1,2-프로판디올의 생산을 최적화하기 위해서는 그러한 아세테이트 합성을 피하는 것이 바람직하다. 아세테이트의 생산을 방지하기 위해, 유익하게는 아세테이트 합성에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성을 감쇠시킨다. 바람직하게는, 모두 상이한 아세테이트 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들인 ackA, pta 및 poxB 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감쇠시킨다 (도 1 참조). 본 발명의 또다른 목적은 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 상기한 바와 같은 진화된 균주를 성장시킨 다음, 생산된 1,2-프로판디올을 회수함으로써 1,2-프로판디올을 제조하는 방법이다. 1,2-프로판디올의 생산은 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행된다. 본 발명에 따른 미생물용 배양 조건 (발효)은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 박테리아는 20 내지 55 ℃, 바람직하게는 25 내지 40 ℃의 온도, 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰 ( C. acetobutylicum )의 경우에 약 35 ℃, 이. 콜라이의 경우에 약 37 ℃에서 발효된다. 상기 공정은 뱃치 공정, 유가식 공정 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다. 진화된 균주는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에서 1,2-프로판디올을 생산하는데 사용될 수 있다. "호기성 조건 하에"란, 산소 기체를 액체 상에 용해시킴으로써 산소를 배양물에 공급하는 것을 의미한다. 이는 (1) 산소-함유 기체 (예를 들어, 공기)를 액체 상에 살포하거나, (2) 배양 배지를 함유하는 용기를 흔들어서 두부 공간에 함유된 산소를 액체 상에 전달함으로써 달성될 수 있다. 혐기성 조건이 아닌 호기성 조건 하에서의 발효의 이점은, 전자 수용체로서의 산소의 존재가 균주의 능력을 개선시켜 세포 과정을 위한 ATP 형태의 에너지가 더 많이 생성된다는 점이다. 따라서, 균주는 개선된 전체 물질대사를 갖게 된다. 미호기성 조건은 낮은 백분율의 산소 (예를 들어, 0.1 내지 10％의 산소 (질소에 의해 100％가 달성됨)를 함유하는 기체의 혼합물이 사용됨)가 액체 상에 용해된 배양 조건으로서 정의된다. 혐기성 조건은 배양 배지에 산소가 전혀 제공되지 않은 배양 조건으로서 정의된다. 극혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지에 살포하여 미량의 다른 기체를 제거함으로써 달성된다. 균주에 의한 ATP 생성을 개선하고 그의 물질대사를 개선하기 위해 니트레이트가 전자 수용체로서 사용될 수 있다. 1,2-프로판디올 생산을 위한 진화 과정 및 발효 과정 동안의 균주의 배양은, 1종 이상의 탄소 공급원을 함유하는, 사용되는 박테리아에 대해 개조된 공지된 설정 조성의 배양 배지를 이용하여 발효기 내에서 행한다. 특히, 이. 콜라이용 미네랄 성장 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]), 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270:88-96]에 정의된 것과 같은 배지, 특히 하기 기재된 최소 배양 배지 (MPG로 지칭됨)와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다: 배지의 pH는 수산화나트륨으로 7.4로 조정한다. * 미량 성분 용액 : 시트르산 4.37 g/L, MnSO 4 3 g/L, CaCl 2 1 g/L, CoCl 2 , 2H 2 O 0.1 g/L, ZnSO 4 , 7H 2 O 0.10 g/L, CuSO 4 , 5H 2 O 10 mg/L, H 3 BO 3 10 mg/L, Na 2 MoO 4 8.31 mg/L. 본 발명의 특정 실시양태에서는, 이. 콜라이의 진화된 균주를 이용하여 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 크실로스일 수 있는 단일 탄소 공급원을 함유하는 성장 배지 중에서 이 방법을 수행한다. 특히 바람직한 단일 탄소 공급원은 글루코스이다. 본 발명의 다른 특정 실시양태에서는, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 진화된 균주를 이용하여 단일 또는 복합 탄소 공급원을 함유하는 성장 배지 중에서 이 방법을 수행한다. 따라서, 씨. 아세토부틸리쿰용 성장 배지는 클로스트리디아 성장 배지 (CGM, 문헌 [Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54:2717-2722]), 또는 문헌 [Monot et al., Appl. Environm. Microbiol., 44:1318-1324] 또는 [Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 176:1443-1450]이 제공하는 미네랄 성장 배지와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다. 씨. 아세토부틸리쿰의 배양에 사용되는 탄소 공급원은 단일 또는 복합 탄소 공급원이다. 단일 탄소 공급원은 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 크실로스일 수 있다. 특히 바람직한 단일 탄소 공급원은 글루코스이다. 복합 탄소 공급원은 전분 또는 헤미셀룰로스일 수 있다. 특히 바람직한 복합 탄소 공급원은 전분이다. 바람직하게는, 회수된 1,2-프로판디올을 추가로 정제한다. 당업자는 생산된 1,2-프로판디올을 회수 및 정제하는 방법을 알고 있다. 이들 방법은 통상적인 공정들이다. 본 발명은 상기, 하기 및 실시예에서 이. 콜라이에 대해 기술하고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 최초 및 진화된 균주에서 감쇠, 결실 또는 과발현될 수 있는 유전자는 주로 이. 콜라이로부터의 유전자의 명칭을 사용하여 정의된다. 그러나, 이러한 정의는 본 발명에 따라 보다 일반적인 의미를 가지며, 다른 미생물에서의 상응하는 유전자를 포괄한다. 당업자는 이. 콜라이로부터의 유전자에 대한 진뱅크 (GenBank) 관리번호를 이용하여 이. 콜라이 이외의 다른 유기체에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 상동성 서열 및 그의 상동성 (％)의 확인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 이 웹사이트에 명시된 디폴트 파라미터와 함께 이용될 수 있는 BLAST 프로그램이 포함된다. 얻어진 서열은, 예를 들어 CLUSTALW 프로그램 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)을 상기 웹사이트에 명시된 디폴트 파라미터와 함께 이용하여 조사 (정렬)할 수 있다. PFAM 데이타베이스 (정렬된 서열 및 은닉 마르코프 모델에 대한 단백질 군 데이타베이스, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)는 정렬된 단백질 서열들의 거대한 모음집이다. 각 PFAM을 이용하여 다수의 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 보고, 유기체 사이의 분포를 평가하고, 다른 데이타베이스로의 접근을 획득하고, 공지된 단백질 구조를 가시화할 수 있다. COG (단백질의 병렬상동 (orthologous) 군의 클러스터, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는, 44개의 주요 계통발생학적 계통을 나타내는 66개 전장 서열 게놈으로부터 유래된 단백질 서열들을 비교함으로써 얻어진다. 각 COG는 3개 이상의 계통으로부터 정의되며, 이에 따라 선조 (ancient) 보존 도메인을 식별할 수 있다.
이하의 실시예에서는 1. 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh의 구축 2. 상기 최초 균주의 진화 3. 선택된 진화된 균주에서 tpiA 유전자의 재구축 4. gapA 유전자의 감쇠; pykA 및 pykF 유전자의 결실; ppsA 유전자의 과발현 5. ackA-pta, poxB 유전자의 결실 6. 몇몇 얻어진 균주에서 호기성 조건 하에서의 1,2-프로판디올 생산을 비교 7. 최상의 균주를 이용하여 유가식 배양물에서 1,2-프로판디올의 생산 을 보여준다. 실시예 1: 개선된 1,2-프로판디올 생산 방향으로 진화될 수 있는 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh의 구축: a) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::Km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd의 구축 프로토콜 1에 따라 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd::cm에서 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다 (WO2005073364 참조). 프로토콜 1 : 내성 카세트의 제거 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트를 다음과 같은 기술에 따라 제거하였다. 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용 하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드인 pCP20을 전기천공법에 의해 균주에 도입하였다. 42℃에서의 계대 배양 후, 하기 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 항생제 내성 카세트의 소실을 조사하였다. 균주 내에 앞서 형성된 변형의 존재를 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 조사하였다. 얻어진 균주를 이. 콜라이 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd로 명명하였다.
b) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd의 구축 카나마이신 내성 카세트를 제거하고 ldhA 유전자를 불활성화시키기 위해, 프로토콜 2에 따라 클로람페니콜 내성 카세트를 ldhA 유전자에 삽입하여 관련 유전자의 대부분을 결실시켰다. 프로토콜 2 : 재조합을 위한 PCR 생성물의 도입 및 재조합체의 선택 유전자 또는 유전자간 영역의 대체를 위해 선택된 올리고뉴클레오티드 (하기 표 2에 나타냄)를 사용하여 플라스미드 pKD3로부터의 클로람페니콜 내성 카세트 또는 플라스미드 pKD4로부터의 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다 (문헌 [Datsenko, KA & Wanner, BL (2000)]). 이후, 얻어진 PCR 생성물을, 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용자 균주에 전기천공법에 의해 도입하였다 (여기서, 발현된 시스템 λ 레드 (Red) (γ, β, exo)는 상동 재조합을 매우 촉진함). 이후, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 표 1에 나타낸 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입 여부를 조사하였다. 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주의 다른 변형을 조사하였다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 lpd * , ΔldhA::cm, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd로 명명하였다.
c) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 ΔarcA::km의 구축 arcA 유전자는, 이. 콜라이 균주 MG1655에서 프로토콜 2에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 ΔarcA::km으로 명명하였다. d) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA의 구축 파지 P1을 이용한 형질도입 기술을 이용하여, 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 arcA 유전자를 카나마이신 내성 카세트로 대체하여 arcA 유전자를 결실시켰다. 프로토콜 3 : 유전자의 결실을 위한, 파지 P1을 이용한 형질도입 파지 P1을 이용한 형질도입 기술에 의해, 수용자인 이. 콜라이 균주에서 선택된 유전자를 내성 카세트 (카나마이신 또는 클로람페니콜)로 대체하여 상기 유전자를 결실시켰다. 이 프로토콜은 두 단계, 즉 (i) 1개 유전자가 결실된 균주 MG1655 상에서 파지 용해물을 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 파지 용해물로 수용자 균주를 형질도입시키는 단계로 구성되었다. 파지 용해물의 제조 - 10 mL의 LB + Cm 30 ㎍/mL + 글루코스 0.2％ + CaCl 2 5 mM에 1개 유전자가 결실된 균주 MG1655의 철야 배양물 100 ㎕를 시딩하였다. - 37℃에서 30분간 진탕하면서 인큐베이션하였다. - 야생형 균주 MG1655 상에서 제조된 파지 용해물 P1 100 ㎕ (대략 1 × 10 9 개 파지/mL)를 첨가하였다. - 모든 세포가 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕시켰다. - 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 볼텍싱하였다. - 10분간 원심분리 (4500 g)하여 세포 파편을 제거하였다. - 상청액을 멸균 튜브에 옮기고, 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하였다. - 용해물을 4℃에서 저장하였다. 형질도입 - LB 배지 중의 이. 콜라이 수용자 균주의 철야 배양물 5 mL를 10분간 원심분리하였다 (1500 g). - 세포 펠렛을 2.5 mL의 10 mM MgSO 4 및 5 mM CaCl 2 에 현탁시켰다. - 대조군 튜브: 세포 100 ㎕ 1개의 유전자가 결실된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕ - 튜브 시험: 세포 100 ㎕ + 1개의 유전자가 결실된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕ - 30℃에서 30분간 진탕 없이 인큐베이션하였다. - 각 튜브에 1 M 나트륨 시트레이트 100 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱하였다. - 1 mL의 LB를 첨가하였다. - 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. - 튜브를 3분간 7000 rpm으로 원심분리한 후, LB + Cm 30 ㎍/mL 디쉬 상에 플레이팅하였다. - 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 표 1에 나타낸 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 결실 삽입 여부를 조사하였다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA::km으로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 수득된 균주를 이. 콜라이 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA로 명명하였다. e) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 Δndh::km의 구축 ndh 유전자는, 프로토콜 2에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Δndh::km으로 명명하였다. f) 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔplfAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh의 구축 상기한 바와 같이 프로토콜 3에 기재한 파지 P1을 이용한 형질도입 기술을 이용하여, 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔplfAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA에서 ndh 유전자를 카나마이신 내성 카세트로 대체하여 ndh 유전자를 결실시켰다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh::km으로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 1에 따라 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 수득된 균주를 이. 콜라이 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh로 명명하였다. 각 단계에서, 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주 내에 앞서 형성된 변형의 존재를 조사하였다. 실시예 2: 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd의 케모스타트 (chemostat) 배양물 중 미호기성 조건 하에서의 진화 및 진화의 생리적 특성: 개선된 1,2 프로판디올 생산 방향으로의 진화를 위해, 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd를 한편으로는 연속 배양물 중에서 혐기성 조건 하에, 다른 한편으로는 상기한 바와 같은 배양 배지 MPG 중에서 미호기성 조건 (1％ 산소) 하에, 과량의 글루코스를 이용하여 (초기에는 20 g/l에서 시작하여 글루코스가 고갈되면 첨가하여) 배양하였다. 온도는 37℃로 설정하였고, pH는 염기를 첨가하여 6.5로 조절하였다. 케모스타트 배양물 중에서의 균주의 진화에 이어, 수 주 (4주 내지 최대 6 개월)에 걸쳐 생성물인 1,2-프로판디올 및 부생성물인 아세테이트 농도의 증가와 함께 생물량의 농도가 증가되었다. 이는 균주 성능의 개선을 의미한다. 배양물이 이러한 조건 하에서 추가적인 농도의 증가없이 안정 상태에 이르렀을때, 진화가 완료되었다. 진화 이전 및 이후의 균주의 특성을 평가하였다. 개별 클론을 대표하는 단일의 콜로니를 페트리 디쉬 상에 단리해 내었다. 최초 균주를 대조군으로 하고, 이들 클론을 케모스타트 배양물에서 사용한 것과 동일한 MPG 배지를 사용하여 삼각 플라스크 검정법으로 평가하였다. 이들 클론 중에서, 수 개의 클론이 대조군에 비해 더 나은 1,2-프로판디올 특이적 생산율을 나타내었다. 그러한 클론은 다음과 같은 단계로 선택하였다. 진화의 각 조건에서의 최상의 클론에 대해 얻은 결과를 아래의 표 4 및 5에 보고하였다.
이들 클론은 효모 추출물을 함유하는 배양 배지에서 장기간 배양되었으므로, 최소 배지에서의 성장을 위해서는 개조될 필요가 있었다. 그 성능을 표 4 및 5에 나타낸 2종의 최상의 클론을 최소 배지 조건 하에서 성장 속도를 증가시키기 위해 최소 배지에서의 계대 배양에 의해 개조시키고, 그들의 성장 속도가 안정되면 그러한 개조를 멈추었다. 최종 배양물로부터의 클론을 단리하고 개조된 군집을 대표하는지를 조사하였다. 실시예 3: 선택된 이. 콜라이의 진화된 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서의 tpiA 유전자의 재구축: a) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 ΔtpiA::km의 구축 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로토콜 2에 기재된 기술에 따라 카나마이신 항생제 내성 카세트를 tpiA 유전자의 상류에 삽입하였다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 tpiA::km으로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 3에 기재한 파지 P1을 이용한 형질도입 기술을 이용하여 진화된 이. 콜라이 균주 MG1655 lpd * , ΔtpiA, ΔplfAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh에 tpiA 유전자를 재구축시켰다. 생성된 균주를 진화된 이. 콜라이 MG1655 lpd * , tpiArc::km, ΔplfAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔarcA, Δndh로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 2에 따라 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 수득된 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc"로 명명하였다. 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주 내에 앞서 형성된 변형의 존재를 조사하였다. 실시예 4: "진화된 이. 콜라이 tpiArc"의 변형: gapA 유전자의 감쇠; pykA 및 pykF 유전자의 결실; pJB137-PgapA-ppsA 벡터를 이용한 ppsA 유전자의 과발현 a) 천연 gapA 프로모터의 합성 단(short) Ptrc16 프로모터로의 대체: 225 pb의 상류 gapA 서열을 FRT-CmR-FRT 및 조작된 프로모터로 대체함으로써 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" 균주에서 천연 gapA 프로모터를 합성 단 Ptrc16 프로모터 (서열 52: gagctg ttgacg attaatcatccggctcg aataat gtgtggaa)로 대체하였다. 사용된 기술은 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용한 것으로 프토토콜 2에 기재되어 있다. 생성된 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA::cm으로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 얻어진 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA로 명명하였다. b) pykA 유전자의 결실 pykA 유전자는, 프로토콜 2에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA ΔpykA::km으로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 1에 따라 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 얻어진 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA ΔpykA로 명명하였다. c) pykF 유전자의 결실 pykF 유전자는, 프로토콜 2에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF::km으로 명명하였다. 이어서, 상기한 바와 같이 프로토콜 1에 따라 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 얻어진 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF로 명명하였다. d) 균주에의 발현 벡터 pJB137-PgapA-ppsA의 도입 포스포에놀피루베이트의 생산을 증가시키기 위해, gapA 프로모터를 이용한 pJB137 플라스미드로부터 ppsA 유전자를 발현시켰다. 플라스미드 pJB137-PgapA-ppsA의 구축을 위해, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA로부터 ppsA 유전자를 PCR로 증폭시켰다. 1. 65개의 염기로 이루어진 gapA-ppsAF (서열 53) ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC [상기 서열은 - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/의 기준 서열인, ppsA 유전자 (1785136 내지 1782758)의 서열 (1785106-1785136)에 상동인 영역 (대문자 부분), 및 - gapA 프로모터 (1860794 - 1860761)에 상동인 영역 (소문자 부분) 을 포함함] 2. 43개의 염기로 이루어진 ppsAR (서열 54) aatcgc aagctt GAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC [상기 서열은 - ppsA 유전자 (1785136 - 1782758)의 영역의 서열 (1782758 - 1782780)과 상동인 영역 (대문자 부분), 및 - HindIII 제한 부위 (밑줄친 부분) 을 포함함] 동시에, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 gapA 유전자의 gapA 프로모터 영역을 증폭시켰다. 1. 65개의 염기로 이루어진 gapA-ppsAR (서열 55) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg [상기 서열은 - ppsA 유전자 (1785136 - 1782758)의 서열 (1785106 - 1785136)과 상동인 영역 (대문자 부분), 및 - gapA 프로모터 (1860794 - 1860761)와 상동인 영역 (소문자 부분) 을 포함함] 2. 33개의 염기로 이루어진 gapAF (서열 56) ACGT CCCGGG caagcccaaaggaagagtgaggc [상기 서열은 - gapA 프로모터 (1860639 - 1860661)와 상동인 영역 (소문자 부분) - SmaI 제한 부위 (밑줄친 부분) 를 포함함] 이어서, 올리고뉴클레오티드 ppsAR 및 gapAF를 사용하여 두 단편을 융합시켰다 (문헌 [Horton et al. 1989 Gene 77:61-68]). PCR 증폭된 단편을 제한 효소인 HindIII 및 SmaI로 절단하고, 벡터 pJB137 (EMBL 기탁 번호: U75326)의 HindIII/SmaI 부위 내로 클로닝하여, 벡터 pJB137-PgapA-ppsA를 생성하였다. 재조합체 플라스미드를 DNA 서열분석으로 확인하였다. 플라스미드 pJB137-PgapA-ppsA를 균주 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF에 도입하였다. 얻어진 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc", Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, (pJB137-PgapA-ppsA)로 명명하였다. 각 단계에서, 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주 내에 앞서 형성된 변형의 존재를 조사하였다. 실시예 5: 부산물로서 아세테이트를 생산하지 않고 1,2-프로판디올을 생산할 수 있는 균주 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta, ΔpoxB (pJB137-PgapA-ppsA)의 구축 a) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 ΔackA-pta::cm의 구축 ackA 및 pta 유전자는, 프로토콜 2에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 ΔackA-pta::cm으로 명명하였다. b) 균주 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta의 구축 프로토콜 3에 기재한 파지 P1을 이용한 형질도입 기술을 이용하여 균주 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc1-gapA, ΔpykA, ΔpykF에서 ackA 및 pta 유전자를 결실시켰다. 생성된 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta::cm으로 명명하였다. 이어서, 상기한 바와 같이 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 얻어진 균주를 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta로 명명하였다. c) 변형 균주 "진화된 이. 콜라이 tpiArc" Ptrc1-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta, ΔpoxB (pJB137-PgapA-ppsA)의 구축 poxB 유전자는, 프로토콜 2에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주를 진화된 이. 콜라이 tpiArc Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta, ΔpoxB::cm으로 명명하였다. 이어서, 상기한 바와 같이 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 얻어진 균주를 진화된 이. 콜라이 tpiArc Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta, ΔpoxB로 명명하였다. 플라스미드 pJB137-PgapA-ppsA를 진화된 이. 콜라이 균주 tpiArc Ptrc1-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta, ΔpoxB에 도입하였다. 얻어진 균주를 진화된 이. 콜라이 tpiArc Ptrc16-gapA, ΔpykA, ΔpykF, ΔackA-pta, ΔpoxB (pJB137-PgapA-ppsA)로 명명하였다. 각 단계에서, 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주에 균주 내에 앞서 형성된 변형의 존재를 조사하였다. 실시예 6: 호기성 조건 하에서의 1,2-프로판디올 생산에 대한 상이한 진화된 균주의 비교 실시예 4에 기재한 바와 같이 얻은 균주 및 대조군 균주 (대조군 1: 혐기성 조건 하에서 진화된 MG1655 lpd * ΔtpiA ΔpflAB ΔadhE ΔldhA::Cm ΔgloA Δald, ΔaldB Δedd 및 대조군 2: 미호기성 조건 하에서 진화된 MG1655 lpd * ΔtpiA ΔpflAB ΔadhE ΔldhA::Cm ΔgloA Δald, ΔaldB Δedd)를 탄소 공급원으로서 글루코스를 함유하고 효모 추출물이 보충된 최소 배지에서 호기성 조건 하에 삼각 플라스크 검정법으로 배양하였다. 34℃에서 배양을 수행하였고, 배양 배지를 MOPS로 완충시킴으로써 pH를 유지시켰다. 배양이 끝났을 때, 발효액 중의 1,2-프로판디올, 아세톨 및 잔류 글루코스를 HPLC에 의해 분석하고, 글루코스로부터의 1,2-프로판디올 수율, 및 글루코스로부터의 1,2-프로판디올 + 아세톨 수율을 계산하였다. 이어서, 발효기 유가식 배양을 위한 최상의 균주를 선택하였다. 실시예 7: 최상의 균주를 이용한, 유가식 배양에서의 1,2-프로판디올의 생산 상기 실험에서 선택된 최상의 균주를 유가식 프로토콜을 이용하여 2 l 발효기에서 배양하였다. 배양 온도를 37℃로 일정하게 유지시키고, NH 4 OH 용액을 이용하여 pH를 6.5 내지 8의 값으로 영속적으로 조정하였다. 교반 속도는 뱃치 상(batch phase)일 동안에는 200 내지 300 rpm으로 유지시키고, 유가식 상(fed-batch phase)의 후반부에 최대 1000 rpm으로 증가시켰다. 용해된 산소의 농도는 기체 제어기를 이용하여 30 내지 40％ 포화 값으로 유지시켰다. 광학 밀도가 3 내지 5의 값에 이르면, 유가식 배양을 0.3 내지 0.5 ml/h의 처음 유속으로 시작하여, 최대 2.5 내지 3.5 ml/h의 유속값으로 점진적으로 증가시켰다. 이 시점에서의 유속을 24 내지 48시간 동안 일정하게 유지시켰다. 유가 배지는 글루코스를 300 내지 500 g/l의 농도로 함유하는 최소 배지에 기초하였다.
SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> New micro-organisms for the production of 1,2-propanediol obtained by a combination of evolution and rational design <130> D24916 <150> PCT/IB2007/001680 <151> 2007-03-23 <160> 56 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 ggtgatgata gttatcgccg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 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<213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 gccatcagca ggcttagcgc 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 19 cgacaattgg attcaccacg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 gcggtattga aaggttggtg c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 ccgtgagaag aatcgcgatc g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 gcgtagtcgt gtaagtatcg c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 23 catttccggt ggtgcgattg c 21 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 gccacagccg gaatcatact tggtttggg 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> 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