Cell surface display of proteins of interest, screening, and production |
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申请号 | JP2010500980 | 申请日 | 2008-03-26 | 公开(公告)号 | JP2010522561A | 公开(公告)日 | 2010-07-08 |
申请人 | コドン デバイシズ インコーポレイテッド; | 发明人 | ダーサ リポフシェク,; ジェームス エー. レイクストロー,; | ||||
摘要 | 本発明の局面は、人工ポリペプチドを細胞表面にディスプレイするための組成物および方法を提供する。 本発明の局面により、固定化ポリペプチドを分泌させ、1つまたは複数の関心対象の機能的または構造的な特性を有する1つまたは複数の変異体を同定することができる。 本発明の局面は、関心対象の機能的または構造的な特性を有する人工のタンパク質またはタンパク質変異体を産生するための組成物および方法を提供する。 本発明の局面は、人工タンパク質を宿主細胞上に発現させ、ディスプレイする方法を含む。 本発明の局面は、核酸コンストラクト、発現されたタンパク質、宿主細胞、および/または単離されたタンパク質を含む。 | ||||||
权利要求 | 人工タンパク質を宿主細胞にディスプレイするための方法であって、以下の工程を含む方法: 宿主細胞が第1の結合パートナーをその表面にディスプレイすることを特徴とし、 人工タンパク質が修飾モチーフを含み、人工タンパク質が発現する時に第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役されることを特徴とし、かつ 発現される人工タンパク質が宿主細胞から分泌され、第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、 第1の核酸を含む宿主細胞を第1の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下でインキュベートする工程。 各々の異なる人工タンパク質が異なる宿主細胞内の異なる第1の核酸にコードされることを特徴とする、複数の異なる人工タンパク質をディスプレイする工程をさらに含む、請求項1記載の方法。 異なる人工タンパク質が互いの配列変異体であることを特徴とする、請求項2記載の方法。 人工タンパク質が分泌ペプチドを含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。 宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする、請求項1記載の方法。 修飾モチーフがビオチン受容体ペプチドであることを特徴とする、請求項1記載の方法。 第1の結合パートナーが、細胞表面に付着したさらなる第2の結合パートナーとの相互作用を介してディスプレイされることを特徴とする、請求項1記載の方法。 第1の結合パートナーがアビジン様タンパク質であることを特徴とする、請求項1記載の方法。 第2の結合パートナーがビオチンであることを特徴とする、請求項1記載の方法。 第2の結合パートナーの修飾モチーフへの共役が共役酵素によって触媒されることを特徴とする、請求項1記載の方法。 共役酵素が第2の核酸にコードされていることを特徴とし、第2の核酸がベクターまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた組換え核酸であることを特徴とする、請求項10記載の方法。 共役酵素がビオチンリガーゼであることを特徴とする、請求項1記載の方法。 シャペロンタンパク質を宿主細胞内で発現させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。 人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、以下の工程を含む方法: 宿主細胞が第1の結合パートナーをその表面に含むことを特徴とし、かつ第1の結合パートナーに特異的に結合する第2の結合パートナーを含む細胞壁タンパク質に結合することによって第1の結合パートナーが細胞表面に付着することを特徴とする、第1の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下で第1の核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程、 第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して標的分子を宿主細胞の表面に固定化するのに十分な条件下で第2の結合パートナーをも含む宿主細胞を標的分子と接触させる工程、 人工タンパク質が標的分子に結合することを特徴とする、人工タンパク質の分泌をもたらす条件下で細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程。 人工タンパク質が、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片であることを特徴とする、請求項14記載の方法。 第2の結合パートナーが発現した人工タンパク質に共役されることを特徴とし、かつ 発現した人工タンパク質が分泌され、第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、 第1の結合パートナーを含む細胞表面を有する宿主細胞内で修飾モチーフを含む人工タンパク質を発現させる工程;および 細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の特性を評価する工程を含むタンパク質スクリーニング法。 評価する工程が、活性のレベルをアッセイする工程、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを決定する工程、人工タンパク質の特性を参照タンパク質の特性と比較する工程、細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の量を決定する工程、またはその任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項16記載の方法。 人工タンパク質が、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片で、評価されているタンパク質の機能がタンパク質の標的分子への結合親和性であることを特徴とし、標的分子が抗原および/またはエピトープを含むことを特徴とする、請求項16記載の方法。 宿主細胞が、ディスプレイされた人工タンパク質の第1の所定の特性に基づいて選択されることを特徴とする、請求項16記載の方法。 ディスプレイされた人工タンパク質の第2の所定の特性に基づいて宿主細胞を選択する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。 少なくとも所定のレベルの人工タンパク質をディスプレイする選択された宿主細胞から人工タンパク質を放出する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。 活性のレベルをアッセイする工程が、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかをアッセイする工程を含むことを特徴とする、請求項17記載の方法。 基質が表面に共役されることを特徴とする、請求項22記載の方法。 基質が、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることを特徴とする、請求項22記載の方法。 基質を処理する工程が、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことを特徴とする、請求項22記載の方法。 人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、以下の工程を含む方法: a)人工タンパク質が分泌され、かつ b)基質が宿主細胞表面に共役されることを特徴とする、 宿主細胞内での人工タンパク質の発現を誘導する工程、および 基質を処理する人工タンパク質によって生み出された検出可能なシグナルのレベルを測定する工程。 基質が、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることを特徴とする、請求項26記載の方法。 基質を処理する工程が、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、基質に分子をコンジュゲートする工程、基質にペプチドをコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことを特徴とする、請求項26記載の方法。 宿主細胞がその細胞表面に共役した第1の結合パートナーを有することができることを特徴とし、 人工タンパク質が修飾モチーフを含むことを特徴とし、かつそれが第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの相互作用結合を介して細胞表面にディスプレイされることができるように、人工タンパク質の発現が第2の結合パートナーの修飾モチーフへの共役および人工タンパク質の分泌をもたらすことを特徴とする、 人工タンパク質をコードする第1の核酸を含む宿主細胞。 宿主細胞が少なくとも10 4個の人工タンパク質をディスプレイすることを特徴とする、請求項29記載の宿主細胞。 請求項29記載の宿主細胞のライブラリー。 ライブラリーが少なくとも10 8個の異なるメンバーを有することを特徴とする、請求項31記載のライブラリー。 各々の核酸が人工タンパク質の異なる変異体をコードすることを特徴とし、かつ各々の変異体が結合パートナーを共役することができる同一の修飾モチーフを含むことを特徴とする、複数の核酸を含む、核酸のライブラリー。 修飾モチーフがビオチン化モチーフであることを特徴とする、請求項33記載のライブラリー。 ライブラリーが少なくとも10 8個の異なるメンバーを有することを特徴とする、請求項33記載のライブラリー。 それが所定の機能または所定のレベルの活性を有する場合に人工タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項17記載の方法。 |
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说明书全文 | 関連出願 本発明は、タンパク質スクリーニングならびにタンパク質スクリーニング用のライブラリーおよび構成要素の分野に属する。 本発明はまた、関心対象のタンパク質のディスプレイおよび産生に関する。 組換え核酸および合成核酸は、研究、工業、農業、および医学において多くの用途を有する。 組換え核酸および合成核酸を用いて、様々な医学的、工業的、または農業的目的のために使用し得る酵素、抗体、成長因子、レセプター、およびその他のポリペプチドを含む、大量のポリペプチドを発現および取得することができる。 ファージディスプレイを含む、所定の機能または特性を持つポリペプチドのスクリーニングのための方法が記載されている。 しかしながら、現在のスクリーニング法は、ライブラリーの大きさ、ポリペプチドの長さおよび複雑さ、ならびに利用可能な機能アッセイによって限定されている。 本発明の局面は、人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイするための組成物および方法に関する。 ある態様において、宿主細胞から分泌された時、修飾タンパク質が表面に固定化された結合パートナーに結合するようにタンパク質が修飾される結果をもたらす条件下で人工タンパク質を宿主細胞内で発現させる。 したがって、本発明の局面は、人工タンパク質が分泌されて、宿主細胞の表面に保持されるように人工タンパク質を宿主細胞核酸から発現するのに有用である。 それゆえ、本発明の態様は、多くの異なる変異体タンパク質およびポリペプチドを宿主細胞表面に発現し、ディスプレイし、タンパク質ディスプレイライブラリーを作製するのに有用である。 これらのタンパク質ディスプレイライブラリーを用いて、タンパク質の1つまたは複数の構造的および/または機能的な特性をスクリーニングすることができる。 ひとたび宿主細胞が所望の特徴または機能を持つ表面にディスプレイされたタンパク質を有することが同定されれば、そのタンパク質をコードする核酸を単離し、特徴付けることができる。 本発明の局面は、人工タンパク質を宿主細胞上に発現させ、ディスプレイする方法を含む。 本発明の局面は、核酸コンストラクト、発現されたタンパク質、宿主細胞、および/または単離されたタンパク質を含む。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を宿主細胞にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーをその表面にディスプレイすることを特徴とし、人工タンパク質が修飾モチーフを含み、人工タンパク質が発現された時に第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役することを特徴とし、発現された人工タンパク質が宿主細胞から分泌されて、第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、第1の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下で第1の核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本方法は、各々の異なる人工タンパク質が異なる宿主細胞内で異なる第1の核酸にコードされることを特徴とする、複数の異なる人工タンパク質をディスプレイする工程をさらに含む。 ある態様において、異なる人工タンパク質は互いの配列変異体である。 ある態様において、人工タンパク質は分泌ペプチドを含む。 ある態様において、宿主細胞は酵母細胞である。 ある態様において、修飾モチーフはビオチン受容体ペプチドである。 ある態様において、第1の結合パートナーは、細胞表面に付着したさらなる第2の結合パートナーとの相互作用を介してディスプレイされる。 ある態様において、第1の結合パートナーはアビジン様タンパク質である。 ある態様において、第2の結合パートナーはビオチンである。 ある態様において、第2の結合パートナーの修飾モチーフへの共役は共役酵素によって触媒される。 ある態様において、共役酵素は、第2の核酸がベクターまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた組換え核酸であることを特徴とする、第2の核酸にコードされる。 ある態様において、共役酵素はビオチンリガーゼである。 ある態様において、本方法は、シャペロンタンパク質を宿主細胞内で発現させる工程をさらに含む。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーをその表面に含むことを特徴とし、第1の結合パートナーに特異的に結合する第2の結合パートナーを含む細胞壁タンパク質に結合することによって第1の結合パートナーが細胞表面に付着することを特徴とする、第1の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下で第1の核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程、第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して宿主細胞の表面に標的分子を固定化するのに十分な条件下で第2の結合パートナーをも含む宿主細胞を標的分子と接触させる工程、人工タンパク質が標的分子に結合することを特徴とする、人工タンパク質の分泌をもたらす条件下で細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、人工タンパク質は、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片である。 ある態様において、本発明は、タンパク質をスクリーニングする方法であって、第2の結合パートナーが発現された人工タンパク質に共役することを特徴とし、発現された人工タンパク質が分泌され、第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、第1の結合パートナーを含む細胞表面を有する宿主細胞内で修飾モチーフを含む人工タンパク質を発現する工程;および細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の特性を評価する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、評価する工程は、活性のレベルをアッセイする工程、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを決定する工程、人工タンパク質の特性を参照タンパク質の特性と比較する工程、または細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の量を決定する工程を含む。 ある態様において、人工タンパク質は抗体であり、評価されている抗体の機能は抗体の標的分子への結合親和性であり、標的分子は抗原および/またはエピトープを含む。 ある態様において、宿主細胞は、ディスプレイされた人工タンパク質の第1の所定の特性に基づいて選択される。 ある態様において、本方法は、ディスプレイされた人工タンパク質の第2の所定の特性に基づいて宿主細胞を選択する工程をさらに含む。 ある態様において、本方法は、少なくとも所定のレベルの人工タンパク質をディスプレイする選択された宿主細胞から人工タンパク質を放出する工程をさらに含む。 ある態様において、活性のレベルをアッセイする工程は、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかをアッセイする工程を含む。 ある態様において、基質を表面に共役させる。 ある態様において、基質は、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物である。 ある態様において、基質を処理する工程は、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含む。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、a)人工タンパク質が分泌され、b)基質が宿主細胞表面に共役することを特徴とする、人工タンパク質の発現を宿主細胞内で誘導する工程、および基質を処理する人工タンパク質によって生成された検出可能なシグナルのレベルを測定する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、基質は、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物である。 ある態様において、基質を処理する工程は、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含む。 ある態様において、本発明は、宿主細胞がその細胞表面に共役した第1の結合パートナーを有することができることを特徴とし、人工タンパク質が修飾モチーフを含むことを特徴とし、それが第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの相互作用結合を介して細胞表面にディスプレイされることができるように、人工タンパク質の発現によって第2の結合パートナーの修飾モチーフへの共役および人工タンパク質の分泌がもたらされることを特徴とする、人工タンパク質をコードする第1の核酸を含む宿主細胞を提供する。 ある態様において、宿主細胞は、少なくとも10 2個の人工タンパク質をディスプレイする。 ある態様において、宿主細胞は、少なくとも10 3個の人工タンパク質をディスプレイする。 ある態様において、宿主細胞は、少なくとも10 4個の人工タンパク質をディスプレイする。 ある態様において、宿主細胞は、少なくとも10 5個の人工タンパク質、少なくとも10 6個の人工タンパク質、またはそれより多くをディスプレイする。 ある態様において、本発明は、本明細書に記載された宿主細胞のいずれかのライブラリーを提供する。 ある態様において、ライブラリーは、少なくとも10 8個の異なるメンバーを有する。 ある態様において、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも10 7個、少なくとも10 8個、少なくとも10 9個、少なくとも10 10個、または少なくとも10 11個のメンバーを有する。 ある態様において、本発明は、核酸のライブラリーであって、各々の核酸が人工タンパク質の異なる変異体をコードすることを特徴とし、各々の変異体が結合パートナーを共役することができる同一の修飾モチーフを含むことを特徴とする、複数の核酸を含むライブラリーを提供する。 ある態様において、修飾モチーフはビオチン化モチーフである。 ある態様において、ライブラリーは、少なくとも10 8個の異なるメンバーを有する。 ある態様において、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも10 7個、少なくとも10 8個、少なくとも10 9個、少なくとも10 10個、または少なくとも10 11個のメンバーを有する。 ある態様において、本発明は、所定の機能または所定のレベルの活性を持つ人工タンパク質を単離する方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を宿主細胞にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーをディスプレイすることを特徴とし、人工タンパク質が修飾モチーフを含み、人工タンパク質が発現された時に第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役することを特徴とし、発現された人工タンパク質が宿主細胞から分泌されて、第1の結合パートナーへの第2の結合パートナーの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、第1の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下で第1の核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、第1の結合パートナーはアビジン様タンパク質である。 ある態様において、第2の結合パートナーはビオチンである。 ある態様において、修飾モチーフはビオチン化ペプチドである。 ある態様において、第2の結合パートナーの共役は共役酵素によってなされる。 ある態様において、共役酵素はビオチンリガーゼである。 ある態様において、本方法は、シャペロンタンパク質を発現する工程をさらに含む。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とする、人工タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入する工程、第2の結合パートナーに付着した標的分子を細胞表面の第1の結合パートナーに共役し、それにより標的分子を細胞表面に固定化する工程、人工タンパク質が標的分子に結合することを特徴とする、人工タンパク質の分泌をもたらす条件下で細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、細胞壁タンパク質を介して第1の結合パートナーを細胞表面に付着させる。 ある態様において、人工タンパク質は抗体であり、標的分子は抗原である。 ある態様において、人工タンパク質はスキャフォールドタンパク質である。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第3の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とする、人工タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入する工程、第2の結合パートナーが細胞表面での第2の結合パートナーのディスプレイをもたらす第3の結合パートナーに結合することを特徴とする、第3の結合パートナーをディスプレイする宿主細胞に第2の結合パートナーを添加する工程、第2の結合パートナーが宿主細胞表面での標的分子のディスプレイをもたらす第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、第1の結合パートナーに付着した標的分子を第2の結合パートナーに添加する工程、人工タンパク質が標的分子に結合することを特徴とする、人工タンパク質の分泌をもたらす条件下で細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、タンパク質をスクリーニングする方法であって、第2の結合パートナーが発現された人工タンパク質に共役することを特徴とし、発現された人工タンパク質が分泌されて、第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、第1の結合パートナーを含む細胞表面を有する宿主細胞内で修飾モチーフを含む人工タンパク質を発現する工程;および細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の機能を評価する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、評価する工程は、活性のレベルをアッセイする工程、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを決定する工程、または人工タンパク質を参照タンパク質と比較する工程を含む。 ある態様において、活性のレベルをアッセイする工程は、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかをアッセイする工程を含む。 ある態様において、基質は、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物である。 ある態様において、基質を処理する工程は、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含む。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、a)人工タンパク質が分泌され、b)基質が宿主細胞表面に共役することを特徴とする、宿主細胞内での人工タンパク質の発現を誘導する工程、および基質を処理する人工タンパク質によって生成された検出可能なシグナルのレベルを測定する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、基質は、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物である。 ある態様において、基質を処理する工程は、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含む。 ある態様において、本発明は、宿主細胞がその細胞表面に共役した第1の結合パートナーを有することができることを特徴とし、人工タンパク質が修飾モチーフを含むことを特徴とし、それが第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの相互作用結合を介して細胞表面にディスプレイされることができるように、人工タンパク質の発現によって第2の結合パートナーの修飾モチーフへの共役および人工タンパク質の分泌が引き起こされることを特徴とする、人工タンパク質をコードする第1の核酸を含む宿主細胞を提供する。 ある態様において、宿主細胞は、少なくとも10 4個の人工タンパク質をディスプレイする。 ある態様において、本発明は、宿主細胞のライブラリーを提供する。 ある態様において、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも10 7個、少なくとも10 8個、少なくとも10 9個、少なくとも10 10個、または少なくとも10 11個のメンバーを有する。 ある態様において、本発明は、核酸のライブラリーであって、各々の核酸が人工タンパク質の異なる変異体をコードすることを特徴とし、各々の変異体が同一の修飾モチーフを含むことを特徴とする、複数の核酸を含むライブラリーを提供する。 ある態様において、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも10 7個、少なくとも10 8個、少なくとも10 9個、少なくとも10 10個、または少なくとも10 11個のメンバーを有する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、人工タンパク質が修飾モチーフを含むことを特徴とする、人工タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入する工程、第2の結合パートナーを修飾モチーフに共役するのに十分な条件下で人工タンパク質を発現する工程、人工タンパク質を宿主細胞表面に分泌する工程;および第2の結合パートナーを細胞表面の第1の結合パートナーに結合し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、第1の結合パートナーをその細胞表面でディスプレイする宿主細胞を作製する工程、第2の結合パートナーまたは第2の結合パートナーのインビボ共役を可能にする修飾モチーフをコードする配列を含む人工タンパク質をコードする核酸を導入する工程、および第1の結合パートナーが第2の結合パートナーに結合することを特徴とする、人工タンパク質を分泌するのに十分な条件下で宿主細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイする宿主細胞を作製する工程、第2の結合パートナーを含む人工タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを導入する工程、人工タンパク質を分泌するのに十分な条件下で宿主細胞をインキュベートする工程、および第2の結合パートナーを細胞表面の第1の結合パートナーに結合し、それによって人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とする、人工タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入する工程、標的分子を細胞表面の第1の結合パートナーに共役し、それにより標的分子を細胞表面に固定化する工程、人工タンパク質の分泌を誘導する工程;および人工タンパク質を標的分子に結合し、それにより、細胞表面に付着する第2の結合パートナーへの結合を通じて第1の結合パートナーが細胞表面に接続されることを特徴とする、人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質のライブラリーを作製するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに連結された独自のポリペプチドを含むことを特徴とし、固定化ペプチドが修飾モチーフを含むことを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、a)第2の結合パートナーを修飾モチーフに共役し;b)人工タンパク質を宿主細胞表面に分泌するのに十分な条件下で人工タンパク質を発現する工程、および第2の結合パートナーを細胞表面の第1の結合パートナーに結合し、それにより細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質のライブラリーを作製する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質のライブラリーを作製するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、各々のベクターが第2の結合パートナーに連結された独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、人工タンパク質を分泌するのに十分な条件下で人工タンパク質を発現する工程、および第2の結合パートナーを細胞表面の第1の結合パートナーに結合し、それにより細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質のライブラリーを作製する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、細胞表面の人工タンパク質のライブラリーを作製するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面でディスプレイすることを特徴とし、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とし、人工タンパク質が標的分子に対する親和性を有することを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、標的分子を細胞表面の第1の結合パートナーに共役し、それにより標的分子を細胞表面に固定化する工程、人工タンパク質の分泌を誘導する工程、および人工タンパク質を標的分子に結合し、それにより細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質のライブラリーを作製する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを評価するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面でディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面で提示する工程、および人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを評価する工程を含む、方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質の活性をアッセイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、および人工タンパク質の活性をアッセイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質のタンパク質複合体が所定の機能を有するかどうかを評価するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、2つまたはそれより多くの人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより、2つまたはそれより多くの人工タンパク質が相互作用して人工タンパク質のタンパク質複合体を形成することを特徴とする、人工タンパク質を宿主細胞表面でディスプレイする工程、および人工タンパク質のタンパク質複合体が所定の機能を有するかどうかを評価する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質のタンパク質複合体の活性をアッセイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、2つまたはそれより多くの人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより、2つまたはそれより多くの人工タンパク質が相互作用して人工タンパク質のタンパク質複合体を形成することを特徴とする、人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、および人工タンパク質のタンパク質複合体の活性をアッセイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合する、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程;および人工タンパク質が基質と相互作用する場合、人工タンパク質が基質を処理することができることを特徴とする、人工タンパク質を基質と接触させる工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質の活性をアッセイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程;人工タンパク質を基質と接触させる工程、および人工タンパク質の活性をアッセイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質のタンパク質複合体が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、2つまたはそれより多くの人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより、2つまたはそれより多くの人工タンパク質が相互作用して人工タンパク質のタンパク質複合体を形成することを特徴とする、人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、および人工タンパク質のタンパク質複合体が基質と相互作用する場合、人工タンパク質のタンパク質複合体が基質を処理することができることを特徴とする、人工タンパク質のタンパク質複合体を基質と接触させる工程を含む、方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質のタンパク質複合体の活性をアッセイするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、2つまたはそれより多くの人工タンパク質の宿主細胞での発現を誘導し、それにより、2つまたはそれより多くの人工タンパク質が相互作用して人工タンパク質のタンパク質複合体を形成することを特徴とする、人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、人工タンパク質のタンパク質複合体を基質と接触させる工程;および人工タンパク質のタンパク質複合体の活性をアッセイする工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導する工程、およびa)人工タンパク質が分泌され、かつb)基質が宿主細胞表面に共役することを特徴とする、基質を処理する人工タンパク質によって生成される検出可能なシグナルのレベルを測定する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、候補人工タンパク質をスクリーニングするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、および人工タンパク質が所定の機能を有する場合、人工タンパク質が候補人工タンパク質であると同定されることを特徴とする、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを決定する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、候補人工タンパク質をスクリーニングするための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、a)人工タンパク質が修飾モチーフを含み;b)第2の結合パートナーが修飾モチーフに共役し;c)人工タンパク質が分泌され;かつd)第2の結合パートナーが細胞表面の第1の結合パートナーに結合することを特徴とする、人工タンパク質の宿主細胞内での発現を誘導し、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、および人工タンパク質が基質と相互作用する場合、人工タンパク質が候補人工タンパク質であると同定されることを特徴とする、人工タンパク質を基質と接触させる工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、候補人工タンパク質をスクリーニングするための方法であって、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、a)人工タンパク質が分泌され、かつb)基質が宿主細胞表面に共役し、人工タンパク質が基質を処理する場合、検出可能なシグナルが発生し、かつ検出可能なシグナルが発生する場合、人工タンパク質が候補人工タンパク質であると同定されることを特徴とする、人工タンパク質の宿主細胞での発現を誘導する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、標的分子に対する所定の親和性を有する人工タンパク質を産生するための方法であって、宿主細胞が第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイすることを特徴とし、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する工程、標的分子を第1の結合パートナーに共役し、それにより標的分子を細胞表面に固定化する工程、人工タンパク質の分泌を誘導する工程、人工タンパク質を宿主細胞表面の標的分子に結合し、宿主細胞表面での人工タンパク質のライブラリーの作製をもたらす工程、標的分子に対する所定の親和性を有する関心対象の人工タンパク質を分泌する宿主細胞の亜集団を選択する工程、および宿主細胞の選択された亜集団から人工タンパク質を産生する工程を含む方法を提供する。 ある態様において、本発明は、各々の宿主細胞が独自の人工タンパク質の遺伝子をコードするベクターを含むことを特徴とし、宿主細胞が基質をも含むことを特徴とし、基質が宿主細胞表面に共役することを特徴とする、宿主細胞のライブラリーを提供する。 ある態様において、本発明は、各々の宿主細胞が独自の人工タンパク質を発現し、基質を含むことを特徴とし、基質が宿主細胞表面に共役することを特徴とする、宿主細胞のライブラリーを提供する。 ある態様において、本発明は、各々の宿主細胞が独自の人工タンパク質を発現することを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含むことを特徴とする、宿主細胞のライブラリーを提供する。 ある態様において、本発明は、各々の宿主細胞がその表面に人工タンパク質をディスプレイすることを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含むことを特徴とする、宿主細胞のライブラリーを提供する。 ある態様において、本発明は、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含むことを特徴とする、ベクターのライブラリーを提供する。 ある態様において、本発明は、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含むことを特徴とする、人工タンパク質のライブラリーを提供する。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドを、人工タンパク質のC末端またはN末端に連結させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドを人工タンパク質のN末端に連結させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質は分泌ペプチドを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質をコードする遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれ得るということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質は、治療的ポリペプチド、ポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、トポイソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝酵素、触媒酵素、治療的酵素、薬学的酵素、環境酵素、工業的酵素、薬学的ポリペプチド、環境ポリペプチド、工業的ポリペプチド、結合タンパク質、抗体、抗体断片、シグナル伝達分子、サイトカイン、またはレセプターを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質はポリメラーゼを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、ポリメラーゼはphi 29ポリメラーゼであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質はスキャフォールドタンパク質であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質はレポーター部分を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドは膜貫通ポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドはポリペプチド膜アンカーであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドはGPI連結ポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドは天然の表面ポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、天然の表面ポリペプチドはAga2であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第2の結合パートナーの共役は、インビボで共役酵素によってなされることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第2の結合パートナーの共役は、インビボで共役酵素によって触媒されることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、本方法は、共役酵素を発現する工程をさらに含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、共役酵素をベクターから発現させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、共役酵素をコードする遺伝子を細胞のゲノムに組み込むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、共役酵素はビオチンリガーゼであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、共役酵素はBirAであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、共役酵素はBpl1であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、修飾モチーフはビオチン化ペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、ビオチン化ペプチドはBirAによって認識される配列を有することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第2の結合パートナーはビオチンであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第2の結合パートナーは炭水化物結合ドメインであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、炭水化物結合ドメインはレクチンであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、レクチンはコンカナバリンAであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、レクチンはフィトヘマグルチニンであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、炭水化物結合ドメインは凝集タンパク質の糖結合ドメインであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、凝集タンパク質は、Flo1、Flo5、およびFlo11からなる群より選択されることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、炭水化物結合ドメインは炭水化物結合モジュールであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、炭水化物結合モジュールはセルロース結合ドメインであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、本方法は、第1の結合パートナーをコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入する工程、および第1の結合パートナーを宿主細胞表面に発現するのに十分な条件下で宿主細胞をインキュベートする工程をさらに含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーは、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーは、少なくとも1つのアビジンまたはアビジン様タンパク質の単量体を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーは融合タンパク質であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、融合タンパク質はアンカーリングモチーフを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、アンカーリングモチーフは、GPIアンカー、修飾されたGPIアンカー、α−アグルチニン、a−アグルチニン、凝集タンパク質、主要細胞壁タンパク質、CCW14、CIS3、CWP1、PIR1、およびPIR3からなる群より選択されることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、融合タンパク質は分泌ペプチドを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーを1本のポリペプチドとして発現させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーを、ビオチンスペーサーを介して細胞表面に接続することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、ビオチンスペーサーはPEG部分を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーはビオチンであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーはビオチン結合タンパク質またはその部分であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質および第1の結合パートナーを発現するための条件は異なることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質および第1の結合パートナーを発現するための条件は同じであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、条件は、宿主細胞の環境への薬剤の添加を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、条件は、宿主細胞の環境の温度の変化を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、条件は、宿主細胞の炭素源の変化を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、第1の結合パートナーを細胞表面に共有結合でコンジュゲートすることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、本方法は、シャペロンポリペプチドの発現をさらに含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は哺乳動物細胞であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は酵母細胞であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は出芽酵母(S. cerevisiae)であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は細菌細胞であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は大腸菌(E. coli)であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は、低下したレベルのプロテアーゼ活性を有する細胞であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、細胞は、シャペロンタンパク質を発現していることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質を細胞表面に共役することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質は、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、発現を誘導する前に基質を細胞に共役することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、発現が誘導された後に基質を細胞に共役することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質は宿主細胞表面に天然に存在しない部分であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、宿主細胞表面に天然に存在する部分に基質を共役させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、ポリペプチドのアミノ酸側鎖に基質を共役することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質はビオチンを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、結合部分へのビオチンの結合を介して基質を細胞表面に固定化することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質は核酸を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質は鋳型およびプライマーを含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質の処理は、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、閾値レベルは対照ポリペプチドのシグナルのレベルであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、本方法は、シグナルのレベルが閾値レベルを上回る場合、人工タンパク質が候補人工タンパク質であると同定されることを特徴とする、シグナルを生み出す基質と人工タンパク質を接触させる工程をさらに含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、対照ポリペプチドまたは対照タンパク質は、ランダムコイル構造を持つポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、対照ポリペプチドまたはタンパク質は、野生型ポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、対照ポリペプチドまたは対照タンパク質は、市販のポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質処理は、1つまたは複数のヌクレオチドをプライマーに付加する工程を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、基質処理は、蛍光部分を含む1つまたは複数のヌクレオチドをプライマーに付加する工程を含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、本方法は、検出可能なシグナルを対照タンパク質のシグナルと比較する工程をさらに含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、候補人工ポリペプチドを単離する行為は、閾値レベルを上回る検出可能なシグナルを同定することに基づくことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、検出可能なシグナルは人工タンパク質によって発生させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、検出可能なシグナルは基質を処理することによって発生させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、検出可能なシグナルは、人工タンパク質と基質処理の両方によって発生させることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、検出可能なシグナルは蛍光シグナルであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、候補人工ポリペプチドを単離する行為は、蛍光活性化細胞選別という行為を含むことができるということが理解されるべきである。 本発明は、本発明の態様のいずれかによって同定される候補人工タンパク質も含むということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質は抗体または抗体断片であることができ、標的分子は抗原であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質は抗原であることができ、標的分子は抗体または抗体断片であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質は抗原であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質は抗体または抗体断片であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、人工タンパク質はレセプターであることができ、標的分子はリガンドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも10 7個、少なくとも10 8個、少なくとも10 9個、少なくとも10 10個、または少なくとも10 11個のメンバーを有することができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、宿主細胞は、細胞当たり少なくとも10 4個の人工タンパク質をディスプレイすることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドはビオチン化ペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドは膜貫通ポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドはポリペプチド膜アンカーであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドはGPIポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、固定化ペプチドは天然の表面ポリペプチドであることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、レポーター部分は蛍光タンパク質であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、本方法は、検出可能な作用物質のレポーター部分への結合をさらに含むことができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、検出可能な作用物質は抗体であることができるということが理解されるべきである。 態様のいずれかにおいて、抗体は蛍光部分を含むことができるということが理解されるべきである。 各々の本発明の限定は、本発明の様々な態様を包括的に含むことができる。 それゆえ、いずれか1つの要素または要素の組み合わせを含む各々の本発明の限定を、本発明の各々の局面に含めることができるものと思われる。 本発明は、以下の説明で示されるかまたは図で例説されるコンストラクションの詳細および構成要素の配置へのその適用に限定されない。 本発明は、その他の態様が可能であり、様々な方法で実施することまたは実行することが可能である。 また、本明細書で用いられる用語および術語は、説明の目的のためのもであって、限定するものとみなされるべきではない。 「含む(including)」、「含む(comprising)」、または「有する(having)」、「含む(containing)」、「含む(involving)」、および本明細書におけるその変形の使用は、その後ろに列挙される項目およびその同等物だけでなく、追加の項目も包含するということを意味する。 本発明の局面は、1つまたは複数の細胞発現分子を細胞表面にディスプレイするための方法および組成物に関する。 ある態様において、分子(例えば、人工タンパク質)を細胞表面でのそれらの固定化(例えば、人工タンパク質の固定化)をもたらす条件下で宿主細胞内で発現させる。 本発明の局面は、1つまたは複数のタンパク質をそれらが合成される細胞に固定化し、それにより1つまたは複数のタンパク質の各々をそれらの遺伝子型と関連させるのに有用である。 ディスプレイされるタンパク質を任意の好適なアッセイまたは実験系を用いて調べ、タンパク質の1つまたは複数の特性または機能(例えば、結合特性、酵素活性、安定性など、またはその任意の組み合わせ)を評価してもよい。 好ましいアッセイは、望ましい場合に(例えば、タンパク質をコードした核酸を特徴付けることによって)評価されているタンパク質の遺伝子型を回復させることができるように宿主細胞の完全性を維持する。 ある態様において、関心対象の1つのタンパク質を本発明の組成物および方法を用いてディスプレイし、評価してもよい。 ある種の態様において、異なるタンパク質のライブラリーを評価してもよい。 各々の異なるタンパク質は、ライブラリーの異なる宿主細胞内の異なる核酸によってコードされてもよい。 異なるタンパク質は、新規のおよび/または向上した特性(例えば、増大した活性、増大した安定性、増大した結合親和性など、またはその任意の組み合わせ)を同定または選択するために評価されている変異体であってもよい。 ある態様において、変異体は、タンパク質の大部分に対して共通のアミノ酸配列を共有するが、構造的および/または機能的に重要であると考えられる領域におけるアミノ酸配列が異なる。 例えば、抗体変異体は、1つまたは複数の共通のフレームワーク配列を共有してもよいが、(例えば、異なるCDR配列を持つ)異なる可変配列を有する。 レセプターライブラリーには、それらのリガンド結合ドメインに異なるアミノ酸配列を持つレセプター変異体が含まれてもよい。 同様に、酵素ライブラリーには、それらの活性部位領域に異なる配列を持つ酵素変異体が含まれてもよい。 本発明の局面を用いて、大きい配列空間をサンプリングしかつ検証し得るように、多数の変異体をディスプレイし、評価してもよい。 ある態様において、各々の宿主細胞は、評価すべきタンパク質変異体のうちのたった1種類を発現し、ディスプレイする。 しかしながら、本発明の局面は、多くのコピーのタンパク質を細胞表面に発現し、ディスプレイするのに有用である可能性がある。 本発明のディスプレイ系の高い容量は、ディスプレイされたタンパク質を(例えば、高スループットアッセイで)効果的かつ効率的にアッセイするのに有用である。 ある種の態様において、1つの宿主細胞は、2個またはそれより多く(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多く)の(例えば、タンパク質のプールを評価するための)異なるタンパク質変異体を発現し、ディスプレイしてもよい。 本発明のその他の局面は、関心対象の分子を細胞内で産生するための方法および組成物に関する。 好ましい態様において、関心対象の分子は、タンパク質またはポリペプチドである。 本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換的に用いられる。 「人工タンパク質」という用語は、天然タンパク質および合成ポリペプチドならびに例えば、固定化ペプチド、レポーターペプチド、分泌ペプチドのような、付加的なポリペプチド要素に連結した合成ポリペプチドまたは天然タンパク質を含むタンパク質コンストラクトを包含する。 タンパク質は、アミノ酸で完全に構成されてもよいしまたはアミノ酸で完全に構成されなくてもよい。 その他の非アミノ酸構成成分を含むタンパク質の部類の例として、糖タンパク質、リポタンパク質、およびプロテオグリカンが含まれるが、これらに限定されない。 本発明の局面によって、人工タンパク質は、配列変異体、組換えプロモーター、転写制御エレメント、融合ペプチド、その他の修飾、またはその2つもしくはそれより多くの任意の組み合わせを含むように人工的に改変し得る組換え核酸にコードされかつ/または組換え核酸から発現される。 ある態様において、タンパク質は、タンパク質の固定化によって細胞表面にディスプレイされる。 本発明のある態様において、タンパク質は、膜であるかまたは表面に結合しているペプチドを介して細胞表面に固定化されてもよい。 ある種の態様において、固定化は、結合パートナー間の特異的相互作用を含んでもよい。 例えば、関心対象のタンパク質は、第1および第2の結合パートナー間の相互作用を通じて宿主細胞表面に付着する。 ある態様において、第1の結合パートナーは、宿主細胞表面で付着していてもよく、人工タンパク質は、第1の結合パートナーと特異的に(例えば、約10 −7 M、約10 −8 M、約10 −9 M、約10 −10 M、約10 −11 M、約10 −12 M、約10 −13 M、約10 −14 M、または約10 −15 Mという解離定数によって表される結合親和性で)相互作用する第2の結合パートナーを含んでもよい。 ある態様において、人工タンパク質は、共役酵素によって修飾され、第2の結合パートナーの修飾モチーフへの共役をもたらす修飾モチーフを含む。 ある態様において、第2の結合パートナーは、人工タンパク質と細胞内で共役する。 ある態様において、標的分子(例えば、標的タンパク質)が細胞表面に直接的に付着し、発現された人工タンパク質が標的タンパク質に結合し、それにより発現されたタンパク質をディスプレイする。 ある態様において、標的分子は宿主細胞に直接的には付着しないが、宿主細胞に付着する第1の結合パートナーに結合する第2の結合パートナーに付着する。 人工タンパク質および標的分子の組み合わせの非限定的な態様は、人工タンパク質が抗体でかつ標的分子が抗原であること、人工タンパク質が抗原でかつ標的分子が抗体であること、人工タンパク質がレセプターでかつ標的分子がリガンドであること、人工タンパク質が酵素でかつ標的分子が基質であることなど、またはその任意の組み合わせである。 ある態様において、宿主細胞を誘導して、人工タンパク質を発現させる。 ある態様において、誘導工程は必要なく、宿主細胞をインキュベートすることによって人工タンパク質の発現がもたらされる。 ある態様において、第2の結合パートナーを含む人工タンパク質が分泌され、第1の結合パートナーに結合し、それにより人工タンパク質を細胞表面にディスプレイする。 ある態様において、第1の結合パートナーはアビジンであり、第2の結合パートナーはビオチンである。 ある態様において、アビジンを共有結合で細胞表面に(例えば、直接的または間接的に)コンジュゲートする。 さらにある態様において、第1の結合パートナーを細胞に発現させ、宿主細胞表面でディスプレイする。 例えば、結合パートナーの1つを細胞壁または細胞膜融合タンパク質などの融合タンパク質として宿主細胞に発現させ、宿主細胞の表面でディスプレイしてもよい。 ある態様において、人工タンパク質をアミノ酸修飾によって固定化する。 しかしながら、本発明は、そのように限定されるわけではなく、任意の1つまたは複数のアミノ酸、アミノ酸側鎖、アミノ酸骨格、ならびにその重複および組み合わせによって人工タンパク質を固定化してもよい。 ある態様において、人工タンパク質を固定化ペプチドによって固定化する。 ある態様において、人工タンパク質を、互いに対する親和性を有する2つの結合パートナー、例えば、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ニュートラアビジン−ビオチンなど、またはその任意の組み合わせの間の相互作用を通じて細胞表面で固定化し、ディスプレイする。 本発明の1つの局面において、第1の結合パートナーおよび第2の結合パートナーと融合した人工タンパク質(例えば、インビボビオチン化タンパク質)は、宿主細胞に共発現され、分泌される。 その結果として、結合パートナーが細胞内または細胞表面で会合してもよい。 1つの態様において、2つの結合パートナーは細胞内で会合し、輸送され、細胞表面で複合体としてディスプレイされる。 本発明の別の局面において、第1の結合パートナーおよび第2の結合パートナーと融合した人工タンパク質は別々に分泌される。 2つの結合パートナーが別々に発現する場合、第2の結合パートナーに融合した人工タンパク質の大部分と結合するのに十分な量で第1の結合パートナーが発現するように第1の結合パートナーの発現を調節してもよいし、または分泌細胞の細胞表面でディスプレイされるには十分な量であるが、細胞集団内のその他の細胞に結合するには不十分な量で融合タンパク質が発現する(少なくとも検出可能なレベルでは発現しない)ように融合タンパク質の発現を調節する。 ある態様において、宿主細胞を、培地中での細胞発現産物の拡散の速度を落とす物質の存在下でインキュベートする。 液体培地の粘度を増大させることによって、宿主細胞に発現されるタンパク質が非分泌細胞よりも分泌細胞に捕捉される可能性の方がより高いと考えられるということを理解すべきである。 液体中のタンパク質の拡散の速度を落とすための方法は当技術分野において公知であり、例えば、PEG、ゼラチンなど、またはその任意の組み合わせを含む。 本発明の局面は、所定の関心対象の機能を有する1つまたは複数の分子を同定するのに有用である場合がある。 細胞に発現されたタンパク質をそれが発現される細胞の表面にディスプレイする系を提供することによって、細胞表面で行なう(例えば、細胞表面にディスプレイされている1つまたは複数の分子を検出するための細胞調製物上で行なう)ことができる任意のアッセイを用いて関心対象のタンパク質を発現する細胞を同定することができる。 本発明の局面を用いて、タンパク質変異体を発現するライブラリーをスクリーニングし、関心対象の1つまたは複数のタンパク質を同定することができる。 本明細書で使用される場合、「変異体」は、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な特性を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指してもよい。 ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が別の参照ポリペプチドと異なる。 通常、相違は、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に極めて類似し、多くの領域で、同一であるように限定される。 変異体および参照ポリペプチドは、アミノ酸配列が1つまたは複数の修飾(例えば、置換、付加、および/または欠失)だけ異なっていてもよい。 ポリペプチドの変異体は、保存的に修飾された変異体であってもよい。 置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸残基であってもよいし、または遺伝暗号によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、非天然のアミノ酸)であってもよい。 ポリペプチドの変異体は、アレル変異体などの天然に生じるものであってもよいし、またはそれは天然に生じることが知られていない変異体であってもよい。 本発明の局面は、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子型を同定するための最適化された方法を提供する。 関心対象のタンパク質を(例えば、直接的もしくは間接的に蛍光部分と共役した)レポーター部分を用いるかまたは機能アッセイによって同定することにより、関心対象のタンパク質を発現する細胞を容易に単離することができる。 本発明の局面は、細胞表面に発現したタンパク質の量によって関心対象のタンパク質を同定するための方法を提供する。 本発明の局面は、細胞表面にディスプレイすることができる多数のおよび/または高濃度の細胞発現分子により、広範囲のアッセイを細胞表面で行なうための機会を提供する。 関心対象のタンパク質を発現する細胞を、標的分子、抗原、リガンド、基質など、またはその任意の組み合わせに対するそれらの親和性に基づいて選択してもよい。 本発明の局面は、発現されたタンパク質およびそれらの基質または潜在的基質を細胞表面に同時に固定化するための方法を提供する。 関心対象のタンパク質を発現する細胞を、蛍光活性化細胞選別(FACS)、もしくは任意のその他の好適な細胞選別法、または任意のその他の高スループット細胞スクリーニング法および/もしくは単離法を用いて単離してもよい。 本発明の1つの局面は、標的分子(例えば、リガンドまたは抗原)に対する望ましい親和性または特異性を持つタンパク質をディスプレイし、高レベルの関心対象のタンパク質を分泌する宿主細胞を選択するための方法を提供する。 例示的な態様において、まず、インビボまたはインビトロでビオチン化された宿主細胞を、可溶性アビジンの存在下で、ビオチン化されたリガンドまたは抗原と共にインキュベートする。 リガンドまたは抗原に対する親和性を有する関心対象の人工タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる。 人工タンパク質の発現は、標的分子に対する親和性を有する人工タンパク質の細胞表面での固定化をもたらす。 標的分子に結合した関心対象のタンパク質を発現する細胞を、分泌タンパク質のレポーター部分に基づくかまたは関心対象のタンパク質に対する標識抗体を用いて検出することができる。 標的分子に対する望ましい親和性または選択性を有するタンパク質をディスプレイする宿主細胞または望ましいレベルの関心対象のタンパク質を発現する宿主細胞を、検出可能な標識の強度に基づいて選択することができる。 その後、選択された宿主細胞を、ビオチン化抗原の非存在下で、修飾モチーフを含む人工タンパク質の発現および分泌に好都合な条件下でインキュベートしてもよい。 好ましい態様において、修飾モチーフはビオチン受容体ペプチドであり、人工タンパク質はインビボでビオチン化される。 人工タンパク質の発現は、細胞表面のアビジン様タンパク質へのビオチン化タンパク質の結合を介したタンパク質の宿主細胞表面への固定化をもたらす。 高分泌型の宿主細胞が最初の選択過程の間に選択された場合には、その後、それらの細胞表面に関心対象のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を、標識された標的分子(例えば、エピトープタグ抗原またはリガンド)とインキュベートすることができるということを理解すべきである。 宿主細胞を、例えば、上で考察したような標的分子に対する親和性または特異性に基づいて、後でスクリーニングし、選択することができる。 さらに別の態様において、まず、標的分子に対する望ましい範囲の親和性または特異性を持つタンパク質のディスプレイについて最初の選択過程の間に宿主細胞を選択し、その後、人工タンパク質の発現レベルに基づいて宿主細胞をスクリーニングし、選択することができる。 発現レベルは、関心対象の人工タンパク質に関連した検出可能な標識(例えば、関心対象のタンパク質に対する標識抗体、または関心対象のタンパク質がエピトープタグと融合している場合には、検出可能な抗エピトープ抗体)の定量化によって決定することができる。 ある態様において、インビトロのタンパク質進化の第2の工程は選択である。 候補タンパク質を選択するために、変異体ライブラリー、または変異体ライブラリーの構成要素、およびライブラリーメンバーの所望の機能および特徴を評価しなければならない。 理想的な場合には、ライブラリーの各々の構成要素が評価に利用可能である。 タンパク質ライブラリーは、核酸ライブラリーによってコードされてもよく、したがって(例えば、細胞表面または細胞外の特性を調べるアッセイを用いて)特異的な表現型を評価するのに利用可能であるためには、核酸を発現させ、タンパク質を分泌および/またはディスプレイしなければならない。 インビトロのディスプレイ系では、タンパク質を発現および提示させ、それによりそれらを発現系の構成要素と連結することによって、それらを評価に利用可能にする。 インビボのディスプレイ系では、タンパク質を生物内で発現させ、その生物の表面にディスプレイする。 ある種のタンパク質ディスプレイ技術の概説については、Sergeevaら(2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58:1622−1654)を参照されたい。 核酸のライブラリーを複数の宿主細胞に導入し、各々の宿主細胞内でのライブラリーのメンバーの発現をもたらすことができる。 発現させるのに加えて、それらの機能または特徴を評価するためにタンパク質を提示させなければならない。 それらが宿主細胞から上清中に分泌された後にタンパク質を評価することができるが、それらが固定化される場合の方がタンパク質を評価するのがより簡単である。 さらに、固定化によって、関心対象のタンパク質を発現する宿主細胞を同定するのがより簡単になる。 タンパク質の発現およびディスプレイのための様々な技術が開発されている。 これらの系の例は、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、ファージディスプレイ、および細胞表面ディスプレイである。 これらのディスプレイは、ライブラリーメンバーによって産生されたポリペプチドをその対応する遺伝子型と物理的に連結する能力に基づく。 本発明の局面はさらに、ライブラリーメンバーによって産生されたポリペプチドをその対応する遺伝子型と連結するための方法および組成物に関する。 ある態様において、人工タンパク質はリーダーペプチドをさらに含む。 本明細書で使用される場合、リーダーペプチドまたは分泌ペプチドまたは分泌リーダーペプチドという用語は、合成された融合タンパク質を翻訳部位から離れる方向に導く任意のシグナル伝達配列を指し、融合タンパク質が細胞膜を越えて分泌されるのをもたらすと考えられるシグナル伝達配列を含む。 リーダーペプチドまたは分泌ペプチドは、タンパク質が分泌経路に沿って細胞内区画の内腔に輸送されるのと同時にかまたは輸送された直後にタンパク質分解によって成熟タンパク質から取り除かれてもよい。 リーダーペプチドは、天然の配列であるかまたは合成の配列であってもよい。 ある態様において、リーダーペプチドは修飾モチーフを含む。 本発明は、任意の配列順序の関心対象のタンパク質、固定化ペプチド、およびリーダーペプチドを包含するということ、ならびにこれらの要素はスペーサー配列によって分離され得るということ、例えば、人工タンパク質は、リーダー配列 − 関心対象のタンパク質 − スペーサー − 固定化ペプチド、または関心対象のタンパク質 − リーダー配列 − 固定化ペプチドによって特徴付けられることができるということが理解されるべきである。 しかしながら、本発明は、この点において限定されるものではないので、その他の配列順序が用いられてもよい。 本発明のある局面において、人工タンパク質を、細胞表面の標的分子との相互作用を通じて固定化してもよい。 本発明の目的のために、標的分子という用語は、抗体、抗体断片、もしくは抗体様ポリペプチド、レセプター、抗原、酵素など、またはその任意の組み合わせなどのタンパク質に結合特異性を伴って結合する分子を指す。 標的分子は、例えば、抗原、エピトープ、リガンド、基質など、またはその任意の組み合わせであることができる。 「標的分子」という用語は、酵素基質などの基質または結合を評価されている分子(例えば、リガンド、エピトープ、抗原、ホモもしくはヘテロの二量体パートナーなどの多量体化パートナーなど、もしくはその任意の組み合わせ)を指すために用いることができるということが理解されるべきである。 したがって、本明細書における「標的分子」に関する一般的説明は、基質および/または結合分子に関する態様に適用されてもよい。 ある態様において、標的分子は細胞表面に直接的に付着する。 ある態様において、発現された人工タンパク質は標的分子に結合し、それにより人工タンパク質を細胞表面にディスプレイする。 しかしながら、標的分子が基質であるある態様において、人工タンパク質は、宿主細胞の表面に固定化されるかまたはディスプレイされるのに十分な親和性で結合しなくてもよい。 これらの態様において、酵素反応は細胞表面で人工タンパク質によって触媒されてもよい。 ある態様において、産物(例えば、検出可能な産物)は細胞表面に固定化されてもよい。 ある態様において、産物(例えば、検出可能な産物)は細胞表面から放出されてもよい。 ある態様において、第1の結合パートナーをその表面でディスプレイする細胞は、第2の結合パートナーに結合した可溶性の標的分子に結合し、それにより標的分子をその表面に固体化する。 第2の結合パートナーに連結した標的分子または基質分子は、第2の結合パートナーの細胞表面に付着した好適な第1の結合パートナーへの結合を通じて宿主細胞表面に固定化され得るということを理解すべきである。 例えば、基質は、ビオチンを含んでもよく(例えば、ビオチンに連結してもよく)、第1の結合パートナーとして働く、例えば、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、もしくは任意のその他の好適な結合部分、またはその任意の組み合わせとのその相互作用を通じて宿主細胞表面に固定化されてもよい。 第1の結合パートナーを直接的または間接的に宿主細胞表面にディスプレイし、付着させ、共役してもよい。 例えば、アビジンまたはアビジン様タンパク質は、第1の結合パートナーであってもよく、本明細書に記載された様々な方法で細胞表面に連結されてもよい。 例えば、ビオチンを細胞表面と化学的に共役してもよく、かつ可溶性のアビジンもしくはアビジン様タンパク質を細胞外から添加してもよいし、またはビオチンを好適なリンカーを介して細胞表面に化学的に付着させてもよく、かつ可溶性のアビジンもしくはアビジン様タンパク質を細胞外から添加してもよいし、または細胞表面タンパク質(例えば、細胞壁タンパク質もしくは細胞膜タンパク質)を(例えば、インビボのビオチン化によって)ビオチン化タンパク質として発現させてもよく、かつアビジンもしくはアビジン様タンパク質を細胞外から添加してもよい。 あるいは、例えば、アビジンを含む細胞表面融合タンパク質を発現させてもよいし、またはアビジンを細胞壁にコンジュゲートしてもよく、かつ可溶性ビオチンを添加してもよい。 本発明は任意の第1の結合パートナーおよび/または第2の結合パートナーを包含するということが理解されるべきである。 本明細書で使用される場合、結合パートナーは、本発明の局面に好適な条件下でタンパク質またはその他の分子を細胞表面に固定化するのに十分な親和性で互いに結合する分子を指す。 多くの例がビオチンおよびアビジンの文脈で記載されているが、任意の好適な結合パートナーが使用され得るということが理解されるべきである。 例えば、環状ペプチドモチーフは、ニュートラアビジンおよびアビジンに結合することが示されている(Meyer et al., 2006, Chem. Biol. Drug Des. 68:3−10; Gaj et al., 2007, Protein Expr. Pur. 56(1):54−61)。 別の例示的な態様において、第1の結合パートナーは、DXaAXbPXc(ここで、XaはRまたはLであり、XbはSまたはTであり、かつXcはYまたはWである)を含む6残基の環状ペプチドであり、第2の結合パートナーは、アビジン、ニュートラアビジン、または任意のその他の好適な結合部分である。 しかしながら、ある態様において、第1の結合パートナーおよび第2の結合パートナーの内容を本明細書に記載されたように交換してもよい。 ある態様において、人工タンパク質は、細胞壁に直接的に結合することができる融合タンパク質である。 ある態様において、融合タンパク質は、細胞表面タンパク質である。 ある態様において、人工タンパク質は、細胞表面に直接的に結合することによって細胞表面に発現され、ディスプレイされる。 ある態様において、細胞表面タンパク質が細胞表面に結合するので、人工タンパク質が細胞表面にディスプレイされる。 別の局面において、本発明は、第2の結合パートナーと共役した細胞表面タンパク質を発現させ、第1の結合パートナーを第2の結合パートナーに結合させることによって、第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイするための方法を提供する。 ベクターは、細胞の維持または人工タンパク質の発現のための様々な調節エレメントを含んでもよい。 調節エレメントは、プロモーターおよびベクターを取り込んだ細胞の陽性同定を可能にするマーカーを含む。 調節エレメントは種特異的であってもよい。 調節エレメントは当技術分野において公知であり、本発明は、人工タンパク質を発現させるのに必要とされるかまたは所望される任意の1つの調節エレメントまたは調節エレメントの組み合わせを包含する。 本発明の1つの局面において、抗体または抗体断片を、N末端からC末端にかけて:リーダーペプチド(例えば、分泌シグナル)、鎖の第1の鎖または断片および鎖の第2の鎖または断片(例えば、V LおよびV H ;V L −C LおよびV H −C H )を含む融合タンパク質として発現させる。 真核細胞では、リーダーペプチドは、融合タンパク質を、小胞体からゴルジ装置、ゴルジ装置から細胞膜へと導く。 ある例示的な態様において、重鎖および軽鎖のVドメインを、柔軟性のあるリンカー(例えば、[Gly 4 −Ser] 3リンカー)でつながれた同じポリペプチド上に発現させて、単鎖FV断片(scFv)を形成させることができる(例えば、McCafferty et al., Nature, 1990, 348:552−554を参照されたい)。 ある態様において、スキャフォールドタンパク質は、ヒトのビタミンD結合タンパク質または修飾型のビタミンD結合タンパク質である。 ビタミンD結合タンパク質の利点の幾つかは、(1)タンパク質が非免疫原性であることを示唆するヒト血漿中のその高い濃度(0.5 mg/l);(2)血漿中での長い滞留をもたらす高い分子量(52kD)および低いpI(5.0)のその組み合わせ;(3)高い熱力学的安定性を与える広範囲に及ぶジスルフィド交差結合;(4)その他のタンパク質結合パートナーを受け取るように修飾することができる、天然のアクチン結合部位の存在;ならびに(5)その他の小分子結合パートナーを受け取るように修飾することができる天然のビタミンD結合部位の存在である。 ビタミンD結合タンパク質の結合部位を人工的に改変して、様々な標的分子に結合することができるタンパク質変異体のライブラリーを作製することができる。 別の態様において、非抗体性スキャフォールドタンパク質は、Cu、Znスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)またはその修飾型である。 SODタンパク質は、細胞をスカベンジングスーパーオキシドラジカルから保護する必須酵素である。 ヒト型のタンパク質(HSOD)は、ベータ−バレルフォールドを取り、ホモ二量体を形成する。 2つの遊離のシステイン残基C6AおよびC111Sにおける突然変異は、熱安定型のタンパク質(HSOD−AS)を生じる。 HSOD−AS変異体は、野生型のフォールディングおよび活性を保持する。 HSODタンパク質およびHSOD−AS変異体の利点として、高い安定性、比較的小さいサイズ(154アミノ酸の単量体)、およびヒト起源が含まれる。 ある態様において、酵素活性を、1つまたは複数の活性部位触媒残基の突然変異によって取り除く。 ある態様において、設計されたスキャフォールドはホモ二量体として働き、ある態様において、設計されたスキャフォールドは安定な単量体として再設計される。 変異体のライブラリーを作製し、特異的な標的または基質への結合についてスクリーニングすることができる。 例えば、アミノ酸配列を、ベータシートエレメントを接続しているループ(例えば、ループ23−28;63−82、102−114、11−14;37−40;90−93;120−123;および141−144)の内部で変化させることができる。 ある態様において、スキャフォールドタンパク質はヒト血清アルブミンまたは修飾型のヒト血清アルブミンである。 ある態様において、人工タンパク質をインビボで発現させる。 本発明の人工タンパク質を、任意の宿主細胞で発現させることができ、本発明は、細菌細胞、酵母細胞(例えば、サッカロミセス種および/またはピキア種)、昆虫細胞、ゼノパス細胞、ならびに哺乳動物細胞を含む、任意の原核細胞または真核細胞を包含する。 本発明の融合タンパク質の発現に特に適している細胞は、大腸菌、出芽酵母、CHO細胞、および293T細胞である。 細胞は「野生型」細胞であってもよいし、または細胞はタンパク質発現を助け得る特定の特徴もしくは特定の酵素機能が最適化されていてもよい。 これらの細胞には、核酸を取り込んで維持する最適化された性能を有する細胞、増大したタンパク質合成性能を有する細胞、および/または増大したタンパク質分泌性能を有する細胞が含まれる。 増大したDNA修復能力、低下した組換え能力、増大したタンパク質フォールディング能力、および/または低下したタンパク質分解(例えば、プロテアーゼ)能力を持つ細胞を含む、核酸および合成されたタンパク質の完全性を維持することができる細胞を特に包含する。 ある態様において、関心対象の発現されたタンパク質が分解されないように1つまたは複数のプロテアーゼ欠損を有するように細胞を選択するかまたは人工的に改変してもよい(例えば、細胞は1つもしくは複数のプロテアーゼ酵素を欠き、かつ/またはそれらは1つもしくは複数のプロテアーゼ標的化タンパク質を欠く)。 ある局面において、細菌または酵母ディスプレイ用の細胞を用いてもよい。 ある態様において、細胞ディスプレイ系は、細胞にDNAライブラリーをトランスフェクトすることおよびポリペプチドまたはタンパク質をコードするライブラリーを細胞外レセプターとの融合体として発現させることを特色とする。 細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞は全て、細胞表面ディスプレイに用いることができる。 これらの細胞による発現および/または分泌および/または固定化技術のいずれかを、本発明のディスプレイ技術と組み合わせて使用し得るということが理解されるべきである。 1つの局面において、本発明は、細菌細胞表面にディスプレイするための融合タンパク質を提供することによって、1つまたは複数の人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせを細胞表面に固定化するための方法を提供する。 ある態様において、細菌融合タンパク質は、1つまたは複数の人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせを細菌にディスプレイするのに使用し得る、細菌表面タンパク質に基づく。 細菌細胞ディスプレイにおいて、外来遺伝子産物は、タンパク質ならびにOmpA、OmpC、PhoE、LamB、FhuA、およびBtuBなどの外膜タンパク質の表面接近可能な領域に融合されている(Lang, Int. J. Med. Microbiol. 2000, 290:579−585; Etz et al., J. Bacteriol 2001, 183:6924−6935)。 100より多くのアミノ酸残基のポリペプチドの挿入が、ある種の場合に許容されることができる。 ディスプレイ用の別の部類の細菌表面タンパク質は、パッセンジャータンパク質の外膜トラフィッキングを仲介するトランスロケータードメインを含む、輸送体タンパク質である。 これらの輸送体の中性パッセンジャードメインを代わりのポリペプチド(例えば、1つまたは複数の人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)と置き換えることが、このポリペプチドを細菌表面上にトランスロケータードメインでディスプレイすることにつながる。 タンパク質を細菌の表面に提示するための関連する方法は、TraTのようなリポタンパク質、およびそれらのC末端を介してペプチドグリカン層に共有結合で付着しているが、関心対象のポリペプチドの融合のための遊離N末端を有する、ペプチドグリカン関連リポタンパク質(PAL)の使用によるものである(Dhillon et al., Lett. Appl. Microbiology (1999); 28:350−354)。 1つの局面において、本発明は、細菌表面ディスプレイ用の新規融合タンパク質のための方法を提供する。 関心対象のタンパク質のディスプレイ用の細菌融合アンカーリングモチーフのリストを表1に載せる。 表1のアンカーリングモチーフは、関心対象のポリペプチドを細菌細胞壁に提示するそれらの能力に基づいて選択される。 ある態様において、酵母ディスプレイ用の融合タンパク質には、真核細胞壁にアンカーリングすることができるタンパク質(例えば、α−アグルチニン、AGA1, Flo1、または下等真核生物の主要細胞壁タンパク質、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,027,910号および第6,114,147号を参照されたい)のN末端またはC末端の部分に融合した人工タンパク質、例えば、Flo1のGPI断片と融合したタンパク質またはFlo1機能ドメインに融合したタンパク質(Kondo et al., Appl. MicroBiol. Biotechn., 2004, 64:28−40) が含まれる。 GPIアンカーモチーフを含む確立された融合タンパク質に基づく表面ディスプレイ法に加えて、本発明は、修飾されたGPIアンカーモチーフを含む新規の融合タンパク質に基づくディスプレイ法も包含する。 本発明の融合タンパク質は、ディスプレイされるべきタンパク質(例えば、1つまたは複数の人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)、GPIアンカー、および融合タンパク質が酵母内で発現した時に翻訳後修飾され得る、適当なシグナル伝達配列を含んでもよい。 GPIアンカーおよびC末端のシグナル伝達配列を含むタンパク質がERを通ってトラフィッキングされると、GPIアンカーに隣接するC末端シグナル配列上の疎水性領域がER膜に埋め込まれるようになり、そこでそれはERプロテアーゼによって切断される。 ERプロテアーゼがこのC末端シグナル配列を切断すると、それは同時に予め形成されたGPIアンカーを人工タンパク質(例えば、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)の新しいC末端に付着させ、最終的にタンパク質(例えば、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)の細胞表面へのディスプレイをもたらす(例えば、Kondo et al. Appl. MicroBiol. Biotechn. 2004, 64:28−40を参照されたい)。 本発明は、GPIアンカータンパク質を含む融合タンパク質の改良されたディスプレイをもたらす改良された処理特性を持つC末端配列を包含する。 改良されたディスプレイには、ディスプレイされるタンパク質の数の増加および/または正確に発現されるタンパク質の数の増加が含まれる。 ある態様において、当技術分野において公知の技術に従って変異体C末端配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって、改良された処理特性を持つC末端配列を進化させる。 1つの局面において、本発明は、アンカーリングモチーフがGPIアンカーを含まないことを特徴とする、酵母ディスプレイ・アンカーリングモチーフを含む融合タンパク質を含む人工タンパク質(1つまたは複数の人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)をディスプレイするための方法を提供する。 酵母のアンカーリングモチーフは、その末端の一方で細胞外環境に部分的に露出している細胞表面タンパク質であってもよく、かつ高いコピー数を有していてもよい。 固定化されるべき関心対象のタンパク質(例えば、人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)を露出末端に融合してもよい。 ディスプレイされるべき関心対象のタンパク質をそれらのN末端またはC末端のいずれかを介してディスプレイ融合パートナーに融合することができる。 アンカーリングモチーフをそれら自体の分泌リーダー配列と共に発現させることができるし、またはアンカーリングモチーフを、発現および/もしくは分泌の向上をもたらすリーダー配列に取り付けることができる。 酵母のアンカーリングモチーフの非限定的な総覧を表2に提示する。 *コピー数は、Ghaemmaghami S, et al. (2003) Global analysis of protein expression in yeast. Nature 425(6959):737−41に基づく ある態様において、ディスプレイに用いる酵母融合タンパク質には、ディスプレイされるべき人工タンパク質をGPIアンカータンパク質の凝集ドメイン(例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,192,764号に記載されているようなFlo1、Flo2、Flo3、Flo4、Flo5、Flo9、Flo1O、またはFlo11)にGPIアンカータンパク質のC末端部なしで融合することに基づく細胞表面ディスプレイ系が含まれる。 凝集ドメインの糖鎖は細胞壁の糖鎖に結合し、それにより人工タンパク質(例えば、人工タンパク質、結合パートナー、分子標的、基質など、またはその任意の組み合わせ)を細胞表面にディスプレイする。
上で同定されたものなどの公知または既存の炭水化物結合タンパク質を直接的に炭水化物結合ドメインとして用いてもよい。 ある態様において、より高い結合親和性、より特異的な結合、より高い安定性、増大した表面発現、および/または改良されたオリゴマー特性を特徴とする改良された炭水化物結合ドメインを用いる。 さらに、公知の炭水化物結合タンパク質のオリゴマー構造を変化させてもよい。 例えば、炭水化物結合ドメインと関心対象のタンパク質(結合パートナー、分子標的など)の1つのポリペプチド融合体を作るために、単鎖形態の高次オリゴマーを作り出してもよい。 Flo1、Flo5、およびFlo10は3つのドメイン:マンノース結合ドメイン、中間反復トランス細胞壁ドメイン、ならびにC末端GPIアンカーシグナル配列およびモチーフを含む(Teunissen and Steensma, 1995, Yeast, Vol. 11, pp 1001−1003)。 野生型凝集素の過剰発現は、細胞がフロックを形成する傾向の増大をもたらす傾向があるということが示されている(Guo et al., 2001, PNAS早版, (2001))。 しかしながら、FLO1を介するディスプレイ系での初期の試みにおいて行なわれているように、この傾向は、N末端機能ドメインのみを含む切断型を標的タンパク質との融合体として発現させることによって幾分緩和することができる(Matsumoto et al., 2002, Applied and Environmental Microbiology, 68:9 4517−4522)。 本発明の1つの局面において、マンノース結合ドメインを含むFlo1またはFlo1ホモログタンパク質のN末端機能ドメインを酵母細胞内で発現させる。 発現される切断タンパク質は、GPIアンカーモチーフも細胞壁ドメインも含まないが、それが細胞壁中または細胞表面上のマンノース残基に結合するのを可能にするマンノース結合ドメインを含む。 ある態様において、炭水化物結合ドメインは、特定の炭水化物結合特性を持たないタンパク質に由来する。 例えば、炭水化物結合ドメインを、単鎖抗体、その他の抗体形式、設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)、ロイシンリッチリピート(LRR)タンパク質、テトラトリコペプチドリピート(TPR)タンパク質、アルマジロリピート(ARM)タンパク質、アビマー、リポカルシン、Fn3(10Fn3、またはAdNectinを含む)、線状ペプチド、ジスルフィド拘束ペプチド、小型モジュラー式免疫製薬(SMIP)、テトラネクチン、T細胞レセプター、PDZドメイン、もしくはAドメインタンパク質など、またはその任意の組み合わせなどの一般的なタンパク質結合プラットフォームに由来してもよい。 さらなるスキャフォールドとして、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA−4)、テンダミスタット、ネオカルジノスタチン、ロドサーマス・マリナス(Rhodothermus marinus)由来のキシラナーゼのファミリー2の炭水化物結合モジュール4(CBM4−2)、免疫タンパク質9(Im9)、ジンクフィンガー、フィラメント状バクテリオファージのタンパク質VIII(pVIII)、GCN4、WWドメイン、srcホモロジードメイン3(SH3)ドメイン、srcホモロジードメイン2(SH2)ドメイン、TEM−1 β−ラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、植物ホメオドメインフィンガー(PHDフィンガー)、キモトリプシンインヒビター2(C12)、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)、アルツハイマーのアミロイドβタンパク質前駆体インヒビター(APPI)、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター(hPSTI)、エコチン、ヒトリポタンパク質関連凝固インヒビタードメイン1(LACI−D1)、ヒル由来トリプシンインヒビター(LDTI)、マスタードトリプシンインヒビター2(MTI II)、サソリ毒素、昆虫ディフェンシンA、テッポウウリ(Ecballium elaterium)トリプシンインヒビターII(EETI II)、およびセルロース結合ドメイン(CBD)が含まれる。 ある態様において、炭水化物結合ドメインは、全体の解離速度を結合活性効果によって減少させるかまたは融合タンパク質の炭水化物への結合親和性を増大させるために、多数の相互作用ドメインから構成されている。 各々のドメインは、同一であっても、類似していてもよく、または異なるタンパク質配列を有していてもよい。 各々のドメインは、同じかまたは異なる炭水化物エピトープに結合してもよい。 ある態様において、タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞がインキュベートされ、別個の誘導工程が必要とされない時に、タンパク質発現が起こる。 ある態様において、2つのタンパク質を2つの発現コンストラクトによって共発現させ、宿主細胞によって同時に分泌させる。 例えば、2つの人工タンパク質を、同じ培養条件下で発現および分泌させてもよい。 ある態様において、2つのタンパク質を連続的に発現させる。 2つの人工タンパク質を連続的に発現させる場合、2つの誘導性プロモーター(例えば、2つの異なる誘導性プロモーター)の制御下にある2つの発現コンストラクトを宿主細胞に同時にコトランスフェクトしてもよい。 第1のタンパク質の発現を、第1のタンパク質の発現を誘導するのに十分な条件下で宿主細胞をインキュベートすることによって開始し、第2のタンパク質の発現を、第2のタンパク質の発現を誘導するのに十分な条件下で開始する。 あるいは、宿主細胞に第1のタンパク質をコードする第1の発現ベクターをトランスフェクトし、その後、第2のタンパク質をコードする第2の発現ベクターをトランスフェクトしてもよい。 あるいは、宿主細胞は第1のタンパク質を構成的に発現し、その後に第2のタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトされるかまたはその発現ベクターで形質転換されてもよい。 ある態様において、分泌される人工タンパク質を第1の結合パートナーに結合させ、それによって第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイさせてもよい。 第1の結合パートナーをインビトロかまたはインビボのいずれかで、直接的または間接的に、様々な方法で細胞表面に付着させ得るということが理解されるべきである。 好適なインビトロ法には、直接的なアミノ基への共役もしくはチオールへの共役かまたは(例えば、ビオチンもしくは抗体を介した)間接的な共役が含まれるが、これらに限定されない。 あるいは、第1の結合パートナーを宿主細胞によって発現および分泌させてもよい。 ある態様において、第1の結合パートナーをアンカーリングモチーフに融合し、細胞表面でディスプレイさせる。 ある態様において、第1の結合タンパク質を1組の結合パートナーを介して細胞表面に付着させる。 ある態様において、細胞表面は第3の結合パートナーをディスプレイする。 ある態様において、第1の結合パートナーを、第3の結合パートナーに結合することができる、第4の結合パートナーに連結し、それにより第1の結合パートナーを細胞表面にディスプレイする。 ある態様において、第3および第4の結合パートナーは第1の結合パートナー、標的分子、または基質の細胞表面へのディスプレイに関係する。 第3および第4の結合パートナーは第1および第2の結合パートナーと同じ物理的実体であることができるということが理解されるべきである。 例えば、本発明の1つの態様において、第1および第3の結合パートナーが両方ともビオチンであり、その一方で第2および第4の結合パートナーが両方ともストレプトアビジンである。 本発明の別の態様において、第1および第4の結合パートナーがビオチンであり、その一方で第2および第3の結合パートナーがアビジンである。 ビオチンの細胞表面でのディスプレイを、例えば、インビトロでの、例えばスルホ−NHS−ビオチン(Pierce Chemical社)またはビオチン・スルホスクシンイミジルエステル(Invitrogen)の使用による細胞表面タンパク質のビオチン化によって確立することができる。 しかしながら、細胞が分裂すると、娘細胞はビオチンを保持しないということを理解すべきである。 ある態様において、細胞表面タンパク質のビオチン化をインビボで遂行してもよい。 本発明のある局面において、ビオチン受容体ペプチド(すなわち、修飾モチーフを含む固定化ペプチド)を、アンカーリングしている細胞表面タンパク質または細胞壁タンパク質に融合し、(例えば、ビオチンリガーゼを用いて)インビボでビオチン化してもよく、表面タンパク質または細胞壁タンパク質およびビオチン化された受容体ペプチドを含む融合タンパク質を宿主細胞の細胞表面でディスプレイさせてもよい。 ある態様において、細胞表面タンパク質を、1つまたは複数のビオチン受容体ペプチドを含むように人工的に改変してもよい。 例えば、細胞表面タンパク質を、アンカーリングドメインもしくはモチーフ、細胞外ドメイン、および細胞外ドメインに融合したビオチン受容体ペプチドを含むように人工的に改変してもよいし、または細胞表面タンパク質を、1つよりも多くのビオチン受容体ペプチドをその細胞外末端および細胞外ドメインに含むように人工的に改変してもよい。 結果として生じるビオチン化された細胞表面タンパク質の発現は、構成的であってもよいしまたは誘導性であってもよい。 細胞表面は、好ましくは、細胞膜または細胞壁にネイティブに局在するタンパク質である。 そのようなタンパク質を、例えば、それらの発現レベル、それらのサイズ、およびそれらの構造的特色、ならびにその任意の組み合わせに基づいて選抜してもよい。 例えば、好ましい細胞表面タンパク質は、高いネイティブの発現レベルを有する。 好ましい態様において、タンパク質は、細胞外のN末端および/もしくはC末端、または第2(もしくは第4)の結合パートナー(例えば、ビオチン)が第1(もしくは第3)の結合パートナー(例えば、アビジン)と細胞表面で自由に相互作用するのを可能にするペプチドの挿入もしくは融合を施し易い細胞外ドメインを持つタンパク質内ループを有する。 酵母では、細胞表面タンパク質として、SAG1、HPS150(PIR2P)、CWP2、BIO5、SAG1、FLO5、FLO1、FIG1、FIG2、STE2、STE3など、もしくは上記タンパク質の変異体、または任意のその他の関連細胞壁タンパク質などのネイティブに存在する細胞壁タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。 好ましい態様において、少なくとも1つのビオチン受容体ペプチドを含む人工細胞表面タンパク質をビオチンリガーゼと共発現させ、ビオチン受容体ペプチドのインビボでのビオチン化をもたらし、それによりビオチンを宿主細胞表面でディスプレイする。 ある態様において、少なくとも1つのビオチン受容体ペプチドを含む人工細胞表面タンパク質を、ビオチン受容体ペプチドのインビボでのビオチン化およびビオチンの宿主細胞表面でのディスプレイをもたすシャペロンタンパク質と共発現させる。 シャペロンタンパク質は、人工タンパク質の輸送および/またはフォールディングを促進するタンパク質である。 シャペロンタンパク質は当技術分野において公知であり、非限定的な例として、BiP、GRP94、GRP170、クラネキシン、カルレティキュリン、HSP47、HSP60、HSP70、HSP90、HSP1OO、ERp29、ERp57、PDI、およびPPIが含まれる。 ある態様において、シャペロンタンパク質はBiPである。 インビボでビオチン化された細胞を、捕捉アッセイまたはスクリーニングアッセイの過程の間の任意の時点で可溶性アビジンとインキュベートすることができる。 例えば、遊離の可溶性アビジンをアッセイの間の任意の時点で添加し、それにより娘細胞がアビジンまたはアビジン様タンパク質で標識され、ビオチン化された人工タンパク質を捕捉するのを可能にすることができる。 細胞がディスプレイされたビオチンに結合したアビジンを保持するように、宿主細胞の培養条件を最適化することができる。 ビオチンをディスプレイする細胞の表面に最適な数のアビジンを維持することを、例えば、増大したアビジン濃度(例えば、2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/mlなど)で細胞をインキュベートすること、細胞培養温度を(例えば、酵母用に20℃まで)低下させること;培地の粘度を(例えば、PEGの添加によって)増大させること、またはその任意の組み合わせにより達成してもよい。 さらに別の態様において、細胞分裂を阻害し、ディスプレイアッセイで存在するアビジン標識細胞のパーセンテージを最大化する。 細胞表面タンパク質のビオチン化の後に細胞分裂が阻害される場合、「親」細胞は分裂しないと考えられ、娘細胞は生み出されず、大多数の細胞はそれらの細胞表面にアビジンを保有すると考えられるということを理解すべきである(図12参照)。 細胞分裂の速度を落とすための戦略として、温度変化、化学物質による処置、またはアッセイの時間規模の変更が含まれるが、これらに限定されない。 細胞分裂の速度を落とすのに用いられる化学物質として、ヒドロキシウレア、ノコダゾール、ファルネソール、a−接合因子、α−接合因子、レフルノミド、カルシウム不足培地、EGRA、リチウム、ミモシン、ロバスタチン、アフィディコリン、およびチミジンが含まれるが、これらに限定されない。 ビオチン結合部分(例えば、アビジンおよびアビジン様タンパク質)は当技術分野において公知であり、アビジンならびにストレプトアビジンおよびニュートラアビジンなどのその変形体を含む。 アビジン(卵白由来)、ストレプトアビジン(ストレプトマイセス・アビジニイ(Streptomyces avidinii)由来)、およびニュートラアビジンは、約10 −15 Mというよく似た解離定数でビオチンと結合する関連タンパク質である(Green, 1975, Adv. Protein Chem., vol. 29, pp. 85−133)。 ニュートラアビジンタンパク質は、脱グリコシル化型のアビジンであり、より少ない程度にレクチンに結合する。 アビジンおよびアビジン様タンパク質は、非共有結合で付着した4つの同一のサブユニットから構築されており、その各々が1つのビオチン結合部位を持ち、同じ3次元フォールドを示す。 各々のタンパク質はホモ四量体として機能し、その場合4つの同一コピーの単量体が会合してネイティブな4次構造を取り、各々の単量体は1分子のビオチンと結合する。 2つの単量体が会合して1次二量体または構造二量体を形成し、その後、そのうちの2つが組み合わさって四量体を形成する(概説のために、例えば、Laitinen et al., Trends Biotech., Vol. 25, No8, pp 269−277, 2007を参照されたい)。 アビジンのビオチンへの結合の独特の特色は、アビジン−ビオチン複合体の形成の強さおよび特異性である。 アビジンについて1.6 x 10 −15 Mおよびストレプトアビジンについて2.5 x 10 −13 Mと推定される、結果として得られる親和性定数は、タンパク質および有機リガンドについて知られている最高のものである。 アビジンまたはストレプトアビジンのビオチンに対する強い親和性は、タンパク質の四量体形状に依存している。 アビジン単量体は極めて低下した親和性定数(10 −7 M、Laitinen et al., 2003, J Biol. Chem. Vol. 278, pp 4010−4014)を示す。 ある態様において、アビジンは、ディスプレイされるべき人工タンパク質と一緒に細胞によって発現される。 アビジンおよびストレプトアビジンの組換え形態が、電荷、オリゴマー化、およびリガンド特異性の修飾された特性を持つ真核生物および原核生物の発現系で人工的に作製され、産生されている。 本明細書に記載された方法を、本明細書に記載された任意のアビジン、アビジン変異体、またはアビジン様タンパク質を用いて実行し得るということが理解されるべきである。 オリゴマータンパク質は、アンカーリングモチーフと融合した1つのサブユニットを発現させ、残りのサブユニットを分泌させることによって、首尾よく細胞表面にディスプレイされている。 例えば、ヘテロオリゴマーの機能性抗体のFab断片は、軽鎖Fab断片を融合Fab−α−アグルチニンタンパク質としておよびFab重鎖の断片を分泌タンパク質として発現させることによって首尾よく酵母細胞表面にディスプレイされている(Lin Y. et al., 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 62, pp 226−236)。 さらに、Furukawaらは、ネイティブなサブユニットおよびFlo1pの318アミノ酸のC末端と融合したアンカーサブユニットを共発現させることによってストレプトアビジンを酵母細胞表面にディスプレイすることができた(2006, Biotechnol. Prog., Vol. 22, pp 994−997)。 ある態様において、アンカーリングモチーフと融合したアビジン単量体を細胞表面にディスプレイさせる。 ある態様において、さらなるコピーのアビジンを宿主細胞によって発現および分泌させる。 ある態様において、アンカーリングモチーフと融合したディスプレイされたアビジン単量体は、宿主細胞によって分泌されたさらなるアビジンタンパク質に結合する。 アビジンおよびアビジン様タンパク質を2つのポリペプチド二量体鎖(Nordlund et al., 2004, J. Biol. Chem., Vol. 279, pp36715−36719および国際公開公報第05047317号)としてまたは1つの四量体ポリペプチド鎖(Nordlund et al., Biochem. J., 2005, Vol. 392, pp 485−491)として発現させることもできるということが理解されるべきである。 1つの態様において、アビジンまたはアビジン様タンパク質を、1つの単鎖二量体をアンカーリングモチーフに融合したタンパク質として発現させ、第2の単鎖二量体を宿主細胞によって発現および分泌させることを特徴とする、2つの単鎖アビジン二量体として発現させる。 別の態様において、アビジンまたはアビジン様タンパク質をアンカーリングモチーフに融合した単鎖四量体として発現および分泌させる。 さらにその他の態様において、アビジンまたはアビジン様タンパク質の異なるサブユニットを、単鎖二量体のアビジン、単量体のアビジン、およびアンカーリングモチーフに融合した単量体のアビジンサブユニットとして共発現および分泌させる。 別の態様において、アビジンを単量体または二量体のアビジン−アンカリングモチーフタンパク質の融合体として宿主細胞の表面にディスプレイさせる。 アンカーリングモチーフには、任意の公知の細胞壁タンパク質(例えば、α−アグルチニン、Flo1p)、GPIアンカー、修飾されたGPIアンカー、AGA2など、または本明細書に記載されているかもしくは当業者に公知の任意のその他のアンカーリングモチーフが含まれるが、これらに限定されない。 人工の四量体、二量体、および単量体アビジンを、約10 −7 M、約10 −8 M、約10 −9 M、約10 −10 M、約10 −11 M、約10 −12 M、約10 −13 M、約10 −14 M、または約10 −15 Mという解離定数によって表される親和性でアビジンに結合するように設計してもよい。 ある態様において、アビジン、ストレプトアビジン、またはアビジン様タンパク質などの第1の結合パートナーを細胞表面に直接コンジュゲートする(接続するとも言う)(図2参照)。 第1の結合パートナーを細胞表面に共有結合で結合させることができるしまたは第1の結合パートナーを、親和性に基づく結合相互作用を含む、その他の結合相互作用を通じて細胞表面に結合させることができる。 第1の結合パートナーの細胞表面への共有結合によるコンジュゲーションを様々なコネクターを用いて遂行することができる。 コネクターとは、結合部分を細胞表面に共有結合でコンジュゲートすることができる任意の分子である。 ある態様において、ヘテロ二官能性コネクターを用いる。 ヘテロ二官能性コネクターの非限定的な例は、C6−スクシンイミジル4−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(C6−SANH)、スクシンイミジル4−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(SANH)、スクシンイミジル4−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩(SHTH)、スクシンイミジル4−ホルミルベンゾエート(SFB)、およびC6−スクシンイミジル4−ホルミルベンゾエート(C6−SFB)である。 ある態様において、コネクターは、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS;遊離アミンと反応することができる)およびアルデヒド反応性ヒドラジド官能基を含む。 NHSおよびヒドラジド基を含むコネクターの非限定的な例は、C6−SANHおよびSANHである。 アビジンのような、遊離アミンを含む第1の結合パートナー、または炭水化物を含有する結合パートナーを細胞表面にコンジュゲートするのに用いることができるヘテロ二官能性コネクターの非限定的な例は、C6−スクシンイミジル4−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(C6−SANH)である。 結合パートナーをC6−SANHで標識することによって、第1の結合パートナーを細胞表面にコンジュゲートすることができる。 このコンジュゲーションは、NHS基を第1の結合パートナーの表面の遊離アミンと反応させることによって起こる(結合部分がポリペプチドである場合、溶媒に曝露されたリジンが遊離アミンを提供し得る)。 その後の工程で、ヒドラジド部分を細胞表面の遊離アルデヒドと反応させ、それにより第1の結合パートナーを細胞表面に共有結合でコンジュゲートしてもよい。 ある態様において、細胞を過ヨウ素酸塩で前処置し、細胞表面の炭水化物上に遊離アルデヒドを発生させる。 あるいは、第1の結合パートナーが炭水化物基を含む場合、細胞をC6−SANHと反応させて細胞表面上の遊離アミンとコネクターのNHSエステル部分の間で共有結合を形成させることによって、コンジュゲーションを行なうことができる。 その後、細胞を過ヨウ素酸塩で処置した結合部分と混合し、コネクターの遊離ヒドラジド基を用いて第1の結合パートナー上の酸化した炭水化物と細胞表面の間の安定な接続を作り出すことができる。 しかしながら、本発明はこの点において限定されるものではないので、任意のその他の好適な技術を用いて、第1の結合パートナーを細胞表面に接続させ得るということが理解されるべきである。 ある態様において、結合パートナーを、スペーサーを介して細胞表面に接続させる。 ある態様において、第1の結合パートナーを、スペーサーを介して細胞表面に接続させる。 第1の結合パートナーをスペーサーに共有結合で結合させることができるし、または第1の結合パートナーを、親和性に基づく結合相互作用を含む、その他の結合相互作用を通じてスペーサーに結合させることができる。 ある態様において、スペーサーはビオチン部分を含み、ビオチンスペーサーと称される。 ある態様において、第1の結合パートナーは、アビジンなどのビオチン結合部分であり、スペーサーはビオチンおよびリンカーエレメントを含む。 ある態様において、リンカーを細胞表面に付着させる。 ある態様において、スペーサーは1組の結合タンパク質を含む。 ある態様において、第1の結合パートナーを、細胞表面に付着する、第3の結合パートナーに接続する、第4の結合パートナーに結合させる。 スペーサーは結合パートナー間の相互作用に限定されず、本発明は、細胞壁と第1の結合パートナーの間のスペーサーとして機能することができる任意の部分を包含する。 ある態様において、ビオチンスペーサーを含む、スペーサーは任意の長さであることができ、アルカン、PEGなど、またはその任意の組み合わせを含む、任意の種類のリンカーを含む。 ある態様において、細胞壁結合タンパク質の作用を通じて、リンカーを細胞表面に付着させる。 好ましくは、スペーサーは化学的に不活性であり、宿主細胞の任意のその他の構成要素、人工タンパク質、または宿主細胞の細胞環境の薬剤と反応しない。 スペーサー中のリンカーに好適である分子は当技術分野において公知である。 スペーサーを細胞表面に接続してもよく、本発明は、糖、アミノ酸、および脂質を含む、任意の細胞表面部分へのスペーサーの連結を包含する。 ある態様において、スペーサーを(例えば、N−スクシミジルエステルの作用を介して)アミノ酸側鎖に連結させる。 ある態様において、分泌される人工タンパク質およびスペーサーを同じビオチン結合部分に結合させる。 ある態様において、分泌される人工タンパク質をそのビオチンを介してアビジンに結合させ、アビジンもビオチンスペーサーのビオチン部分に結合させ、それにより人工タンパク質を細胞表面に固定化する。 ある態様において、1つよりも多くの人工タンパク質を1つのアビジンに結合させる。 ある態様において、修飾モチーフは、ある種の修飾事象を導くアミノ酸の配列である。 ある態様において、修飾モチーフは、ある種の修飾事象のための基質として作用するアミノ酸の配列である。 修飾モチーフはまた、化学反応を受けることができる配列であってもよく、例えば、配列は、二硫酸架橋を形成することができる、1つもしくは複数のシステイン、交差結合を形成することができる、1つもしくは複数の芳香環、または化学反応に関与することができる1つもしくは複数の側鎖を含んでもよい。 ある態様において、配列は、酵素による修飾事象のための基質として機能することができる。 酵素による修飾事象の非限定的な例は、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化、またはその他の側鎖修飾事象である。 酵素による修飾はまた、ペプチド、タンパク質、もしくはコレステロールのようなその他の生体分子、およびビオチンのような補酵素、またはその他の生体分子の共役であってもよい。 第2の結合パートナーの共役はまた、非生体分子(例えば、細胞に天然には存在しない分子)の付加を含んでもよい。 本発明は、1工程修飾と多工程修飾の両方を包含する。 ある態様において、第2の修飾を受けることができる、第1の修飾を生じさせ、第2の結合パートナーの共役をもたらす。 ある態様において、第2の結合パートナーを細胞外で共役させる。 関心対象のタンパク質の突然変異、または関心対象のタンパク質に修飾モチーフを含むペプチド配列を融合することによって、修飾モチーフを作り出し得るということが理解されるべきである。 1つの局面において、本発明は、人工タンパク質のインビボビオチン化のための方法を提供する。 ビオチンは、植物、多くの細菌、および幾つかの菌類によって合成される必須の補酵素である。 ビオチンは、タンパク質結合型でかつ細胞内にあるビオチンが、ある部類の代謝酵素である、ビオチンカルボキシラーゼおよびデカルボキシラーゼに共有結合で付着した時のみ生物学的活性がある。 これらの酵素は、ビオチン補因子を可動性カルボキシル担体として用いることによって代謝物質へのおよび代謝物質間のCO 2の転移を触媒しており、かつ糖新生、脂質生成、アミノ酸分解、およびエネルギー変換の鍵酵素である。 ビオチンタンパク質リガーゼ(BPL)は、ビオチンをビオチンカルボキシラーゼおよびデカルボキシラーゼに付着させるのに関与する酵素である。 BPLは、ビオチンのカルボキシル基とカルボキシラーゼおよびデカルボキシラーゼの特定のリジン残基のε−アミノ基の間のアミド連結の翻訳後形成を触媒する(Chapman−Smith et al., Biomol. Engineering, 1999, 16:119−125)。 本発明は、タンパク質またはポリペプチドへのビオチンの共役を触媒する任意の酵素を包括する。 ある態様において、共役酵素はビオチンタンパク質リガーゼ(BPL)である。 ある態様において、BPLはBirA(大腸菌BPL)である。 Bir AポリペプチドおよびBirAをコードする核酸は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,255,075号および米国特許第5,723,584号に記載されている。 ヒト化型のBirAも当技術分野において公知である(J. Biotechnol. 2005, 0:245−249)。 BirAおよびBPLタンパク質の配列を表3に示す。 しかしながら、出芽酵母由来のBPL(Cronan et al. FEMS Kett 1995, 130:221)およびヒトBPL(Suzuki et al. Nat. Genetics 1994, 8:122−128)を含む、全てのBPLが本発明によって包括される。 本発明は、修飾型および突然変異型のBPLを含む、任意のBPLを任意の宿主細胞で用いること(例えば、大腸菌BPL(BirA)を出芽酵母で用いること)を包括する。 ある態様において、BPLは、温度を特異的なレベルまで下げるかまたは上昇させることによって活性化することができる、温度感受性BPLである。 BPLは、ビオチンをポリペプチドに共役するのにATPとビオチンの両方を必要とする。 ある態様において、宿主細胞を、ビオチンをポリペプチドに共役するのに十分な条件下で成長させる。 ある態様において、条件は、十分に高い濃度のATPおよび十分に高い濃度のビオチンである。 ある態様において、ATPおよび/またはビオチンを宿主細胞環境に添加し、ビオチンのポリペプチドへの共役を開始させるかまたは加速させる。 各々のBPLは、ビオチンが共役する天然のポリペプチド基質配列(ビオチン化配列)を有しており、本発明は、任意のBPL由来のビオチン化配列、合成のビオチン化配列、またはその任意の組み合わせを用いることを包含する。 BPL基質配列の例をChapmanら(Biomol. Engineering, 1999, 16:119−125)に見出すことができる。 市販のBPL基質ペプチドの例は、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)に由来する72アミノ酸ペプチドを含む、InvitrogenのBioease(商標)Tag、15アミノ酸のペプチドを含む、Avidity(商標)のAviTag(商標)、および128アミノ酸ペプチドを含むPromegaのPinPoint(商標)である。 ビオチン化配列は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,723,584号、米国特許第5,252,466号、米国特許第5,874,239号、米国特許第6,265,552号にも記載されている。 BirAおよびBirAをコードするプラスミドを過剰発現する細胞はAvidity(Denver, CO)から市販されており、大腸菌系統AVB 99、AVB 100、およびAVB 101を含む。 ある態様において、修飾モチーフはビオチン化配列を含む。 ビオチン化モチーフを含むペプチドを、ビオチン化ペプチドまたはビオチン受容体ペプチドとも称する。 ある態様において、修飾モチーフはビオチン化ペプチドを含み、アミノ酸修飾はビオチンをビオチン化ペプチドに共役することを含む。 ある態様において、共役酵素を人工タンパク質と同時に発現させる。 ある態様において、共役酵素をベクターから発現させる。 ある態様において、共役酵素をコードする遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込む。 ある態様において、共役酵素の遺伝子は、人工タンパク質の遺伝子と同じベクター上にある。 ビオチン化法を用いて、本明細書に記載された任意の関心対象のタンパク質または細胞結合タンパク質をビオチン化し得るということが理解されるべきである。 (表3)BirAおよびBPLタンパク質の配列 ある態様において、第1の結合パートナーまたは第1の結合パートナーを含む人工タンパク質および第2の結合パートナーを含む人工タンパク質を宿主細胞内で共発現させ、宿主細胞によって同時に分泌させる。 例えば、2つの人工タンパク質を同じ培養条件下で発現および分泌させてもよい。 2つの人工タンパク質を連続的に発現させる場合には、第1の結合パートナーまたは第1の結合パートナーを含む第1の人工タンパク質を第1の構成的または誘導性プロモーターの制御下にコードする核酸配列を含む1つの発現コンストラクト、および第2の結合パートナーを含む第2の人工タンパク質を第2の誘導性プロモーターの制御下にコードする核酸配列を含む第2の発現コンストラクトという、2つの発現コンストラクトを宿主細胞に同時にコトランスフェクトし、第1の結合パートナーを構成的に発現させるかまたは第1のプロモーターの誘導後に細胞の表面で発現させ、第2の結合パートナーを第2のプロモーターの誘導後に細胞によって発現および分泌させてもよい。 あるいは、第1の結合パートナーを含む人工タンパク質をコードするベクターを、第1の結合パートナーが宿主細胞の表面で発現されるような条件下で宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。 その後、第2の結合パートナーを含む第2の人工タンパク質をコードするベクターを、第2の結合パートナーを宿主細胞によって発現および分泌させるような条件下で培養細胞にトランスフェクトしてもよい。 あるいは、宿主細胞は第1の結合パートナーを含む人工タンパク質を構成的に発現してもよく、その後に第2の結合パートナーを含む人工タンパク質をコードするベクターを宿主細胞内に導入する。 本発明の別の局面において、第2の結合パートナーを含む人工細胞表面タンパク質をコードするベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、第2の結合パートナーが宿主細胞の表面で発現される条件下でインキュベートしてもよい。 その後、培養細胞を可溶性の第1の結合パートナーとインキュベートし、第1の結合パートナーのディスプレイをもたらしてもよい。 その後、第2の結合パートナーがインビボで共役することができる、人工タンパク質または第2の結合パートナーを含む人工タンパク質をコードするベクターを、第2の結合パートナーを含む人工タンパク質が宿主細胞によって発現および分泌されるような条件下で細胞にトランスフェクトしてもよい。 別の態様において、宿主細胞は、第2の結合パートナーを含む人工細胞表面タンパク質および/または第2の結合パートナーを含む関心対象の人工タンパク質を構成的に発現してもよい。 あるいは、宿主細胞は、可溶性の第1の結合パートナー(例えば、アビジン)を構成的に発現するか、または宿主細胞は、可溶性の第1の結合パートナーを発現するように誘導されてもよい。 第1の結合パートナーを、上記のように直接的または間接的に宿主細胞表面に付着させるかまたは共役させてもよい。 例えば、第1の結合パートナー(例えば、アビジン)を、細胞表面に化学的に共役しているかまたは好適なリンカーを介して細胞表面に化学的に付着している第2の結合パートナー(例えば、ビオチン)を介して細胞表面に連結させてもよい。 宿主細胞に、第2の結合パートナーを含む人工タンパク質を構成的または誘導性プロモーターの制御下にコードするベクターをコトランスフェクトするかまたはそのベクターを後からトランスフェクトしてもよい。 本明細書に記載されたタンパク質はまた、ベクターに加えて、またはベクターの代わりに、宿主細胞のゲノム上にコードされ得るということが理解されるべきである。 本発明の別の局面において、第1の結合パートナーを含む人工細胞表面タンパク質をコードするベクターおよび標的分子に対する親和性を有する関心対象の人工タンパク質をコードするベクターを宿主細胞にコトランスフェクトしてもよい。 その後、第1の結合パートナーが宿主細胞の表面で発現する条件下で培養細胞をインキュベートしてもよい。 第2の結合パートナーの第1の結合パートナーへの結合によって表面での標的分子のディスプレイがもたらされることを特徴とする、第2の結合パートナーと共役した可溶性の標的分子の存在下で第1の結合パートナーをディスプレイする細胞をインキュベートする。 その後、関心対象の人工タンパク質が細胞によって発現および分泌される条件下および関心対象の人工タンパク質が宿主細胞の表面でディスプレイされた標的分子に結合するのに好都合な条件下で細胞をインキュベートしてもよい。 あるいは、宿主細胞が、第2の結合パートナーを含む人工細胞表面タンパク質および/または関心対象の人工タンパク質を構成的に発現してもよい。 ある態様において、可溶性の第2の結合パートナーを、第3の結合パートナーをディスプレイする細胞に添加し、第2の結合パートナーの結合および第2の結合パートナーのディスプレイをもたらす。 第3の結合パートナーは、第1の結合パートナーと類似しているかまたは同じ部分であることができ、第3の結合パートナーをディスプレイする細胞を、第3の結合パートナーをディスプレイする細胞を作製するのと同じ方法で作製することができるということが理解されるべきである。 ひとたび第3の結合パートナーをディスプレイする細胞が作製されれば、可溶性の第2の結合パートナーを添加し、第2の結合パートナーのディスプレイを結果としてもたらすことができる。 次の工程として、第1の結合パートナーに付着した標的分子を添加し、標的分子のディスプレイをもたらすことができる。 ある態様において、第1または第3の結合パートナーは、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、アビジン様タンパク質、または任意のビオチン結合タンパク質であり、第2の結合パートナーはビオチンまたはアビジン結合ペプチドである。 ある態様において、第1の結合タンパク質(例えば、アビジン)をコードするベクター、標的分子に対する親和性を有する関心対象の人工タンパク質をコードするベクター、ならびに標的分子および第2の結合パートナーを含むコンストラクトをコードするベクターを宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。 このやり方で、3つ全ての原理構成要素をインビボで発現させ、処理させ、かつ分泌させ得るということを理解すべきである。 3つの構成要素を宿主細胞内で発現させ、宿主細胞により同時的または連続的に分泌させ、標的分子のディスプレイおよび人工タンパク質の標的分子への結合をもたらしてもよい。 蛍光タンパク質は当技術分野において公知であり、緑色蛍光タンパク質(GFP)ならびにYFP(黄色蛍光タンパク質)およびDsRedのようなその色変異体を含む。 レポーター部分は、アッセイによって容易に検出することができる基質を処理することができるタンパク質またはポリペプチドも含む。 例えば、この群のタンパク質としてペルオキシダーゼが含まれる。 レポーター部分には、ポリペプチドを標識抗体に結合させることにより検出することができるポリペプチドがさらに含まれ、FLAG(登録商標)ペプチドおよびHis6親和性タグ(配列番号11)が含まれる。 レポーター部分は、人工タンパク質を分泌している細胞の選択を可能にする。 ある態様において、FACS(蛍光活性化細胞選別)を用いて、人工タンパク質を分泌する宿主細胞を同定および単離することができる。 しかしながら、その他の蛍光に基づく技術を用いてもよい(例、蛍光認識コロニーピッカー、例えば、Genetixから入手可能である)。 ある態様において、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は同じプロモーターの制御下にある。 ある態様において、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は異なるプロモーターの制御下にある。 例えば、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、酵母での抗体の発現用に反対方向にそれぞれGAL1よびGAL1OまたはGAL1OおよびGAL1プロモーター下にクローニングしてもよい。 酵母発現ベクターは当技術分野において公知であり、市販されている。 例示的なベクターとして、StratageneからのpESCベクターが含まれる。 1つの局面において、軽鎖および重鎖の発現の割合を最適化するためにプロモーターのライブラリーを提供する。 ある態様において、ライブラリーは、プロモーターのコンセンサス配列内に突然変異を含む。 真核細胞では、TATAボックス(またはゴールドバーグ・ホグネスボックス)が、多くの遺伝子のプロモーター領域に見出されるDNA配列である。 TATAボックスは中心の5'−TATAAA−3' DNA配列を有する。 配列解析により、2番目の位置のヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドAが酵母で高度に保存されていることが明らかにされている。 ある態様において、NANNNN配列という突然変異型TATAボックスライブラリーを作製する。 ある態様において、重鎖および軽鎖の発現を制御するプロモーターの各々1つについて、NANNNN配列という突然変異型TATAボックスライブラリーを作製する。 例として、1つの位置が保存され、5つの位置が保存されていない場合、コンビナトリアルライブラリーには、各々のプロモーターについて10 5個のTATAボックス配列(例えば、NANNNN)が含まれる。 ある態様において、TATA配列のライブラリーをランダム突然変異生成によって作製する。 ある態様において、ライブラリーをスクリーニングし、所望の特性を有するTATAボックス変異体を同定する。 例えば、TATAボックスライブラリーをスクリーニングし、野生型TATAボックスよりも増大した抗体または抗体断片の発現を有するTATAボックスを同定してもよい。 TATAボックス変異体の制御下にある抗体または抗体断片の発現を、野生型TATAボックスの制御下にある抗体または抗体断片の発現と比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍増大させてもよい。 本発明のある局面は、高レベルの関心対象のタンパク質を発現する細胞をスクリーニングするための方法に関する。 例示的な態様において、インビボまたはインビトロでビオチン化された細胞を可溶性アビジンと共にかつ関心対象のタンパク質を含むビオチン化人工タンパク質の分泌を可能にする条件下でインキュベートする。 人工タンパク質をディスプレイする細胞を、人工タンパク質を標識することによって検出する。 ある態様において、人工タンパク質をディスプレイする細胞を、関心対象のタンパク質に対する標識抗体に結合させるかまたは検出可能な抗クラス抗体を用いることによって検出する。 ある態様において、関心対象のタンパク質をエピトープタグ(例えば、Sigma−AldrichからのFLAGペプチド)と融合させ、関心対象のタンパク質を分泌する細胞を、検出可能な抗エピトープ抗体(例えば、モノクローナル抗FLAG抗体)を用いて標識してもよい。 高レベルの関心対象のタンパク質を発現する細胞の選択を、多数回の細胞選別および細胞培養成長による増幅を用いて実行することができる。 各回の選択は、蛍光などの検出可能な標識の強度に基づいた細胞の選別を含む。 蛍光活性化細胞選別(FACS)系、磁気細胞選別系(MACS)、または任意のその他の好適な細胞の分離もしくは選別の技術を含む当技術分野において公知の方法のいずれかによって分離を行なってもよい。 本発明のある局面は、特異的な標的分子(例えば、抗原またはリガンド)と所望の特異性で相互作用することができる関心対象のタンパク質(例えば、抗体、抗体模倣タンパク質、スキャフォールドタンパク質、レセプター)を発現する細胞をスクリーニングするための方法に関する。 本発明のその他の局面は、標的分子に対する高い(例えば、最も高いまたは最適化された)特異性を有する関心対象のタンパク質(例えば、高い、例えば、最も高いまたは最適化された、抗原に対する親和性を有する抗体)の濃縮に関する。 例示的な態様において、インビボまたはインビトロでビオチン化された宿主細胞をまず、可溶性アビジンの存在下でかつビオチン化されたリガンドまたは抗原とインキュベートする。 ある態様において、リガンドまたは抗原を、エピトープタグ(例えば、His6タグ(配列番号11))を用いて標識する。 その後、抗原をそれらの表面でディスプレイする細胞をインキュベートし、リガンドまたは抗原に対する親和性を有する関心対象のタンパク質(例えば、レセプター、抗体、酵素、スキャフォールドタンパク質、または任意のその他の関心対象のタンパク質)の分泌を可能にする。 抗原に結合した関心対象のタンパク質を発現する細胞を、分泌タンパク質、リガンド、またはその両方のレポーター部分に基づいて検出することができ、様々な方法で単離することができる。 ある態様において、分泌されるタンパク質またはリガンドはビオチン化されない。 ある態様において、細胞を、関心対象のタンパク質を検出するための関心対象のタンパク質に対する標識抗体かまたは検出可能な抗クラス抗体で標識し、かつ抗原に対する標識抗体かまたは抗原上のタグエピトープを認識する抗体で標識する。 あるいは、関心対象のタンパク質をエピトープタグ(例えば、Sigma AldrichからのFLAGペプチド)と融合させる場合、関心対象のタンパク質を分泌する細胞を、検出可能な抗エピトープ抗体(例えば、モノクローナル抗FLAG抗体)を用いて標識してもよい。 例えば、高レベルの関心対象のタンパク質を分泌する宿主細胞のリガンドまたは抗原に対する高い親和性または特異性(例えば、極めて高い親和性または特異性)を示す宿主細胞の選択を、多数回の細胞選別および細胞培養成長による増幅を用いて実行してもよい。 各々の回の選択は、蛍光などの検出可能な標識に基づいた細胞の選別を含む。 ある態様において、候補タンパク質のライブラリーを、表面にディスプレイされた抗原に結合するそれらの能力についてスクリーニングする。 ディスプレイされたタンパク質のそのリガンドまたは抗原に対する所望の親和性に応じて、ある範囲のリガンドまたは抗原の濃度を異なる回の選別に用いてもよい。 蛍光活性化細胞選別(FACS)系、磁気細胞選別系(MACS)、または任意のその他の好適な細胞の分離もしくは選別の技術を含む当技術分野において公知の方法のいずれかによって分離を行なってもよい。 本明細書に記載された技術を、2つまたはそれより多くの特性(例えば、発現、ディスプレイ、親和性、活性などのうちの2つまたはそれより多く)に基づいて細胞を選別し、スクリーニングし、選択し、かつ/または単離するのに使用し得るということが理解されるべきである。 ある態様において、1つまたは複数の特性に基づいて単離される細胞を、さらに評価してもよい(例えば、コードされる人工タンパク質を関心対象の1つもしくは複数の機能または特性についてアッセイしてもよい)。 例えば、細胞によってコードされたディスプレイされた人工タンパク質変異体の発現のレベルおよびまたは結合特性および/または酵素特性に基づいて細胞を単離してもよい。 その後、コードされたタンパク質を(例えば、細胞ディスプレイ系の文脈で、または宿主細胞からの単離および/もしくは精製の後に)1つまたは複数の類似または追加の特性について(例えば、インビトロアッセイで、非細胞環境で、および/または研究的もしくは薬学的な調製物として哺乳動物、例えば、ヒトなどの対象に投与した時に)アッセイしてもよい。 人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを評価するために、人工タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる。 ある態様において、宿主細胞の環境への薬剤の添加によって発現を誘導する。 人工タンパク質の発現は、人工タンパク質の第1の結合パートナーへの結合を介した人工タンパク質の細胞表面での固定化をもたらす。 本明細書に記載された態様のいずれかを用いて、第1の結合パートナーまたは標的分子が細胞表面に接続されていることを特徴とする、第1の結合パートナーまたは標的分子に結合した人工タンパク質を達成し、それにより人工タンパク質の固定化をもたらすことができる。 ひとたび固定化されれば、人工タンパク質を所定のタンパク質機能について評価することができる。 ある態様において、関心対象のタンパク質の変異体をコードする核酸のライブラリーを発現させ、所定の機能についてスクリーニングすることができる。 ある態様において、関心対象のタンパク質の変異体をコードする核酸を含む細胞のライブラリーを発現させ、所定の機能または特性についてスクリーニングすることができる。 関心対象のタンパク質の変異体をコードする核酸のライブラリーを多数の特性または機能についてスクリーニングすることができるということが理解されるべきである。 さらに、ライブラリーを、多数回の1つまたは複数の特性のスクリーニングに供し、その1つまたは複数の特性についてのライブラリーの濃縮を結果としてもたらすことができる。 タンパク質機能を評価するための方法は当技術分野において公知である。 ある態様において、人工タンパク質は、蛍光部分などのレポーター部分を含み、レポーター部分のシグナルを用いて、特異的なタンパク質機能を評価することができる。 タンパク質機能を評価するのに用いる特異的なアッセイは、評価されている特定のタンパク質機能による。 例えば、所定の機能がタンパク質安定性である場合には、固定化された人工タンパク質を、カオトロピック試薬にさらすかまたは上昇した温度にさらすことができ、タンパク質の物理的構造(例えば、タンパク質のフォールディング)の変化を観察することができ、その場合、より高い安定性は、より高いカオトロピック濃度でタンパク質のフォールディングを維持する能力と相関する。 タンパク質またはタンパク質変異体の安定性は、発現されたタンパク質の機能に決定的に重要な意味を持つ場合がある(例えば、単鎖抗体、例えば、Worn et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:2795−2803を参照されたい)。 タンパク質の安定性を評価するための標準的なアプローチは、例えば、走査熱量測定を用いてタンパク質の融解温度(T m )を測定することおよび/または例えば、グアニジン塩酸塩もしくは尿素による変性、続いで内部トリプトファン蛍光分析もしくは円二色性分析を用いて特異的な温度(例えば、25℃)でのアンフォールディングの自由エネルギー(ΔG)を測定することを含む。 熱安定性は、単鎖T細胞レセプターの分泌および酵母細胞表面ディスプレイと相関することが示されている(Shusta et al. J. Mol. Biol., 1999, 292:949−956および米国特許第6,300,065号)。 ある態様において、タンパク質またはタンパク質変異体の発現レベルの測定を用いて、より安定なタンパク質を選択してもよい。 本発明の局面によると、より安定なタンパク質はより高い発現レベルを有し、高度に発現したタンパク質(例えば、最初のタンパク質または参照タンパク質よりも高いレベルで発現するタンパク質)を単離することによって同定することができる。 ある態様において、発現レベルを、レポーター部分を用いてタンパク質を標識することによって決定し、細胞当たりまたは細胞表面積当たりの発現されたタンパク質の量を決定する。 より安定な変異体を発現する細胞の集団を、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって同定および単離してもよい。 最も高度に発現する集団をFACSで回収し、次回の選別に供し、それによってより安定なタンパク質変異体を発現する細胞を持つ集団を濃縮してもよい。 ある態様において、タンパク質変異体のライブラリーをタンパク質発現についてスクリーニングし、向上した生物物理学的特性(例えば、安定性)を持つタンパク質変異体を選択してもよい。 1つの態様において、対応する野生型タンパク質よりも少なくとも5倍、10倍、20倍、40倍、または50倍高い発現レベルを示すタンパク質変異体を選択する。 評価されるべき望ましい所定の機能がプロテアーゼに対する非感受性である場合、固定化されたタンパク質を増加濃度の1つまたは複数のプロテアーゼにさらすことができ、人工タンパク質の完全性をモニターすることができる。 所定の機能が、特異的な酵素活性などの生物学的機能である場合、その特定の酵素機能に適当なアッセイを行なうことができる。 酵素アッセイは当技術分野において日常的に行なわれており、当業者は特異的な酵素機能を評価するのにどのような酵素アッセイを用いるべきかということを知っていると考えられる。 タンパク質複合体の人工タンパク質は同じように処理される必要がないということが理解されるべきである。 例えば、タンパク質複合体の第1の人工タンパク質を宿主細胞に一時的に存在するベクターから発現させることができ、その一方でタンパク質複合体の第2の人工タンパク質を細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子から発現させる。 2つの人工タンパク質を同時に発現させることができるし、または第2の人工タンパク質の発現および固定化の前に第1のタンパク質を発現させ、細胞表面に固定化することができる。 ある態様において、第1の人工タンパク質を細胞表面に固定化し、第2のタンパク質を宿主細胞の環境に添加し、その後それが第1の人工タンパク質と相互作用してタンパク質複合体を形成する。 ある態様において、タンパク質複合体の人工タンパク質の1つがライブラリーの構成要素である一方で、第2の人工タンパク質はライブラリーの一部ではない。 この最後の態様は、第1の人工タンパク質のライブラリーの構成要素を、第2の人工タンパク質と共にタンパク質複合体を形成するかまたは特定の機能もしくは特定のレベルの活性を有する能力について評価することを可能にする。 ある態様において、分泌され、細胞表面にアンカーリングするようにタンパク質複合体の1つのタンパク質だけを人工的に改変するということが理解されるべきである。 細胞表面にアンカーリングされたタンパク質複合体の少なくとも1つのメンバーの存在を用いて、アンカーリングされたタンパク質と相互作用するタンパク質複合体のその他のメンバー(例えば、人工または非人工のタンパク質)を固定化してもよい。 本明細書に記載された技術を、2つまたはそれより多くの特性(例えば、発現、ディスプレイ、親和性、活性などのうちの2つまたはそれより多く)に基づいてタンパク質またはタンパク質複合体を評価し、選別し、スクリーニングし、選択し、かつ/または単離するのに使用し得るということが理解されるべきである。 細胞、タンパク質、タンパク質複合体についてのアッセイ、および/または本明細書に記載された基質解析はどれも、標準的な結合、検出、および/または酵素アッセイに基づき得るということが理解されるべきである。 例えば、ディスプレイのレベルは、レポーター分子(例えば、抗原および/もしくはエピトープ、検出可能な産物を産生する酵素レポーター、機能性レポーター、もしくは所定の発現および/もしくは活性のレベルに基づく定量化および/もしくは選択を可能にする任意のその他の検出可能もしくは選択可能なレポーター、またはその任意の組み合わせ)の検出に基づいてもよい。 ある態様において、基質の処理は、検出可能なシグナルまたはシグナルのレベルもしくは種類の変化を発生させる。 シグナルの性質は、基質の処理を評価するのに用いられる特異的なアッセイによると考えられる。 ある態様において、シグナルは蛍光シグナルである。 蛍光シグナルを、様々な処理方法によって発生させることができる。 蛍光シグナルの発生の非限定的な例は、蛍光部分を基質の中に取り込むこと、または蛍光部分を基質に共役することである。 本発明は、蛍光シグナルの消失、例えば、基質の処理による蛍光部分の基質からの除去に基づくアッセイ、および蛍光シグナルの変化に基づくアッセイも包含する。 蛍光シグナルの変化に基づくアッセイには、蛍光シグナルの変化が2つの蛍光部分の間の距離の変化に依存する、FRET(蛍光共鳴転移)も含まれる。 蛍光シグナルに基づくアッセイは、2次的な事象による蛍光シグナルの発生に基づくアッセイも包括する。 例えば、蛍光標識抗体を処理されている途中の基質に添加し、特定の基質特徴の出現/消失をモニタリングすることができる。 ある態様において、所定の機能は基質の処理を含む。 ある態様において、基質の処理は、シグナル(例えば、蛍光の変化、色の変化、または未処理の基質に元々取り込まれているそのようなシグナルの損失など)を結果として生じる。 ある態様において、基質の処理によって生み出されるシグナルを閾値レベルと比較する。 シグナルレベルを閾値レベルと比較することによって、所定の機能を持つ人工タンパク質の同定が促進される。 例えば、特定の基質処理事象についてのシグナルの閾値レベルが10であり、人工タンパク質をその特定の処理事象における能力について評価するならば、10よりも高いシグナルを持つ任意の人工タンパク質が候補人工タンパク質である。 対照的に、所望のタンパク質機能が、ある種の過程(例えば、望まない非特異的な副反応)についてより小さい活性を有することであるならば、10よりも低いシグナルを持つ人工タンパク質が候補人工タンパク質である。 ある態様において、閾値シグナルは、ランダムコイル構造を持つポリペプチドによって生み出されるシグナルである。 ある態様において、閾値シグナルは、野生型バージョンの人工候補タンパク質によって生み出されるシグナルである。 ある態様において、閾値シグナルは人工タンパク質の市販の変異体によって生み出されるシグナルである。 本明細書に記載された結合アッセイまたは基質アッセイのいずれかを用いて、1つまたは複数のより新しいまたは変更された特性または機能を有するタンパク質または標的分子の変異体を同定または選択し得るということが理解されるべきである。 例えば、増大した処理能力、より低いエラー率、増大した塩安定性および/もしくは熱安定性など、またはその任意の組み合わせを持つポリメラーゼを、本発明の局面に従って同定および/または単離してもよい。 本発明のライブラリーは、各々の宿主細胞が独自の人工タンパク質を発現することを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチド(例えば、同じ固定化ペプチド)に結合した独自のポリペプチドを含むことを特徴とする、宿主細胞のライブラリーを含む。 ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができるし、またはベクターは、自由に複製する、例えば、宿主細胞に導入されているが宿主細胞のゲノムには組み込まれていないプラスミドであることができる。 ライブラリーは、自由に複製するベクターおよび組み込まれたベクターを含む宿主細胞の組み合わせを含むこともできる。 本発明のライブラリーはまた、各々の宿主細胞がその表面に独自の融合タンパク質をディスプレイすることを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含むことを特徴とする、宿主細胞のライブラリーであってもよい。 ある態様において、ライブラリーは、細胞表面に固定化された高密度の人工タンパク質を持つ宿主細胞を提供する。 ある態様において、高密度は、多数の人工ポリペプチドを1つの結合パートナーに結合させることによって遂行される。 ある態様において、細胞当たりの人工タンパク質の数は、細胞当たり10 3個より多いか、10 4個より多いか、10 5個より多いか、10 6個より多いか、10 7個より多いか、または10 8個より多い人工タンパク質である。 ある態様において、固定化ペプチドはビオチン化ペプチドである。 ある態様において、固定化ペプチドは膜貫通タンパク質である。 ある態様において、固定化ペプチドはGPIアンカーを含む。 ある態様において、固定化ペプチドは、細胞表面に天然に存在するペプチドである。 ある態様において、固定化ペプチドは、細胞表面に天然に存在する1つまたは複数の分子(例えば、表面炭水化物または細胞表面のタンパク質)に結合するペプチドである。 本発明は、各々のベクターが独自の人工タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とし、各々の人工タンパク質が固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含みかつ/または修飾モチーフを含むことを特徴とする、ベクターのライブラリーも包含する。 本発明はまた、人工タンパク質のライブラリーを包含し、各々の人工タンパク質は固定化ペプチドに共役した独自のポリペプチドを含む。 本発明のライブラリーのいずれかにおいて、人工タンパク質は、治療的ポリペプチド、ポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、トポイソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝酵素、触媒酵素、治療的酵素、薬学的酵素、環境酵素、工業的酵素、薬学的ポリペプチド、環境ポリペプチド、工業的ポリペプチド、結合タンパク質、抗体、抗体断片、シグナル伝達分子、サイトカイン、レセプター、またはその任意の2つもしくはそれより多くの組み合わせを含むことができる。 ある態様において、抗体またはその他の結合タンパク質(例えば、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質など)のライブラリーを評価またはスクリーニングし、i)選抜された抗原および/もしくはエピトープおよび/もしくはその他の標的分子(例えば、新規の抗原および/もしくはエピトープ)に結合し、かつ/またはii)特定の抗原および/もしくはエピトープおよび/もしくはその他の標的分子に対する高い(例えば、増大した)親和性を有する変異体を同定および/または単離してもよい。 本発明の方法を、特定の抗原および/またはエピトープおよび/またはその他の標的分子に対する、約10 −7 M、約10 −8 M、約10 −9 M、約10 −10 M、約10 −11 M、約10 −12 M、約10 −13 M、約10 −14 M、または約10 −15 Mという解離定数によって表される結合親和性よりも大きい親和性を有する抗体またはその他の結合タンパク質を同定するように設計してもよい。 ある態様において、1つの抗体またはその他の結合タンパク質を標的分子のライブラリーに対してアッセイし、抗体またはその他の結合タンパク質に結合する1つまたは複数の標的ペプチド配列(例えば、新規のまたは修飾されたリガンド、抗原、エピトープ、レセプター、二量体化、多量体化、もしくはその他の結合モチーフ、またはタンパク質)を同定してもよい。 同様に、本発明の方法を、特定の抗体またはその他の結合タンパク質に対する、約10 −7 M、約10 −8 M、約10 −9 M、約10 −10 M、約10 −11 M、約10 −12 M、約10 −13 M、約10 −14 M、または約10 −15 Mという解離定数によって表される結合親和性よりも大きい親和性を有する標的ペプチド配列を同定するように設計してもよい。 本発明の1つの局面は、関心対象のタンパク質の宿主細胞でのディスプレイ、スクリーニング、および産生に関する。 1つの態様において、関心対象のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を選択し、ディスプレイモードから産生モードに切り換えてもよい。 ディスプレイモードでは、タンパク質変異体のライブラリーを宿主細胞の集団によって発現させ、細胞表面で固定化する。 上記のように、ディスプレイモードは、それらの発現レベル、安定性、または標的分子に対する親和性に基づくタンパク質変異体のライブラリーのスクリーニングおよびタンパク質変異体の選別を可能にする。 産生モードでは、ディスプレイモードで選択されたタンパク質変異体を発現する細胞が、細胞外の培地中に関心対象のタンパク質を分泌する。 ディスプレイのモードによっては、ディスプレイ系の結合パートナーのうちの1つの発現/ディスプレイ/添加を含む1つの工程を省略することにより、関心対象のタンパク質の細胞からの分泌をもたらすことができるということを理解すべきである。 例えば、関心対象のタンパク質がインビボでのビオチン化を受けて細胞表面でディスプレイされる必要がある場合には、(抑制、非誘導などにより)BirA遺伝子を発現させないことにより、ビオチン化されていない細胞壁タンパク質の発現またはビオチン化されていない関心対象のタンパク質の発現がもたらされ、関心対象のタンパク質の分泌がもたらされると考えられる。 ディスプレイ系がアビジンを細胞表面のビオチンに結合させる工程を含む場合には、アビジンを含まない培地中での細胞のインキュベーションにより、関心対象のタンパク質の分泌がもたらされると考えられる。 あるいは、宿主細胞表面タンパク質がインビトロで化学的にビオチン化される場合には、細胞を、ビオチンを含まない培地中でインキュベートすることによっても、関心対象のタンパク質の分泌が結果としてもたらされると考えられる。 細胞をディスプレイモードから産生モードに切り換える任意の方法が本発明によって包含される。 本発明の局面を、発現およびディスプレイ系の非限定的な態様に関する付随する図によって例説する。 例えば、図1〜2はインビボでビオチン化され、分泌され、細胞表面に付着したアビジンへの結合によって細胞表面にディスプレイされる人工タンパク質の態様を例説している。 図3〜4は、本発明の非限定的なディスプレイ法を用いた実験結果を提供している。 図5〜6は、本発明の方法および組成物を用いたタンパク質の修飾およびディスプレイのさらなる非限定的な例を例説している。 図7〜12は、本発明の組成物および方法を用いた抗体ディスプレイ適用の非限定的な例を例説している。 図13〜16は、本発明の組成物および方法を用いた基質ディスプレイアッセイの非限定的な例および実験結果を例説している。 本発明のこれらおよびその他の局面を以下の実施例によりさらに例説するが、それらは決してさらに限定するものとみなされるべきではない。 本出願の全体を通して引用された全ての参照(文献参照、公開された特許、公表された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む)の内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。 実施例1:細胞内ビオチン化によるタンパク質固定化 インビボでのタンパク質ディスプレイ法は、典型的には、タンパク質を細胞壁、細胞膜、またはファージ粒子のタンパク質との融合体として発現させることに依存している。 これらの昔からの方法に代わるものとして、タンパク質をベクターから発現させ、インビボでビオチン化してもよい。 その後、ビオチン化タンパク質を分泌させるか、またはビオチン化タンパク質が、ビオチンリンカーを介して細胞表面に付着しているアビジンに結合する可能性がある場合には、上清中に排出させてもよい。 この「ビオチン−アビジンサンドイッチ」により、ビオチン化タンパク質が細胞の表面に固定化される。 細胞に固定化されたタンパク質を蛍光標識し、表現型アッセイを行なって望ましい表現型を持つタンパク質を選択する。 望ましい表現型を持つ固定化されたタンパク質を持つ細胞を、フローサイトメトリーまたは固定化された抗原に対するパニングなどの別の形の選択によって単離する。 望ましい場合には、多数回の選択および単離を行なう。 単離された細胞を培養中で拡大し、望ましい表現型を持つタンパク質をコードする核酸を同定する。 任意で、N末端の分泌シグナルを真核細胞内での発現に用いる。 タンパク質を転写し、その後BirAビオチン化酵素の過剰発現によってビオチン化する。 次の工程で、タンパク質を上清中に分泌させるかまたは培地補充物の添加もしくは透過タンパク質の共発現によって行なわれる穏やかな細胞表面の透過処理によって排出させる。 最後に、ビオチン化タンパク質を、細胞表面に直接コンジュゲートされているかまたはビオチン−PEG−NHSリンカーもしくはビオチン化された細胞壁タンパク質を介して細胞表面にアンカーリングされている、アビジンによって細胞の表面に固定化する。 ビオチン化タンパク質人工改変系の一例の概要を図1および図2に示す。 その後、細胞を1 mL PBS/BSA中で3回洗浄し、50 ulの20 mg/mLアビジン中で10分間2回インキュベートした。 細胞を、3 mLのビオチンを含まないディスプレイ培地(30 μlの100 mg/mLアビジンを、3 mLの濾過滅菌したビオチンを含まないYPG/BSA/PEG(30重量%)と混合することにより作製)の中に植菌し、6ウェルプレートの2つのウェルの中で終夜30℃でインキュベートした。 細胞をウェルの底から1 mL PBS/BSAで洗い流し、沈降し、1 mLの冷PBS/BSAで3回洗浄した。 その後、細胞を50 μlの1:50希釈ニワトリ抗FLAG抗体中で20分間氷上でインキュベートした。 500 μl PBS/BSA中で洗浄した後、細胞を50 ulの1:100希釈ヤギ抗ニワトリAlexa633および5O nMビオチン−フルオレセイン中で20分間氷上でインキュベートした。 標識後、細胞を500 μl PBS/BSAで1回洗浄し、FACSで実験を行なった。 非発現細胞を内部陰性対照として用いて、(フローサイトメーター上のFLAG陽性集団によって示される)タンパク質捕捉が、タンパク質−BAP融合体のプラスミドを発現する細胞に限定されていることを示した。 FLAG発現とプラスミドの存在の間の特異的な関連を示すために、アビジン陽性/FLAG陽性集団をYPDプレート(非選択的な、リッチ培地)上に直接選別した。 2日後、FLAG/BAP融合体プラスミドを含む細胞にのみ選択的な培地上で、コロニーのレプリカ・プレーティングを行なった。 プラスミド陽性細胞が、全体として30倍の濃縮に当たる選別された細胞中の全集団の10%まで濃縮されていることが分かった。 この実験により、本明細書に記載されたディスプレイ法が、タンパク質人工改変用途に必要な表現型/遺伝子型の関連を実際に維持するということが示されている。 細胞をウェルの底から1 mL PBS/BSAで洗い流し、沈降し、その後1 mLの冷PBS/BSAで3回洗浄した。 細胞を1:20希釈の1 uM His6タグ付きIgG−A抗原中でインキュベートした。 その後、細胞を50 ulの1:50希釈のニワトリ抗FLAG抗体中で20分間氷上でおよび1:50希釈のマウス抗His6抗体中でインキュベートすることにより標識した。 細胞を500 μl PBS/BSAで1回洗浄し、その後50 μlの1:100希釈のヤギ抗ニワトリAlexa488および1:30希釈のヤギ抗マウスPEで20分間氷上でインキュベートした。 500 μl PBS/BSA中で洗浄した後、IgG−A抗原に結合している細胞をFACSで選別し、5 mL SD−CAA中に回収した。 細胞を拡大し、誘導し、選択アッセイにかけ、その後合計2回の選択になるようにもう1回選別した。 最後の選別からの細胞を拡大し、それらのDNAをシーケンシング用に調製した。 シーケンシング解析により、IgG−AクローンがIgG−B発現クローンよりも9,800倍濃縮されていたことが分かった。 全てのIgG発現細胞を2回の選択で採取する、等モルのクローンの混合物からなる対照も行ない、表面ディスプレイおよび選別とは無関係に起こった可能性のあるIgG−A選択を標準化した。 この対照により、そのような選択は起こらず、濃縮はIgG−A抗原の標識だけが原因であるということが示された。 形質転換後、酵母形質転換体を、10,000個の抗原B結合細胞に対して1個の抗原A結合scFvの細胞の割合で混合した。 混合物は、実施例3と同じ処置、一連の選択、および対照に従った。 抗原A結合酵母細胞は、2回のFACSによって110倍濃縮された。 ノコダゾールで処置しない細胞のうちの30%は、表面標識アビジンを保有しない。 これらの細胞はおそらく、それらの母親からアビジンを受け継がなかった娘細胞である。 20 ug/mLノコダゾールで処置した細胞は、5%の未標識アビジン細胞しか保有しなかった(図12)。 抗原および抗FLAG抗体による標識によって、ディスプレイされるタンパク質の発現および結合能力が処置によって最小限に乱されるということが示された。 さらに、200 mMおよび50 mM濃度のヒドロキシウレア、5 mM濃度のEGTA、ならびに25 uMのファルネソールの処置を用いて、同様の実験を実行した。 これらの処置も、量を変えることによってディスプレイされるタンパク質の発現または機能に重大な影響を与えることなく細胞分裂を遅らせた。 形質転換後、酵母形質転換体を、100個のあまり熱安定性でない突然変異体に対して1個のより熱安定性の突然変異体の割合で混合した。 混合物は、FLAGタグを標識して、選択用の基準として用いることだけを除き、実施例3と同じ処置、一連の選択、および対照に従った。 2回の選択の後、単離されたクローンの配列解析を行ない、より熱安定性のクローンがあまり熱安定性でないクローンよりも45倍濃縮されていることが明らかになった(図10)。 前述の書面の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分であると考えられる。 実施例は、本発明の1つの局面の1つの例説であることが意図されており、その他の機能的に同等の態様が本発明の範囲内であるので、本発明は、提供された実施例によって範囲が限定されるべきでない。 本明細書に示され、記載されたものに加えた本発明の様々な変更は、前述の説明から当業者に明白となり、付随する特許請求の範囲の範囲内に収まると考えられる。 本発明の利点および目的は、本発明の各々の態様に必ずしも包括的に含まれるわけではない。 本出願の全体を通して引用された全ての参照、特許、および公表された特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。 |