抑郁症生物标志物及其应用

申请号 CN201610922665.7 申请日 2016-10-18 公开(公告)号 CN106554998A 公开(公告)日 2017-04-05
申请人 深圳市康宁医院; 发明人 荣晗; 王明帮; 徐丹; 刘铁榜; 赵杰; 刘泱慧; 杨海晨; 张建;
摘要 本 发明 提供了 抑郁症 生物 标志物,包括糖解梭菌和嗜中温螺旋杆菌,还包括嗜二 氧 化 碳 噬细胞菌、绿色糖单孢菌、猫螺杆菌、 瘤胃 球菌属、 氨 基酸球菌、氨基酸球菌属和 发酵 型氨基酸球菌;本发明还提供了用于诊断抑郁症的 试剂 盒 ,以及 预防 或 治疗 抑郁症的组合物;本发明进一步提供了筛选易患抑郁症的生物样品的系统,通过此筛选系统,可筛选易患抑郁症的生物样品;本发明更进一步提供了用于诊断抑郁症的生物标志物的筛选方法,通过此方法可筛选出用于诊断抑郁症的生物标志物。
权利要求

1.生物标志物,其特征在于,包括糖解梭菌和嗜中温螺旋杆菌;
任选的,所述生物标志物还包括嗜二噬细胞菌;
任选的,所述生物标志物还包括绿色糖单孢菌;
任选的,所述生物标志物还包括猫螺杆菌;
任选的,所述生物标志物还包括瘤胃球菌属;
任选的,所述生物标志物还包括基酸球菌;
任选的,所述生物标志物还包括氨基酸球菌属;
任选的,所述生物标志物还包括发酵型氨基酸球菌。
2.权利要求1所述的生物标志物在筛选易患抑郁症的生物样品的系统中的应用。
3.一种试剂盒,其特征在于,包括适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂;
任选的,还包括分析所述生物标志物在体内是否异常的工具。
4.权利要求3的试剂盒在筛选易患抑郁症的生物样品的系统中的应用。
5.一种组合物,其特征在于,包括糖解梭菌和/或其代谢产物,以及嗜中温螺旋杆菌和/或其代谢产物;
任选的,所述组合物还包括瘤胃菌属和/或其代谢产物;
任选的,所述组合物还包括氨基酸球菌和/或其代谢产物;
任选的,所述组合物还包括氨基酸球菌属和/或其代谢产物;
任选的,所述组合物还包括发酵型氨基酸球菌和/或其代谢产物;
任选的,所述组合物还包括食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。
6.权利要求5所述的组合物在制备预防治疗抑郁症的产品上的用途;
任选的,所述的产品为药物或食品。
7.一种筛选易患抑郁症的生物样品的系统,其特征在于,包括:
核酸提取装置,所述核酸提取装置用于从所述生物样品中提取核酸样本;
核酸序列确定装置,所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连,用于对所述核酸样本进行分析,以便确定所述核酸样本的序列;以及
判断装置,所述判断装置与所述测序装置相连,基于所述核酸样本的序列对其肠道菌群所含的权利要求1所示的生物标志物进行分析,根据分析结果判断所述生物样品是否易患抑郁症;
任选的,所述核酸序列确定装置进一步包括:
文库构建单元,所述文库构建单元用于基于所述核酸样本,构建所述核酸的文库;以及测序单元,所述测序单元与所述文库构建单元相连,对所述文库进行测序,以便确定所述核酸样本的序列,
任选地,所述文库构建单元进一步包括:
PCR扩增模,所述PCR扩增模块中设置权利要求1所示的生物标志物的特异性引物,以便利用所述特异性引物,对所述核酸样本进行扩增。
8.一种用于诊断抑郁症的生物标志物的筛选方法,包括以下步骤:
1)分别收集抑郁症和正常人的粪便,提取粪便中的DNA;
2)将DNA建库测序,获得DNA测序结果;
3)根据DNA测序结果对肠道菌群进行分类并对菌群进行功能分析,获得功能分析结果;
4)根据功能分析结果统计菌群种类、丰度的差异,获得差异信息;
5)根据差异信息将其中具有显著差异的肠道菌种作为生物标志物;
所述生物标志物为权利要求1所示的生物标志物。

说明书全文

抑郁症生物标志物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域,具体地,本发明涉及抑郁症生物标志物及其应用。

背景技术

[0002] 抑郁症的核心症状是情绪低落、兴趣减退、精缺失,在全球范围内有超过3.5亿人患有抑郁症。世界卫生组织预测,到2020年,抑郁症将占据世界疾病负担的第二位。
[0003] 抑郁症对社会造成的重大负担,其原因有发病率高、发病年轻化、呈慢性发展、损害其社会功能和认知能力,及非自然死亡,抑郁症患者中自杀死亡与自杀未遂的比例远远高于在普通人群中的比值。因此研究抑郁症发病机理及可以体现其严重程度的生物标志物,并及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。
[0004] 关于抑郁症的发病机制及治疗原理目前尚不明确,既往认为遗传因素、生物学因素、心理社会因素对抑郁症的发生有一定的影响,
[0005] 上世纪提出的相关假说主要集中在神经内分泌系统中的下丘脑—垂体—肾上腺轴(hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA轴)、单胺类神经递质及受体、神经营养因子,细胞因子学说等。已有许多研究表明,应激可通过调节HPA轴从而影响机体神经递质及受体、神经营养因子以及细胞因子的表达平,而新的研究又表明,肠道微生物又可以调控HPA轴、细胞因子以及单胺类神经递质,此外,补充益生菌可以改善抑郁模型大鼠的抑郁行为,这些使研究者逐渐认识到肠道微生物与抑郁症的发病密切相关。
[0006] 目前,对于抑郁症的研究仍有待改进。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题是提供了抑郁症生物标志物;本发明还提供了用于诊断抑郁症的试剂盒,以及预防或治疗抑郁症的组合物;本发明进一步还提供一种筛选易患抑郁症的生物样品的系统以及一种用于诊断抑郁症的生物标志物的筛选方法。
[0008] 本发明第一方面提供了一种生物标志物,包括糖解梭菌和嗜中温螺旋杆菌。
[0009] 在一优选例中,所述生物标志物还包括嗜二噬细胞菌。
[0010] 在一优选例中,所述生物标志物还包括绿色糖单孢菌。
[0011] 在一优选例中,所述生物标志物还包括猫螺杆菌。
[0012] 在一优选例中,所述生物标志物还包括瘤胃球菌属。
[0013] 在一优选例中,所述生物标志物还包括基酸球菌。
[0014] 在一优选例中,所述生物标志物还包括氨基酸球菌属。
[0015] 在一优选例中,所述生物标志物还包括发酵型氨基酸球菌。
[0016] 本发明第二方面提供了所述的生物标志物在筛选易患抑郁症的生物样品的系统中的应用。
[0017] 本发明第三方面提供了一种试剂盒,包括适用于检测所述的生物标志物的试剂。
[0018] 在一优选例中,还包括分析所述生物标志物在体内是否异常的工具。
[0019] 本发明第四方面提供了所述试剂盒在筛选易患抑郁症的生物样品的系统中的应用。
[0020] 本发明第五方面提供了一种组合物,包括糖解梭菌和/或其代谢产物,以及嗜中温螺旋杆菌和/或其代谢产物。
[0021] 在一优选例中,所述组合物还包括瘤胃菌属和/或其代谢产物。
[0022] 在一优选例中,所述组合物还包括氨基酸球菌和/或其代谢产物。
[0023] 在一优选例中,所述组合物还包括氨基酸球菌属和/或其代谢产物。
[0024] 在一优选例中,所述组合物还包括发酵型氨基酸球菌和/或其代谢产物。
[0025] 在一优选例中,所述组合物还包括食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。
[0026] 本发明第六方面提供了所述的组合物在制备预防或治疗抑郁症的产品上的用途。
[0027] 在一优选例中,所述的产品为药物或食品。
[0028] 本发明第七方面提供了一种筛选易患抑郁症的生物样品的系统,包括:
[0029] 核酸提取装置,所述核酸提取装置用于从所述生物样品中提取核酸样本;
[0030] 核酸序列确定装置,所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连,用于对所述核酸样本进行分析,以便确定所述核酸样本的序列;以及
[0031] 判断装置,所述判断装置与所述测序装置相连,基于所述核酸样本的序列对其肠道菌群所含的权利要求1所示的生物标志物进行分析,根据分析结果判断所述生物样品是否易患抑郁症。
[0032] 在一优选例中,所述核酸序列确定装置进一步包括:
[0033] 文库构建单元,所述文库构建单元用于基于所述核酸样本,构建所述核酸的文库;以及
[0034] 测序单元,所述测序单元与所述文库构建单元相连,对所述文库进行测序,以便确定所述核酸样本的序列。
[0035] 在一优选例中,所述文库构建单元进一步包括:
[0036] PCR扩增模,所述PCR扩增模块中设置权利要求1所示的生物标志物的特异性引物,以便利用所述特异性引物,对所述核酸样本进行扩增。
[0037] 本发明第八方面提供了一种用于诊断抑郁症的生物标志物的筛选方法,包括以下步骤:
[0038] 分别收集抑郁症和正常人的粪便,提取粪便中的DNA;
[0039] 将DNA建库测序,获得DNA测序结果;
[0040] 根据DNA测序结果对肠道菌群进行分类并对菌群进行功能分析,获得功能分析结果;
[0041] 根据功能分析结果统计菌群种类、丰度的差异,获得差异信息;
[0042] 根据差异信息将其中具有显著差异的肠道菌种作为生物标志物;
[0043] 所述生物标志物为上述的生物标志物。
[0044] 在本发明中,术语“生物标志物”应做广义理解,其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标,可以包含基因标志物,物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(KO/OG标志物),其具有非常广泛的用途,可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。
[0045] 在本发明中,术语“糖解梭菌”源自拉丁文名称“Clostridium saccharobutyl icum”,也即图4出现的“糖解梭菌WM1”。
[0046] 在本发明中,术语“嗜中温螺旋杆菌”源自拉丁文名称“Heliobacterium mo desticaldum Ice1”,也即图4出现的“嗜中温螺旋杆菌Ice1”
[0047] 在本发明中,术语“嗜二氧化碳噬细胞菌”源自拉丁文名“Capnocytopchag a”,也即图4提及的“嗜二氧化碳噬细胞菌”。
[0048] 在本发明中,术语“绿色糖单孢菌”源自拉丁文名称“Saccharomonospora v iridis”,也即图4提及的“绿色糖单孢菌DSM 43017”。
[0049] 在本发明中,术语“猫螺杆菌”源自拉丁文名称“Helicobacter feli”,也即图4提及的“猫螺杆菌ATCC 49179”。
[0050] 在本发明中,术语“瘤胃球菌属”源自拉丁文名称“Ruminococcaceae”,也即图4提及的“瘤胃菌科”。
[0051] 在本发明中,术语“氨基酸球菌”源自拉丁文名称“Acidaminococcus intes tini”,也即图4提及的“氨基酸球菌属intestini”。
[0052] 在本发明中,术语“氨基酸球菌属”源自拉丁文名称“Acidaminococcus”,也即图4提及的“氨基酸球菌属”。
[0053] 在本发明中,术语“发酵型氨基酸球菌”源自拉丁文名称“Acidaminococcu s fermentans”,也即图4提及的“发酵氨基酸球菌”。
[0054] 本发明具有以下有益效果:
[0055] 本发明首次发现抑郁症的致病与糖解梭菌和嗜中温螺旋杆菌有关,因此将糖解梭菌和嗜中温螺旋杆菌作为抑郁症的检测标志物,这样抑郁症的诊断将不依靠主观经验判断,而是可以通过检测糖解梭菌和嗜中温螺旋杆菌,进行确诊,提高诊断准确率,简化诊断过程,且便于早期预测;而且由于糖解梭菌和/或其代谢产物,以及嗜中温螺旋杆菌和/或其代谢产物在抑郁症患者体内相比于健康人有明显减少,因此可将其制备成药品或食品应用于抑郁症的预防或治疗。附图说明
[0056] 图1是抑郁症组和对照组的菌群丰度分布情况的对比图,纵轴均取log10后的数据结果,每个点代表一个样品。
[0057] 图2是抑郁症组和对照组的菌群种类分布情况的对比图,纵轴均取log10后的数据结果,每个点代表一个样品。
[0058] 图3是抑郁症组和对照组的样本相似性和样本距离分析结果聚类图。
[0059] 图4是抑郁症组和对照组差异显著细菌热图。图中每列代表一个样品,每行代表有统计学差异(p<0.05)的菌种;左侧18例为抑郁症组,右侧24例为正常对照组;红色为低表达,蓝色为高表达。
[0060] 图5为抑郁症组和对照组的菌群功能通路热图。图中每列代表一个样品,每行代表有统计学差异(p<0.05)的不同功能通路;左侧18例为抑郁症组,右侧24例为正常对照组;红色为低表达,蓝色为高表达。

具体实施方式

[0061] 除非特殊说明,本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0062] 下面参考具体实施例和附图,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
[0063] 实施例1
[0064] 本实施例运用高通量测序,批量分析健康人群和抑郁症患者群的粪便样本。基于高通量测序数据,对健康人群与抑郁症患者群进行统计检验,从而确定与抑郁症患者群相关的特异性核酸序列。具体步骤如下:
[0065] 1.样品来源
[0066] 抑郁症组:选取自2015年1月到2016年在深圳市康宁医院就诊的诊及住院患者18名,其中男性10名,女性8名,患者年龄44.73±12.54岁,BMI指数为(22.59±3.76),总病程(94.18±64.97)月,发作次数(4.68±9.21)次。入组标准:①同时符合ICD-10及DSM-5单相抑郁的诊断标准;②年龄在30-65岁之间,发作次数2次及以上;③(汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)>17分;④小学以上文化;⑤18.5<BMI指数<24。排除标准:①合并躯体疾病及脑器质性疾病者;②合并轴I、轴II其他任何精神障碍人格障碍及物质滥用/依赖者(近两周内曾使用任何抗抑郁药物及抗精神病药物者);③近一月内使用长效抗精神病药物者或接受电休克治疗者(MECT);④妊娠及哺乳期妇女;⑤近1周内存在应激事件;⑥有内分泌疾病病史。
[0067] 对照组:在深圳市康宁医院周边社区选取健康志愿者24名,其中男14名,女10名,年龄44.73±12.54岁。排除近1周内有应激事件者及妊娠及哺乳期妇女。
[0068] 上述抑郁症组及对照组均要求两周内未曾应用抗生素和微生态制剂。
[0069] 依据问卷调查,抑郁症组及对照组在膳食结构、主食量、对油腻食物、高胆固醇食物、红肉白肉、蔬菜、水果、豆类、奶制品、发酵食品的偏好上无显著差异。两组患者在年龄、性别构成比及BMI指数差异均无统计学意义(t=0.07,p=0.94;χ2=0.096a,p=0.76;t=0.18,p=0.86),本研究经康宁医院伦理委员会审查通过,所有纳入的研究对象均签署知情同意书,测试前告知被试及监护人实验目的及测试内容,被试均为自愿参加,不愿参加者可中途退出,数据不纳入研究。
[0070] 2.粪便采集与DNA提取
[0071] 抑郁症组的门诊及住院患者在入组后24小时内样本采集完成。粪便收集在一个容量为30ml的带有旋转盖子的一个无菌的塑料盒中,收集大便约15克,编号登记后随即放入-80℃低温箱保存直到DNA提取。对照组粪便收集则在门诊体检完成后收集,处理同前。所有粪便标本收集完后采用北京康为世纪生物科技有限公司提供的产品货号为CW2092的粪便DNA提取试剂盒(StoolGen DNA kit)进行DNA的提取。
[0072] 3.宏基因组建库和枪法宏基因组测序
[0073] 取2ul已提取的DNA样品用美国赛默飞世尔公司提供的试剂盒(Qubit dsDNA BR assay kit)进行定量,文库(插入大小为200-500bp)应用美国Illumina公司生产的Truseq DNA建库试剂盒,该试剂盒连接在一个美国贝克曼库尔特公司生产的自动化SPRI工作站上。每个文库构建完成后,采用美国安捷伦科技公司生产的Agilent 2100生物分析仪进行质控(QC,quality control)。通过QC后,即文库浓度需在3ng/μl以上,该文库应用美国加州圣地亚哥Illumina公司提供的Illumina HiSeq 2500测序平台(150bp,双端测序)进行了深度测序,每个样本有1G以上的测序数据。
[0074] 4.菌群分类和基因功能注释
[0075] 首先,过滤掉接头序列和一些质量差的测序reads。其次,所有测定的序列均对照人类参考基因组Hg19以剔除人基因组序列。再次,采用最新的MEGAN软件(即MEGAN5)(http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan5/下载)对鸟枪法宏基因组数据进行菌群分类及基因功能分析。最后,分类分析和基因功能注释结果应用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html)和eggNOG数据库进行功能注释,得到的菌种和基因功能通路等数据用于后续的统计分析。
[0076] 5.统计学分析
[0077] 鸟枪法宏基因组测序得到的数据,菌群的丰度和种类进行独立T检验;菌群的丰度标准化(即均一化为一百万条测序序列)后分别应用wilcoxon秩和检验和DESeq2(DESeq2的使用可参考文献Love MI,Huber W,Anders S.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J].Genome Biology,2014,15(12):550)计算;KEGG注释的功能通路得到的数据采用wilcoxon秩和检验进行分析。
[0078] 结果:
[0079] 1.抑郁症组和对照组在菌群丰度上无明显差异,但抑郁症组菌群种类减少。
[0080] 通过测序所得的样品菌群丰度及种类情况(如图1和图2所示),采用独立T检验,抑郁症组和对照组在菌群丰度上没有明显差异(P值=0.744),但其在细菌种类水平上有差异(P值=8.676e-05),抑郁症组在细菌种类上要比对照组少。
[0081] 2.抑郁症组和对照组,各组内肠道菌群相似性较高,组间的相似度较低。
[0082] 为了对比抑郁症组和对照组的肠道菌群的组内和组间的差异,采用不同样本标准化后(即均一化为一百万条测序序列)的菌种数据,两个样本之间的相似性根据Jaccard系数来度量,样本A和B之间的Jaccard系数=(样本A∩样本B)/(样本A∪样本B),而两个样本之间的距离(distance)根据1-Jaccard系数来度量,作出如图3所示的聚类图,如两个样本之间的1-Jaccard系数值越小,即距离越小,在聚类图上就聚在一起,由图可知,抑郁症组的样本(D004、D78、N057、N61、N68、D055、D21、D60、D69、N62、D052、D66、D051、D72、D67、D053、D050、D82)很好的聚在了一起,这说明抑郁症组内的患者之间肠道菌群相似性较高,而对照组样本(图3中以NLM开头的样本)也很好的聚在了一起,这说明对照组内的相似性也较高,不过抑郁症组和对照组的样本之间的距离也较大,说明相似性较低。
[0083] 3.抑郁症组和对照组在菌群种类上有差异,检测到差异显著的菌种。
[0084] 为了找到差异显著的细菌,首先对菌种测序数据标准化后(即均一化为一百万条测序序列),用方差分析的方法,将得到的p值小于等于0.05的菌种,用DESeq2计算组间log2(case/control)差异绝对值不小于1的菌种,然后选择样品中菌群平均表达量不小于100的菌种,最后将这些菌种画出热图(如图4所示)。结果显示,氨基酸球菌、氨基酸球菌属、发酵型氨基酸球菌、糖解梭菌、瘤胃球菌属和嗜中温螺旋杆菌在抑郁症组中较少(p<0.05),而嗜二氧化碳噬细胞菌、绿色糖单孢菌和猫螺杆菌在抑郁症组中较多(p<0.05)。
[0085] 4.抑郁症组和对照组在菌群功能通路水平上有差异。
[0086] 为了进一步从细菌基因水平上检测抑郁症组和对照组的差异,本研究利用KEGG数据库对基因进行功能注释后,选取第三级的功能通路(kegg pathway level 3)的数据,先标准化后(即均一化为一百万条测序序列),然后进行方差分析,将差异显著(p≤0.05)的通路绘成热图(如图5所示),能发现一些在抑郁症组和对照组占比有差异的功能通路,既有抑郁症组的表达高于对照组,如泛酸酯和辅酶A合成、色氨酸代谢等通路。又有抑郁症组的表达低于对照组的,如P53信号通路等通路。
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