使用包含非天然氨基酸的蛋白质进行定向进化 |
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| 申请号 | CN200880118668.9 | 申请日 | 2008-10-31 | 公开(公告)号 | CN101878303B | 公开(公告)日 | 2014-04-30 |
| 申请人 | 斯克利普斯研究院; | 发明人 | C·刘; 曹梦麟; V·斯米德尔; P·G·舒尔茨; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供用于筛选多肽文库的方法，其中多肽文库包含携带非天然 氨 基酸的变体。另外，本发明还提供了用于将核酸 包装 在载体内的载体包装系统和方法。本发明还提供了利用该方法和系统制备的载体组合物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种根据一种或多种目的功能筛选多肽变体文库的方法，该方法包括： |
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| 说明书全文 | 使用包含非天然氨基酸的蛋白质进行定向进化[0001] 相关申请的交叉参考 [0002] 本申请要求如下美国临时专利申请的优先权和权益：Liu等人的美国临时专利申请系列号61/001,681，题目“使用包含非天然氨基酸的蛋白质进行定向进化”(Directed evolution using proteins comprising unnatural amino acids)，申请日2007年11月2日，Liu等人的美国临时专利申请系列号61/127,262，题目“使用包含非天然氨基酸的蛋白质进行定向进化”(Directed evolution using proteinscomprising unnatural amino acids)，申请日2008年5月8日，以及Liu等人的美国临时专利申请系列号61/194,773，题目“使用包含非天然氨基酸的蛋白质进行定向进化”(Directed evolution using proteins comprising unnatural amino acids)，申请日2008年9月29日，其内容已完整纳入本文作为参考。 [0004] 本发明得到了国立卫生研究所基金No.5R01 GM62159和国家科学基金会博士生助学金的政府资助。政府享有本发明的某些权利。发明领域 [0005] 本发明涉及蛋白质化学领域，例如，翻译生物化学。本发明涉及用于筛选含非天然氨基酸的多肽文库的方法和组合物。本发明还涉及用于制备载体的系统、组合物和方法，该载体包含已有非天然氨基酸插入其中的载体蛋白质和/或异源蛋白质。 [0006] 发明背景 [0007] 生命的几乎所有复杂过程，从光合作用到信号转导和免疫反应，都是由蛋白质来完成的。为了理解这些复杂的活动，了解蛋白质是如何通过与其他分子的相互作用来执行其功能将是有用的。多肽文库筛选技术是研究和操作这些分 子相互作用的非常有用的工具。一般来说，多肽文库的筛选依赖于表达多种多肽变体以及随后分离和扩增具有目的功能的那些变体，例如，可与特定配基结合的变体。但是，分离这种变体的关键在于保持文库的多样性。 [0008] 文库中多肽变体之间不同的表达率不利于文库多样性的保持，因此也不利于功能序列的筛选。例如，经过多轮筛选、分离和扩增以后某些高表达的变体在群体中的丰度提高不是因为它们符合筛选标准，而是因为它们具有生长优势而过量表达。因此，表达水平较低的理想变体所占比例下降甚至丢失。包含非天然氨基酸的多肽变体特别容易发生这种情况，因为内源性的体内表达偏好那些只包含天然氨基酸的蛋白质。 [0009] 本领域需要控制整个表达多肽变体群的表达水平的新策略，特别是包含带有非天然氨基酸的变体的群体，这样才能避免对群体内变体的多样性产生不良影响。本文所描述的本发明可满足这些以及其他要求，通过阅读下面的说明书将会明白这一点。 [0010] 发明概述 [0011] 带有独特官能团的非天然氨基酸以位点特异性的方式掺入到多肽内使制备具有增强的或新型的立体、化学或生物特性的多肽成为可能。通过筛选多肽文库可鉴定这种理想候选多肽，其中多肽文库包含带有非天然氨基酸的变体。但是，如果文库内的所有多肽变体的表达都不受控制，那么理想变体，尤其是那些包含非天然氨基酸的变体，所占比例将降低或丢失。 [0012] 目前需要用新的策略来调节整个表达的肽变体群的表达水平。本发明提供了用于多肽文库的新型组合物，该多肽文库包括含有非天然氨基酸的变体，以及用于筛选这种文库的新方法。另外，本发明还提供了用于包装新型载体的方法和系统，这种新型载体可用于建立上述多肽文库。 [0013] 本发明提供了根据一种或多种目的功能来筛选多肽变体文库的方法。该方法包括使文库内的一群多肽变体的表达标准化，这样表达的变体的平均比例为10∶1或更低。可选的是，表达的变体的比例为5∶1或更低，或者1∶1。该方法还包括从变体群中筛选具有目的功能的变体，这样所观察到的目的功能的差异就与变体活性的差异相关。文库可包含一群多肽变体，其中至少一个多肽变体 包含至少一个非天然氨基酸。可选的是，变体群中的每一个多肽变体都包含至少一个非天然氨基酸。多肽变体文库的筛选还可包括上述任何一种多肽变体文库的筛选。 [0014] 在该方法中，当变体的表达被标准化后筛选的敏感性可能会提高。筛选具有目的功能的变体包括在表达的变体的比例为1∶10或更低时筛选可检测的目的功能的差异。可选的是，筛选具有目的功能的变体包括在表达的变体的比例为1∶5或更低时筛选可检测的目的功能的差异。 [0015] 本发明还提供了包含一群表达的多肽变体的重组多肽表达文库。文库中表达的多肽变体还可包含上述任何一种多肽变体。变体群中的每一种变体在文库中所占的摩尔比例可以是10∶1或更低，5∶1或更低，或者1∶1。例如，重组多肽表达文库可包含一群重组M13来源的噬菌体，其中每一种噬菌体都在其外表面展示一种重组多肽变体，例如，抗体片段变体。可选的是，重组多肽表达文库可包含一群多价重组M13来源的噬菌体，其中每一种噬菌体都在其外表面展示一种以上的相同重组多肽变体，例如，抗体片段变体。 [0016] 可选的是，变体中至少有1种、至少2种、至少3种或3种以上的变体包含至少一个非天然氨基酸残基。可选的是，至少一种多肽变体包含至少一个非天然氨基酸残基、至少两个不同的非天然氨基酸残基，或者两个以上不同的非天然氨基酸残基。多肽变体还可以包含本文所述的任何非天然氨基酸。 [0017] 本发明还提供了核酸表达文库。核酸表达文库包含一群重组核酸表达构建物，这些构建物可被表达从而使构建物的多肽产物以10∶1或更低，5∶1或更低，或者1∶1的比例呈现在文库中。构建物表达的多肽产物还可以包含本文所述的任何一种多肽变体。 [0018] 至少一种表达构建物的编码区可包含至少一个选择者密码子，这样至少一个非天然氨基酸残基就可以被插入到至少一个多肽产物中。选择者密码子包括终止密码子、四碱基密码子、罕用密码子或非编码密码子。掺入到重组核酸表达构建物所表达的至少一个多肽产物内的非天然氨基酸残基还可以包括本文所述的任何非天然氨基酸。 [0019] 另外，本发明提供了包含一群多肽变体的表达产物文库。可选的是，多肽变体可包含本文所述的任何一种多肽变体。每一种多肽变体包含至少一个非天 然氨基酸。非天然氨基酸可以是本文所述的任何非天然氨基酸。变体可以10∶1或更低，5∶1或更低，或者1∶1的比例呈现在文库中。 [0020] 一种应用最广的筛选多肽变体文库的技术是噬菌体展示技术，利用上述方法和组合物很容易使用该技术。噬菌体展示是一种体外筛选技术，其中编码多肽变体的基因被融合到编码噬菌体包膜或衣壳蛋白的基因上。当基因表达时，其编码的融合蛋白就展示在噬菌体的外表面，而编码融合蛋白的核酸位于噬菌体自身内。噬菌体展示中的表型和基因型之间的物理联系是有优势的，这不仅因为它可以用于特异性地分离和扩增这些编码目的多肽变体的噬菌体，而且还因为它可以平行筛选大量的变体。在下文将要讨论的本发明的方面提供了用于载体装配的新型系统和方法以及可用于噬菌体展示的新型载体所用的组合物。 [0021] 本发明提供了包含载体核酸的新型载体包装系统。载体核酸包含或编码包装位点并且编码包含至少一个选择者密码子的靶多肽。可选的是，这个选择者密码子可与靶多肽编码的选择者密码子相同。在载体装配期间，包装多肽或特异性多肽可与载体核酸包装在一起，或者与载体核酸的一个拷贝或转录物包装在一起。另外，载体包装系统可以包含加载非天然氨基酸的正交tRNA(O-tRNA)。O-tRNA可识别靶多肽和/或包装或特异性多肽所编码的选择者密码子并且使其翻译。 [0022] 载体包装系统的载体核酸可编码包含融合蛋白的靶多肽。可选的是，融合蛋白可包括核糖体合成的抗体片段或其衍生物，和/或互补决定区(CDR)。可选的是，靶多肽和/或包装或特异性多肽所编码的选择者密码子包括终止密码子、四碱基密码子、罕用密码子或非编码密码子。载体包装系统的包装或特异性多肽可包含病毒衣壳或包膜蛋白，例如，M13噬菌体pIII衣壳蛋白。可选的是，载体包装系统可包含体外翻译系统。在另一个方面，载体包装系统还可包括细胞，例如哺乳动物、昆虫、细菌或大肠杆菌细胞。系统可包括正交氨酰-tRNA合成酶，能够将非天然氨基酸如联吡啶丙氨酸和非天然氨基酸如联吡啶丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、硫酪氨酸或对-乙酰苯丙氨酸。 [0023] 在一个实施方式中，载体包装系统包括含M13噬菌体包装序列的噬菌粒。噬菌粒可编码包含选择者密码子的融合蛋白，例如，包含带有至少一个选择者密码子的抗体片段的融合蛋白。载体包装系统还包含编码突pIII多肽的质粒， 该多肽含有至少一个选择者密码子，可选的是，该选择者密码子与融合蛋白的选择者密码子相同。突变pIII多肽可与一个拷贝的噬菌粒包装在一起。另外，载体包装系统还包含可加载非天然氨基酸残基的正交tRNA。加载的正交tRNA识别选择者密码子，然后载体包装系统使突变pIII多肽和抗体片段融合蛋白翻译。 [0024] 在一个相关方面，本发明提供了包含包装的核酸的载体以及包装的核酸编码的靶多肽，其中包装的核酸编码靶多肽。载体可包含病毒衣壳，可来源于哺乳动物病毒、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、昆虫病毒、杆状病毒或噬菌体，例如重组M13来源的噬菌体。包装的核酸可包含或编码包装位点，包装的核酸编码的靶多肽可包含融合蛋白，例如包含核糖体合成的抗体片段、其衍生物和/或互补决定区的融合蛋白。可选的是，靶多肽被展示在载体的外表面。另外，载体包含特异性多肽，它能将宿主细胞的特异性赋予载体，包含至少一个非天然氨基酸。可选的是，特异性多肽可包含病毒衣壳蛋白，例如，M13噬菌体pIII蛋白，或者病毒包膜蛋白。 [0025] 在另一实施方式中，载体包含编码靶多肽的包装的核酸以及包装的核酸编码的靶多肽，其中包装的核酸包含至少一个选择者密码子，靶多肽包含至少一个非天然氨基酸。可选的是，靶多肽被展示在载体的外表面。另外，载体包含能包装核酸或将宿主细胞的特异性赋予载体的包装多肽或特异性多肽。包装多肽或特异性多肽包含至少一个非天然氨基酸，可选的是，与靶多肽相同的非天然氨基酸。 [0026] 例如，载体可包含重组M13来源的噬菌体，该噬菌体包含编码融合蛋白的嗜菌粒，其中融合蛋白包含携带至少一个选择者密码子的抗体片段。载体还可包含融合蛋白，融合蛋白包含至少含有一个非天然氨基酸的抗体片段。融合蛋白可展示在重组M13来源的噬菌体的外表面。另外，载体可包含pIII多肽，其中包含至少一个与融合蛋白相同的非天然氨基酸，例如，本文所描述的任何非天然氨基酸。 [0027] 本发明提供了用于包装载体核酸的方法。该方法包括使载体核酸表达以制备包含至少一个非天然氨基酸的靶多肽以及使互补核酸表达以制备包含至少一个与靶多肽相同的非天然氨基酸的包装多肽或特异性多肽。该方法还包括使 载体核酸或其拷贝或者转录物与包装多肽或特异性多肽和靶多肽装配在一起从而包装载体核酸。 [0028] 在该方法中，被表达的载体核酸可包含或编码包装位点和带有至少一个选择者密码子的靶多肽。被表达的互补核酸可包含编码包装多肽或特异性多肽的互补核酸，其中包装多肽或特异性多肽包含至少一个与靶多肽相同的选择者密码子。载体核酸和/或互补核酸可利用多种方法表达，其中包括用载体核酸和/或互补核酸转化、转导、结合、稳定转染或瞬时转染细胞。表达载体核酸以制备靶多肽或者表达互补核酸以制备包装多肽或特异性多肽的过程包括诱导编码靶多肽和/或包装多肽或特异性多肽的RNA合成。 [0029] 使载体核酸或其拷贝或者转录物与包装多肽或特异性多肽和靶多肽装配在一起的过程包括，例如，培养携带载体核酸的大肠杆菌菌株，使大肠杆菌菌株携带的载体核酸表达以制备靶多肽，提供互补核酸，例如通过用携带互补核酸的辅助噬菌体感染大肠杆菌菌株，以及表达互补核酸以制备包装多肽或特异性多肽。包装载体核酸的过程包括使载体核酸与其他多肽如聚合酶、病毒基质蛋白或病毒核心蛋白装配在一起。该方法的步骤可以在细胞内执行，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞或大肠杆菌。 [0030] 例如，在一个实施方式中，用于包装载体质粒的方法包括表达载体质粒以制备包含抗体片段的融合蛋白。片段可包含至少一个非天然氨基酸。该方法包括表达互补质粒以制备包含至少一个与融合蛋白相同的非天然氨基酸的突变pIII蛋白。载体质粒的拷贝可与突变pIII蛋白和融合蛋白装配在一起，从而包装载体质粒。 [0032] 本领域的技术人员应当理解，本发明的提供的方法、试剂盒、系统和组合物可单独使用或者组合使用。例如，包含标准化表达产物文库，例如，每一种产物包含至少一个非天然氨基酸，可通过本文所描述的用于筛选多肽变体的一个或多个目的功能的任何方法筛选。技术人员应当理解本文所述的本发明特征的其他组合。 [0033] 定义 [0034] 在详细描述本发明之前，应当理解本发明并不限于特定的装置或生物学系统，当然也可以改变。还应当理解的是本文所用的术语只是用于描述特定的实施方式，并不意味着限制。在本说明书及附属权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“这个”也指复数形式，除非另外说明。因此，例如，“一种氨酰tRNA合成酶(RS)”包括两种或多种RS分子的组合，除非另外说明；“细菌”包括细菌的混合物，等等。 [0035] 除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同。尽管与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可用于实现本发明，但是本文描述的是优选材料和方法。在本发明的说明书和权利要求中，下列术语可与下文所述的定义一起使用。 [0036] 互补核酸：术语“互补核酸”是指编码包装多肽或特异性多肽的核酸。互补核酸例子包括重组M13来源的噬菌体M13KO7的基因组，该核酸编码用于M13噬菌体装配以及使M13噬菌体具有感染性的pIII蛋白。 [0037] 编码：在本文中，术语“编码”是指聚合物大分子或序列串内的信息用于指导与第一分子或序列串不同的第二分子或序列串的合成所依据的任何程序。在本文中，该术语用途广泛，具有多种用途。在某些方面，术语“编码”用于描述DNA半保守复制的过程，其中双链DNA分子的一条链用作模板，由DNA依赖性的DNA聚合酶编码合成新互补姊妹链。在另一方面，术语“编码”是指一个分子内的信息用于指导化学性质与第一分子不同的第二分子的合成所依据的任何程序。例如，DNA分子可编码RNA分子，例如，通过有DNA依赖性的RNA聚合酶参与的转录过程。另外，RNA分子可编码多肽，如翻译过程。当术语“编码”用于描述翻译过程时，该术语还指编码氨基酸的三联密码子。在某些方面，RNA分子也可编码DNA分子，例如，通过有RNA依赖性的DNA聚合酶参与的逆转录过程。在另一方面，DNA分子可编码多肽，此时“编码”应当被理解为既包括转录过程又包括翻译过程的情况。 [0038] 融合蛋白：在本文中，“融合蛋白”是指两个或多个核酸分子的表达产物，在天然状态下这些核酸分子不会一起表达形成一个表达产物。例如，包含亚单位A和亚单位B的天然蛋白X在天然状态下不会一起表达形成一个表达产物， 因此不是融合蛋白。但是，本领域熟知的重组DNA方法可用于使亚单位A和B一起表达形成一个表达产物，得到由亚单位A和亚单位B组成的融合蛋白。融合蛋白可包含异源氨基酸序列，例如，来源不同的氨基酸序列、功能不同的氨基酸序列，等等。 [0039] 文库：术语“文库”可根据其在本领域的通常用法使用，是指目的分子的集合。例如，多肽文库是指表达的多肽或多肽变体的集合。可选的是，本发明的多肽变体包含随机修饰的或特异修饰的残基，这样每一个文库包含或编码一组相关多肽，其中每个多肽的序列都彼此不同。相同的原则也适用于为筛选而建立的文库，如噬菌体展示文库。 [0040] 标准化文库：本文的术语“标准化文库”是指包含目的分子集合的文库，其中每一种分子的代表性就平均而言处于特定范围内，例如，与文库中其他分子的比例为约10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1或约0.9∶1。 [0041] 正交的：在本文中，术语“正交的”是指一种分子，如正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，与细胞的内源性组分一起行使功能时与细胞或翻译系统的相应分子相比其效率降低，或者与细胞的内源性组分一起无法行使功能。对于tRNA和氨酰tRNA合成酶来说，正交是指正交tRNA与内源性tRNA合成酶一起行使功能时和内源性tRNA与内源性tRNA合成酶一起形式功能相比，或者正交氨酰tRNA合成酶与内源性tRNA一起行使功能时和内源性tRNA合成酶与内源性tRNA一起形式功能相比，无效或效率降低，例如效率低于20％、10％、5％或1％。正交分子在细胞内缺乏正常内源性互补分子的功能。例如，与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比，细胞所有的内源性RS氨酰化细胞内的正交tRNA的效率都降低，或者效率为0。在另一个实施例中，与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比，正交RS氨酰化细胞的所有内源性目的tRNA的效率都下降，或者效率为0。第二“同源”正交分子可被导入细胞内与第一正交分子一起行使功能。例如，正交tRNA/RS对包括导入的互补组分，二者在细胞内一起行使功能，与对照正交对如相应的内源性tRNA/RS对或活性正交对如酪氨酰正交tRNA/RS对相比，其效率为对照的，例如，45％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或更高。因此，O-RS/O-tRNA对一起发挥功能时其效率较高，其中O-RS以适当的效率氨酰化 O-tRNA，而O-RS不能氨酰化内源性tRNA，或者至少氨酰化内源性tRNA的效率极低，而O-tRNA很难或根本无法被内源性RS氨酰化。 [0042] 包装位点：包装位点是载体核酸序列内的顺式调节元件，该位点可使载体核酸有效而特异地插入到正在装配的载体颗粒的内部，例如，病毒衣壳。 [0043] 包装多肽或特异性多肽：在本文中，术语“包装多肽或特异性多肽”是指构建病毒颗粒最外层结构和/或决定载体宿主范围的必要组分。包装多肽或特异性多肽的例子包括+在M13噬菌体装配和M13感染F 大肠杆菌中扮演关键角色的M13噬菌体pIII多肽，在λ噬菌体装配中扮演关键角色的λ噬菌体gpE以及保持疱疹病毒衣壳稳定性所必须的疱疹病毒VP5。 [0044] 多肽：多肽是指任何长度的，通常但不绝对是由共价肽键连接在一起的氨基酸残基(天然的或非天然的，或其组合)的任何寡聚物。多肽可以是任何来源的，例如，天然多肽、通过重组分子基因技术制备的多肽、细胞和翻译系统来源的多肽、或者以无细胞合成方式制备的多肽。多肽的特征由其氨基酸序列决定，例如，其组成氨基酸残基的一级结构。在本文中，多肽的氨基酸序列不限于全长序列，也可能是部分序列或完整序列。另外，这并不意味着根据拥有或不拥有任何特定生物活性来限制多肽。在本文中，术语“蛋白质”是多肽的同义词。术语“肽”是指小的多肽，例如而不限于2-25个氨基酸长度的多肽。 [0045] 选择者密码子：术语“选择者密码子”是指在翻译过程中能被O-tRNA识别但是不能被内源性tRNA识别的密码子。O-tRNA反密码子环可识别mRNA上的选择者密码子，将其氨基酸如非天然氨基酸插入到多肽的这个位点上。选择者密码子包括，例如无义密码子如终止密码子、琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子；四碱基或多碱基密码子；罕用密码子；天然或非天然碱基对来源的密码子和/或等等。 [0046] 特异性多肽：术语“特异性多肽”是指决定载体宿主范围的多肽。特异性多肽的例子包括使M13感染大肠杆菌的M13噬菌体pIII多肽和使λ噬菌体感染大肠杆菌的λ噬菌体J蛋白。 [0047] 靶多肽：在本文中，术语“靶多肽”是指载体核酸编码的多肽(例如，M13的pIII融合蛋白，杆状病毒的gp64融合蛋白，T7噬菌体的10b融合蛋白以及λ噬菌体内的D融合蛋白)。 [0048] 非天然氨基酸：在本文中，术语“非天然氨基酸”是指20个常见天然氨基酸或硒代胱氨酸或吡啶赖氨酸之外的任何氨基酸、修饰氨基酸和/或氨基酸类似物。例如，可用于本发明的非天然氨基酸联吡啶丙氨酸和磺酸酪氨酸。 [0049] 载体：“载体”是指包含核酸的组合物，载体可用于将游离核酸转移到宿主细胞内。本领域熟知的载体有很多，其中包括而不限于线性多聚核苷酸、与离子化合物或双亲性化合物相连的多聚核苷酸、噬菌体、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括而不限于可自主复制的质粒或病毒，可以是包装的或裸露的。病毒载体的例子包括而不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和其他重组病毒。 [0050] 载体核酸：在本文中，“载体核酸”是指编码靶多肽的核酸，其中核酸或其拷贝或转录物被包装到载体内部，通过载体可转移到宿主细胞内。 [0052] 图1是本发明所提供的载体包装系统的示意图。 [0053] 图2是能通过本发明提供的方法制备的载体的可选实施方式。 [0054] 图3是能通过本发明制备的载体的第二种可选实施方式。 [0055] 图4描述的是确定噬菌体是否能在其外表面展示Fab的试验所得到的结果。 [0056] 图5描述的是制备包含非天然氨基酸的Fab变体的三个文库所用的寡核苷酸序列。 [0057] 图6描述的是分离能结合镍树脂的Fab的筛选结果。 [0058] 图7a-d描述的是用于实施例2所描述的试验的四种非天然氨基酸的结构。图7e-f描述的是用于确定包含非天然氨基酸的scFv-pIII融合蛋白的试验结果，该融合蛋白可展示在实施例2所用的M13来源的噬菌体的表面。 [0059] 图8所描述的试验结果是从Keto-X-大肠杆菌(Keto-X-E.coli)、SY-X-大肠杆菌(SY-X-E.coli)、Bpy-X-大肠杆菌(Bpy-X-E.coli)或Boro-X-大肠杆菌(Boro-X-E.coli)pSEX-GermNNK文库表达噬菌体后包含TAG密码子的噬菌体克隆的百分率。 [0060] 图9所描述的试验结果是每毫升412d-2SY培养物内的噬菌体产量以及与之相比较的初始文库的噬菌体产量和第三轮筛选时的文库的噬菌体产量。 [0061] 图10描述的是噬菌体ELISA的结果，检测的是和选自412d掺杂文库的412d-2SY结合的gp120以及与之相比较的和412d-Y结合的gp120，其中412d-Y的磺酸酪氨酸被酪氨酸取代。 [0062] 图11a-b所描述的试验结果显示能结合gp120的克隆和包含非天然氨基酸磺酸酪氨酸的克隆在每一轮成功的筛选中都得到富集。 [0063] 图12所描述的试验结果是每毫升展示33CC8-Y的培养物内的噬菌体产量以及与之相比较的初始文库的噬菌体产量和第三轮筛选时的文库的噬菌体产量。 [0064] 图13描述的是ELISA试验的结果，该试验用于确定66CC8-SY、66CC8-Y、66CC14和412d-2SY与gp120的亲和力。 [0065] 图14a描述的是使用抗人κ轻链HRP抗体的G蛋白纯化的Fab的Western印迹分析结果，利用金属增强DAB试剂盒（Pierce）显色。样品用变性PAGE胶（Invitrogen NuPAGE4-12%Bis-Tris）电泳。对66CC8-SY和412d-SY来说，缺少磺酸酪氨酸的表达相应的泳道也显示硫化抗体的表达依赖于磺酸酪氨酸的存在。图14b-f描述的是Fab66CC14、 66CC8-SY、66CC8-Y、412d-SY和412d-Y的LCMS（ESI-阳性）光谱。图14g显示的是纯化的Fab412d-2SY、412d-Y、66CC8-SY、66CC8和66CC14所结合的gp120的ELISA检测结果。 [0066] 详细描述 [0067] 本发明利用体内表达天然不利于包含非天然氨基酸的多肽这一特征来构建标准化的多肽表达文库。由于这种天然偏好，文库内包含非天然氨基酸的多肽变体所占比例通常较低，丢失，或者在筛选目的功能的试验中无法检测到。然而，本发明依赖于至少一个与掺入可筛选基序内的非天然氨基酸相同的非天然氨基酸掺入到保持活性所需的多肽内，这样才能使文库内所有变体的表达达到标准化。 [0068] 本发明的方法和组合物可用于降低文库内高丰度多肽变体的冗余度，以及提高稀有变体所占的比例，例如，目的特性增强的包含非天然氨基酸的变体。由于保持文库的多样性是大多数多肽表达文库的构建和筛选过程中遇到的主要挑战之一，因此本发明可用于以及通常用于各种各样的原核、真核和古细菌 多肽文库筛选系统。 [0069] 在本文所述的一个优选实施方式中，本发明可用于噬菌体展示文库。这些文库包括，例如，包含至少一个非天然氨基酸的M13噬菌体pIII多肽，其中这个非天然氨基酸与展示的包含非天然氨基酸的pIII融合多肽变体的一个亚组所包含的非天然氨基酸相同。这种文库通常通过多轮筛选，其中显示目的功能，例如，与配基结合，的噬菌体可以被分离出来，并在细菌如大肠杆菌中扩增。本发明提供了可用于构建标准化多肽文库的新型载体的包装所用的方法和系统。 [0070] 多肽文库的标准化 [0071] 在一个方面，本发明涉及通过将至少一个与掺入可筛选变体内的非天然氨基酸相同的非天然氨基酸掺入到活性所需的多肽内从而使多肽文库内的变体的表达达到标准化。因此，文库内的每一个成员都用不利于生长的条件培养，但是通常只有包含非天然氨基酸的那些变体才会受影响。本发明提供的方法包括使文库内的一群多肽变体的表达达到标准化，可选的是，其中表达的变体的平均比例约为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、 1:1，或者，例如，约0.9:1。这些方法可用于蛋白质探测系统如λgt11，表面展示系统如噬菌体展示、杆状病毒展示、酵母细胞表面展示、哺乳动物细胞表面展示、昆虫细胞表面展示、大肠杆菌细胞表面展示，酵母和哺乳动物双杂交系统等。 [0072] 在一个优选实施方式中，噬菌体展示系统（Smith,G.P.（1985）“丝状融合噬菌体：在病毒粒子表面展示克隆抗原的新型表达载体）（“Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.”）Science,228:1315-7，综述见Sergeeva,A.等，（2006）“展示技术：在发现药物和基因转移试剂中的应用”（“Display technologies:application for the discovery of drug and gene delivery agents.”）Adv.Drug Deliv.Rev.58:1622-54）可用于本发明。在一个优选实施方式中，与掺入到噬菌体展示文库如重组M13来源的噬菌体展示文库的一个亚类的多肽变体内的非天然氨基酸残基相同的非天然氨基酸残基也被掺入到噬菌体包装多肽或特异性多肽内，如M13pIII多肽。由于噬菌体的活力部分依赖于包装多肽或特异性多肽如pIII向衣壳的装配，因此只包含天然氨基酸的多肽变体不在具有生长优势，这种生长优势可以使其在文库内的比例过高。与噬菌体展示实施方式有关的更大范围的讨论将在下文分别描述。 [0073] 在另一个有用的实施方式中，λgt11文库(Young，R.A.等，(1983)“利用抗体探针有效分离基因”(“Efficient isolation ofgenes by using antibody probes.”)Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：1194-8)所产生的包含非天然氨基酸的多肽变体的表达水平可根据相同的原则利用只包含天然氨基酸的那些变体进行标准化。在一个实施方式中，这可通过用编码功能性温度敏感cI突变株的等位基因替代编码cI857的λ噬菌体基因来完成，其中cI突变株也包含至少一个与文库中的变体所包含的非天然氨基酸一样的非天然氨基酸。 [0074] 通过用突变的等位基因，该突变等位基因可补充野生型基因的功能，其产生的蛋白包含至少一个与变体总所包含的非天然氨基酸相同的非天然氨基酸，取代酿酒酵母基本基因如PDA1的内源性拷贝可以使酵母双杂交(Y2H)“捕食者”文库的成员的表达水平达到标准化，该文库包含携带非天然氨基酸的变体。(有关酵母双杂交系统的详细描述见Fields，S.等，(1989)“一种用于检测蛋白-蛋白相互作用的新型遗传系统”(“A novel genetic system to detectprotein-protein interactions.”)Nature.340：245-246；Armour，C.D.等，(2005)“从药物到蛋白质：利用酵母遗传学进行高通量靶标筛选”(“From drug toprotein：using yeast genetics for high-throughput target discovery.”)Curr.Opin.Chem.Biol.9：20-24；以及Miller，J.，等，(2004)“利用酵母双杂交系统鉴定相互作用的蛋白质”(“Using the yeast two-hybrid system to identify interactingproteins.”)Methods Mol Biol.261：247-262)。在同一系统的另一种实施方式中，Y2H“捕食者”文库成员的标准化通过用互补等位基因替代UMP合成所必须的代谢基因URA1的内源性拷贝，并且在尿嘧啶营养缺陷型无法生长的条件下进行文库筛选来完成，其中互补等位基因包含至少一个与变体内所发现的非天然氨基酸相同的非天然氨基酸。 [0075] 在一个同样的方式中，多肽变体，例如哺乳动物细胞表面展示文库(Wolkowicz，R.等，(2005)“一种用于筛选通过逆转录载体而表达于哺乳动物细胞表面的模拟表位的融合到CCR5上的随机肽文库”(“A random peptide library fused to CCR5 for selection of mimeotopes expressed on the mammaliancell surface via retroviral vectors.”)J.Biol.Chem.，280：15195-15201)内的多肽变体表达的标准化可通过将编码包含至少一个非天然氨基酸的功能性氨基糖苷3’-磷酸转移酶蛋白的Neo等位基因导入到适当细胞系的基因组内来完成。细胞在添加庆大霉素的合适培养基中生长。细胞对庆大霉素的耐药性依赖于至少一个非天然氨基酸残基向氨基糖苷3’-磷酸转移酶内的掺入，这种非天然氨基酸残基与包含非天然氨基酸的可筛选多肽变体内的非天然氨基酸残基相同。在这个方式中，文库内每一个多肽变体的生长率及其相应的表达水平可以达到更高的同质化。 [0076] 本发明的这一方面用途广泛，同样也适用于标准化多肽变体表达水平的其他系统或技术，其中包括锚定的和少锚定子的胞质表达系统(美国专利号7,094,571)。在这个技术中，构建一个多肽变体文库并在革兰氏阴性细菌中表达，可选的是，其中的多肽以融合蛋白的形式锚定在内膜的胞质面，或者以多肽的形式靶向定位到胞质区室中。通过化学的、物理的、遗传学的方式或其他处理使细菌外膜通透化，这样就可以使多肽变体锚定到膜上，或者使多肽能够接近添加到外部溶液中的靶分子。当这种文库包含由非天然氨基酸残基组成的变体使，如本发明的非天然氨基酸残基，所有变体的表达都可以被标准化，例如，通过将包含非天然氨基酸的功能性β内酰胺酶的编码基因导入到合适的菌株内，然后在添加氨苄青霉素的培养基中筛选。 [0077] 噬菌体展示文库的标准化 [0078] 在一个优选实施方式中，本发明发现了噬菌体展示技术的用途，例如M13噬菌体展示技术，这是一种广泛应用于多肽文库筛选的技术。参见，例如，Smith，G.P.和Petrenko，V.A.(1997)“噬 菌 体 展 示”(“Phage Display.”)Chem.Rev.97：391-410；Sidhu，S.S.(2001)“用于噬菌体展示的经过改造的M13”(“EngineeringM13 for phage display.”)Biomolecular Engineering，18：57-63；Rodi，D.J. 和 Malakowski，L.(1999)“噬菌体展示技术—在分子大海中捞针”(“Phage-displaytechnology--finding a needle in a vast molecular haystack.”)Curr.Opin.Biotechnol.10：87-93； 以及Willats，W.G.T.(2002)“噬菌体展示：实用性及应用前景”(“Phage display： practicalities and prospects.”)Plant Molecular Biology， 50：837-854。一般来说，噬菌体展示文库中的多肽的展示通过使目的多肽变体与噬菌体衣壳(包被)蛋白或其片段或变体或者其他衣壳蛋白变体融合在一起来完成。这些衣壳蛋白包括pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX。为了证明本发明，本文的实施例描述了噬菌体展示的包含噬菌体pIII包被蛋白氨基酸序列的融合多肽的制备方法。但是，这并不意味着本发明只限于使用pIII多肽序列来展示重组M13-来源的噬菌体展示文库内的多肽变体。 [0079] 正如上面所讨论的，重组M13来源的噬菌体展示文库的标准化依赖于将文库内的每一个多肽变体都置于相同的不利生长条件下，这种生长条件通常只会对那些包含非天然氨基酸残基的变体产生影响。相应的，本发明的第一方面提供了新型载体包装系统，例如，用于包装重组M13来源的噬菌体，这种包装系统可以使至少一个非天然氨基酸被掺入到保持载体活力所必须的包装多肽或特异性多肽内，例如pIII蛋白，这种非天然氨基酸与组成文库的靶多肽内的非天然氨基酸相同，例如，pIII-多肽变体融合蛋白。本发明所提供的载体包装系统的一个实施方式在图1中有说明。图1所描述的实施方式包括载体核酸(100)、互补核酸(120)以及加载非天然氨基酸(135)的正交tRNA(O-tRNA)(130)。 [0080] 如图1所示，载体核酸包含或编码包装位点(105)，该位点可使载体核酸在病毒装配期间被包装到载体的内部。载体核酸还包含编码的靶多肽(110)，这种靶多肽可包含融合蛋白，例如，包含多肽变体的融合蛋白。可选的是，编码的靶多肽可包含至少一个选择者密码子(115)，这样表达出的靶多肽可能包含至少一个非天然氨基酸残基。 [0081] 如图1所示，载体包装系统的互补核酸编码包装多肽或特异性多肽(125)，可选的是，这种多肽可包括病毒衣壳或包膜蛋白，例如，保持病毒活力所必须的M13噬菌体pIII蛋白或其他蛋白。互补核酸包含至少一个选择者密码子(115)，这样，当包装多肽或特异性多肽表达时就会包含至少一个与包含非天然氨基酸的那些靶多肽内的非天然氨基酸相同的非天然氨基酸。 [0082] 相应的，如图1所示，载体包装系统还包括可加载非天然氨基酸(135)的正交tRNA(O-tRNA)(130)，这种O-tRNA可用于因响应编码的选择者密码子而将非天然氨基酸掺入到包装多肽或特异性多肽内，以及还可以掺入到靶 多肽内。非天然氨基酸向包装多肽或特异性多肽内的掺入可使载体文库内的所有靶多肽的表达水平都达到标准化，无论其氨基酸组成如何。 [0083] 在一个相关的方面，本发明提供了利用载体包装系统制备，例如，一组载体如重组M13来源的噬菌体，的方法，这一组载体组成了噬菌体展示文库。一般来说，该方法包括表达载体核酸以制备靶多肽，例如，pIII-多肽变体融合蛋白，可选的是，其中可包含非天然氨基酸，以及表达互补核酸以制备包含非天然氨基酸的包装多肽或特异性多肽，例如，pIII。该方法还包括使载体核酸的一个拷贝或一个转录物与包含非天然氨基酸的靶多肽和包装多肽或特异性多肽装配在一起，从而制备出一个载体，例如，重组M13来源的噬菌体。在这种方式中，由本发明所提供的方法制备的所有载体都置于相同的不利生长条件下，这种条件通常只会影响那些包含靶多肽的载体，其中靶多肽带有非天然氨基酸。 [0084] 本发明还提供了由上述系统和方法制备新型载体所需的组合物。图2和图3描述的是载体的一种可选实施方式，例如，组成标准化载体展示文库的噬菌体，如重组M13来源的噬菌体展示文库。图2描述的是包含包装的核酸(200)的的载体，其中包括编码的靶多肽(210)以及靶多肽(205)，例如，pIII-多肽变体融合蛋白。另外，图2中的载体包含特异性多肽(215)，例如，pIII，这种多肽包含至少一个非天然氨基酸残基(220)。图3描述的是各方面与图2所示的载体几乎完全一样的载体，只是图3所示载体的靶多肽(300)包含非天然氨基酸残基(305)。 [0085] 虽然下面所述的实施例使用了M13KO7噬菌体系统，但是这并不意味着本发明被限定于这个特定系统。本发明同样可使用其他噬菌体展示系统，其中包括T4(Jiang，J.等，(1997)“脑膜炎球菌PorA肽在噬菌体T4衣壳表面上的展示”(“Display of a PorA peptide from Neisseria meningitidis on the bacteriophageT4 capsid surface.”)Infect.Immun.65：4770-4777)、T7(Danner，S.等(2001)“T7噬菌体展示：一种用于从cDNA文库克隆RNA结合蛋白的新型基因筛选系统”(“T7phage display：A novel genetic selection system for cloningRNA-binding proteins from cDNA libraries.”)Proc.Natl.Acad.U.S.A.，98：12954-19959)、P4(Lindqvist，B.H.等(1995)“噬菌体P4的多肽提 呈”(“Peptide presentation by bacteriophage P4.”)FEMS Microbiol.Rev.，17：33-39)、以及λ噬菌体(Kong，B.等(2006)“人PPARγ的易凝集结合在λ噬菌体表面的展示”(“Display of aggregation-prone ligand binding domain of human PPAR gammaon surface of bacteriophage lambda.”)Acta Pharmacol.Sin.27：91-99。另外，本发明还可使用真核病毒展示系统，其中包括杆状病毒展示系统(综述见Oker-Blom，C.等(2003)“杆状病毒展示系统：用于真核文库和基因转移的新工具”(“Baculovirus display strategies：Emerging tools for eukaryotic libraries andgene delivery.”)Brief Funct.Genomic Proteomic.2：244-253，以及Makela，A.R.等(2006)“杆状病毒展示：用于基因转移和真核文库构建的多功能技术”(“Baculovirus display：a multifunctional technology for gene delivery andeukaryotic library development.”)Adv.Virus Res.68：91-112)、腺伴随病毒展示系统(Work，L.M.等(2006)“利用经过向性修饰的腺伴随病毒进行靶向到血管床的体内基因转移”(“Vascular Bed-Targeted in Vivo Gene Delivery UsingTropism-Modified Adeno-associated Viruses.”)Mol.Ther.13： 683-693)以及新出现的逆转录病毒展示系统(Urban，J.H.等(2005)“从逆转录病毒展示文库中筛选功能性的人抗体”(“Selection of functional human antibodies from retroviraldisplay libraries.”)Nucleic Acids Res.33：e35)。 [0086] 同样，为了证明本发明，下面所描述的实施例证实核糖体衍生的抗体片段的表达水平可在重组M13来源的噬菌体展示文库中达到标准化。这并不意味着本发明只限于标准化包含这个模式蛋白的变体的文库的表达水平。噬菌体展示的任何目的多肽文库的标准化，其中包括本文所列举的那些，都有利于筛选用于治疗和研究目的的各种各样的蛋白质。 [0087] 多价噬菌体展示文库的标准化 [0088] 本发明还可使用多价噬菌体展示文库，例如，多价M13噬菌体展示文库。如上所述，重组M13来源的噬菌体展示文库的标准化依赖于生长优势的去除，这种生长条件只允许那些只包含天然氨基酸的变体生长从而使其所占比例过高。但是，多价重组M13来源的噬菌体不包含包装多肽或特异性多肽，例如野生型pIII。当多价M13噬菌体被包装时，pIII-多肽变体融合蛋白是pIII的唯一来源。因而多价噬菌体展示文库的标准化可通过，例如，将至少一个相同的 非天然氨基酸掺入到文库内所有噬菌体共有的融合蛋白部分来完成，例如，包含pIII的部分，这种非天然氨基酸可掺入到融合蛋白的可变区部分，例如，包含可筛选多肽变体的部分。在这种方式中，多价噬菌体展示文库的所有多肽变体都置于相同的不利生长条件下，这种条件通常只影响那些展示含有非天然氨基酸残基的可筛选多肽变体的噬菌体。 [0089] 多价噬菌体展示文库的标准化可通过，例如，改变制备噬菌体如多价重组M13来源的噬菌体所需的生长条件来完成。例如，标准化的多价噬菌体展示文库可通过用嗜菌粒文库转化合适的大肠杆菌菌株来构建，其中大肠杆菌菌株包含编码6个拷贝的正交tRNA(O-tRNA)及其同源正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)的质粒，构建方法包括用超噬菌体感染菌株以及在包含过量浓度，如1-15mM，的非天然氨基酸，如磺酸酪氨酸(15mM)、对乙酰苯丙氨酸(6mM)、双吡啶丙氨酸(1mM)，的培养基中30℃培养感染的培养物过夜。这些生长条件可提高大肠杆菌菌株的倍增时间和渗透性，使翻译机器如加载有非天然氨基酸的O-tRNA与靶多肽的合成保持同步。这些生长条件可制备出标准化比例为5∶1的多价噬菌体文库，如多价重组M13来源的噬菌体文库，标准化比例是通过比较随机筛选的噬菌体的表达水平与那些展示不含非天然氨基酸的靶多肽的噬菌体的表达水平来确定的，其中随机筛选的噬菌体能展示包含一个或多个筛选子非天然氨基酸的靶多肽。 [0090] 正交翻译系统的组分 [0091] 在一个方面，本发明提供了用于制备抗体的组合物、系统和方法，其中抗体包含多肽，例如靶多肽如pIII-多肽变体融合蛋白，以及包含非天然氨基酸的包装多肽或特异性多肽，例如pIII。在另一方面，本发明提供了用于筛选包含携带非天然氨基酸的成员的多肽文库的组合物和方法。非天然氨基酸向这些多肽内的掺入可利用识别理想非天然氨基酸并根据选择者密码子(例如，琥珀无义密码子，TAG)将其掺入到蛋白质内的正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)来完成。这些正交组分不与宿主细胞如大肠杆菌细胞翻译机器的内源性组分或者天然氨基酸发生交叉反应。本文的一个实施例中所用的正交组分包括O-RS，例如扬氏产甲烷球菌来源的O-RS，和O-tRNA，例如，突变的酪氨酰tRNACUA琥珀抑制子，二者可在宿主细胞如大肠杆菌内作为正交对发 挥功能。 [0092] 在本文中，非天然氨基酸是指除硒代胱氨酸和/或吡咯酪氨酸以及20种遗传编码的α氨基酸之外的任何氨基酸、修饰的氨基酸或氨基酸类似物。参见，例如，L.Stryer的《生物化学》(Biochemistry)，第3版，1988，Freeman andCompany，New York，其中有20种氨基酸的结构。本发明的非天然氨基酸的侧链基团与天然氨基酸不同，尽管非天然氨基酸也可能是20种用于蛋白合成的α氨基酸之外的天然化合物。本文所用的非天然氨基酸包括O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基(alkynl)、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物(boronate)、磷、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸，或其任何组合；带有光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；带有新型官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光束缚的和/或光敏异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或糖修饰的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；带有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等；含碳连接的糖的氨基酸；具有氧化还原活性的氨基酸；含α-羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α，α二取代氨基酸；β-氨基酸；以及脯氨酸之外的环状氨基酸。 [0093] 本发明还可包括多个O-tRNA/O-RS对。例如，本发明还包括其他的O-tRNA/O-RS对，其中第二O-RS优先用第二非天然氨基酸氨酰化第二O-tRNA，第二O-tRNA识别第二选择者密码子。多个不同的选择者密码子，例如，独特的三碱基密码子、无义密码子如终止密码子，例如琥珀密码子(UAG) 或乳白密码子、非天然密码子、至少一个四碱基密码子、罕用密码子等，可被掺入到基因内，例如，载体核酸和/或互补核酸的编码序列。多个正交tRNA/合成酶对可利用这些不同的选择者密码子同时掺入多个非天然氨基酸，例如，其中包括至少一个非天然氨基酸。 [0094] 虽然本发明所用的正交翻译系统组分可利用培养的宿主细胞制备包含非天然氨基酸的蛋白，但是这并不意味着本发明一定要求用完整的活宿主细胞。例如，本发明的正交翻译系统组分可利用细胞提取物中存在的无细胞系统。利用无细胞的体外转录/翻译系统制备蛋白确实是一项已经成熟的技术。利用本文所述的正交翻译系统通过这些体外系统制备包含非天然氨基酸的蛋白也在本发明的范围内。 [0095] 适用于制备包含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的O-tRNA和/或O-RS、非天然氨基酸、选择者密码子和正交翻译系统的制备方法和/或改变其特异性的方法通常在如下文献中有描述，例如，名称为“用于制备正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶对的方 法和 组 合 物”(“METHODS AND COMPOSITION FOR THEPRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASEPAIRS；”)的国际专利出版号WO 2002/086075；名称为“非天然氨基酸的体内掺入”(“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS；”)的WO 2002/085923以及名称为“扩展真核遗传密码子”(“EXPANDING THEEUKARYOTIC GENETIC CODE；”)的WO 2004/094593；申请日为2004年7月7日的WO 2005/019415；申请日为2004年7月7日的WO 2005/007870以及申请日为申请日为2004年7月7日 的WO 2005/007624。所有这些申请都已完整纳入本文作为参考。也可参见，Wang和Schultz“扩展遗传密码子”(″Expanding the Genetic Code，″)Angewandte Chemie Int.Ed.，44(1)：34-66(2005)；Deiters等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15：1521-1524(2005)；Chin等，J.Am.Chem.Soc.2002，124，9026-9027；以及申请日为2005年9月20日的国际专利出版号WO2006/034332，其内容都已完整纳入本文作为参考。其他细节可见于美国专利号No.7,045,337；No.7,083,970；No.7,238,510；No.7,129,333； No.7,262,040；No.7,183,082；No.7,199,222；以及No.7,217,809。 [0096] 目的蛋白和多肽 [0097] 包含带有非天然氨基酸的成员的标准化多肽变体文库的制备和筛选方法是本发明的一个特征。非天然氨基酸的掺入可通过，例如，修饰多肽的结构和/或功能来完成，如改变多肽的大小、酸性、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点的可及性、掺入标记物或活性基团等。包含非天然氨基酸的多肽的催化活性或物理特性得到改善，甚至获得了完全不同的催化或物理特性。例如，可选的是，下列特性可通过将非天然氨基酸插入到多肽内加以修饰：毒性、电特性性、结构特性、分光特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期、与其他分子的反应能力如共价的或非共价的，等等。参见，例如，Dougherty(2000)“非天然氨基酸用作蛋白质结构和功能的探针”(“Unnatural Amino Acids asProbes of Protein Structure and Function，”)Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。所有这些都包含能通过筛选标准化多肽文库而加以鉴定的目的特性或功能。然而，本发明并不局限于只筛选上面所列的那些特性。 [0098] 在某些方面，多肽文库内的变体可包含至少1个，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个或更多个非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同也可以不同，例如，可以是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个不同非天然氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个不同蛋白位点。虽然我们并不想鉴定数百个已知的多肽文库，但是这些文库的所有成员都可以被修饰以使其包含一个或多个非天然氨基酸，例如，通过改变任何已有的突变方法将一个或多个合适的选择者密码子掺入到相关的翻译系统内。已知蛋白的公共序列库包括GenBank EMBL、DDBJ和NCBI。 通过检索因特网可以很容易地找到其他序列库。 [0099] 包含在文库内的可被修饰从而包含一个或多个非天然氨基酸的治疗性、诊断性以及其他可筛选多肽变体的例子包括而不限于下列文献所包含的那些：申请日为2004年4月16日、名称为“扩展真核遗传密码子”(“Expanding theEukaryotic Genetic Code；”)的国际专利出版号WO 2004/094593；以及名称为“非天然氨基酸的体内掺入”(“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS.”)的WO 2002/085923。文库内的可被修饰从而包含一个或多 个非天然氨基酸的治疗性、诊断性以及其他多肽变体的例子包括而不限于，例如，抗体变体、抗体片段变体、α-1抗胰蛋白酶变体、血管抑素变体、抗溶血因子变体、脱辅基载脂蛋白变体、载脂蛋白变体、心钠素变体、心房利钠多肽变体、心房肽变体、C-X-C趋化因子变体、T39765变体、NAP-2变体、ENA-78个变体、Gro-a变体、Gro-b变体、Gro-c变体、IP-10变体、GCP-2变体、NAP-4变体、SDF-1变体、PF4变体、MIG变体、降钙素变体、c-kit配体变体、细胞因子变体、趋化因子变体、单核细胞化学引诱物蛋白-1变体、单核细胞化学引诱物蛋白-2变体、单核细胞化学引诱物蛋白-3变体、单核细胞炎性蛋白-1α变体、单核细胞炎性蛋白-1β变体、RANTES变体、I309变体、R83915变体、R91733变体、HCC1变体、T58847变体、D31065变体、T64262变体、CD40变体、CD40配体变体、c-kit配体变体、胶原变体、集落刺激因子(CSF)变体、补体因子5a变体、补体抑制因子变体、补体受体1变体、细胞因子变体、上皮细胞中性粒细胞激活肽-78变体、GROα变体、MGSA变体、GROβ变体、GROγ变体、MIP1-α变体、MIP1-β变体、MCP-1变体、表皮生长因子(EGF)变体、上皮细胞中性粒细胞激活肽变体、促红细胞生成素(EPO)变体、去角质毒素变体、因子IX变体、因子VII变体、因子VIII变体、因子X变体、成纤维细胞生长因子(FGF)变体、纤维蛋白原变体、纤连蛋白变体、G-CSF变体、GM-CSF变体、葡萄糖脑苷脂酶变体、促性腺激素变体、生长因子变体、生长因子受体变异、Hedgehog蛋白变体、血红蛋白变体、肝细胞生长因子(HGF)变体、水蛭素变体、人血清白蛋白变体、ICAM-1变体、ICAM-1受体变体、LFA-1变体、LFA-1受体变异、胰岛素变体、胰岛素样生长因子(IGF)变体、IGF-I变体、IGF-II变体、干扰素变体、变体干扰素-α变体、干扰素-β变体、干扰素-γ变体、白细胞介素变体、IL-1变体、IL-2变体、IL-3变体、IL-4变体、IL-5变体、IL-6变体、IL-7变体、IL-8变体、IL-9变体、IL-10变体、IL-11变体、IL-12变体、角质化细胞生长因子(KGF)变体、乳铁蛋白变体、白血病抑制因子变体、荧光素酶变体、神经营养因子(Neurturin)变体、中性粒细胞抑制因子(NIF)变体、抑瘤素M变体、成骨蛋白变体、癌基因产物变体、甲状旁腺激素变体、PD-ECSF变体、PDGF变体、肽类激素变体、人生长激素变体、多效生长因子(Pleiotropin)变体、蛋白A变体、G蛋白变体、致热外 毒素A、B或C变体、松弛素变体、肾素变体、SCF/c-kit变体、可溶性补体受体I变体、可溶性I-CAM变体、可溶性白细胞介素受体变体、可溶性TNF受体的变异、生长调节素变体、生长抑素变体、生长激素变体、链激酶变体、超抗原变体、葡萄球菌肠毒素变体、SEA变体、SEB变体、SEC1变体、SEC2变体、SEC3变体、SED变体、SEE变体、类固醇激素受体变体、超氧化物歧化酶变体、中毒性休克综合征毒素变体、胸腺素α1变体、组织纤溶酶原激活物变体、肿瘤生长因子(TGF)变体、TGF-α变体、TGF-β变体、肿瘤坏死因子变体、肿瘤坏死因子α变体、肿瘤坏死因子β变体、肿瘤坏死因子受体(TNFR)变体、VLA-4蛋白变体、VCAM-1蛋白变体、血管内皮生长因子(VEGEF)变体、尿激酶变体、Mos变体、Ras变体、Raf变体、Met变体、p53变体、Tat变体、Fos变体、Myc变体、Jun变体、Myb变体、Rel、雌激素受体变体、孕酮受体变体、睾酮受体变体、醛固酮受体变体、LDL受体变体、炎性分子变体、信号转导分子变体、转录激活物变体、转录抑制物变体、透明质素(hyalurin变)体、CD44变体和皮质酮变体。 [0100] 许多纯化/蛋白纯化方法都是本领域熟知的，可用于纯化和分析基于标准化多肽文库的筛选而鉴定出的多肽变体。这些技术以及分析多肽所需的其他技术包括下列文献所描述的那些：R.Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，182卷：蛋白质纯化指导(Guide to Protein Purification)，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana(1997)《蛋白质的生物分离》(Bioseparation of Proteins)，Academic Press，Inc.；Bollag等(1996)《蛋白质方法》(Protein Methods)，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)《蛋白质方法手册》(The Protein ProtocolsHandbook)Humana Press，NJ；Harris和Angal(1990)《蛋白质纯化应用：实用方法》(Protein Purification Applications：A Practical Approach)IRL Press atOxford，Oxford，England；Harris和Angal《蛋白质纯化方法：使用方法》(ProteinPurification Methods：A Practical Approach)IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes(1993)《蛋白质纯化：原理和实践》(Protein Purification：Principles and Practice)，第3版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)《蛋白质纯化：原则、高分辨率方法及应用》(Protein Purification：Principles， High Resolution Methods and Applications)，第2版，Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)《储存在CD-ROM上的蛋白质方法》(Protein Protocols onCD-ROM)，Humana Press，NJ；以及本文所引用的参考文献。 [0101] 制备目的多肽的突变衍生物 [0102] 本文所述的目的蛋白和多肽的突变衍生物可通过标准方法制备，例如，制备一群组成标准化多肽文库的变体。有关变体形式的其他信息参见Sambrook和Ausubel，以及《PCR方法，方法和应用指导》(PCR Protocols A Guide toMethods and Applications)(Innis等编辑)，Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)。下面的出版物和参考文献提供了有关变体形式的其他细节：Arnold等(1993)“经过工程改造可用于罕见环境的蛋白质”(“Protein engineeringfor unusual environments.”)Current Opinion in Biotechnology 4：450-455；Bass等(1988)“具有新型DNA结合特异性的突变Trp抑制因子”(“Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities.”)Science242：240-245；Botstein&Shortle(1985)“体外诱变的策略和应用”(“Strategies and applications ofin vitromutagenesis.”)Science 229：1193-1201；Carter(1985)“利用M13载体改良寡核苷酸定向诱变”(“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13vectors.”)Nucl.Acids Res.13：4431-4443；Carter等(1986)“定向诱变”(“Site-directed mutagenesis.”)Biochem.J.237：1-7；Carter(1987)“利用M13载体改良寡核苷酸定向诱变”(“Improved oligonucleotide-directed mutagenesisusing M13 vectors.”)Methods in Enzymol.154：382-403；Dale等(1996)“利用磷硫酰方法进行寡核苷酸定向随机诱变”(“Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method.”)Methods Mol.Biol.57：369-374；Eghtedarzadeh & Henikoff(1986)“利用寡核苷酸制备大片段缺失”(“Use ofoligonucleotides to generate large deletions.”)Nucl.Acids Res.14：5115；Fritz等(1985)“突变的寡核苷酸定向构建：无需体外酶催化反应的缺口双螺旋DNA方法”(“Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro.”)Nucl.Acids Res.16：6987-6999； 等(1985)“通 过微量“鸟枪”基因合成进行寡核苷酸定向诱变“(“Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis.”) Nucl.Acids Res.13： 3305-3316；Kunkel，“寡核苷酸定向诱变的效率”(“Theefficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，”)，见《核酸与分子生物学》(Nucleic Acids & Molecular Biology)(Eckstein，F. 和 Lilley，D.M.J. 编 辑，SpringerVerlag，Berlin))(1987)； Kunkel(1985)“无需表型筛选的快速而有效的位点特异性诱变”(“Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection.”)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：488-492(1985)；Kunkel等，“无需表型筛选的快速而有效的位点特异性 诱 变”(“Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection，”)Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Kramer 等 (1984)“利 用 缺口双螺旋DNA方法构建寡核苷酸定向突变”(“The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction.”)Nucl.Acids Res.12：9441-9456； Kramer&Fritz“通过缺口双螺旋DNA构建寡核苷酸定向突变”(“Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA，”)Methods in Enzymol.154： 350-367(1987)；Kramer等(1984)“点错配修复”(“Point Mismatch Repair.”)Cell 38： 879-887；Kramer等(1988)“缺口双螺旋DNA方法中改良的体外酶催化反应用于构建寡核苷酸定向突变”(“Improved enzymatic in vitro reactions in the gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations.”)Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Ling等 (1997)“DNA 诱 变 方 法：概 述”(“Approaches to DNA mutagenesis：an overview.”)Anal Biochem.254(2)：157-178；Lorimer 和Pastan.(1995)Nucleic Acids Res.23：3067-8；Mandecki(1986)“大肠杆菌质粒中双链缺口的寡核苷酸定向修复：一种位点特异性诱变方法”(“Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia coli：a method for site-specific mutagenesis.”)Proc.Natl.Acad.Sci.U.A.A.83：7177-7181；Nakamaye & Eckstein(1986)“磷硫酰基团对限制性内切酶Nci I裂解的抑制作用及其在寡核苷酸定向诱变中的应用“(“Inhibition ofrestriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and itsapplication to oligonucleotide-directed mutagenesis.”)Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Nambiar等(1984)“核酸酶S蛋白编码基因的全合成和克隆”(“Totalsynthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein.”)Science 223：1299-1301；Sakamar 和 Khorana(1988)“牛视杆外片段鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导素)a亚单位的基因的全合成和表达”(“Total synthesis and expressionof a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-bindingprotein(transducin)”)Nucl.Acids Res.14： 6361-6372；Sayers 等 (1988)“Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.”Nucl.Acids Res.16：791-802；Sayers 等(1988)“在溴化乙锭存在的条件下通过与限制性内切酶反应链特异性地裂解含磷硫酰 的 DNA”(“Strand specificcleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restrictionendonucleases in the presence of ethidium bromide.”)Nucl.Acids Res.16：803-814；Sieber 等 (2001)Nature Biotechnology 19：456-460； Smith(1985)“体 外 诱 变”(“In vitro mutagenesis.”)Ann.Rev.Genet.19：423-462； Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)； Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；Taylor等(1985)“限制性内切酶反应中使用磷硫酰修饰的DNA来制备裸DNA”(“The use of phosphorothioate-modified DNA inrestriction enzyme reactions to prepare nicked DNA.”)Nucl.Acids Res.13： 8749-8764；Taylor等(1985)“利用磷硫酰修饰的DNA以高频率快速制备寡核苷酸定向突 变”(“The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations athigh frequency using phosphorothioate-modified DNA.”)Nucl.Acids Res.13：8765-8787； Wells等(1986)“氢键形成在稳定枯草杆菌蛋白酶中间态中的重要性”(“Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state ofsubtilisin.”)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317：415-423；Wells等(1985)“盒式诱变：一种在特定位点制备多个突变的有效方法”(“Cassette mutagenesis：anefficient method for generation of multiple mutations at defined sites.”)Gene34：315-323；Zoller&Smith(1982)“利用M13来源的载体进行寡核苷酸定向诱变：一种在任意DNA片段上制备点突变的有效而通用的方法”(“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors： an efficientand general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment.”)Nucleic Acids Res.10：6487-6500；Zoller & Smith(1983)“克隆在M13载体内的DNA片段的寡核苷酸定向诱变”(“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.”)Methods in Enzymol.100：468-500；以及Zoller & Smith(1987)“寡核苷酸定向诱变：一种使用两个寡核苷酸引物和一个单链DNA模板的简单方法”(“Oligonucleotide-directedmutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template.”)Methods in Enzymol.154：329-350。这些参考文献中所描述的方法可用于通过定向诱变、部分随机诱变或全随机诱变制备多肽变体。有关上述方法的其他细节可见于《酶学方法》(Methods in Enzymology)第154卷，其中还描述了用于排除各种诱变方法出现的问题的对照。用于分离、克隆和扩增核酸的常用诱变方法在下文有更详细的描述。 [0103] 提供和表达载体包装系统的载体核酸和/或互补核酸 [0104] 组成携带非天然氨基酸的多肽变体文库的载体制备所用的载体包装系统是本发明的一个特征。本发明还提供了包含载体核酸和/或互补核酸的包装载体的制备方法以及表达载体核酸和/或互补核酸以分别制备靶多肽如pIII融合多肽和包装多肽或特异性多肽如pIII的方法。 [0105] 载体核酸和/或互补核酸可以多种方式提供给载体包装系统，其中包括通过转化核酸，如线性双链DNA片段、环状DNA等。在原核系统中，这些方法包括用质粒、嗜菌粒等转化宿主细胞，如大肠杆菌细胞，或者通过噬菌体转导或与F’因子连接。在真核系统中，载体核酸和/或互补核酸可通过质粒转化或通过稳定转导或瞬时转导等方法提供给载体包装系统。也可以只是简单地将纯化的载体核酸和/或互补核酸添加给体外转录/翻译系统。 [0106] 表达载体核酸和/或互补核酸以制备其编码多肽可通过多种方式完成。然而，最常用的技术是提高编码靶多肽和/或包装多肽或特异性多肽的mRNA的转录水平。将编码靶多肽和/或包装多肽或特异性多肽的序列克隆到可诱导启动子的下游，这样在培养物或体外转录/翻译系统中添加合适的诱导物如IPTG时就可以提高这些基因的转录水平。 [0107] 用于分离、克隆和扩增核酸的方法；以及向细胞和无细胞系统提供核酸构建物的方法和在细胞和无细胞系统内表达核酸构建物的方法在文献中多有描述，这些方法都可用于本发明，为载体包装系统提供载体核酸和/或互补核酸并表达之。这些技术的其他细节可参见Berger和Kimmel，“分子克隆技术指南” 《酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology) 第 152 卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第3版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，2000(“Sambrook”)；《核酸方法学手册》(The Nucleic AcidProtocols Handbook)Ralph Rapley(编辑)(2000)Cold Spring Harbor，Humana Press Inc(Rapley)；《当代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编辑，《当代手册》(Current Protocols)，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，之间的临时合作(增补2007)(“Ausubel”))；《PCR方法，方法和应用指南》(PCR Protocols A Guide to Methods andApplications)(Innis等编辑)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)；Chen等(编辑)《PCR克隆方法》(PCR Cloning Protocols)，第2版(《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第192卷)Humana Press；Viljoen等(2005)《分子诊断PCR手册》(Molecular Diagnostic PCRHandbook)Springer； 以及Demidov和Broude(编辑)(2005)《DNA扩增：当代技术和应用》(DNA Amplification： Current Technologies and Applications)Horizon Bioscience，Wymondham，UK。其他有用的参考文献，例如，用于细胞分离和培养，例如，用于随后的核酸分离，包括Freshney(1994)《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique)，第3版，Wiley-Liss，New York以及其中引用的参考文献；Payne等(1992)《植物细胞和组织在液体系统中的培养》(Plant Cell and Tissue Culture inLiquid Systems)John Wiley&Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)《植物细胞、组织和有机培养物》(Plant Cell，Tissue and OrganCulture)；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)以及Atlas和Parks(编辑)《微生物培养基手册》(TheHandbook of Microbiological Media)(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。 [0108] 许多商品化的试剂盒都可用于从细胞中纯化质粒或其他相关核酸(参见，例如，TM TM TMPharmacia Biotech的EasyPrep 和FlexiPrep ；Stratagene的StrataClean ；QiagenTM 的QIAprep )。任何分离的和/或纯化的核酸都可以进 一步加工以制备其他核酸，用于转染细胞、掺入到相关载体以感染有机体用于表达等。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列、以及用于调节特定吧核酸的启动子。可选的是，载体可包含基因表达盒，其中含有至少一个独立终止子序列、使表达盒在真核细胞或原核细胞或者二者(例如，穿梭载体)中复制的序列以及用于原核和真核系统的筛选标志物。参见Sambrook，Ausubel和Berger。另外，基本上所有核酸都可以从各种公司定制或订购，例如Operon Technologies Inc.(Huntsville，AL)。 [0109] 试剂盒 [0110] 试剂盒也是本发明的一个特征。例如，这种试剂盒可包含使用本文的组合物所需的组分，例如：盛装试剂盒组分的容器、使用试剂盒来操作本文所述的任何方法所需的说明书或者制备标准化多肽文库如本文描述的任何文库的说明书，例如，可选的是，利用本文所述的任何载体包装系统制备的文库。用于制备标准化多肽文库的试剂盒，例如，其中至少一个多肽变体含有至少一个非天然氨基酸，可包括含有O-tRNA编码多聚核苷酸序列的核酸、含有O-RS编码多聚核苷酸序列的核酸、用于表达O-tRNA/O-RS和标准化多肽文库的合适原核宿主细胞如细菌(例如大肠杆菌)或真核宿主细胞(如酵母或哺乳动物细胞)。本领域的技术人员应该理解，可选的是，试剂盒可以包含本发明提供的用于本文所述方法的系统和组合物的任意组合。实施例 [0111] 下面所提供的实施例用于说明而不是限制本发明的权利要求。 [0112] 实施例1 [0113] 标准化噬菌体展示文库的制备 [0114] 本实施例描述的是，例如，用于制备典型标准化噬菌体展示文库的组合物和方法。本文所描述的方法可用于在各种多肽文库筛选系统中筛选各类多肽。 [0115] 构建嗜菌粒，其中包含种系VH3-23/DH3-10/JH4-pIII融合蛋白的Fab和VA27-J区的编码基因被置于lac启动子的转录控制之下。另外，这个嗜菌粒包含一个位于CDR3上的TAG选择者密码子。该嗜菌粒被转化到两种携带质粒的大肠杆菌菌株内，其中一种质粒编码6个拷贝的加载p-乙酰苯丙氨酸的正交 tRNA(O-tRNA)和能用p-乙酰苯丙氨酸加载O-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，另一只质粒编码6个拷贝的加载磺酸酪氨酸的正交tRNA(O-tRNA)和能用磺酸酪氨酸加载编码O-tRNA的O-RS。菌株在添加有IPTG和合适非天然氨基酸(UAA)如p-乙酰苯丙氨酸(keto)或磺酸酪氨酸(sulfo)的培养基中生长。对照培养物在只添加IPTG的培养基中生长。 [0116] 展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌体可通过用M13kO7-TAG辅助噬菌体感染嗜菌粒转化的大肠杆菌菌株制备，该辅助噬菌体的基因组携带一个pIII基因的含选择者密码子TAG的突变等位基因。由于M13噬菌体的装配和感染活性依赖于是否有功能性的pIII，因此只有那些包含M13KO7-TAG辅助噬菌体来源的pIII的噬菌体才能存活，例如包含p-乙酰苯丙氨酸或磺酸酪氨酸。四种培养物中的任何一种在培养18小时后都能产生噬菌体，然后收获噬菌体。 [0117] 在测定四种培养物上清的滴度时发现，在添加合适UAA的培养基中生长的菌株所产生的噬菌体量比在缺少UAA的培养基中生长的菌株高50倍。值得注意的是，利用非UAA系统在12小时内就可以产生相似的滴度。 [0118] 为了确定嗜菌粒编码的Fab是否能展示在收获的噬菌体的表面，我们利用抗pIII抗体进行了Western印迹分析。Western印迹分析的结果显示在图4A中。由于Fab-pIII融合蛋白只包含pIII的羧基端部分，因此预计在还原条件下融合蛋白的迁移速度要快于野生型(WT)pIII。在还原条件下，可以检测到Fab-pIII相应的新条带位于WT-pIII之下。这个条带未出现在辅助噬菌体提取物中，这说明这个条带是表达Fab-pIII融合蛋白的构建物特异性的(参见，例如，图4a，1道与2、3道比较)。 [0119] 在非还原条件下，可以检测到一条迁移速度较慢的条带，其分子量约为60kDa，但是只出现在含嗜菌粒的制备物中(参见，例如，图4a，5道和6道)。研究发现，这些道中的约60kDa的条带还能与抗κ抗体反应，这说明收获的噬菌体颗粒表面存在完整装配的Fab。在未用辅助噬菌体感染的表达Fab-pIII融合蛋白的大肠杆菌细胞来源的提取物中也检测到了相同的～60kDa的蛋白质(参见，例如，图4b，2道和4道)，这说明约60kDa的pIII反应性条带不是来自于辅助噬菌体。另外，这个条带还能与抗κ抗体反应。据估计，每100个噬菌体颗粒中有1个噬菌体克隆能展示一个Fab-pIII融合蛋白。 [0120] 检测收获自在缺乏UAA的条件下生长的培养物的噬菌体颗粒并测定其滴度，然后用amicon 100kDa MWCO滤器浓缩。为了确定这些噬菌体是否在其表面展示Fab，例如通过酪氨酸的掺入，O-RS从其中进化而来的天然氨基酸，或者这些噬菌体是否是“光秃的”，例如，根本不展示任何Fab，通过夹心ELISA分析相同滴度的收获自四种培养物的噬菌体，例如，在添加p-乙酰苯丙氨酸的培养基中培养的keto RS细胞、在未添加p-乙酰苯丙氨酸的培养基中培养的ketoRS细胞、在添加磺酸酪氨酸的培养基中培养的sulfo RS细胞、在未添加磺酸酪氨酸的培养基中培养的sulfo RS细胞。微量滴定板用抗κ抗体包被，封闭，然后与滴度逐渐增加的噬菌体结合。利用能与噬菌体包膜蛋白pVIII反应的抗体检测结合到微量滴定板上的噬菌体的量。结果发现，所有实验组都检测到了与κ抗体特异性结合的噬菌体，除阴性对照辅助噬菌体之外(参见，例如，图4C)。同样，在直接ELISA中，利用蛋白G-HRP试剂也可在除辅助噬菌体之外的所有噬菌体上检测到Fab。因此，Fab可呈现在无UAA的条件下培养的噬菌体上，虽然在缺乏UAA的条件下培养噬菌体的产量只有1/20。在无UAA的条件下培养的噬菌体也能展示Fab的机制可能是由O-RS掺入了酪氨酸。这个结果说明确定任何文库筛选的Fab展示其表型都需要UAA是有用的。 [0121] 在已经确定Fab被适当展示在噬菌体颗粒上以后，可以利用上述嗜菌粒制备编码Fab变体的嗜菌粒文库，其中Fab变体的CDR3上有选择者密码子。利用改良的重叠延伸PCR方法制备了三种不同的文库。在第一种文库即种系/TAG-CDR3中，Fab基因序列上的酪氨酸密码子被突变成TAG以制备出一群嗜菌粒变体，其中每一个嗜菌粒变体包含一个非天然氨基酸，非天然氨基酸所处的位置是酪氨酸残基通常掺入的位置。另外一些NNK密码子被添加到该文库一个亚组的Fab编码序列的VH-DH和DH-JH之间以模拟N区添加片段，这种添加片段发生在体内的V(D)J重组期间。第二种文库即NNK/TAG-CDR3提供了编码三种不同长度的CDR3的Fab基因变体，其中TAG密码子的掺入位置在不同的文库成员之间是不同的。第三种文库即NNK-CDR3提供了Fab基因变体，其中21种氨基酸中的任何一种都可以掺入到任何位置上。 [0122] 图5显示的是用于制备各个文库的寡核苷酸。这些序列来源于人DH1-DH3家族，被设计成可用于简并编码每一个完整家族。下划线标出的是添加到V-D 和D-J连接处的密码子。途中显示的是CD3附近的序列。实际的寡核苷酸在5’和3’端各延伸约10个碱基。密码子简并符合为N＝A，T，C，G；B＝C，G，T；D＝A，G，T；H＝A，C，T；V＝A，C，G；R＝A，G；Y＝C，T；K＝G，T；M＝A，C；S＝G，C；W＝A，T。 [0123] 从每一种“天然”文库中挑取至少20个克隆进行测序以验证在不同变体之间密码子的代表性是否存在偏好，以及验证变体是否编码全长Fab片段。3种文库的理论多样性都7 8 9 约为10-10。对每一种文库来说，根据转化效率来看，实际发生的独立连接事件都＞10，这说明每一种文库都完整涵盖了多样性。 [0124] 将各嗜菌粒突变文库转化到合适的大肠杆菌菌株内，其中大肠杆菌菌株携带的质粒编码6个拷贝的双吡啶丙氨酸特异性的O-tRNA和O-RS。转化的菌株在添加双吡啶丙氨酸的培养基中生长，这种氨基酸是一种预计会拥有有效金属螯合特性的非天然氨基酸。 [0125] 展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌体通过用M13-KO7-TAG辅助噬菌体感染嗜菌粒转化的大肠杆菌制备，如上所述，这种辅助噬菌体携带一个pIII基因的包含选择者密码子TAG的突变等位基因。培养大肠杆菌菌株以使其生产噬菌体，18小时后收获噬菌体。 [0126] 为了确定是否有可能从文库中分离噬菌体展示的包含双吡啶丙氨酸的Fab，我们利用以前报道的一个模型系统来筛选只包含非天然氨基酸的金属结合抗体(Trisler等(2007)“能够不可逆结合蛋白质抗原的金属抗体”(“AMetalloantibody That Irreversibly Binds a Protein Antigen.”)Journal of BiologicalChemistry.282：26344-26353)。用第二种和第三种嗜菌粒文库转化的大肠杆菌产生的噬菌体与镍树脂(Qiagen)共孵育5分钟，然后用5倍柱体积的TBST(20mM Tris pH＝8，150mM NaCl，0.025％吐温-20)，再用一倍柱体积(0.2ml)的10mM、100mM、150mM、200mM、300mM和500mM咪唑以不连续的梯度洗涤洗脱。洗脱出的噬菌体用于感染大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到添加氨苄青霉素的琼脂培养基平板上。挑取克隆并培养，对提取自各个克隆的每一个嗜菌粒DNA进行测序。 [0127] 从每一个咪唑洗脱组分形成的克隆中挑取几个克隆进行测序。即使仅仅经过一轮筛选，也可以从每一种文库中分离出几个包含至少一个位于CDR3上的 双吡啶丙氨酸残基的Fab变体，例如，编码至少一个TAG密码子。从每一种文库中挑取多个克隆进行测序，测定TAG的频率并与预筛选的文库进行比较(参见，例如，图6)。由于NNK-TAG-CDR3文库的所有成员都包含TAG，因此要计数包含两个TAG的克隆的频率。CDR3上的TAG密码子的频率随着咪唑洗脱液严格程度的升高而升高(参见，例如，图6)。 [0128] 已知组氨酸是一种能在天然状态下掺入到多肽内的金属结合氨基酸。作为内部阳性对照，我们还监测了CD3上组氨酸密码子的频率，结果发现分离克隆CDR3上的组氨酸密码子的频率也随着咪唑洗脱液严格程度的升高而升高(参见，例如，图6b；UAA的位置用星号标识)。 [0129] 实施例2 [0130] 标准化多价噬菌体展示文库的制备 [0131] 本实施例描述的是，例如，用于制备典型标准化多价噬菌体展示文库的组合物和方法。本文所述的方法还适用于在各种多肽文库筛选系统中筛选各类多肽。有关这些方法的详细描述可参见Liu等(2008)“利用扩展的遗传密码进行蛋白质进化研究”(“Protein Evolution with and Expanded Genetic Code.”)，Proc Natl Acad Sci USA，待发表，本文已纳入作为参考。 [0132] 我们构建了一个以前文献报道的嗜菌粒(参见，例如，Rondot等(2001)“一种用于改进单链抗体在噬菌体展示中的提呈的辅助噬菌体”(“A helperphage to improve single-chain antibody presentation in phage display.”)NatureBiotech.19：75-78)，该噬菌粒编码包含选择者密码子TAG的scFv。这个嗜菌粒被转化到大肠杆菌菌株内，菌株所携带的质粒编码6个拷贝的加载非天然氨基酸如对乙酰苯丙氨酸、双吡啶丙氨酸、磺酸酪氨酸或4-溴苯丙氨酸的正交tRNA(O-tRNA)和能用非天然氨基酸如对乙酰苯丙氨酸、双吡啶丙氨酸、磺酸酪氨酸或4-溴苯丙氨酸加载O-tRNA的正交氨酰-tRNA(O-RS)。有关遗传性掺入硼酸氨基酸的其他细节可见于Brustad等(2008-)“遗传编码的含硼酸盐的氨基酸”(“A Genetically Encoded Boronate-Containing Amino Acid.”)AgnewChem 120：8344-8347，本文已纳入作为参考。执行试验(如方法中所描述的)以确定添加非天然氨基酸如对乙酰苯丙氨酸、双吡啶丙氨酸、磺酸酪氨酸或4- 溴苯丙氨酸的培养基中产生的噬菌体与不含非天然氨基酸的培养基中所产生的噬菌体的特征差异。收获噬菌体并测定其滴度(如下面所描述的)，结果发现在添加非天然氨基酸的培养基中生长的培养物所产生的噬菌体比缺乏UAA的条件下生长的培养物高300倍。 [0133] 我们制备了种系抗体变体的嗜菌粒文库，其中每一种变体的CDR3环都携带一个包含6个随机NNK密码子的插入片段。这个嗜菌粒文库被用于转化适当的大肠杆菌菌株，该菌株所携带的质粒编码6个拷贝的非天然氨基酸磺酸酪氨酸特异性的O-tRNA和O-RS，转化的菌株在添加15mM磺酸酪氨酸的培养基中生长。展示抗体变体-pIII融合蛋白的多价噬菌体通过用超噬菌体感染嗜菌粒转化的大肠杆菌菌株制备，超噬菌体中编码pIII的基因已被删除(参见，例如，Rondot等(2001)“一种用于改进单链抗体在噬菌体展示中的提呈的辅助噬菌体”(“A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phagedisplay.”)Nature Biotech.19：75-78)。大肠杆菌菌株培养18小时以制备噬菌体，然后收获噬菌体。利用实施例1所描述的Western印迹分析确定抗体变体是否以适当的方式展示在噬菌体颗粒上。 [0134] 然后通过ELISA筛选收获的噬菌体以鉴定和分离那些展示能结合gp120的抗体变体的噬菌体，其中gp120是一种能结合硫化受体的HIV包膜糖蛋白。研究发现，这个试验中分离出的抗体变体富含TAG密码子，说明硫化抗体变体如包含非天然氨基酸磺酸酪氨酸的抗体变体在这个试验中被优先筛选出来。其他细节将在下文描述。 [0135] 利用扩展的遗传密码子进行蛋白质进化 [0136] 我们设计出了一种噬菌体展示系统，其中扩展的遗传密码可用于蛋白质进化。这可使包含非天然氨基酸的蛋白质序列进化，这样该序列的功能就应该优于只包含20种标准氨基酸的序列。我们利用几种非天然氨基酸优化了这个系统以用于功能进化，研究表明这个系统可用于抗-gp120抗体的筛选。一种筛选自天然种系scFv抗体文库，其中VHCDR3上的6个残基是随机分布的，的这种抗体包含磺酸酪氨酸，其与gp120结合的亲和力高于分离自人血清的已知硫化抗体。扩展的“合成”遗传密码在使具有特殊特性的蛋白质发生定向进化方面具有优势。 [0137] 除了少数几个例外，有机体的遗传密码只编码20种标准氨基酸用于蛋白质合成。其他氨基酸及其代表的化学功能性具有进化优势还是有可能的，特别是因为20种氨基酸的自然选择都已被武断地固定在社会进化论和达尔文进化论之间的跃迁点上，并且随后维持密码惯性(code’s inertia)(1)。另外，在有限的实验室定向进化的范围内，这种进化只涉及在一个较短时间内的一个或几个特殊功能而不是数千年间有机体的一般适合度，人们很容易想象其他氨基酸的筛选优势。我们实验室最近的研究进展促使我们开始探究这种可能性。比较特殊的是，能够响应独特的无义密码子和移码密码子而将各种非天然氨基酸掺入到蛋白质内的正交tRNA/氨酰tRNA合成酶(aaRS)对被添加到大肠杆菌的翻译机器内(2)。现在这些大肠杆菌可用于蛋白质的功能进化，其中有21种建筑砖块可用，而不是常见的20种。 [0138] 起初我们根据其独特的化学特性挑选了几种非天然氨基酸用于我们的系统。例如，编码二齿金属螯合氨基酸双吡啶丙氨酸的X-E.coli(3，美国专利申请号No.11/665,083，名称“用于非天然氨基酸体内掺入的正交翻译组分”(“Orthogonal translation components for the in vivo incorporation of unnaturalamino acids)，Schultz等，申请日为4/10/2007；也可参见WO/2006/110182，申请日为2005年10月26日)很适于氧化还原和水解催化剂的进化，因为金属离子结合不需要预先组织的一级和二级配基衣壳。同样，编码反应性4-二羟硼基-苯丙氨酸的X-E.coli(4，申请日为2008年8月1日的美国临时转录申请号Nos.61/137,689；以及申请日为2008年8月22日的61/189,739)很适于糖蛋白或丝氨酸蛋白酶特异性抗体的进化，因为硼酸基团能与二醇或反应性丝氨酸残基形成高亲和力的复合物。另外编码其他翻译后修饰的氨基酸如磺酸酪氨酸的X-E.coli(5，美国专利申请号No.11/903,499，名称“特异性的硫化蛋白质在真细菌内的遗传程序性表达”(“Genetically programmed expression of selectivelysulfated proteins in Eubacteria，”)，Liu等，申请日为2007年9月20日；还可参见申请日为2007年9月 20日的WO/2008/036392，filed September 20，2007)可用于特性的进化，这些特性利用了给定翻译后修饰的独特化学特征，但是正常情况下却无需任何宿主有机体和序列局限于这种修饰(6)。最后，利用酮氨基酸如对乙酰苯丙氨酸的X-E.coli可用于催化剂的进化，这些催化剂催化有 亚铵盐(iminiumuim)中间体参与的反应(例如，添加，异构化或脱羧反应)(7)。基于这种构想，我们开发出了一种用于蛋白质进化的系统，其中噬菌体展示文库中包含了X-E.coli编码的非天然氨基酸。该系统可根据序列群的功能来筛选含有非天然氨基酸的序列，其中序列群既包括含有非天然氨基酸的序列，也包括只含有20种常见氨基酸的序列。然后我们利用这个系统来进化抗-gp120抗体，结果发现包含磺酸酪氨酸的特异性序列优于序列群中的所有其他序列，其中包括那些只含常规氨基酸的序列。这些研究首次证明扩展的遗传密码能赋予非天然氨基酸的功能分布以筛选优势。 [0139] 包含非天然氨基酸的蛋白质可正确展示在嗜菌粒的噬菌体包被上 [0140] 噬菌体展示以一种用于定向进化多种蛋白质功能的通用平台(8-13)。在噬菌体展示进化的系统规定参数中，功能进化须符合两个基本标准。第一个标准是，大肠杆菌产生的噬菌体必须正确而有效地展示正经历进化的蛋白质；以及第二个标准是，筛选优势(例如，富集)应该与功能表现尽可能地紧密相关。这需要降低对某些类型的不是基于功能的序列的任何系统偏性。虽然非天然氨基酸已经以单肽的形式被展示在野生型M13噬菌体上(14)，但是在这些系统规定参数下，这种系统无法用于定向进化试验。因此我们转向嗜菌粒展示，特别是多价超噬菌体展示(15，16)，我们感觉它们能满足常规氨基酸和非天然氨基酸的这两个标准。 [0141] 为了检测嗜菌粒编码的包含非天然氨基酸的蛋白质序列是否能够展示在噬菌体表面，我们将pIII融合到人共有VH3-23和VLA27种系序列来源的scFv的羧基端。将VHCDR3环上的111位密码子替换成琥珀密码子，将这种构建物插入到pSEX嗜菌粒内形成pSEX-GermTAG。随后将这个质粒转化到四种不同的X-E.coli内，其中一个编码磺酸酪氨酸(SY-X-E.coli)(5)，一个编码对乙酰苯丙氨酸(Boro-X-E.coli)(4)，它们都可相应琥珀密码子。由于嗜菌粒编码的抗体-pIII融合蛋白是噬菌体包装所用的pIII的唯一来源(16)，因此应该只有在pIII的琥珀密码子上游被抑制的情况下才能产生噬菌体。然后利用超噬菌体从这些克隆制备各个噬菌体展示的scFvs。测定在各种非天然氨基酸存在和不存在的情况下的噬菌体产量(图7a-d)。与缺乏非天然氨基酸时的产量相比，在培养基中添加相应的非天然氨基酸可以使噬菌体的产量增加1000倍以上(图7e)， 这说明包含非天然氨基酸的蛋白质序列可以被展示在这个系统中。利用沉淀的完整噬菌体进行SDS-PAGE和Western印迹分析，结果证明完整的scFv-pIII融合蛋白可以被有效提呈(图7f)。 [0142] 噬菌体生成中对包含非天然氨基酸的序列的偏性可以被最小化以便于定向进化[0143] 尽管可以成功地将包含非天然氨基酸的序列展示在噬菌体包膜上，但是在早期的试验中，与pSEX-GermTAT所产生的序列展示相比，pSEX-GermTAG的噬菌体总产量很低，其中前者的琥珀密码子被一个特化的酪氨酸取代(参见下面的表1a)。这种情况是可以预计的，因为使用经过改造的aaRS/tRNA对的非天然氨基酸的抑制效率要低于使用内源性机器的常见氨基酸的抑制效率。为了进化包含非天然氨基酸的蛋白质，人们必须使包含非天然氨基酸的序列经过多轮筛选战胜只包含常规氨基酸的那些序列，这样就不能容忍不利于含非天然氨基酸的序列的大系统表达偏性。因此，我们优化了几种X-E.coli的生长条件(噬菌体产生温度、表达时间和编码tRNA/aaRS的质粒)和非天然氨基酸浓度(表1a)，这样展示非天然氨基酸的噬菌体的产量就与展示天然序列的噬菌体的产量一样了。我们猜测只通过改变生长条件和氨基酸浓度就可以达到这种优化的目的，因为这种优化只需提高全长融合蛋白-pIII蛋白相对于噬菌体包装和装配过程中其他步骤的表达速率就可以了；根本无需提高琥珀密码子的抑制效率。如表1b所示，在优化条件下，对于四种被测X-E.coli来说，有利于只含常见氨基酸的序列的产量/表达偏性为＜3倍。这说明如果包含非天然氨基酸的序列的功能表现优于大多数只含天然氨基酸的竞争序列至少约3倍，则尽管有不利的偏性也能富集。 [0144] 下面的表1a显示的是用于优化根据模型scFV计算的噬菌体产量的条件。“所用菌株”是指包含非天然氨基酸的菌株和该菌株特异性的合成酶。在噬菌体表达期间，非天然氨基酸以表中的浓度直接添加到培养基内。这种产量比是根据pSEX-GermTAG表达的噬菌体(非天然噬菌体)的滴度除以pSEX-GermTAT表达的噬菌体(天然噬菌体)的滴度计算出来的。我们估计我们的优化方法能够提高含非天然氨基酸的pIII-融合蛋白的总产量，同时能够降低噬菌体产生过程如装配或包装的其他步骤的速率。 [0145] 表1a [0146] 合成酶 温度 噬菌体 所用菌株 非天然 (非天然噬菌体产量)/ [0147] 质粒 (℃) 生长时间 氨基酸浓度 (天然噬菌体产量)*[0148] 骨架 (小时) (mM) [0149] pSup 37 12 SY-X-E.coli 5 0.02 [0150] pSup 37 12 Keto-X-E.coli 5 0.02 [0151] pCDF 37 12 SY-X-E.coli 5 0.08 [0152] pCDF 37 12 Keto-X-E.coli 5 0.09 [0153] pCDF 30 12 Keto-X-E.coli 5 0.18 [0154] pCDF 30 18 Keto-X-E.coli 5 0.25 [0155] pCDF 30 18 SY-X-E.coli 10 0.24 [0156] pCDF 30 18 Keto-X-E.coli 8 0.4±0.031 [0157] pCDF 30 18 SY-X-E.coli 15 0.33±0.057 [0158] pCDF 30 18 Bpy-X-E.coli 1.5 0.34±0.072 [0159] pCDF 30 18 Boro-X-E.coli 6.5 0.90±0.149** [0160] *对于最后一组条件，比例是根据三个复孔的结果确定的，其中培养物分成三组，每组两个样品(天然和非天然噬菌体)用于测定噬菌体的表达水平。(±报告的标准差) [0161] **添加NaOH是用于稳定4-二羟硼基-苯丙氨酸，结果导致较低的生长速度。因此，在这个例子中，天然噬菌体的产量是在NaOH和4-二羟硼基-苯丙氨酸存在的条件下测定的。在其他例子中，非天然氨基酸的添加对天然噬菌体的产量没有明显影响。 [0162] 表1b显示的是有利于表达待测scFV-pIII的噬菌体生长的最终优化条件和产量偏性，其中待测scFv-pIII中TAT密码子代替了TAG密码子(天然噬菌体)。 [0163] 表1b [0164] 菌株 合成酶 温度 噬菌体 非天然 对天然氨基酸 [0165] 质粒 (℃) 生长时间 氨基酸浓度 的偏性 [0166] 骨架 (小时) (mM) [0167] SY-X-E.coli pCDF 30 18 15 3x [0168] Keto-X-E.coli pCDF 30 18 8 2.5x [0169] Bpy-X-E.coli pCDF 30 18 1.5 2.9x [0170] Boro-X-E.coli pCDF 30 18 6 1.5x [0171] 表1c显示的是pSEX-GermNNK文库在Keto-X-E.coli、SY-X-E.coli、Bpy-X-E.coli或Boro-X-E.coli中表达噬菌体后包含TAG密码子的克隆数(n＝50或100)以及相关的χ2值，说明单个克隆的偏性代表了群体水平的偏性。噬菌体表达前的输入值是指噬菌体产生前原始文库中发现的克隆。 [0172] 表1c [0173] 菌株 测序的 包含至少1个 包含至少1个 估计的 χ2(使用二 [0174] 克隆数 TAG的克隆 TAG的克隆数 二项分布 项分布标准 [0175] (n) 数(测定的) (根据偏性估计的) 的标准差* 差)**[0176] 0.62 [0177] SY-X-E.coli 100 7 5.71 2.32 [0178] 2.94 [0179] Keto-X-E.coli100 10 6.92 1.79 [0180] 1.62 [0181] Bpy-X-E.coli 100 7 5.88 1.66 [0182] 0.03 [0183] Boro-X-E.coli100 16 15.56 3.63 [0184] 噬菌体表达前 0.03 [0185] 50 9 8.65 2.67 [0186] *[np(1-p)]^(1/2)其中n是测序的克隆数，p＝(非天然噬菌体产量)/(天然噬菌体产量)x 0.173 [0187] **3.84以下的数值(对应于5％的可能性)被认为与根据单个克隆所确定的预计偏性相一致 [0188] 随后利用抗体的嗜菌粒文库检测这些优化的条件以确保基于单个克隆确定的偏性扩展到群体水平。利用NNK通过饱和诱变形成的完全随机的6个连续残基被插入到VH 3-23CDR3环以替代残基101-106，利用随机引物通过重叠PCR实现。随后将其克隆到pSEX-GermTAT载体内以构建文库pSEX-GermNNK(参见方法)。转化Top10F’后最大复杂性8 可达5x10，测序结果显示约有18％的克隆在噬菌体产生前包含琥珀密码子(n＝50，根据二项分布估计为17.3％，在NNK随机位点上有1/32的可能性能够发现TAG)。在SY-X-E.coli、Keto-X-E.coli、Bpy-X-E.coli或Boro-X-E.coli生产噬菌体后，测序结果显示，得到的噬菌体群中有7-16％的克隆包含琥珀密码子(n＝100)。在群体水平上，这代表有利于只含常规氨基酸的序列的表达偏性为1.1到2.5倍，这与单个克隆所代表的偏性一致(图 8)。图8显示的是pSEX-GermNNK文库在SY-X-E.coli、Keto-X-E.coli、Bpy-X-E.coli或Boro-X-E.coli中表达噬菌体后包含一个或多个TAG密码子的噬菌体克隆的百分率(n＝ 100)。预测值为17.3％；偏差代表有利于只含20种常规氨基酸的序列的偏性。在优化条件下生产噬菌体。χ2检验表明这些数值与单个克隆所代表的偏性相一致(表1c)。这种温和的表达偏性应该可以被功能表现所克服。 [0189] 已知的包含磺酸酪氨酸的抗-gp120抗体可利用SY-X-E.coli从杂合的随机文库中筛选出来 [0190] 已知HIV感染需要gp120与CCR5复合受体结合，CCR5的硫化是这种相互作用所必须的，中和分离自血清的抗-GP120硫化人抗体利用了这个特性(17，18)。事实上，最近发现的与gp120结合的一个这种抗体412d的晶体结构显示，它的两个磺酸酪氨酸贡献了总埋藏表面的约20％，其中两个中的一个几乎占 (19)。因此，我们有理由相信，高亲和力的抗-gp120抗体能够在SY-X-E.coli中进化，因为与复杂真核生物内的翻译后修饰所产生的结果不同，磺酸酪氨酸可以作为非天然氨基酸掺入到大肠杆菌的任何序列内。 [0191] 我们首先做了检测进化试验以观察包含两个磺酸酪氨酸(残基100和100c)的抗体412d是否能基于其对gp120的亲和力从随机文库中筛选出来。为了使噬菌体采用412d，将包含两个琥珀密码子的scFv 412d-2SY克隆到pSEX骨架内形成pSEX-412d2TAG，其中两个琥珀密码子被掺入到人412d酪氨酸硫化的两个位点上(scFv的残基104和107)。然后利用SY-X-E.coli将412d-2SY展示在噬菌体上。为了构建412d文库，利用NNK通过位点饱和诱变将靠近磺酸酪氨酸的残基-Pro101、Asn105、Ala108、Pro109、Gly112、Met113以及硫化作用发生的两个位置-残基104和107随机分布到412d scFv-pIII编码序列上(参8 见方法)(20)。得到的嗜菌粒文库(实验性最大复杂性为2x10)转化到SY-X-E.coli内，然后从中生产噬菌体。这个噬菌体群中展示412d-2SY的噬菌体占到文库噬菌体的1/2000，利用固定到微滴定板上的gp120淘洗该噬菌体群。经过四轮筛选以后，每一轮筛选后都在SY-X-E.coli内扩增噬菌体，噬菌体群集中到一个序列412d-2SY上，这说明SY-X-E.coli内gp120结合的进化能产生包含非天然氨基酸的序列。事实上，经过三轮筛选以后(经过第4论筛选后几乎完全集中到该412d-2SY上)噬菌体还有起源于文库而不是粗短刺状噬菌体的包含磺酸酪氨酸的序列(下面的表2)。这说明包含非天然氨基酸的新序列，而不仅仅是 412d-2SY，也进化成可以结合gp120。表2显示的是从掺杂有412d-2SY的412d文库中筛选出来的序列列表。下划线部分是利用NNK随机化的位置。 [0192] 表2 [0193] 掺杂的412d-2SY的序列 [0194] …Y P N D * N D * A P E E G M… [0195] 筛选出的序列 [0196] …Y T N D L N D * G E E E H G… [0197] …Y N N D D N D L R L G E * S… [0198] …Y D N D N D D G T A E E * Y… [0199] …Y P N D * N D * A P E E G S… [0200] …Y P N D * N D * A P E E G M…(群的～75％) [0201] 为了确保412-2SY是基于其功能特点而被筛选出来的，我们鉴定了展示412d-2SY的噬菌体的表达水平的特征，并且与初始文库噬菌体和第三轮的文库噬菌体的表达水平比较，二者都包含不含非天然氨基酸的某些到多个序列。通过比较发现，展示412d-2SY的噬菌体的产率低于文库噬菌体(图9)；因此，412d-2SY噬菌体的富集一定是因为其功能优势而不是一般的表达优势。图9描述的是每毫升培养物中412d-2SY噬菌体的产量以及与之相比的初始噬菌体文库和第三轮筛选的文库的噬菌体产量。所有噬菌体都用SY-X-E.coli制备。对于412d-2SY来说，计算出三个独立噬菌体制备物的滴度的平均值，误差棒代表+标6 准差。对于412d-2SY来说，当从培养基中去除磺酸酪氨酸时，噬菌体的产量为～1x10/mL。 分离出412d-2SY噬菌体，然后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其与gp120的结合。利用pSEX-412d2TAT制备展示412d的噬菌体作为天然对照，其中两个磺酸酪氨酸被酪氨酸取代(412d-Y)，并且进行同样的检测。如图10所示，412d-2SY可越过BSA对照有效结合。另外，412d-2SY与gp120结合所产生的ELISA信号比412d-Y强约10倍。因此，412d-2SY是基于其结合亲和力而被筛选出来的，这种结合亲和力来自于两个磺酸酪氨酸残基。 [0202] 从SY-X-E.coli内的天然种系文库中筛选抗-gp120抗体来生产硫化抗体 [0203] 接着我们做了gp120结合的进化试验，其中我们根据结合gp120的能力来筛选完全天然的种系抗体文库，而不是基于任何已知的gp120结合序列。由于我们不想让这个文库偏好任何靶位，因此我们从人基因组DNA中扩增出人种系重链可变区的混合物，然后利用重叠PCR将其与A27种系轻链一起装配到scFv内，scFv的CDR3环区包含6个完全随机分布的连续残基，这种随机分布是通过NNK定向饱和诱变制备的(参见方法)。这6个残基两侧有两个部分随机分布的残基，用于模拟天然连接的多样性，因为VH基因区在框架内还9 未结束。然后将文库克隆到嗜菌粒载体内，得到的实验性最大复杂性为2x10。DNA测序结果表明预计有约17％的克隆包含至少一个琥珀密码子。 [0204] 然后利用SY-X-E.coli从该文库中生产噬菌体，随后根据gp120淘洗该文库。结合的噬菌体在SY-X-E.coli内扩增，这个过程总共重复4轮，其中在相同的严格条件下进行的每一轮筛选都会使gp120结合能力超过上一轮(图11a)。测序结果表明在测序的克隆中磺酸酪氨酸也同时得到富集(图11b)。图11a显示的是根据每一轮筛选后洗脱的噬菌体量判断的gp120结合的富集情况。与随后几轮筛选相比，第1论的筛选所用的严格程度低很多(参见方法)，这是为了在提呈只有几个拷贝的克隆时使可能的采样点的随意丢失尽量减少。图11b显示的是根据测序结果确定的每一轮筛选过后包含磺酸酪氨酸的克隆所占的百分数上升(n＝15-30)。 [0205] 经过三轮筛选以后，约40％的噬菌体包含磺酸酪氨酸；经过第4轮筛选以后，文库主要集中在这些包含磺酸酪氨酸的抗体中的一个上，该抗体包含序列…E s Y G S P R G Y…(sY＝磺酸酪氨酸；斜体字部分是部分随机化的位置相应的氨基酸；下划线部分是完全随机化的位置相应的氨基酸)和重链V区VH3-38。这个克隆在群体中占60％(n＝20)。与缺乏磺酸酪氨酸的条件相比，在有磺酸酪氨酸存在的条件下展示这个scFv(66CC8-SY)的噬菌体的产量要高出100倍以上，说明磺酸酪氨酸可以被特异性地掺入(5)。同时我们还比较了展示66CC8-SY的噬菌体的产量与展示初始文库以及第三轮筛选时的文库的噬菌体的产量，结果显示，在两种情况下展示66CC8-SY的噬菌体的产量都较低(图12)，这符合我们的预计，因为事实是66CC8-SY包含非天然氨基酸。图12显示的是每毫升培养物中展示66CC8-SY的噬菌体的产量以及与之相比的初始噬菌体文库和第三轮筛选时的噬菌体文库的噬菌体产量。所有噬菌体都用SY-X-E.coli制备。对于66CC8-SY来说，计算出三个独立噬菌体制备物的滴度的平均值，误差棒代表+标准差。对于66CC8-SY来说，当从培养基中 6 去除非天然氨基酸时，噬菌体的产量为～5x10/mL。因此，根据结合亲和力可以将66CC8-SY从其他序列中筛选出来，其中包括只含常规氨基酸的序列。这个结果证明利用编码磺酸酪氨酸的菌株内的无偏性天然文库进行进化试验可以得到与gp120结合的硫化抗体。 [0206] 随后通过ELISA确定66CC8-SY与Gp120结合的特征。如图13所示，66CC8-SY可与gp120特异性结合，超过BSA对照，并且比已知的抗体412d-2SY强约5倍。与只含天然氨基酸的从相同筛选中富集出来的大多数抗体相比(包含序列…E R R G R E G H…的抗体66CC14，经过第4轮筛选以后占群体的20％，n＝20)，66CC8-SY的亲和力高出约4倍(图13)。事实上，66CC14与BSA也有可检测量的结合，因此，其在群体中存在的部分原因可能是非特异性相互作用。我们还将66CC8-SY与其类似物进行了比较，类似物中用酪氨酸取代了磺酸酪氨酸(66CC8-Y)，这是为了证明66CC8-SY的亲和力是由硫化残基贡献的。利用编码酪氨酸以响应TAG的aaRS制备66CC8-Y，通过ELISA检测噬菌体的gp120结合能力，并与展示66CC8-SY的噬菌体进行比较。如图13所示，噬菌体展示的66CC8-SY所产生的与gp120结合的ELISA信号比66CC8-Y高约5倍，说明磺酸酪氨酸被正确展示在噬菌体上，证明66CC8-SY的亲和力来自于硫化残基。这个结果是可以预期的，因为66CC8-Y和许多相关的序列应该出现在66CC8-SY浮出的起始文库群内。我们注意到，在所有这些例子中，各个克隆之间噬菌体上的scFv展示水平是一致的，这是因为超噬菌体增强的多价性，可以直接比较各个样品。 [0207] 我们下一步要做的是表达不与噬菌体融合的游离scFv并确定其特征。虽然利用磺酸酪氨酸特异性的正交tRNA/aaRS对来表达scFv 66CC8-SY所得到的产量与66CC8-Y的表达相似(～7mg/L)，但是产生出的蛋白质都是不溶性的，经过多种尝试后依然无法使其重新折叠。当然转化成Fab形式时，66CC8-SY、66CC8-Y和66CC14(纯化后的产率分别为0.8、1.0和1.0mg/mL)都丢失了其与gp120的结合活性(图14)。我们认为，这些筛选出的抗体相应的种系可变区是不稳定的，需要scFv连接子，这既可以解释当转化为Fab形式时活性为何会丢失，又能解释游离形式的scFv为何难以重新折叠。这不同于游离412d-2SY和412d-Y的表达(纯化后的Fab产率分别为0.25和0.7mg/mL)，二者都可以产生高产率的折叠scFv，当转化为Fab形式时也能保留与gp120结合的全部活性。虽然还没有文献报道用于比较的Kd值，但是Fab 412d-2SY可以有效地结合gp120，并且是以硫化依赖性的方式，通过ELISA检测发现其亲和力比Fab 412d-Y高15倍以上(图14)。图14a描述的是利用金属-增强的 DAB试剂盒(Pierce)开发的抗人κ轻链HRP抗体对蛋白G纯化的Fab进行Western印迹分析的结果。样品在变性PAGE胶上电泳(Invitrogen NuPAGE4-12％Bis-Tris)。对于66CC8-SY和412d-SY来说，缺乏磺酸酪氨酸时的表达相应的道也显示出硫化抗体的表达对磺酸酪氨酸存在的依赖性。图14b-f描述的是Fab 66CC14、66CC8-SY、 66CC8-Y、412d-SY和412d-Y的LCMS(ESI-阳性的)谱。图14g显示的是纯化的Fab 66CC14、 66CC8-SY、66CC8-Y、412d-2SY和412d-Y与gp120结合的ELISA检测结果。这类似于哺乳动物的硫化412d，该抗体只有在被硫化时才能与gp120发生免疫沉淀。根据稳定性来筛选或者使用Fab而不是天然种系scFv来源的文库可防止出现折叠和形式转化的这种问题。 [0208] 讨论 [0209] 我们开发出了一种用于蛋白质进化的系统，其中20种常规氨基酸之外的非天然氨基酸用于研究蛋白质函数空间。与以前试图在定向进化试验中引入非天然或非常规氨基酸不同(21，22)，我们的系统中的非天然氨基酸是通过遗传编码的，只需要位点特异性地掺入独特密码子TAG。因此，非天然氨基酸的翻译所利用的基本规则与天然氨基酸的翻译相同，结果导致无限制的21种氨基酸蛋白进化。但是，有一个条件：有利于只含天然氨基酸的序列的产率偏性。因此我们优化了以噬菌体为基础的系统，降低这种偏性，这样导致群体中既有包含非天然氨基酸的序列也有只包含常规氨基酸的序列的多样化策略进行功能进化。由于产率偏性虽然被最小化但并未完全去除，因此筛选，包括我们已经描述的那些，需要非天然氨基酸来贡献序列的功能，这些序列包含非天然氨基酸才能被保留在群体中。 [0210] 通过改变生长条件来优化掺入四种非天然氨基酸的X-E.coli菌株，用于以嗜菌粒为基础的定向进化，编码非天然氨基酸的一个菌株被用于进化无偏性的天然种系抗体文库来源的gp120结合抗体。在这个试验中，抗体群几种在一个包含磺酸酪氨酸的新型克隆上，这个磺酸酪氨酸直接决定了gp120结合亲和力。从完全天然的文库中可以筛选出这个克隆，这个结果首次证明扩展的遗传密码可以通过非天然氨基酸的功能贡献来赋予筛选优势。 [0211] 为了使偏性最小化而对该系统进行的优化可通过只包含一个非天然氨基酸 的序列来完成。因而不利于包含一个以上非天然氨基酸的序列的噬菌体产率偏性可能更高，这就要求这种序列具有更明显的功能优势才能在多轮筛选中被筛选出来。不利于包含多个非天然氨基酸的序列筛选的任何这种偏性都可以通过反复筛选试验来克服。例如，如果一个给定的筛选中最适合的序列包含一个非天然氨基酸，那么可以进行第二种筛选试验，其中获胜序列的非天然氨基酸被固定，其周围的其他氨基酸随机分布。利用这种受限文库，掺入第二非天然氨基酸遇到的偏性可能是最小的，因为群体中的所有成员都包含第一非天然氨基酸。当然，如果具有多个非天然氨基酸的功能优势能够克服相关的表达偏性，这种方法是可选的。例如，包含两个非天然氨基酸磺酸酪氨酸的412d-2SY可以利用我们的系统从以412d为基础的文库中直接筛选出来，这种文库最初被只含天然氨基酸的序列控制。 [0212] 虽然这个系统经过优化以后可利用四种非天然氨基酸磺酸酪氨酸、双吡啶丙氨酸、4-二羟硼基-乙酰苯丙氨酸和对乙酰苯丙氨酸进行进化，之所以选择这四种氨基酸是根据它们的独特化学功能，但是利用遗传密码进行以噬菌体为基础的进化还可以使用能被正交aaRS/tRNA对掺入的任何非天然氨基酸(到目前为止约有45个)，其中包含特征还未完全清楚的非天然氨基酸。现在，根据这个事实以及噬菌体展示的多样性和现有文库设计和多样化策略的矩阵(13)使我们能够对新结合模式、催化活性和结构进行进化，其中非天然氨基酸扩展了可以完成的功能的范围和类型。 [0213] 方法 [0214] X-E.coli质粒设计和构建 [0215] [0001]tRNA/aaRS对由pCDF质粒编码。pCDF质粒携带一个CloDF13来源的启动子Tyr Tyr(23)，编码MjtRNA CUA以及可用非天然氨基酸特异性加载MjtRNA CUA的突变MjTyrRS。为Tyr 了构建编码突变aars的pCDF-Keto，其中突变aaRS可用对乙酰苯丙氨酸加载MjtRNA CUA，利用如下引物通过PCR从载体pCDF-1b中扩增包含CloDF13复制子的插入片段基因： [0216] MT01：5′-GTGTTGTTGTTGTTGTATACCAAATAGCTAGCTCACTCGGTC-3′和 [0217] MT02：5′-GTTGTTGAGCTCGATAAATTGCACTGAAATCTAGAGCGGTTC-3′ [0218] 然后用限制性内切酶AccI和SacI消化这个插入片段，纯化后连接到AccI/SacI消化的pSup载体内(24)。测序结果表明质粒中第二tRNA表达盒的proK启动子上有一个G到A的突变，这个突变导致了更多的活克隆具有了功能活性。因此保留了这个突变。pCDF-Keto制备出来以后，利用限制性内切酶位点NdeI和PstI将其他合成酶交换到载体内以制备pCDF-Bpy，其中掺入了双吡啶丙氨酸；pCDF-SY，其中掺入了磺酸酪氨酸；以及pCDF-1BGll，其中掺入了4-二羟硼基-苯丙氨酸，所有这些都能响应琥珀密码子。然后将这些pCDF质粒转化到Top 10F′(Invitrogen)内形成Keto-X-E.coli、Bpy-X-E.coli、SY-X-E.coli和Boro-X-E.coli，并在抗生素氯霉素(30g/mL)和四环素(30g/mL)上生长。 [0219] pSEX-GermTAG和pSEX-GermTAT质粒的构建 [0220] [0002]利用Blue Heron合成包含VH 3-23和VL A27的Fab形式的抗体，其中在CDR3环上有TAG。为了构建pSEX-GermTAG，首先利用如下引物从这个合成的Fab抗体中扩增轻链基因： [0221] LC1：5′-GCACGCGTAGAAATTGTGTTGACG-3′ [0222] 和 [0223] LC2：5′-CTTTGGATCCAGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCC-3’ [0224] 随后用Mlu和BamHI消化这个轻链基因，然后将其插入到用相同内切酶消化的pSEX81(Progen)中形成pSEX-GermA27。然后利用如下引物从这个合成的Fab抗体基因中扩增重链基因： [0225] HC1：5′-CGGCCAGGCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3′ [0226] 和 [0227] HC2：5′-CTTCAAGCTTTGGGGCGGATGCACTCCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGG-3′ [0228] 再用NcoI和HindIII消化。将这个序列插入到用相同的内切酶消化的pSEX-GermA27内形成pSEX-GermTAG。利用Quickchange(Stratagene)定向诱变技术制备pSEX-GermTAT，其中pSEX-GermTAG内的TAG密码子被TAT密码子取代。 [0229] 在这些pSEX质粒中，胰蛋白酶位点位于scFv和pIII之间，这样就可以去除展示的scFv，暴露出感染性的pIII。这对于洗脱和感染来说是至关重要的。 [0230] pSEX-GermNNK文库的构建 [0231] 利用如下引物从合成的Fab抗体中扩增包含VH3-23的重链基因片段： [0232] VH-23-F：5′TCTCGAAATCCATGGCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3′和 [0233] VH3-23-R：5′-TCTTTCGCACAGTAATATACGG-3′. [0234] 利用如下引物通过重叠PCR将随机化的CDR3环添加到这个片段内： [0235] NNK1：5′-CCGTATATTACTGTGCGAAAGANNNKNNKNNKNNKNNKNNKNACTACTTTGACTACTGGGG-3′ [0236] 和 [0237] NNK2：5′-AGCCATCGCGGCCGCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCAAAG-3′ [0238] 其中N＝A、T、G或C，K＝G或T。然后利用如下引物扩增包含完整重链文库的最终基因产物： [0239] HC1：5′-CGGCCATGGCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3′ [0240] 和 [0241] HC2：5’-CTTCAAGCTTTGGGGCGGATGCACTCCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGG-3′. [0242] 在限制性内切酶位点NcoI和HindIII上消化这个产物并将其插入到用相同的内切酶消化的pSEX-GermTAT内形成文库pSEX-GermNNK。沉淀连接混合物，连接产物转化到8 电穿孔感受态Top 10F′细胞内，总共得到5x10 个转化子。在添加100g/mL氨苄青霉素、 30g/mL四环素和1％葡萄糖的2YT中过夜培养，然后分离超螺旋DNA。然后将这个DNA转化到Keto-X-E.coli、Bpy-X-E.coli、SY-X-E.coli和Boro-X-E.coli内用于在群体上进行噬菌体展示研究。 [0243] pSEX-412d2TAT和pSEX-412d2TAG的构建 [0244] 利用如下引物从哺乳动物412d表达载体(18)中扩增scFv编码区： [0245] 412dF：5′CACGCCATGGCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTG-3′ [0246] 和 [0247] 412dB：5′-CTTTGGATCCAGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCCT GGCCAAA-3′. [0248] 得到的scFv用NcoI和BamHI消化，然后插入到用相同内切酶消化的pSEX81内形成pSEX-412d2TAT。利用Quickchange(Stratagene)定向诱变技术将两个哺乳动物酪氨酸硫化位点(残基104和107)替换成琥珀密码子，形成pSEX-412d2TAG。 [0249] 412d文库的制备 [0250] 为了制备包含随机分布的残基Pro101、Tys104、Asn107、Ala108、Pro109、Gly112和Met113的412d文库，我们首先利用如下引物从pSEX-412d2TAG中扩增重链片段： [0251] 412dLib1：5′-CCGCTGGCTTGCTGCTGCTG-3′ [0252] 和 [0253] 412dLib2：5′-GTAAGGGCTCGCACAGTAAAATACGGCC-3′. [0254] 然后利用如下引物通过重叠PCR扩展得到的产物： [0255] 412dLib3： [0256] 5′-GCCGTATTTTACTGTGCGAGCCCTTACNNKAATGACNNKNNKGACNNKNNKNNKGAGGAGNNKNNK AGCTGGT ACTTCGATCTCTG-3′ [0257] 和 [0258] 412dLib4：CAGAGATCGAAGTACCAGCT [0259] 其中N＝A、T、G或C，K＝G或T。利用如下引物从pSEX-412d2TAG扩增第二片段： [0260] 412dLib5：AGCTGGTACTTCGATCTCTG [0261] 和 [0262] 412dLib6：CTCTGATATCTTTGGATCCA [0263] 通过重叠PCR将两个片段装配在一起形成412d基因文库。这个文库用NcoI和BamHI消化后插入到用相同的内切酶消化的pSEX81载体内。连接产物与辅助tRNA共沉淀，8 然后转化到Top 10F’细胞内，总共得到2x10 个转化子。在添加100g/mL氨苄青霉素、30g/mL四环素和1％葡萄糖的2YT中过夜培养，然后分离超螺旋DNA。然后将这个DNA转化到SY-X-E.coli内用于噬菌体展示和抗gp120抗体的筛选。 [0264] 用于抗-gp120抗体筛选的天然种系抗体文库的制备 [0265] 利用如下引物从人cDNA中扩增种系VH片段的混合物： [0266] VH-Mix-F：5′-TCTCGAAATCCATGGCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′ [0267] 和 [0268] VH-Mix-R：5′-TCTCTCGCACAGTAATACACGGCCG-3′. [0269] 这个PCR反应的退火温度为56℃。利用如下引物通过重叠PCR将随机化的CDR3环添加到这些片段内： [0270] NNK1：5′-CGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGANNNKNNKKNKNNKNNKNNKNACTACTTTGACTACTGGGG-3′ [0271] 和 [0272] NNK2：5′-AGCCATCGCGGCCGCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCAAAG-3′ [0273] 其中N＝A、T、G或C，K＝G或T。然后利用如下引物扩增最终的基因产物： [0274] VH66CC-F：5′-CCGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′ [0275] 和 [0276] VH66CC-R：5 ′ CTTCAAGCTTTGGGGCGGATGCACTCCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCT-3′.’. [0277] 利用NcoI和HindIII消化这个PCR文库并将其插入到用相同内切酶消化的pSEX-GermTAT内形成天然种系scFv的文库。沉淀连接混合物，连接产物转化到电穿孔感 9 受态Top 10想F′细胞内，总共得到2x10 个转化子。在添加100g/mL氨苄青霉素、30g/mL四环素和1％葡萄糖的2YT中过夜培养，然后分离超螺旋DNA。然后将这个DNA转化到SY-X-E.coli内用于噬菌体展示和抗gp120抗体的筛选。 [0278] 噬菌体制备 [0279] 在优化条件下进行的所有试验都使用如下的噬菌体表达方法。首先，嗜菌粒文库或单个嗜菌粒克隆转化的X-E.coli培养物在添加100g/mL氨苄青霉素、30g/mL四环素和1％葡萄糖的2YT中过夜培养。达到饱和以后，从培养物中取出总体积等于噬菌体表达终体积12.5％的培养物离心，然后重悬到2YT中， 体积等于噬菌体表达终体积的25％。2YT中添加了100g/mL氨苄青霉素、30g/mL四环素和30g/mL氯霉素。将20MOI(MOI＝感染复数)的超噬菌体(Progen)添加到这个培养物中，然后在100rpm、37℃下孵育1小时，离心细胞，去除培养基。然后将噬菌体重悬到理想的最终噬菌体表达体积的2YT中，其中添加了100g/mL氨苄青霉素、50g/mL卡那霉素和30g/mL氯霉素。X-E.coli相应的非天然氨基酸直接添加到培养基中，噬菌体培养物在280rpm、30℃孵育18小时。对于Keto-X-E.coli、Bpy-X-E.coli、SY-X-E.coli和Boro-X-E.coli来说，非天然氨基酸的添加浓度分别为8mM、15mM、1.5mM和 6.5mM(13mM的消旋混合物)。对于Bpy-X-E.coli来说，还要添加20mM FeSO4与抑制离子耗竭相关的毒性。对于Boro-X-E.coli来说，添加25mM NaOH以稳定氨基酸。对乙酰苯丙氨酸由Synchem基于发表的方法合成(7)，磺酸酪氨酸购自Senn Chemicals和Bachem，4-二羟硼基-苯丙氨酸混合购自Aldrich，是D和L异构体的混合物。双吡啶丙氨酸的合成参见下文。 [0280] 噬菌体产生出来以后，收集培养基，弃去细胞。然后用10kD截断浓缩器(Amicon)将培养基浓度到合适的体积。通过添加5x噬菌体沉淀缓冲液(20％PEG8000，2.5mM NaCl)沉淀浓缩的噬菌体，溶解到合适体积的磷酸盐缓冲液，pH7(PBS)中。沉淀进行两次。 [0281] 双吡啶丙氨酸的合成 [0282] 5-甲基-2，2′-双吡啶。用无水甲苯(250mL)制备2-溴-5-甲基吡啶(5.0g，29mmol)、2-三丁基甲锡烷基吡啶(10g，27mmol)和Pd(PPh3)4(2.0g，1.7mmol)的混合物，在110℃搅拌18小时。反应混合物通过Celite过滤，在负压下蒸发。残留物溶解到EtOAc中，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，有机层在MgSO4上干燥，在负压下浓缩。快速柱层析(0.5％MeOH，溶于CH2Cl2)以无色油状物的形式提供甲基-2，2′-双吡啶(3.5g，75％)。 1 H-NMR(500MHz，CDCl3)： 2.47(s，3H)、7.35(dd，1H)、7.70(dd，1H)、7.87(m，1H)、8.36(d， 1H)、8.43(d，1H)、8.58(d，1H)、8.74(dd，1H)。 [0283] 2-(2，2′-双吡啶-5-基甲基)-2-乙酰氨基丙二酸二乙酯。甲基-2，2′-双吡啶(1.7g，10mmol)混合到水和苯(1∶1)的混合容积(100mL)中，利用卤素灯(150w)辐射和回流。添加溴(1.6g，10mmol)，混合物加热回流30分 钟。溶液在负压下浓缩，溶解到EtOAc中。用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机层，在MgSO4上干燥，在负压下浓缩，得到粗溴化产物。利用无水DMF(50mL)配制乙酰氨基丙二酸二乙酯(2.6g，12mmol)和氢化钠(0.48g，12mmol，60％，溶于矿物油)的混合物，在0℃搅拌30分钟。在0℃条件下向溶液中添加无水DMF(20mL)溶解的粗产物，混合物在室温下搅拌1小时。然后用EtOAc(200mL)稀释反应混合物，用10％硫代硫酸钠水溶液(2×150mL)洗涤两次。有机层在MgSO4上干燥，在负压下浓缩。粗产物通过快速柱层析(0.5％MeOH，溶于CH2Cl2)纯化，得到白色固体形式的 1 2-(2，2′-双吡啶-5-基甲基)-2-乙酰氨基丙二酸二乙酯(2.5g，65％)。H-NMR(500MHz，CDCl3)： 1.38(m，6H)、2.15(s，3H)、3.81(s，2H)、4.35(m，4H)、6.68(s，1H)、7.36(dd，1H)、 7.55(dd，1H)、7.87(m，1H)、8.36(d，1H)、8.41(d，1H)、8.42(d，1H)、8.74(dd，1H)。 [0284] 双吡啶-丙氨酸：3-(2，2′-双吡啶-5-基)-2-氨基丙氨酸。2-(2，2′-双吡啶-5-基甲基)-2-乙酰氨基丙二酸二乙酯(2.5g，6.5mmol)溶于12M HCl中，加热回流6小时。反应混合在负压下浓缩得到HCl盐形式的白色固体产物(2.3g，99％)。 1 H-NMR(500MHz，CDCl3： 3.59(m，2H)、4.58(t，1H)、8.11(m，1H)、8.40(dd，1H)、8.67(d， 1H)、8.70(m，1H)、8.83(d，1H)、8.99(dd，1H)。C13H13N3O2(M+1)LC-MS(ESI)：计算值243.1，实测值243.1。 [0285] 噬菌体纯化 [0286] 两种方法用于测定噬菌体的滴度(16)。在用于感染性噬菌体为相关群体的筛选时，通过感染Top 10F′细胞来对噬菌体进行定量。具体地说，用1.75μg/mL胰蛋白酶(Worthington Biochemicals)消化少量噬菌体，用于感染Top 10F′细胞。然后通过在筛选平板(氨苄青霉素平板用于以pSEX为基础的嗜菌粒)上接种稀释液来确定感染细胞的数量。在用于ELISA时，其中噬菌体的总颗粒是相关群体，噬菌体包被到ELISA板上，用PBS溶解的2％乳蛋白封闭，用PBST(PBS+0.025％Tween 20)洗涤数次，然后与溶解到2％乳蛋白PBST内的抗M13多克隆抗体(NEB)结合，利用QuantaBlu发荧光底物(Pierce)检测。该样品与标准曲线比较，其中平板上吸附有已知量的超噬菌体并且经过相同的处理。当比较多个样品时，可以对样品进行标准化以使其产生相同的滴度 信号。 [0287] gp120结合噬菌体的筛选 [0288] 用100μL PBS溶解的0.5g可溶性的ADA gp120包被到MaxiSorp(Nunc)微滴定板的孔内，37℃孵育12小时。用PBS溶解的2％乳蛋白(Biorad)封闭2小时，然后用200μL PBST洗涤3次，添加100μL2％乳蛋白PBST溶解的浓缩噬菌体文库，37℃孵育4小时。用PBST和PBS洗涤，噬菌体用1.75μg/mL胰蛋白酶(Worthington Biochemicals)洗脱12分钟。洗脱下来的噬菌体用于感染20mL 0.4O.D.的SY-X-E.coli培养物，其中添加了30μg/mL氯霉素和30μg/mL四环素。在37℃孵育1小时使其感染，然后接种少量细胞以确定洗脱的噬菌体数。其余细胞离心，然后重悬到添加30μg/mL氯霉素、30μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素和1％葡萄糖的25mL 2YT中。过夜培养后富集的文库用于在随后几轮中生产噬菌体。 [0289] 通过ELISA确定gp120结合亲和力 [0290] 对于每个样品来说，用100μL PBS溶解的0.33μg可溶性ADA gp120包被MaxiSorp(Nunc)微滴定板孔的表面，37℃孵育12小时。用PBS溶解的200μL 2％乳蛋白(Bio-rad)封闭2小时，然后添加100μL 2％乳蛋白PBST溶解的Fab蛋白，该蛋白是按照上述方法纯化和定量的，37℃孵育2小时。用PBST洗涤5次后加入110μL 2％乳蛋白PBST溶解的抗人κ轻链抗体(Sigma)，37℃孵育2小时。用PBST洗涤8次后加入QuantaBlu发荧光底物(Pierce)，利用荧光平板计数器(SpectraMax Gemini)测定ELISA信号。 [0291] 利用掺杂文库进行gp 120-结合筛选 [0292] 我们利用通用的gp120-结合筛选方法(见上)。该筛选的特殊之处在于使用如下洗涤方案： [0293] 第1轮：洗涤的10X w/200μL PBST/洗涤；～1分钟/洗涤 [0294] 第2轮：洗涤的12X w/200μL PBST/洗涤；～1分钟/洗涤 [0295] 第3轮：洗涤的14X w/200μL PBST/洗涤；～1分钟/洗涤 [0296] 第4轮：洗涤的15X w/200μL PBST/洗涤；～1分钟/洗涤 [0297] 对于该筛选来说，各轮筛选中加载和洗脱的噬菌体量如下表所示。表中还列出了洗脱前最后一次洗涤液中的噬菌体量，如果测定的话。 [0298] 轮次 加载的 洗脱的 最终洗涤液中的 加载/洗脱 [0299] 噬菌体量 噬菌体量 噬菌体量 [0300] 1 1.23x109 4000 ＜40 3.08x105 [0301] 2 4.5x108 1.08x104 40 4.17x104 [0302] 3 6.3x106 1.7x104 220 370 [0303] 4 3x107 7600 ND 3747 [0304] 对于该筛选来说，包含至少1个ATG的噬菌体所占的百分数和包含412d2TAG掺杂克隆的噬菌体所占的百分数列在下表中。 [0305] 轮次 包含至少一个TAG的噬菌体％ 包含412d2TAG掺杂克隆的噬菌体％ [0306] 1 17(n＝40) 2.2(n＝45) [0307] 2 14.5(n＝55) 10.9(n＝55) [0308] 3 86(n＝50) 74(n＝50) [0309] 4 100(n＝20) 100(n＝20) [0310] 利用天然种系文库进行gp120-结合筛选 [0311] 我们利用通用的gp120-结合筛选方法(见上)。该筛选的特殊之处在于使用如下洗涤方案： [0312] 第1轮：洗涤的2X w/200μL PBST/洗涤；～1分钟/洗涤。 [0313] 第2轮：洗涤的10X w/200μL PBST/洗涤和1X w/200μL PBS；～1分钟/洗涤。 [0314] 第3轮：洗涤的10X w/200μL PBST/洗涤和1X w/200μL PBS；～1分钟/洗涤。 [0315] 第4轮：洗涤的10X w/200μL PBST/洗涤和1X w/200μL PBS；～1分钟/洗涤。 [0316] 对于该筛选来说，各轮筛选中加载和洗脱的噬菌体量如下表所示。需要注意的是，第1轮的严格程度较低，因此洗脱的噬菌体量较高。这确保了当文库中的每个克隆只有很少几个拷贝时不会发生功能性克隆的随意丢失。 [0317] 轮次 加载的噬菌体量 洗脱的噬菌体量 加载/洗脱 [0318] 1 1.28x109 2.0x105 6400 [0319] 2 2.72x108 9200 2.86x104 [0320] 3 1x109 2.4x105 4166 [0321] 4 2.5x107 3.5x104 714 [0322] 游离scFv蛋白的表达 [0323] 为了表达游离蛋白形式而不是与噬菌体融合的scFv，利用标准方法将scFvs66CC8、412d-2SY和412d-Y的编码区插入到包含gIII胞质信号序列和C端6X-组氨酸标签的pBAD表达载体内，形成pBAD-66CC8、pBAD-412d-2SY和pBAD-412d-Y。 [0324] 为了表达scFv 412d-Y，在添加100μg/mL氨苄青霉素的2YT中250rpm、37℃培养包含pBAD-412d-Y的Top10F’细胞，直到光密度值达到0.6，在该时间点上用0.1％L阿拉伯糖诱导scFv生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离心沉淀细胞团，然后用8M尿素裂解，因为生成的是不溶性的scFv。利用蛋白质重折叠试剂盒(Novagen)重折叠得到可溶性的scFv。 [0325] 为了表达scFv 412d-2SY，在添加100μg/mL氨苄青霉素、30μg/mL氯霉素和10mM磺酸酪氨酸(Bachem)的2YT中250rpm、37℃培养包含pBAD-412d-SY和pSUPAR6-L3-3SY的Top10F’细胞，其中pSUPAR6-L3-3SY是经过优化后适用于表达非天然氨基酸的质粒，在该例子中pSUPAR6-L3-3SY包含磺酸酪氨酸特异性的合成酶和相应的正交tRNA(Cellitti，S.，Jones，D.，Lagpacan，L.，Hao，X.，Zhang，Q.，Hu，H.，Brittain，S.，Brinker，A.，Caldwell，J.，Bursulaya，B.，Spraggon，G.，Brock，A.，Ryu，Y.，Uno，T.，Schultz，P.，Geierstanger，B.J.Am.Chem.Soc.(2008)130，9268-9281)。当光密度值达到0.6时利用0.2％L阿拉伯糖诱导合成酶和scFv生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离心沉淀细胞团，然后用8M尿素裂解。利用蛋白质重折叠试剂盒(Novagen)重折叠得到可溶性的scFv。 [0326] 为了表达scFv 66CC8-SY，在添加100μg/mL氨苄青霉素、30μg/mL氯霉素和10mM磺酸酪氨酸(Bachem)的2YT中250rpm、37℃培养包含pBAD-66CC8的Top10F’细胞。当光密度值达到0.6时利用0.2％L阿拉伯糖诱导合成酶和scFv生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离 心沉淀细胞团，然后用8M尿素裂解。重折叠没有成功，因为没有回收到可溶性的蛋白质。 [0327] 为了表达scFv 66CC8-Y，在添加100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的2YT中250rpm、37℃培养包含pBAD-66CC8和pCDF-JYRS的Top10F’细胞，其中pCDF-JYRS是能响应TAG而编码酪氨酸的质粒。当光密度值达到0.6时利用0.2％L阿拉伯糖诱导合成酶和scFv生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离心沉淀细胞团，然后用8M尿素裂解。重折叠没有成功，因为没有回收到可溶性的蛋白质。 [0328] 利用已知浓度的抗6XHis抗体(Sigma)和标准6X-组氨酸标签蛋白通过Western印迹分析确定蛋白质的产量。 [0329] 游离Fab蛋白的表达和纯化 [0330] 为了将噬菌体展示的scFv转化成Fab形式，利用标准方法分别将scFvs66CC14、66CC8、412d-2SY和412d-Y的轻链和重链可变区插入到包含人重链和轻链恒定区(通过Blue Heron合成 的)的pBC表 达载体 内，得 到pBC-66CC14Fab、pBC-66CC8Fab、pBC-412d-2SYFab和pBC-412d-YFab，这些载体可用于从lac启动子控制下的双顺反子构建物中表达Fab。 [0331] 为了表达Fab形式的66CC14和412d-Y，在添加100μg/mL氨苄青霉素的2YT中250rpm、37℃培养包含pBC-66CC14Fab或pBC-412d-YFab的Top10F’细胞，直到光密度值达到0.6，在该时间点用1mM IPTG诱导Fab生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离心沉淀细胞团，用1/20培养物体积的胞质裂解缓冲液(20％蔗糖、30mM Tris-HCl、 1mM EDTA、1mg/mL溶酶体酶，pH 7.4)裂解三次。收集胞质裂解物，利用蛋白G树脂进行纯化。 [0332] 为了表达Fab形式的412d-2SY和66CC8-SY，在添加100μg/mL氨苄青霉素、30μg/mL氯霉素和10mM磺酸酪氨酸(Bachem)的2YT中250rpm、37℃培养包含 pBC-412d-SYFab或pBC-66CC8-SYFab以及pSUPAR6-L3-3SY的Top10F’细胞。当光密度值达到0.3时利用0.2％L阿拉伯糖诱导合成酶生成。当光密度值达到0.6时用1mM IPTG诱导Fab生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离心沉淀细胞团，用1/20培养物体积的胞质裂解缓冲液裂解三次。收集胞质裂解物，利用蛋白G树脂进行纯化。 [0333] 为了表达Fab形式的66CC8-Y，在添加100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的2YT中250rpm、37℃培养包含pBC-66CC8Fab和pCDF-JYRS的Top10F’细胞。当光密度值达到0.3时利用0.2％L阿拉伯糖诱导合成酶生成。当光密度值达到0.6时用1mM IPTG诱导Fab生成。然后在室温下以250rpm振荡孵育培养物30小时，离心沉淀细胞团，用1/20培养物体积的胞质裂解缓冲液裂解三次。收集胞质裂解物，利用蛋白G树脂进行纯化。 [0334] 为了利用蛋白G纯化胞质裂解物，将1mL蛋白G树脂(Pierce)填充到1mL聚丙烯柱(Qiagen)中。色谱柱用5mL结合缓冲液(50mM MES，100mMNaCl，pH 5.5)平衡以后将胞质裂解物上载到色谱柱内，通过重力作用使裂解物流过色谱柱。然后用15mL结合缓冲液洗涤色谱柱，再用5mL洗脱缓冲液(100mM甘氨酸，pH2.8)洗脱，色谱柱被立即中和到pH7.4。 洗脱下列的Fab用PBS透析，浓缩后用于下一步的试验。 [0335] 通过测定λ＝280处的UV吸收确定Fab的产量。 [0336] 参考文献 [0337] 1.Vetsigian K，Woese C & Goldenfeld N(2006)集 体 进 化 和 遗 传 密 码(Collective evolution and the genetic code).Proc Natl A cad Sci USA 103(28)：10696-10701。 [0338] 2.Wang L，Xie J & Schultz PG(2006) 扩 展 遗 传 密 码 (Expanding the geneticcode).Annual review of biophysics and biomolecular structure 35：225-249。 [0339] 3.Xie J，Liu W & Schultz PG(2007)遗传编码的二齿金属结合氨基酸(Agenetically encoded bidentate，metal-binding amino acid).Angewandte Chemie(国际版)46(48)：9239-9242。 [0340] 4.Brustad E等(2008)遗传编码的硼酸(A genetically encoded boronic acid).Angewandte Chemie(国际版)特发表。 [0341] 5.Liu CC&Schultz PG(2006)特异性硫化蛋白质在大肠杆菌内的重组表达(Recombinant expression of selectively sulfated proteins in Escherichia coli).Nature biotechnology 24(11)：1436-1440。 [0342] 6.Liu CC，Brustad E，Liu W，&Schultz PG(2007)与凝血酶复合的生物 合成硫化水蛭素的晶体结构(Crystal structure of a biosynthetic sulfohirudincomplexed to thrombin).Journal of the American Chemical Society 129(35)：10648-10649。 [0343] 7.Wang L，Zhang Z，Brock A，&Schultz PG(2003)将酮官能团添加给大肠杆菌的遗传密码(Addition of the keto functional group to the genetic code ofEscherichia coli).Proc Natl Acad Sci USA 100(1)：56-61。 [0344] 8.Xia G等，(2002)新型聚合酶活性的定向进化：DNA聚合酶突变成有效的RNA聚合酶(Directed evolution of novel polymerase activities：mutation of aDNA polymerase into an efficient RNA polymerase).Proc Natl Acad Sci USA99(10)：6597-6602。 [0345] 9.Rebar EJ & Pabo CO(1994)锌指噬菌体：具有新DNA结合特异性的锌指的亲和力筛选(Zinc finger phage：affinity selection of fingers with newDNA-binding specificities).Science 263(5147)：671-673。 [0346] 10.Rader C & Barbas CF，第三版，(1997)组合抗体文库的噬菌体展示(Phage display of combinatorial antibody libraries).Current opinion inbiotechnology8(4)：503-508。 [0347] 11.Martin A，Sieber V & Schmid FX(2001)具有优化表面的高稳定性蛋白变体的体外筛选(In-vitro selection of highly stabilized protein variants withoptimized surface).Journal of molecular biology 309(3)：717-726。 [0348] 12.Famm K & Winter G(2006)通过定向进化改造凝集耐受性的蛋白质(Engineering aggregation-resistant proteins by directed evolution).Protein EngDes Sel 19(10)：479-481。 [0349] 13.Brakmann S & Johnsson K(2002)《蛋 白 质 的 定 向 分 子 进 化》(DirectedMolecular Evolution of Proteins)(Wiley-VCH，Weinheim). [0350] 14.Tian F，Tsao ML & Schultz PG(2004)含有非天然氨基酸的噬菌体展示系统(A phage display system with unnatural amino acids).Journal of theAmerican Chemical Society 126(49)：15962-15963。 [0351] 15.Rondot S，Koch J，Breitling F & Dubel S(2001)一种用于提高单链抗体在噬菌体展示中所占比例的辅助噬菌体(A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display).Nature biotechnology19(1)：75-78。 [0352] 16.Broders O，Breitling F & Dubel S(2003)超噬菌体。提高抗体在噬菌体展示中的比例(Hyperphage.Improving antibody presentation in phage display).Methods in molecular biology 205：295-302。 [0353] 17.Farzan M等，(1999)CCR5氨基端的酪氨酸发生硫化作用可促进HIV-1进入(Tyrosine sulfation of the amino terminus of CCR5 facilitates HIV-1 entry).Cell96(5)：667-676。 [0354] 18.Choe H等，(2003)人抗体的酪氨酸发生硫化作用有助于HIV-1 GP120CCR5结合区的识别(Tyrosine sulfation of human antibodies contributes torecognitionof the CCR5 binding region of HIV-1 gp120).Cell 114(2)：161-170。 [0355] 19.Huang CC 等，(2007)Structures of the CCR5 N terminus and of atyrosine-sulfated antibody with HIV-1 gp120 and CD4。Science317(5846)：1930-1934。 [0356] 20.Huang CC等，(2004)酪氨酸硫化作用的结构偏性和VH基因在识别gp120上的HIV-1型辅助受体结合位点的抗体中的应用(Structural basis oftyrosine sulfation and VH-gene usage in antibodies that recognize the HIV type 1coreceptor-binding site on gp120).Proc Natl Acad Sci USA 101(9)：2706-2711。 [0357] 21.Yoo TH，Link AJ & Tirrell DA(2007)氟化绿色荧光蛋白的进化(Evolution of a fluorinated green fluorescent protein).Proc Natl Acad Sci USA104(35)：13887-13890。 [0358] 22.Love KR，Swoboda JG，Noren CJ & Walker S(2006)促使糖基转移酶进化：一种用于噬菌体展示酶进化的便捷底物结合策略(Enablingglycosyltransferase evolution：a facile substrate-attachment strategy forphage-display enzyme evolution).Chembiochem 7(5)：753-756。 [0359] 23.Nijkamp HJ等，(1986)产细菌质粒CloDF13的完整核苷酸序列(Thecomplete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13).Plasmid16(2)：135-160。 [0360] 24.Ryu Y & Schultz PG(2006)非天然氨基酸向大肠杆菌的蛋白质内的有 效掺入(Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins inEscherichia coli).Nature methods 3(4)：263-265。 [0361] 图例 [0362] 图7.非天然氨基酸的嗜菌粒展示。(a)磺酸酪氨酸的结构。(b)对乙酰苯丙氨酸的结构。(c)双吡啶丙氨酸的结构。(d)4-二羟硼基-苯丙氨酸的结构。(e)优化条件下的噬菌体产率(参见方法)，其中+UAA表示在培养基中添加相应非天然氨基酸(UAA)时生产出的噬菌体(参见方法)，-UAA表示在缺少相应的非天然氨基酸时生产出的噬菌体。滴度值得自三个复孔的数据，误差棒代表+标准差。(f)从在非天然氨基酸存在的条件下利用8 pSEX-GermTAG生产的完整噬菌体中检测pIII-scFv融合蛋白。每个样品约10 个噬菌体颗粒(相当于约200μL噬菌体培养物，沉淀并浓缩到约10μL)在还原条件下进行变性PAGE凝胶电泳，随后转移到膜上，利用抗pIII抗体进行Western印迹分析。在缺乏非天然氨基酸的条件下利用pSEX-GermTAG生产和制备的同样体积的噬菌体电泳并利用pIII抗体进行Western印迹分析时未检测到条带。超噬菌体对应于未展示scFv的噬菌体。对照对应于展示pIII-scFv融合蛋白的噬菌体，其中pIII-scFv融合蛋白来自于只包含常见氨基酸的pSEX-GermTAT-51kD条带是62kD条带(pIII-scFv融合蛋白)发生非特异性蛋白裂解的结果。 [0363] 图 8.pSEX-GermNNK 文 库 在 Keto-X-E.coli、SY-X-E.coli、Bpy-X-E.coli 或Boro-X-E.coli内表达噬菌体后(n＝20)包含TAG密码子的噬菌体克隆所占的百分率。预测值为17.3％；偏差代表有利于只含20种常规氨基酸的序列的偏性。噬菌体在优化条件下制备。 [0364] 图9.每毫升412d-2SY培养物中的噬菌体产量以及与之相比较的初始噬菌体文库和第3轮筛选时的文库的噬菌体产量。所有噬菌体都是用SY-X-E.coli制备的。对于412d-2SY来说，计算出三个独立噬菌体制备物的滴度的平均值，误差棒代表+标准差。 [0365] 图10.通过噬菌体ELISA方法检测筛选自掺杂412d文库的412d-2SY和磺酸酪氨酸被酪氨酸取代的412d-Y与gp120结合亲和力的比较。在检测每一个样品时，将0.33μg gp120包被到Maxisorp板上，用2％乳蛋白封闭，然后与各自 的噬菌体结合。噬菌体用抗M13抗体检测。BSA结合作为对照用于显示特异性的gp120结合。模拟是指未添加任何噬菌体时产生的信号。 [0366] 图11.(a)根据每一轮筛选后洗脱出来的噬菌体量判断出来的gp120结合能力的富集情况。第1轮筛选是在严格程度比随后几轮低很多的情况下进行的(参见方法)，这是为了使每个克隆只有几个拷贝时发生功能性克隆的随意丢失达到最小化。(b)根据测序结果发现，每一轮筛选过后包含磺酸酪氨酸的克隆所占的百分率都升高(n＝15-30). [0367] 图12.每毫升66CC8-SY培养物中的噬菌体产量以及与之相比较的初始噬菌体文库和第3轮筛选时的文库的噬菌体产量。所有噬菌体都是用SY-X-E.coli制备的。对于66CC8-SY来说，计算出三个独立噬菌体制备物的滴度的平均值，误差棒代表+标准差。对于 6 66CC8-SY来说，当从培养基中去除非天然氨基酸时，噬菌体的产量约为5x10。 [0368] 图13.通过噬菌体ELISA方法检测66CC8-SY、66CC8-Y和66CC14与gp120结合能力。在检测每一个样品时，将0.3μg gp120包被到微滴定板的孔内，用2％乳蛋白封闭，然后与各自的噬菌体结合。噬菌体用抗M13抗体检测。BSA结合作为对照用于显示特异性的gp120结合。(a)利用两个噬菌体浓度进行的代表性gp120结合试验的ELISA结果。(b)利用两个独立的噬菌体制备物进行的4次独立试验所产生的ELISA信号的平均值。所有试验都用相同量的噬菌体，无论何种样品。根据同一个试验内的412d-2SY的结合对信号进行标准化，然后从标准化的信号中计算出平均值。误差棒代表+标准差。我们注意到，这个图放大了变异，这是因为不同的ELISA试验使用了不同浓度的噬菌体，代表不同的孵育、洗涤、生色和检测时间。 [0369] 图14a描述的是使用抗人κ轻链HRP抗体的G蛋白纯化的Fab的Western印迹分析结果，利用金属增强DAB试剂盒(Pierce)显色。样品用变性PAGE胶(Invitrogen NuPAGE 4-12％Bis-Tris)电泳。对66CC8-SY和412d-SY来说，缺少磺酸酪氨酸的表达相应的泳道也显示硫化抗体的表达依赖于磺酸酪氨酸的存在。图14b-f描述的是Fab 66CC14、 66CC8-SY、66CC8-Y、412d-SY和412d-Y的LCMS(ESI-阳性)光谱。图14g显示的是纯化的Fab 412d-2SY、412d-Y、66CC8-SY、66CC8和66CC14所结合的gp120的ELISA检测结果。 [0370] 虽然为了澄清和理解的目的在上文对本发明的某些细节进行了描述，但是本领域的技术人员在阅读本说明书后应当清楚，只要不偏离本发明的真实范围，也可以对本发明的形式和细节作出各种改变。例如，上述各种技术和装置都可以各种组合的方式使用。本说明书引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文献都已通过引用完整纳入本文用于所有目的，其程度等同于各出版物、专利、专利申请和/或其他文献被单独指出通过引用纳入本文用于所有目的。 |
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