响应外部损伤和内部退化，机体的细胞必须修复包围每一单个 细胞的膜，以维持其有机体的功能和健康。细胞修复外膜能力的缺 陷与多种疾病和病理疾患相关，例如神经退行性疾病(如帕金森 病)、心脏病发作、心脏衰竭、肌肉萎缩症、褥疮、糖尿病性溃疡、 氧化性损伤和组织损伤，如由于给予化疗药物的副作用而产生的鼻 窦炎。此外，与多种疾病相关的肌无力和萎缩，以及正常的衰老过 程也与膜修复改变相关。为了在急性损伤时修复其膜，这些细胞利 用位于细胞内部称为囊泡的小膜袋(small packet ofmembrane)。这 些囊泡通常位于细胞内部，但细胞膜损伤时，这些囊泡移至损伤部 位形成补片(patch)而维持细胞完整性。如果没有这项必要功能， 细胞可能死亡，而该细胞损伤的累积效应可能最终引起组织或器官 的功能障碍。
很多公司对改善多种组织再生能力的方法感兴趣。例如，预期 到2009年仅创伤修复市场就将超过110亿美元。因此，对用于治 疗与急性和慢性细胞和组织损伤相关疾患的细胞膜修复过程的药 物调节剂的开发存在持续的需要。

本发明涉及与细胞膜损伤修复相关的蛋白的惊人的意外发现。 本发明总体上涉及核酸，并包括由本发明的核酸编码的多肽。更具 体地，本发明涉及例如核酸的组合物，用于抑制靶核酸转录或翻译； 编码胞质、核、膜结合多肽以及分泌型多肽的核酸；以及载体、宿 主细胞、抗体、重组蛋白、假肽、融合蛋白、化合物以及用于生成 这些物质的方法。
在某些方面，本发明还涉及作为疾患和病症的治疗和预防的疗 法非常有用的组合物。本发明的治疗性组合物包括核酸，包括干扰 性核酸，和编码对应于SEQ ID NO.1(本文中，“MG53”)蛋白的 多肽的核酸、MG53多肽、其同系物及其部分、MG53假肽、MG53 肽类似物和MG53拟肽；以及能够调节MG53活性或涉及MG53 的分子间相互作用的化合物，以及例如小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)。 如本文中所述，MG53介导对细胞膜损伤的修复，因此，靶向和调 节MG53基因表达、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用，成为 组织修复的新型治疗性干预。
在某些其他方面，本发明涉及与组织损伤相关的组合物和方 法。在某些示例性实施方式中，本发明包括例如给予有效量的本发 明的治疗组合物，用于促进伤口愈合；用于缓解手术创伤，用于治 疗和/或预防组织修复中作为衰老过程固有副作用而发生的年龄相 关的缺陷；用于治疗和/或预防任何类型肌组织的损伤，如患心血管 疾病和/或运动相关损伤的个体中发生的损伤；以及由于化妆或个人 护理应用所致的机体组织的修复和再生。
此外，本发明涉及核酸，包括干扰性核酸，以及编码MG53相 互作用蛋白的多肽，如小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)多肽及其同系 物；假肽和拟肽；以及可以调节小窝蛋白-3的活性或其与MG53的 分子间相互作用的化合物。因此，在其他方面，本发明包括用于靶 向小窝蛋白-3基因表达、活性和/或分子间相互作用的方法，用于治 疗和/或预防患者疾患或病症，例如用于促进上述组织修复。
前述一般应用领域仅作为例子而给出，并非为了限制本发明和 所附权利要求的范围。根据本权利要求、说明书和实施例，本领域 的普通技术人员将能理解本发明的其他目的和优点。这些其他目的 和优点清楚地包含在本发明的范围之内。
附图说明
图1：MG53是TRIM蛋白家族的一种肌肉特异性成员。不同 生物MG53蛋白序列的比对(见SEQ ID No：1、3、5、9-16)表明 该蛋白是TRIM家族的成员。功能结构域以灰色框出，箭头表示该 结构域延伸至序列的另一行上。
图2：示出了某些同源性蛋白的示例性结构域比较，这些同源 性蛋白包含存在于MG53中的一种或多种保守三联基元。MG53在 多种形式损伤后易位至细胞膜损伤部位的能力方面比较独特，并介 导受损膜的修复-这是一种所列出的其他TRIM家族蛋白未表现出 的功能。
图3：MG53包含独特的TRIM和SPRY基元(或基序，motif)， 主要在肌细胞内表达。A.MG53的基元结构的示意图。根据cDNA 克隆和同源性搜索的结果，在MG53中检测到了示出的几个基元序 列。兔和小鼠MG53 cDNA的序列已经分别以编号AB231473和 AB231474储存于数据库中。B.蛋白印迹分析示出了骨骼肌和心肌 中MG53的特异性表达。利用抗小鼠MG53多克隆抗体分析小鼠组 织(肺、肾、骨骼肌、肝脏、心脏、脑)裂解物(20μg总蛋白/泳 道)。C.小鼠骨骼肌细胞的纵向横截面的免疫荧光染色。比例尺是 25μm。
图4：通过MG53在肌细胞和非肌细胞中的过表达诱导filapodia 样结构(或丝足样结构)。A.蛋白印迹分析示出了MG53在C2C12 成肌细胞(左图)和CHO(中图)细胞中的过表达水平，还示出了 GFP-MG53和MG53-GFP(右图)在C2C12成肌细胞中的过表达水 平(20μg总蛋白/泳道)。B.转染了GFP(左图)或GFP+MG53(右 图)的CHO(上图)和C2C12成肌细胞(下图)的典型共聚焦图像， 显示出MG53过表达后的filapodia样结构(或丝足样结构)。C.CHO 细胞(上图)和C2C12成肌细胞(下图)表达的GFP-MG53(左图) 和MG53-GFP(右图)的共聚焦图像，表明MG53的膜靶向和细胞 内囊泡分布以及filapodia样结构的出现。比例尺是5μm。D.放大 的共聚焦图像，示出了细胞内囊泡、质膜上的出芽囊泡(左图)和 细胞外囊泡(右图)。比例尺是1μm。
图5：MG53通过调节成肌细胞分化而促进骨骼肌的肌形成。 A.蛋白印迹分析显示，shRNA介导了CHO细胞中MG53的下调。 裂解物制备自CHO细胞，该细胞用MG53表达载体以及针对MG53 的shRNA或错配(scrambled)shRNA质粒转染。免疫印迹是利用 多克隆抗小鼠MG53抗体(上图)或单克隆α-actin抗体(下图) 而实施。B.C2C12细胞在不同分化天数的代表性荧光显微镜图像 (第0天，上图；第5天，中图；第10天，下图)，表明与错配 shRNA对照(左图)相比，用抗MG53的shRNA转染的细胞(右 图)中没有肌管形成。比例尺是50μm。C.与对照相比，MG53在 第5天或第10天抑制肌管形成的下调的统计分析(t检验，*p<0.01 和**p<0.001)。将绿色肌管与全部绿色细胞的比值定义为肌管的 百分比。数据是以均值和SEM表示。
图6：MG53与小窝蛋白-3之间的功能性相互作用调节骨骼肌 中的动态膜出芽过程。A.C2C12细胞分化过程中，在分化诱导后的 指定时间(第0、2、5、8、10天)，MG53(上图)、小窝蛋白-3 (中图)和小窝蛋白-1(下图)的表达水平的蛋白印迹分析。B.将 来自小鼠腓肠肌骨骼肌的总细胞裂解物利用抗MG53(兔多克隆抗 体)、抗小窝蛋白-3(小鼠单克隆抗体)、正常兔IgG(作为阴性 对照)和细胞裂解物(作为阳性对照)进行co-IP(免疫共沉淀)。 C.共聚焦图像，示出了与成肌细胞(左图)相比，C2C12肌管形 成(右图)过程中filapodia样结构的消失。可注意到，在转染的C2C12 肌管中仍然存在对GFP-MG53为阳性的细胞内囊泡。D.小窝蛋白-3在 C2C12成肌细胞中的过表达阻止了MG53诱导的filapodia样结构的 形成。CHO细胞(上图)或C2C12成肌细胞(下图)用pCDNA-Cav-3 和GFP-MG53(10:1)共转染(右图)，或用pcDNA载体和GFP-MG53 (10:1)共转染作为对照(左图)。转染后48小时获取共聚焦图像。 比例尺是10μm。E和F.对C和D的统计分析。将表现出filapodia 样结构的细胞与全部绿色细胞的比值定义为filapodia样结构百分 比。数据以均值和SEM表示(t检验，*p<0.01)。
图7：shRNA介导的小窝蛋白-3表达抑制影响肌管的形成。A. 用针对小窝蛋白-3的shRNA质粒转染后(分化6天后)，通过蛋 白印迹分析C2C12肌管中小窝蛋白-3的下调水平。用错配shRNA 质粒转染的细胞用作对照。B.与对照shRNA相比(左图)，利 用shRNA下调小窝蛋白-3(右图)抑制肌管形成。红色荧光指示 转染的细胞。在分化诱导后6天获取荧光显微镜图像。比例尺是 20μm。C.统计分析表明，第6天时，与对照相比，小窝蛋白-3 的下调显著抑制肌管形成(t检验，*p<0.001)。红色荧光肌管与 全部红色荧光细胞的比值作为肌管百分比。数据以均值和SEM表 示。D.共表达GFP-MG53和针对小窝蛋白-3的shRNA的C2C12 成肌细胞的共聚焦图像(右图)表明，与对照shRNA(左图)相 比，其对GFP-MG53所诱导的filapodia样结构或GFP-MG53的分 布没有影响。比例尺是5μm。
图8：用甲基-β-环糊精处理细胞引起GFP-MG53在C2C12成 肌细胞中的胞吐和增溶。A.代表性共聚焦图像，示出了在指定时 间点(0分钟，左图；15分钟，右图)的自发囊泡融合以及从膜出 芽脱落。比例尺是5μm。B.共聚焦图像，示出了在用10mM M-βCD 处理后，在指定时间点(0秒，左图；16秒，中图；32秒，右图) GFP-MG53诱导的囊泡迅速从膜出芽脱落。C.共聚焦图像，示出了 在用10mM M-βCD在室温下进行1小时的延长处理(右图)之后， 与处理前的相同细胞(左图)相比，GFP-MG53的增溶作用。比例 尺是5μm。
图9：MG53敲除小鼠对心脏损伤易感。来自未做运动 (unexercised)的野生型小鼠的心肌石蜡包埋切片表现为正常形态 (左)，无埃文斯蓝染色(右)。相比之下，mg53-/-小鼠表现为埃 文斯蓝渗入肌细胞，表明mg53-/-心脏的膜完整性存在显著缺陷。
图10：由于细胞膜损伤增加，mg53-/-骨骼肌中观察到恶化病 状。A.苏木素和伊红染色(H/E)示出了，在老龄mg53-/-肌肉(10m) 对比幼龄(3m)野生型(wt)或mg53-/-小鼠中其中央核数量增加 (箭头)。B.与老龄(8-10个月)野生型对照(黑色，n＝562)相 比，老龄(8-10个月)mg53-/-小鼠(蓝色，n＝541)中肌纤维直径 减小，但幼龄(3-5个月)wt(n＝765)与mg53-/-(n＝763)肌肉相 比则不存在差异。与wt相比，显示mg53-/-骨骼肌中中央核的肌纤 维百分比随年龄而增加。数据以均值±s.e.m.表示，利用ANOVA， *p<0.005。C.按照所述步骤，利用体外电压刺激法评价对从经过 30分钟下坡跑运动的小鼠中得到的完整比目鱼肌收缩性能进行的 跟踪记录。黑色跟踪代表wt肌肉，蓝色跟踪则对应于mg53-/-肌肉。 D.疲劳刺激前(前，空心柱)，最大强直收缩力，以g/mg总蛋白标准 化，在老龄肌肉(蓝色)中与wt(黑色)相比显著较低(n＝4)。疲劳刺 激后6分钟(后，实心柱)，wt肌肉的恢复显著好于mg53-/-肌肉。 利用ANOVA，*p<0.005。E.与wt肌肉中极低染色相比，强的埃 文斯蓝染色表明经历下坡跑的mg53-/-骨骼肌中存在重度损伤。F. 运动后，利用甲酰胺从老龄mg53-/-(蓝色)和wt(黑色)骨骼肌 中提取的埃文斯蓝染料量的图。数据表示埃文斯蓝的平均值(ng) /g肌肉±s.e.m。n＝8-12。通过Student’s t-检验，*p<0.005。
图11：去除MG53可引起肌细胞膜修复功能缺陷。(a)分离的 wt FDB纤维中MG53的免疫染色显示它们在损伤部位共定位。这 些是分离时出现损伤的20种以上不同肌纤维的代表性图像。(b) 激光诱导肌纤维膜损伤后，从wt小鼠中分离的FDB肌纤维中不透 膜性FM-143荧光染料的排除。(c)激光诱导性损伤后，FM-143荧 光染料进入从mg53-/-小鼠中分离的FDB肌纤维。指出了激光损伤 后的时间。(d)在由激光损伤肌纤维膜引起的FDB肌纤维内FM-143 的时间依赖性蓄积。数据为均值±s.e.m.，从wt小鼠获得的纤维数 n＝30以及从mg53-/-小鼠中获得的纤维数n＝18。
图12：物理损伤后，含MG53的囊泡在质膜中形成补片。A.利 用微量加液器损伤C2C12成肌细胞膜，引起GFP-MG53在损伤部 位(箭头)快速蓄积。图像代表n＝40的单个细胞。B.成熟C2C12 肌管响应重度损伤例如细胞膜分离时的恢复，与GFP-MG53向愈合 部位补充相关(n＝28)。
图13：TRIM和SPRY结构域在将MG53靶向肌细胞的细胞表 膜过程中的作用。A.MG53缺失融合蛋白构建体(GFP融合于N- 末端或C-末端)的示意图。参考SEQ ID NO.1，“TRIM”代表 a.a.1-287，“SPRY”代表a.a.288-477，且包括PRY和SPRY两个基 元。B.代表性共聚焦图像，示出了每一种缺失构建体在C2C12细 胞中的细胞内定位。比例尺为5μm。C.MG53通过TRIM基元与小 窝蛋白-3相互作用。来自用GFP-MG53或GFP-TRIM和 pcDNA-Cav-3共转染的CHO细胞的细胞裂解物，用抗小窝蛋白-3 (小鼠单克隆抗体)进行IP。(泳道1，混合的细胞裂解物作为阳 性对照；泳道2，正常小鼠IgG作为阴性对照；泳道3，来自过表 达GFP-MG53的细胞的裂解物；泳道4，来自过表达GFP-TRIM的 细胞的裂解物)。
图14：TRIM和SPRY结构域在将MG53靶向在非肌肉CHO 细胞中的细胞表膜过程中的作用。代表性共聚焦图像显示， GFP-MG53表现为细胞内囊泡、膜靶向和出芽，然而在天然状态下 MG53-GFP主要为可溶性(上图)；SPRY-GFP和GFP-SPRY是胞 浆(中图)；TRIM-GFP和GFP-TRIM主要为细胞内囊泡，并且不 靶向于质膜(下图)。“TRIM”代表a.a.1-287，“SPRY”代表a.a. 288-477，且包含PRY和SPRY两个基元。比例尺为5μm。
图15：重组TAT-MG53和突变构建体的纯化。(a)TAT-MG53 重组蛋白构建体和相关缺失构建体的示意图。(b)变性胶考马斯蓝染 色示出了TAT-MG53的纯化步骤。凝胶泳道用分子量标志物 (Marker)(M)、埃希氏大肠杆菌上清(Sup)、免疫亲和柱流出 液(FT)、洗液(W1、W2)和洗脱馏分(E1-5)上样。(c)从埃 希氏大肠杆菌分离的重组突变体TAT-MG53蛋白的考马斯染色变 性胶。
图16：产生表达RFP-MG53的稳定HEK293(人胚肾)细胞系。 (a)稳定表达RFP(红色荧光蛋白)对照蛋白的细胞系表现为胞浆表 达模式。(b)在仅表达RFP的HEK293细胞中，微电极损伤未引起 RFP易位至损伤部位(箭头)。RFP荧光部分褪色则由于胞外缓冲 液(*)的过量进入而发生。(c)稳定表达RFP-MG53的HEK293细 胞表现为细胞内囊泡定位。(d)表达RFP-MG53的HEK293细胞的 损伤引起MG53在少于90秒以内大量易位至损伤部位(箭头)。 质膜迅速修复限制缓冲液进入细胞，从而防止RFP-MG53荧光的褪 色。
图17：重组人类TAT-MG53(参见HIV-1TAT蛋白，SEQ ID NO.17)可穿透不同来源的细胞。HL-1心肌细胞和3T3成纤维细胞 与4或8μg/mL的重组人类TAT-MG53于37℃一起孵育15分钟。 将细胞在缓冲盐溶液中洗涤三次，然后裂解进行蛋白印迹分析。蛋 白印迹表明对照细胞(对照)不含有内源性MG53，然而那些与 TAT-MG53一起孵育的细胞则包含充足的细胞内TAT-MG53。可注 意到，由于该蛋白添加了TAT细胞穿透肽，因此从骨骼肌提取物 (肌肉)可见TAT-MG53略大于MG53。
图18：MG53的重组表达。(a)利用Ni-NTA柱从Sf9细胞分 离的重组人类MG53蛋白(箭头)馏分的考马斯蓝染色凝胶。Input＝ 细胞提取物，FT＝流出液，M＝标志物，E＝洗脱液标号。(b)从Sf9 细胞分离的重组人类TAT-MG53(箭头)的考马斯蓝染色凝胶。(c) 从E.coli中分离的重组小鼠TAT-MG53(箭头)的考马斯蓝染色凝 胶。
图19：MG53通过与磷脂酰丝氨酸结合而与细胞膜相互作用以 介导囊泡运输。(A)PIP2-Strip脂斑点杂交分析显示，重组MG53 (1μg/ml)特异性结合磷脂酰丝氨酸(PS)而不结合其他膜脂质， 包括鞘氨醇-1-P、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和多种磷酸 肌醇代谢物。(B)膜联蛋白-V-GFP(一种已确定能够结合PS的 分子)转染入C2C12成肌细胞(左)，在微电极(箭头)引起细胞 创伤后，表现出极低的易位，而膜联蛋白-V-GFP与RFP-MG53共 表达(右)则引起膜联蛋白-V-GFP的蓄积加速。数据表示均值 ±s.e.m。通过学生氏t检验，*p<0.01。
图20：示意图，示出了本发明人目前对MG53所介导的膜修 复的机制的假说。尽管不受任何特定理论的限制，实验证据表明， MG53可能由于与含磷脂酰丝氨酸的囊泡结合而定位于质膜的内表 面。在正常条件下，MG53可能为单体，且由于与小窝蛋白-3结合 而多价螯合于膜表面附近。细胞膜损伤后，将MG53(通常处于还 原形式)暴露于局部的氧化环境，该环境触发二硫交联键形成和分 子间MG53寡聚化。MG53寡聚化使得含磷脂酰丝氨酸的囊泡聚集 于损伤部位。随后，该脂质囊泡能够贴补受损膜-可能由简单的疏水 力介导。

本发明提供新型核苷酸以及由其编码的多肽。本发明还包括新 型核酸序列及其编码的多肽。本文中所述序列统称为“MG53核酸” 或“MG53多核苷酸”，所编码的相应多肽称为“MG53多肽”或“MG53 蛋白”。除非另有指明，“MG53”指本文所披露新型序列中的任何一 个。
动态膜修复不仅对于长期保持细胞完整性而且对于急性细胞 损伤恢复都是必需的。膜修复缺陷与多种疾病状态包括肌萎缩、心 脏衰竭和神经退行有关。细胞膜修复需要细胞内囊泡运送，其与质 膜处的囊泡累积有关。
本发明涉及一个发现，即在急性膜修复的过程中，囊泡融合受 mitsugumin53(MG53)(SEQ ID NO.1)驱动，而MG53是一种新 型肌肉特异性三联基元(TRIM)家族蛋白。MG53表达对于允许细胞 内囊泡运输至质膜并与其融合是必需的。细胞膜急性损伤引起含 MG53的囊泡补充至损伤部位以贴补在膜上。无MG53的细胞在响 应多种应激的膜修复方面表现出缺陷，所述应激包括激光诱导的损 伤、运动导致的肌肉损伤以及疲劳后肌收缩功能的恢复不足。因此， MG53是囊泡输送事件中的关键组分，而囊泡输送是细胞膜急性修 复和重塑的基础。
本发明部分基于对编码新型多肽的核酸序列的发现。本文中， 该新型核酸和多肽称为MG53核酸和多肽。
一方面，本发明提供一种分离的编码一种MG53多肽的MG53 核酸分子，该MG53多肽包含一种核酸序列，该序列与SEQ ID NO： 2、4和6中披露的核酸具有30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％的一致性。在某些实施方式中，在严格条件下，该分 离的MG53核酸分子杂交于与一种核酸分子互补的一种核酸序列， 其中该核酸分子包含一种MG53核酸序列的蛋白编码序列。本发明 还包括编码MG53多肽或其片段、同系物、类似物、融合蛋白、假 肽、拟肽或衍生物的分离核酸。例如，该核酸可编码一个多肽，其 与包含SEQ ID NO：1、3、5和7的氨基酸序列的多肽具有至少30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的一致性。该核酸可 以为例如包含SEQ ID NO：2、4和6中任何一个氨基酸序列的基因 组DNA片段或cDNA分子。
本发明还包含寡核苷酸，例如包含MG53核酸(如SEQ ID NO： 2、4和6)中至少6个相邻核苷酸的寡核苷酸或者所述寡核苷酸的 互补物。
本发明还包含基本纯化的MG53多肽(SEQ ID NO：1、3、5 和7)。在某些实施方式中，该MG53多肽包括的氨基酸序列基本 等同于人类MG53多肽的氨基酸序列。
本发明的特征还在于与MG53多肽或其片段、同系物、类似物、 假肽、拟肽或衍生物免疫选择性结合的抗体。
另一方面，本发明包括药物组合物，其包含治疗或预防有效量 的一种治疗剂和药用载体。该治疗剂可以为例如MG53核酸如肽核 酸、cDNA或RNA如抑制性小RNA；MG53多肽；或对MG53多 肽具有特异性的抗体。另外一方面，本发明包括存在于一种或多种 容器中的治疗或预防有效量的该药物组合物。
另一方面，本发明包括通过在适于由该DNA编码的MG53多 肽表达的条件下培养细胞而生成多肽的方法，该细胞包含内源性或 外源性表达的MG53核酸。如果需要，随后可收集该MG53多肽。
另一方面，本发明包括通过培养细胞而生成多肽的方法，该细 胞包含位于外源性启动子上游或下游的内源性MG53核酸。在某些 实施方式中，通过同源重组、链断裂或错配修复机制将该外源性启 动子结合入宿主细胞的基因组内。
另一方面，本发明包括检测样品中MG53多肽存在情况的方 法。在该方法中，在适于该多肽与该化合物之间形成复合物的条件 下，使样品与一种选择性结合于该多肽的化合物接触。检测该复合 物，如果存在，则确定样品内有MG53多肽。
本发明还包括基于MG53核酸、多肽或MG53融合多肽表达而 鉴定特异细胞或组织类型的方法。例如，在某些实施方式中，本发 明包括含有“标签”或指示剂部分和MG53部分的融合蛋白。在某些 方面，该标签或指示剂部分可以为适于纯化目的的肽，例如FLAG 标签、6xHis标签等。在其他方面，该标签肽包括适于提供信号的 肽例如抗体表位或荧光肽。另外的方面包括MG53与适用于介导亚 细胞定位或跨细胞膜易位的一种肽的融合，例如来自HIV病毒的 TAT融合蛋白。
本发明也包括检测一种样品内MG53核酸分子的存在的方法 在内，其通过使该样品与MG53核酸探针或引物接触并检测样品内 是否存在结合于MG53核酸分子的核酸探针或引物。
另一方面，本发明提供一种通过使包含MG53多肽的细胞样品 与结合该MG53多肽的一种化合物相接触而调节MG53多肽活性的 方法，其中该化合物的量足以调节所述多肽的活性。该化合物可以 为例如小分子如核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、脂质或其他 有机(含碳)或无机分子，如本文进一步阐述的。
治疗剂在制造用来治疗或预防病症或综合征的药剂中的应用 也包括在本发明中，这些病症或综合征包括，例如，心血管疾病、 心肌病、动脉粥样硬化、高血压、先天性心脏缺损、主动脉瓣狭窄、 房间隔缺损(ASD)、房室(A-V)通道缺损、动脉导管、肺动脉瓣狭窄、 主动脉瓣下狭窄、室间隔缺损(VSD)、瓣膜病、高凝、血友病、溃 疡、创伤、伤痕(lesion)、割伤、擦伤、氧化性损伤、老年性组织 变性、手术相关损伤、烧伤、肌无力、肌萎缩、结缔组织病、特发 性血小板减少性紫癜、心脏衰竭、由心脏衰竭和高血压引起的继发 病症、低血压、心绞痛、心肌梗塞、结节性硬化症、硬皮症、移植、 自身免疫病、红斑狼疮、病毒性/细菌性/寄生虫感染、多发性硬化 症、自身免疫病、变态反应、免疫缺陷、移植物抗宿主病、哮喘、 肺气肿、ARDS、炎症和免疫应答的调节、病毒所致病症、衰老相 关病症、Th1炎症性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性 肠病、AIDS、创伤修复、心脏病发作、心脏衰竭、肌肉萎缩症、褥 疮、糖尿病性溃疡、氧化性损伤和组织损伤如鼻窦炎或粘膜炎、皱 纹、湿疹或皮炎、干性皮肤、肥胖症、糖尿病、内分泌疾病、厌食 症、食欲过盛、肾动脉狭窄、间质性肾炎、肾小球肾炎、多囊性肾 病、全身性(systemic)、肾小管性酸中毒、IgA肾病、肾病、高钙 血症、莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhan syndrome)、林岛(VHL)综合 征(Von Hippel-Lindau syndrome)、外伤、再生(体外和体内)、先天 性巨结肠症(希尔施普龙病)、克隆病(克罗恩病)、阑尾炎、子宫 内膜异位症、喉炎、银屑病、光化性角化病、痤疮、毛发生长/脱落、 秃发(allopecia)、色素沉着病、重症肌无力、α-甘露糖苷过多症、 β甘露糖苷过多症、其他贮积病、过氧化小体病如泽韦格综合征 (zellweger syndrome)、婴儿期雷夫叙姆病(infantile refsum disease)、肢根软骨发育不全(点状软骨发育不良、肢根)和高哌啶酸 血症、骨质疏松症、肌紊乱病、尿潴留、奥尔布赖特遗传性骨发育 不全(Albright Hereditary Ostoeodystrophy)、溃疡、阿尔茨海默氏 病、中风、帕金森病、亨廷顿病、脑性麻痹、癫痫、莱萘二氏综合 征、多发性硬化症、共济失调型毛细血管扩张症、行为障碍、成瘾 性、焦虑症、疼痛、神经保护、中风、无晶状体、神经退行性疾病、 神经系统疾病、发育性缺陷、与脑内GRK2作用和趋化因子受体调 节相关的疾患、脑脊髓炎、焦虑症、精神分裂症、躁郁症、谵妄、 痴呆、重度精神发育迟缓和运动障碍、抽动秽语综合征、脑白质营 养不良、癌症、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、 卵巢癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和宫颈 癌、赘生物；腺癌、淋巴瘤；子宫癌、良性前列腺肥大、生育、生 长和发育/分化控制相关的功能例如但不限于成熟、哺乳期和青春 期、生殖机能障碍和/或其他类似疾患和病症。
在某些实施方式中，本发明的治疗性组合物包括例如MG53核 酸；结合MG53编码核酸的核酸；MG53多肽、肽类似物、以其为 基础的假肽或拟肽；MG53或MG53蛋白-蛋白相互作用的小分子调 节剂；或MG53特异性抗体或其生物活性衍生物或片段。如本文所 述，MG53介导细胞膜损伤的修复。因此，对这些核酸、多肽和其 同系物的表达和/或活性的导向性将提供多种与组织修复相关的急 性和慢性疾患和病症的新型疗法。
在某些其他方面，本发明包括用于治疗或缓解与组织损伤和/ 或与组织损伤相关的疾病的方法，包括给予需要该疗法的患者有效 量的本发明组合物。在某些实施方式中，本发明包括用于治疗组织 损伤或创伤如割伤、擦伤、伤痕、溃疡、烧伤、褥疮、牙龈疾病、 粘膜炎等的方法，包括给予需要该疗法的患者有效量的本发明的治 疗组合物。
在另外一些其他实施方式中，本发明包括用作手术佐剂的治疗 组合物。在本文所述任一种实施方式中，本发明的手术辅助组合物 可作为单独的治疗剂直接地使用或应用于手术部位或其可与手术 或医疗器具结合为整体，例如，本发明的治疗剂可结合于聚合物基 支架、管或其他植入性装置，使得该治疗剂以可控方式弥散入作用 部位以促进愈合和/或将侵入性手术操作造成的创伤降到最低。在另 一种实施方式中，本发明的治疗组合物作为例如医疗器具的膜或涂 层而应用，因此该治疗剂弥散入血流或周围组织内和/或逐渐减少， 从而直接递送至组织损伤部位；将由于采用手术器具发生的细胞损 伤程度降到最低或将改善该损伤程度。
在另外一些其他实施方式中，本发明包括用于治疗和/或预防组 织修复缺陷的方法，该组织修复缺陷作为衰老过程的固有副作用而 发生(例如，皮肤年轻化、牙龈退缩、骨退化、关节炎、阿尔茨海 默、帕金森等)。在该实施方式的某些方面中，本发明包括对那些 在组织修复能力、组织完整性和/或组织弹性方面具有与年龄相关的 缺陷的个体给予有效量的本发明的治疗组合物。在某些实施方式 中，该与年龄相关的缺陷为皱纹、鱼尾纹、面部皱纹、斑(pot marks)、 瘢痕、纤维瘤、晒斑等中的至少一种或其组合。
此外，由于内源性MG53基因表达的肌肉特异性本质，本发明 涵盖用于治疗和/或预防任何类型的肌肉或脉管细胞/组织损伤(例 如由于心血管疾病如心肌梗塞而发生的组织损伤；或由于剧烈体力 活动而发生的组织损伤如运动相关损伤)的方法，包括给予需要该 治疗的患者有效量的本发明治疗剂。
在其他实施方式中，本发明包括对于机体组织的修复、再生或 恢复非常有用的化妆组合物，其包含本发明的治疗剂和化妆用载体 或赋形剂。在该实施方式的一个方面，本发明涵盖了改善皮肤外观 的方法，该方法包括以化妆品形式给予个体有效量的本发明的治疗 组合物。
在本发明的任何一个方面，本发明的治疗组合物可以为任何药 用形式，并可通过任何药用途径而给药，例如，该治疗组合物可作 为口服剂型(单日剂量或单元剂量形式)而给予，用于治疗由于心 肌梗塞、骨硬化损伤(sclerotic lesion)引起的肌肉损伤或由于运动 相关的活动引起的肌肉撕裂，以促进受损肌肉组织的再生和修复。 这些药用载体和赋形剂以及给予方法对于本领域的技术人员应是 显而易见的。
此外，本发明涉及包括干扰性核酸的核酸以及编码MG53相互 作用蛋白的多肽，如小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)多肽及其同系物； 假肽和拟肽；以及可调节小窝蛋白-3活性或其与MG53的分子间相 互作用的化合物。因此，在另外的方面，本发明涵盖导向小窝蛋白 -3基因表达、活性和/或分子间相互作用的方法，用于治疗和/或预 防患者疾患或病症，例如用于促进上述组织修复。
例如，本发明的组合物将对于治疗患上文披露的疾患和病症和 /或其他类似疾患和病症的患者具有有效性。该多肽可作为免疫原而 产生用于本发明的特异抗体并可作为疫苗。其还可用来筛查可能的 激动剂和拮抗剂复合物。此外，编码MG53的cDNA可用于基因治 疗中，且当给予需要该治疗的个体时，MG53是有用的。通过非限 制性实例，本发明的组合物将对于治疗患上文披露的疾患和病症和 /或其他类似疾患和病症的患者具有有效性。
本发明进一步包括用于筛选疾病或综合征调节剂的方法，这些 疾病或综合征包括，例如上文披露的疾患和病症和/或其他类似的疾 患和病症。该方法包括使受试化合物与MG53多肽接触并确定该受 试化合物是否与所述MG53多肽结合。该受试化合物与该MG53多 肽的结合表明该受试化合物是活性调节剂、或上述疾病或综合征潜 伏期或易感性的调节剂。
一种用于筛选活性调节剂、或疾患或综合征(包括例如上文披 露的疾患和病症和/或其他类似疾患和病症)的潜伏期和易感性的调 节剂的方法，也包括在本发明的范围内，该方法通过将受试化合物 给予对上文所提到的病症或综合征的增加风险的受试动物。该受试 动物表达由MG53核酸编码的重组多肽。随后测定受试动物中的 MG53多肽的表达或活性，同时测定对照动物中该蛋白的表达或活 性，该对照动物重组表达MG53多肽且患该病症或综合征的风险并 未增加。接下来，比较受试动物和对照动物中MG53多肽的表达。 受试动物中MG53多肽相对于对照动物的变化表示该受试化合物是 该病症或综合征潜伏期的调节剂。
另一方面，本发明包括用于确定一个个体(如人类个体)体内 是否存在或者易感与MG53多肽、MG53核酸或二者水平改变相关 的疾病的方法。该方法包括测定来自该个体的受试样品中MG53多 肽的量，并比较该受试样品中该多肽的量与对照样品中存在的 MG53多肽的量。与对照样品相比，受试样品中MG53多肽水平的 改变表示个体中存在一种疾病或对该疾病具有易感性。优选地，该 易感性包括例如上文披露的疾患和病症和/或其他类似的疾患和病 症。而且，本发明的新型多肽的表达水平可用在用于筛查多种疾病 以及确定特定疾病阶段的方法中。
另一方面，本发明包括通过给予个体MG53多肽、MG53核酸 或针对个体(例如人类个体)的MG53特异性抗体(其量足以缓解 或预防该病态)来治疗或预防与哺乳动物中病症相关的病态的方 法。在优选的实施方式中，该病症包括例如上文披露的疾患和病症 和/或其他类似疾患和病症。
另外一方面，本发明可用于一种方法中，以通过本领域中通常 采用的多种技术中任何一种来鉴定本发明的细胞受体和下游效应 物。这些包括但不限于利用抗体或其他特异性相互作用分子的双杂 交系统、亲和纯化、共沉淀。
除非另有定义，本文中应用的全部技术和科学术语均具有与本 发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的意义。尽管与 本文所述那些类似或等同的方法和技术可用于实施或测试本发明， 但下文将描述恰当的方法和材料。所有的出版物、专利申请、专利 和本文提到的其他参考文献的全部内容均结合于此供参考。如果出 现矛盾，将以本说明书包括的定义为准。此外，所述材料、方法和 实例仅仅是示例性的而非为了限制的目的。
如本文中使用的，术语“MG53拮抗剂”或拮抗剂“MG53”通常用 来指能够直接或间接抑制MG53表达、翻译和/或活性的试剂。此外， 如本文中使用的，“MG53受体”通常是指它的能够结合MG53蛋白 的任何蛋白或其片段。
如本文中使用的，术语“小窝蛋白拮抗剂”通常用来指能够直接 或间接抑制小窝蛋白表达、翻译和/或活性的试剂。此外，如本文中 使用的，“小窝蛋白受体”通常是指它的能够与小窝蛋白结合的任何 蛋白或其片段。
在某些方面，MG53活性的调节可如下实现：例如通过采用或 调节MG53结合伴侣(即结合MG53并中和其生物活性的因子如中 和性抗MG53)、MG53受体(例如，或小窝蛋白-3)、MG53受体 片段和MG53受体类似物；采用MG53受体拮抗剂，例如抗小窝蛋 白-3抗体、假肽、肽类似物或结合并破坏MG53-受体相互作用的拟 肽；采用抑制MG53活性或分子间相互作用或者改变MG53的正常 构型或者抑制能生产的MG53-MG53-受体结合的小分子；或采用来 自MG53基因和/或MG53受体基因的核苷酸序列，包括编码、非 编码和/或调节性序列以通过例如反义分子、核酶和/或三链螺旋法 来防止或降低MG53表达。
另一方面，本发明的特点还在于一种核酸分子，例如诱饵RNA、 dsRNA、siRNA、shRNA、微小RNA、适配体、反义核酸分子，其 下调编码MG53或MG53受体如小窝蛋白-3的一种序列的表达。在 一种实施方式中，本发明的核酸分子经改造用以治疗和/或预防组织 损伤并促进组织修复。在另一种实施方式中，本发明的核酸分子具 有内切酶活性或是核酸酶复合体的一个组分，并切割具有MG53或 MG53受体核酸序列的RNA。
在一种实施方式中，本发明的核酸分子包括12-100个碱基，其 互补于具有MG53或MG53受体核酸序列的RNA。在另一种实施 方式中，本发明的核酸分子包括14-24个碱基，其互补于具有MG53 或MG53受体核酸序列的RNA。在本文所述的任何一种实施方式 中，该核酸分子可按照本领域中熟知的方法化学合成。
另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括恰当容器、能够以 药用形式置于该容器中的能够抑制MG53活性、表达或结合的活性 剂以及其使用说明书。
在另一方面，本发明涉及用于诊断或监测病症或疾患或进展的 方法，包括通过检测MG53或MG53受体基因或蛋白或二者的表达 水平，而检测MG53或与疾病相关的MG53受体结构基因中的核苷 酸多态性存在情况。多态性已经被确定与疾病严重性相关(见Zhong 等，Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor(MG53)gene by thin-film biosensor chips and application to rural field studies.Nucleic Acids Res. 2005 Aug 2；33(13)：e121；Donn等，A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis.Arthritis Rheum.2004 May；50(5)：1604-10； 为了所有的目的，其全部内容均结合于此供参考)。如本文中使用 的，“MG53或MG53受体基因”或“MG53或MG53受体结构基因” 包括5’UTR、3’UTR、启动子序列、增强子序列、MG53或MG53 受体基因的内含子和外显子DNA以及MG53或MG53受体基因 mRNA或cDNA序列。
如普通技术人员将能理解的，与组织修复病症相关从而可用作 根据本发明方法的诊断标志物的MG53或MG53受体基因多态性， 可存在于之前提到的核酸区域中的任何一个中。用于多态性鉴定和 监测的技术在本领域中已经为人所知，并在授予Wohlgemuth的美 国专利第6,905,827号中详细论述，为了所有的目的，该专利全部 内容均结合于此供参考。
本发明的某些方面涵盖通过一个或多个DNA分子检测基因表 达或多态性的方法，其中所述一个或多个DNA分子具有一个可检 测对应于序列表中所示寡核苷酸的基因的表达的核苷酸序列。在一 种形式中，该寡核苷酸检测一种被差异表达的基因的表达。该基因 表达系统可以为候选文库、诊断试剂、诊断寡核苷酸集或诊断探针 集。该DNA分子可以为基因组DNA、RNA、蛋白核酸(PNA)、 cDNA或合成的寡核苷酸。遵照本文教导的操作步骤，人们可鉴定 感兴趣的基因，用于分析基因表达或多态性。这些序列可以预测疾 病状态。
本发明的诊断性寡核苷酸
如本文中使用的，术语“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA 或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、利用核苷酸类似物生 成的DNA或RNA类似物、和其衍生物、片段和同系物。该核酸分 子可以为单链或双链，但优选包含双链DNA。
在某些方面，本发明涉及诊断性寡核苷酸和一种或多种诊断性 寡核苷酸集，因此在一个个体的健康状态与该个体RNA表达或对 应于该核苷酸序列的蛋白产物之间存在一种关联性。在某些情况 下，对于该检测，仅需要一个寡核苷酸。诊断性寡核苷酸集(组， set)的成员可利用任何能够检测RNA或蛋白产物的表达或多态性 的方式进行鉴定，包括但不限于差异表达筛选、PCR、RT-PCR、SAGE 分析、高通量测序、微阵列、脂质或其他阵列、基于蛋白的方法(例 如蛋白印迹、蛋白质组学、质谱和本文中描述的其他方法)和数据 挖掘方法，如本文中进一步描述的。
在本发明中，按照熟知的分子生物学技术处理核酸和/或蛋白。 用于大量这种操作的详细流程在例如Ausubel等.Current Protocols in Molecular Biology(supplemented through 2000)John Wiley & Sons， New York(＂Ausubel＂)；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989(＂Sambrook＂)，以及Berger和Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(＂Berger＂)中加以 阐述。
基因分型
除了表达谱和临床资料的关联之外(或者与其结合)，常常需 要将表达模式与个体在一个或多个基因位点的基因型相联系，或将 两个表达谱和基因位点与临床数据相联系。所选位点可以为例如对 应于候选文库中一个或多个成员的染色体位点、标志物位点的多态 性等位基因，或者已知为一种疾病(或疾病标准)或公认与疾病(疾 病标准)相关的替代性疾病相关位点。事实上，应该理解，如果一 个位点的(多态性)等位基因与一种疾病(或对一种疾病的易感性) 相关，则该等位基因的存在本身可作为一种疾病标准。
现已存在多种熟知的方法用于评估个体的基因型，除了多种其 他有用的方法之外，还包括DNA印迹分析、限制性片段长度多态 性(RFLP)分析、聚合酶链反应(PCR)、扩增片段长度多态性(AFLP) 分析、单链构象多态性(SSCP)分析、单核苷酸多态性(SNP)分 析(例如通过PCR、Taqman或分子信标)。多种这些操作步骤容易 针对高通量和/或自动化(或半自动)样品制备和分析方法进行调整。 大多数方法均可在通过简单步骤从与生成用于表达谱材料的相同 样品中收集的核酸样品上实施。示例性技术在例如上述Sambrook 和Ausubel中有所描述。
本发明的特点还在于核酸分子，例如酶性核酸分子、反义核酸 分子、诱饵、双链RNA、三链寡核苷酸和/或适配体，以及调节基 因表达的方法，例如调节编码MG53蛋白的基因、MG53蛋白或 MG53受体结合蛋白或MG53受体蛋白的基因表达。特别地，本发 明的特点在于基于核酸的分子以及用来调节MG53蛋白或MG53受 体蛋白表达的方法。
本发明的特点在于一种或多种基于酶性核酸的分子以及独立 或联合地调节编码MG53蛋白的一种或多种基因、MG53蛋白或 MG53受体结合蛋白和/或MG53受体蛋白例如小窝蛋白-3的表达的 方法。
下文对多个方面和实施方式的描述参照示例性MG53和MG53 受体基因而提供。然而，这些多个方面和实施方式也涉及这样的基 因，其编码其他MG53蛋白、MG53结合蛋白和MG53受体基因的 同系物、直系同源和旁系同源，且包括所有的异构体、剪接变体和 多态性。可利用所述用于MG53蛋白、MG53结合蛋白和MG53受 体基因的方法来分析那些其他基因的靶位点。因此，这些其他基因 的抑制以及这种抑制的效应可如本文所述而实施。
“下调”的意思是，基因的表达或者RNA、或编码一种或多种蛋 白的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白(例如MG53和MG53 受体基因)的活性，降至不存在本发明核酸分子时观察到的水平以 下。在一种实施方式中，用酶性核酸分子的抑制或下调优选低于在 存在酶失活或减弱分子时观察到的水平，其中，所述酶失活或减弱 分子能够结合到靶RNA上的相同位点但不能切割该RNA。在另一 种实施方式中，用反义寡核苷酸抑制或下调优选低于在存在例如含 错配序列或含错配的寡核苷酸时观察到的水平。在另一种实施方式 中，用本发明的核酸分子对MG53蛋白、MG53结合蛋白和MG53 受体基因的抑制或下调，在该核酸分子存在时，与其不存在时相比 更强。
“上调”的意思是，基因的表达或者RNA、或编码一种或多种 蛋白亚单位的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白亚单位(例 如MG53蛋白、MG53结合蛋白和MG53受体基因)的活性，高于 不存在本发明核酸分子时观察到的水平。例如，可以增加基因如 MG53蛋白、MG53结合蛋白和MG53受体基因的表达，以治疗、 预防、缓解或调节由于基因表达缺乏或水平较低而引起或加剧的病 态。在一种实施方式中，本发明涉及一种通过上调MG53蛋白、 MG53结合蛋白和MG53受体基因的表达、释放和/或活性而用于治 疗或预防膀胱过度活动症的方法。
“调节”的意思是，基因表达、RNA或编码一种或多种蛋白的 等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白的活性，被上调或下调， 从而使得该表达、水平或活性高于或低于不存在本发明核酸分子时 观察到的水平。
“基因”是指编码RNA的核酸例如，包括但不限于编码多肽 的区段的核酸序列。
“互补性”指的是核酸通过传统Watson-Crick或其他非传统类型 与另一个RNA序列形成一个或多个氢键的能力。
通过“RNA”表示包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。通过“核 糖核苷酸”或“2’-OH”表示在D-核-呋喃糖部分的2’位具有羟基的核 苷酸。
通过“核苷酸”表示与磷酸化糖形成N-糖苷键的杂环含氮碱基。 在本领域中，可认为核苷酸包含天然碱基(标准)以及本领域中熟 知的修饰碱基。这些碱基通常位于核苷酸糖部分的1’位。核苷酸通 常包括碱基、糖和磷酸基团。该核苷酸在糖、磷酸和/或碱基部分可 为未修饰或修饰的(也可互换地称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、 非天然核苷酸、非标准核苷酸等；见例如上文的Usman和 McSwiggen；Eckstein等，International PCT Publication No.WO 92/07065；Usman等，International PCT Publication No.WO 93/15187； Uhlman & Peyman，其全部内容均结合于此供参考)。本领域中已知 存在几个修饰的核酸碱基的实例，如由Limbach等，1994，Nucleic Acids Res.22，2183所总结的。可引入核酸内的经化学修饰和其他天 然核酸碱基的一些非限制性实例包括例如肌苷、嘌呤、嘧啶-4-酮、 嘧啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二 氢尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、 5-烷基尿苷(例如核糖胸核苷)、5-卤素尿核苷(例如5-溴尿核苷)或 6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷酸 (quesosine)、2-硫尿核苷、4-硫尿核苷、wybutosine、wybutoxosine、 4-乙酰替丁(4-acetyltidine)、5-(羧基羟甲基)尿核苷、5’-羧甲基 氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿核苷、β-D-半乳糖Q核苷、 1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺 苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧氨甲基-2-硫尿 核苷、5-甲基氨甲基尿核苷、5-甲基羰甲基尿核苷、5-甲氧基尿核 苷、5-甲基-2-硫尿核苷、2-甲硫基-N6-异戊烯腺苷、β-D-甘露糖Q 核苷、尿苷-5-氧基乙酸、2-巯基胞苷、苏氨酸衍生物等(上文Burgin 等，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman)。
在该方面，通过“修饰碱基”表示1’位除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基或其等价物；这些碱基可用于任何位 置，例如，位于酶性核酸分子的催化中心和/或该核酸分子的底物结 合区。
通过“酶性核酸分子”表示一种核酸分子，其在底物结合区与特 定的基因靶标具有互补性，且还具有或介导一种酶活性，而该活性 可有效的特异性切割靶RNA。即，该酶性核酸分子能够单独或作为 酶复合体的一个组成部分在分子间切割RNA，从而灭活靶RNA分 子。这些互补区可使该酶性核酸分子与靶RNA充分杂交从而实现 切割。优选100％的互补性，但低至50-75％的互补性在本发明中也 有用(见例如Werner和Uhlenbeck，1995，Nucleic Acids Research，23， 2092-2096；Hammann等，1999，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.， 9，25-31)。该核酸可在碱基、糖和/或磷酸基团处加以修饰。术语“酶 性核酸”可与术语如核糖酶(或核酶，ribozymes)、催化性RNA、 酶性RNA、催化性DNA、适配核酶(aptazyme)或适配体结合的 核酶、可调控核酶、催化性寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、脱氧核 酶酶(DNAzyme)、RNA酶、siRNA、微小RNA、小发夹RNA、 内切核糖核酸酶、RNA诱导的沉默复合体、内切核酸酶、小酶、导 酶(leadzyme)、寡聚酶(oligozyme)或DNA酶互换使用。所有这 些技术均描述了具有酶活性的核酸分子。
本申请中描述的特异性酶性核酸分子在本发明中是非限制性 的，本领域中的技术人员将认识到，在本发明的酶性核酸分子中非 常重要的是其具有一个特异的底物结合位点，其与一个或多个靶核 酸区域互补，且在该底物结合位点内部或周围其具有可赋予该分子 以核酸切割和/或连接活性的核苷酸序列(Cech等，美国专利第 4,987,071号；Cech等，1988，260 JAMA 3030)。
目前已知酶性RNA的几种变体。每一种均可在生理条件下反 式催化RNA磷酸二酯键的水解(从而可切割其他RNA分子)。通 常，酶性核酸通过首先结合于靶RNA而发挥作用。这种结合通过 酶性核酸的靶结合部分(其紧邻于该分子中可用来切割靶RNA的 酶部分)而发生。因此，该酶性核酸首先识别靶RNA然后通过互 补碱基配对结合到该靶RNA，一旦结合于正确位点，则通过酶解作 用切割该靶RNA。这种靶RNA的策略性切割将破坏其直接合成所 编码蛋白的能力。酶性核酸已经结合并切割其RNA靶后，则从该 RNA释放以寻觅另一个靶标，且可重复结合并切割新靶标。因此， 单个核酶分子能够切割多个靶RNA分子。此外，该核酶是基因表 达的高度特异性抑制剂，该抑制特异性不仅依赖于结合至靶RNA 的碱基配对机制，而且依赖于靶RNA切割机制。切割位点附近的 单一错配或碱基替换可完全消除核酶的催化活性。
如本文中使用的，通过“核酸分子”表示含有核苷酸的分子。该 核酸可以为单链、双链或多链，且可包含修饰或未修饰的核苷酸或 非核苷酸或其多种混合物或组合物。
通过MG53蛋白、MG53结合蛋白和MG53受体基因的“等效” 或“相关”RNA表示其包括那些与MG53蛋白、MG53结合蛋白和 MG53受体基因具有同源性(部分或全部)的天然RNA分子，其 在多种生物(包括人类、啮齿类、灵长类、兔、猪、原生动物、真 菌、植物以及其他微生物和寄生虫)中编码与MG53蛋白、MG53 结合蛋白和MG53受体基因具有类似功能的蛋白。除了编码区外， 该等效RNA序列还包括诸如5’-非翻译区、3’-非翻译区、内含子、 内含子-外显子交界处等的区域。通过“同源性”表示两个或多个核酸 分子的核苷酸序列部分或完全等同。在某些实施方式中，同源核酸 与MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体基因具有30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或95％的同源性。
通过“反义核酸”表示借助于RNA-RNA或RNA-DNA或 RNA-PNA(蛋白核酸；Egholm等，1993 Nature 365,566)相互作用 而结合靶RNA并改变该靶RNA活性的非酶性核酸分子(综述参见 Stein和Cheng，1993 Science 261，1004以及Woolf等，美国专利第 5,849,902号)。典型地，反义分子沿着该反义分子中单条邻接序列 与靶序列互补。然而，在某些实施方式中，反义分子可结合底物， 从而使得该底物分子形成一个环或发夹，和/或反义分子可结合从而 使得该反义分子形成一个环或发夹。因而，该反义分子可互补于两 个(或者，甚至更多个)非相邻底物序列，或者一个反义分子的两 个(或者，甚至更多个)非相邻序列部分可互补于一个靶序列，或 者二者均存在。为了回顾现有的反义策略，参见Schmajuk等，1999， J.Biol.Chem.，274，21783-21789；Delihas等，1997，Nature，15， 751-753；Stein等，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151；Crooke， 2000，Methods Enzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.Genet. Eng.Rev.，15，121-157；Crooke，1997，Ad.Pharmacol，40，1-49，其全 部内容均结合于此供参考。此外，反义DNA可借助于DNA-RNA 相互作用来导向RNA，从而激活RNA酶H(RNAse H)，其消化 二聚体(duplex)中的靶RNA。该反义寡核苷酸可包含一个或多个 RNAse H活化区，其能够激活靶RNA的RNAse H切割。反义DNA 可进行化学合成或通过使用单链DNA表达载体或其等价物而表 达。
长双链RNA(dsRNA；通常>200nt)可用来沉默多种生物和细 胞类型(例如，蠕虫、果蝇和植物)中靶基因的表达。一旦引入， 该长dsRNA即进入一个细胞途径，其通常称为RNA干扰(RNAi) 途径。首先，通过类似于RNaseIII称为Dicer的酶将该dsRNA加工 成20-25个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)(起始步骤)。然 后，该siRNA组装成含内切核糖核酸酶的称为RNA诱导的沉默复 合体(RISC)的复合体，在该过程中解链。随后，该siRNA链将 RISC引导至互补性RNA分子，其中其切割并破坏同源RNA(效应 步骤)。同源RNA的切割发生于该siRNA链所结合区域的中间附近。 在哺乳动物细胞中，长dsRNA(>30nt)的引入启动了强有效的抗 病毒反应，如通过非特异性抑制蛋白合成和RNA降解所举例说明 的。然而，通过siRNA的导入或表达可绕开(bypass)哺乳动物的 抗病毒反应。
将dsRNA注射或转染入细胞和有机体内，已经成为递送siRNA 的主要方法。尽管沉默效应持续若干天，且似乎能传递至子代细胞， 但其最终会减小。然而，最近，多个研究小组已开发了表达载体， 以在瞬时和稳定转染的哺乳动物细胞内持续表达siRNA(参见，例 如Brummelkamp TR，Bernards R，和Agami R.(2002).A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296：550-553；Lee NS，Dohjima T，Bauer G，Li H，Li M-J， Ehsani A，Salvaterra P，and Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol.20：500-505；Miyagishi M，和Taira K.(2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3′overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.20：497-500；Paddison PJ，Caudy AA，Bernstein E，Hannon GJ，and Conklin DS.(2002).Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells.Genes & Dev. 16：948-958；Paul CP，Good PD，Winer I，和Engelke DR.(2002). Effective expression of smallinterfering RNA in human cells.Nature Biotechnol.20：505-508；Sui G，Soohoo C，Affar E-B，Gay F，Shi Y， Forrester WC，和Shi Y.(2002).A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99(6)：5515-5520；Yu J-Y，DeRuiter SL，和Turner DL.(2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.A cad.Sci.USA 99(9)：6047-6052，其全部内容均结合于此供参考)。
一些载体已经被设计用于表达小发夹RNA(shRNA)，其在体 内加工成能够执行基因特异性沉默的类似siRNA的分子。所述载体 包含位于聚合酶III(pol III)启动子(例如U6或H1启动子)与4-5 胸苷转录终止位点之间的shRNA序列。该转录体终止于终止位点 的2’位(pol III转录体天然缺乏多聚A尾)，随后折叠成具有3’UU- 突出部分的茎-环结构。shRNA的末端在体内进行加工，将该shRNA 转化成约21nt的类似siRNA的分子，其随后启动RNAi。后一个发 现与最近对秀丽小杆线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)、植物 和锥虫(Trypanosome)进行的实验相关，其中RNAi已利用折叠成 茎-环结构的RNA分子而诱导。siRNA载体和表达系统的应用已经 为人所知，可从Ambion，(Austin，TX)、Lentigen，Inc.(Baltimore， MD)、Panomics(Fremont，CA)、和Sigma-Aldrich(ST.Louis，MO) 购得。
在本发明的另一方面，与靶RNA分子相互作用并下调MG53、 MG53结合蛋白和/或MG53受体基因活性的酶性核酸分子或反义分 子由插入DNA或RNA载体内的转录单元表达。所述重组载体优选 为DNA质粒或病毒载体。酶性核酸分子或反义表达的病毒载体可 基于但不限于慢病毒、巨细胞病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、腺 病毒或α病毒来构建。优选地，递送能够表达该酶性核酸分子或反 义分子的重组载体并使其持续存在于靶细胞中。可替代地，可采用 适于酶性核酸分子或反义分子表达的病毒载体。如有必要，这些载 体可重复给予。一旦表达，该酶性核酸分子或反义分子则结合于靶 RNA并下调其功能或表达。酶性核酸分子或反义表达载体的递送可 以为全身性的，如通过静脉内或肌肉内给予，通过给予至从患者或 个体中外植的靶细胞，然后重新引入患者或个体，或通过任何其他 能够引入所需靶细胞内的方式。反义DNA可通过采用单链DNA细 胞内表达载体而表达。
通过“载体”表示任何用来递送所需核酸的基于核酸的技术，例 如细菌质粒、病毒核酸、HAC、BAC等。
本发明的核酸分子可单独地、与其他药物组合或结合地用来治 疗上文讨论的疾患或病症。例如，在适于治疗的条件下，可单独地 或与一种或多种药物组合而对个体进行治疗，或者对其他恰当细胞 进行治疗，这对本领域中的技术人员而言是显而易见的。
采用特别设计而用于诱导RNA干扰的载体构建体相对于基于 寡核苷酸的技术具有多个优势。最明显的优势是稳定性和借助可诱 导性启动子的诱导转录。载体内的启动子区确保shRNA转录体被 持续表达，而始终保持细胞水平。因此，该效应的持续时间不像利 用注射RNA那样短暂，后者通常持续不超过几天。且通过利用表 达构建体而非寡核苷酸注射，能够开展基因敲除(gene knockdown) 的多代研究，因为该载体可变成细胞系内的永久固有成分。
通过“三链形成寡核苷酸”或“三链寡核苷酸”表示一种可以用序 列特异性方式结合双链DNA而形成三链螺旋的寡核苷酸。已证实 这种三链螺旋结构的形成可抑制靶基因的转录(Duval-Valentin等， 1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，504；Fox，2000，Curr.Med.Chem.， 7，17-37；Praseuth等，2000，Biochim.Biophys.Acta，1489，181-206)。
通过“双链RNA”或“dsRNA”表示一种与能够激活细胞酶的预 定基因序列相匹配的双链RNA，其中该细胞酶降解相应的基因信使 RNA转录体。这些dsRNA称为短干扰RNA(siRNA)，可用来抑 制基因表达(见例如Elbashir等，2001，Nature，411，494-498和Bass， 2001，Nature，411，428-429)。如本文中使用的，术语“双链RNA”或 “dsRNA”指能够RNA干扰“RNAi”的双链RNA分子，包括短干扰 RNA“siRNA”，见例如Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等， 2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等，PCT国际公开第WO 00/44895号；Zernicka-Goetz等，PCT国际公开第WO 01/36646号； Fire，PCT国际公开第WO 99/32619号；Plaetinck等，PCT国际公开 第WO 00/01846号；Mello和Fire，PCT国际公开第WO 01/29058 号；Deschamps-Depaillette，PCT国际公开第WO 99/07409号；以及 Li等，PCT国际公开第WO 00/44914号。
本发明的可下调MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体基因 表达的酶性核酸分子、反义核酸或其他核酸分子代表一种治疗多种 膀胱疾患和病症包括但不限于DU、DHIC和任何其他病症的治疗途 径，所述病症对MG53和MG53受体基因功能的调节发生反应。抑 制性RNA分子和技术的应用在本领域中已为人所知，且在美国专 利第7,022,828号中进行详细描述，为了所有的目的，其全部教导 均结合于此供参考。
在本发明的一种实施方式中，本发明的核酸分子长度可以为约 10-100个核苷酸。例如，本发明的酶性核酸分子优选长度为约15-50 个核苷酸，较优选长度为约25-40个核苷酸(见例如Jarvis等，1996， J.Biol.Chem.，271，29107-29112)。本发明的示例性反义分子优选长 度为约15-75个核苷酸，较优选长度为约20-35个核苷酸(见例如 Woolf等，1992，PNAS.，89，7305-7309；Milner等，1997，Nature Biotechnology，15，537-541)。本发明的示例性三链形成寡核苷酸分 子优选长度为约10-40个核苷酸，较优选长度为约12-25个核苷酸 (见例如Maher等，1990，Biochemistry，29，8820-8826；Strobel和 Dervan，1990，Science，249，73-75)。本领域中的技术人员将认识到所 需要的是该核酸分子具有使该核酸分子与其靶标相互作用和/或催 化本文所预期反应的足够长度和恰当构象。，本发明核酸分子的长 度不局限于所述的一般性限制。优选地，调节(例如下调)MG53、 MG53结合蛋白和/或MG53受体基因表达的核酸分子包含12-100 个与MG53基因、MG53结合蛋白基因和/或MG53受体基因的RNA 分子互补的碱基。
本发明提供一种用于生成一类基于核酸的基因调节剂的方法， 该试剂表现出对所需靶标的RNA具有较高程度的特异性。例如， 该酶性核酸分子优选靶向编码MG53、MG53结合蛋白和/或MG53 受体基因的靶RNA的一个高度保守序列区，因此可提供通过本发 明的一种或几种核酸分子而治疗疾患或病症的特殊疗法。这些核酸 分子可根据需要而外源性递送至特异组织或细胞靶标。可替代地， 该核酸分子(例如核糖酶和反义分子)可由递送至特定细胞的DNA 和/或RNA载体表达。
如本文中使用的，“细胞”以其通常的生物学意义而应用，而不 是指整个多细胞生物体。细胞例如可位于体内、体外或离体，例如 存在于细胞培养物中，或存在于多细胞生物体中，该生物体包括例 如鸟、植物和哺乳动物如人类、牛、绵羊、猿、猴、猪、狗和猫。 细胞可以为原核(例如细菌细胞)或真核(例如哺乳动物或植物细 胞)的。
通过“MG53”、“MG53结合蛋白”和“MG53受体”蛋白表示包含 全长MG53、MG53结合蛋白或MG53受体蛋白、其结构域、融合 蛋白、嵌合体或片段的肽或蛋白。
本发明的基于核酸的抑制剂可直接加入或可与包装于脂质体 内的阳离子脂质复合、或以其他方式递送至靶细胞或组织。无论是 否结合于生物聚合体内，该核酸或核酸复合体都可通过注射或灌注 泵局部给予体外、离体或体内的相关组织中。
在另一种实施方式中，本发明的特点是具有一个或多个非核苷 酸部分、并具有切割RNA或DNA分子的酶促活性的酶性核酸分子。
在另一种实施方式中，所述核酸分子如反义分子或核糖酶可与 其他已知疗法联用以治疗上文论及的病症或疾患。例如，所述分子 可与一种或多种已知治疗剂联合应用。
反义分子可以为修饰或未修饰的RNA、DNA或混合的聚合寡 核苷酸，且主要通过特异性结合于引起肽合成抑制(Wu-Pong， November1994，BioPharm，20-33)的匹配序列而发挥作用。反义寡 核苷酸通过Watson Crick碱基配对而结合靶RNA并通过阻止所结 合序列的核糖体翻译而阻断基因表达(通过空间封闭或通过激活 RNase H酶)。反义分子还可以通过干扰RNA加工或从胞核至胞质 的运输而改变蛋白合成(Mukhopadhyay & Roth，1996，Crit.Rev.in Oncogenesis7，151-190)。
此外，单链DNA与RNA的结合可引起异源二聚体的核酸酶降 解(上文的Wu-Pong；Crooke)。至今，仅骨架修饰的DNA化学组 成(其作为RNase H的底物)是磷硫酰、二硫代磷酸酯和三氟化硼。 最近有报道称含2’-arabino和2-氟-arabino的寡聚物也可以激活 RNase H活性。
已经描述了多种反义分子，其利用化学修饰核苷酸的新构象、 二级结构和/或RNase H的底物结构域(Woolf等，PCT国际公开第 WO 98/13526号；Thompson等，PCT国际公开第WO 99/54459号； Hartmann等，于1998年9月21日提交的U.S.Ser.No.60/101,174)， 所有这些文献的全部内容均结合于此供参考。
目前已知几种酶性RNA。此外，几种体外选择(进化)策略 (Orgel，1979，Proc.R.Soc.London，B 205，435)已经用来进化能够 催化磷酸二酯键切割和连接的新核酸催化剂(Joyce，1989，Gene，82， 83-87；Beaudry等，1992，Science 257，635-641；Joyce，1992，Scientific American 267，90-97；Breaker等，1994，TIBTECH 12，268；Bartel等， 1993，Science 261：1411-1418；Szostak，1993，TIBS 17，89-93；Kumar 等，1995，FASEB J.，9，1183；Breaker，1996，Curr.Op.Biotech.，7，442； Santoro等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.，94，4262；Tang等，1997，RNA 3，914；Nakacane & Eckstein，1994，见上文；Long & Uhlenbeck，1994， 见上文；Ishizaka等，1995，见上文；Vaish等，1997，Biochemistry 36， 6495；所有这些均结合于此供参考)。每一种均可催化一系列反应， 包括在生理条件下反式水解磷酸二酯键(且因此可切割其他RNA 分子)。
酶性核酸分子的酶性性质可使实现治疗性疗法所必需的酶性 核酸分子浓度较低。这反映了酶性核酸分子发挥酶促作用的能力。 因此，单个酶性核酸分子能够切割靶RNA的很多分子。此外，酶 性核酸分子是一种高度特异性抑制剂，该抑制特异性不仅依赖于与 靶RNA结合的碱基配对机制，还依赖于靶RNA切割机制。可选择 切割位点附近的单个错配或碱基替换，以大大减弱酶性核酸分子的 催化活性。
具有内切核酸酶的酶活性的核酸分子能够以核苷酸碱基序列 特异性方式重复切割其他单个RNA分子。可使这种酶性核酸分子 靶向几乎任何RNA转录体，并实现体外高效切割(Zaug等，324， Nature 429 1986；Uhlenbeck，1987 Nature 328，596；Kim等，84 Proc. Natl.Acad.Sci.USA 8788，1987；Dreyfus，1988，Einstein Quart.J.Bio. Med.，6，92；Haseloff和Gerlach，334 Nature 585，1988；Cech，260 JAMA 3030，1988；以及Jefferies等，17 Nucleic Acids Research 1371， 1989；Santoro等，1997，见上文)。
由于其序列特异性，反式切割的酶性核酸分子可用作人类疾病 的治疗剂(Usman & McSwiggen，1995 Ann.Rep.Med.Chem.30， 285-294；Christoffersen和Marr，1995 J.Med.Chem.38，2023-2037)。 酶性核酸分子经设计可切割位于细胞RNA背景内部的特异性RNA 靶标。这种切割使得RNA无功能，并消除由该RNA的蛋白表达。 以该方式，可选择性抑制与疾病状态相关的蛋白合成(Warashina 等，1999，Chemistry and Biology，6，237-250)。
本发明的酶性核酸分子可通过变构效应进行调节(“同种异型 酶”)，可用来调节MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体基因表 达。这些异构酶性核酸或同种异型酶(见例如George等，美国专 利第5,834,186和5,741,679号；Shih等，美国专利第5,589,332号； Nathan等，美国专利第5,871,914号；Nathan和Ellington，PCT国 际公开第WO 00/24931号；Breaker等，PCT国际公开第WO 00/26226和98/27104号；以及Sullenger等，PCT国际公开第WO 99/29842号)经设计可对信号剂发生反应，其随后调节该酶性核酸 分子的活性并调节MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体基因的 表达。响应与预定信号剂的相互作用，异构酶性核酸分子的活性被 激活或抑制，使得特定靶标的表达选择性地被下调。该靶标可包括 MG53、MG53结合蛋白、和/或MG53受体基因。
寡核苷酸(例如，反义分子，GeneBlocs)利用本领域中已知的 策略合成，如在Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3 19；Thompson等，PCT国际公开第WO 99/54459号；Wincott等， 1995，Nucleic Acids Res.23，2677 2684；Wincott et al.，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan et al，1998，Biotechnol Bioeng.，61，3345， 以及Brennan，美国专利第6,001,311号中所描述的。所有这些参考 文献均结合于此供参考。在一个非限制性实例中，小规模合成在394
Applied Biosystems，Inc.的合成仪(synthesizer)上进行。可替代地， 本发明的核酸分子可单独合成，并于合成后连接在一起，例如通过 连接作用(Moore等，1992，Science 256，9923；Draper等，PCT国际 公开第WO 93/23569号；Shabarova等，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon 等，1997，Bioconjugate Chem.8，204)。
本发明的核酸分子可以通过用抗核酸酶基团如2’-氨基、2’-C- 烯丙基、2’-氟基、2’-O-甲基、2’-H广泛修饰，而增加稳定性(综 述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman等，1994， Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。
尽管用磷硫酰、硫代磷酸酯和/或5’-甲基磷酸酯键化学修饰寡 核苷酸的核苷酸之间的键合可改善稳定性，但这些修饰过多则可能 引起某种毒性。因此，当设计核酸分子时，应将这些核苷酸之间的 键合的量降到最低。这些键浓度的下降可降低毒性，引起这些分子 的效力增加且特异性提高。
本发明还提供具有可保持或增强活性的化学修饰的核酸分子。 与未修饰核酸相比，这种核酸通常还对核酸酶具有较高的抗性。优 选核酸分子对核酸酶具有抗性，以作为有效的细胞内治疗剂而发挥 作用。RNA和DNA化学合成的改善(Wincott等，1995 Nucleic Acids Res.23，2677；Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19) (结合于此供参考)已经扩大了通过引入核苷酸修饰而修饰核酸分 子的能力，以增加其核酸酶稳定性，如上文所述。采用本发明的基 于核酸的分子可通过提供组合疗法的可能性而形成对疾病恶化的 较好疗法(例如，针对不同基因的多种反义或酶性核酸、与已知小 分子抑制剂偶联的核酸分子或者利用分子和/或其他化学或生物分 子的组合的间歇疗法)。利用核酸分子治疗个体还可包括不同类型 核酸分子的组合。
在一种实施方式中，提供了具有可保持或增强酶活性的化学修 饰的核酸催化剂。与未修饰核酸相比，这种核酸通常还对核酸酶具 有较高的抗性。
在一种实施方式中，本发明的特点在于修饰的酶性核酸分子， 其具有磷酸骨架修饰，包括一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 甲基磷酸酯、吗啉代、氨基甲酸酰胺化物(amidate carbamate)、羧 甲基、乙酰胺化物(acetamidate)、聚酰胺、磺酸盐(酯)、磺酰胺、 氨基磺酸盐(酯)、formacetal、thioformacetal和/或甲硅烷基、取代 等。关于寡核苷酸骨架修饰的综述，参见Hunziker和Leumann，1995， Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331-417，以及Mesmaeker等，1994，Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS，24-39。这些参考文献均结合于此供参考。 可对核酸(例如，反义分子和核糖酶)结构做多种修饰以增强这些 分子的效用。例如，这些修饰可增加保存时间、体外半衰期、生物 可利用度、稳定性并方便将这些寡核苷酸导入靶位置，包括例如增 强细胞膜的通透性和赋予识别并结合靶细胞的能力。
核酸分子的给予。用于递送核酸分子的方法在Akhtar等，1992， Trends Cell Bio.，2，139；以及Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995中加以描述，二者均结 合于此供参考。Sullivan等，PCT WO 94/02595进一步描述了用于递 送酶性RNA分子的一般方法。可利用这些步骤递送几乎任何核酸 分子。可通过本领域普通技术人员已知的多种方法将核酸分子给予 至细胞，包括但不限于封装于脂质体中、通过离子透入法或通过结 合至其他载体如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊以及生物 粘附性微球内。可替代地，核酸/载体组合通过直接注射或通过利用 灌注泵而局部递送。其他递送途径包括但不限于口服(片剂或丸剂 形式)和/或鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience，76，1153-1158)。 其他方法包括采用多种运输和载体系统，例如通过使用偶联物(或 结合物，conjugate)和可生物降解的聚合物。关于药物递送策略的 详尽综述包括CNS递送，参见Ho等，1999，Curr.Opin.Mol.Ther.，1， 336-343和Jain，Drug Delivery Systems：Technologies and Commercial Opportunities，Decision Resources，1998以及Groothuis等，1997，J. NeuroVirol.，3，387-400。
本发明的分子可用作药剂。该药剂预防、抑制个体的疾病状态 出现或者治疗(某种程度上减弱症状，优选全部症状)该疾病。
可通过任何通用方式给予本发明的带负电的多核苷酸(例如 RNA、DNA或蛋白)并导入患者体内，可以用或不用稳定剂、缓 冲夜等，以形成药物组合物。如果需要采用脂质体递送机制，可遵 照用于形成脂质体的标准步骤。还可配制本发明的组合物并用作口 服给予的片剂、胶囊或酏剂；直肠给予的栓剂；无菌溶液；可注射 给予的混悬液以及本领域中已知的其他组合物。
本发明还包括所述化合物的药用制剂。这些制剂包括上述化合 物的盐，例如酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸。
药物组合物或制剂指形式为适于给予(如全身给予)至细胞或 个体(优选人类)的组合物或制剂。通过“全身给药”表示体内全身 吸收或药物在血流中累积后分布于全身。恰当的形式部分依赖于使 用或进入的途径，例如口服、经皮或通过注射。这些形式不应该阻 止所述组合物或制剂到达靶细胞(即，预期该带负电聚合物所递送 至的细胞)。例如，注射入血流内的药物组合物应该为可溶性的。 其他因素在本领域中也是已知的，包括考虑如毒性以及阻止组合物 或制剂发挥作用的剂型。
可引起全身吸收的给药途径包括但不限于静脉内、皮下、腹膜 内、吸入、口服、肺内和肌内。已证实药物进入循环的速率是分子 量或大小的函数。采用包含本发明化合物的脂质体或其他药物载体 可能能够使药物定位于例如某些组织类型中，如网状内皮系统 (RES)的组织中。可促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞的表 面结合的脂质体制剂也非常有用。
通过药用制剂，表示一种可将本发明的核酸分子有效分布于最 适于其预期活性的身体部位的组合物或制剂。适于与本发明的核酸 分子一起制备的试剂的非限制性实例包括：PEG偶联的核酸、磷脂 偶联的核酸、含亲脂基团的核酸、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(如 Pluronic P85)，其可促进药物进入不同组织例如CNS(Jolliet-Riant 和Tillement，1999，Fundam.Clin.Pharmacol.，13，16-26)；可生物降 解的聚合物如聚(DL-丙交酯-乙交酯)微球，用于植入后持续释放 性递送(Emerich，DF等，1999，Cell Transplant，8，47-58)Alkermes，Inc. Cambridge，Mass.；以及负载纳米颗粒如那些用聚丁基氰基丙烯酸酯 制成的纳米颗粒，其可越过血脑屏障递送药物并可改变神经吸收机 制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。 递送策略的其他非限制性实例包括核酸分子的CNS递送，包括 Boado等，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等，1995，PNAS USA.，92，5592-5596； Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等， 1998，Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；以及Tyler等，1999，PNAS USA.，96，7053-7058中描述的材料。所有这些参考文献均结合于此 供参考。
本发明的特点还在于包含表面修饰的脂质体的组合物的应用， 该脂质体包含多聚(乙二醇)脂质(PEG修饰，或长循环脂质体或 隐形脂质体)。本发明的核酸分子还可包括不同分子量的共价连接的 PEG分子。这些制剂提供用于增加靶组织内药物累积的方法。这类 药物载体通过单核巨噬细胞系统(MPS或RES)抵抗调理作用和清 除，从而实现较长的血液循环时间并促进组织暴露于封装药物 (Lasic等.Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等，Chem.Pharm. Bull.1995，43，1005-1011)。基于其避免在代谢较强的MPS组织如肝 脏和脾脏堆积的能力，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可能 较大程度地保护药物不被核酸酶降解。所有这些参考文献均结合于 此供参考。
本发明还包括用于储存或给予而制备的组合物，其包括存在于 药用载体或稀释剂中的药物有效量的所需化合物。用于治疗的可接 受载体或稀释剂在制药领域中为人熟知，且在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit. 1985)中加以描述，其结合于此供参考。例如，可提供防腐剂、稳定 剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的 酯类。此外，可采用抗氧化剂和悬浮剂。
药物有效剂量或药物有效量即预防、抑制个体的疾病状态出现 或者治疗(某种程度上减弱症状，优选全部症状)该疾病所需的剂 量。药物有效剂量依赖于疾病类型、所采用的组合物、给药途径、 所治疗哺乳生物的类型、要治疗的特定哺乳动物的身体特征、同时 用药情况以及医疗领域的普通技术人员将认识到的其他因素。通 常，根据该带负电聚合物的效力，给予用量为0.1mg/kg-1000mg/kg 体重/天的活性成分。
所述制剂可口服、局部、胃肠外、通过吸入或喷雾或者直肠给 予，所用单位剂量制剂包含常规无毒性药用载体、佐剂和赋形物。 如本文中使用的，术语胃肠外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉 内)、肌内或鞘内注射或灌注技术等。此外，提供一种包括本发明 的核酸分子与药用载体的药物制剂。本发明的一种或多种核酸分子 可与一种或多种无毒性药用载体和/或稀释剂和/或佐剂，以及如果 需要，其他活性成分相结合而存在。本发明的药物组合物可以为适 于口服应用的形式，例如片剂、锭剂、糖锭剂、水性或油性混悬液、 可分散性粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊或者糖浆剂或酏剂。
计划口服应用的组合物可按照本领域中已知用于制造药物组 合物的任何方法而制备，这些组合物可包含一种或多种如甜味剂、 调味剂、着色剂或防腐剂，以提供精致且可口的药物制剂。片剂包 含的活性成分与无毒性药用赋形剂(其适于制造片剂)形成混合物。 这些赋形剂可为例如惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙 或磷酸钠；制粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂例如淀 粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。 片剂可未经涂布或者其可以利用已知技术进行涂布。在某些情况 下，这些涂层可通过已知可延缓崩解和胃肠道内吸收的技术而制 备，从而提供较长时间内的持续作用。例如，可应用时间延缓材料 如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服应用的制剂还可以硬明胶胶囊的形式而提供，其中活性成 分与一种惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或以软 明胶胶囊的形式而提供，其中活性成分与水或油介质例如花生油、 液体石蜡或橄榄油混合。
水性混悬液包含与适于制造水性混悬液的赋形剂形成混合物 的活性材料。这样的赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基 纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯酮、西黄蓍胶 和阿拉伯胶；分散或润湿剂可以为天然存在的磷脂，例如卵磷脂或 脂肪酸与烯基氧化物的缩合产物例如硬脂酸聚氧乙烯，或者长链脂 肪醇与环氧乙烷的缩合产物例如十七烷乙烯基氧鲸蜡醇 (heptadecaethyleneoxycetanol)，或者来自脂肪酸和己糖醇的偏酯与 环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者来自脂肪 酸和无水己糖醇的偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚乙烯去山梨 糖醇单油酸酯(或聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，polyoxyethylene sorbitan monooleate)。该水性混悬液可含有一种或多种防腐剂如乙 基、或正丙基对羟基苯甲酸酯；一种或多种着色剂；一种或多种调 味剂；以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
油性混悬液可通过将活性成分悬浮于植物油例如花生油、橄榄 油、麻油或椰子油或悬浮于矿物油如液体石蜡中而制备。该油性混 悬液可含有增稠剂例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂和 调味剂以提供美味的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂如 抗坏血酸而保存。
适于通过加入水而制备水性混悬液的可分散粉末和颗粒提供 与分散剂或湿润剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂形成混合物的活 性成分。恰当的分散剂或湿润剂或悬浮剂可由上文已提到的那些而 举例说明。还可存在其他赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以为水包油乳液的形式。油相可以为 植物油或矿物油或这些油的混合物。恰当的乳化剂可为天然存在的 胶，例如阿拉伯胶或西黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷 脂以及来自脂肪酸和无水己糖醇的酯或偏酯，例如单油酸去山梨糖 醇(或山梨糖醇酐单油酸酯，sorbitan monooleate)，以及所述偏酯 与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯单油酸去山梨糖醇。该乳液还 可含有甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可利用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡 萄糖或蔗糖而制备。这些制剂还可包含缓和剂、防腐剂以及调味和 着色剂。所述药物组合物可以为无菌可注射的水性或油状混悬液形 式。该混悬液可按照已知技艺利用那些上文已提到的恰当的分散或 湿润剂以及悬浮剂而制备。该无菌可注射制剂还可为无毒胃肠外用 稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如1，3-丁二醇中的 溶液。可应用的可接受媒介和溶剂有水、林格液和等渗氯化钠溶液。 此外，常规采用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，任何温 和的不挥发油均可采用，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外， 脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
本发明的核酸分子还可以栓剂的形式给药，例如用于直肠给药 或者借助导管直接引入膀胱本身。这些组合物可通过将药物与恰当 的非刺激性赋形剂混合而制备，该赋形剂在常温下是固体，但在直 肠温度下则为液体，因此将在直肠中溶化而释放药物。这样的材料 包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可在无菌介质中胃肠外给予。该药物根据所 采用的媒介和浓度，可悬浮或溶解于媒介中。有利地，佐剂如局部 麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可溶解于该媒介中。
可与载体材料结合而生成单剂型的活性成分的量随着所治疗 的宿主和特定给予模式而有所不同。单位剂型通常包含约1mg至约 1000mg的活性成分。
应该理解，对于任何特定患者或个体的特定剂量水平依赖于多 种因素，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、 性别、饮食、给药时间、给药途径和排泄速率、药物组合以及待治疗 特定疾病的严重程度。
对于非人类动物的给药，还可将该组合物加入动物饲料或饮用水 中。因为配制动物饲料和饮用水组合物可以很方便，因此动物可与 其饮食一起摄入治疗适当量的该组合物。而且可以很方便地将该组 合物作为预混合物提供，以加入饲料或饮用水中。
还可将该组合物与其他治疗化合物联合给予个体，以增强总体 治疗效果。采用多种化合物治疗一种指征可增加有益效应同时降低 副作用。
可替代地，本发明的核酸分子中某些可在细胞内从真核生物启 动子表达(例如Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry 和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等， 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，105915；Kashani-Sabet等，1992， Antisense Res.Dev.，2，315；Dropulic等，1992，J.Virol.，66，1432 41； Weerasinghe等，1991，J.Virol.，65，55314；Ojwang等，1992，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，89，10802 6；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.， 20，4581 9；Sarver等，1990 Science，247，1222 1225；Thompson等， 1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等，1997，Gene Therapy，4， 45；所有这些参考文献的全部内容均结合于此供参考)。本领域中的 普通技术人员可认识到，任何核酸均可在真核细胞内由恰当的 DNA/RNA载体表达。
在一个方面，本发明的特点在于一种表达载体，其包含的一种 核酸序列编码本发明的核酸分子中的至少一种。该编码本发明核酸 分子的核酸序列以可实现该核酸分子的表达的方式可操作地进行 连接。
该核酸分子序列的转录受用于真核生物RNA聚合酶I(pol I)、 RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(polIII)的启动子驱动。 来自pol II或pol III启动子的转录体在所有细胞内均以高水平表达； 在特定细胞类型中的特定pol II启动子的水平依赖于在附近存在的 基因调节序列(增强子、沉默子等)的性质。还可采用原核RNA 聚合酶启动子，只要该原核生物RNA聚合酶在恰当细胞内表达 (Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6743-7； Gao和Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72；Lieber等，1993， Methods Enzymol.，217，47-66；Zhou等，1990，Mol.Cell.Biol.，10， 4529-37)。所有这些参考文献均结合于此供参考。几个研究者已经 证实，核酸分子(如从这些启动子表达的核糖酶)可在哺乳动物细 胞内发挥作用(例如Kashani-Sabet等.，1992，Antisense Res.Dev.，2， 3-15；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen 等，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，90，6340-4；L′Huillier等，1992，EMBO J.，11，4411-8； Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4； Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger & Cech， 1993，Science，262，1566)
另一方面，本发明的特点在于一种表达载体，其包含的核酸序 列编码本发明核酸分子中的至少一种，其中编码方式可实现该核酸 分子的表达。在一种实施方式中，该表达载体包括a)转录起始区； b)转录终止区；c)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列；其中所 述序列可操作性连接于所述起始区和所述终止区，其连接方式可实 现所述核酸分子的表达和/或递送。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，其包括适合的容器、 以药用形式置于其中的本发明的治疗剂及其使用说明书。
在另一种实施方式中，本发明的一种分离的核酸分子包括一种 核酸分子，其是MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体核苷酸序 列的互补物。如本文中使用的，术语“互补”指核酸分子的核苷酸单 位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，术语“结合”意指两 个多肽或化合物或者相关多肽或化合物之间的物理性或化学性相 互作用或者其组合。结合包括离子、非离子、范德华、疏水性相互 作用等。物理性相互作用可为直接或间接的。
如在本文中使用的，将“片段”定义为至少6个(邻接)核酸或 至少4个(邻接)氨基酸的序列，该长度足以实现核酸的特异性杂 交或氨基酸表位的特异性识别，且多数为某个短于全长序列的部 分。
术语“宿主细胞”包括可用来携带异源核酸或表达由一种异源核 酸所编码的肽或蛋白的细胞。宿主细胞可包含在该细胞天然(非重 组)形式内不存在的基因、该细胞天然形式中存在但通过人工方法 进行修饰或重新导入该细胞内的基因，或者已经过人工修饰但未将 该核酸从细胞去除的细胞内源性核酸。宿主细胞可为真核或原核生 物细胞。细菌培养必需的一般生长条件可在例如BERGEY′S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY，Vol.1，N.R.Krieg， ed.，Williams和Wilkins，Baltimore/London(1984)的正文中查到。“宿 主细胞”还可为一种细胞，其中内源性基因或启动子或二者经过修 饰以生成本发明复合体的一种或多种多肽组分。
“衍生物”是从天然化合物直接、通过修饰或通过部分取代而形 成的组合物。
“类似物”是其所具有的结构与天然化合物类似但并不等同的核 酸序列或氨基酸序列。
本发明的核酸或蛋白的衍生物或类似物包括但不限于这样一 些分子，其包含与本发明的核酸或蛋白基本同源的区域，在多种实 施方式中，其与大小相等的核酸或氨基酸序列，或者当与所比对序 列相比较时(其中，通过本领域中已知的计算机同源性程序进行比 对)具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％ 的一致性，或者其编码核酸能够在严谨性、中度严谨性或低严谨性 条件下与编码本发明蛋白的序列的互补物杂交，见例如Ausubel等， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1993。核酸衍生物和修饰物包括那些通过基 因置换、位点特异性突变、缺失、插入、重组、修复、穿梭(shuffle)、 内切核酸酶消化、PCR、亚克隆以及相关技术而得到的核酸。
“同系物”可为天然存在的、或者通过人工合成一种或多种具有 相关序列的核酸而得到、或通过一种或多种核酸的修饰而生成相关 核酸。当核酸天然或人工来自共有祖先序列(例如直系同源或旁系 同源)时，则其为同源的。如果未对两个核酸之间的同源性加以清 楚描述，则同源性可通过两个或多个序列之间的核酸比较而推断。 如果该序列表现出某种程度的序列相似性，例如在一级氨基酸结构 水平大于30％，则可推断其共有一个共同的祖先。对于本发明的目 的，如果核酸序列足够类似而可在低严谨性条件下重组和/或杂交， 则基因为同源的。
如在本文中使用的，“杂交”指分子仅与特定核苷酸序列在低、 中度或高严谨性条件下结合、二聚化(双联)或杂交，包括当该序 列存在于复杂的混合物(例如，整个细胞)DNA或RNA中时。
此外，普通技术人员将认识到，“保守性突变”还包括核酸的替 换、缺失或添加，其改变、添加或缺失在一个编码序列中的单个氨 基酸或少数氨基酸，其中，该核酸改变引起类似氨基酸的化学替换。 可用作彼此保守性替换的氨基酸包括下列：碱性的：精氨酸(R)、 赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、 天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水的：甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水的：苯丙氨 酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：蛋氨酸(M)、半胱 氨酸(C)。此外，因保守性变异而不同的序列通常是同源的。
对实施本发明非常有用的分子生物学技术，包括诱变作用、 PCR、克隆等的描述包括Berger和Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES，METHODS IN ENZYMOLOGY，volume 152，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif. (Berger)；Sambrook等，MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989，以及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，F.M.Ausubel等，eds.，Current Protocols，a j oint venture between Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.；Berger，Sambrook，与Ausubel，以及Mullis等， 美国专利第4,683,202号(1987)；PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis等.eds)，Academic Press， Inc.，San Diego，Calif.(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson(Oct.1， 1990)C&EN 36-47；Lueng等。
在另一种实施方式中，本发明的核酸利用哺乳动物表达载体而 在哺乳动物细胞中表达。关于既用于原核细胞又用于真核细胞的恰 当表达系统，参见例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL.2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989 的第16和17章。
多核苷酸可以为DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子或 RNA分子。多核苷酸如DNA或RNA可包含的一个序列中T(胸 腺嘧啶)还可以为U(尿嘧啶)。如果多核苷酸某个位置的核苷酸 能够与在一个反向平行DNA或RNA链中相同位置处的一个核苷酸 形成Watson-Crick配对，则该多核苷酸与该DNA或RNA分子在该 位置彼此互补。如果每一个分子内足够数量的对应位置由可彼此杂 交以实现预期加工的核苷酸所占据，则该多核苷酸与该DNA或 RNA分子基本上彼此互补。
用重组DNA转化宿主细胞可利用常规技术而实施，如本领域 中技术人员所熟知的。通过“转化”表示引入新DNA(即该细胞的外 源DNA)后在细胞内诱导的永久或瞬时基因改变。
在另一种实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够引导该核酸 优先在特定细胞类型中表达(例如，应用组织特异性调节元件来表 达该核酸)。组织特异性调节元件在本领域中已经为人所知。恰当 的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异 性；Pinkert等，1987.Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性启动子 (Calame和Eaton，1988.Adv.Immunol.43：235-275)、特别是T细 胞受体启动子(Winoto和Baltimore，1989.EMBO J.8：729-733)和 免疫球蛋白(Banerji等，1983.Cell 33：729-740；Queen和Baltimore， 1983.Cell 33：741-748)的启动子、神经元特异性启动子(例如，神 经微丝启动子；Byrne和Ruddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86： 5473-5477、胰腺特异性启动子(Edlund等，1985.Science 230： 912-916)和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；U.S.Pat.No. 4,873,316和欧洲专利申请公开第264,166号)。还包括发育调节性 启动子例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss，1990.Science 249： 374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，1989.Genes Dev. 3：537-546)。
在任何一种实施方式中，编码MG53、MG53结合蛋白和/或 MG53受体的核酸可以下列形式存在：一种或多种裸DNA；处于恰 当的表达载体中并游离保存的一种或多种核酸；引入宿主细胞基因 组内的一种或多种核酸；编码该复合体中组分的内源性基因的修饰 体；与一种或多种调节性核酸序列结合的一种或多种核酸；或其组 合。，该核酸可以可选地包括连接肽或融合蛋白组分，例如His-TAG、 FLAG-TAG、荧光蛋白、GST、TAT、抗体部分、信号肽等，位于5’ 端、3’端或ORF内的任何位置。
在一种优选实施方式中，本发明的核酸包括编码一种MG53受 体的可溶性(即细胞外)部分的多核苷酸。本文所述实施方式中的 任何一种均可利用本领域中普通技术人员熟知的标准分子生物学 和遗传学途径而实现。
如果宿主是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，则能够摄入DNA 的感受态细胞可由在指数生长期后收集的细胞制备而成，随后用 CaCl2法按照本领域中熟知的步骤而处理。可替代地，可采用MgCl2、 RbCl、脂质体或脂质体-蛋白偶联体。转化还可在形成宿主细胞的 原生质体后或通过电穿孔而实施。这些实例对本发明并非限制性 的；存在多种用于转染宿主细胞的技术，其为本领域中技术人员所 熟知，且应认为其包含在本发明的范围之内。
如果该宿主是真核生物，则这种利用DNA的转染方法包括磷 酸钙共沉淀，也可应用常规机械化程序如微注射、电穿孔、注入被 包装于脂质体中的质粒、或病毒载体以及本领域中已知的其他方 法。该真核细胞可以为酵母细胞(例如酿酒酵母)或者可以为哺乳 动物细胞包括人类细胞。为了长期高产量生产重组蛋白，则优选稳 定表达。
多肽
在其他实施方式中，本发明涉及编码MG53、MG53结合蛋白 和/或MG53受体多肽、抗体多肽或其生物活性部分的分离的核酸分 子。该复合体的多肽可利用例如肽合成仪按照标准方法而形成；或 通过在细胞或细胞提取物中分别表达每一种多肽然后分离并纯化 该多肽而形成。
抗体
如本文中使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋 白(Ig)分子的免疫活性部分，其中免疫球蛋白分子即包含特异性 结合(与其发生免疫反应)一种抗原的抗原结合位点的分子，包括 至少一个、优选两个重(H)链可变区(本文中简写为VH)和至 少一个、优选两个轻(L)链可变区(本文中简写为VL)。这些抗 体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2 片段以及Fab表达文库。该VH和VL区可进一步细分为超变区(称 为“互补决定区”(“CDR”))，通过较保守的区域(称为“框架区(或 骨架区)”(FR))散开。框架区和CDR的含量已经得到精确的确 定(参见Kabat，E.A.等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，以及Chothia，C.等. (1987)J.Mol.Biol.196：901-917，其均结合于此供参考)。每一个VH 和VL均由三个CDR和4个FR构成，从氨基末端至羧基末端以下 列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通 常，从人类得到的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 中的任何一种，其由于分子中存在的重链性质而彼此不同。某些类 别还具有亚类，如IgG1、IgG2和其他亚类。而且，在人类，轻链可 以为K链或λ链。本文中对抗体的提及包括对所有这些人类抗体种类的 类、亚类和型的提及。
抗体可以由完整多肽或含感兴趣的肽作为免疫剂的片段而制 备。优选的抗原多肽片段是MG53、MG53结合蛋白或MG53受体 蛋白中的15-100个邻接氨基酸。在一种实施方式中，该肽位于该多 肽的一种非跨膜结构域，例如位于细胞外或细胞内结构域中。示例 性抗体或抗体片段结合于一个表位，该表位易从细胞外环境接近且 改变蛋白的功能性。在某些实施方式中，本发明包括这样的抗体： 其识别且特异于MG53蛋白、MG53结合蛋白和/或MG53受体蛋白、 变异体、部分的一个或多个表位和/或其组合。在可替换的实施方式 中，本发明的抗体可靶向并干扰MG53/MG53受体相互作用以抑制 信号传导。
单克隆抗体的制备在本领域中为人熟知；见例如Harlow等， Antibodies：A Laboratory Manual，第726页(Cold Spring Harbor Pub. 1988)。可通过用包含一种抗原的组合物注射小鼠或兔子、通过取出 血清样品核实存在抗体生成、取出脾脏以得到B淋巴细胞、使淋巴 细胞与骨髓瘤细胞融合而生成杂交瘤、克隆该杂交瘤、选择生成抗 该抗原的抗体的阳性克隆、并从杂交瘤培养物中分离该抗体，从而 获得单克隆抗体。可利用本领域中熟知的技术从杂交瘤培养物中分 离并纯化单克隆抗体。
在其他实施方式中，该抗体可通过重组生成，例如通过噬菌体 展示或通过组合法而生成。噬菌体展示和组合法可用来分离那些结 合MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体蛋白或其片段的重组抗 体，如在例如Ladner等.美国专利第5,223,409号；Fuchs等.(1991) Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等.(1989)Science 246：1275-1281； Clackson等.(1991)Nature 352：624-628；Gram等.(1992)PNAS 89：3576-3580中描述的。
人类单克隆抗体还可利用携带人类免疫球蛋白基因而非小鼠 系统的转基因小鼠而生成。来自这些用感兴趣的抗原免疫的转基因 小鼠的脾细胞可用来生成杂交瘤，其分泌具有对人类蛋白表位的特 异亲和性的人类mAb(见例如Wood等.国际申请第WO 91/00906 号；Lonberg，N.等.1994 Nature 368：856-859；Green，L.L.等.1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等.1994 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81：6851-6855)。
针对本发明复合体的组分或该复合体本身的治疗上有用的抗 体可来自“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体通过将小鼠互补 决定区从小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链转移入人可变结 构域内，然后将人类残基替换入鼠类对应物的框架区内而生成。采 用来自人源化单克隆抗体的抗体组分避免了与鼠类恒定区免疫原 性相关的潜在问题。用于生成人源化单克隆抗体的技术可在Jones 等，Nature 321：522，1986和Singer等，J.Immunol.150：2844，1993 中查到。该抗体还可来自从组合免疫球蛋白文库分离的人类抗体片 段；见例如Barbas等，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2，119，1991。此外，可通过剪接来自具有恰当抗原特异 性的小鼠抗体分子的基因以及来自具有恰当生物学特异性的人类 抗体分子的基因而得到嵌合抗体；见例如Takeda等，Nature 314： 544-546，1985。嵌合抗体是其中不同部分来自不同动物种属的抗体。
抗独特型技术可用来生成模拟表位的单克隆抗体。针对第一单 克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体将在超变区内具有一个结合 结构域，其为由该第一单克隆抗体结合的表位的“映像”。可替代地， 用来生成单链抗体的技术可用来生成单链抗体。单链抗体通过借助 氨基酸键连接Fv区的重链片段和轻链片段而形成，得到单链多肽。 识别特异性表位(例如细胞外表位)的抗体片段可通过本领域中熟 知的技术而生成。这样的片段包括通过蛋白水解消化生成的Fab片 段和通过还原二硫键而产生的Fab片段。当用于免疫治疗时，单克 隆抗体、其片段或二者可以是未标记的或用治疗药剂进行标记。这 些试剂可通过本领域中熟知的技术直接或间接地偶联于该单克隆 抗体，且包括诸如药物、放射性同位素、凝集素和毒素等试剂。
给予单克隆抗体的剂量范围足够大，以产生预期效果，且将随 年龄、病症、体重、性别、年龄以及待治疗病症的程度而不同，且 可由本领域中的技术人员轻易确定。剂量可为约0.1mg/kg至约 2000mg/kg。该单克隆抗体可静脉内、腹膜内、肌肉内和/或皮下给 药。
在本发明的某些实施方式中，该抗原性肽所包含的至少一个表 位是MG53、MG53结合蛋白和/或MG53受体中位于蛋白表面的区 域，例如亲水性区域。蛋白序列的疏水性分析将表明多肽中哪个区 域是特别亲水的，因此可能编码对于靶向抗体生成有用的表面残 基。作为靶向抗体生成的一种方式，示出亲水性和疏水性区域的亲 水性图可通过本领域中熟知的任何方法而生成，包括例如Kyte Doolittle或Hopp Woods法，利用或者不利用Fourier转化。见例如 Hopp和Woods，1981，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78：3824-3828；Kyte 和Doolittle 1982，J.Mol.Biol.157：105-142，每一个的全部内容均结 合于此供参考。本文提供特异于在抗原蛋白、其衍生物、片段、类 似物或同系物中的一个或多个结构域的抗体。可利用本发明的蛋白 或者其衍生物、片段、类似物、同系物或直系同源作为抗体生成中 的免疫原，该抗体免疫特异性结合这些蛋白组分。
人类抗体
完全的人类抗体本质上是指其中轻链和重链(包括CDR)的整 个序列均来自于人类基因的抗体分子。本文中这些抗体称为“人类 抗体”或“全人类抗体”。人类单克隆抗体可利用三源杂交瘤技术；人 类B细胞杂交瘤技术(见Kozbor等，1983 Immunol Today 4：72)以 及EBV杂交瘤技术来制备，以生成人类单克隆抗体(见Cole等，1985 In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。人类单克隆抗体可用于实施本发明，且可 利用人类杂交瘤(见Cote等，1983.Proc Natl Acad Sci USA 80： 2026-2030)或者通过用艾伯斯坦-巴尔病毒(或EB病毒)体外转 化人B细胞(见Cole等，1985In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)而生成。
此外，人类抗体还可以利用其他技术包括噬菌体展示文库而生 成(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等，J. Mol.Biol.，222：581(1991))。类似地，人类抗体可通过将人类免疫球 蛋白座位引入转基因动物如小鼠内而制备，在转基因动物体内，内 源性免疫球蛋白基因已经部分或全部灭活。一旦激发，即可观察到 人类抗体，其所有方面均与在人类观察到的极其相似，包括基因重 排、组装和抗体集合(或抗体库)。该方法在例如美国专利第 5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第 5,633,425号；第5,661,016号，以及Marks等(Bio/Technology， 10：779-783(1992))；Lonberg等(Nature，368：856-859(1994))； Morrison(Nature，368：812-13(1994))；Fishwild等(Nature Biotechnology，14：845-51(1996))；Neuberger(Nature Biotechnology， 14：826(1996))；以及Lonberg和Huszar(Intern.Rev.Immunol.， 13：65-93(1995))中有描述。
人类抗体还可利用非人类转基因动物而生成，所述非人类转基 因动物经改良可响应抗原激发而生成全人类抗体而非动物内源性 抗体。在非人类宿主体内编码重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链的 内源性基因已经丧失功能，且将编码人类重链免疫球蛋白和轻链免 疫球蛋白的活性座位插入宿主基因组内。例如利用包含必需人类 DNA区段的酵母人工染色体引入这些人类基因。随后，获得可提 供全部所需修饰的动物作为后代，这是通过使含有少于全部修饰补 体(complement)的过渡性转基因动物杂交育种。这种非人类动物 的优选实施方式是小鼠，命名为XenomouseTM，如在PCT公开WO 96/33735和WO 96/34096中披露的。
Fab片段和单链抗体
根据本发明，可以对技术进行调整以生成特异于本发明抗原蛋 白的单链抗体(见例如美国专利第4,946,778号)。此外，可以调整 方法以构建Fab表达文库(见例如Huse等，Science 246：1275-1281 (1989))，以实现单克隆Fab片段的快速和有效鉴定，该片段具有对 蛋白或者其衍生物、片段、类似物或同系物的预期特异性。包含对 蛋白抗原的独特型的抗体片段可利用本领域中已知的技术而生成， 这些技术包括但不限于：(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化而生成的 F(ab’)2片段；(ii)通过还原F(ab’)2片段中的二硫键而生成Fab片段； (iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成的Fab片段以及 (iv)Fv片段。
双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆的，优选人类或人源化抗体，其具有对 至少两种不同抗原的结合特异性。在本发明中，结合特异性之一是 针对本发明的抗原蛋白的。第二结合靶标是任何其他抗原，且有益 地，是细胞表面蛋白或受体或受体亚单位。用于制备双特异性抗体 的方法在本领域中是已知的。常规而言，双特异性抗体的重组生成 是基于两个免疫球蛋白重-轻/轻-重配对的共表达，其中这两个重链 具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983))。 由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤) 生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种分子具有正确 的双特异性结构。1993年5月13日公布的WO 93/08829以及 Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中披露了类似步骤。
具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区可 融合于免疫球蛋白恒定区序列。关于生成双特异性抗体的进一步细 节，见例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)；以及 Brennan等，Science 229：81(1985)。
此外，可以从大肠杆菌中直接回收Fab’片段，并进行化学连接 以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992) 描述了全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的生成。每个Fab’片断 单独从大肠杆菌分泌并体外进行定向化学连接以形成双特异性抗 体。由此形成的双特异性抗体能够结合至过表达ErbB2受体的细胞 和正常人类T细胞，并能够引发人类细胞毒性淋巴细胞对人类乳腺 瘤靶标的细胞溶解酶活性。
用于从重组细胞培养物中直接形成和分离双特异性抗体片断 的多种技术也已经得到描述。例如，已经应用亮氨酸拉链生成双特 异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。 Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的 “双体(diabody)”技术已经提供了一种制备双特异性抗体片段的可 替代机制。还报道了另一种通过应用单链Fv(sFv)二聚体而制备双 特异性抗体片段的策略。见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。 还考虑了二价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J. Immunol.147：60(1991)。双特异性抗体还可用来将细胞毒性剂引入 表达特定抗原的细胞中。这些抗体具有一个抗原结合臂以及一个结 合一种细胞毒性剂或一种放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、 DOTA和ETTA的臂。
异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价 结合的抗体构成。有人提出这些抗体例如使免疫系统细胞靶向于不 需要的细胞(美国专利第4,676,980号)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。可认为这些抗体可利用合成蛋 白化学中已知的方法进行体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。 例如，可利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键而构建免疫毒素。 用于该目的的恰当试剂的实例包括硫醇亚胺(imino thiolate)和4- 巯基-1-亚胺基丁基甲基醚(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和那些 在例如美国专利第4,676,980号中披露的。
免疫偶联物
本发明还涉及免疫偶联物，其包含一种偶联于化学剂或者放射 性同位素(即放射性偶联物)的抗体。该抗体与细胞毒性剂的偶联 物利用多种生物双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫 代)丙酸酯(SPDP)、亚胺基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍 生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥 珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、二叠氮化合物(如二(对位-叠氮苯甲 酰)己二胺)、二重氮衍生物(如二(对位-重氮苯甲酰)-乙二胺)、二 异氰酸酯(如甲苯-2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟 -2，4-二硝基苯)而形成。例如，可如Vitetta等，Science，238：1098(1987) 中所描述的来制备蓖麻毒蛋白的免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰 基苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核 苷酸与该抗体偶联的示例性螯合剂。见WO 94/11026。
免疫脂质体
本文披露的抗体还可配制为免疫脂质体。包含该抗体的脂质体 通过本领域中已知的方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030 (1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中描述的。 美国专利第5,013,556号中披露了循环时间较长的脂质体。
特别有用的脂质体可通过反相蒸发法利用一种脂质组合物而 生成，该组合物包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG源磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)。脂质体通过具有确定孔径的滤器压出，以得到所需直 径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可借助于二硫键交换反应偶联 于脂质体，如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中描述 的。
治疗有效量的本发明抗体通常指达到治疗目标所需的量。如上 文指出的，抗体与其靶抗原之间的结合性相互作用，在某些情况下， 可能干扰靶标发挥作用，而在其他情况下，则可能促进生理反应。 此外，所需给予的量将依赖于抗体与其特异抗原的结合亲和性，且 还将依赖于所给予的抗体从所给予的另一个自由体积个体清除的 速率。本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常用范围，通过 非限制性实例，可为约0.1mg/kg体重至约500mg/kg体重。-常用给 予频率可为例如从每天两次至每周一次不等。
特异性结合本发明一种蛋白的抗体以及通过本文披露的筛选 分析而鉴定的其他分子，均可以药物组合物的形式给予而用于治疗 多种病症。在例如Remington：The Science And Practice Of Pharmacy 第19版(Alfonso R.Gennaro等，编辑)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.： 1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts，Possibilities， Limitations，And Trends，Harwood Academic Publishers，Langhorne， Pa.，1994；and Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991，M.Dekker，New York中提供了制 备这些组合物时涉及的原理和需考虑事项以及选择组分时的指导 原则。这些活性成分还可包裹于微胶囊内，例如通过凝聚技术或通过界 面聚合分别例如羟化甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶 囊，处于胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米 颗粒和纳米胶囊)或粗乳状胶中。用于体内给药的制剂必须无菌。这一 点可通过用无菌滤膜过滤而容易实现。
可制备缓释制剂。缓释制剂的恰当实例包括含该抗体的固体疏 水性聚合物的半透性基质，该基质为成形品形式，例如膜或微胶囊。 缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸 酯)、或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸 和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯、可降 解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚 物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。尽管 聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够使分子释放达到100 天以上，但某些水凝胶释放蛋白的时间则较短。
ELISA测定
用于检测被分析蛋白的试剂是能够结合于被分析蛋白的抗体， 优选具有可检测标记物的抗体。抗体可以为多克隆、或较优选为单 克隆。可采用完整抗体或其片段(例如，Fab或F(ab)2)。提到探针 或抗体时，术语“标记的”旨在包括通过将一种可检测物质偶联(即 物理性连接)于该探针或抗体而直接标记该探针或抗体，以及通过 与另一种直接标记的试剂的反应性而间接标记该探针或抗体。间接 标记的实例包括用一种荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用 生物素末端标记一个DNA探针，使得其可利用荧光标记的抗生物 素蛋白链菌素进行检测。术语“生物学样品”旨在包括从个体分离的 组织、细胞和生物流体以及个体体内存在的组织、细胞和流体。因 此，血液以及血液的部分或组分，包括血清、血浆或淋巴，包括在 术语“生物学样品”的用法内。即，本发明的检测方法可用来在体外和 体内检测生物学样品内的被分析mRNA、蛋白或基因组DNA。例如， 用于检测被分析mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交(或Northern 杂交)和原位杂交。用于检测被分析蛋白的体外技术包括酶联免疫 吸附法(ELISA)、蛋白印迹、免疫沉淀以及免疫荧光。用于检测被 分析基因组DNA的体外技术包括DNA印迹杂交(Southern杂交)。 用于实施免疫测定法的步骤在例如＂ELISA：Theory and Practice： Methods in Molecular Biology＂，Vol.42，J.R.Crowther(Ed.)Human Press，Totowa，N.J.，1995；＂Immunoassay＂，E.Diamandis和T. Christopoulus，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1996；以及 ＂Practice and Thory of Enzyme Immunoassays＂，P.Tij ssen，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985中进行描述。此外，用于检测被 分析蛋白的体内技术包括将抗被分析蛋白的标记抗体导入个体体 内。例如，该抗体可用放射性标记物进行标记，该标记物在个体体 内的存在和位置可通过标准的腔内或经皮显像技术单独地或与效 应细胞一起进行检测。
用于给予本发明治疗剂的制剂包括无菌的水或非水溶液、混悬 液和乳液。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油 以及可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、含醇/含水溶液、 乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。媒介物包括氯化钠溶液、葡 萄糖林格氏液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏静脉内媒介物(包括 液体和营养补充剂)、电解质补充剂等。可加入防腐剂和其他添加 剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
本发明的化合物、核酸分子、多肽和抗体(本文中也称为“活性 化合物”)以及其衍生物、片段、类似物和同系物，可掺入适于给药 的药物组合物内。这些组合物通常包括所述核酸分子、蛋白或抗体以 及药用载体。如本文中使用的，“药用载体”旨在包括适于给药的溶 剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等 中的任何一种和全部。恰当载体在最近一版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(该领域中的标准参考文本)中进行描述， 其结合于此供参考。这些载体或稀释剂的优选实例包括但不限于 水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。还可采 用脂质体和非水性媒介物如不挥发油。这些介质和试剂用作药物活 性物质在本领域中已经为人熟知。除了任何不与活性化合物相容的 常规介质或试剂之外，其在组合物中的应用也在考虑之内。还可将 补充性活性化合物掺入该组合物内。
本发明的药物组合物配制为与其预期的给药途径相容。给药途 径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸 入)、经皮(即，局部)、经粘膜、腹膜内和直肠给药。用于胃肠外、 皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括下列组分：无菌稀释剂如用 于注射的水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其 他合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗 坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液如 乙酸、柠檬酸或磷酸；以及用于张力调节的试剂如氯化钠或葡萄糖。 pH可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠进行调节。胃肠外制剂可封装于 安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多次剂量瓶中。
适于注射用的药物组合物包括无菌含水溶液(如果溶于水)或 分散液以及用于临时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于 静脉内给予，恰当的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorTM. (BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下， 该组合物必须无菌，且应该在某种程度上为易于注射的液体。其在 生产和储存条件下必须稳定，且必须能抵抗微生物如细菌和真菌的 污染作用而保存。载体可以为溶剂或分散介质，其包含例如水、乙 醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其恰当 混合物。恰当流动性可通过使用例如涂层如凝集素、通过保持分散 液情况下必需的颗粒大小以及通过利用表面活性剂而维持。防止微 生物作用可通过多种抗细菌和抗真菌试剂例如对羟苯甲酸酯、三氯 叔丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在多种情况下，组合物中将优 选包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可注 射组合物的延缓吸收可通过在组合物中包括可延缓吸收的试剂例 如单硬脂酸铝和明胶而实现。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物(例如本发明的治疗复合 体)以必需量在恰当溶剂中与上文提到的成分中的一种或其组合 (如需要)混合而制备，随后进行过滤除菌。通常，分散液通过将 活性化合物掺入包含基础分散介质的无菌媒介物和上文列出的其 他必需成分中而制备。对用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，制 备方法则是真空干燥和冷冻干燥，其可从其前述无菌过滤溶液生成 活性成分以及任何其他所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食入载体。其可封装于明 胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗剂给药的目的，可将活性化 合物与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式应用。口服组合物 还可利用液态载体(作为漱口剂使用)制备，其中该液态载体中的 化合物经口给药并漱口然后吐出或咽下。药用结合剂和/或佐剂材料 也可作为该组合物的一部分而包含在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂 等可包含下列成分中任何一种或性质类似的化合物：粘合剂如微晶 纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、 淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes(商标)； 助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、 冬青油或橘子调味剂(orange flavoring)。
对于口服给予，药物组合物可采取例如片剂或胶囊的形式，其 通过常规方法与药用赋形剂一起制备，药用赋形剂例如有结合剂 (例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)； 填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(硬脂酸 镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)； 或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可利用本领域中熟知的方 法涂布。用于口服给药的液态制剂可采取溶液、糖浆或混悬液的形 式，或者其可为干燥品，用于在使用前与水或其他恰当媒介混合。 这些液态制剂可通过常规方法利用药用添加剂如悬浮剂(例如，山 梨糖醇浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，凝集素 或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、酯油、乙醇或分馏的 植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基-对羟苯酸盐或山梨酸) 而制备。该制剂还可包含恰当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
用于口服给药的制剂可恰当制备，以实现活性化合物的控释。 对于含服给药，该组合物可采用以常规方式制备的片剂或锭剂。对 于吸入给药，根据本发明而应用的化合物可方便地通过采用恰当的 推进剂从加压箱或雾化器以气溶胶喷雾的形式递送，恰当的推进剂 例如有二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其 他恰当气体。如果采用加压气溶胶，剂量单位可通过提供计量递送 的阀门而确定。可制备用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和 药筒，其包含该化合物与恰当粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合 物。该化合物可配制用于通过注射例如通过推注注射或连续灌注而 进行胃肠外给药。注射制剂可以以单位剂型的形式存在，例如存在 于安瓿或多次剂量容器中，且含有额外的防腐剂。该组合物可采取 诸如油状或含水媒介物中混悬液、溶液或乳液的形式，且可包含调 制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，活性成分可为粉末 形式，用于在使用前与恰当媒介物例如无菌无热物质的水混合。该 化合物还可配制在直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂中，例如包含常 规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。除了之前描述的配方，该化合 物还可配制为储存制剂(depot preparation)。这种长时间作用的制 剂可通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此， 例如，该化合物可与恰当的聚合或疏水材料(例如合适油类中的乳 液)或离子交换树脂，或作为微溶性衍生物例如作为微溶盐而配制。
对于吸入给药，该化合物可以以气溶胶喷雾形式递送，该气溶 胶喷雾来自高压容器或分配器(含有恰当推进剂例如气体，如二氧 化碳)或雾化器。
全身给药还可为经粘膜或经皮的方法。对于经粘膜或经皮给药， 则在配方中采用适于待穿透屏障的渗透剂。这些渗透剂在本领域中通 常已经为人所知，例如对于经粘膜给药，包括去垢剂、胆汁盐和夫西地 酸衍生物。经粘膜给药可通过采用经鼻喷雾或栓剂而实现。对于经皮 给药，活性化合物可配制入软膏、药膏、凝胶或乳膏中，如本领域 中通常所知的。
在一种实施方式中，将活性化合物与保护该化合物不会从身体 迅速清除的载体(如控释制剂，包括植入物和微囊递送系统)制备 在一起。可采用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯 酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。用于制备这些制 剂的方法，对于本领域中技术人员将很明显。这些材料还可从Alza Corporation和Nova Pharmacruticals，Inc.购得。脂质体混悬液(包括 通过具有针对病毒抗原的单克隆抗体而靶向受感染细胞的脂质体) 也可用作药用载体。这些可按照本领域中技术人员已知的方法制 备，例如，如美国专利第4,522,811号中所描述的。
特别有益的是，以单位剂量配制口服或胃肠外组合物以方便给 药以及剂量的均一性。如本文中使用的，单位剂型指物理上分离的单 位，适合用作用于待治疗个体的单位剂量；每一个单位均包含预定 量的活性化合物，经计算其可与所需药用载体一起产生预期治疗效 果。本发明单位剂型的规格由该活性化合物的独特性质和希望达到 的特定疗效以及本领域中固有的关于配制用于个体治疗的该活性 化合物的限制来规定并直接依赖于这些因素。
本发明的核酸分子可插入载体中，并用作基因治疗载体。基因 治疗载体可通过例如静脉内注射、局部给予(见例如美国专利第 5,328,470号)或通过立体定向注射(见例如，Chen等，1994.Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)。该基因治疗载体的药物制剂可 包括存在于适当稀释剂中的基因治疗载体，或者可包括一种缓释基 质，其中植入了基因递送媒介物。可替代地，如果该完全基因递送 载体可从重组细胞完整地生成，例如逆转录病毒载体，则该药物制 剂可包括一种或多种生成基因递送系统的细胞。该药物组合物可与 给药说明书一起包含于容器、包装或分配器中。
治疗有效剂量指足以引起症状改善或延缓的治疗剂的量。这些 化合物的毒性和治疗效果可通过标准药学步骤在细胞培养物或实 验动物内确定，例如，用于确定LD50(致死总体的50％的剂量) 和ED50(有效治疗总体的50％的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比 是治疗指数，其可表示为LD50/ED50。优选表现出较大治疗指数的 化合物。尽管可采用表现出毒性副作用的化合物，还是应该仔细设 计递送系统，其使这些化合物靶向至受感染的组织部位，以将对未 受染细胞的可能损害降到最低，从而降低副作用。从细胞培养测定 和动物实验得到的数据可用于配制一系列人类应用的剂量。这些化 合物的剂量优选处于包含ED50但毒性很低或无毒性的循环浓度范 围内。根据采用的剂型和所利用的给药途径，剂量可在该范围内变 动。对于任何用于本发明方法中的化合物，该治疗有效剂量最初可 通过细胞培养测定进行评估。可在动物模型中形成一个剂量，以获 得一个循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养中所确定的IC50 (即，可实现症状的半数最大抑制的受试化合物的浓度)。这些信 息可用来更准确的确定人类有用剂量。例如，血浆中的水平可利用 高效液相色谱法测定。
根据本发明，还披露了利用本文所述方法、选择策略、材料或 组分中任何一个的试剂盒或系统。根据本发明的示例性试剂盒将可 选地还包括用于实施方法或测定的说明书、包装材料、一个或多个 容器，其包含测定、装置或系统组分等。
根据本说明书和优选实施方式的实施例，本发明的其他目标和 优势将为本领域的普通技术人员所理解，且明显包含在本发明的范 围内。
实施例
MG53(一种肌肉特异性TRIM家族蛋白)的发现。MG53利 用之前建立的免疫蛋白质组学方法而分离，该方法可鉴定与肌形 成、横纹肌细胞中的Ca2+信号传导和膜完整性的保持有关的新蛋 白。简而言之，该途径利用含有约6500个克隆的单克隆抗体文库， 该文库产生自用富含三联体的膜(来自兔骨骼肌)免疫的小鼠。感 兴趣抗体根据在免疫荧光显微镜下观察到的横纹肌切片的z线染色 模式而选择。通过抗体亲和柱纯化靶蛋白，并得到了所纯化蛋白的 部分氨基酸序列。根据该部分氨基酸序列，从骨骼肌cDNA文库分 离出编码该靶基因的完整cDNA。然后利用同源基因筛选在其他可 兴奋组织中搜索所鉴定基因的不同异构体。最后，生成转基因或敲 除小鼠模型，以研究感兴趣基因的体内生理功能。
筛查该免疫-蛋白质组学文库中的肌肉特异性蛋白可鉴定横纹 肌组织中由分子量53kd的mAb5259特异性识别的抗原(图3B)。 该蛋白，“MG53”，利用mAb5259免疫亲和柱从兔骨骼肌部分纯化， 并进行氨基酸测序。骨骼肌cDNA文库筛选和基因组数据库搜索鉴 定了所预测的MG53氨基酸序列以及人类16p11.2座位上相应的 mg53基因。mg53 mRNA的RNA印迹(Northern印迹)证实了骨 骼肌和心肌的特异性表达(图3C)。结构域同源性分析表明，MG53 含有原型的(prototypical)三联基元，该三联基元包括一个环、B- 盒和卷曲螺旋(RBCC)部分以及羧基末端的SPRY结构域(图1、2 和3A)。该SPRY结构域是一种首先在可兴奋细胞肌浆网的雷诺定 (ryanodine)受体Ca2+释放通道中观察到的保守序列。在迄今已经 在不同哺乳动物基因组内鉴定的约60个TRIM家族成员中，有15 个成员在RBCC结构域之后携带类似的SPRY结构域，且MG53表 现出带有这些TRIM亚家族蛋白的保守的一级结构。
MG53介导肌细胞内的囊泡运输。尽管其一级结构中不存在跨 膜区段或脂质修饰基元，但在骨骼肌中，MG53似乎主要限于膜结 构。免疫组织化学分析揭示了MG53在肌纤维膜和细胞内囊泡中的 特异性标记(图3D)。MG53在C2C12肌源细胞系中的过表达引起 显著的形态改变。用MG53和GFP瞬时转染的细胞表现出质膜扩 展，且具有在仅表达GFP的细胞中不存在的filapodia样结构(图 4A-D)。利用GFP-MG53融合构建体，发现MG53定位于C2C12 肌细胞的细胞内囊泡和质膜(图4B)。活细胞荧光成像揭示了在过 表达GFP-MG53的C2C12细胞内的动态细胞内运输和融合。该 GFP-MG53介导的在细胞表膜的囊泡融合导致GFP-MG53囊泡出 芽而脱离细胞膜(图4D)。这一点可利用全内反射荧光(TIRF)显 微镜通过在质膜处的囊泡融合成像而证实，表明MG53共表达大大 促进了囊泡融合(数据未显示)。总的说来，这些实验表明内源性 MG53是一种肌肉特异性TRIM家族蛋白，其介导细胞内囊泡至肌 纤维膜的运输。
MG53是一种包含TRIM和SPRY基元的肌肉特异性蛋白。在 前面的研究中，我们已经建立了一个单克隆抗体(mAb)文库，其 针对与骨骼肌中三联连接相关的蛋白。筛查该免疫-蛋白质组学文库 中的肌肉特异性蛋白，鉴定出一种分子大小为53千道尔顿(kDa)且 可由mAb5259识别的抗原(称MG53)。利用结合有mAb5259的免 疫亲和柱从兔骨骼肌中部分纯化MG53，并进行氨基酸测序。根据 所得到的部分氨基酸序列，从兔和小鼠肌细胞文库中分离编码 MG53的cDNA。基因组文库搜索鉴定出人类16p11.2座位上相应 的MG53基因。图1中示出了在几个物种中预测的MG53氨基酸序 列。
结构域同源性分析表明，MG53在羧基末端除了SPRY结构域 外还包含RBCC的原型TRIM标签序列，因此属于TRIM/RBCC家 族(图1)。在迄今已经在哺乳动物基因组内鉴定的约60个TRIM 家族成员中，有15个成员在RBCC结构域之后携带类似的SPRY 结构域，且MG53表现出带有这些TRIM亚家族蛋白的保守的一级 结构(图2)。然而，惊人且意外的是，我们的研究表明MG53是图 2蛋白中唯一的表现出膜修复功能的TRIM家族蛋白。
蛋白印记分析证实了MG53在小鼠组织中的肌肉特异性表达 (图3B)。尽管其一级结构中不存在跨膜区段或脂质修饰基元，但 MG53似乎主要限于骨骼肌中的膜结构。用mAb5259进行免疫组织 化学分析，揭示了MG53在骨骼肌纤维横切片的肌纤维膜和TT膜 中的特异性标记(图3C)。而且，横切片表明MG53在肌纤维膜附 近的局部浓度，且具有比肌纤维膜的整体膜蛋白通常所观察的更宽 的染色模式。因此，MG53是一种肌肉特异性TRIM家族蛋白，表 现出独特对TRIM家族蛋白的亚细胞分布模式。
MG53过表达在可兴奋和非可兴奋细胞中均产生filaDodia样结 构。为了阐明MG53的细胞生物学功能，在C2C12肌源细胞以及 中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达小鼠MG53 cDNA。成肌细胞阶 段的C2C12细胞不表达内源性MG53蛋白，然而分化的C2C12肌 管则表达MG53。CHO细胞是不含内源性MG53蛋白的非可兴奋性 上皮细胞。如图4A(左图)所示，将MG53 cDNA瞬时转染入C2C12 成肌细胞或CHO细胞内，则引起可由mAb5259识别的53kDa重组 蛋白的表达。该重组蛋白的分子量等同于在兔和小鼠肌肉内存在的 内源性MG53，从而证实了所分离cDNA克隆的身份为MG53。用两 个包含编码EGFP或MG53的cDNA的质粒以10:1的比例共转染 细胞，提供了一种利用荧光显微镜鉴定转染细胞的便捷方法。通过 共聚焦显微镜成像，我们观察到瞬时转染MG53的细胞形态发生了 显著变化(图4B)。特别地，细胞表膜的扩展在瞬时过表达MG53 的CHO细胞或C2C12成肌细胞中均形成了不同的filapodia样结构。
为了进一步研究MG53诱导的细胞形态变化，生成了MG53的 两个GFP融合构建体：GFP-MG53和MG53-GFP，分别将GFP连 接于MG53的氨基末端和羧基末端。尽管两个融合蛋白均可在CHO 细胞和C2C12成肌细胞中表达(图4C，右图)，但GFP-MG53和 MG53-GFP的亚细胞分布和功能作用却显著且令人意外的不同。利 用共聚焦显微镜，发现GFP-MG53融合蛋白在CHO和C2C12细胞 中均既定位于细胞内囊泡又定位于细胞表膜(图4C，左图)。该结 果与骨骼肌纤维中的MG53免疫染色定位一致(图3C)，表明MG53 参与肌细胞中的膜转运。
意外的是，MG53-GFP融合蛋白在CHO和C2C12细胞中的分 布模式主要为胞浆分布(图4C，右图)，这与GFP-MG53的膜附着 性分布形成了鲜明对比。此外，由MG53或GFP-MG53过表达诱导 的强烈的filapodia样膜扩展在用MG53-GFP转染的细胞中完全不存 在。由于与GFP融合对MG53的羧基末端的屏蔽改变了MG53的 亚细胞分布，可能MG53的羧基末端的SPRY基元在将MG53锚定 于不同膜区室时发挥了作用，且对于MG53功能来说是必要的(见 图13和14)。
活细胞荧光成像鉴定了在过表达GFP-MG53的细胞中的细胞内囊泡 动态转运，以及活跃的外吐融合和细胞表膜处的囊泡出芽。密切观察发 现囊泡融合事件发生在表膜(图4D，左图)。可清楚辨别含 GFP-MG53囊泡的出芽，且在转染细胞附近观察到了所释放的细胞 外囊泡(图4D，右图)。
综上，细胞成像研究表明MG53既可定位于细胞内囊泡，又可 靶向细胞表膜，而且其是膜融合和囊泡出芽的关键介导剂。
MG53介导细胞损伤后骨骼肌纤维中的急性膜修复。囊泡与质 膜的融合对于膜修复是必需的，之前的研究表明了对于dysferlin在 保持骨骼肌膜完整性方面的作用。我们的结果表明，MG53能够驱 动囊泡至质膜的运输，可能介导在膜破坏后的修复过程。由于微电 极物理穿透质膜引起的急性细胞损伤，将GFP-MG53快速募集至损 伤部位(图12A)。如果发生了引起细胞破裂的较严重损伤，则该 修复部位被GFP-MG53密集标记(图12B)。此外，在成熟的C2C12 肌管中也观察到了该急性膜修复(参见图片(movie)2和3)。该 数据表明，MG53介导的囊泡运输在细胞膜急性修复中发挥积极作 用。
为了进一步明确MG53在肌膜修复中的生理功能，生成了无 MG53的小鼠模型(图9-11)。在无应激条件下，该mg53-/-小鼠存 活达到11月龄。体内应激测试表明mg53-/-肌肉的膜修复功能存在 严重缺陷。如图10C所示，下坡跑运动所诱导的膜损伤揭示mg53-/- 小鼠的比目鱼肌收缩功能存在严重缺陷。即便没有高强度运动，与 野生型(wt)对照(未示出)相比，mg53-/-比目鱼肌在离体疲劳刺 激后的收缩功能恢复方面仍表现出一定的困难。在8-10月龄，运动 诱导损伤后的这些差异显著增大。显然，mg53-/-肌肉存在较严重的 损伤，其中与wt肌肉相比，观察到收缩功能较弱且波动(图10D)。
将埃文斯蓝染料注射入小鼠腹膜内腔，可直接监测下坡运动诱 导肌肉损伤后肌纤维膜的完整性。如图10E所示，从mg53-/-小鼠 分离的肌纤维的埃文斯蓝染色显著强于所述wt肌肉，表明程度深 的运动诱导的肌肉损伤。这一点可以通过H/E染色证实，染色表明 mg53-/-肌肉中萎缩增加，且老龄mg53-/-小鼠比幼龄mg53-/-小鼠相 比萎缩增加(图10A)。对从肌束提取的埃文斯蓝总吸光度进行定 量测定，对下坡跑后mg53-/-小鼠肌肉损伤增加提供了直接支持(图 10F)。
与膜修复中MG53的作用一致，通过对分离过程中受损的单个 趾短屈肌(FDB)肌纤维进行免疫染色，可在损伤部位观察到MG53 浓度升高(图11A)。这些膜片将经常与dysferlin染色共定位。通 过测定在激光诱导膜损伤后FM-143荧光染料进入单个FDB肌纤维 的量，我们直接评估了MG53介导的膜修复功能。wt肌纤维具有内 在膜修复功能，并且可充分抵御激光诱导的肌纤维膜损伤，因为其 表现为可有效排除FM-143荧光染料(图11B)。激光诱导损伤后， 可观察到FM-143荧光染料明显进入mg53-/-FDB肌纤维(图11C)。 肌纤维膜的激光损伤后，FDB肌纤维内FM-143的时间依赖性蓄积 对mg53-/-肌肉的膜修复功能缺陷提供了直接支持(图11D)。
MG53表达对于保持正常心肌膜完整性是必要的。mg53-/-小鼠 的缺陷并不限于骨骼肌纤维。在注射埃文斯蓝染料的过程中，约50％ 的mg53-/-小鼠在注射16小时内死亡，相比而言，所注射的野生型 动物死亡比例为0。尸体剖检发现，甚至在没有运动应激的情况下， mg53-/-心脏表现出强烈的心肌纤维埃文斯蓝染色(图9)。我们还 发现，运动将大大增加mg53-/-心脏中的埃文斯蓝染色程度。
肌肉发育过程中MG53在肌管形成方面的作用。膜修复仅是需 要细胞内囊泡动态运输以实现细胞膜结构重组的细胞过程之一。骨 骼肌中一个这种过程发生在肌形成的过程中。在成肌细胞分化成肌 管的过程中，单核成肌细胞必须融合在一起形成多核肌管。为了直 接检测MG53介导的膜融合对骨骼肌形成的作用，采用一种特异性 RNA干扰探针来抑制内源性MG53在正分化的C2C12肌管中的表 达。相比于转染有针对错配形式的MG53靶序列的非特异性shRNA 的细胞，识别小鼠MG53cDNA核苷酸序列632-652的小发夹(sh) RNA探针抑制了转染有shRNA-MG53的细胞中80％以上的MG53 表达(图5A)。MG53的急性抑制引起C2C12肌管分化的明显减少 (图5B)。在血清饥饿诱导的分化后第5天和第10天，以 shRNA-MG53探针转染的C2C12成肌细胞所形成的肌管显著较少 (图5C)。这些结果表明MG53的正常表达对于C2C12成肌细胞分 化成肌管是必需的。
因为小窝蛋白-3受发育过程调节(图6A)，且可与MG53相互 作用(图6B)，因此我们检测了MG53所诱导的C2C12中的filapodia 样结构是否受小窝蛋白-3过表达的影响。如图6D所示，小窝蛋白 -3和MG53在两种C2C12成肌细胞中同时出现的过表达引起对与 GFP-MG53过表达相关filapodia样结构的出现的显著抑制。平均而 言，用小窝蛋白-3和GFP-MG53(比例为10:1)转染的C2C12成 肌细胞分别使filapodia样结构的出现下降82±6％(图6E和F)。这 些结果表明，小窝蛋白-3代表了MG53介导的膜融合事件的分子调节 剂之一。
为了进一步研究小窝蛋白-3在MG53亚细胞分布和filapodia样结 构形成方面的作用，构建一个小窝蛋白-3shRNA质粒(表1)，其包含 独立的红色荧光蛋白表达框，用来为shRNA转染的细胞提供标志 物。图7A中示出的蛋白印迹分析表明，shRNA-小窝蛋白-3探针能 够高效抑制瞬时转染有小窝蛋白-3cDNA的CHO细胞中的小窝蛋 白-3表达，而不影响小窝蛋白-1的表达。
表1.用于构建用于MG53和小窝蛋白-3的shRNA的寡聚物


尽管用非特异性shRNA转染的C2C12成肌细胞表现出正常的 分化模式，如图7B左图中大量红色荧光标记的肌管所示，但小窝 蛋白-3的急性抑制可显著抑制C2C12成肌细胞分化为肌管(图7B， 右图)。平均而言，加入分化介质后6天，由红色荧光标记的shRNA- 小窝蛋白-3转染的成肌细胞中少于10％可分化为成熟的肌管(图 7C)。该结果与其他研究者的前期研究结果一致，证实了小窝蛋白 -3的表达对于C2C12肌管分化是必要的。
共聚焦显微镜成像表明，将shRNA-小窝蛋白-3转染入C2C12 成肌细胞看来未影响这些细胞中所表达GFP-MG53的亚细胞分布 (图7D)。特别的，用shRNA-小窝蛋白-3或非特异性shRNA进行 瞬时转染，GFP-MG53的独特囊泡分布模式和filapodia样结构均不 受影响。该结果与C2C12细胞的成肌细胞阶段缺乏小窝蛋白-3表 达相一致。
由于肌管分化中小窝蛋白-3的必要特性，测定了甲基-β-环糊精 (M-βCD)对过表达GFP-MG53的C2C12成肌细胞的作用，以进 一步分析MG53-小窝蛋白相互作用对膜循环的功能性作用。M-βCD 可从细胞膜提取胆固醇，已经广泛用作破坏细胞膜穴样内陷结构的 试剂。如图8A中所示，过表达GFP-MG53的成肌细胞表现为囊泡 在细胞内以及肌纤维膜处的自发性融合。这些自发性融合事件比较 缓慢，以分钟为数量级而发生。用M-βCD处理后，外吐事件大大 增加，引起膜融合加速以及膜囊泡大量出芽(图8B)。这些初始改 变被迅速诱导，延长的与M-βCD的培育，则引起GFP-MG53在成 肌细胞内的增溶(图8C)。
小窝蛋白介导的膜囊泡的内化可能在抑制MG53过表达产生的 大量外吐事件中发挥调节性作用。而且，MG53与小窝蛋白的相互 作用对于保持MG53的亚细胞定位是必需的。这个结论得到其他利 用突变形式小窝蛋白(SEQ ID NO.8)的实验结果的支持。
TRIM和SPRY基元在MG53功能中的作用。对MG53结构域 的结构/功能评价(图13)揭示了GFP与MG53融合在MG53的细 胞内分布方面的显著极性。特别的，GFP与MG53羧基末端的融合 改变了MG53分配至囊泡区室以及靶向于肌纤维膜的能力。为了进 一步检测TRIM和SPRY结构域在促进MG53膜融合功能方面的作 用，生成了一系列偶联于GFP的缺失突变体(图13A)。
为了分析MG53的这些突变构建体的亚细胞定位，在瞬时表达 后对C2C12成肌细胞进行共聚焦显微镜成像。如图13B(右图)所 示，GFP-TRIM或TRIM-GFP被主要定位于细胞内囊泡，肌纤维膜 上则无明显标记。该结果表明，SPRY结构域(GFP-TRIM或 TRIM-GFP中不存在)对于MG53靶向于肌纤维膜是必需的。 MG53-GFP主要表现为胞浆分布(图13B，左图)这一事实，进一 步支持SPRY在使MG53靶向于细胞表膜方面的作用。
有趣的是，尽管GFP-SPRY或SPRY-GFP均表现主要为胞浆分 布模式，但它们被很明显地从细胞内囊泡排除(图13B，中图)。所 述胞浆分布模式以及GFP-SPRY和SPRY-GFP在细胞内囊泡的定位的排除， 这可能反映了TRIM的作用。推测起来，TRIM基元可能介导MG53 附着于细胞内囊泡(图13B，右图)。SPRY结构域不足以独自靶向 于肌纤维，因此TRIM结构域必须与SPRY结构域一前一后存在， 用于MG53恰当运输至肌纤维膜。此外，我们的免疫共沉淀数据表 明小窝蛋白-3与MG53的TRIM基元相互作用(图13C)。因此， 有可能MG53与小窝蛋白-3之间的功能性相互作用成为某些造成在 C2C12成肌细胞中GFP-SPRY和SPRY-GFP分散模式的细胞因素的 基础。总体而言，MG53在细胞表面和细胞内区室的受调节分布， 可能来自TRIM与SPRY结构域之间的协调作用。为了恰当的MG53 亚细胞定位而对TRIM和SPRY的必需性，还具有明显的功能显著 性，因为这些缺失突变体中没有一个表现出从过表达全长MG53所 观察到的filapodia结构或强烈的囊泡出芽事件。
MG53可在非肌细胞类型中充分发挥作用。对MG53在肌源 C2C12细胞中和分离的骨骼肌纤维中的功能进行分析，表明MG53 在横纹肌中囊泡运输和膜修复的必要作用。考虑到膜修复对于保持 细胞稳态是一个必要因素，因此有可能在其他非肌细胞类型中的类似 修复机制也采用类似的分子机制以促进该过程。为了检测该可能 性，之前用C2C12肌源细胞开展的部分实验在非肌中华仓鼠卵巢 (CHO)细胞上重复进行。在这些细胞中，发现了与C2C12细胞 中所观察到的极为类似的表型。首先，GFP-MG53可产生质膜的 filapodia样突出，且定位于细胞内囊泡，并定位于质膜(图6和14)。 其次，MG53缺失蛋白与在C2C12细胞中观察到的行为方式相同。 最后，小窝蛋白-3也可控制表达在CHO细胞中的MG53的活性(图 14)。因此，这些研究表明，MG53通过保守的分子机制而发挥作用， 该分子机制存在于除肌肉之外的其他细胞类型中。
重组MG53和TAT-MG53的纯化。为了将MG53供应至靶细胞， 以促进更快的细胞再生，将源于HIV中TAT基因的细胞穿透肽序 列偶联于全长MG53(TAT-MG53)以及几个MG53缺失突变体(图 15A)。这些融合蛋白可在大肠杆菌(E.coli)细菌甲衣达，开利用 亲和层析有效地纯化(图15B和15C)。我们之前已经证实，将这 些融合蛋白应用于细胞单层可引起重组蛋白有效易位入哺乳动物 细胞内。生成这些融合蛋白应使得我们能够增加靶细胞内MG53的 量，因此我们可以实现MG53对皮组织的治疗效应。
重组MG53的表达可在真核或原核细胞内实施。图18示出了 重组MG53在真核或原核系统中均可表达。简单而言，重组MG53 在Sf9细胞中作为既含TAT肽部分又含6-组氨酸标签(6-HIS tag) 的融合蛋白而表达。该组氨酸标签可用来利用本领域中熟知的过滤 层析技术而分离并纯化重组蛋白。图(A)示出了重组人类MG53 蛋白(箭头)的考马斯蓝染色凝胶，该馏分是利用Ni-NTA柱从Sf9 细胞分离而来。Input＝细胞提取物，FT＝流出液，M＝标志物，E＝洗 脱次数。(B)从Sf9细胞分离的重组人类TAT-MG53(箭头)的考 马斯蓝染色凝胶。(C)中的考马斯蓝染色凝胶提供了被表达的并从 大肠杆菌(E.coli)中分离的小鼠TAT-MG53(箭头)。
重组人类TAT-MG53可穿透不同来源的细胞。为了使MG53发 挥作用，其必须存在于细胞内。为了证实重组MG53可以以治疗上 有意义的量跨细胞膜而易位，将HL-1心肌细胞和3T3成纤维细胞 与约4或8μg/mL的重组人类TAT-MG53于37℃一起培育15分钟 (图17)。将细胞在缓冲盐溶液中洗涤三次，然后裂解进行蛋白印 迹分析。蛋白印迹表明对照细胞(对照)不含有内源性MG53，然 而那些与TAT-MG53一起培育的细胞则包含充足的细胞内 TAT-MG53。我们注意到，由于该蛋白添加了TAT细胞穿透肽，因 此从骨骼肌提取物(肌肉)可见TAT-MG53略大于MG53。通过 TAT-MG53融合蛋白的细胞内加工，可生成多个条带。因此，在 MG53多肽疗法的一个优选实施方式中，本发明包括一种重组多肽， 其包含一个TAT多肽部分和一个MG53多肽部分，其中所述TAT 和MG53多肽部分存在于单条相邻接的多肽链内。
MG53在人类细胞系中的异源表达引起响应急性损伤的膜修 复。图16表明，重组MG53可在异源表达系统中表达，并保留其 修复细胞膜损伤的能力，而并不表达额外的蛋白。特别的，将MG53 作为与红色荧光蛋白(RFP)的融合蛋白而克隆入表达载体内。在人 胚肾细胞系(HEK293成纤维细胞系)中表达该融合蛋白，并比较 该细胞与仅表达FRP的细胞的修复膜损伤的能力。图(a)证实， 稳定表达RFP(红色荧光蛋白)对照蛋白的细胞系表现为胞浆表达 模式。然而，在仅表达RFP的HEK293细胞中(图16A)，微电极 损伤未引起RFP易位至损伤部位(箭头)。RFP荧光的部分褪色则 是由于胞外缓冲液(*)的过量进入。与之对比的是，稳定表达 RFP-MG53(c)的HEK293细胞显示定位至细胞内囊泡。表达 RFP-MG53(d)的HEK293细胞的微电极损伤引起MG53在90秒 以内大量易位至损伤部位(箭头)。该结果表明重组MG53可以用 于修复任何细胞环境中的细胞和/或组织损伤。尽管当在异源系统中 表达时，重组MG53能够修复对细胞膜的损伤，但本发明并不限于 此。在某些实施方式中，本发明涵盖了共表达MG53和小窝蛋白-3 以促进膜修复从而治疗或预防组织损伤的方法。在另一种实施方式 中，本发明涉及一种包含TATA-MG53多肽和TAT-小窝蛋白-3多肽 的治疗组合物。
MG53与膜和膜修复的关联依赖于与磷脂酰丝氨酸的相互作 用。脂质谱(图19)表明，纯化的重组MG53可与磷脂酰丝氨酸(PS) 特异性相互作用，而PS是优先出现在质膜内层以及细胞内囊泡胞 质面的脂质(图19A)。如果该相互作用使MG53连接至细胞内膜， 则可通过膜联蛋白-V(一种已知与PS相互作用的蛋白)的迁移来 监测膜破坏后的囊泡累积。利用膜联蛋白-V-GFP，我们观察到膜联 蛋白-V-GFP在C2C12成肌细胞损伤部位的迅速标记(图19B)。膜 联蛋白-V-GFP的累积可通过RFP-MG53的共表达而加速，与MG53 介导急性膜修复过程的作用一致。活细胞成像证实了RFP-MG53和 膜联蛋白-V-GFP朝向损伤部位的有序移动。
示例性方法
MG53的鉴定和克隆前面描述了(21)用于兔骨骼肌微粒体 蛋白的mAb文库的制备和筛选。mAb5259(IgG亚类)的制备以及 免疫亲和性纯化如前所述而进行(21)。纯化的MG53进行氨基酸 测序分析，已确定的全部序列均在兔MG53cDNA中编码(数据未 示出)。在数据库中的同源性搜索发现，小鼠和人类MG53利用部 分兔氨基酸序列。从小鼠基因组DNA中扩增小鼠MG53基因的一 个外显子区域，并利用32P标记的外显子片段筛选兔和小鼠骨骼肌 文库以得到全长cDNA。
免疫组织化学和免疫染色分析如前所述利用mAb5259进行 免疫化学分析(21)。利用结合有15nm金颗粒的二抗的免疫电镜术 如前所述而进行(17)。
细胞培养用于全部研究的C2C12鼠类成肌细胞系从美国典型 菌种保藏中心(弗吉尼亚，马纳萨斯)购得。细胞在37℃的湿润 环境中用5％CO2中培养，C2C12采用DMEM培养基，CHO细胞 采用Ham F12培养基，用10％的胎牛血清、100单位/ml的青霉素 和100μg/ml的链霉素补充。为了诱导肌管分化，将C2C12成肌细 胞培养至汇合阶段(confluence)，将培养基更换成含2％马血清、 青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)的DMEM。为了进行瞬时 转染，将C2C12成肌细胞或CHO细胞以70％汇合涂布于玻璃底平 皿中。24小时后，利用GeneJammer试剂(Stratagene)用上述质粒 转染细胞。在转染后24-48小时或个别实验指定的时间，通过活细 胞共聚焦成像使细胞可视化。在某些实验中，可使C2C12成肌细胞 在观察前的指定时间内分化成肌管。
质粒构建全长小鼠MG53cDNA和相关截短突变体利用补充 的表1中描述的引物通过PCR而生成。为了构建pCMS-MG53，用 恰当限制性酶消化后，将PCR扩增的cDNA在Nhe I/Xba I位点插 入pCMS-EGFP载体内(Invitrogen)。为了构建GFP-MG53、 GFP-TRIM、GFP-SPRY、MG53-GFP、TRIM-GFP和SPRY-GFP， 将PCR产物在Xho I/Xba I位点插入pEGFP-C1中，或在 Xho I/Kpn I位点插入pEGFP-N1中。
活细胞成像为了监测GFP-MG53的细胞内运输，在玻璃底平 皿(Bioptechs Inc.)中培养CHO或C2C12细胞，并用上述质粒进 行转染。利用BioRad 2100 Radiance激光扫描共聚焦显微镜通过 63X1.3NA油浸物镜以3.18s/帧的速度采集荧光图像(512x512)。
RNAi分析用于MG53的shRNA抑制的靶序列处于小鼠MG53 cDNA的622-642位置处(GAG CTG TCA AGC CTG AAC TCT)。 对于小窝蛋白-3，靶序列处于363-380位置处(GAC ATT CAC TGC AAG GAG ATA)。合成了互补的正义和反义寡核苷酸。为了构建 MG53shRNA和对照质粒，将退火的寡核苷酸在Acc651/HindIII限 制性酶位点插入psiRNA-hH1GFPzeo G2(InvivoGene)内。为了小窝 蛋白-3shRNA和对照质粒，将退火的寡核苷酸在EcoR I/BamH I限 制性酶位点插入pRNAiDsRed载体(BD Biosciences)内。每一种载体 均具有独立的荧光蛋白表达框(绿或红)，以作为细胞转染的标志 物。所有质粒均利用侧翼引物(flanking primers)通过直接测序而 证实，并通过蛋白印迹分析检测MG53和小窝蛋白-3蛋白的表达下 调。
蛋白印迹和免疫共沉淀利用标准技术进行免疫印迹。简单而 言，收集C2C12或CHO细胞，并于存在蛋白酶抑制剂(Sigma) 混合物(cocktail)的情况下用冰预冷的改良RIPA缓冲液(150mM NaCl，5mM EDTA，1％NP40，20mM Tris-HCl，pH7.5)裂解。在 4-12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离20μg总蛋白。采用标准流程 进行MG53和小窝蛋白-3的免疫共沉淀研究。简单而言，将骨骼肌 组织或C2C12肌管在0.5ml改良RIPA缓冲液中裂解。全细胞裂解 物(500μg)与5μg多克隆抗MG53(多克隆抗体)或抗小窝蛋白-3 抗体(mAb)一起过夜孵育。作为阴性对照，将500μg全细胞裂解 物与5μg正常兔和小鼠IgG一起孵育，并如上进行处理。通过培育 2小时将免疫复合物收集在蛋白G琼脂糖珠子上并用RIPA缓冲液 洗涤4次。
应该理解，本文描述的详细实例和实施方式仅为了说明的目的 而通过实例给出，绝不能认为会限制本发明。本领域的技术人员根 据这些例子能够想到很多种改良或变化，这些改良或变化包含在本 申请的精神和范围内并且认为其包含在所附权利要求的范围内。例 如，成分的相对量可加以变化以使预期结果达到最优，可加入其他 成分，和/或用类似的成分替代所述成分中的一种或多种。其他与本 发明的系统、方法和工艺相关的有利特征和功能性，从所附权利要 求中将变得很明显。
相关申请
按照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2006年7月11日提交的美 国临时申请第60/830,013号和2006年12月22日提交的美国临时 申请第60/876,871号的优先权，为了所有的目的，其全部内容均结 合于此供参考。
参考性引用
按照37 C.F.R.§1.52(e)(5)，光盘上包含的序列信息(文件名： Ma_2007utility SEQ List_ST25.txt；大小61KB；于2007年6月29 日制作；应用PatentIn-3.4和Checker 4.4.0)的全部内容在这里以引 用形式结合在本文中。以机读形式(CRF)记录的序列表信息等同 于随其一起提供的书面序列表。序列表纸件中的数据、以及随其一 起提交的机读形式的序列表不包含新的主题，而是得到优先权申 请，即美国临时专利申请第60/830,013和60/876,871号的充分支持。
关于联邦资助性研究的陈述
由于美国国立卫生研究院(NIH)对Dr.Jianjie Ma的下列资助： RO1-CA095739；RO1-AG015556；RO1-HL069000，美国政府对本发 明具有一定的权利。
序列表
<110>新泽西医科和牙科大学(University of Medicine and Dentistry)
<120>蛋白、编码该蛋白的核酸和相关应用方法
<130>P24036HAC
<140>PCT/US2007/015815
<141>2007-07-11
<150>US60/830,013
<151>2006-07-11
<150>US60/876,871
<151>2006-12-22
<160>25
<170>Patent In version 3.4
<210>1
<211>477
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(477)
<223>人MG53多肽
<400>1



<210>2
<211>1434
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1434)
<223>人MG53 cDNA
<400>2

<210>3
<211>477
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(477)
<223>小鼠 MG53
<400>3


<210>4
<211>1434
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1434)
<223>小鼠MG53 cDNA
<400>4


<210>5
<211>477
<212>PRT
<213>欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(477)
<223>兔MG53
<400>5



<210>6
<211>1434
<212>DNA
<213>欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1434)
<223>兔MG53 cDNA
<400>6


<210>7
<211>477
<212>PRT
<213>人类(人类(人类(Homo sapiens)))
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(29)..(29)
<223>C29L/C242A
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(242)..(242)
<223>C29L/C242A
<400>7


<210>8
<211>151
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(151)
<223>P56539 CAV3_人小窝蛋白-3-人类(人)
<400>8

<210>9
<211>477
<212>PRT
<213>负鼠(Didelphis sp.)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>负鼠MG53
<400>9



<210>10
<211>477
<212>PRT
<213>狼(Canis sp.)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>狗MG53
<400>10



<210>11
<211>477
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>黑猩猩MG53
<400>11


<210>12
<211>477
<212>PRT
<213>猕猴(Macaca mulatta)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>恒河猴MG53
<400>12


<210>13
<211>482
<212>PRT
<213>Bos sp.
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(482)
<223>牛MG53
<400>13



<210>14
<211>477
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>大鼠MG53
<400>14



<210>15
<211>477
<212>PRT
<213>非洲爪蟾(Xenopus laevis)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>非洲爪蟾
<400>15



<210>16
<211>477
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus sp.)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(477)
<223>非洲蛙MG53
<400>16


<210>17
<211>101
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒1型
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(101)
<223>HIV-1 TAT蛋白
<400>17

<210>18
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(66)
<223>MG53的错配shRNA-正义
<400>18

<210>19
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(66)
<223>MG53的错配shRNA-反义
<400>19

<210>20
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(66)
<223>MG53的shRNA
<400>20

<210>21
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(66)
<223>MG53的shRNA
<400>21

<210>22
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(65)
<223>Cav-3的错配shRNA-正义
<400>22

<210>23
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(65)
<223>Cav-3的错配shRNA-反义
<400>23

<210>24
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(65)
<223>Cav-3的shRNA-正义
<400>24

<210>25
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(65)
<223>Cav-3的shRNA-反义
<400>25