β－折叠模拟物和组合物及其有关方法

有关申请的交叉参考

本申请要求保护2002年2月14日提交的美国临时专利申请No. 60/357,261的利益，其中该临时申请全文结合在此作为参考。

发明背景

发明领域

本发明一般涉及β-折叠(β-sheet)模拟物，包括治疗炎症和几种 其他失调的类胰蛋白酶抑制剂，以及涉及β-折叠模拟物的化学文库。

有关领域的说明

β-折叠构型(也称为β-链构型)是存在于很多多肽中的二级结构。 β-折叠构型是几乎完全延续的，相邻氨基酸之间的轴向距离为大约 3.5A。不同多肽片中NH与CO基团之间的氢键使β-折叠稳定。另外， 肽键的偶极沿着片交替，这赋予β-折叠以内在稳定性。β-折叠中的相 邻片可以是相同的方向(即平行的β-折叠)或者是相反的方向(即反 向平行的β-折叠)。尽管这两种方式在双面角上略有不同，不过二者都 是空间上可取的。β-折叠构型的延续构型导致氨基酸侧链突出在β-折 叠的交替面上。

β-折叠在肽和蛋白质中的重要性是公认的(Richardson，Nature 268：495-499，1977；Halverson et al.，J.Am.Chem Soc.113：6701-6704， 1991；Zhang，J.Bio1.Chem.266：15591-15596，1991；Madden et al.， Nature 353：321-325，1991)。β-折叠在大量生物学蛋白质-蛋白质识别 事件中都是重要的，包括蛋白酶与它们的底物之间的相互作用。

模拟生物学活性蛋白质或肽的β-折叠结构的抑制剂将在广泛病症 的治疗中具有实用性。例如，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶构成一大家族 高度选择性酶，参与止血/凝固(Davie，E.W.and K.Fujikawa，″Basic mechanisms in blood coagulation，″Ann.Rev.799-829，1975)和补体活 化(Muller-Eberhard，H.J.，″Complement，″Ann.Rev.Biochem.44： 697-724，1975)。这些蛋白酶的测序已经显示有同源性胰蛋白酶样核心 的存在，并且具有这样的氨基酸插入，它们修饰特异性，一般负责与 其他大分子组分的相互作用(Magnusson et al.，″Proteolysis and Physiological Regulation，″Miami Winter Symposia 11：203-239， 1976)。

类胰蛋白酶是一种仅见于肥大细胞的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶， 由于它作为炎症介质的潜在角色而受到很多关注。例如，在肺中，类 胰蛋白酶随着其他炎症介质一起响应于所吸入的抗原与细胞表面IgE 受体的结合而被释放(Ishizaka and Ishizaka，Prog.Allergy 34：188-235， 1984)。已经显示类胰蛋白酶体外裂解血管作用性肠肽(Caughey et al.， J.Pharmacol.Exp.Ther.244：133-137，1988；Tam and Caughey，Am. J.Respir.Cell Mol.Biol.3：27-32，1990)。这些结果提示了类胰蛋白酶 在哮喘患者中可能经由支气管扩张性肽的蛋白水解作用增加支气管收 缩。与这种假设一致的是最近这样的发现，合成的类胰蛋白酶抑制剂 阻滞变应性绵羊中的气道应答(Clark et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.152：2076-2083，1995)。

类胰蛋白酶经由MMP-3激活细胞外基质降解性蛋白质 prostromelysin(pro-MMP-3)和胶原酶原(pro-MMP-1)，提示了该酶在 组织再造和炎症中的角色(Gruber et al.，J.Clin.Invest.84：8154-8158， 1989)，因此很可能在类风湿性关节炎中扮演角色。另外，已经显示 prostromelysin在被激活时降解动脉粥样硬化斑周围的细胞外基质。 由于含有异常高水平类胰蛋白酶的肥大细胞已经见于冠脉粉瘤，类胰 蛋白酶可能在粉瘤破裂(血栓的释放)中扮演角色，这是冠状动脉粥 样硬化的最终事件(Kaartinen et al.，Circulation 90：1669-1678，1994)。

类胰蛋白酶的其他活性包括如下。类胰蛋白酶裂解纤维蛋白原， 但是在内源性蛋白酶抑制剂的存在下不被灭活(Schwartz et al.，J Immunol.135：2762-2767，1985；Ren et al.，J Immunol.159：3540- 3548，1997)，可以充当局部抗凝剂。它已被证明是成纤维细胞的有力 促分裂剂，可以参与肺纤维化和间质性肺疾病(Ruoss et al.，J Clin. Invest.88：493-499，1991)。类胰蛋白酶还可以负责内皮细胞和角质形 成细胞上PAR-2(蛋白酶活化受体-2)的活化(Molino et al.，J BioL Chem.272：4043-4049，1997)。

肠运动性、尤其是结肠运动性的抑制是腹部手术的主要并发症。 该病症被称为术后肠梗阻，延缓了手术后食物摄取的正常恢复，经常 引起住院期延长。肥大细胞是通常存在于肠壁中的前炎性细胞。肠部 处理和肠部炎症伴有肠壁中肥大细胞的流入和脱粒。肥大细胞类胰蛋 白酶和胃促胰酶是占到肥大细胞全部蛋白质25％的蛋白酶(Schwartz et al.，J.Immunol.138：2611-2615，1987)。一旦在结肠壁内脱粒，肥大 细胞释放这些酶。基于下列观察结果发现了治疗或预防术后肠梗阻的 方法，即PAR-2在结肠肌肉细胞中被表达，PAR-2的活化抑制结肠运 动性。由于PAR-2受体至少在部分程度上是被类胰蛋白酶活化的，抑 制类胰蛋白酶可能是治疗术后肠梗阻的有效方法(美国专利No. 5,958,407和美国专利No.5,888,529)。

鉴于肥大细胞在变态反应和炎性反应中的核心角色，抑制类胰蛋 白酶可以产生显著的治疗效果。类胰蛋白酶抑制剂可以用于预防或治 疗哮喘、肺纤维化与间质性肺炎、肾炎、肝纤维化、肝炎、肝硬变、 硬皮病、牛皮癣、特应性皮炎、慢性类风湿性关节炎、流感、克罗恩 氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠疾病、鼻变态反应和动脉粥样硬化。

尽管在受构型约束的β-折叠模拟物的合成和鉴别上已经取得显著 的进展(美国专利No.6,245,764、6,117,896与6,020,331和已公布的 PCT WO 00/11005与WO 99/41276)，不过本领域仍然需要模拟肽二 级结构的小分子。本领域还需要含有这类成员的文库，特别是那些能 够支持取代基高度多样性的小模板。另外，本领域需要合成这些文库 和根据生物靶筛选文库成员的技术，以鉴别有生物活性的文库成员。 进而，本领域需要小的口服可利用的类胰蛋白酶抑制剂，用于治疗炎 性疾病、中枢神经系统失调以及若干其他失调。确切而言，需要用于 治疗或预防多种哺乳动物疾病状态的类胰蛋白酶抑制剂，例如哮喘、 咳嗽、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管痉挛、呕吐、神经变性疾病、 眼疾病、炎性疾病(例如关节炎)、中枢神经系统病症(例如焦虑、偏 头痛和癫痫)、痛觉、精神病和多种胃肠失调(例如克罗恩氏病)。

本发明满足了这些需要，并且进一步提供有关的优势。

发明概述

简而言之，本发明涉及受构型约束的化合物，它们模拟生物活性 肽与蛋白质β-链区的二级结构。还涉及这些化合物预防和治疗炎性与 若干其他失调的用途。本发明化合物具有下列通式结构(I)：

及其药学上可接受的盐和立体异构体，其中A、A’、B、X、Y、R2、 R3、R4和R5如下所定义。

本发明还涉及含有结构(I)化合物的文库，以及合成这类文库的方 法和筛选这类文库的方法，以鉴别生物活性化合物。另外，公开了含 有本发明化合物与药学上可接受的载体的组合的组合物。还公开了利 用本发明化合物和包含它们的组合物治疗细胞粘连-介导疾病的方法。 进而，还公开了利用本发明化合物和包含它们的组合物治疗和预防炎 性失调以及若干其他失调的方法。

参照下列详细说明，本发明的这些和其他方面将是显而易见的。 为此，本文陈列多份参考文献，它们更详细地描述某些工艺、化合物 和/或组合物，全文结合在此作为参考。

发明的详细说明

本发明涉及β-链模拟物和含有β-链模拟物的化学文库。本发明的 β-链模拟物可用作生物活性物质，包括(但不限于)用作诊断剂、预 防剂和/或治疗剂，尤其用作抗炎剂，用于中枢神经系统失调以及若干 其他失调。本发明的β-链模拟物文库可用于鉴别这类生物活性物质。 在本发明的实施中，文库可以含有数十种至数百种乃至数千种(或者 更多)单独的β-链模拟物(本文也称为“成员”)。

在本发明的一个方面，公开了具有下列结构(I)的β-链模拟物：

或其药学上可接受的盐或立体异构体，

其中

A和A’是相同或不同的，独立地是N或CH；

B是-C(R1)(NHZ)-、-N(Z)-或-C(R1)(Z)-；

X是取代或未取代的二价杂环；

Y和Z代表分子的其余部分；

R1、R2、R3、R4和R5是相同或不同的，独立地是氨基酸侧链部 分或氨基酸侧链衍生物；

稠合二环化合物的任意两个相邻的CH基团(即CH-CH)或者相 邻的NH和CH基团(即NH-CH)可选地构成双键(分别即C＝C或 N＝C)。

本文所用的“氨基酸侧链部分”表示任意的氨基酸侧链部分，它 们存在于肽化学领域人员在制备天然存在的肽的合成类似物时普遍采 用的天然存在α-氨基酸和其他“非蛋白质”氨基酸中，包括D和L型。 “非蛋白质”氨基酸表示肽化学领域人员在制备天然存在的肽的合成 类似物时普遍采用的非天然α-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸，包括D 和L型。本文所用的“氨基酸侧链部分”包括(但不限于)天然存在 的氨基酸侧链部分，如下表1所示。本发明的其他天然存在的氨基酸 侧链部分包括(但不限于)3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羟基赖 氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸丝氨酸的侧 链部分。另外，糖基化的氨基酸侧链也可以用于实施本发明，包括(但 不限于)糖基化的苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。

表1

氨基酸侧链部分

氨基酸侧链部分                  氨基酸

-H                              甘氨酸

-CH3                           丙氨酸

-CH(CH3)2                     缬氨酸

-CH2CH(CH3)2                亮氨酸

-CH(CH3)CH2CH3              异亮氨酸

-(CH2)4NH2                  赖氨酸

-(CH2)3NHC(NH2)NH2         精氨酸

               组氨酸

-CH2COOH                       天冬氨酸

-CH2CH2COOH                   谷氨酸

-CH2CONH2                     天冬酰胺

-CH2CH2CONH2                谷氨酰胺

                 苯丙氨酸

             酪氨酸

           色氨酸

-CH2SH                         半胱氨酸

-CH2CH2SCH3                 甲硫氨酸

-CH2OH                          丝氨酸

-CH(OH)CH3                      苏氨酸

                   脯氨酸

                羟基脯氨酸

另外，本文所用的“氨基酸侧链衍生物”代表对氨基酸侧链部分 的修饰和/或改变，包括羟基(-OH)。例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸侧链部分一般可以分为烷基、芳基或芳 基烷基部分，可选地被一个或多个如下所定义的取代基取代。类似地， 组氨酸、色氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的氨基酸侧链部分一般可以分 为杂环或杂环烷基部分，可选地被一个或多个如下所定义的取代基取 代。因此，代表性氨基酸侧链衍生物包括取代或未取代的烷基、芳基、 芳基烷基、杂环、杂环烷基、杂芳基和杂芳基烷基部分。

氨基酸侧链衍生物还包括但不限于下列氨基酸的侧链：羟基赖氨 酸、高丝氨酸、高酪氨酸、高苯丙氨酸、瓜氨酸、犬尿氨酸、4-氨基 苯丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、甲硫氨酸砜、叔丁 基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、4-羟基苯基甘氨酸、氨基丙氨酸、苯基甘 氨酸、乙烯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸、1，2，4-三唑并-3-丙氨酸、4，4，4- 三脯苏氨酸、甲状腺原氨酸、6-羟基色氨酸、5-羟基色氨酸、3-羟基犬 尿氨酸、3-氨基酪氨酸、三氟甲基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、(2-(4-吡 啶基)乙基)半胱氨酸、3，4-二甲氧基苯丙氨酸、3，5-双三氟苯丙氨酸、 3-(2-噻唑基)丙氨酸、鹅膏蕈氨酸、1-氨基-1-环戊烷羧酸、1-氨基-1- 环己烷羧酸、quisqualic acid、3-三氟甲基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙 氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、硫代组氨酸、3-甲氧基酪氨酸、 弹性酶抑制剂、正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸、硫代 脯氨酸、脱氢脯氨酸、羟基脯氨酸、isonipectotic acid、高脯氨酸、环 己基甘氨酸、α-氨基-n-丁酸、环己基丙氨酸、氨基苯基丁酸、在苯基 部分原、间或对位被一个或两个低级烷基、低级烷氧基、卤素或硝基 取代或者被亚甲二氧基取代的苯丙氨酸、β-2-和3-噻吩基丙氨酸、β-2- 和3-呋喃基丙氨酸、β-2-、3-和4-吡啶基丙氨酸、3-(苯并噻吩-2-与3- 基)丙氨酸、β-(1-与2-萘基)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的O-烷 基化衍生物、S-烷基化半胱氨酸、S-烷基化高半胱氨酸、酪氨酸的O- 硫酸酯、O-磷酸酯与O-羧酸酯、3-磺基酪氨酸、3-羧基酪氨酸、3-磷 酸酪氨酸、酪氨酸的4-甲磺酸酯、酪氨酸的4-甲膦酸酯、3，5-二碘酪 氨酸、3-硝基酪氨酸、ε-烷基赖氨酸和δ-烷基鸟氨酸等。任意这些“氨 基酸侧链衍生物”可以在α、β或γ位被甲基取代，在氨基侧链任意芳 族残基上被卤素取代，或者在侧链部分O、N或S原子上被适当的保 护基团取代。适当的保护基团公开在″Protective Groups In Organic Synthesis，″T.W.Greene and P.G.M.Wuts，J.Wiley&Sons，NY，MY， 1991中。

本文所用的“烷基”是含有1至12个碳原子的直链或支链、环状 或无环、饱和或不饱和烷基(本文也称之为“C1-12烷基”)。类似地， “低级烷基”如上所定义，但是含有1至4个碳原子(本文也称之为 “C1-4烷基”)。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁 基、正戊基、正己基等；饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、 叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊 基、环己基等。不饱和烷基在相邻碳原子之间含有至少一条双键或叁 键(分别称之为“链烯基”或“炔基”)。代表性直链和支链链烯基包 括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2- 戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等， 代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、 1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。代表性不饱和环状烷基包 括环戊烯基和环己烯基等。烷基包括如下所定义的“烷氧基”。

“烷氧基”是这样一种烷基，其中至少一个烷基氢原子被氧原子 代替，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、正戊氧基、异丙 氧基、仲丁氧基等。“低级烷氧基”具有相同的含义，但是用低级烷基 代替烷基。

“氨基烷基”是含有1至12个碳原子的直链或支链、环状或无环、 饱和或不饱和烷基，其中至少一个烷基氢原子或碳原子分别被-NH2或-NH-代替(本文也称之为“C1-12氨基烷基”)。

“芳基”是含有6至12个碳原子的芳族碳环部分(本文也称之为 “C6-12芳基”)，例如苯基和萘基。芳基包括如下所定义的芳氧基。

“芳氧基”是这样一种芳基，其中至少一个芳基氢原子被氧原子 代替，例如苯氧基等。“芳基烷基”是这样一种烷基，其中至少一个烷 基氢原子被芳基部分代替，例如苄基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、 -CH(苯基)2等。芳基烷基包括如下所定义的芳基烷氧基。

“芳基烷氧基”是这样一种芳基烷基，其中至少一个烷基氢被氧 原子代替，例如苄氧基等。“烷基芳氧基”是这样一种芳基烷基，其中 至少一个芳基氢被氧原子代替，例如羟基苄基等。

“杂环”表示5-至7-元单环或7-至10-元二环杂环的环，它是饱 和、不饱和或芳族的，并且含有1至4个独立选自氮、氧和硫的杂原 子，其中氮和硫杂原子可以可选地被氧化，氮杂原子可以可选地被季 铵化，包括二环的环，其中任意上述杂环与苯环稠合。杂环可以经由 任意杂原子或碳原子连接。杂环包括如下所定义的杂芳基。因而，除 了下列杂芳基以外，杂环还包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌 啶基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、氧杂环丙烷基、氧杂环丁烷基、氮 杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、 四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、 四氢噻喃基等。

在上述结构(I)的X背景(context)中，“二价杂环”表示与结构 (I)的R5部分和稠合二环环系碳原子共价键合的杂环部分。

“杂环烷基”表示这样一种烷基，其中至少一个烷基氢原子被杂 环部分代替，例如-CH2(杂环)、-(CH2)2(杂环)等。

“杂芳基”表示5-至10-元的芳族杂环，具有至少一个选自氮、 氧和硫的杂原子，并且含有至少一个碳原子，包括单环和二环的环系。 代表性杂芳基是吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、 喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、吲唑基、苯并咪唑 基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、 嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基(phthalazinyl)、喹唑啉 基等。

“杂芳基烷基”表示这样一种烷基，其中至少一个烷基氢原子被 杂芳基部分代替，例如-CH2吡啶基、-CH2嘧啶基等。

本文所用的术语“取代”表示任意上述基团，也就是烷基、芳基、 芳基烷基、杂环、二价杂环、杂环烷基、杂芳基或杂芳基烷基，其中 至少一个氢原子被取代基代替。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢 原子被代替。“取代基”在这一点上是卤素(例如F、Cl、Br和I)、 氧代、羟基、卤代烷基(例如三氟甲基)、-R、-OR、-C(＝O)R、-C(＝O)OR、 -C(＝O)NRR、-NRR、-NRC(＝O)R、-NRC(＝O)OR、-NRC(＝O)NRR、 -OC(＝O)R、-OC(＝O)OR、-OC(＝O)NRR、-SH、-SR、-SOR、-SO2R、 -NRSO2R、-Si(R)3或-OP(OR)3，其中R的每次出现是相同或不同的， 独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取 代的芳基烷基、杂环、取代的杂环、杂环烷基或取代的杂环烷基，或 者其中任意两个与同一氮原子连接的R基团与它们所连接的氮原子一 起构成杂环或取代的杂环。

“肽”表示至少两个经由肽键连接的天然或非天然存在的α-氨基 酸。依赖于经由肽键连接的氨基酸数，所得肽也可以被称为“多肽” 或“蛋白质”。类似地，“肽衍生物”表示这样一种肽，它已经被共价 修饰和/或含有除α-氨基酸以外的氨基酸。代表性肽衍生物包括这样的 肽，它们在氨基末端例如被甲基、苄基、乙酰基、苯甲酰基、甲磺酰 基、苯磺酰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基或芴氧羰基部分 N-烷基化、N-酰化或N-磺酰化；其中羧基末端被酯化(甲基、乙基、 苄基)或还原为羟基或醛；它们在肽键例如被甲基或2-羟基-4-甲氧基 苄基N-烷基化；它们结合有β-或γ-氨基酸，例如β-丙氨酸或γ-氨基丁 酸。

“连接剂”是任意共价桥连的部分，它有利于结构(I)化合物通过 各R1、R2、R3和/或R4部分与另一种部分、试剂、化合物、固体载体、 分子、氨基酸、肽或蛋白质连接。例如，本发明化合物可以与一种或 多种已知化合物连接，例如生物素，用在诊断或筛选测定中。此外， 一个(或多个)R1、R2、R3或R4可以是连接结构(I)化合物与固体载 体(例如用在固相肽合成中的载体)的连接剂。这类连接剂的实例包 括对-烷氧基苯甲醇、苯基乙酰氨基甲基和2-氯三苯甲基氯。

“固体载体”表示任意组成的物质，另一种化合物与之直接连接 或者通过连接剂连接，并且不溶于至少一种溶剂，而所连接的化合物 在其中是可溶的。作为替代选择，“固体载体”可以是一定组成的物质， 具有与所连接的化合物相似的溶解度特征，但是可以容易从溶液中沉 淀和过滤出来，为固体。代表性实例包括聚苯乙烯、聚乙二醇、与聚 乙二醇接枝聚合的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酰胺-聚乙二醇共聚物、 受控多孔玻璃和二氧化硅。

短语“分子的其余部分”表示在Y和Z位与β-链模拟物共价连接 的任意部分、试剂、化合物、固体载体、分子、连接剂、氨基酸、肽 或蛋白质，包括如上所定义的氨基酸侧链部分、氨基酸侧链衍生物和 肽衍生物。因此，在结构(I)的替代描绘中，对应的Y和Z部分可以是 不确定的，如下列结构(I’)、(I”)和(I)所代表的：

其中 代表分子的其余部分，A、A’、R1、R2、R3、R4和R5 如上所定义。

在结构(I)的进一步实施方式中，本发明化合物具有下列结构(II)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中A、A’、X、Y、Z、R2、 R3、R4和R5如上所定义。

在结构(II)的进一步实施方式中，本发明化合物具有下列结构 (III)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中A、A’、X、Y、Z、R2、 R3、R4和R5如上所定义。

在结构(II)的更进一步实施方式中，R2和R3是氢，本发明化合物 具有下列结构(IV)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中A、A’、X、Y、Z、R4和 R5如上所定义。

在结构(IV)的进一步实施方式中，A和A’都是N，本发明化合物 具有下列结构(V)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中X、Y、Z、R4和R5如上 所定义。

在结构(V)的更进一步实施方式中，R4是氢，本发明化合物具有 下列结构(VI)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中X、Y、Z和R5如上所定 义。

在结构(VI)的更进一步实施方式中，X是含氮二价杂环，本发明 化合物具有下列结构(VII)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中Y、Z、R5和“取代基” 如上所定义，m是1、2、3或4，其中R5与取代基一起可以可选地构 成取代或未取代的杂环。

在结构(VII)的更进一步实施方式中，本发明化合物具有下列结构 (VIII)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中Y、Z、m和R5如上所定 义。

在结构(VIII)的更进一步实施方式中，m是2，本发明化合物具有 下列结构(IX)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中Y、Z和R5如上所定义。 在结构(IX)的更具体实施方式中，Y和Z各自是氨基酸侧链部分或氨 基酸侧链衍生物。

在结构(IX)的更进一步实施方式中，Y是-NHR6，本发明化合物 具有下列结构(X)：

或其药学上可接受的盐和立体异构体，其中

Z是

1)烷基，

2)烷氧基，

3)苯基，

4)苄基，

5)苯乙基，

6)1-萘甲基，

7)2-萘甲基，

8)苯基苄基，

9)联苯，

10)氨基烷基，

11)芳基，

12)芳基烷基，

13)Het，

14)选自R7d的基团，

15)-(CH2)o-N(RdRd′)，

16)-(CH2)m-芳基-NHRt，

17)-(CH2)m-芳基-NRdRd′，

18)-(CH2)o-CO2Re，

19)-(CH2)o-C(＝O)-NReRe′，

20)-(CH2)o-O-Rf，

21)-(CH2)o-SO2-芳基，

22)-(CH2)o-Het，或

23)氢，

其中烷基、苯基、苄基、苯乙基、1-萘甲基、2-萘甲基、苯基苄 基、联苯、氨基烷基、芳基、芳基烷基和Het可选地独立地被一个或 多个取代基取代，取代基独立地选自但不限于Rs；

Rd和Rd′相同或不同，独立地选自

1)氢，

2)-C(＝O)-烷基，

3)-C(＝O)-链烯基，

4)-C(＝O)-炔基，

5)-C(＝O)-芳基，

6)-C(＝O)-芳基烷基，

7)-C(＝O)-Het，

8)选自R5的基团，

9)-C(＝O)-烷基-NH2，

10)-C(＝O)(CH2)m-芳基-(CH2)n-NH2，

11)-C(＝O)(CH2)m-芳基-(CH2)n-Het，

12)-C(＝O)(CH2)m-1，4-环己基-(CH2)n-NH2，

13)-C(＝O)(CH2)m-芳基-OH，

14)-C(＝O)(CH2)m-芳基-SO2-NH2，

15)-C(＝O)(CH2)m-芳基-(CH2)n-NHC(＝O)-烷基，

16)-C(＝O)(CH2)m-Het，

17)-C(＝O)(CH2)m-S-Het，

18)-SO2-芳基，

19)-SO2-芳氧基，和

20)-SO2-芳基烷基，

其中烷基、链烯基、炔基、芳基、芳基烷基、芳氧基和Het可选 地独立地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自但不限于Rs；

Re和Re′相同或不同，独立地选自

1)氢，

2)烷基，

3)链烯基，

4)炔基，

5)芳基，

6)芳基烷基，

7)Het，

8)-烷基芳基，

9)-(CH2)o-芳基-(CH2)m-NH2，

10)-(CH2)o-NH-芳基，

11)-(CH2)o-1，4-环己基-(CH2)m-NH2，

12)-(CH2)o-芳氧基，

13)-(CH2)o-芳基-NH2，

                           和

其中烷基、链烯基、炔基、芳基、芳基烷基和Het可选地独立地 被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自但不限于Rs；

Rf选自

1)氢，

2)烷基，

3)链烯基，

4)炔基，

5)芳基，

6)芳基烷基，

7)Het，

8)烷基芳基，

9)-C(＝O)-烷基，

10)-C(＝O)-芳基，

11)-C(＝O)-芳基烷基，

12)-C(＝O)-Het，

13)-C(＝O)-烷基芳基，

14)-C(＝O)-NH-烷基，

15)-C(＝O)-NH-芳基，

16)-C(＝O)-NH-芳基烷基，

17)-C(＝O)-NH-Het，和

18)-C(＝O)-NH-烷基芳基，

其中烷基、链烯基、炔基、芳基、芳基烷基和Het可选地独立地 被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自但不限于Rs；

Rs是

1)卤素，

2)氢，

3)低级烷基

4)-CN，

5)-CF3，

7)-C(＝O)Re，

8)-C(＝NH)-NH2，

9)-C(＝NRd)(NRdRd′)，

10)-NRdRd′，

11)-NReC(＝O)Re，

12)-NReC(＝O)ORe，

13)-NReC(＝O)NReRe′，

14)-NH-C(＝NH)NH2，

15)-NO2，

16)-OCF3，

17)-OH，

18)-ORe，

19)-OC(＝O)Re，

20)-OC(＝O)NReRe′，

21)-SRe，

22)-S(O)kRe，

23)-S(O)2ORe，

24)-S(O)kNReRe′，或

25)选自R5的基团；

Rt是

1)氢，

2)-C(＝NH)-NH2，或

3)选自R5的基团；

R5是

1)-C(＝O)O-R7，

2)-C(＝O)NH-R7，

3)-S(O2)-R7，

4)-C(＝O)-R7，或

5)氢，

其中R7是R7a、R7b、R7c或R7d；

R7a是烷基或氨基烷基，可选地独立地被一个或多个取代基取代， 取代基独立地选自但不限于Rs；

R7b是芳基、芳基烷基或Het，可选地独立地被一个或多个取代基 取代，取代基独立地选自但不限于Rs；

R7c是苯基、苄基或苯乙基，可选地独立地被一个或多个取代基取 代，取代基独立地选自但不限于Rs；

R7d是

1)-(CH2)l-NRdRd′，

2)-(CH2)l-CO2Re，

3)-(CH2)m-芳基-(CH2)n-NRdRd′，

4)-CH(NRdRd′)-(CH2)o-NRdRd′，

5)-(CH2)m-1，4-环己基-(CH2)n-NRdRd′，

6)-(CH＝CH)k-(CH2)p-NRdRd′，

                            或

8)

R6是

1)-(CH2)l-NHRt，

2)-(CH2)l-Het-NHRt，

3)-(CH2)o-芳基-(CH2)n-Rt，

4)-(CH2)o-芳基-(CH2)n-NHRt，

5)-(CH2)o-环己基-(CH2)m-NHRt，

6)-(CH＝CH)k-(CH2)p-NHRt，

或

Rd和Rd′与它们所连接的原子一起构成3至7个成员的单环或二 环杂环的环，各自含有另外0-3个杂原子，各自独立地选自氮、氧和 硫；

Re和Re′与它们所连接的原子一起构成3至7个成员的单环或二 环杂环的环，各自含有另外0-3个杂原子，各自独立地选自氮、氧和 硫；

k是整数1至2；

l是整数1至10；

m是数字0至4；

n是数字0至4；

o是整数1至4；

p是整数1至2；

Het是杂环、杂环烷基、杂芳基或杂芳基烷基。

上述结构(I)中，表示各种R基团与稠合二环上碳原子连接的实线 表明这些R基团可以位于页面上方或下方。如果本发明β-链模拟物打 算模拟天然存在氨基酸(即“L-氨基酸”)的β-链，那么R基团一般 将位于结构(I)中页面下方(即 )。不过，如果本发明β-链模 拟物打算模拟含有一种或多种D-氨基酸的β-链，那么相应的R基团将 位于结构(I)中页面上方(即 )。

在进而更具体的结构(I)实施方式中，本发明化合物具有下列构型 (XI)：

在进而更具体的结构(I)实施方式中，本发明化合物具有下列构型 (XII)：

在进而更具体的结构(I)实施方式中，本发明化合物具有下列构型 (XIII)：

在进而更具体的结构(I)实施方式中，本发明化合物具有下列构型 (XIV)：

在进而更具体的结构(I)实施方式中，本发明化合物具有下列构型 (XV)：

在进而更具体的结构(I)实施方式中，本发明化合物具有下列构型 (XVI)：

本发明化合物一般可以这样制备，在溶液中逐步进行或者借助固 相合成，依次偶联个别的组分片段，正如固相肽合成所普遍实施的。 为此，化合物可以这样合成，在固体载体上(例如聚苯乙烯，使用4- 羟甲基苯氧基丁酸酯作为连接剂)，借助已知技术(例如参见John M. Stewart and Janis D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，1984， Pierce Chemical Comp.，Rockford，Illinois；Atherton，E.，Shepard，R. C.Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach；IRL：Oxford， 1989)，或者在连接有甲硅烷基的树脂上借助醇的连接(Randolph et al.， J.Am.Chem.Soc.117：5712-14，1995)。本发明合成法的实用性和易用 性进一步以多种商业上可得到的树脂的可利用性为例。为此，聚苯乙 烯或ArgoGel(聚乙二醇接枝聚合的聚苯乙烯；Argonaut，San Carlos， CA)内核可以用在本发明的合成中，其中采用氨甲基聚苯乙烯、二苯 甲胺(BHA)甲基二苯甲胺(MBHA)(Matsueda et al.，Peptides 2：45， 1981)、苯氧基苄醇(Wang树脂)(Wang，J.Am.Chem.Soc.95：1328， 1973)、2-氯三苯甲基(Barlos et al.，Tetrahedron Lett.30：3943，1989， ibid 30：3947，1989)和PAL(Albericio et al.，J.Org.Chem.55：3730， 1990)和其他树脂。

另外，可以利用溶液与固相合成技术的组合来合成本发明的化合 物。例如，可以利用固体载体合成线性肽序列直至向该序列加入本发 明化合物的点。然后可以加入以前已经用溶液合成技术合成的适合化 合物，作为固相合成的下一个“氨基酸”(也就是说，可以利用具有至 少两个反应性部位的化合物作为向线性肽加入的下一个残基)。一旦化 合物结合到序列中，然后可以加入额外的氨基酸，以完成与固体载体 键合的肽。作为替代选择，可以在固体载体上合成线性N-末端与C- 末端保护的肽序列，再从载体上除去，然后利用已知的溶液偶联技术 与溶液中的化合物偶联。

在本发明的另一方面，公开了构建文库的方法。传统的组合化学 (例如The Combinatorial Index，Bunin，Academic Press，New York， 1998；Gallop et al.，J.Med.Chem.37：1233-1251，1994)和平行合成技 术允许借助试剂与基本分子骨架的先后组合而迅速制备大量化合物。 例如，利用Nicolaou及合作者的定向排序技术可以进行上述合成 (Nicolaou et al.，Angew.Chem.Int’l.Ed.34：2289-2291，1995)。目前， 用于这种技术的设备在商业上可从IRORI获得(La Jolla，CA)。作为 替代选择，可以利用48-或96-孔平板格式借助平行合成方式进行上述 合成，其中每孔含有排放溶剂和试剂的玻璃原料出口(A Practical Guide to Combinatorial Chemistry，Czarnik and DeWitt，Eds.， American Chemical Society，Washington DC，1997)。Robbins (Sunnyvale，CA)、Charybdis(Carlsbad，CA)和Bohdan(Chicago，IL) 目前供应适合于这种技术的设备。

在本发明的另一方面，公开了筛选文库的生物活性和分离生物活 性文库成员的方法。可以借助多种技术和方法筛选本发明文库的生物 活性。一般而言，筛选测定法可以这样进行，(1)使文库与有关生物靶 接触，例如受体，以便在文库模拟物与靶之间发生结合，(2)借助适当 的测定法检测结合事件，例如由Lam等(Nature 354：82-84，1991)或 Griminski等(Biotechnology 12：1008-1011，1994)公开的比色测定法。 在优选的实施方式中，文库成员是在溶液中，靶是固定在固相上的。 作为替代选择，可以将文库固定在固相上，使其与溶液中的靶接触进 行探查。

另一方面，本发明涵盖为贮存或给药而制备的药物组合物，在药 学上可接受的载体或稀释剂中包含治疗有效量的本发明化合物。细胞 粘连抑制剂疗法适用于治疗和预防多种炎性病症，特别是类风湿性关 节炎、炎性肠疾病和哮喘。本领域技术人员容易获知需要抗炎疗法的 环境。

本发明化合物的“治疗有效量”将依赖于给药途径、所治疗的温 血动物类型和所考虑具体动物的身体特征。这些因素和它们与确定该 有效量的关系是医学领域技术人员所熟知的。为实现最佳功效可以调 整这种给药量和方法，但是将依赖于体重、饮食、并行药物治疗和其 他因素等，如上所述，这些将为医学领域技术人员所认识。通常，剂 量将在约0.01mg/kg与100mg/kg体重之间，优选在约0.01与10mg/kg 体重之间。

治疗性应用的“药学上可接受的载体”、包括稀释剂，是药学领域 熟知的，例如描述在Remingtons Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(Gennaro Ed.1985)中。例如，可以使用生理pH的无 菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。药物组合物可以含有防腐剂、稳定剂、染 剂、甚至矫味剂。例如，作为防腐剂可以加入苯甲酸钠、山梨酸和对- 羟基苯甲酸酯。另外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

本发明化合物可以借助吸入给药，因而可以以气雾喷雾剂的方式 从加压包装或雾化器中递送。化合物还可以作为经过配制的粉剂被递 送，并且可以借助吹入粉剂吸入装置吸入粉剂组合物。吸入所优选的 递送系统是计量剂量吸入气雾剂，它可以被配制成本发明化合物在适 合推进剂中的悬浮液或溶液，例如碳氟化合物或碳氢化合物。另一种 优选的递送系统是干粉吸入气雾剂，它可以被配制成本发明化合物有 或者没有额外赋形剂的干粉。

本发明化合物可以以药库注射剂或植入物的方式给药，它们可以 以这样一种方式配制，以便允许活性成分的持续释放。可以将活性成 分压制成颗粒或小圆柱体，作为药库注射剂或植入物皮下或肌内植入。 植入物可以采用惰性材料，例如生物可降解聚合物或合成硅酮，例如 硅橡胶、硅酮橡胶或其他聚合物，由Dow-Corning Corporation制造。

本发明化合物还可以以脂质体递送系统的方式给药，例如小型单 层囊、大型单层囊和多层囊。脂质体可以从各种磷脂生成，例如胆固 醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。

本发明化合物还可以这样递送，使用单克隆抗体作为个别的载体， 使化合物分子与之偶联。类胰蛋白酶抑制剂还可以与作为可靶向药物 载体的可溶性聚合物偶联。这类聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡 喃共聚物、聚羟丙基-异丁烯酰胺-苯酚、聚羟乙基-天冬酰胺-苯酚或被 棕榈酰残基取代的聚氧乙烯-聚赖氨酸。此外，类胰蛋白酶抑制剂可以 与一类可用于实现药物控制释放的生物可降解聚合物偶联，例如聚乳 酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁 酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交 联或两亲嵌段共聚物。

本发明药物组合物可以以药物制备物的形式使用，例如固体、半 固体或液体形式，其中含有一种或多种本发明化合物作为活性成分， 并且混合有适合于外部、肠内或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形 剂。例如，活性成分可以与常用的无毒性药学上可接受的载体复合成 片剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、溶液、乳剂、悬浮液和任意其他适用 的形式。可以使用的载体有水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘 露糖醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化 硅、马铃薯淀粉、尿素和其他适用于制造固体、半固体或液体制备物 的载体，另外可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、着色剂和香料。包括 在药物组合物中的活性化合物的量足以对疾病过程或条件产生所需效 果。

就上述临床病症或疾病的治疗而言，本发明化合物可以被口服、 局部、肠胃外、吸入喷雾或直肠给药，剂量单元制剂含有常规的无毒 性药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。本文所用的术语肠胃外包括 皮下、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。

就某些病症的治疗而言，可能需要采用本发明化合物连同另一种 药理活性成分。例如，本发明化合物可以与另一种治疗剂一起呈现为 联合制备物，同时、单独或先后使用以缓解呕吐。这类联合制备物例 如可以是双包装形式。优选的组合包含本发明化合物与一种化疗剂， 例如烷基化剂、抗代谢剂、有丝分裂抑制剂或细胞毒性抗生素，如上 所述。一般而言，目前可用在这类组合中的已知治疗剂的剂型将是适 合的。

在与类胰蛋白酶有关的病症的治疗中，适当的剂量水平一般将是 约0.001至50mg每kg患者体重每天，这可以在单一或多个剂量中给 药。优选地，剂量水平将是约0.01至约25mg/kg每天，更优选为约 0.05至约10mg/kg每天。为实现最佳功效可以调整给药的剂量和方法， 但是将依赖于体重、饮食、并行药物治疗和其他因素，这些将为医药 领域技术人员所认识。当给药是肠胃外方式时，例如在每日基础上的 静脉内方式，可注射的药物组合物可以被制成常规剂型，既可以是液 体溶液或悬浮液，也可以是适合在注射前制成液体溶液或悬浮液的固 体剂型，或是乳剂。

出于例证而非限制的目的提供下列实施例。这些实施例阐述本发 明β-链模拟物的合成。具体而言，β-链模拟物的制备是在固相上进行 的。这些β-链模拟物的固相合成证明，可以容易地制备含有这类成员 的文库。

表2

用于实施例的缩写

试剂：

AcOH        乙酸

Ac2O       乙酸酐

BOP       苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐

DIAD      偶氮二羧酸二异丙酯

DIC       二异丙基羰基二酰亚胺

DIEA      N，N-二异丙基乙胺

HATU      O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HOAt      1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HOBt      1-羟基苯并三唑水合物

MCPBA     间-氯过苯甲酸

PyBOP     苯并三唑-1-基氧基-三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐

TFA       三氟乙酸

TPP       三苯膦

溶剂：

CAN       乙腈

DCM       二氯甲烷

DMF       二甲基甲酰胺

DMSO      二甲基亚砜

Et2O     乙醚

MeOH      甲醇

THF       四氢呋喃

保护基团：

All       烯丙基

Alloc     烯丙氧羰基

Fmoc      9-芴基甲氧羰基

tButyl    叔丁基

Trt       三苯甲基

其他：

RT        室温

equiv     当量

g         克

h          小时

min        分钟

实施例

出于例证而非限制的目的提供下列实施例。这些实施例阐述本发 明β-链模拟物的合成。

材料和方法

化学合成：试剂、原料和溶剂购自Aldrich，Maybridge，Advanced ChemTech，ICI，Fluka Lancaster，或者酌情来自任何其他精细化学品 来源。Wang聚苯乙烯树脂(负载率1.0mmolOH/g)购自Advanced ChemTech。

分析：1H NMR光谱是在500MHz下、在Varian Unity 500光谱 计上记录的，并且参比CDCl3或CD3OD信号残余质子(分别为δ 7.26ppm和δ3.31ppm)。化合物QC分析是利用下列条件进行的： LCMS(方法A)，借助HPLC纯化(方法B)。LCMS分析(方法A)是在 这样一种系统上进行的，由Mass Spectrometer Micromass-Platform LCZ系统和HPLC Hewlett Packard(1100系列)组成，配备有Gilson 215液体操控器作为自动进样器，具有下列检测器：DAD 210-350mm、 ELSD(蒸发光散射检测器)和MS(ESI+/-)。

色谱条件：溶剂系统A-水(0.1％TFA)，B-乙腈(0.1％TFA)； 梯度5-95％(3min)，流速0.9mL/min。柱子：Zorbax C18柱(2.1× 30mm)。色谱峰是用ELSD和DAD检测器测定的，通过色谱峰顶部 附近0.1分钟时间窗内的质谱取平均，以阳离子和阴离子模式得到对 应的质谱。色谱纯度是用ELSD测定的。采用制备型和半制备型HPLC 进行样品纯化，用分析型HPLC(方法B)测定纯度，条件如下：柱子 5μM 4.6×50mm，A-水(0.1％TFA)，B-乙腈(0.1％TFA)，梯度5 -90％B(15min)，流速1.5mL/min。

实施例1

代表性β-链模拟物的合成

这些实施例阐述代表性本发明化合物的合成。具体而言，化合物 的制备是在固相中进行的。这些化合物的固相合成证明，可以容易地 制备含有这类成员的文库。表3和4给出代表性化合物的结构。

反应是如下进行的，但不限于此：适当大小的塑料一次性注射器， 各自装有聚丙烯玻璃料以留存树脂，与Symphony自动肽合成仪 (Protein Technologies)相匹配的1-10ml反应容器，ACT 90合成仪 (Advanced ChemTech)、Robbins构件或IRORI系统。

代表性化合物的固相合成

一般反应流程：

方法A1：

上述一般反应流程中，下列反应顺序完全适合于固相合成。因而， 在BOP(3equiv)、HOBT(3equiv)的存在下，在DMF中，在室温下， 通过H2N-A-NH2与商业上可得到的Wang树脂(1.0mmol/g)反应所制备 的树脂-键合性胺与必要的Fmoc-二烯酸(a)(3.0equiv)偶联4h，生成对 应的聚合物-键合性Fmoc-二烯(b)。用25％哌啶/DMF进行Fmoc的去 保护，继之以采用上述条件与Fmoc-酸连接剂(Fmoc-HN-B-CO2H)偶 联，得到中间体Fmoc二烯-连接剂。最后除去Fmoc，随后与Boc-保 护的芳族氨基酸或其等价物(R1-CO2H)偶联，完成链长，进入倒数第 二的Diels-Alder反应步骤阶段。在[双(三氟乙酰氧基)碘]苯(3equiv) 的存在下，在室温下，使这种延长了的二烯单元与适当的尿唑(3equiv) 接触3h，有效地得到树脂-键合性化合物抑制剂。然后用95％TFA/H2O处理90分钟，使所需抑制剂连同Boc-保护基团从树脂上裂解下来。 此后，收集上清液，与洗液合并(2×1mL 95％aq TFA)。将蒸发溶液 后所得残余物重新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥，得到所需 粗加合物(TFA盐)。

方法A2：

上述一般反应流程中，下列反应顺序完全适合于固相合成。因而， 在BOP(3equiv)、HOBT(3equiv)的存在下，在DMF中，在室温下， 通过H2N-A-NH2与商业上可得到的Wang树脂(1.0mmol/g)反应所制备 的树脂-键合性胺与必要的Fmoc-二烯酸(a)(3.0equiv)偶联4h，生成对 应的聚合物-键合性Fmoc-二烯(b)。按照Diels-Alder反应条件，在[双 (三氟乙酰氧基)碘]苯(3equiv)的存在下，在室温下，使这种Fmoc哌啶 -二烯单元与适当的尿唑(3equiv)接触3h，有效地得到树脂-键合性二环 化合物(c)。用25％哌啶/DMF进行Fmoc的去保护，继之以采用上述 偶联条件与Fmoc-酸连接剂(Fmoc-HN-B-CO2H)偶联，得到中间体 Fmoc二烯-连接剂。最后除去Fmoc，随后与Boc-保护的芳族氨基酸 或其等价物(R1-CO2H)偶联，完成链长，进入裂解步骤阶段。然后用 95％TFA/H2O处理90分钟，使所需抑制剂连同Boc-保护基团从树脂 上裂解下来。此后，收集上清液，与洗液合并(2×1mL 95％aq TFA)。 将蒸发溶液后所得残余物重新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥， 得到所需粗加合物(TFA盐)。

方法B：

一般合成工艺与上面(方法A1)相同，但是在Diels-Alder反应 之后，采用下列条件将树脂-键合性O2N-C-尿唑(e)上的硝基还原为苯 胺。在室温下用氯化亚锡二水合物(21equiv，2N DMF溶液)处理3h， 得到中间体苯胺。在DIEA(21equiv)、PyBOP和HOBt(各10equiv) 的存在下，在DMF中，将所得苯胺用芳基酸(R3CO2H)(10equiv)酰化 过夜。然后用95％TFA/H2O处理90分钟，使所需产物连同t-Boc-保 护基团从树脂上裂解下来。收集上清液，与洗液合并(2×1mL 95％aq TFA)。将蒸发溶液后所得残余物重新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷 冻干燥，得到所需粗加合物(TFA盐)。

方法C：

一般合成工艺与上面(方法A1)相同，但是在Diels-Alder反应 之后，采用下列条件将树脂-键合性O2N-C-尿唑(e)上的硝基还原为苯 胺。在室温下用氯化亚锡二水合物(21equiv，2N DMF溶液)处理3h， 得到中间体苯胺。在吡啶(4equiv)的存在下，在DMF中，使所得苯胺 与磺酰氯(R4SO2Cl)(2.5equiv)反应过夜。然后用95％TFA/H2O处理 90分钟，使所需产物连同Boc-保护基团从树脂上裂解下来。收集上清 液，与洗液合并(2×1mL 95％aq TFA)。将蒸发溶液后所得残余物重 新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥，得到所需粗加合物(TFA 盐)。

方法D：

一般合成工艺与上面(方法A1)相同，但是在Diels-Alder反应 之后，在DIEA(5equiv)、PyBOP和HOBt(各4equiv)的存在下，在 DMF中，使游离酸(e)与胺(H2N-R6)(4equiv)反应过夜。然后用95％ TFA/H2O处理90分钟，使所需产物连同t-Boc-保护基团从树脂上裂 解下来。收集上清液，与洗液合并(2×1mL 95％aq TFA)。将蒸发溶 液后所得残余物重新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥，得到所 需粗加合物(TFA盐)。

方法E：

一般合成工艺与上面(方法A1)相同，但是在Diels-Alder反应 之后，在DIEA(5equiv)、PyBOP和HOBt(各4equiv)的存在下，在 DMF中，使游离胺(e)与酸(R7-CO2H)(4equiv)反应过夜。然后用95％ TFA/H2O处理90分钟，使所需产物连同Boc-保护基团从树脂上裂解 下来。收集上清液，与洗液合并(2×1mL 95％aq TFA)。将蒸发溶液 后所得残余物重新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥，得到所需 粗加合物(TFA盐)。

实施例2

代表性β-链模拟物的合成

羟基树脂的活化

首先在DCM中，在-20℃下，将购自Advanced ChemTech的商 业上可得到的4-羟甲基苯氧基树脂(Wang-树脂)用4-硝基苯基氯甲酸 酯(5equiv)和吡啶(4equiv)活化约一小时，然后达到室温，搅拌过夜。 将树脂过滤，用DMF、DCM和Et2O洗涤(各5x)，放干。

活化羟基-树脂与二胺的偶联

使树脂与(10-15equiv)2M适当二胺的DMF溶液在室温下反应 15h，然后将树脂过滤，用DMF反复洗涤，直至洗液变为无色。用 DCM和Et2O进行额外的洗涤(各5x)，得到洁净的胺-树脂。干燥后， 取一小部分进行Fmoc保护和裂解，通过测量UV吸收来测定负载率。

一般在树脂上经由与胺偶联延长二烯

在BOP(3equiv)、HOBT(3equiv)和DIEA(4.5equiv)的存在下， 在DMF中，使胺-键合性树脂与Fmoc-保护的二烯酸(3equiv)偶联3h， 此时Kaiser试验为阴性。用25％(v/v)哌啶/DMF裂解Fmoc基团10 分钟，氯醌试验为阳性。在BOP(3equiv)、HOBT(3equiv)和DIEA (4.5equiv)的存在下，在DMF中，将新去保护的胺官能度用3equiv适 当的酸连接剂处理，在5h反应时间内的氯醌试验为阴性。如上所述， 从连接剂上除去Fmoc基团可由阳性Kaiser分析得到证实。采用上述 偶联条件和洗涤循环，使游离氨基与Boc-氨基酸衍生物(3equiv)反应， 使链封端。

一般Diels-Alder反应工艺

利用所装配的所需链长，如下进行Diels-Alder化学：在DMF中， 在室温下，使二烯-树脂与各为3equiv的适当尿唑和[双(三氟乙酰氧基) 碘]苯反应3.5h，在常规洗涤之后可得到二环化合物。

方法F：

将干燥后的树脂重新溶胀在DCM中，排干。然后在室温下用95％ (v/v)TFA/H2O处理1.5h，使产物从树脂上裂解下来。收集上清液，与 洗液合并，在高速真空中蒸发。将蒸发溶液后所得残余物重新溶于冰 乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥，得到所需产物。

方法G：

将干燥后的树脂预先溶胀在DCM中，排干。然后在室温下用4N HCl的二噁烷溶液处理3h，使产物从树脂上裂解下来。收集上清液， 与洗液(乙腈-H2O，1∶1，4×5mL)合并，蒸发。将蒸发溶液后所得残余 物重新溶于冰乙酸或50∶50乙腈-水，冷冻干燥，得到所需产物。

实施例3

代表性β-链模拟物的合成

组分片段的合成

氨甲基环己烷胺树脂(3)的合成

将氨甲基环己烷羧酸(1)(20g，127mmol)和碳酸钠(13.6g，128mmol) 溶于600mL水，然后历经30min加入FmocOSu(40g，118mmol)的溶 液，同时搅拌。将混合物搅拌过夜，在此期间有大量白色沉淀生成。 将混合物用1N HCl酸化至pH＝3，然后用2L乙酸乙酯稀释。分离有 机层，用5％含水柠檬酸、水和盐水洗涤。将有机层经无水硫酸钠干 燥，过滤，在冰箱中冷却过夜。滤出固体，然后将滤液浓缩至约1L， 冷却过夜。将固体过滤与预先收集的固体合并(2)，然后在干燥器中干 燥。

将Fmoc氨甲基环己基羧酸(2)溶于1L二氯甲烷。加入草酰氯 (39mL，450mmol)，继之以DMF(10滴)，将混合物搅拌1h。在真空下 浓缩混合物，将残余物溶于1L甲苯，加入叠氮化钠(18.4g，280mmol) 的30mL水溶液以及3.4g(12mmol)叠氮化四丁基铵。由于溶解度低， 加入另外2L甲苯，将混合物剧烈搅拌，直至等分试样的IR光谱显示 酰基叠氮化物的峰(2120cm-1)。将混合物过滤，固体备用(未反应的酰 氯)。滤液用5％含水柠檬酸(2×200mL)和盐水(200mL)萃取，然后将 甲苯溶液经无水硫酸钠干燥，过滤。将溶液加热至回流，直至溶液等 分试样的IR光谱显示异氰酸酯的峰(2230cm-1)和酰基叠氮化物的峰消 失。蒸发溶液，得到31g固体。将固体溶于二氯甲烷(800mL)，与Wang 树脂(57g，54mmol)搅拌，加入4N HCl的二噁烷溶液(1.5mL)。将混合 物搅拌过夜，然后过滤。将树脂(3)用DMF(3×800mL)、二氯甲烷(3× 800mL)和乙醚(3×800mL)洗涤，然后在真空干燥器中干燥。

4-({[(苄氧基)羰基]氨基}甲基)苯甲酸(4)的合成

将氨甲基苯甲酸(6.0g，39.7mmol)和Na2CO3(8.41g，79.4mmol)溶 于H2O(40mL)。向该混合物加入Cbz-Osu(10.4g，41.7mmol)的THF (40mL)溶液。将所得溶液在室温下搅拌过夜，然后浓缩。将残余物用 2N HCl酸化至pH＝2，生成固体沉淀。过滤收集产物，在真空中干 燥过夜，得到9.6g 85％白色固体(4)。

4-(氨基羰基)苄基氨甲酸苄酯(5)的合成

在室温下，向上述固体(4)(2.0g，7.0mmol)的DCM(20mL)溶液加 入草酰氯(2.0mL)，然后向溶液缓慢加入DMF(40μL)。将反应混合物 搅拌2小时后，浓缩溶液。将残余物重新溶于DCM(10mL)，在0℃ 下用28％氨水溶液(20ml)处理，在该温度下搅拌1小时。过滤收集所 生成的固体产物，用水洗涤，在真空中干燥过夜，得到白色固体(5) (1.95g，98％)。

4-(氨基硫代羰基)苄基氨甲酸苄酯(6)的合成

向酰胺(5)(2.0g，7.0mmol)的THF(20mL)溶液加入Lawesson试剂 (1.42g，3.5mmol)。将混合物在回流下加热3h，浓缩至干，然后缓慢加 入DCM(10mL)。搅拌2h后，过滤收集所生成的黄色固体，用冷DCM 洗涤，在真空下干燥，得到1.68g 80％所需产物(6)。

4-[[(叔丁氧羰基)氨基](亚氨基)甲基]苄基氨甲酸苄酯(7)的合成

将硫代酰胺(6)(1.0g，3.3mmol)在DCM/CH3Cl混合物(4/1，10mL) 中的悬液在回流下加热3h，直至完全溶解。浓缩溶液，得到浓稠的油。 将该油溶于MeOH(5.0mL)，加入到甲酸铵(0.8g，10.0mmol)的MeOH(10mL)溶液中，在室温下搅拌过夜。这引起白色固体的生成，过滤， 用冷MeOH洗涤。将固体溶于THF/水(5∶1，20mL)，加入TEA(1.4mL， 10.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min，然后用Boc2O(0.8g， 3.4mmol)的THF(2.0mL)溶液处理。搅拌24h后，产物用乙酸乙酯萃 取(3×50mL)。合并有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩。将 残余物用乙醚悬浮1h，然后过滤，得到灰白色固体产物4-[[(叔丁氧羰 基)氨基](亚氨基)甲基]苄基氨甲酸苄酯(7)(1.1g，88％)。1H NMR (300MHz，CDCl3)δ7.79(d，J＝8.3Hz，2H)，7.33(m，7H)，5.19(bs，1H)， 5.16(s，2H)，4.42(d，J＝6.0Hz，2H)，1.56(s，9H).

[4-(氨甲基)苯基(亚氨基)甲基]氨甲酸叔丁酯(8)的合成

将4-[[(叔丁氧羰基)氨基](亚氨基)甲基]苄基氨甲酸苄酯(7)(2.5g， 6.5mmol)的80mL甲醇溶液与1.3g Pd-C(5wt％Degussa型E101 NO/W，50％H2O)在氢气氛下搅拌1.5h。过滤除去催化剂，在真空中 蒸发溶剂，得到1.51g(93％)游离胺(8)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ 7.79(br s，2H)，7.36(br s，2H)，3.92(br s，2H)，1.54(s，9H)；MS(ES+) m/z 250.44(M+H+).

9H-芴-9-基甲基4-[[(叔丁氧羰基)氨基](亚氨基)甲基]苄基氨甲酸 酯(9)的合成

向Boc-脒(8)(4.71g，18.9mmol)的THF(100mL)溶液加入15mL饱 和NaHCO3溶液，继之以Fmoc-Osu(6.4g，19mmol)。将混合物在室温 下搅拌过夜。加入乙酸乙酯/水(1∶1，50mL)，分离各层。含水层进一步 用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。合并有机层，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，在真空中蒸发。经过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(95∶5) 洗脱，得到(6.72g，76％)产物(9)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.83(d， J＝8.0Hz，2H)，7.76(d，J＝7.5Hz，2H)，7.59(d，J＝7.0Hz，2H)，7.40(t， J＝7.5Hz，3H)，7.31(t，J＝7.5Hz，3H)，4.44(d，J＝7.0Hz，2H)，4.38(d， J＝6.0Hz，2H)，4.22(t，J＝6.0Hz，1H)，1.57(s，9H)；MS(ES+)m/z 472.45(M+H+).

9H-芴-9-基甲基4-[氨基(亚氨基)甲基]苄基氨甲酸酯(10)的合成

向Fmoc-Boc-脒(9)(6.72g，14.2mmol)加入4N HCl的二噁烷溶液 (50mL)。在室温下搅拌2h后，在真空中除去溶剂，得到HCl盐(10)， 直接用于下一步。MS(ES+)m/z 372.41(M+H+).

树脂-键合性9H-芴-9-基甲基4-[氨基(亚氨基)甲基]苄基氨甲酸酯 (11)的合成

就装载到树脂上而言，将14.2mmol粗游离脒(10)与DIEA(6.2mL， 35mmol)预先混合在40mL DMF中，加入到(4.2g，7.1mmol)对-硝基苯 基Wang树脂的DMF溶液中。将混合物摇动5.5h，将树脂过滤，用 DCM、MeOH、DMF、MeOH和乙醚洗涤(各2x)，得到5.8g树脂(11) (负载率＝0.71mmol/g)。

3-[甲氧基(甲基)氨基]-3-氧代丙基降冰片烯二酸叔丁酯(carbate) (13)的合成

向Boc-对-苯胺(12)(1.0g，5.28mmol)的DCM(30mL)溶液加入 N，N’-羰基二咪唑(856mg，5.81mmol)，继之以在室温下搅拌30min。加 入二异丙基乙胺(1.0mL，5.81mmol)和Weinreb胺(567mg，5.81mmol)， 将混合物搅拌过夜。将溶液用DCM(100mL)稀释，用5％柠檬酸(30mL) 和盐水(30mL)洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩，得到无色的油(13)(1.21g， 99％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.22(br s，1H)，3.68(s，3H)，3.41 (m，2H)，3.18(s，3H)，2.63(m，2H)，1.42(s，9H)；MS(ESI+)m/z 133.29 (M+H+-boc).

3-氧代丙基降冰片烯二酸叔丁酯(14)的合成

在-10℃下，向搅拌着的上述Weinreb酰胺(13)(930mg，4.01mmol) 的THF(20mL)溶液加入LiAlH4(2.1mL，2.1mmol，1M乙醚溶液)。原 料完全消耗后(10-20min)，缓慢加入饱和KHSO4的H2O溶液(30mL)。 将混合物用乙醚稀释，搅拌15分钟，用EtOAc萃取(3×50mL)。合 并有机萃取液，用饱和NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥 (MgSO4)，浓缩，得到油(14)(670mg，97％)。1H NMR(400MHz，CDCl3) δ9.80(s，1H)，4.89(br s，1H)，3.41(m，2H)，2.70(m，2H)，1.42(s，9H)； MS(ESI+)m/z 118.31(M+H+-亚异丁基).

(2E，4E)-7-[(叔丁氧羰基)氨基]-2，4-庚二烯酸乙酯(15)的合成

将上述醛(14)(400mg，2.31mmol)、三乙基反式-4-膦酰基-2-丁烯酸 酯(760mg，2.77mmol)、LiOH-H2O(116mg，2.77mmol)与4A分子筛 (1.2g)在THF(20mL)中的混合物在回流下加热1.5小时。通过短C盐 垫过滤分子筛，用EtOAc(100mL)洗涤，浓缩滤液，得到粘性褐色的 油。将油性残余物用5％柠檬酸稀释，用100mL EtOAc萃取两次。合 并萃取液，用NaHCO3、盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，浓缩。经 过快速色谱纯化(EtOAc∶己烷＝1∶5)，得到无色的油(15)(315mg，50％) 所需化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.24(dd，J＝15.2，10.8Hz， 1H)，6.22(dd，J＝15.2，10.8Hz，1H)，6.04(五重峰，J＝7.2Hz，1H)，5.81 (d，J＝15.2Hz，1H)，4.55(br s，1H)，4.19(q，J＝7.0Hz，2H)，3.23(m， 2H)，2.36(m，2H)，1.43(s，9H)，1.29(t，J＝7.0Hz，3H)；MS(ESI+)m/z 170.29(M+H+-boc).

(2E，4E)-7-[(叔丁氧羰基)氨基]-2，4-庚二烯酸(16)的合成

向上述乙基酯(15)(140mg，0.52mmol)的无水EtOH(4mL)溶液加 入LiOH-H2O(0.75mL，1.5mmol，2N水溶液)。将反应在50℃下加热 1h，然后浓缩除去过量EtOH。用5％柠檬酸(20mL)酸化后，产物用 EtOAc萃取(2×50mL)。合并有机萃取液，用盐水(30mL)洗涤，干燥 (MgSO4)，浓缩，得到白色固体(16)(110mg，88％)。1H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.31(dd，J＝15.2，10.8Hz，1H)，6.25(dd，J＝15.2，10.8Hz， 1H)，6.11(五重峰，J＝7.2Hz，1H)，5.81(d，J＝15.2Hz，1H)，4.58(br s， 1H)，3.24(m，2H)，2.37(m，2H)，1.44(s，9H)；MS(ESI-)m/z 240.11 (M-H+).

(2E，4E)-7-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2，4-庚二烯酸(17)的合 成

向上述Boc-化合物(16)(1.50g，6.2mmol)的DCM(10mL)溶液加入 5mL TFA。将混合物在室温下搅拌1h，浓缩得到黄色固体。将上述固 体溶于饱和NaHCO3(50mL)/THF(50mL)。在室温下向其中加入 Fmoc-Osu(2.14g，6.3mmol)。悬浮液在30min内变为澄清。在室温下 搅拌过夜后，浓缩溶液以除去有机溶剂，将所得白色悬浮液用1N HCl(50mL)酸化，用EtOAc萃取(3×100mL)。合并有机萃取液，干燥 (MgSO4)，浓缩，得到白色固体(17)(2.2g，98％)。MS(ES+)m/z 386.19 (M+Na+).

1-(叔丁氧羰基)-4-哌啶羧酸(19)的合成

在室温下，将六氢异烟酸(isonipecotic acid)(18)(2.6g，20mmol)的 1，4-二噁烷/H2O(3∶2，100mL)溶液用NaHCO3(8.4g，100mmol，20mL H2O)处理，继之以t-Boc2O(4.8g，22mmol)处理。搅拌3h后，将溶液 用1N HCl(50mL)酸化，用EtOAc萃取(3×100mL)。合并有机萃取液， 用饱和NaHCO3溶液(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，浓 缩，得到白色固体(19)(4.16g，91％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ4.02 (br s，2H)，2.86(t，J＝12.0Hz，2H)，2.50(tt，J＝11.0，4.0Hz，1H)，1.91 (dd，J＝13.0，2.5Hz，2H)，1.65(m，2H)，1.46(s，9H)，MS(ESI-)m/z 228.65(M-H-).

4-{[甲氧基(甲基)氨基]羰基}-4-哌啶羧酸叔丁酯(20)的合成

在室温下，向搅拌着的t-Boc-六氢异烟酸(19)(2.34g，10.2mmol) 与Weinreb胺(1.5g，15mmol)的DMF(50mL)悬浮液加入三乙胺(2.8mL， 20mmol)。搅拌10min后，加入HOBt(1.62g，12mmol)，继之以EDCI (2.3g，12mmol)。将所得溶液搅拌过夜，浓缩。将残余物溶于1N HCl (100mL)，用EtOAc萃取(3×100mL)。合并有机萃取液，用饱和 NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩，得到无色 的油(20)(2.79g，＞100％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ4.14(m，2H)， 3.71(s，3H)，3.19(s，3H)，2.78(m，3H)，1.68(m，4H)，1.46(s，9H)；MS (ESI+)m/z 217.72(M+H+-亚异丁基).

4-甲酰基-1-哌啶羧酸叔丁酯(21)的合成

在-10℃下，向搅拌着的上述Weinreb酰胺(20)(2.70g，10mmol) 的THF(100mL)溶液加入LiAlH4(460mg，12mmol)。原料完全消耗后 (10-20min)，缓慢加入KHSO4(2.8g)的H2O(100mL)溶液，继之以1N HCl(50mL)。将混合物搅拌15分钟，用EtOAc萃取(3×100mL)。合 并有机萃取液，用饱和NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥 (MgSO4)，浓缩，得到油(21)(2.14g，100％)。1H NMR(500MHz，CDCl3) δ9.66(s，1H)，3.98(br d，J＝11.5Hz，2H)，2.93(m，2H)，2.41(m，1H)， 1.90(m，2H)，1.55(m，2H)，1.46(s，9H)；MS(ESI+)m/z 158.67(M+H+- 亚异丁基).

4-[(1E，3E)-5-乙氧基-5-氧代-1，3-戊二烯基]-1-哌啶羧酸叔丁酯(22) 的合成

将上述醛(21)(2.10g，10mmol)、三乙基反式-4-膦酰基-2-丁烯酸酯 (3.0g，12mmol)、LiOH-H2O(510mg，12mmol)与4A分子筛(5g)在THF (100mL)中的混合物在回流下加热1.5小时。通过短C盐垫过滤分子 筛，用EtOAc(100mL)洗涤，浓缩滤液，得到粘性褐色的油。将油性 残余物用5％柠檬酸稀释，用100mL EtOAc萃取三次。合并萃取液， 用NaHCO3、盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，浓缩。经过快速色谱 纯化(EtOAc∶己烷＝1∶5)，得到所需化合物的白色固体(22)(2.95g， 95％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.24(dd，J＝15.5，10.5Hz，1H)， 6.16(dd，J＝15.5，10.5Hz，1H)，6.04(dd，J＝15.5，7.0Hz，1H)，5.82(d， J＝15.5Hz，1H)，4.20(q，J＝7.0Hz，2H)，4.10(m，2H)，2.75(m，2H)， 2.25(m，1H)，1.71(m，2H)，1.46(s，9H)，1.34(m，2H)，1.29(t，J＝7.0Hz， 3H)；MS(ESI+)m/z 210.75(M+H+-boc).

(2E，4E)-5-[1-(叔丁氧羰基)-4-哌啶基]-2，4-戊二烯酸(23)的合成

向上述乙基酯(22)(2.60g，8.4mmol)的无水EtOH(30mL)溶液加 入LiOH-H2O(720mg，17mmol，10mL水溶液)。将反应加热至50℃达 1h，然后浓缩除去过量EtOH。用5％柠檬酸(50mL)酸化后，产物用 EtOAc萃取(2×100mL)。合并有机萃取液，用盐水(100mL)洗涤，干 燥(MgSO4)，浓缩，得到白色固体(23)(2.32g，98％)。1H NMR(500MHz， CDCl3)δ7.31(dd，J＝15.5，11.0Hz，1H)，6.18(dd，J＝15.5，11.0Hz， 1H)，6.08(dd，J＝15.5，7.0Hz，1H)，5.80(d，J＝15.5Hz，1H)，4.10(m， 2H)，2.75(m，2H)，2.25(m，1H)，1.70(m，2H)，1.44(s，9H)，1.33(m， 2H)；MS(ESI-)m/z 280.74(M-H+).

(2E，4E)-5-(4-哌啶基)-2，4-戊二烯酸(24)的合成

向上述Boc-化合物(23)(2.50g，8.4mmol)的DCM(20mL)溶液加入 10mL TFA。将混合物在室温下搅拌1h，浓缩得到黄色固体(24)。1H NMR(500MHz，CH3OH)δ7.25(dd，J＝15.5，11.0Hz，1H)，6.34(dd，J ＝15.5，11.0Hz，1H)，6.12(dd，J＝15.5，7.0Hz，1H)，5.87(d，J＝15.5Hz， 1H)，3.41(m，2H)，3.04(dd，J＝12.5，2.5Hz，2H)，2.50(m，1H)，2.00(m， 2H)，1.62(m，2H)；MS(ESI-)m/z 182.73(M-H+).

(2E，4E)-5-{1-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-4-哌啶基}-2，4-戊二烯酸 (25)

将上述固体(24)溶于饱和NaHCO3(50mL)/THF(50mL)。在室温 下向其中加入Fmoc-Osu(3.0g，9.0mmol)。悬浮液在30min内变为澄 清。在室温下搅拌过夜后，浓缩溶液以除去有机溶剂，将所得白色悬 液用1N HCl(50mL)酸化，用EtOAc萃取(3×100mL)。合并有机萃取 液，干燥(MgSO4)，浓缩得到白色固体(25)(3.63g，＞100％)。1H NMR (500MHz，CDCl3)δ7.77(d，J＝7.5Hz，2H)，7.58(d，J＝8.0Hz，2H)， 7.40(t，J＝7.5Hz，2H)，7.34(dd，J＝15.0，11.0Hz，1H)，7.32(t，J＝ 7.5Hz，2H)，6.21(dd J＝15.0，11.0Hz，1H)，6.09(dd，J＝15.0，7.0Hz， 1H)，5.85(d，J＝15.5Hz，1H)，4.45(br s，2H)，4.18(m，3H)，2.83(br s， 2H)，2.31(m，1H)，1.72(m，2H)，1.26(m，2H)；MS(ES+)m/z 404.81 (M+H+).

4-(4{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}苯基)丁酸(26)的合成

向4-(4-氨基苯基)丁酸(3.0g，16.7mmol)的30mL饱和NaHCO3悬 液加入Fmoc-Osu和20mL THF。将混合物在室温下搅拌过夜。用1N HCl稀释后，产物用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。合并萃取液，用稀 HCl、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩得到白色固体6.6g(26)(98％)。 1H NMR(500MHz，CH3OD)δ7.80(m，2H)，7.70(m，2H)，7.39(m，3H)， 7.32(m，4H)，7.90(m，2H)，4.46(m，2H)，4.27(t，J＝7.0Hz，1H)，2.60(t， J＝8.0Hz，2H)，2.28(t，J＝7.0Hz，2H)，1.87(m，2H)；MS(ESI+)m/z 424.19(M+Na+).

4-(氨甲基)苄基氨甲酸叔丁酯(27)的合成

将t-Boc2O(1.6g，7.34mmol)的DCM(30mL)溶液历经45分钟滴 加到搅拌着的1，4-双(氨甲基)二甲苯(2.0g，14.7mmol)与TEA(5mL， 36.7mmol)的50mL DCM溶液中。搅拌4h后，将反应用水稀释，用 各为75mL的DCM萃取三次。合并萃取液，用水、5％柠檬酸、盐水 洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩得到白色固体0.73g(27)(42％)。1H NMR (500MHz，CH3OD)δ7.26(m，5H)，4.83(br s，1H)，4.29(m，2H)，3.85(s， 2H)，1.46(s，9H)；MS(AP+)m/z 237.4(M+H+).

4-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苄基)氨基]-4-氧代丁酸(28)

将上述化合物(27)(2.0g，8.5mmol)与琥珀酸酐(0.85g，8.5mmol)在 DCM(50mL)中的混合物在36℃下搅拌若干小时。将产物用5％柠檬 酸稀释，用DCM萃取(3×50mL)。合并萃取液，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，得到2.1g(28)(72％)所需化合物。MS(ESI-)m/z 335.23(M-H+).

4-(1-萘甲基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(30)的合成

在氩气下，将肼基羧酸甲酯(14.3g，159.0mmol)溶于THF (500mL)。加入1，1-羰基二咪唑(25.8g，159.0mmol)，将混合物在室温 下搅拌15min。加入1-氨甲基萘(25.0g，159.0mmol)，将混合物搅拌过 夜。将反应蒸发至干。加入DCM(200mL)，将溶液在-20℃下冷却2h， 向其中加入100mL Et2O。过滤收集产物，用Et2O洗涤(2×150mL)， 干燥，得到30.2g(69％)产物，为灰白色固体。将粗产物与K2CO3(30.5g， 220.6mmol)的400mL MeOH溶液在回流下加热6h，然后浓缩至干。 将残余物重新溶于水(250mL)，用300mL乙酸乙酯洗涤。水层用浓 HCl酸化(pH＝1-2)，这引起产物沉淀出来。过滤后，将产物用水洗涤 (2×200mL)，真空干燥过夜，得到17.1g(64％)灰白色固体(30)。1H NMR(500MHz，DMSO-d3)δ10.27(s，2H)，8.27(d，J＝8.5Hz，1H)， 7.95(d，J＝8.5Hz，1H)，7.86(d，J＝8.5Hz，1H)，7.55(m，2H)，7.46(t，J ＝(d，J＝8.0Hz，1H)，7.32(d，J＝7.0Hz，1H)，5.00(s，2H)；MS(ESI+) m/z 242.22(M+H+).

实施例4

代表性化合物的合成

N-[4-(氨甲基)苄基]-8-[1-(4-{[(4-氨基苯基)乙酰基]氨基}丁酰 基)-4-哌啶基]-2-(1-萘甲基)-1，3-二氧代-2，3，5，8-四氢-1H-[1，2，4]三唑并 [1，2-a]哒嗪-5-酰胺(31)的合成

在BOP(3equiv)、HOBT(3equiv)的存在下，在N，N-二甲基甲酰 胺(DMF，8mL)中，在室温下，使树脂键合性1，4-双(氨甲基)苯(500mg， 0.35mmol，0.69mmol/g负载率)与Fmoc-哌啶二烯酸(3.0equiv)偶联4h， 得到对应的聚合物键合性Fmoc-二烯。Kaiser试验为阴性。用25％哌 啶/DMF进行Fmoc的去保护(阳性氯醌试验)，继之以采用上述条件 和试剂等价物与Fmoc-4-氨基丁酸(3equiv)偶联，得到中间体Fmoc- 丁酸二烯酰胺。最后除去Fmoc，随后利用上述条件和试剂等价物与 2-[4-[(叔丁氧羰基)氨基]苯基]乙酸(3equiv)偶联，完成链长，进入倒数 第二的Diels-Alder反应步骤阶段。在[双(三氟乙酰氧基)碘]苯(3equiv) 的存在下，在室温下，使这种延长了的二烯基单元与4-(1-萘甲 基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(3equiv)接触3h，有效地得到树脂-键合性化 合物抑制剂。用95％TFA/H2O处理90分钟，使所需产物连同t-Boc 保护基团从树脂上裂解下来。收集上清液，与洗液合并(2×1mL 95％ aq TFA)。将蒸发溶液后所得残余物重新溶于TFA(250μL)，用Et2O研制。离心(3000rpm)后，收集固体产物，干燥，直接用于下一步。 MS(ESI+)m/z 757.50(M+H+).

N-{4-[(乙酰氧基氨基)甲基]苄基}-8-{1-[4-({[4-(乙酰氨基)苯基]乙 酰基}氨基)丁酰基]-4-哌啶基}-2-(1-萘甲基)-1，3-二氧代-2，3，5，8-四氢 -1H-[1，2，4]三唑并[1，2-a]哒嗪-5-酰胺(32)的合成

将粗加合物(31)用饱和NaHCO3溶液(5mL)处理，在室温下搅拌 20分钟。将混合物浓缩至干，生成白色粉末。将固体重新悬浮在无水 甲醇(10mL)中，在3000rpm下离心，过滤，浓缩。将所得油性残余物 与过量乙酸酐在DCM中搅拌12h，浓缩。经过HPLC纯化，以定量 收率得到所需双-乙酰化化合物(32)，异构比为1∶1。MS(ESI+)m/z 841.20(M+H+).

N-[4-(氨甲基)苄基]-8-[1-(4-{[4-氨基苯基)乙酰基]氨基}丁酰基)-4- 哌啶基]-2-(1-萘甲基)-1，3-二氧代六氢-1H-[1，2，4]三唑并[1，2-a]哒嗪-5- 酰胺(33)的合成

将31(150mg)的MeOH(5mL)溶液用10％Pd/C催化氢化2h。过 滤除去催化剂后，蒸发溶剂，所需产物经过HPLC纯化(33)。MS(ESI+) m/z 759.70(M+H+).

N-[4-(氨甲基)苄基]-8-[1-(4-{[4-氨基苯基)乙酰基]氨基}丁酰基)-4- 哌啶基]-2-(1-萘甲基)-1，3-二氧代-2，3，7，8-四氢-1H-[1，2，4]三唑并[1，2-a] 哒嗪-5-酰胺(34)的合成

在BOP(3equiv)、HOBT(3equiv)的存在下，在N，N-二甲基甲酰 胺(DMF，8mL)中，在室温下，使树脂键合性1，4-双(氨甲基)苯(200mg， 0.14mmol，0.69mmol/g负载率)与Fmoc-哌啶二烯酸(3.0equiv)偶联4h， 得到对应的聚合物键合性Fmoc-二烯。Kaiser试验为阴性。用25％哌 啶/DMF进行Fmoc的去保护(阳性氯醌试验)，继之以采用上述条件 和试剂等价物与Fmoc-4-氨基丁酸(3equiv)偶联，得到中间体Fmoc- 丁酸二烯酰胺。最后除去Fmoc，随后利用上述条件和试剂等价物与 2-[4-[(叔丁氧羰基)氨基]苯基]乙酸(3equiv)偶联，完成链长，进入 Diels-Alder反应步骤阶段。在[双(三氟乙酰氧基)碘]苯(3equiv)的存在 下，在室温下，使这种延长了的二烯基单元与4-(1-萘甲基)-1，2，4-三唑 烷-3，5-二酮(3equiv)接触3h，有效地得到树脂-键合性二环化合物。在 Diels-Alder反应之后，在室温下将树脂-键合性β-链模拟物用DBU (3equiv)的DCM溶液处理2h。用95％TFA/H2O处理90分钟，使所 需产物连同t-Boc保护基团从树脂上裂解下来。收集上清液，与洗液 合并(2×1mL 95％aq TFA)。将蒸发溶液后所得残余物重新溶于TFA (250μL)，用Et2O研制。离心(3000rpm)后，收集固体产物，干燥(34)。 MS(ESI+)m/z 757.50(M+H+)，tR 12.78(B)min.

实施例5

表3

代表性化合物

实施例6

表4

代表性化合物

实施例7

代表性化合物的类胰蛋白酶拮抗作用测定

类胰蛋白酶抑制作用测定法是在室温下、在96孔微量平板中、利 用Bio-Rad Model 3550(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Cambridge， MA)、SpectroMax(Molecular Devices，Model 250，Sunnyvale，CA)或 Fluoroskan Ascent fluorescence(Labsystems，Inc.，Helsinki，Finland) 平板读数器进行的。1mM供试化合物的水溶液或10mM供试化合物 的DMSO溶液充当每次抑制作用测定的储备溶液。就这种测定法而 言，在405nm下监测从产色底物S-2366，L-pyroGlu-Pro-Arg-pNA(Km ＝242μM)(diaPharma，West Chester，OH)释放的pNA。读取平板，通 常间隔24秒80次，记录反应进程曲线。测定的一般格式如下：将100μL 抑制剂溶液和50μL酶溶液置于微量平板小孔中，在室温下培育 30min，然后加入100μL底物溶液，引发反应。在类胰蛋白酶测定中， 使用0.2nM人肺类胰蛋白酶(Elastin Products Company，Inc.， Owensville，MO)和200μM S-2366的Tris缓冲溶液，pH 8.0。在GraFit (Erithacus Software Ltd.，London，UK)或GraphPad Prism (GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)中，借助对一级反应的未加 权非线性最小平方拟合来测定最初的速率。然后利用GraFit或 GraphPad Prism，将所测定的最初速度对供试化合物浓度进行非线性 最小平方拟合，得到Ki。

优选地，本发明化合物在此测定法中的抑制值在400ηM下大于 70％，和/或Ki小于300nM。为此，优选的本发明化合物是化合物1、 3、6、13、14、16、20、22、27、39-42、44、52、57、58、60、61、 64、79、82、87、123、127、132和134。因此，本发明化合物有效地 抑制类胰蛋白酶，在炎性相关疾病的治疗中是有效的。

由此可见，尽管出于例证的目的已经描述了发明的具体实施方式， 不过可以进行各种修改而不偏离发明的精神和范围。因此，本发明仅 受所附权利要求书所限。