基因检测用载体,及检测干扰素疗法有效性的应用

本发明是关于基因检测用载体、对个体检测干扰素疗法有效性的方法、检 测干扰素疗法对个体有效性的基因检测用装置、及检测干扰素疗法有效性的基 因检测用试剂盒。

近年来，丙型肝炎病毒(以下称HCV)的感染者急剧增加，已成为极大的 社会问题。

和其他病毒性疾病一样，虽然早已明确干扰素疗法对丙型肝炎有一定的效 果，但是，干扰素疗法并不是对所有的感染者都有效，仍有不少感染者对干扰 素疗法没有显示出效果对干扰素疗法不显示效果的感染者，仍继续采用干扰 素疗法，这不仅使感染者引起发烧和贫血等副作用，而且也延误了其他方法的 治疗。

因此，迫切希望对实施治疗的所有HCV感染者，在治疗前预测干扰素疗法 是否有效，但是到目前为止，进行这种预测完全是不可能的。

本发明的目的就是提供在治疗前预测干扰素疗法对患者是否有效的方法。

上述目的通过下述的本发明即可达到。

根据本发明的第一个侧面，提供一种基因检测用载体，其特征是具有基体 和在该基体上固定化而形成的多核苷酸，上述多核苷酸包括从以下组中选取的 多核苷酸，即

(at)下述序列表中序列1所示的多核苷酸、

(bt)对上述(at)所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进行 缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(ct)含有序列1的441～455位所示的序列的多核苷酸、

(dt)含有序列1的449～459位所示的序列的多核苷酸、

(et)上述的互补链。

根据本发明的第二个侧面，提供一种基因检测用载体，其特征是具有基体 和在该基体上固定化而形成的多核苷酸。上述多核苷酸包括从以下组中选取的 多核苷酸，即，

(ag)下述序列表中序列2所示的多核苷酸、

(bg)对上述(ag)所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进行 缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(cg)含有序列2的441～455位所示的序列的多核苷酸、

(dg)含有序列2的449～459位所示的序列的多核苷酸、

(eg)上述的互补链。

根据本发明的第三个侧面，提供一种基因检测用载体，特征是具有基体和 固定在该基体上而形成的多核苷酸。该多核苷酸包括从以下组选取的多核苷 酸，即

(aa)下述序列表中序列3表示的多核苷酸、

(ba)对上述(aa)中所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进 行缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(ca)含有序列3的441～455位所示的序列的多核苷酸、

(da)含有序列3的449～459位所示的序列的多核苷酸、

(ea)上述的互补链。

根据本发明的第四个侧面，提供一种基因检测用载体，特征是具有基体和 固定在该基体上而构成的多核苷酸、该多核苷酸包括从以下组中选取的多核苷 酸，即

(ac)下述序列表中序列4表示的多核苷酸、

(bc)对上述(ac)中表示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进 行缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(cc)含有序列4的441～455位所示的序列的多核苷酸、

(dc)含有序列4的449～459位所示的序列的多核苷酸、

(ec)其他的互补链。

根据本发明的第五个侧面，提供一种使用了上述基因检测用载体的DNA芯 片。

根据本发明的第六个侧面，提供一种检测干扰素疗法对个体有效性的方 法，包括以下步骤：

1)将从上述个体采取的试样多核苷酸，与上述基因检测用载体接触的步 骤，

2)检测上述试样多核苷酸和固定在基因检测用载体上的多核苷酸的杂交 反应，确定上述试样中多核苷酸的碱基序列的步骤。

根据本发明的第七个侧面，提供一种检测干扰素疗法对个体有效性的方 法，包括如下步骤：

1)将从个体采取的试样多核苷酸与被固定在基体上而构成的基因检测用 载体的探针多核苷酸相接触的步骤，

2)检测固定在基体上的试样多核苷酸和上述多核苷酸的杂交反应，确定 上述试样多核苷酸的碱基序列的步骤。

上述探针多核苷酸包括从以下组中选取的多核苷酸，即，

(at)下述序列表中序列1中所示的多核苷酸、

(bt)对上述(at)中所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进 行缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(ct)含有序列1中441～455位所示序列的多核苷酸、

(dt)含有序列1中449～459位所示序列的多核苷酸、

(et)上述的互补链。

(ag)下述序列表中序列2中表示的多核苷酸、

(bg)对上述(ag)中所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进 行缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(cg)含有序列2中441～455位所示序列的多核苷酸、

(dg)含有序列2中449～459位所示序列的多核苷酸、

(eg)上述的互补链。

(aa)下述序列表中序列3所示的多核苷酸、

(ba)对上述(aa)中所示的多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸 进行缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(ca)含有序列3的441～455位所示的序列的多核苷酸、

(da)含有序列3的449～459位所示的序列的多核苷酸、

(ea)上述的互补链。

(ac)下述序列表中序列4中所示的多核苷酸、

(bc)对上述(ac)中所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进 行缺失、置换或附加修饰的多核苷酸、

(cc)含有序列4中441～455位所示的序列的多核苷酸、

(dc)含有序列4中449～459位所示的序列的多核苷酸、

(ec)上述的互补链。

根据本发明的第八个侧面，提供一种检测干扰素疗法有效性的基因检测用 装置，该装置至少具有以下部分，即，

上述基因检测用载体、

使固定在上述基体上的多核苷酸和含有带有标记的多核苷酸试样接触，将 固定在上述基体上的多核苷酸和上述带有标记的多核苷酸置于杂交反应条件下 的反应部分，和

检测上述带有标记的多核苷酸所带有的标记的标记检测装置。

根据本发明的第九个侧面，提供一种检测干扰素疗法有效性的基因检测用 装置，该装置包括以下部分，即，

上述基因检测用载体、

对电极

在上述基因检测用载体和上述相对电极之间施加电压的电压施加部分、

使固定在上述基因检测用载体上的上述多核苷酸和含有多核苷酸的试样接 触，将固定在上述基体上的多核苷酸和上述试样中的多核苷酸，置于杂交反应 条件下的部分、和

在上述杂交反应后，利用上述电压施加装置施加电压时，测定基因检测用 载体和上述对电极间产生电信号的测定部分。

根据本发明的第十个侧面，提供一种测定干扰素疗法有效性的试剂盒，其 特征是具有上述基因检测用载体、和缓冲液。

根据本发明的第十一个侧面，提供一种测定干扰素疗法对个体有效性的试 剂盒，其特征是具有上述基因检测用载体、双链识别体和缓冲液。

图1是本发明实施例涉及的基因检测用装置的一例示意图。

图2是本发明实施例涉及的自动化的本发明电子检测用装置的一例示意图。

图3是MxA基因启动子区域的碱基序列示意图。

图4是关于实施例中使用HhaI的RFLP电泳结果的示意图。

图5是对具有4种SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA启动子，分别以 该启动子支配下的萤光素酶活性作为指标，比较对Hela细胞内的干扰素α应 答性结果的示意曲线图。

图6是对具有4种SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA启动子，分别以 该启动子支配下的萤光素酶活性作为指标，比较对卵巢癌细胞内的干扰素α应 答性结果的示意曲线图。

图7是对具有4种SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA启动子，分别以 该启动子支配下的萤光素酶活性作为指标，比较对Hela细胞内的干扰素β应 答性结果的示意曲线图。

图8是对具有4种SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA启动子，分别以 该启动子支配下的萤光素酶活性作为指标，比较对卵巢癌细胞内的干扰素β应 答性结果的示意曲线图。

图9是本发明一实施例中形成的基因检测用载体的示意图。

图10是本发明另一实施例中形成的基因检测用载体的示意图。

图11是本发明又一实施例中形成的基因检测用载体的示意图。

以下详细说明本发明。

序列1、序列2、序列3、和序列4的多核苷酸是包含人MxA基因启动子 区域的多核苷酸，本发明者们首先发现存在于这些多核苷酸的455位的单碱基 多型(Single nucleotide polymorphism)(以下称SNP)与干扰素疗法效果的 应答性有关。

在各个多核苷酸的441～456位上存在着干扰素应答序列(interferon- stimulated response element)(以下称ISRE)。

序列1的441～456位的ISRE碱基序列「GGTTTCGTTTCTGCTC」(序列5)， ISRE的15位(相当于序列1的455位，序列1中的455位，根据将转录起始 位点取为+1的通常的表示方法，相当于-88位)是胸腺嘧啶。

序列2中的441～456位的ISRE碱基序列是「GGTTTCGTTTCTGCGC」(序列 6)、ISRE的15位(相当于序列2的455位。序列2中的455位，根据将转录 起始位点取为+1的通常的表示方法，相当于-88位)是鸟嘌呤。

序列3的441～456位的ISRE碱基序列是「GGTTTCGTTTCTGCAC」(序列7)、 ISRE的15位(相当于序列3中455位。序列3中的455位，根据将转录起始 位点取为+1的通常的表示方法，相当于-88位)是腺嘌呤。

序列4中的441～456位的ISRE碱基序列是「GGTTTCGTTTCTGCCC」(序列8)、 ISRE的15位(相当于序列4中455位。序列4中455位，根据将转录起始位点 取为+1的通常的表示方法，相当于-88位)是胞嘧啶。

以下在本说明书中，将序列1、序列2、序列3和序列4中455位都称作 SNP位点(SNP Site)。

这些ISRE的SNP位点以外的区域，各序列都是一样的。这些ISRE中具有 15位的核苷酸为胸腺嘧啶的ISRE(序列5)的HCV感染者，对于干扰素疗法是 有效的，不具有15位的核苷酸为胸腺嘧啶的ISRE(序列5)的HCV感染者， 对干扰素疗法是无效的，本发明者们从流行病学的角度已得到证实。

即，如实施例中详述的那样，已经证实，具有455位的核苷酸为鸟嘌呤纯合 的序列1的多核苷酸(以下记作G/G同型)的HCV感染者，与具有杂合455位 的核苷酸为胸腺嘧啶的序列1的多核苷酸，和455位的核苷酸为鸟嘌呤的序列1 的启动子区域(以下记作G/T异型)的HCV感染者，或者是具有纯合序列1中 多核苷酸(以下记作T/T同型)的HCV感染者相比较，对干扰素疗法是无效的。

或者，具有纯合455位的核苷酸不为胸腺嘧啶的MxA基因启动子区域的HCV 感染者(以下记作非-T/非-T同型)，与T/非-T异型或T/T同型的HCV感染者 比较，显示出对干扰素疗法无效。作为非-T/非-T同型的组合，有G/G、G/A、 G/C、A/A、A/C、C/C。作为T/非-T组合，有T/G、T/A、T/C。

因此，在实施干扰素疗法之前，通过确定在包含附如HCV感染者所具有的 人MxA基因启动子区域的多核苷酸ISRE中SNP位点的核苷酸，可以检测知道 干扰素对该HCV感染者的有效性。

本发明的基因检测用载体等，将从被检者提取多核苷酸的核酸链序列的检 测探针，可使用包括上述SNP位点的该SNP位点的碱基序列为胸腺嘧啶的序列 1中的多核苷酸、其片段或它们的互补链。

使用本发明的这种基因检测用载体等，在治疗前可以研究包含被检者具有 的人MxA基因启动子区域的多核苷酸中上述SNP位点是否是胸腺嘧啶。根据这 种研究，可以预测干扰素疗法对上述被检者的有效性。

本发明的基因检测用载体等，作为检测从被检者提取的多核苷酸的核酸链 序列的检测探针，可使用含有上述SNP位点、SNP位点的碱基序列为g的序列 2的多核苷酸、其片段或它们的互补链、或者该SNP位点的碱基序列为a的序 列3的多核苷酸、其片段或它们的互补链、或者该SNP位点的碱基序列为c的 序列4的多核苷酸、其片段或它们的互补链。

使用本发明的这种基因检测用载体等，可研究包含被检者具有的人MxA基 因启动子区域的多核苷酸中上述SNP位点的序列，通过这种研究，可以预测干 扰素疗法对上述被检者的有效性。

对于实施干扰素疗法的所有疾病，除了丙型肝炎外，还有胶质母细胞瘤、 髓母细胞瘤、星细胞瘤、皮肤恶性黑色素瘤、乙型肝炎、肾癌、多发性骨髓瘤、 毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、亚急性硬化性全脑炎、病毒性脑炎、免疫 抑制患者的全身性带状疱疹及水痘、上咽头未分化癌、伴有听力低下的病毒性 内耳感染症、疱疹性角膜炎、扁平湿疣、尖锐湿疣、由腺病毒和疱疹病毒感染 引发的结膜炎、生殖器疱疹、口唇疱疹、子宫颈癌、癌性胸水症、角化棘皮瘤、 基底细胞癌、δ型慢性活动性肝炎等。作为上述干扰素疗法中使用的干扰素有 干扰素α、β或ω等。

对患有这些疾病的被检者实施干扰素疗法之前，可使用本发明的基因检测 用载体等检测干扰素疗法的有效性。

以下对本发明的各个侧面进行更详细的说明。

第一，本发明提供基因检测用载体，可用于在实施干扰素疗法之前，对患 有干扰素疗法有效疾病的患者，检测干扰素疗法的有效性。

<基因检测用载体的概述>

本发明的基因检测用载体，可将上述规定的多核苷酸固定在基板、多孔质 物体、微滴度板、玻璃珠等基体上，即可制成。

用于固定多核苷酸基体的材质、大小、形状等没有特殊限制，可以使用任 何能固定多核苷酸的基体。

作为基体的材质，例如可使用硅、玻璃、石英玻璃、氧化铝、兰宝石、镁 橄榄石、碳化硅、氧化硅、氮化硅、磁性体等无机材料；聚乙烯、聚丙烯、聚 异丁烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏氯 乙烯、聚酯酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯 乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树脂、密胺 树脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯聚合物、硅氧烷树脂、聚 苯醚、聚砜、硝基纤维素、尼龙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯砜、聚醚砜、聚醚 酮、氟乙烯共聚物、聚甲基戊烯等有机材料。也可以使用上述无机材料和有机 材料的复合体。

在基体上固定多核苷酸的方法，例如可使用Science 251：767-773(1991) 中公开的方法。除了该方法外，还知道有将多核苷酸固定在基体上的改进方法， 使用这些改进方法也可以固定多核苷酸。

使用由有机材料或玻璃形成的基体时，在基体表面上覆盖一层聚赖氨酸和 氨基硅烷的面，可稳定地固定多核苷酸。

本说明书中，所谓「多核苷酸」是指2个以上核苷通过磷酸酯连接形成的 物质。「核苷」包括脱氧核糖核苷和核糖核苷，但不限于这些。

进而，本发明的在基体上固定的多核苷酸，可使用RNA、DNA、PNA、甲基 磷酸酯核酸、S-Oligo的寡核苷酸，和cNDA、cRNA等多核苷酸等。

本说明书中，所谓「启动子区域」，不仅仅指与TATA盒等转录起始反应直 接有关的区域，而且也指存在于该区域附近或远处，对转录起始反应的效率施 加影响的包括调节序列的序列。因此，对于「启动子区域」术语，不仅注意与 转录起始反应有关的序列、调节序列，与必须注意包含两者连接的序列。

所谓「ISRE」是指因干扰素α、β或γ刺激诱导的在基因的转录调节区 域内存在的约12～15个核苷酸形成的碱基序列。

作为固定在基体上的多核苷酸，可举出以下(a)～(e)的。

(a)序列1，2，3，4中任何一个表示的多核苷酸、

(b)对上述(a)中所示多核苷酸中除455位外的1个或数个核苷酸进行 缺失、置换、或附加修饰的多核苷酸。

作为缺失的实例，有128位、133位、152位、508位、和543位的缺失， 作为置换的实例，有330位的置换(G→T)、542位的置换(G→G)，作为附加 的实例，有向501位的附加(C)。

在上述序列1，2，3，4的多核苷酸或上述多核苷酸的片段上，可使用连 接至少1个从以下基因中选出的功能性多核苷酸而形成的修饰的多核苷酸，即， 含有启动子、增强子、上游活化序列、沉默基因、上游抑制序列、衰减子、Poly A尾、核转移信号、Kozak序列、ISRE、耐药性因子、信号肽的基因、跨膜区 域的基因、包括萤光素、绿色萤光蛋白、藻菁苷、辣根过氧化酶在内的标记蛋 白质的基因、干扰素应答性蛋白质的基因、非干扰素应答性蛋白质的基因。

序列1，2，3，4所示上述多核苷酸的碱基序列中，与干扰素疗法有效性有 关的是位于455位的SNP位点中的1个核苷酸，所以要固定在基体上的多核苷酸 也可以是含有上述455位的SNP位点的多核苷酸片段。

使用上述片段作为固定在基体上的多核苷酸时，最好是11～30个核苷酸。 固定在基体上的多核苷酸长度过长时，难以识别出1个核苷酸的不同。另一方 面，固定在基体上的多核苷酸的长度过短时，难以确定试样中所含多核苷酸的 减基序列。

作为固定在基体上适宜的多核苷酸，是以下片段。

(c)是含有上述455位中SNP位点的序列1、序列2、序列3、序列4的 多核苷酸片段，包含有以相当于序列1、序列2、序列3、序列4中441～456 位的序列5、序列6、序列7、序列8所表示序列的多核苷酸(即上述ISRE) 片段。

(d)是含有上述455位中SNP位点的序列1、序列2、序列3、序列4的 多核苷酸片段，含有相当于序列1至序列4中449～459位的序列9、10、11、 12的多核苷酸片段。特别是(d)，由于含有大致以上述SNP为中心而前后同等 长度的碱基序列，所以可以进行高精度的碱基序列确定。为了进行更高精度的 检测，最好是含有相当于序列1至序列4中447～461位的核苷酸片段。

进而，作为固定在基体上适宜的多核苷酸，也可以是(e)在上述(a)～ (d)表示的多核苷酸的互补链。

上述序列5、序列6、序列7、序列8表示序列(即上述ISRE)的互补链 是序列13、14、15、16表示的序列。

上述序列9、序列10、序列11、序列12表示的序列的互补链、分别是以 序列17、序列18、序列19、序列20表示的序列。

本发明的基因检测用载体是将固定在基体上的上述规定多核苷酸作为探 针，检测该探针与从被检者提取的多核苷酸的杂交反应，确定被检者的包含人 MxA基因启动子区域的多核苷酸序列，调查在上述SNP位点上有什么而使用的。

<基因检测用载体的使用方法>

以下对使用上述基因检测用载体具体确定从被检者提取多核苷酸序列的方 法进行说明。

使用上述基因检测用载体确定从被检者提取多核苷酸序列的方法有(1) 使用标记物质的方法、(2)电化学的方法2种。

首先，对(1)使用标记物质的方法进行具体说明。

首先从包括人在内的哺乳动物等被检者，采取含有多核苷酸的试样(血液 等体液、血细胞成分、生物检测组织、培养细胞等)。由于多核苷酸广泛存在 于体内，所以可以是从个体采取的任意试样，优选的试样是血液。

接着，根据需要，进行酚提取和乙醇沉淀等分离提取操作、PCR等扩增操 作后，提取上述试样中所含试样多核苷酸。作为提取多核苷酸的方法，例如除 了酚提取，乙醇沉淀外，可使用任意的提取方法。提取mRNA时，也可用寡dT 柱。当试样多核苷酸的量很少时，可根据需要也可进行对试样多核苷酸扩增的 操作。

随后，向试样多核苷酸附加标记物质，进行获得标记多核苷酸的标记操作。 也可以在没有附加标记的试样多核苷酸内，混合含有附加标记物质的多核苷酸 的2次探针。

作为标记物质，可以是萤光物质等发光物质、半抗原、氧、放射性同位素、电 极活性物质等可检测的物质，对此没有特殊限定。对试样多核苷酸的标记最好是对 启动子区域进行标记。对启动子区域进行标记，可使用各种公知的手法，根据使用 标记的引物的PCR反应，可同时进行扩增操作和标记操作，这是非常有用的。

接着，将试样多核苷酸和基体上的多核苷酸置于杂交反应的条件下。即，首 先，将进行了上述标记的试样多核苷酸添加到杂交用的反应溶液中后，使该反应 溶液和本发明的基因检测用载体接触。在试样多核苷酸上存在基体上的核苷酸互 补链的活，该试样多核苷酸和基体上的多核苷酸进行杂交反应，而固定在基体上。

杂交反应条件，反应温度为10～90℃，反应时间为1分钟到过夜。反应 中也可以用搅拌或振动等操作以便提高反应速度。杂交用的反应溶液是离子强 度为0.01～5，pH5～10的缓冲液。反应溶液中也可添加作为杂交促进剂的硫 酸葡聚糖、和鲑精DNA、牛胸DNA、EDTA、表面活性剂等。

随后进行适当洗。

接着，为了确定被检者的上述SNP位点上有什么，可检测试样多核苷酸和 基体上的多核苷酸之间有无杂交反应。

在基体上固定的含有上述(a)～(e)任何一种的多核苷酸中，若检测出 上述SNP位点为胸腺嘧啶的多核苷酸或其互补链与试样多核苷酸进行杂交，则 包含受检者的人MxA基因启动子区域的多核苷酸的SNP位点是胸腺嘧啶。另一 方面，若测出上述SNP位点为鸟嘌呤的多核苷酸或其互补链与试样多核苷酸进 行杂交，则包含受检者的人MxA基因启动子区域的多核苷酸的SNP位点是鸟嘌 呤。同样也可为腺嘌呤、胞嘧啶。

这种检测，根据标记的种类使用适当的检测装置，通过检测试样中的标记 多核苷酸或2次探针中的标记进行。在标记物为萤光物质时，例如，可以使用 荧光检测器检测标记。作为基因检测用载体，在一个基体上可同时固定上述 (a)～(e)中任何一个多核苷酸中上述SNP位点是胸腺嘧啶或其互补链的、 是鸟嘌呤或其互补链的、是腺嘌呤或其互补链的、是胞嘧啶或其互补链的组中 的至少1种，这时，多核苷酸的种类与基体上的各多核苷酸的位置以及标记的 种类的至少一项必须特定。振据被检测标记的位置以及标记的种类至少一项， 就可以知道试样中的多核苷酸和基体上的什么多核苷酸进行了杂交。

使用(1)的标记物质的方法中，即使使用将从被检者采取的试样多核苷 酸固定在基体上的基因检测用载体，也可确定试样多核苷酸的序列。即，预先 附加不同标记的序列是从已知的(a)～(e)中选取的多核苷酸，与上述SNP 的碱基种类不同的多核苷酸溶液接触，将溶液中的多核苷酸和电极上的试样多 核苷酸置于杂交反应的条件下。若溶液中存在基体上试样多核苷酸的互补链， 该试样多核苷酸和基体上的多核苷酸进行杂交反应，而固定在基体上。随后通 过检测标记物质的种类，即可检测和哪一种序列的多核苷酸发生了杂交反应， 也就能够知道试样多核苷酸的序列。

使用以上方法，试样多核苷酸和上述SNP位点具有胸腺嘧啶的多核苷酸或 其互补链进行杂交时，受验者在上述SNP位点具有胸腺嘧啶，故可预测此受检 者干扰素疗法是有效的。与其相反，试样中的多核苷酸和上述SNP位点具有鸟 嘌呤的多核苷酸或其互补链进行杂交，而且和上述SNP位点具有胸腺嘧啶的多 核苷酸或其互补链不进行杂交时，在上述SNP位点不具有胸腺嘧啶，故此，可 预测受检者对干扰素疗法无效。

以下关于(2)的电化学方法进行具体说明。

在上述使用(1)的标记物质的方法中，通过检测标记物质，进行检测试 样多核苷酸和基体上的多核苷酸有无杂交反应，而在(2)的电化学方法中， 电化学地检测有无杂交反应。

在电化学的方法中，作为基因检测用载体，使用固定多核苷酸的电极。固定 多核苷酸的电极(以下称本发明的电极)是在由导电物质形成的基体上，固定 上述(a)～(e)中任何一种多核苷酸而形成的。

固定多核苷酸的最好导电性物质虽然是金，但也可使用其他材料。例如可 以使用金的合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓、钨等金属单质及其合金， 或者石墨、精碳(グラシ一カ一ボン)等碳，或者它们的氧化物、化合物。也 可将这些导电性物质，利用电镀、印刷、溅射、蒸镀等方法形成在其他基板上。

在由导电性物质形成的基体上固定多核苷酸的方法，没有特殊限定。例如， 利用导入了巯基的多核苷酸和金结合，简单进行。除此之外，也可以用物理吸 附、化学吸附、疏水结合、嵌埋、共价键等进行固定。也可使用生物素-抗生 物蛋白结合和碳化二亚胺等缩合剂。这些情况，首先用具有官能团的分子修饰 导电性物质的表面，可很容易进行固定。为了抑制多核苷酸在基体表面的非特 异吸附，最好用巯基乙醇等硫醇、和硬脂胺等脂质涂敷基体表面。

以下以一个实例讲述在金基体上固定多核苷酸的方法。首先，用去离子水 洗金基体后，进行活化处理，活化中使用0.1～10mmol/L的硫酸溶液。在该溶 液中，在-0.5～2V(相对于Ag/AgCl)的范围内、在1v/s～100000v/s范围内 扫描电位。由此，直到金基体表面被活化到能固定多核苷酸的状态为止。

在要固定化的多核苷酸中5’或3’末端上导入巯基。巯基化的多核苷酸， 溶解在DTT等还原剂的溶液中直到固定化之前，在使用前，以凝胶过滤或醋酸 乙酯的提取操作除去DTT。固定化是将探针溶解在离子强度0.01～5，pH5～10 的缓冲液中，形成1ng/ml～1mg/ml，浸渍活化即后的基体。固定化反应，在4～ 100℃范围内进行10分钟到过夜。固定多核苷酸后的基体，最好在无核酸分解 酶(核酸酶)的条件下保存，可能的话进行遮光保存。

在基体上固定多核苷酸时，使用叫作DNA点样器(スポツタ一)和DNA阵 列的固定化装置，能比较容易地固定多核苷酸。这时为了不损伤基体的表面， 最好使用喷墨方式或静电方式的点样器。也可以在基体表面上直接进行多核苷 酸的合成。

本发明的电极结构，最好是将导电体和与该导电体电连接的本发明电极配 置在基板上构成所谓DNA芯片。DNA芯片的制作，是在基板上，最好在绝缘性 基板上配设用绝缘材料适当涂覆的金属线等导电体后，再将上述固定了规定多 核苷酸的上述电极与上述导电体可通电地连接。

具有不同序列的多核苷酸必须分别固定在相互绝缘的多个不同的电极上， 将多个电极设置在基板上时，要设置在基板上的电极数从实用性上说为101～105 个。

在基板上设置多个本发明的电极时，再设置扫描线，也可在上述导电体和 扫描线的各交点上配置开关元件。利用它依次在各电极上施加电压，并能迅速 确定每个电极是否发生杂交反应。

在用本发明的电极检测有无杂交反应中，和其他一般电化学检测法相同， 除了本发明的电极外，至少配置对电极，根据需要适当配置参比电极。配置参 比电极时，例如可使用银/氯化银电极、汞/氯化汞电极等一般的参比电极。 这些电极最好和本发明的电极配置在同一个基板上。

使用本发明的电极，确定从被检者采取的多核苷酸的序列，进行以下操作。

首先，从包括人在内的哺乳动物等被检者采取含核酸的试样，根据需要进 行上述的提取操作、扩增操作、根据需要附加标记。这些操作和(1)的方法 相同，但不一定必须附加标记。

接着，使含有上述试样的溶液和本发明的电极接触，将试样多核苷酸和电 极上的多核苷酸置于杂交反应的条件下。若试样多核苷酸中存在基体上多核苷 酸的互补链，该试样多核苷酸和基体上的多核苷酸进行杂交反应，固定在基体 上。该操作，及条件和(1)的方法相同，随后，洗本发明的电极。

然后，通过在本发明的电极附近添加导电性的双链识别体溶液，在由电极 上固定的多核苷酸和试样多核苷酸进行杂交形成的双链的多核苷酸上嵌入着双 链的识别体。检测试样多核苷酸和基体上的多核苷酸之间有无杂交反应，可按 如下进行，即，向电极施加电压时，检测由在电极上的双链的多核苷酸中嵌入 的双链的识别体产生的电信号。

此处使用的双链的识别体没有特殊限定，例如，可使用ヘキスト33258、 吖啶橙、米帕林、多脑河霉菌素、金属嵌入(メタロインタ一カレ一タ一)、 双吖啶等双嵌入、三嵌入、多嵌入等。可以使用称作金属嵌入的钌、钴、铁等 的金属配合物、和溴乙锭等有机化合物。除了这些之外，还可使用ヘキスト33258 和花菁色素等的基团合剂、抗体、酶等生物高分子。

双链识别体浓度随其种类而不同，一般来说范围为1ng/ml～1mg/ml。这 时使用离子强度为0.001～5、pH5～10的缓冲液。

使本发明的电极和双链的认识体反应后，根据需要进一步洗电极。以本发 明的电极为作用电极，在该作用电极和另设的对电极之间施加电位，通过测定 两极间的电流，检测电化学的信号。检测电化学的信号也可以用这样的2个电 极(作用电极和对电极)进行，或者用作用电极、对电极、参照极3极进行。 在电化学信号检测中，以恒定速度扫描电位、或者施加脉冲、或者施加恒定电 位、测定中，使用恒电位计、数字伏-欧-毫安表、函数发生器等装置控制电 流、电位。根据得到的电流值从标准曲线计算出目的基因浓度。

将上述(a)～(e)中任何一个多核苷酸中，上述SNP位点为胸腺嘧啶者 或其互补链、上述SNP位点为鸟嘌呤者或其互补链、上述SNP位点为腺嘌呤者 或其互补链、上述SNP位点为胞嘧啶者或其互补链，分别固定在彼此绝缘的不 同电极上并构成配置在同一基板上的DNA芯片，可进行高精度测定。这时从各 电极检测出与各核苷酸相对应的电化学信号。

使用(2)的电化学方法，使用将从被检者采取试样的多核苷酸固定在电 极上的电极，也能确定试样多核苷酸的序列。即，通过与预先已知序列的(a)～ (e)中任何一个多核苷酸的溶液接触，将溶液中的多核苷酸和电极上的试样 多核苷酸置于杂交反应条件下。若溶液中存在基体上的试样多核苷酸的互补 链，该试样多核苷酸与基体上的多核苷酸发生杂交反应，而固定在基体上。通 过检测这种杂交反应，即可检测试样多核苷酸的序列。

以上述方法检测试样多核苷酸与上述SNP位点具有胸腺嘧啶的多核苷酸或 其互补链的杂交反应时，被检者在上述SNP位点有胸腺嘧啶，故此，可预测对 干扰素疗法是有效的。与此相反，检测出试样中的多核苷酸与上述SNP位点具 有胸腺嘧啶以外的多核苷酸或其互补链的杂交反应，而且，没有检测出和上述 SNP位点具有胸腺嘧啶的多核苷酸或其互补链的杂交反应时，被检者在SNP位 点上不具有胸腺嘧啶，故此，可预测对干扰素疗法是无效的。

<电检测装置>

以下示出使用本发明的电极进行确定从被检者提取多核苷酸序列的一例基 因检测装置。即，该基因检测用装置包括上述本发明的电极、与固定在电极上 的多核苷酸完成杂交反应的反应部分、对上述电极上被固定的核酸施加电压的 施加装置、和测定由该施加装置工作产生的信号的测定装置。

<电检测装置的基本构成>

图1中示出了这种基因检测用装置的基本实施例。图1中，11是固定了 多核苷酸12的电极。13是反应槽，电源14通过电极11和反应槽13连接形成 电路，在电路内部配置电流计15、电压计16和可变电阻17，在反应槽13内 进行杂交反应后，施加电压，测定流过电路中的电流等。

在使用图1的基因检测用装置进行检测时，将缓冲液和含有从被检者采取 的多核苷酸的试样装入反应槽13内，在试样多核苷酸和电极11上的多核苷酸 12之间进行杂交反应。杂交反应的温度和时间等条件如上所述。接着，最好洗 净反应槽13和电极11，向反应槽13内装满含有插入剂的杂交溶液，启动电源 14，使用电流计15和电压计16测量电流值或电压值等。

图1中示出了本发明基因检测用装置的最基本形态，为了使检测完全自动 化，本发明的基因检测用装置也可以采用更复杂的结构，如图2所示。

<自动化的电检测装置结构>

如图2所示的检测装置20，具有保持多核苷酸固定化电极的电极托架21、 反应槽22、第1洗净槽23、插入剂反应槽24、第2洗净槽25、及电化学测定 槽26，以及载有反应槽22、第1洗净槽23、插入剂反应槽24、第2洗净槽25、 及电化学测定槽26的移动装置27，以及分析单元28、及操作单元29。这些槽 之间的电极移动，使用移动装置27，通过动作反应槽等，即可达到。

<自动化电检测装置的使用方法>

检测装置20的使用方法如下。

首先，将试样或含有预先从试样提取的多核苷酸的溶液装入反应槽22内， 将固定在电极固定托架21的上述电极浸入反应槽22中。接着，在反应槽22 中进行杂交反应后，将电极固定托架21移入第1洗净槽23内，在第1洗净槽 23内进行洗净，除去与电极非特异结合的核酸和蛋白质等。洗净后，将电极固 定托架21移入插入剂反应槽24内，使插入剂嵌入杂交反应形成的2链多核苷 酸。接着将电极固定托架21移入第2洗净槽25内，洗净后，再将电极固定托 架21移入电化学测定槽26内，进行电化学测定。测定结束后，参考预先记录 在分析单元28中的标准曲线，输出试样中多核苷酸的浓度。以上操作都是通 过与各槽及单元进行电连接的操作单元29进行。

本发明提供了一种备有本发明基因检测用载体和缓冲液的试剂盒。这样， 若提供一套本发明的基因检测用载体和缓冲液，就能很方便地直接进行检测。

本发明试剂盒中使用的缓冲液，可以是杂交反应中使用的任意缓冲液。例 如有磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、Tris缓冲液等，并不仅限于这些。

在试剂盒内，备有与缓冲液共用的，或代替缓冲液的基因扩增用的引物、 萤光色素标记核苷酸、酶、精制用柱子等。

本发明提供一种备有本发明电极和双链的识别体的试剂盒。

本发明试剂盒中所使用的双链识别体，例如，是关于本发明电极的上述双 链识别体。

试剂盒内，备有与双链的识别体共用的，或代替双链的识别体的基因扩增 用引物、酶、缓冲液、核苷酸等。

以下根据实施例更详细地说明本发明。

实施例1

在该实施例中，将具有以杂合或纯合MxA基因启动子区域的-88位(在 序列1的碱基序列中相当于455位)的核苷酸为胸腺嘧啶的基因(以下记作MxA (T))的HCV感染者，与具有纯合该核苷酸为鸟嘌呤的基因(以下记作MxA(G)) 的HCV感染者进行比较，证实对干扰素疗法的应答性很好。

<被检者>

从组织学上被证明是慢性丙型肝炎的，进行干扰素疗法的115名患者和抗 HCV阴性的健康者42名参加本研究。这些被检者全部是日本人，相互间没有血 缘关系。

115名患者中，52名患者在干扰素疗法结束后，在至少6个月的跟踪观察 期间，血清丙氨酸转氨酶的水平处于正常范围，而且是HCV的RNA一直处于阴 性的持续应答者(以下记作SR)；63名患者与ALT水平无关，在跟踪期间HCV 的RNA一直为阳性，或者，是复发丙型肝炎的非应答者(以下记作NR)。对所 有患者服用干扰素α和/或β，总用量超过300万单位。

从患者和健康对照者采取的pBMC中提取核酸。将该核酸供给PCR，对包 含MxA基因启动区域的599核苷酸的DNA进行扩增。

PCR的概述如下。

将0.05μg核酸与Taq-Gold(Perkin Elmer)、序列12的寡核苷酸引物 #MXAF01(正向引物，-569～-540位)、及序列6的寡核苷酸引物#MXAF02(反 向引物、+30～+1位)混合后，在[95℃10分钟]、[95℃10秒钟]、[68℃60 秒钟]×55、[72℃7分钟]的循环条件下进行反应。通过直接译码PCR产物， 确定157个试样中的12个序列。

通过确定序列，同时确定扩增区域中SNP位点后，构建用于可识别地检出 等位基因核苷酸的RFLP系统。将所有患者的599核苷酸的PCR产物用HhaI(GCG ↓C)进行消化，在琼脂糖凝胶中进行电泳，以调查是生成482核苷酸带，还是 533核苷酸带，或是两者都生成。

<统计分析>

进行イエ一ツ补正，或者不进行，根据费希尔的概率试验比较组数据，在 统计学中把p＜0.05看作是统计学上有显著性的。

<结果>

通过进行12个样品的序列确定，在MxA基因启动子区域中同时确定多型 位点。在该启动子区域的-88位中存在SNP(G和T)，该SNP包含在类似图3 所示的ISRE区域中。

接着，在HhaI进行的RFLP中，对全部157个样品确定MxA基因的基因型。 在该分析中，在多型位点上具有鸟嘌呤的试样，在电泳凝胶中呈现出482核苷 酸的带。与此相反，鸟嘌呤置换成胸腺嘧啶时，由于限制酶HhaI的识别位点 消失，所以呈现出533核苷酸的带。具有杂合多型位点为鸟嘌呤的启动子区域 和多型位点为胸腺嘧啶的启动子区域时，可同时检测出482核苷酸带和533核 苷酸带(参见图4)。

如表1所示，在NR组中，62％的患者具有纯合上述多型位点为鸟嘌呤的 启动子区域(G·G同型)、在SR组中，31％的患者是G·G同型(p＝0.0009； SRvsNR)。与此相反，在NR组中，35％的患者具有以杂合上述多型位点为乌嘌 呤的启动子区域和上述多型位点为胸腺嘧啶的启动子区域(G·T异型)、而在 SR组中，60％的患者为G·T异型(p＝0.0082；SRvs.NR)。T·T同型的患者， 分别在NR组中为3.2％，在SR组中为10％(p＝0.2956；SRvs.NR)。

具有上述多型位点为鸟嘌呤启动子区域的等位基因频率，在SR组中为 0.606，而在NR组中为0.794(p＝0.0018；SRvsNR)。

表1   MxA启动子-88    位的多型    SR患者    (n＝52)    NR    (n＝63)    健康对照者    (n＝42)    p：    SR vs NR    等位基因频率    G    T      0.606    0.394      0.794    0.296      0.714    0.286      0.0018    0.0018    接合型    G·G同型    G·T异型    T·T同型      16(31％)    31(60％)    5(10％)      39(62％)    22(35％)    2(3.2％)      20(48％)    20(48％)    2(4.8％)      0.0009    0.0082    0.2956* 

*进行イエ一ツ补正。

进而由与NR组相比较，在SR组中，G·G同型的个体显著少的上述结果 也可明确不依赖于患者感染的HCV基因型。

表2   MxA启动子中-88位   的SNP接合型   SR患者   NR患者   p：   SR vs NR   基因型为1b的HCV   感染患者   G·G同型   G·T异型   T·T同型   基因型为2a或2b的   HCV感染患者   G·G同型   G·T异型   T·T同型   N＝18     5(28％)   12(67％)   1(5.6％)   n＝34     11(32％)   19(56％)   4(12％)   N＝42     26(62％)   14(33％)   2(4.8％)   n＝21     13(62％)   8(38％)   0     0.0321*   0.0170   0.6051*       0.0318   0.1999   0.2722*

*进行イエ一ツ补正。

从表2可知，在基因型为1b的HCV感染患者组(HCV 1b组)和基因型为2a 或2b的HCV感染患者组(HCV 2a/2b组)中，在NR组中62％都是G·G同型的 个体，而SR组中则分别28％和32％是G·G同型的个体。从表2所示结果可 以明确，不管患者感染HCV的基因型如何，在SR组中，G·G同型的个体显著 要少(HCV 1b组；p＝0.0321、HCV 2a/2b组；p＝0.0318)。

以上根据本实施例，证实了具有以杂合或纯合上述多型位点为胸腺嘧啶的 MxA启动子区域的HCV感染者，不依赖于感染的HCV基因型，对于干扰素疗法 都显示出很高的应答性。

本实施例也暗示出，具有以杂合或纯合上述多型位点不为鸟嘌呤的MxA启 动子区域的HCV感染者，对干扰素疗法也显示出很高的应答性。

进而，由于ISRE中存在上述多型位点，也可以说，这些情况也适用于丙 型肝炎以外的疾病。

实施例2

如实施例1中所明确的，MxA启动子的SNP为T型的HCV感染者，通过给 以干扰素，肝炎的治疗效果很高。另一方面，该SNP为G型时，治疗效果很低、 作为其理由，可解释为起ISRE功能的碱基序列为T型，对于干扰素的刺激能 进行准确的应答，G型由于和其序列仅1个碱基的差异，对于干扰素的刺激没 有应答，MxA蛋白质的生成量很低。

从这种状况考虑时，可以推测MxA启动子的SNP为C型及A型的HCV肝炎 患者，也和G型一样，MxA启动子对干扰素没有应答，其治疗效果也很低。

为了证明这些情况，在MxA启动子的下游构建具有萤光素酶基因的质料， 使其转染人细胞(HeLa细胞、及卵巢癌细胞)。同样，对具有4种SNP(T型、 G型、A型、C型)的MxA启动子，分别调查作为它们对干扰素的应答结果而产 生的萤光毒酶活性。

其结果示于图5～图8。图5是使用干扰素α在Hela细胞内进行诱导的实 例。图6是用干扰素α在卵巢癌细胞内进行诱导的实例。图7是使用干扰素β 在Hela细胞内进行诱导的实例。图8是使用干扰素β在卵巢癌细胞内进行诱 导的实例。在这些图中，+号表示添加干扰素时的萤光毒活性，-号表示没有 添加干扰素时的萤光素活性。这些结果都是3次试验的平均值，以条线棒表示 其标准偏差。

从图中可知，在哪种场合，T型的MxA启动子均呈现出最高值，具有A型 和C型SNP的HCV肝炎患者，和G型一样，对于干扰素α及干扰素β的应答性 很低。因此，可预测出利用干扰素的治疗效果很低。

实施例3

在本实施例中，一边参照图9，一边对使用本发明基因检测用载体预测干 扰素疗法有效性的预测操作进行说明。

首先，为制作本发明的基因检测用载体，使用序列21和序列22的引物， 对序列1的多核苷酸片段的含有上述SNP位点的该SNP位点为胸腺嘧啶的T型 片段31，和序列2的多核苷酸的含有上述SNP位点的该SNP为鸟嘌呤的G型片 段32进行扩增，用蒸馏水调制成2μg/μL。

接着，在各片段中添加等量的4mg/mL硝基纤维素(DMSO溶液)，热变性后， 在用聚赖氨酸被覆的载玻片33上点样，待测定点充分干燥后，利用紫外线照射 进行固定化处理，得到T型片段31和G型片段32被固定的基因检测用载体。

接着，利用序列20和序列21的引物，对由被检者血液中提取的试样多核 苷酸进行扩增处理后，在Pharmacia制的ECL制标记系统内进行FITC标记， 和预先调制的上述基因检测用载体在65℃下反应12小时。反应后，用萤光检 测器测定信号。

从固定T型片段的测定点观察到的萤光信号，从其结果判明本试验中所用 试样多核苷酸的SNP为T型。

实施例4

本实施例中，一边参照图10，一边对使用固定了试样中片段的基因检测 用载体的检测进行说明。

对用序列21、序列22的引物使从被检者提出的多核苷酸扩增的片段(试 样A：41，试样B：42)，用蒸馏水调制成2μg/μL。接着，添加等量的4mg/L 硝基纤维素(DMSO溶液)后，使其热变性，在用聚赖氨酸被覆的载玻片43上 点样，待测定点充分干燥后，用紫外线照射进行固定化处理。

将以下片段和预先调制的DNA芯片在50℃下反应1小时。即，预先进行萤 光标记的、序列1的多核苷酸片段即含有上述SNP位点的、该SNP位点为胸腺嘧 啶的T型片段(JOE标记)，和预先进行萤光标记的序列2的多核苷酸片段即含 有上述SNP位点的、该SNP位点为鸟嘌呤的G型片段(5-FAM标记，和预先进行 萤光标记的、序列3的多核苷酸片段即含有上述SNP位点的、该SNP位点为腺嘌 呤的A型片段(TAMRA标记)，和预先进行萤光标记的，序列4的多核苷酸片 段即含有上述SNP位点的、该SNP位点为胞嘧啶的C型片段(ROX标记)。

反应后，用萤光检测器测定信号，结果只得到来自HEX萤光的信号，可以 判明本试样多核苷酸的SNP只为T型。

实施例5

本实施例中，一边参照图11，一边对利用电化学检测的基因检测用载体 进行说明。

使用序列21和序列22的引物，对序列1的T型片段51和G型片段52进 行扩增，用蒸馏水调制成2μg/μL。接着，与2-羟乙基二硫化物和1-环己 基-3-(2-吗啉代乙基)-碳化二亚胺进行反应，向扩增产物的末端导入巯 基。在预先制作的金电极53上点样，在不使干燥的条件下反应1小时。样品 用序列21和序列22的引物扩增、热变性后，和预先调制的DNA芯片在65℃ 下反应1小时。反应后，在10μmol/L的ヘキスト33258溶液中进行伏安测量， 测定ヘキスト33258的氧化电流值。结果是只从固定了G型片段的电极上获得 显著性的信号，可判明本试样为G型。

序列表

<110>株式会社东芝

<120>基因检测用载体，及检测干扰素疗法有效性的应用

<130>A000001162

<140>

<141>

<160>22

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>581

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60

ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120

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gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300

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<210>2

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<212>DNA

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<210>3

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<212>DNA

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<210>4

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<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<210>6

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<212>DNA

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<210>7

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

ggtttcgttt ctgccc                                                    16

<210>9

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

ttctgctcccg                                                          10

<210>10

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

ttctgcgcccg                                                          10

<210>11

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

ttctgcacccg                                                          10

<210>12

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

ttctgcccccg                                                          10

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

gagcag aaacgaaacc                                                    16

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>14

gcgcag aaacgaaacc                                                    16

<210>15

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>15

gtgcag aaacgaaacc                                                    16

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>16

gggcag aaacgaaacc                                                    16

<210>17

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>17

cgggagcagaa                                                          10

<210>18

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>18

cgggcgcagaa                                                          10

<210>19

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>19

cgggtgcagaa                                                          10

<210>20

<211>10

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>20

cgggggcagaa                                                          10

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>对人工合成序列的描述：引物

<400>21

acacacccgt ttccaccctg gagaggccag                                    30

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>对人工合成序列的描述：引物

<400>22

tgcgcagtgc tggagtgcgg cctccgctct                                    30