一种无引物的基因合成方法 |
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| 申请号 | CN201410211672.7 | 申请日 | 2014-05-19 | 公开(公告)号 | CN104109683A | 公开(公告)日 | 2014-10-22 |
| 申请人 | 武汉金开瑞生物工程有限公司; 湖北大学; | 发明人 | 马立新; 沈鹤霄; 陈晚苹; 华权高; 张桂敏; 杨明波; 陈羽西; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种无引物的基因合成方法，属于基因的人工合成领域。本发明首先公开了一个pNew载体质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示。本发明还公开了用pNew载体质粒构建的包含有16384(47)个质粒的载体库。本发明进一步公开了一种无引物的基因合成方法，包括以下步骤：(1)将待合成的目标基因DNA序列按照每个 片段 82bp进行分组；(2)将分组的片段分别在构建的质粒库中找到对应的质粒；(3)将对应的质粒酶切，用抗生素筛选，重构得到含82bp目的基因序列的质粒；(4)通过金 门 克隆反应将基因片段拼接成完整的目的基因。本发明基因合成方法不需要利用引物，合成成本低，突变率极其低，准确率高，可以合成诸如高度重复序列、Poly A等特殊的基因序列，操作简单，能实现自动化操作。 | ||||||
| 权利要求 | 1.合成基因用的pNew载体质粒，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示。 |
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| 说明书全文 | 一种无引物的基因合成方法技术领域[0001] 本发明涉及一种基因合成方法，尤其涉及一种基于库的无引物基因合成方法，属于基因合成技术领域。 背景技术[0002] 近年来合成生物学，特别是基因合成技术的研究进展非常迅速。目前，全基因合成是依照某一蛋白质的核苷酸序列，首先设计合成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长的基因序列，在此基因合成过程中无需模板，是目前获取基因的有效手段之一。 [0003] 迄今为止，已经报道的基因合成方法都是依赖于化学合成的寡核苷酸引物，主要包括以下几种方法：(1)化学合成法，由于化学合成法的原理本身存在着一定程度的缺陷，这些缺陷决定了化学法合成的DNA片段不可能太长，化学合成法主要用于寡核苷酸的合成；(2)PCR介导的合成方法，这种方法可以合成大的DNA片段，而且周期也比较短，但PCR介导的合成方法错误率比较高，对于合成大于2kb以上的DNA其错误率更高，因此为了得到大的DNA片段的正确克隆，可能需要多次克隆和测序的重复工作，这样会额外的增加基因合成的成本，而且由于是PCR介导的方法，需要DNA高温聚合酶和dNTP等试剂，这样也会增加基因合成的成本；(3)非PCR介导的方法，到目前为止报道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技术。这种固相合成技术，其合成的错误率大大降低，但是由于在合成过程中需要使用经过特殊修饰的引物，这样就会导致引物的成本增加，从而导致后续基因合成的成本增加。同时，固相合成技术依赖特殊的仪器设备，无法满足普通实验室和科研单位的需求。 [0004] 随着合成生物学的研究进展，特别是基因合成技术方法研究的不断深入，目前急需开发一种新的基因合成方法，建立一种能够以相对低廉的价格，在短时间内准确和高效的合成长片段基因的方法，以解决现有基因合成技术中存在的错误率高，合成成本高等问题。 发明内容[0005] 本发明的主要目的是提供一种无引物的基因合成方法； [0006] 为实现上述目的，本发明首先提供了一种用于基因合成用的pNew载体质粒；其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示； [0007] 本发明进一步提供了一种构建所述pNew载体质粒的方法，该方法包括： [0008] (1)构建获得核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示的线性载体骨架pNew； [0009] (2)扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示的3KCGS； [0010] (3)将线性载体骨架pNew、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆到一个完整的载体上，即得所述pNew载体质粒。 [0011] 本发明以pet23a质粒为模版，以ori-PF/ori-PR为引物，通过PCR扩增得到线性载体骨架pNew(1.9kb)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示；在PCR过程中通过引物ori-PR引进限制性内切酶BseRI的识别位点。 [0012] 本发明分别以质粒RNALIC、pDEST32、pet28b和pet23a为模板，设计引物，通过PCR扩增5Spc片段(656bp)、5Gem片段(535bp)、5Cam片段(371bp)、5Kana片段(556bp)和Amp盒式结构(969bp)，扩增的上述片段5’或3’端分别引入了适宜的限制性酶切位点；每个片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段逐次做重叠延伸PCR，即通过引物5Spc-PF和5Gem-PR扩增将5Spc片段和5Gem片段连接；通过引物5Spc-PF和5Cam-PR扩增将5Spc5Gem片段与5Cam片段连接；通过引物5Spc-PF和5Kana-PR扩增将5Spc5Gem5Cam片段与5Kana片段连接；通过引物5Spc-PF和Amp-PR扩增将5Spc5Gem5Cam5Kana片段与Amp盒式结构连接得到一个大片段5SGCK(3kb)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示。 [0013] 本发明分别以质粒pet28b、pDEST32和RNALIC为模板，设计引物，通过PCR扩增3Kana片段(531bp)、3Cam片段(566bp)、3Gem片段(279bp)和3Spc片段(387bp)，扩增的上述片段5’或3’端分别引入了适宜的限制性酶切位点；每个片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段逐次做重叠延伸PCR，即通过引物3Kana-PF和3Cam-PR扩增将3Kana片段和3Cam片段连接；通过引物3Kana-PF和3Gem-PR扩增将3Kana3Cam片段与 3Gem片段连接；通过引物3Kana-PF和3Spc-PR扩增将3Kana3Cam3Gem片段与3Spc片段连接得到一个大片段3KCGS(1.7kb)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示。 [0014] 通过无 酶克 隆的方 式(Zhu D,Zhong X,Tan R,Chen L,Huang G,Li J,et al.High-throughput cloning of human liver complete open reading framesusing homologous recombination in Escherichia coli.[J]Anal Biochem.2010；397(2):162-167)把3个片段：线性载体骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一个完整的载体上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的pNew载体质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示，命名为pNew载体质粒。 [0015] 本发明进一步用获得的pNew载体质粒构建一个包含有16384(47)个质粒的载体库，该载体库中的每个质粒包含有任意7个碱基对的任一排列组合序列。 [0016] 因此，本发明进一步提供一个载体库，该载体库用pNew载体质粒构建得到，该载7 体库中包含有16384(4)个质粒，每个质粒包含有任意7个碱基对的任一排列组合序列。 [0017] 本发明进一步提供了一种应用所述的载体库合成目的基因的方法，该方法包括以下步骤： [0018] (1)将预合成的目标基因DNA序列按照每个片段82bp进行划分，各个片段从头至尾依次进行命名为G1、G2、G3、G4、G5……，每个片段之间有3个碱基的重复。 [0019] (2)根据依次命名的G1、G2等小片段的序列分别在所构建的7bp质粒库中找到对应的质粒，每个82bp的片段需要16个带有7bp碱基的质粒； [0020] (3)将查找得到的对应的质粒分别用AgeI、BsgI和XmaI、BseRI酶切，用Kana(卡纳霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含12bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、SalI和BseRI、XhoI酶切，用相应的Cam(氯霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含22bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、BamHI和BseRI、BglII酶切，用相应的Gem(庆大霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含42bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、SpeI和BseRI、XbaI酶切，用相应的Spc(壮观霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含82bp目的基因序列的质粒； [0021] (4)要合成大于82bp以上的DNA片段，用XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc-Kana，做金门克隆反应，通过金门克隆反应能够将基因片段拼接成完整基因；如果目的基因比较大，则进行第二轮金门克隆以达到合成较大片段的目的基因。 [0022] 本发明方法中合成的含82bp目的基因序列的质粒XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……为壮观霉素抗性，同时所构建的金门克隆受体载体puc-Kana有gfp表达盒式结构，受体质粒转化大肠杆菌菌落是发光的，而且puc-Kana受体载体是kana抗性，与供体质粒的抗性不一样，所以最后转化所得重组子可以通过Kana抗性的正筛选作用和gfp的负筛选作用，这样可以使后期筛选重组子的工作进一步的简洁化和效率化。将PCR鉴定正确的重组子送测序，就可以得到正确的完整的DNA序列。由于在后期的金门克隆反应中只涉及到酶切连接反应，所以只要合成的小片段DNA是正确的，就不会突变，这样拼接准确率很高。 [0023] 本发明合成方法主要利用抗性基因重构的遗传筛选机制，从已构建好的含有7bp目的基因序列的质粒出发，质粒分别用(AgeI、BsgI)和(XmaI、BseRI)酶切，然后再用T4连接酶16℃连接处理，重构Kana抗性基因，转化后得到含12bp目的基因片段质粒。再依次重构Cam、Gem、Spc抗性基因，即将对应的质粒分别用(BsgI、SalI)和(BseRI、XhoI)酶切，用相应的Cam抗生素进行遗传筛选；将对应的质粒分别用(BsgI、BamHI)和(BseRI、BglII)酶切，用相应的Gem抗生素进行遗传筛选；将对应的质粒分别用(BsgI、SpeI)和(BseRI、XbaI)酶切，用相应的Spc抗生素进行遗传筛选。四轮重构后得到若干含82bp目的基因序列的质粒，最后以82bp供体质粒和puc-Kana受体载体做金门克隆反应(Engler,C.,R.Kandzia,and S.Marillonnet,A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability.PLoS One,2008.3(11):36-47)，通过金门克隆反应将基因片段拼接成完整的目的基因。如果目的基因比较大，可以进行第二轮金门克隆以达到合成较大片段的目的基因。 [0024] 本发明的基因合成方法与现有的基因合成方法相比具有以下优点： [0025] (1)本发明方法不需要利用引物进行基因合成，只要构建好了包含任意7bp的载体库(16384种)就可以达到一劳永逸的效果，以后合成基因都可以不用合成引物，合成成本低。 [0026] (2)突变率极其低。由于整个合成过程是从质粒出发，只是经过酶切酶连等操作，没有常规DNA合成方法中引物引进的突变，而且没有经过PCR过程，所以突变率极低，甚至为零。 [0027] (3)本发明合成方法在整个过程都是进行的酶切酶连操作，没有引进PCR等操作，而且利用抗性重构的原理，用重构的相应抗生素进行遗传筛选，准确率高，无需测序，进一步降低成本。 [0028] (4)本发明合成方法可以合成特殊的基因序列，如高度重复序列，Poly A等Poly序列，可以用于研究一些复杂结构或一些调控序列的机理，由于该方法是从质粒出发，酶切酶连，不需要PCR，可以合成PCR方法不能合成的高度重复序列。 [0029] (5)本发明合成方法操作简单，酶切产物可以直接连接转化，无需纯化。由于是通过抗性基因这个遗传因素来筛选，在加入相应抗生素后，只有重构出相应抗性的转化子才能生长起来，而那些没有酶切的质粒或者连接错误的产物由于不能得到完整的抗性基因，不能在加有抗生素的培养基中生长。 [0030] (6)本发明合成方法可以实现自动化操作。由于筛选是用抗性基因筛选，不需要涂平板等操作，故可以进行溶液操作，从而实现自动化。 [0031] (7)本发明合成方法有利于构建突变体文库，对于做定点诱变和定向进化效率非常高，筛选工作量比现有的构建突变体库的方法可以降低2-3个数量级。 [0032] 本发明所涉及到的术语定义 [0033] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。 [0034] 术语“载体”意指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 [0035] 术语“质粒”意指一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子。 [0036] 术语“基因”意指遗传的基本单元，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。 [0037] 术语“抗性基因”意指抗性的遗传因子，如Kana抗性基因。 [0038] 术语“重叠延伸PCR”意指由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 [0039] 术语“基因序列”意指使用一串字母表示的真实的或者假设的携带基因信息的DNA分子的一级结构。 [0042] 图1为载体pNew的构建过程。 [0043] 图2为利用重构抗性基因合成82bp片段的过程。 [0044] 图3为以82bp供体质粒和puc-Kana受体载体做金门克隆反应的原理和流程图。 具体实施方式[0045] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 [0046] 实验材料 [0047] 商品化的pet23a、pet28b和pDEST32均购于Invitrogen公司。 [0048] 实施例1构建pNew载体质粒 [0049] 1、构建线性载体骨架pNew [0050] 以商品化载体pet23a质粒为模板，以ori-PF/ori-PR为引物(序列见表1)，通过PCR扩增得到线性载体骨架pNew(1.9kb)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示)，在PCR过程中通过引物ori-PR引进限制性内切酶BseRI的识别位点。 [0051] 2、构建大片段5SGCK [0052] 设计引物5Spc-PF/5Spc-PR(序列见表1)，以RNALIC质粒为模板，通过PCR扩增得到5Spc片段(656bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.22所示)，扩增好的5Spc片段5’和3’端分别带上了限制性酶切位点BsgI和XbaI；设计引物5Gem-PF/5Gem-PR(序列见表1)，以pDEST32质粒为模板，通过PCR扩增得到5Gem片段(535bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.23所示)，扩增好的5Gem片段3’端带上了限制性酶切位点BglII；设计引物5Cam-PF/5Cam-PR(序列见表1)，以pDEST32质粒为模板，通过PCR扩增得到5Cam片段(371bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.24所示)，扩增好的5Cam片段3’端带上了限制性酶切位点XhoI；设计引物5Kana-PF/5Kana-PR(序列见表1)，以pet28b质粒为模板，通过PCR扩增得到5Kana片段(556bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.25所示)，扩增好的5Kana片段 3’端带上了限制性酶切位点XmaI；设计引物Amp-PF/Amp-PR(序列见表1)，以pet23a质粒为模板，通过PCR扩增得到Amp盒式结构(969bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.26所示)；每个扩增的片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段通过5Spc-PF和Amp-PR引物逐次做重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR)，即通过引物5Spc-PF和5Gem-PR扩增将5Spc片段和5Gem片段连接；通过引物5Spc-PF和5Cam-PR扩增将5Spc5Gem片段与5Cam片段连接；通过引物5Spc-PF和5Kana-PR扩增将5Spc5Gem5Cam片段与5Kana片段连接；通过引物5Spc-PF和Amp-PR扩增将5Spc5Gem5Cam5Kana片段与Amp盒式结构连接得到一个大片段5SGCK(3kb)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示。 [0053] 3、构建大片段3KCGS [0054] 设计引物3Kana-PF/3Kana-PR(序列见表1)，以pet28b为模板，通过PCR扩增得到3Kana片段(531bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.28所示)，扩增好的3Kana片段5’端带上了限制性酶切位点AgeI；设计引物3Cam-PF/3Cam-PR(序列见表1)，以pDEST32为模板，通过PCR扩增得到3Cam片段(566bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.29所示)，扩增好的3Cam片段5’端带上了限制性酶切位点SalI；设计引物3Gem-PF/3Gem-PR(序列见表1)，以pDEST32为模板，通过PCR扩增得到3Gem片段(279bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.30所示)，扩增好的3Gem片段5’端带上了限制性酶切位点BamHI；设计引物3Spc-PF/3Spc-PR(序列见表1)，以RNALIC为模板，通过PCR扩增得到3Spc片段(387bp)(其核苷酸序列为SEQ ID NO.31所示)，扩增好的3Spc片段5’端带上了限制性酶切位点SpeI；每个片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段通过3Kana-PF和3Spc-PR引物逐次做重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR)，即通过引物3Kana-PF和3Cam-PR扩增将3Kana片段和3Cam片段连接；通过引物3Kana-PF和3Gem-PR扩增将3Kana3Cam片段与3Gem片段连接；通过引物3Kana-PF和3Spc-PR扩增将3Kana3Cam3Gem片段与3Spc片段连接得到一个大片段 3KCGS(1705bp)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示。 [0055] 4、构建pNew载体质粒 [0056] 通过无 酶克 隆的方 式(Zhu D,Zhong X,Tan R,Chen L,Huang G,Li J,et al.High-throughput cloning of human liver complete open reading frames using homologous recombination in Escherichia coli.[J]Anal Biochem.2010；397(2):162-167)把3个片段：线性载体骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一个完整的载体上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的pNew载体质粒(其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示)，命名为pNew载体质粒(构建过程见图1)。 [0057] 表1载体pNew构建中使用的引物 [0058] [0059] [0060] 实施例2目标基因的合成 [0061] 1、质粒库的构建 [0062] 以实施例1构建好的pNew载体，用PCR、反扩载体、无酶克隆常规的构建方法构建7 4(16384)种质粒库，该质粒库中的每个质粒任意包含有7个碱基对的任一排列组合序列。 [0063] 2、目的基因的分析及分组 [0065] 3、库质粒的查找 [0066] 根据G1、G2等小片段的序列和质粒对应的编号的一一对应关系分别在建好的7bp质粒库中找到对应的质粒，每个82bp的片段需要16个带有7bp碱基的质粒。 [0067] 4、若干含82bp目的基因序列质粒的获得 [0068] 将对应的质粒分别用BsgI、AgeI和BseRI、XmaI酶在37℃酶切3h，然后在65℃热处理10min后进行混合，然后再取5uL反应体系和T4Liagse，然后将反应体系在16℃连接30min后分别转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，最后在加有Kana抗生素的LB培养基中培养过夜，抽提质粒得到含12bp目的基因序列的质粒。然后再通过相应的酶切和同样的操作步骤，如此依次重构cam、gem和spc抗性基因，即将对应的质粒分别用BsgI、SalI和BseRI、XhoI酶切，用相应的Cam抗生素进行遗传筛选，得到含22bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、BamHI和BseRI、BglII酶切，用相应的Gem抗生素进行遗传筛选，得到含42bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、SpeI和BseRI、XbaI酶切，用相应的Spc抗生素进行遗传筛选，最后得到含82bp目的基因序列的质粒。 [0069] 由于整个过程只有酶切酶连的操作，而起始质粒是正确的库质粒，所以通过抗性基因这种遗传因素筛选的重组子就是正确的，无需测序，分别命名为XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……。 [0070] 5、目的基因的拼接组装 [0071] 要合成大于82bp以上的DNA片段，需要用步骤4的XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc-Kana，做金门克隆反应(Engler,C.,R.Kandzia,and S.Marillonnet,A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability.PLoS One,2008.3(11):36-47)，通过金门克隆反应能够将基因片段拼接成完整基因，具体过程见图4。如果目的基因比较大，可以进行第二轮金门克隆以达到合成较大片段的目的基因。 [0072] 合成的含82bp目的基因序列的质粒XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……为壮观霉素抗性，同时实验室构建的金门克隆受体载体puc-Kana有gfp表达盒式结构，受体质粒转化大肠杆菌菌落是发光的，而且puc-Kana受体载体是kana抗性，与供体质粒的抗性不一样，所以最后转化所得重组子可以通过Kana抗性的正筛选作用和gfp的负筛选作用，这样可以使后期筛选重组子的工作进一步的简洁化和效率化。将PCR鉴定正确的重组子送测序，就可以得到正确的完整的DNA序列。由于在后期的金门克隆反应中只涉及到酶切连接反应，所以只要合成的小片段DNA是正确的，就不会突变，这样拼接准确率很高。 [0073] 如果目标基因DNA序列按照每个片段82bp进行划分，最后一段为1-6个碱基，这样的话可以把最后两个或者更多片段进行调整，不一定要以82bp的形式，从7bp到82bp之间是可以按照5个碱基差距随意组合，如12bp、17bp、22bp、27bp等。 [0074] 实验例1抗生物素蛋白(avidin)的基因合成 [0075] 利用本发明的基因合成方法合成鸡(G.gallus)来源的抗生物素蛋白(avidin)的基因片段。 [0076] 抗生物素蛋白的合成过程包括以下步骤： [0077] (1)采用商品化的puc-19质粒以及pGSilG-Lic质粒(购于Invitrogen公司)通过PCR、套叠PCR、无酶克隆等常规方法构建puc-Kana质粒载体。 [0078] (2)将目标基因avidin的碱基序列(438bp)分成6个小段，每个小段分别命名为AV1、AV2、……AV6，前5段各为82bp，第6段为42bp。然后，在已经构建好的16384个7bp的质粒库中找出对应的质粒，每个82bp的片段需要16个质粒，42bp的片段需要8个质粒。 [0079] (3)每组找出的16个质粒分别两两分组，并命名为A1\B1，A2\B2……A8\B8，每组质粒(An\Bn)有2bp的重叠供连接用，An质粒和Bn质粒分别按照以下反应体系加入各组分。 [0080] [0081] [0082] An组和Bn组反应体系都在37℃条件下反应3h。 [0083] (4)将上述酶切产物分别以对应的An\Bn混合，并在65℃热失活10min，然后分别取5uL混合物加入T4Liagse，然后将反应体系在16℃连接30min后分别转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，转化产物分别接种在加有kana抗生素的LB培养基中培养12-16h，然后用常规方法抽提质粒，质粒分别对应命名为KA1、KA2……KA8，这些质粒都含有12bp片段。 [0084] (5)将KA1、KA2……KA8质粒两两分组(根据抗性基因重构的顺序进行分组，每组质粒有2bp的重叠，这个是根据BsgI、BseRI酶决定的，这两个酶切后突出2个碱基的粘性末端)，分别用(SalI、BsgI)和(XhoI、BseRI)酶组合酶切，重构Cam表达盒，用Cam抗生素进行筛选。反应体系和程序与步骤(3)类似，再重复步骤(4)后，就可以得到含有22bp片段的质粒。重复上述步骤，再重构Gem抗性基因，对应质粒分别用(BsgI、BamHI)和(BseRI、BglII)酶切，用相应的Gem抗生素进行遗传筛选，得到含有42bp片段的质粒；重构Spc抗性基因，对应质粒分别用(BsgI、SpeI)和(BseRI、XbaI)酶切，用相应的Spc抗生素进行遗传筛选。如此经过四轮重构后，最后得到含有82bp目的基因的质粒，分别命名为AV1、AV2……AV5；AV6只有42bp，只需要重构3轮。 [0085] (6)将正确的质粒AV1、AV2……AV6和实验室已经改造的载体puc-Kana按照以下体系和程序反应操作： [0086] 反应体系： [0087] [0088] 反应程序： [0089] [0090] 反应完成后的体系可取出，并保存在4℃条件下。取5uL反应产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂LB+kana的平板，37℃培养过夜，挑取不发光的菌落进行PCR和质粒大小鉴定，再送去测序，序列测定证明本发明合成方法所合成的基因序列是正确的全长avidin基因序列。 |
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