双功能钉接多肽和其用途 |
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| 申请号 | CN201080040139.9 | 申请日 | 2010-07-13 | 公开(公告)号 | CN102510755A | 公开(公告)日 | 2012-06-20 |
| 申请人 | 哈佛大学校长及研究员协会; | 发明人 | 格雷戈里·L·维尔戴恩; 汤姆·N·格罗斯曼; 雷蒙德·E·莫勒林; 约翰尼斯·松汉·叶; 梁乐; 玉柳斌; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及包含靶向结构域、连接子部分和效应结构域的双功能钉接或针接肽，其可用于系栓至少两个细胞实体(例如 蛋白质 )或使至少两个细胞实体(例如蛋白质)紧密接近。某些方面涉及通过所述效应结构域结合到效应 生物 分子且通过所述靶向结构域结合到靶生物分子的双功能钉接或针接肽。由本发明的双功能钉接或针接肽系栓的多肽和/或多肽复合物，其中结合于所述双功能钉接或针接肽的所述效应结构域的效应多肽修饰或改变结合于所述双功能肽的所述靶向结构域的靶多肽。还提供本发明双功能钉接或针接肽的用途，包括 治疗 疾病 (例如癌症、发炎性疾病)的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种双功能钉接肽，其包含： |
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| 说明书全文 | 双功能钉接多肽和其用途[0001] 相关申请案 技术领域背景技术[0003] 肽和蛋白质作为激素、酶抑制剂、底物和神经递质的重要生物作用已经引起使用肽和/或肽模拟物作为治疗剂。肽组合结构元件得到的生物活性构象，例如α-螺旋、 β-折叠、转角和/或环极为重要，因为其允许受体、酶和核酸的选择性生物识别，由此影响细胞-细胞通信和/或控制关键细胞功能，例如代谢、免疫防御和细胞分化(巴宾(Babine) 等人，化学评述(Chem.Rev.) (1997)97：1359)。不幸的是，肽作为药物的效用受到数个因素的严格限制，包括其在生理条件下被蛋白酶迅速降解、其较弱的细胞渗透性以及其由构 象柔性引起的结合特异性的缺乏。 [0005] 许多研究团体已经开发出用于设计和合成更为稳固的肽作为治疗剂的策略。举例来说，一种策略是将较为稳固的官能团并入肽链中，同时仍保持肽的独特构象和二级 结构(参看例如，甘特(Gante)，德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.) (1994)33：1699-1720；里斯克普(Liskamp)，荷兰皇家化学协会杂志(Recl.Trav.Chim. Pays-Bas)(1994)113：1；吉安尼丝(Giannis)，德国应用化学(英文版)(1993)32：1244； 拜雷(Bailey)，肽化学(Peptide Chemistry)，威立出版公司(Wiley)，纽约(New York) (1990)，182；和其中引用的参考文献)。另一种方法是通过共价交联使肽稳定(参看例 如，费荷兰(Phelan)等人，美国化学协杂志(J.Am.Chem.Soc.) (1997)119：455；卢克 (Leuc)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(2003)100：11273；布拉肯 (Bracken)等人，美国化学协会杂志(1994)116：6432；颜(Yan)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.)(2004)14：1403)。然而，大部分报导的方法都涉及使用极性和/或不稳定的交联基团。 [0006] “肽钉接(Peptide stapling)”是关于使用烯烃复分解反应共价接合多肽链中存在的两个含烯烃侧链所使用的合成方法而造出的术语(有机化学杂志(J.Org.Chem.) (2001)66(16)；布莱克威尔(Blackwell)等人，德国应用化学(1994)37：3281)。经显示， 使用由烯烃复分解反应产生的烃交联剂进行肽钉接有助于保持肽的天然构象，尤其是在生 理条件下(美国专利第7,192,713号；斯查梅斯特(Schafmeister)等人，美国化学协会杂 志(J.Am.Chem.Soc.)(2000)122：5891-5892；瓦伦斯基(Walensky)等人，科学(Science) (2004)305：1466-1470；各文献以引用的方式并入本文中)。这一策略已被应用于细胞凋亡诱导性BID-BH3α-螺旋，在动物模型中引起比未钉接肽高的针对白血病恶性生长的抑制 作用(瓦伦斯基等人，科学(2004)305：1466-1470；美国专利申请公开案第2005/02506890 号；美国专利申请公开案第2006/0008848号；各案以引用的方式并入本文中)。 发明内容 [0007] 本发明源自对于钉接或接结肽的新用途的认识。已知这些肽的稳定性，故其可用作将蛋白质或其它生物分子募集到特定蛋白质、核酸、其它生物分子、细胞或细胞器(即，将两个细胞组件系栓在一起或使其紧密接近)的试剂。具体说来，本发明提供双功能肽，其中一个或两个结构域可经钉接或接结。所述双功能肽的一个结构域充当结合于靶的靶向部 分；另一结构域充当效应结构域以将蛋白质或蛋白质复合物募集到所述靶。效应结构域通 常作用于或改变靶的活性。实质上，双功能肽用于使两个蛋白质或其它生物分子彼此紧密 接近。靶向结构域、效应结构域或两个结构域可经钉接或接结以使所述肽的构象稳定。这 两个结构域经由连接子连接在一起，所述连接子的结构范围可为简单的共价键到双功能分 子到聚合物连接子。 [0008] 一方面，本发明提供一种双功能肽，其中靶向结构域和效应结构域中一者或两者经钉接或接结。本发明的双功能肽包括靶向结构域缔合效应结构域。必要时，每一肽包含 5到100个氨基酸以充当靶蛋白质的配体。必要时，所述肽可包括具有烯烃侧链的非天然 氨基酸以形成钉或接针，用于使肽的构象稳定。在某些实施例中，钉接或接结的肽是螺旋 肽。通常，这两个结构域通过连接子彼此共价缔合；但也可使用非共价缔合。在某些实施例中，双功能肽是SAH p53-8的钉接型式缔合Bcl-9的钉接型式。在其它实施例中，双功能肽 是SAH p53-8的钉接型式缔合Tcf4。所述本发明的双功能肽通过将E3泛素连接酶募集到 β-连环蛋白来促进β-连环蛋白降解。随后E3泛素连接酶催化β-连环蛋白泛素化，引 起蛋白酶体对其的降解。 [0009] 在某些实施例中，包含靶向结构域、连接子和效应结构域的发明性双功能钉接或接结肽是本发明的焦点。本发明提供双功能钉接或接结肽，以及其制备和使用方法。本发 明还提供包含本发明双功能钉接或接结肽和医药学上可接受的赋形剂的医药组合物。在某 些实施例中，本发明提供双功能、α螺旋钉接或接结肽，其中所述肽中至少一者是α螺旋 且通过钉接或接结来稳定。在某些实施例中，本发明的α-螺旋肽在生理条件下(例如在 个体体内，例如在胃肠道中；在血流中)保持其α-螺旋结构。 [0010] 在某些实施例中，包含靶向结构域、连接子和效应结构域的钉接或接结双功能肽一般布置如下： [0011] [0012] 其中A和E是肽或类肽；A和/或E是钉接或接结肽；且L是连接子(例如共价键；聚乙二醇(PEG)；基于氨基己酸的连接子；聚甘氨酸肽、单分散聚合物等)，且其中如果A是靶向结构域，那么E是效应结构域。 [0013] 一方面，本发明提供一种双功能钉接或接结肽，其中一个或两个结构域(即A或E)具有下式： [0014] [0015] 其中L1、L2、Ra、Rb、Re、Rf、RLL、XAA、s、t、q、z、j和 如本文所述。 [0016] 另一方面，本发明提供一种双功能接结肽，其中一个或两个结构域具有下式(即具有多个钉的肽)： [0017] [0018] 其中K、L1、L2、M、Ra、Rb、Re、Rf、RKL、RLL、RLM、XAA、y、z、j、p、s、t、u、v、q和如本文所述。 [0019] 所述结构域中一者或两者的氨基酸序列可与已知肽实质上类似或同源。在一些实施例中，靶向结构域结合蛋白质、核酸或其它生物分子。在某些实施例中，靶向结构域结合β-连环蛋白、c-Myc、Ras或缺氧诱导因子。在一些实施例中，效应结构域将酶募集到靶分子。在某些实施例中，效应结构域是泛素化酶(例如E3泛素连接酶)、糖基化酶、组蛋白去 乙酰化酶、组蛋白酰基转移酶、激酶、蛋白酶、法呢基转移酶(farnesyl transferase)、乙酰化酶或磷酸酶的配体。 [0020] 连接子可为蛋白质或非蛋白质的。连接子可简单为共价键(例如碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)，或者其可较为复杂，例如聚合物连接子(例如聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施例中，连接子包含氨基烷酸单体、二聚体或聚合物。在某些实施例中，连接子包含氨基烷酸(例如甘氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在某些实施例中，连接子包含氨基己酸(Ahx)单体、二聚体或聚合物。在 其它实施例中，连接子包含聚乙二醇部分(PEG)。在其它实施例中，连接子包含氨基酸。连接子可包括官能化部分，以便利将肽中的亲核基团(例如硫醇、氨基)附接到连接子。在某 些实施例中，连接子包括顺丁烯二酰亚胺基团。在某些实施例中，连接子包括NHS酯。在某些实施例中，连接子同时包括NHS酯和顺丁烯二酰亚胺基团。 [0021] 举一个例子，在钉接的双功能肽可用于治疗或研究疾病或其它生物过程的情况下，认为人类癌症中丧失内源性β-连环蛋白的降解。为了恢复β-连环蛋白的降解，使 用本发明的双功能钉接肽。双功能肽包括钉接的β-连环蛋白配体(例如Bcl-9或Tcf4) 缔合E3泛素连接酶配体(SAH p53-8)；由此将泛素化机器募集到待降解的β-连环蛋白。 β-连环蛋白在泛素连接酶作用下泛素化，导致其蛋白酶体受到破坏。所属领域技术人员将理解，使用此方法可靶向除β-连环蛋白外的供泛素化的蛋白质，和/或可将其它细胞机器 或酶募集到除泛素化机器外的靶。举例来说，可将例如激酶、磷酸酶、蛋白酶、糖基化酶、连接酶、乙酰化酶、脂肪酶等酶或酶复合物募集到靶蛋白质。使用本发明的双功能肽可促进几乎任何翻译后修饰，包括蛋白质降解。所述本发明的双功能肽可用于医药组合物中以治疗 个体(例如人类)的疾病。 [0022] 本发明还提供一种用于设计和制备双功能肽的系统。所述双功能肽的一个或两个结构域可为此项技术中已知。所述肽结构域可接着经修饰以增加其对靶蛋白质的亲和力。 肽也可经修饰以包括钉接或接结肽所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，可筛选具有各 种突变的肽文库以鉴别对靶蛋白质具有高亲和力的肽。所述文库可包括钉接或未钉接、接 结或未接结的肽。在某些实施例中，可使用靶蛋白质或已知蛋白质-蛋白质相互作用的结 构信息在计算机中设计肽结构域。在设计肽结构域时，可能需要确定在一级序列中何处放 置一个或一个以上钉和/或进行取代来得到较佳的双功能肽。设计的肽可使用此项技术中 已知用于评估结合亲和力、功能性、稳定性、药物动力学等的技术来分析所需活性。一旦设计出双功能肽，就可使用可用的肽化学进行制备。举例来说，可使用标准固相肽合成方法合成肽。可将必要或所需的非天然氨基酸(例如S5、R5、S8、R8)引入一级序列中。一旦合成肽，就将其与另一肽缔合，或者可一次性产生整个双功能肽。在肽与另一肽结构域缔合之前或 之后，其可经钉接、接结、脱除保护基或以其它方式修饰。 [0023] 本发明的双功能肽可用作治疗剂以及研究工具。在某些实施例中，使用本发明的双功能肽治疗个体的疾病(例如增生性疾病、神经退化性疾病)。举例来说，可使用本文所 述的Tcf4-SAH p53肽或Bcl-9-SAH p53肽(参看图8到11；SEQ ID NO：1-20)来治疗个体 的癌症。所属领域技术人员将理解，使用本发明的双功能肽可以治疗几乎任何疾病、病症或病况。所述双功能肽的效应和靶向结构域可经定制以用于特定用途。本发明的双功能肽也 可用作研究工具。举例来说，可使用所述双功能肽探查细胞中特定蛋白质的功能。增加降 解将使研究人员能够了解所述蛋白质的缺乏如何影响路径或细胞。促进磷酸化或其它二级 修饰将使研究人员能够了解蛋白质的状态如何影响其在生物路径或细胞中的作用。 [0025] 定义 [0026] 下文更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。出于本发明的目的，化学元素是根据元素周期表(Periodic Table of the Elements)，CAS版本，化学与物理手册 (Handbook of Chemistry and Physics)，第75版，封二来鉴别，且特定官能团一般如其 中所述来定义。此外，有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性描述于有机化学 (Organic Chemistry)，托马斯索瑞尔(Thomas Sorrell)，大学学报(University Science Books)，索萨利托(Sausalito)，1999；史密斯(Smith)和马奇(March)，马奇氏高等有机 化学(March′sAdvanced Organic Chemistry)，第5版，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，纽约(New York)，2001；拉洛克(Larock)，有机化学官能团转换大全(Comprehensive Organic Transformations)，VCH出版公司(VCH Publishers，Inc.)，纽 约，1989；卡卢瑟斯(Carruthers)，现代有机合成方法(Some Modern Methods of Organic Synthesis)，第3版，剑桥大学出版社(Cambridge University Press)，剑桥(Cambridge)， 1987中。 [0027] 本文中使用的“钉接”、“烃钉接”将至少两个能够经历反应以促进碳-碳键形成的部分引入肽中，其可与试剂接触以在所述至少两个部分之间产生至少一个交联剂。钉接对例如α螺旋结构等二级结构提供约束。交联剂的长度和几何形状可经优化以改良所需二 级结构含量的产率。提供的约束可例如防止二级结构展开和/或可加强二级结构的形状。 防止展开的二级结构例如更为稳定。 [0028] “钉接”肽是包含所选数量的标准或非标准氨基酸，进一步包含至少两个能够经历反应以促进碳-碳键形成的部分的肽，所述肽与试剂接触以在所述至少两个部分之间产生至少一个交联剂，其调节例如肽稳定性。 [0029] 本文中使用的“接结”肽是包含超过一个，即多个(两个、三个、四个、五个、六个等)交联部分的钉接肽。 [0030] 本发明的化合物、蛋白质或肽(例如氨基酸，以及未钉接、部分钉接和钉接肽和蛋白质，以及未接结、部分接结和接结肽和蛋白质)可以特定几何或立体异构形式存在。本发明涵盖在本发明的范围内的所有所述化合物，包括顺式和反式异构体、R-和S-对映异构 体、非对映异构体、(D)-和(L)-异构体、其外消旋混合物和其它混合物。 [0031] 尽管优选某一异构体/对映异构体，但在一些实施例中，可提供实质上不含相应对映异构体的化合物，并且也可将其称为“光学富集的(optically enriched)”。本文中 使用的“光学富集的”意思指化合物是由明显较高比例的一种对映异构体构成。在某些 实施例中，本发明化合物是由至少约90重量％的优选对映异构体构成。在其它实施例 中，化合物是由至少约95重量％、98重量％或99重量％的优选对映异构体构成。优选对 映异构体可借助于所属领域技术人员已知的任何方法，包括手性高压液相色谱(chiral high pressure liquid chromatography，HPLC)以及手性盐的形成和结晶，从外消旋混 合物中分离，或通过不对称合成法制备。参看例如，杰奎斯(Jacques)等人，对映异构 体、外消旋物和拆分(Enantiomers，Racemates and Resolutions)(威立公司在线出版 平台(Wiley Interscience)，纽约(New York)，1981)；威伦(Wilen)等人，四面体通讯 (Tetrahedron)33：2725(1977)；艾里尔(Eliel)，碳化合物的立体化学(Stereochemistry of Carbon Compounds)(麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，NY，1962)；威伦，拆分剂和光 学拆分表(Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions)第268页(E.L.艾 里尔(E.L.Eliel)编，圣母大学出版社(Univ.of Notre Dame Press)，印第安纳州圣母城 (Notre Dame，IN)1972)。 [0032] 应理解，本文中所述的本发明化合物可用许多取代基或官能部分取代。一般来说，术语“经取代”(无论前面是否加有术语“任选”)和本发明各式中所含取代基是指用指定取代基置换给定结构中的氢基。当任一给定结构中一个以上位置可经一个以上选自指定群 组的取代基取代时，各位置的取代基可相同或不同。本文中使用的术语“经取代”预期包括用有机化合物的所有允许取代基取代，所述取代基为使得形成稳定部分的本文所述的任何 取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基(thiooxo)、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基等)和其任何组合(例如脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等)。本发明涵盖任何和所有所述组合以便得到稳定的取代基/部分。一般适用的取代基的其它实例将通过本文所 述的实例中所示的特定实施例说明。出于本发明的目的，例如氮等杂原子可具有满足杂原 子的价态并使得形成稳定部分的氢取代基和/或本文所述的任何适合的取代基。 [0033] 本文中使用的加前缀“亚-”的取代基名称是指由去除取代基中的两个氢原子得到的二价基团。因此，例如酰基是亚酰基；烷基是亚烷基；烯基是亚烯基；炔基是亚炔基；杂烷基是亚杂烷基，杂烯基是亚杂烯基，杂炔基是亚杂炔基，芳基是亚芳基，且杂芳基是亚杂芳基。 [0034] 本文中使用的术语“酰基”是指具有通式-C(＝O)RA、-C(＝O)ORA、-C(＝A A A A A O)-O-C(＝O)R、-C(＝O)SR、-C(＝O)N(R)2、-C(＝S)R、-C(＝S)N(R)2和-C(＝S) A A A A A A A A A A S(R)、-C(＝NR)R、-C(＝NR)OR、-C(＝NR)SR 和-C(＝NR)N(R)2的基团，其中R 是 氢；卤素；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；取代或未取代的酰基；环状或无环、取代或未取代、分支或未分支的脂肪族基；环状或无环、取代或未取代、分支或未分支的杂脂肪族基；环状或无环、取代或未取代、分支或未分支的烷基；环状或无环、取代或未取代、分支或未分支的烯基；取代或未取代的炔基；取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、单-或二-脂肪族氨基、单-或二-杂脂肪族氨基、单-或二-烷基氨基、单-或二-杂烷基氨基、单-或二-芳 基氨基或单-或二-杂芳基氨基；或两个RA基团连在一起形成5元到6元杂环。示范性酰 基包括醛(-CHO)、羧酸(-CO2H)、酮、酰基卤化物、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。 酰基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族 基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0035] 术语“酰氧基”是指式(-ORi)的“经取代羟基”，其中Ri是任选取代的本文所定义的酰基，且氧部分直接附接到母分子。 [0036] 本文中使用的术语“亚酰基”是指具有以下通式的酰基：-R0-(C＝1 0 0 2 1 0 0 2 1 3 0 1 2 3 r X)-R-、-R-X(C＝X)-R-或-R-X(C＝X)X-R-，其中X、X 和X 独立地为氧、硫或NR， r 0 其中R 是氢或脂肪族基，且R 是任选取代的本文所定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷 0 基、亚杂烯基或亚杂炔基。示范性亚酰基(其中R 为亚烷基)包括-(CH2)T-O(C＝O)-(CH2) r r T r r T-；-(CH2)T-NR(C＝O)-(CH2)T-；-(CH2)T-O(C＝NR)-(CH2)T-；-(CH2)-NR(C＝NR)-(CH2) r T-；-(CH2)T-(C＝O)-(CH2)T-；-(CH2)T-(C＝NR)-(CH2)T-；-(CH2)T-S(C＝S)-(CH2)T-；-(CH2)r r T-NR(C＝S)-(CH2)T-；-(CH2)T-S(C＝NR)-(CH2)T-；-(CH2)T-O(C＝S)-(CH2)T-；-(CH2)T-(C＝S)-(CH2)T-；或-(CH2)T-S(C＝O)-(CH2)T-等，其可带有一个或一个以上取代基；且其中xx在各情况下独立地为0到20之间的整数。亚酰基可为环状或无环、分支或未分支、取代 或未取代的。亚酰基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基 (例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0037] 本文中使用的术语“脂肪族基”包括饱和和不饱和、非芳香族、直链(即，未分支)、分支、无环和环状(即碳环)烃，其任选经一个或一个以上官能团取代。所属领域技术人员将理解，“脂肪族基”在本文中拟包括(但不限于)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。因此，本文中使用的术语“烷基”包括直链、分支和环状烷基。类似惯例适用于例如“烯基”、“炔基”等其它一般术语。此外，本文中使用的术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等还涵盖取代和未取代的基团。在某些实施例中，本文中使用的“脂肪族基”用于指具有1到20个碳原子的脂肪族基团(环状、无环、取代、未取代、分支或未分支)。脂肪族基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0038] 本文中使用的术语“烷基”是指由含有介于1个与20个之间的碳原子的烃部分通过去除单个氢原子得到的饱和直链或分支烃基。在一些实施例中，本发明中使用的烷基含 有1到20个碳原子。在另一实施例中，所用烷基含有1到15个碳原子。在另一实施例中， 所用烷基含有1到10个碳原子。在另一实施例中，所用烷基含有1到8个碳原子。在另一 实施例中，所用烷基含有1到5个碳原子。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙 基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基等，其可带有一个或一个以上取代基。烷基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、 烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0039] 本文中使用的术语“亚烷基”是指由本文所定义的烷基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚烷基可为环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的。亚烷基取代基包 括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、 炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0040] 本文中使用的术语“烯基”表示由具有至少一个碳-碳双键的直链或分支烃部分通过去除单一氢原子得到的单价基团。在某些实施例中，本发明中使用的烯基含有2到20 个碳原子。在一些实施例中，本发明中使用的烯基含有2到15个碳原子。在另一实施例中，所用烯基含有2到10个碳原子。在其它实施例中，烯基含有2到8个碳原子。在其它实施 例中，烯基含有2到5个碳。烯基包括例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基 等，其可带有一个或一个以上取代基。烯基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的 本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0041] 本文中使用的术语“亚烯基”是指由本文所定义的烯基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚烯基可为环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的。亚烯基取代基包 括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、 炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0042] 本文中使用的术语“炔基”是指由具有至少一个碳-碳三键的直链或分支烃通过去除单一氢原子得到的单价基团。在某些实施例中，本发明中使用的炔基含有2到20个 碳原子。在一些实施例中，本发明中使用的炔基含有2到15个碳原子。在另一实施例中， 所用炔基含有2到10个碳原子。在其它实施例中，炔基含有2到8个碳原子。在其它实 施例中，炔基含有2到5个碳原子。代表性炔基包括(但不限于)乙炔基、2-丙炔基(炔 丙基)、1-丙炔基等，其可带有一个或一个以上取代基。炔基取代基包括(但不限于)使得 形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0043] 本文中使用的术语“亚炔基”是指由本文所定义的炔基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚炔基可为环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的。亚炔基取代基包 括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、 炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0044] 本文中使用的术语“氨基”是指式(-NH2)的基团。“经取代氨基”是指双取代胺h h h (-NR2)的单取代胺(-NHR)，其中R 取代基是使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基 (例如适合的氨基保护基；脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氨基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，h h 其各自可或可不进一步经取代)。在某些实施例中，双取代氨基(-NR2)的R 取代基形成5 元到6元杂环。 [0045] 术语“烷氧基”是指式(-ORi)的“经取代羟基”，其中Ri是任选取代的本文所定义的烷基，且氧部分直接附接到母分子。 [0046] 术语“烷硫基”是指式(-SRr)的“经取代硫醇”，其中Rr是任选取代的本文所定义的烷基，且硫部分直接附接到母分子。 [0047] 术语“烷氨基”是指式(-NRh2)的“经取代氨基”，其中Rh独立地为氢或任选取代的本文所定义的烷基，且氮部分直接附接到母分子。 [0048] 本文中使用的术语“芳基”是指具有3到20个环原子的稳定芳香族单环或多环系统，其中所有环原子都为碳且其可为取代或未取代的。在本发明某些实施例中，“芳基”是指具有1、2或3个芳香族环的单环、双环或三环C4-C20芳香族环系统，其包括(但不限于) 苯基、联苯、萘基等，其可带有一个或一个以上取代基。芳基取代基包括(但不限于)使得 形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0049] 本文中使用的术语“亚芳基”是指由本文所定义的芳基通过去除两个氢原子得到的芳基二价基团。亚芳基可为取代或未取代的。亚芳基取代基包括(但不限于)使得形 成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。此外，亚芳基可作为连接基团并入本文所定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基中。 [0050] 本文中使用的术语“芳烷基”是指芳基取代的烷基，其中术语“芳基”和“烷基”如本文所定义，且其中芳基附接到烷基，烷基又附接到母分子。示范性芳烷基包括苯甲基。 [0051] 术语“芳氧基”是指式(-ORi)的“经取代羟基”，其中Ri是任选取代的本文所定义的芳基，且氧部分直接附接到母分子。 [0052] 术语“芳基氨基”是指式(-NRh2)的“经取代氨基”，其中Rh独立地为氢或任选取代的本文所定义的芳基，且氮部分直接附接到母分子。 [0053] 术语“芳硫基”是指式(-SRr)的“经取代硫醇”，其中Rr是任选取代的本文所定义的芳基，且硫部分直接附接到母分子。 [0054] 本文中使用的术语“叠氮基”是指式(-N3)的基团。 [0055] 本文中使用的术语“氰基”是指式(-CN)的基团。 [0056] 本文中使用的术语“卤基”和“卤素”是指选自氟(氟基，-F)、氯(氯基，-Cl)、溴(溴基，-Br)和碘(碘基，-I)的原子。 [0057] 本文中使用的术语“杂脂肪族基”是指包括饱和和不饱和、非芳香族、直链(即，未分支)、分支、无环、环状(即杂环)或多环烃；任选经一个或一个以上官能团取代；且含有一个或一个以上氧、硫、氮、磷或硅原子例如代替碳原子的本文所定义的脂肪族部分。在某些实施例中，杂脂肪族部分通过用一个或一个以上取代基独立置换其上一个或一个以上氢原子来进行取代。所属领域技术人员将理解，“杂脂肪族基”在本文中拟包括(但不限于) 杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基和杂环炔基部分。因此，术语“杂脂肪族基”包括术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”等。此外，本文中使用的术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”等还涵盖取代和未取代的基团。在某些实施例中，本文中使用的“杂脂肪族基”用于指具有1到20个碳原子的杂脂肪族基团(环状、无环、取代、未取代、分支或未分支)。杂脂肪族基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族 基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、亚磺酰基、磺酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0058] 本文中使用的术语“杂烷基”是指含有一个或一个以上氧、硫、氮、磷或硅原子例如代替碳原子的本文所定义的烷基部分。 [0059] 本文中使用的术语“亚杂烷基”是指由本文所定义的杂烷基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚杂烷基可为环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的。亚杂烷基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、 烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0060] 本文中使用的术语“杂烯基”是指含有一个或一个以上氧、硫、氮、磷或硅原子例如代替碳原子的本文所定义的烯基部分。 [0061] 本文中使用的术语“亚杂烯基”是指由本文所定义的杂烯基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚杂烯基可为环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的。 [0062] 本文中使用的术语“杂炔基”是指含有一个或一个以上氧、硫、氮、磷或硅原子例如代替碳原子的本文所定义的炔基部分。 [0063] 本文中使用的术语“亚杂炔基”是指由本文所定义的杂炔基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚杂炔基可为环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的。 [0064] 术语“杂烷基氨基”是指式(-NRh2)的“经取代氨基”，其中Rh独立地为氢或任选取代的本文所定义的杂烷基，且氮部分直接附接到母分子。 [0065] 术语“杂烷氧基”是指式(-ORi)的“经取代羟基”，其中Ri是任选取代的本文所定义的杂烷基，且氧部分直接附接到母分子。 [0066] 术语“杂烷硫基”是指式(-SRr)的“经取代硫醇”，其中Rr是任选取代的本文所定义的杂烷基，且硫部分直接附接到母分子。 [0067] 本文中使用的术语“杂环的”、“杂环”或“杂环基”是指环状杂脂肪族基团。杂环基是指非芳香族、部分不饱和或完全饱和的3元到10元环系统，其包括大小为3到8个原子的单环，以及可包括芳香族5元或6元芳基或杂芳基与非芳香族环稠合的双环和三环系统。 这些杂环包括具有1到3个独立选自氧、硫和氮的杂原子者，其中氮和硫杂原子可任选氧 化，且氮杂原子可任选季铵化。在某些实施例中，术语杂环基是指非芳香族5元、6元或7元环或者多环基团，其中至少一个环原子是选自O、S和N的杂原子(其中氮和硫杂原子可任 选氧化)，且其余环原子为碳，所述基团经由任一环原子接合到分子的其余部分。杂环基包括(但不限于)包含具有介于1个与3个之间的独立选自氧、硫和氮的杂原子的稠合5元、 6元或7元环的双环或三环系统，其中(i)每一5元环具有0到2个双键，每一6元环具有 0到2个双键，且每一7元环具有0到3个双键；(ii)氮和硫杂原子可任选氧化；(iii)氮 杂原子可任选季铵化；且(iv)上述任一杂环可与芳基或杂芳基环稠合。示范性杂环包括氮 杂环丙基、氮杂环丁基、1，3-二氮杂环丁基、哌啶基、哌嗪基、氮杂环辛基(azocanyl)、硫杂环丁基(thiaranyl)、硫杂环丁基(thietanyl)、四氢噻吩基、二硫杂环戊基、硫杂环己基、环氧乙基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基(tetrahydropuranyl)、二噁烷基、氧硫杂环戊基、吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、四氢萘基等，其可带有一个或一个以上取代基。取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、 烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、亚磺酰基、磺酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0068] 本文中使用的术语“杂芳基”是指具有3到20个环原子的稳定芳香族单环或多环系统，其中一个环原子选自S、O和N；0、1或2个环原子为独立选自S、O和N的额外杂 原子；且其余环原子为碳，所述基团经由任一环原子接合到分子其余部分。示范性杂芳基 包括(但不限于)吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基(pyyrolizinyl)、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹嗪基、噌啉基、喹唑啉基(quinazolynyl)、酞嗪基、萘啶基(naphthridinyl)、喹喔啉基、噻吩基、硫茚基(thianaphthenyl)、呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、噻唑啉基(thiazolynyl)、异噻唑基、噻二唑啉基(thiadiazolynyl)、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(oxadiaziolyl)、噁二唑基(oxadiaziolyl)等，其可带有一个或一个以上取代基。杂芳基 取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷 基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、亚磺酰基、磺酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0069] 本文中使用的术语“亚杂芳基”是指由本文所定义的杂芳基通过去除两个氢原子得到的二价基团。亚杂芳基可为取代或未取代的。此外，亚杂芳基可作为连接基团并入本 文所定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基中。亚杂芳基取代基包括(但不限于)使得形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如脂肪族基、烷基、烯基、 炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫酮基、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤基、脂肪族氨基、杂脂肪族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂肪族氧基、杂脂肪族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂肪族硫基、杂脂肪族硫基、烷硫基、杂烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、酰氧基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0070] 术语“杂芳基氨基”是指式(-NRh2)的“经取代氨基”，其中Rh独立地为氢或任选取代的本文所定义的杂芳基，且氮部分直接附接到母分子。 [0071] 术语“杂芳氧基”是指式(-ORi)的“经取代羟基”，其中Ri是任选取代的本文所定义的杂芳基，且氧部分直接附接到母分子。 [0072] 术语“杂芳硫基”是指式(-SRr)的“经取代硫醇”，其中Rr是任选取代的本文所定义的杂芳基，且硫部分直接附接到母分子。 [0073] 本文中使用的术语“羟基(hydroxy/hydroxyl)”是指式(-OH)的基团。“经取代羟i i基”是指式(-OR)的基团，其中R 可为产生稳定部分的任何取代基(例如，适合的羟基保护 基；脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、硝基、烷芳基、芳烷基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0074] 本文中使用的术语“亚氨基”是指式(＝NRr)的基团，其中Rr对应于氢或使得形成稳定部分的本文所述任何取代基(例如适合的氨基保护基；脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、氨基、羟基、烷芳基、芳烷基等，其各自可或可不进一步经取代)。 [0075] 本文中使用的术语“异氰基”是指式(-NC)的基团。 [0076] 本文中使用的术语“硝基”是指式(-NO2)的基团。 [0077] 本文中使用的术语“氧代”是指式(＝O)的基团。 [0078] 本文中使用的术语“树脂”是指适用于固相合成的树脂。固相合成是众所周知的合成技术；一般参看艾瑟顿E.(Atherton，E.)，夏帕德R.C.(Sheppard，R.C.)，固相肽合成：实践方法(Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach)，IRL出版社，牛津(Oxford)，英格兰(England)，1989；和斯特沃特J.M.(Stewart J.M.)，杨J.D.(Young，J.D.)，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，第2版，皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company)，罗克福德(Rockford)，1984，其各自的完整内容以引用的方式并入本文中。本发明可使用的示范性树脂包括(但不限于)： [0079] (1)烯基树脂(例如REM树脂、乙烯基砜聚合物结合的树脂、乙烯基-聚苯乙烯树脂)； [0080] (2)胺官能化树脂(例如脒树脂、N-(4-苯甲氧基苯甲基)羟基胺聚合物结合、(氨基甲基)聚苯乙烯聚合物结合的(R)-(+)-a-甲基苯甲胺、2-氯三苯甲基科诺树脂(Knorr resin)、2-N-Fmoc-氨基-二苯并环庚-1，4-二烯聚合物结合的树脂、4-[4-(1-Fmoc-氨基 乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酰胺基甲基-聚苯乙烯树脂、4-苯甲氧基苯甲胺聚合 物结合、4-羧基苯磺酰胺聚合物结合、双(叔丁氧羰基)异硫脲聚合物结合、二甲基氨基甲 基-聚苯乙烯、Fmoc-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸聚合物结合、N-甲基氨基甲基化聚苯 乙烯、PAL树脂、希博(Sieber)酰胺树脂、N-(2-巯基乙基)氨基甲酸叔丁酯聚合物结合、三苯基氯甲烷-4-甲酰胺聚合物结合)； [0081] (3)二苯甲胺(BHA)树脂(例如2-氯二苯甲氯聚合物结合、HMPB-二苯甲胺聚合物结合、4-甲基二苯基甲醇聚合物结合、二苯甲氯聚合物结合、二苯甲胺聚合物结合)； [0082] (4)Br官能化树脂(例如4-(苯甲氧基)苯甲基溴聚合物结合、4-溴聚苯乙烯、溴化PPOA树脂、溴化王树脂(Wang resin)、溴乙缩醛聚合物结合、溴聚苯乙烯、 200Br、用于肽合成的聚苯乙烯A-Br、溴化硒聚合物结合、特塔吉尔(TentaGel)HL-Br、特塔吉尔MB-Br、特塔吉尔S-Br、特塔吉尔S-Br)； [0083] (5)氯甲基树脂(例如5-[4-(氯甲基)苯基]戊基]苯乙烯聚合物结合、4-(苯甲氧基)苯甲基氯聚合物结合、4-甲氧基二苯甲氯聚合物结合)； [0084] (6)CHO官能化树脂(例如(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯、(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯、3-苯甲氧基苯甲醛聚合物结合、4-苯甲氧基-2， 6-二甲氧基苯甲醛聚合物结合、甲酰基聚苯乙烯、 200 CHO、吲哚树脂、聚苯乙烯 A-CH(OEt)2、特塔吉尔HL-CH(OEt)2)； [0085] (7)Cl官能化的树脂(例如苯甲酰氯聚合物结合、(氯甲基)聚苯乙烯、玛丽菲尔德氏树脂(Merrifield′s resin))； [0086] (8)CO2H官能化的树脂(例如羧乙基聚苯乙烯、 200 COOH、聚苯乙烯AM-COOH、特塔吉尔HL-COOH、特塔吉尔MB-COOH、特塔吉尔S-COOH)； [0087] (9)Hypo-Gel树脂(例如 200 FMP、 200 PHB、200Trt-OH、 200 HMB)； [0088] (10)I官能化的树脂 (例如4-碘苯酚聚合 物结合、碘聚苯乙 烯)；TM Janda-Jels ( - 林 克 酰 胺 (Rink amide)、JandaJel-NH2、JandaJel-Cl、 JandaJel-4-巯基苯酚、JandaJel-OH、JandaJel-1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化 二亚胺、JandaJel-1，3，4，6，7，8-六氢-2H-嘧啶并-[1，2-a]嘧啶、JandaJel-吗啉、 JandaJel-聚吡啶、JandaJel-三苯基膦、JandaJel-王(Wang))； [0089] (11)MBHA树脂(3[4′-(羟甲基)苯氧基]丙酸-4-甲基二苯甲胺树脂、4-(羟甲基)苯氧基乙酸聚合物结合的MBHA树脂、HMBA-4-甲基二苯甲胺聚合物结合、4-甲基二苯 甲胺盐酸盐聚合物结合的卡帕西提(Capacity)(胺))； [0090] (12)NH2官能化的树脂((氨基甲基)聚苯乙烯、(氨基甲基)聚苯乙烯、200NH2、聚苯乙烯AM-NH2、聚苯乙烯微球2-氨基乙基化、聚苯乙烯(Polystyrol)微球2-溴 乙基化、聚苯乙烯微球2-羟基乙基化、特塔吉尔HL-NH2、特塔吉尔M Br、特塔吉尔M NH2、特塔吉尔M OH、特塔吉尔MB-NH2、特塔吉尔S-NH2、特塔吉尔S-NH2)； [0092] (14)肟树脂(例如4-氯二苯甲酮肟聚合物结合、二苯甲酮肟聚合物结合、4-甲氧基二苯甲酮肟聚合物结合)； [0093] (15)PEG树脂(例如乙二醇聚合物结合)； [0094] (16)Boc-/Blz肽合 成树 脂(例如 Boc-Lys(Boc)-Lys[Boc-Lys(Boc)]-Cys(Acm)-b-Ala-O-PAM 树 脂、Boc-Lys(Fmoc)-Lys[Boc-Lys(Fmoc)]-b-Ala-O-Pam 树 脂、Bo c-Lys(Boc)-Lys[Boc-Lys(Boc)]-Lys{Boc-Lys(Boc)-Lys[Boc-Lys(Boc)]}-b-Ala-O- PA M 树 脂、Boc-Lys(Fmoc)-Lys[Boc-Lys(Fmoc)]-Lys{Boc-Lys(Fmoc)-Lys[Boc-Lys (Fmoc)]}-b-Ala-O-PAM树脂、Boc-Lys(Boc)-Lys[Boc-Lys(Boc)]-Lys{Boc-Lys(Boc)-Lys[ Boc-Lys(Boc)]}-Cys(Acm)-b-Ala-O-PAM树脂、预载PAM树脂(Preloaded PAM resins))； [0095] (17)Fmoc-/t-Bu肽合成树脂(例如Fmoc-Lys(Fmoc)-Lys[Fmoc-Lys(Fmoc)]-b-Ala-O-王树脂、Fmoc-Lys(Fmoc)-Lys[Fmoc-Lys(Fmoc)]-Lys{Fmoc-Lys(Fmoc)-Lys[Fmoc-Lys (Fmoc)]}-b-Ala-O-王树脂、预载特塔吉尔 S( S)三苯甲基树脂、预载特塔吉尔 树脂、预载三苯甲基树脂、预载王树脂、预载有氨基醇的三苯甲基树脂)； [0096] (19)硫醇官能化的树脂(例如 200 S-Trt、聚苯乙烯AM-S-三苯甲基、特塔吉尔HL-S-三苯甲基、特塔吉尔MB-S-三苯甲基、特塔吉尔S-S-三苯甲基)；和 [0097] (20) 王 树 脂 ( 例 如 Fmoc-Ala- 王 树 脂、Fmoc-Arg(Pbf)- 王 树 脂、Fmoc-Arg(Pmc)- 王 树 脂、Fmoc-Asn(Trt)- 王 树 脂、Fmoc-Asp(OtBu)- 王 树 脂、 Fmoc-Cys(Acm)- 王 树 脂、Fmoc-Cys(StBu)- 王 树 脂、Fmoc-Cys(Trt) 王 树 脂、 Fmoc-Gln(Trt)-王树脂、Fmoc-Glu(OtBu)-王树脂、Fmoc-Gly-王树脂、Fmoc-His(Trt)-王 树脂、Fmoc-Ile-王树脂、Fmoc-Leu-王树脂、Fmoc-Lys(Boc)-王树脂、Fmoc-Met-王树 脂、Fmoc-D-Met-王树脂、Fmoc-Phe-王树脂、Fmoc-Pro-王树脂、Fmoc-Ser(tBu)-王树脂、Fmoc-Ser(Trt)-王树脂、Fmoc-Thr(tBu)-王树脂、Fmoc-Trp(Boc)王树脂、Fmoc-Trp-王树 脂、Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂、Fmoc-Val-王树脂)。 [0098] 本文中使用的术语“稳定部分”优选是指具有足以允许制造的稳定性且维持其完整性足够时间以适用于本文所详述的目的的部分。 [0099] 本文中使用的“适合的氨基保护基”是此项技术中众所周知的且包括有机合成中的保护基(Protecting Groups in Organic Synthesis)，T.W.格里尼(T.W.Greene)和 P.G.M.伍兹(P.G.M.Wuts)，第3版，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons)，1999中 详细描述者，所述文献的全文以引用的方式并入本文中。适合的氨基保护基包括氨基甲酸 甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基 甲酸9-(2，7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2，7-二叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10， 10-四氢噻吨基)]甲酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸4-甲氧基苯甲酰甲酯(Phenoc)、氨基甲酸 2，2，2-三氯乙酯(Troc)、氨基甲酸2-三甲基硅烷基乙酯(Teoc)、氨基甲酸2-苯基乙酯 (hZ)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1，1-二甲基-2-卤基乙 酯、氨基甲酸1，1-二甲基-2，2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、氨基甲酸1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙酯(TCBOC)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3，5-二叔丁 基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸2-(2′-和4′-吡啶基)乙酯(Pyoc)、氨基 甲酸2-(N，N-二环己基甲酰胺基)乙酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸1-金刚烷基酯 (Adoc)、氨基甲酸乙烯基酯(Voc)、氨基甲酸烯丙基酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙基 酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂基酯(Coc)、氨基甲酸4-硝基肉桂基酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉 基酯、氨基甲酸N-羟基哌啶基酯、烷基二硫氨基甲酸酯、氨基甲酸苯甲酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苯甲酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苯甲酯、氨基甲酸对溴苯甲酯、氨基甲酸对氯苯甲酯、氨基甲酸2，4-二氯苯甲酯、氨基甲酸4-甲基亚磺酰基苯甲酯(Msz)、氨基甲酸9-蒽基 甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸2-甲基硫乙酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙酯、氨基甲酸[2-(1，3-二噻烷基)]甲酯(Dmoc)、氨基甲酸4-甲 基硫苯酯(Mtpc)、氨基甲酸2，4-二甲基硫苯基酯(Bmpc)、氨基甲酸2-磷鎓基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2-三苯基磷鎓基异丙酯(Ppoc)、氨基甲酸1，1-二甲基-2-氰基乙酯、氨基甲酸 间氯-对酰氧基苯甲酯、氨基甲酸对-(二羟基氧硼基)苯甲酯、氨基甲酸5-苯并异噁唑 基甲酯、氨基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯酯、氨基甲酸 3，5-二甲氧基苯甲酯、氨基甲酸邻硝基苯甲酯、氨基甲酸3，4-二甲氧基-6-硝基苯甲酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲酯、苯并噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N′-对甲苯磺酰基 氨基羰基衍生物、N′-苯基氨基硫羰基衍生物、氨基甲酸叔戊基酯、硫代氨基甲酸S-苯甲 酯、氨基甲酸对氰基苯甲酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、氨基甲酸环丙基甲酯、氨基甲酸对癸氧基苯甲酯、氨基甲酸2，2-二甲氧基羰基乙烯基酯、氨基甲酸邻-(N，N-二甲基甲酰胺基)苯甲酯、氨基甲酸1，1-二甲基-3-(N，N-二甲基甲酰胺基) 丙酯、氨基甲酸1，1-二甲基丙炔基酯、氨基甲酸二(2-吡啶基)甲酯、氨基甲酸2-呋喃基 甲酯、氨基甲酸2-碘乙酯、氨基甲酸异冰片基酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟碱基酯、氨基甲酸p-(p′-甲氧基苯基偶氮)苯甲酯、氨基甲酸1-甲基环丁酯、氨基甲酸1-甲基 环己酯、氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲酯、氨基甲酸1-甲基-1-(3，5-二甲氧基苯基)乙 酯、氨基甲酸1-甲基-1-(对苯基偶氮苯基)乙酯、氨基甲酸1-甲基-1-苯基乙酯、氨基 甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙酯、氨基甲酸苯酯、氨基甲酸对(苯基偶氮)苯甲酯、氨基 甲酸2，4，6-三叔丁基苯酯、氨基甲酸4-(三甲基铵)苯甲酯、氨基甲酸2，4，6-三甲基苯 甲酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶甲酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N′-二硫苯甲氧基羰基氨基)乙 酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙 酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻 硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰 胺、4，5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫代琥珀酰亚胺(Dts)、N-2， 3-二苯基顺丁烯二酰亚胺、N-2，5-二甲基吡咯、N-1，1，4，4-四甲基二硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1，3-二甲基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1，3-二苯 甲基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3，5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙基 胺、N-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝 基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苯甲胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二 苯并环庚基胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯 基芴基胺(PhF)、N-2，7-二氯-9-芴基亚甲基胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲 基氨基N′-氧化物、N-1，1-二甲基硫亚甲基胺、N-苯亚甲基胺、N-对甲氧基苯亚甲基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)均三甲苯基]亚甲基胺、N-(N′，N′-二甲基氨基亚 甲基)胺、N，N′-亚异丙基二胺、N-对硝基苯亚甲基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基 胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5，5-二甲基-3-氧代-1-环 己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸(borinic acid)衍生物、N-[苯基(五羰基 铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝基胺、胺N-氧化物、二 苯基膦酰胺(Dpp)、二甲基硫代膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、氨基磷酸二烷酯、氨基磷酸二苯甲酯、氨基磷酸二苯酯、苯亚磺酰胺、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2，4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、3-硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2，3，6，-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2，4，6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2，6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2，3，5， 6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2，4，6-三甲基苯磺酰胺 (Mts)、2，6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基硅烷基乙烷磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4′，8′-二甲氧 基萘甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苯甲基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。 [0100] 本文中使用的“适合的羧酸保护基”或“经保护的羧酸”是此项技术中众所周知的且包括格里尼(1999)中详细描述者。适当保护的羧酸的实例进一步包括(但不限于)硅烷基-、烷基-、烯基-、芳基-和芳烷基-保护的羧酸。适合的硅烷基的实例包括三甲基硅 烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三异丙基硅烷基等。适合的烷基的实例包括甲基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3，4-二甲氧基苯甲基、三苯甲基、叔丁基、四氢吡喃-2-基。适合的烯基的实例包括烯丙基。适合的芳基的实例包括任选取代 的苯基、联苯或萘基。适合的芳烷基的实例包括任选取代的苯甲基(例如对甲氧基苯甲基 (MPM)、3，4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤基苯甲基、2，6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基)以及2-和4-吡啶甲基。 [0101] 本文中使用的“适合的羟基保护基”是此项技术中众所周知的且包括有机合成中的保护基，T.W.格里尼和P.G.M.伍兹，第3版，约翰威立父子出版公司，1999中详细描述 者，所述文献的全文以引用的方式并入本文中。适合的羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基 (MOM)、甲基硫甲基(MTM)、叔丁基硫甲基、(苯基二甲基硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苯甲 氧基甲基(BOM)、对甲氧基苯甲氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对AOM)、愈创 木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2，2，2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基硅烷基)乙氧基 甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢硫吡喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢硫吡喃基、4-甲氧基四氢硫吡喃基S，S-二氧化物、 1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1，4-二噁烷-2-基、四氢呋喃 基、四氢噻吩基、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8-三甲基-4，7-亚甲基苯并呋喃-2-基、 1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苯甲氧基乙 基、1-甲基-1-苯甲氧基-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、2-(苯基氧硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2，4-二硝基苯基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3，4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤基苯甲基、2，6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基、对苯基苯甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧离子基、二苯基甲基、p，p′-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基) 甲基、4-(4′-溴苯甲酰甲基氧基苯基)二苯基甲基、4，4′，4″-三(4，5-二氯邻苯二甲 酰亚胺基苯基)甲基、4，4′，4″-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4，4′，4″-三(苯甲 酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4′，4″-二甲氧基苯基)甲基、1，1-双(4-甲 氧基苯基)-1′-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)氧杂蒽基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽 基、1，3-苯并二硫杂环戊-2-基、苯并异噻唑基S，S-二氧离子基、三甲基硅烷基(TMS)、三乙基硅烷基(TES)、三异丙基硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基 硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基硅烷 基(TBDPS)、三苯甲基硅烷基、三-对二甲苯基硅烷基、三苯基硅烷基、二苯基甲基硅烷基 (DPMS)、叔丁基甲氧基苯基硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4，4-(亚乙基二硫)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、新戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯(均三苯甲酸酯)、碳酸烷基甲基酯、碳酸9-芴基甲基酯(Fmoc)、碳酸烷基乙基酯、碳酸烷基2，2，2-三氯乙基酯(Troc)、碳酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯(TMSEC)、碳酸2-(苯基磺酰基)乙基酯(Psec)、碳酸2-(三苯基磷鎓基)乙基 酯(Peoc)、碳酸烷基异丁基酯、碳酸烷基乙烯基酯碳酸烷基烯丙基酯、碳酸烷基对硝基苯基酯、碳酸烷基苯甲基酯、碳酸烷基对甲氧基苯甲基酯、碳酸烷基3，4-二甲氧基苯甲基酯、碳酸烷基邻硝基苯甲基酯、碳酸烷基对硝基苯甲基酯、硫代碳酸烷基S-苯甲基酯、碳酸4-乙 氧基-1-萘基酯、二硫代碳酸甲基酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、戊酸4-硝基-4-甲 基酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫甲氧基)乙基、4-(甲基硫 甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫甲氧基甲基)苯甲酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2， 6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-双(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、乙酸氯二苯基酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、二氨基磷酸烷基N，N，N′，N′-四甲基酯、N-苯基氨基甲酸烷基酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、次磺酸烷基2，4-二硝基苯基酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苯甲基磺酸酯和甲苯磺酸酯(Ts)。为保护1，2-或1，3-二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩 醛、2，2，2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、苯亚甲基缩醛、对甲氧基苯亚甲基缩醛、2，4-二甲氧基苯亚甲基缩酮、3，4-二甲氧基苯亚甲基缩醛、2-硝基苯亚甲基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1，2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基苯亚甲基原酸酯、1-(N，N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N，N′-二甲基氨基)苯 亚甲基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基亚硅烷基(DTBS)、1，3-(1，1，3，3-四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(TIPDS)、四叔丁氧基二硅氧烷-1，3-二亚基衍生物(TBDS)、环状 碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙酯和硼酸苯酯。 [0102] 本文中使用的“适合的硫醇保护基”是此项技术中众所周知的且包括有机合成中的保护基，T.W.格里尼和P.G.M.伍兹，第3版，约翰威立父子出版公司，1999中详细描述 者，所述文献的全文以引用的方式并入本文中。适当保护的硫醇基的实例进一步包括(但 不限于)硫酯、碳酸酯、磺酸酯烯丙基硫醚、硫醚、硅烷基硫醚、烷基硫醚、芳烷基硫醚和烷氧基烷基硫醚。适合的酯基的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、戊酸酯、巴豆酸酯和苯甲酸酯。适合的酯基的具体实例包括甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4，4-(亚乙基二硫)戊酸酯、新戊酸酯(三甲基乙酸酯)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯甲基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯。适合的碳酸酯的实例包括9-芴基甲基、乙基、2， 2，2-三氯乙基、2-(三甲基硅烷基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、乙烯基、烯丙基和对硝基苯甲基碳酸酯。适合的硅烷基的实例包括三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三异丙基硅烷基醚和其它三烷基硅烷基醚。适合的烷基的实例包括甲基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3，4-二甲氧基苯甲基、三苯甲基、叔丁基和烯丙基醚或其盐生物。适合的芳烷基的实例包括苯甲基、对甲氧基苯甲基(MPM)、3，4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤基苯甲基、2，6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基、2-和4-吡啶甲基醚。 [0103] 本文中使用的术语“硫基”或“硫醇”是指式(-SH)的基团。“经取代的硫醇”是指r r式(-SR)的基团，其中R 可为使得形成稳定部分的任何取代基(例如，适合的硫醇保护基； 脂肪族基、烷基、烯基、炔基、杂脂肪族基、杂环基、芳基、杂芳基、酰基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、烷芳基、芳烷基等，其各自可或可不经进一步取代)。 [0104] 本文中使用的术语“硫酮基”是指式(＝S)的基团。 [0105] 本文中使用的“其医药学上可接受的形式”包括如下文和本文中所定义的本发明化合物的任何医药学上可接受的盐、前药、互变异构体、对映异构体、非对映异构体、立体异构体、异构体和/或多晶型物。 [0106] 本文中使用的术语“医药学上可接受的盐”是指在合理医学判断的范围内，适于与人类和低等动物组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等且与合理的效益/风险比相称的盐。此项技术中众所周知医药学上可接受的盐。举例来说，伯格(Berge)等人于药 物科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences)，1977，66，1-19中详细描述了医药学上可接受的盐；所述文献是以引用的方式并入本文中。本发明化合物的医药学上可接受的盐包括衍 生自适合的无机和有机酸和碱的盐。医药学上可接受的无毒酸加成盐的实例为氨基与例如 盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸等无机酸或与例如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等有机酸形成的盐，或通过使用例如离子交换法等此项技术中使用的 其它方法形成的盐。其它医药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属+ 盐、铵盐和N(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。适当时，其它医药学上可接受的盐包括使用例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳数烷基磺酸根和芳基磺酸根等平衡离子形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。 [0107] 本文中使用的术语“前药”是指需要在体内转化以便释放母体化合物的母体化合物衍生物。在某些情况下，前药具有优于母体化合物的改良的物理和/或递送特性。前药通常经设计以增强与母体化合物相关的基于医药学和/或药代动力学的特性。前药的益处可 在于其物理特性，例如对于不经肠投药，在生理pH值下相比母体化合物增强的水溶性；或 其增强消化道的吸收；或其可增加长期储存的药物稳定性。近年来，已经探索数种类型的生物可逆衍生物以用于设计前药。此项技术中已知使用酯作为含有羧基或羟基官能团的化合 物的前药类型，如例如“药物设计和药物相互作用的有机化学(The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Interaction)”，理查德希尔曼(Richard Silverman)，学术出版社(Academic Press)出版(1992)中所述。 [0108] 本文中使用的术语“互变异构体”包括两种或两种以上可相互转化的化合物，其是由氢原子的至少一种形式迁移(formal migration)和至少一种价态改变(例如，单键变为双键、三键变为双键，或反之亦然)所产生。互变异构体的确切比率取决于包括温度、溶剂和pH值在内的数种因素。互变异构作用(即，提供互变异构对的反应)可由酸或碱催化。 示范性互变异构作用包括酮-烯醇；酰胺-酰亚胺；内酰胺-内酰亚胺；烯胺-亚胺；和烯 胺-(不同的)烯胺互变异构作用。 [0109] 本文中使用的术语“异构体”包括任何和所有几何异构体和立体异构体。举例来说，“异构体”包括在本发明范围内的顺-和反-异构体、E-和Z-异构体、R-和S-对映异 构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及其其它混合物。举例 来说，在一些实施例中，可提供实质上无对应的对映异构体的异构体/对映异构体，且其也可称为“光学富集的”。本文中使用的“光学富集的”意思指化合物是由明显较高比例的一种对映异构体构成。在某些实施例中，本发明化合物是由至少约90重量％的优选对映异 构体构成。在其它实施例中，化合物是由至少约95重量％、98重量％或99重量％的优选 对映异构体构成。优选对映异构体可借助于所属领域技术人员已知的任何方法，包括手性 高压液相色谱(HPLC)以及手性盐的形成和结晶，从外消旋混合物中分离，或通过不对称合 成法制备。参看例如杰奎斯(Jacques)等人，对映异构体、外消旋物和拆分(Enantiomers，Racemates and Resolutions)(威立公司在线出版平台(Wiley Interscience)，纽约(New York)，1981)；威伦S.H.(Wilen，S.H.)等人，四面体通讯(Tetrahedron)33：2725(1977)； 艾里尔E.L.(Eliel，E.L.)碳化合物的立体化学(Stereochemistry of Carbon Compounds) (麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，NY，1962)；威伦S.H.(Wilen，S.H.)拆分剂和光学拆分表(Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions)第268页(E.L.艾里尔编，圣 母大学出版社(Univ.of Notre Dame Press)，印第安纳州圣母城(Notre Dame，IN)1972)。 [0110] 术语“氨基酸”是指含有氨基和羧基的分子。氨基酸包括α-氨基酸和β-氨基酸，其结构描绘如下。在某些实施例中，氨基酸是α-氨基酸。 [0111] [0112] 适合的氨基酸包括(不限于)天然α-氨基酸，例如肽和蛋白质中所见20种常见的天然存在的α-氨基酸的D-和L-异构体(例如A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V，如下表1中所描绘)、非天然α-氨基酸(如下表2和3中所描绘)、天然 β-氨基酸(例如β-丙氨酸)和非天然β-氨基酸。 [0113] 本发明的肽构造中所用氨基酸可通过有机合成制备，或通过其它途径获得，例如由天然来源降解或分离。在本发明某些实施例中，式-[XAA]-对应于具有以下各式的天然和/或非天然氨基酸： [0114] [0115] 其中R和R′对应适合的氨基酸侧链(如本文所定义)且Ra如本文中所定义。 [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] 存在许多已知的非天然氨基酸，其中任一者都可包括在本发明的肽中。参看例如，S.汉特(S.Hunt)，非蛋白质氨基酸：氨基酸的化学和生物化学(The Non-Protein Amino Acids：In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids)，G.C.巴雷 特 (G.C.Barrett)，查普曼(Chapman)和霍尔(Hall)编辑，1985。非天然氨基酸的一些实例为 4-羟基脯氨酸、锁链素(desmosine)、γ-氨基丁酸、β-氰基丙氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基-L-苏氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、1-氨基-环丙烷甲酸、1-氨 基-2-苯基-环丙烷甲酸、1-氨基-环丁烷甲酸、4-氨基-环戊烯甲酸、3-氨基-环己烷甲 酸、4-哌啶基乙酸、4-氨基-1-甲基吡咯-2-甲酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2， 4-二氨基丁酸、2-氨基庚二酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨基苯甲酸、邻-、间-和对-取 代的苯丙氨酸(例如经-C(＝O)C6H5；-CF3；-CN；-卤基；-NO2；-CH3取代)、双取代的苯丙氨酸、取代的酪氨酸(例如经-C(＝O)C6H5；-CF3；-CN；-卤基；-NO2；-CH3进一步取代)和抑胃酶氨酸(statine)。此外，适用于本发明中的氨基酸可经衍生化以包括例如经水解、磷酸化、磺酸化、酰基化、脂化和糖基化的氨基酸残基。 [0124] 术语“氨基酸侧链”是指附接到氨基酸的α-或β-碳的基团。“适合的氨基酸侧链”包括(但不限于)如上文所定义且如表1到3中提供的任何适合的氨基酸侧链。 [0125] 举例来说，适合的氨基酸侧链包括甲基(如对于丙氨酸，α-氨基酸侧链为甲基)、4-羟基苯甲基(如对于酪氨酸，α-氨基酸侧链为4-羟基苯甲基)和硫甲基(如对于半胱 氨酸，α-氨基酸侧链为硫甲基)等。“末端不饱和的氨基酸侧链”是指氨基酸侧链带有末 端不饱和部分，例如取代或未取代的双键(例如烯系)或三键(例如炔系)，其参与与多肽 链中其它末端不饱和部分的交联反应。在某些实施例中，“末端不饱和的氨基酸侧链”是末端烯系氨基酸侧链。在某些实施例中，“末端不饱和的氨基酸侧链”是末端炔系氨基酸侧链。 在某些实施例中，“末端不饱和的氨基酸侧链”的末端部分未经进一步取代。末端不饱和的氨基酸侧链包括(但不限于)表3中描绘的侧链。 [0126] “肽”、“蛋白质”、“多肽”或“肽的”包含通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。本文中使用的这些术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。通常，肽或多肽将为至少三个氨基酸长。肽或多肽可指个别蛋白质或蛋白质集合。本发明 的蛋白质优选仅含有天然氨基酸，但另外可使用此项技术中已知的非天然氨基酸(即，自 然界中不存在但可并入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物。另外，肽或多肽中的一 个或一个以上氨基酸可例如通过添加化学实体(例如碳水化合物基团、羟基、磷酸酯基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、供结合、官能化或其它修饰的连接基等)来进行修饰。肽或多肽也可为单一分子或可为多分子复合物。肽或多肽可仅为天然存在的蛋白质或肽的片段。 肽或多肽可为天然存在、重组或合成的，或其任何组合。 [0127] 以下定义是本申请案通篇使用的更通用术语： [0129] 本文中使用的术语“投予(administer/administering/administration)”是指植入、施用、吸收、摄取、注射或吸入本发明的多肽或化合物。 [0130] 本文中使用的术语“治疗(treat/treating)”是指部分或完全减轻、抑制、改善和/或缓解个体所患疾病或病况。 [0131] 本文中使用的术语“有效量”和“治疗有效量”是指当投予个体时有效地至少部分治疗个体所患病况的结合当前主张的发明的发明性多肽的生物活性剂的量或浓度，或者发明性多肽的量或浓度。 [0132] 如本文中使用，当两个实体彼此“缔合”时，其是通过直接或间接共价或非共价相互作用连接。在某些实施例中，缔合是共价的且实体“经结合”。在其它实施例中，缔合是非共价的。非共价相互作用包括氢键结、范德华相互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁相互作用、静电相互作用等。间接共价相互作用是两个实体通过连接子共价缔合的情形。 [0133] 本文中使用的“标记”是指部分中并入至少一种元素、同位素或官能团的所述部分，其使得能检测附接标记的本发明多肽。标记可直接附接(即，经由键)或可通过系栓 (例如环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚炔基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂炔基；取代或未取代的亚芳基； 取代或未取代的亚杂芳基；或取代或未取代的亚酰基，或其任何组合，其可构成系栓)附 接。应理解，标记可附接到或并入本发明多肽中的任何位置。 [0134] 一般说来，标记可属于以下5种类别中任一类(或一类以上)：a)含有同位素部2 3 13 14 15 31 分的标记，所述同位素部分可为放射性或重同位素，包括(但不限于)H、H、C、C、N、P、 32 35 67 99m 111 123 125 169 186 P、S、Ga、Tc(Tc-99m)、 In、I、 I、Yb和 Re；b)含有免疫部分的标记，所述免疫 部分可为抗体或抗原，其可结合于酶(例如辣根过氧化物酶)；c)作为有色、发光、发磷光或发荧光部分的标记(例如荧光标记FITC)；d)具有一个或一个以上光亲和部分的标记；和 e)具有带有一种或一种以上已知结合搭配物的配体部分(例如生物素-抗生蛋白链菌素、 FK506-FKBP等)的标记。 [0135] 在某些实施例中，标记包含放射性同位素，优选发射可检测粒子(例如β粒子)的同位素。 [0136] 在某些实施例中，标记包含荧光部分。在某些实施例中，标记是荧光标记FITC。在某些实施例中，标记包含具有一种或一种以上已知结合搭配物的配体部分。在某些实施例中，标记包含配体部分生物素。 附图说明 [0137] 图1描绘贝克尔(Barker)和克莱文思(Clevers)，NRDD，5，998-1014(2006)(以引用的方式并入本文中)所采用的内源性β-连环蛋白的降解路径。 [0138] 图2绘示人类癌症中内源性β-连环蛋白降解的丧失。 [0139] 图3描绘使用双功能钉接肽修复β-连环蛋白受到的破坏。 [0140] 图4绘示β-连环蛋白臂重复结构域(Arm repeat domain)上作为推定的泛素化位点的表面暴露的赖氨酸。 [0141] 图5绘示基于Bcl9和p53的双功能钉接肽的实例，其可使hDM2与β-连环蛋白紧密接近以实现泛素化。 [0142] 图6绘示基于Tcf4和p53的双功能钉接肽的实例，其可使hDM2与β-连环蛋白紧密接近以实现泛素化。 [0143] 图7描绘具有不同定向的双功能钉接肽Tcf4-SAH p53-8、SAH p53-8-Tcf4、Bcl-9-SAH p53-8、SAH p53-8-Bcl-9的实例。 [0144] 图8描绘具有Ahx连接子的双功能钉接肽SAH p53-8-Bcl-9(SEQ ID NO：1-3)和Bcl-9-SAH p53-8(SEQ ID NO：4-6)的实例序列。 [0145] 图9描绘具有PEG连接子的双功能钉接肽SAH p53-8-Bcl-9(SEQ ID NO：7-9)和Bcl-9-SAH p53-8(SEQ ID NO：10-12)的实例序列。 [0146] 图10描绘具有Ahx连接子的双功能钉接肽SAH p53-8-Tcf4(SEQ ID NO：13、14)和Tcf4-SAH p53-8(SEQ ID NO：15、16)的实例序列。 [0147] 图11描绘具有PEG连接子的双功能钉接肽SAH p53-8-Tcf4(SEQ ID NO：17、18)和Tcf4-SAH p53-8(SEQ ID NO：19、20)的实例序列。 [0148] 图12描绘使用交联剂接合两个肽结构域(靶向结构域和效应结构域)的实例。 [0149] 图13描绘NHS与顺丁烯二酰亚胺之间不同类型的间隔子的实例。 [0150] 图14描绘呈不同定向交联的区段的实例。 [0151] 图15描绘针对钉接肽合成文库与靶的高亲和力结合的筛选程序的实例。 [0152] 图16描绘针对钉接肽合成文库与靶的高亲和力结合的筛选程序的实例。所述筛选程序包括检测第二蛋白质的修饰作为选择标准。 [0153] 图17描绘显示通过靶向泛素化实现降解的图。 [0154] 图18描绘显示通过募集辅阻遏物阻遏靶基因的图。 [0155] 图19描绘显示通过用含核输出序列(Nuclear Export Sequence，NES)的双功能肽进行靶向核输出来抑制转录因子的图。 [0156] 图20描绘显示通过用含核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)的双功能肽进行靶向核输入来活化转录因子的图。 [0157] 图21描绘显示通过募集辅活化子蛋白活化合成转录因子的图。 [0158] 图22描绘显示通过系栓的效应结构域进行常规转录因子翻译后修饰的图。 [0159] 图23描绘显示双功能钉接肽的设计和合成以及附接策略的图。 [0160] 图24描绘(A)Sin3/Mad1相互作用(吉泽尼克(Geuzennec)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，2004.279，25823-9，以引用的方式并入本文中)和(B)KIX/c-Myb和 KIX-MLL相互作用(KIX:c-Myb：佐(Zor)等人，JMB，2004，337，521-34，以引用的方式并入本文中；KIX:MLL：古兹曼(Guzman)等人，JMB，2005，355，1005-13，以引用的方式并入本文中)的分子模型。 [0161] 图25包括示范性阻遏性结构域的序列和生物活性。(A)SID肽和其钉接型式的序列。星号指示供肽钉接的非天然氨基酸的并入。(B)用于测定解离常数(KD)的SID2和SID5 与野生型SID的样品荧光偏振实验数据的比较。(C)用结合FITC的SID系列肽处理的海拉 细胞(Hela cell)的共聚焦显微镜检查。SID2和SID5揭露出稳固的细胞穿透。 [0162] 图26包括示范性活化结构域的序列和生物活性。(A)MLL和cMyb肽以及其钉接型式的序列。星号指示供肽钉接的非天然氨基酸的并入。NT：未测试。(B)用于测定解离常 数(KD)的MLL1-2的样品荧光偏振实验数据。(C)用结合FITC的MLL系列肽处理的U2OS 细胞的共聚焦显微镜检查。MLL1-2揭露出稳固的细胞穿透。 [0163] 图27描绘显示双功能钉接肽的设计和合成以及附接策略的实例的图。 [0164] 图28描绘显示含有顺丁烯二酰亚胺反应性基团的钉接肽的合成的图。 [0165] 图29描绘显示含有硫醇反应性基团的钉接肽的合成的图。 [0166] 图30描绘显示经由含硫醇的钉接肽与含顺丁烯二酰亚胺的钉接肽的反应缔合的经结合双功能钉接肽的图。 [0167] 图31描绘含硫醇的钉接肽(上图)、含顺丁烯二酰亚胺的钉接肽(中图)和得到的经结合双功能钉接肽(下图)的质谱。 [0168] 图32描绘HPLC纯化的经结合双功能钉接肽的质谱。 具体实施方式[0169] 引言 [0170] 本发明源自对于钉接或接结肽的新用途的认识。已知这些肽的稳定性，故其可用作将蛋白质或其它生物分子募集到特定蛋白质、核酸、其它生物分子、细胞，或者细胞器或其它细胞实体的试剂。本发明因此涉及可将细胞实体系栓或连在一起的双功能钉接或接结 肽。所述双功能肽的一个结构域充当结合于靶的靶向部分；另一结构域充当效应结构域以 将蛋白质、蛋白质复合物或其它生物分子募集到所述靶。实质上，双功能肽用于使两个蛋白质或其它生物分子彼此接近。靶向结构域、效应结构域或两个结构域可经钉接或接结以使 所述肽的构象稳定。 [0171] 在某些实施例中，本发明的双功能钉接或接结肽可用于将任何两个生物分子(例如多肽)系栓在一起。多肽可为例如单一多肽，例如蛋白质，或者可为包含两个或两个以上彼此缔合的多肽的复合物，例如蛋白质复合物。 [0172] 本文中使用的系栓是指使细胞实体(例如蛋白质、核酸、膜、细胞器等)紧密接近。在某些实施例中，当通过本发明的双功能钉接肽将两个多肽连在一起(或系栓在一起)时， 其可能达到紧密的分子接触以致一个多肽(“效应”生物分子)可能改变或修饰另一多肽 (“靶”生物分子)。 [0173] 本发明双功能肽的结构 [0174] 在某些实施例中，钉接或接结的双功能肽包含三个组成部分：A-L-E，即包含靶向结构域(A)、连接子(L)和效应结构域(E)，其一般布置如下： [0175] [0176] 其中A和/或E是钉接或接结肽，且L是连接子；其中A是靶向结构域且E是效应结构域。A和E是靶向或效应结构域，其为可或可不经钉接以特异性缔合或结合于多肽(例 如靶生物分子或效应生物分子)的氨基酸序列。肽A的任何部分可通过连接子L连接到肽 E的任何部分。在某些实施例中，键联是N末端到N末端。在某些实施例中，键联是C末端 到N末端。在某些实施例中，键联是C末端到C末端。在其它实施例中，键联可通过一个或 两个肽的内部氨基酸进行。所属领域技术人员将理解，键联通常按避免干扰肽的结合活性 的方式定位。键联也可按避免干扰肽的钉接的方式定位。 [0177] 在A为靶向结构域且特异性缔合或结合于靶的某些实施例中，E是效应结构域且特异性缔合或结合能够修饰与靶向结构域A结合或缔合的靶的效应生物分子。L是共价连 接A与E的化学连接子。连接子L可为脂肪族基或杂脂肪族基。在某些实施例中，连接子L 为1到50个原子长，并且可任选取代。在某些实施例中，连接子L为1到25个原子长，并 且可任选取代。 [0178] A和E可具有任何长度，也就是说，其可包含任何数量的氨基酸。氨基酸的数量可为4个或4个以上、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、 100或更多个，或在4与100之间的任何数量的氨基酸。A和E可包含多个氨基酸，所述氨 基酸的最少数量足以与靶或效应生物分子特异性结合或缔合。所述结构域中一者或两者的 氨基酸序列可与已知肽实质上类似或同源。 [0179] 一方面，本发明提供一种双功能钉接肽，其中一个或两个结构域包含下式： [0180] [0181] 其中 [0182] L1和L2在各情况下独立地为键；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚炔基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂炔基；取代或未取代的亚芳基；取代或未取代的亚杂芳基；或取代或未取代的亚酰基； [0183] Ra在各情况下独立地为氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；环状或无环、取代或未取代的酰基；或适合的氨基保护基； [0184] Rb在各情况下独立地为适合的氨基酸侧链；氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；环状或无环、取代或未取代的酰基；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；氰基；异氰基；卤基；或硝基； [0185] Re在各情况下独立地为连接于所述连接子部分的键、-RE、-ORE、-N(RE)2或-SRE，其中RE在各情况下独立地为氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；树脂；适合的羟基、氨基或硫醇保护基；或-N(RE)2的两个RE基团一起形成取代或未取代的5元到6元杂环或杂芳香族环； [0186] Rf在各情况下独立地为连接于所述连接子部分的键；氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基； 取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；树脂；适合的氨基保护基；任选通过系栓接合的标记，其中所述系栓选自环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚炔基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烷基； 环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂炔基；取代或未取代的亚芳基；取代或未取代的亚杂芳基；或取代或未取代 的亚酰基；或末端氨基酸的Rf和Ra一起形成取代或未取代的5元到6元杂环或杂芳香族 环； [0187] RLL在各情况下独立地为氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；叠氮基；氰基；异氰基；卤基；硝基； [0188] 或两个相邻的RLL基团接合形成取代或未取代的5元到8元环脂肪族环；取代或未取代的5元到8元环杂脂肪族环；取代或未取代的芳基环；或取代或未取代的杂芳基环； [0189] XAA在各情况下独立地为天然或非天然氨基酸； [0190] z在各情况下独立地为2到6之间的整数； [0191] j在各情况下独立地为1到10之间的整数； [0192] s和t在各情况下独立地为0与100之间的整数； [0193] q在各情况下独立地为0到2之间的整数；且 [0194] 对应于单键或双键。 [0195] 另一方面，本发明提供一种双功能接结肽，其中一个或两个结构域包含下式(即具有多个钉的肽)： [0196] [0197] 其中 [0198] K、L1、L2和M在各情况下独立地为键；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚炔基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂炔基；取代或未取代的亚芳基；取代或未取代的亚杂芳基；或取代或未取代的亚酰基； [0199] Ra在各情况下独立地为氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；环状或无环、取代或未取代的酰基；或适合的氨基保护基； [0200] Rb在各情况下独立地为适合的氨基酸侧链；氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；环状或无环、取代或未取代的酰基；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；氰基；异氰基；卤基；或硝基； [0201] Re在各情况下独立地为连接于所述连接子部分的键、-RE、-ORE、-N(RE)2或-SRE，其E中R 在各情况下独立地为氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代E 的杂芳基；取代或未取代的酰基；树脂；适合的羟基、氨基或硫醇保护基；或-N(R)2的两个E R 基团一起形成取代或未取代的5元到6元杂环或杂芳香族环； [0202] Rf在各情况下独立地为连接于所述连接子部分的键；氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基； 取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；树脂；适合的氨基保护基；任选通过系栓接合的标记，其中所述系栓选自环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烷基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚炔基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烷基； 环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂烯基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的亚杂炔基；取代或未取代的亚芳基；取代或未取代的亚杂芳基；或取代或未取代 f a 的亚酰基；或R 和R 一起形成取代或未取代的5元到6元杂环或杂芳香族环； [0203] RKL、RLL和RLM在各情况下独立地为氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；叠氮基；氰基；异氰基；卤基；硝基； [0204] 或两个相邻的RKL基团接合形成取代或未取代的5元到8元环脂肪族环；取代或未取代的5元到8元环杂脂肪族环；取代或未取代的芳基环；或取代或未取代的杂芳基环；两 KL 个相邻的R 基团接合形成取代或未取代的5元到8元环脂肪族环；取代或未取代的5元到 LM 8元环杂脂肪族环；取代或未取代的芳基环；或取代或未取代的杂芳基环；或两个相邻的R 基团接合形成取代或未取代的5元到8元环脂肪族环；取代或未取代的5元到8元环杂脂 肪族环；取代或未取代的芳基环；或取代或未取代的杂芳基环； [0205] XAA在各情况下独立地为天然或非天然氨基酸； [0206] y和z在各情况下独立地为2到6之间的整数； [0207] j在各情况下独立地为1到10之间的整数； [0208] p在各情况下独立地为0到10之间的整数； [0209] s和t在各情况下独立地为0与100之间的整数； [0210] u、v和q在各情况下独立地为0到2之间的整数；且 [0211] 对应于单键或双键。 [0212] 在某些实施例中，肽A和E中一者或两者为α-螺旋多肽。在某些实施例中，肽A为实质上呈α-螺旋的。在某些实施例中，肽E为实质上呈α-螺旋的。本文中使用的短语 “实质上呈α-螺旋的”是指平均起来，多肽呈现的主链 二面角在约(-90°，-15°)到 约(-35°，-70°)的范围内。或者，短语“实质上呈α-螺旋的”是指多肽呈现的二面角使得一个残基的ψ二面角和紧接着的残基的 二面角的总和平均起来为约-80°到约-125°。 在某些实施例中，多肽呈现的二面角使得一个残基的ψ二面角和紧接着的残基的 二面角 的总和平均起来为约-100°到约-110°。在某些实施例中，多肽呈现的二面角使得一个残 基的ψ二面角和紧接着的残基的 二面角的总和平均起来为约-105°。此外，短语“实质上 呈α-螺旋的”也可以指多肽的多肽链中所提供的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的氨基酸呈α-螺旋构象或具有本文指定的二面角。多肽α-螺旋二级结构的构象可通过 已知分析技术确定，例如x射线晶体学、电子晶体学、纤维衍射法、荧光各向异性、圆二色性(CD)和核磁共振(NMR)波谱法。 [0213] 将多肽A与多肽E缔合的连接子可为能够在将使用双功能多肽的条件下缔合所述两个多肽的任何化学部分。连接子可为简单的共价键，或其可为许多个原子长的聚合物连 接子。在某些实施例中，连接子为多肽或基于氨基酸。在其它实施例中，连接子不为类肽的。 在某些实施例中，连接子为共价键(例如碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)。在某些实 施例中，连接子为酰胺键联的碳-氮键。在某些实施例中，连接子为环状或无环、取代或未取代、分支或未分支的脂肪族或杂脂肪族连接子。在某些实施例中，连接子为聚合物(例如聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施例中，连接子包含氨基烷酸的单体、二聚体或聚合物。在某些实施例中，连接子包含氨基烷酸(例如甘氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在某些实施例中，连接子包含氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物。在某些实施例中，连接子是基于碳环部分(例如环戊烷、环己烷)。 在其它实施例中，连接子包含聚乙二醇部分(PEG)。在其它实施例中，连接子包含氨基酸。 在某些实施例中，连接子包含肽。在某些实施例中，连接子包含芳基或杂芳基部分。在某 些实施例中，连接子是基于苯基环。在某些实施例中，连接子包含三唑部分(即，胡伊斯根(Huisgen)环加成反应的产物)。连接子可包括官能化部分以便利肽中的亲核基团(例如 硫醇、氨基)附接到连接子。任何亲电子试剂都可用作连接子的一部分。示范性亲电子试 剂包括(但不限于)活化酯、活化的酰胺、迈克尔受体(Michael acceptor)、烷基卤化物、芳基卤化物、酰基卤化物和异硫氰酸酯。在某些实施例中，连接子包括顺丁烯二酰亚胺基团。 在某些实施例中，连接子包括NHS酯。在某些实施例中，连接子同时包括NHS酯和顺丁烯二 酰亚胺基团。举例来说，环己烷环可经NHS酯和顺丁烯二酰亚胺基团取代。使用多种连接 子和/或官能团使多肽A与多肽E缔合的共价结合策略和适合的化学条件的实例陈述于图 27到32中。在某些实施例中，产生硫醇-顺丁烯二酰亚胺结合物。在其它实施例中，产生 1，4-或1，5-三唑结合物。 [0214] 双功能肽的用途 [0215] 本发明的双功能肽可用于将两个细胞实体系栓在一起。在某些实施例中，通过系栓两个细胞实体，理想的情形是，一个实体使另一实体发生改变。使另一实体发生改变的一个实体是修饰作为靶的另一实体的效应生物分子。靶生物分子的修饰靶的一些特征(例如 生物活性)。在一些实施例中，通过系栓两个细胞实体，理想的情形是，两个实体基本上不可逆地系栓在一起。举例来说，在某些刺激物或分子信号作用下，某些效应生物分子可自然地与靶缔合或与靶解离。本发明的双功能肽可用于将两个细胞实体不可逆地系栓在一起，以 致其在所述刺激物或其它信号作用下不会解离，并且保持缔合。效应生物分子例如可为靶 的细胞抑制剂或特定分子复合物，其与靶缔合以使其保持在某一细胞内位置(例如细胞质 或核)中。在其它实施例中，在所述刺激物不存在的情况下，双功能肽可用于将只在某些刺激物或分子信号作用下自然缔合的生物分子系栓在一起。在其它实施例中，可将无法自然 地彼此缔合的生物分子系栓在一起。本文中使用的“自然地”意思指在细胞环境中在生理 条件下，包括患病的条件。 [0216] 在某些实施例中，双功能钉接肽可用于改变靶的一种或一种以上特征。在某些实施例中，靶特征是按此改变影响细胞命运和/或细胞行为的方式改变。在某些实施例中，由靶一种或一种以上特征的改变引起的细胞命运或细胞行为的改变影响个体(例如哺乳动 物，例如人类)的疾病状态。在某些实施例中，双功能钉接肽可用于治疗疾病。在某些实施例中，双功能钉接肽可用于探查或阐明研究的生物路径。生物路径的探查可在体外(例如 在细胞或组织培养物中)或在体内(例如，在例如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、鱼或灵长类动物等动物中)进行。 [0217] 在一些实施例中，两个细胞实体是多肽，例如蛋白质和缔合的蛋白质复合物。在某些实施例中，一个实体(靶生物分子)的改变或修饰可为另一实体(效应分子)的酶促活性引起。对于蛋白质，例如所述改变或修饰可包含此项技术中已知的任何翻译后修饰。 [0218] 翻译后修饰包括(但不限于)泛素化、磷酸化、乙酰化、糖基化、甲基化、小泛素相关性修饰蛋白化(sumoylation)、urm化(urmylation)、nedd化(neddylation)、蛋白水解、脂化、酰基化、法呢基化、香叶酰香叶酰化和/或连接。所属领域技术人员将理解，翻译后修饰可包括添加化学部分以及去除所述化学部分，如本文中所用，所述化学部分是可添加到多肽实体中或从多肽实体去除的任何化学基团(例如蛋白质、糖或无机分子，例如磷酸 酯)。所述化学部分的实例是蛋白质，例如泛素(Ub)和泛素样蛋白质(Ubl)SUMO、Urm1和 Nedd8；碳水化合物，例如聚糖；和小有机或无机基团，例如磷酸酯基、乙酰基-、酰基-或甲基-；或脂质。化学部分也可包括核酸。化学部分可通过多种酶活性效应生物分子附接到 靶生物分子或从靶生物分子去除。 [0219] 在某些实施例中，双功能肽的效应结构域将泛素化酶或泛素化机器募集到靶蛋白质。靶蛋白质的泛素化通常引起蛋白酶体对泛素化蛋白质的降解。泛素是通过泛素连接酶 (例如E3连接酶)附接到蛋白质。E3连接酶可为单一多肽链酶，例如MDM2或E6AP，或为蛋 白质复合物，例如Skp1-滞蛋白(Cullin)-F-盒(Skp1、Cul1/Cdc53、Roc1/Hrt/Rbx1、SCF)、分裂后期促进复合物(anaphase-promoting complex，APC)或BRCA1-Bard1复合物。这些 复合物可与提供天然底物特异性的适体蛋白(例如对于APC为cdh1和cdc20；且对于SCF 为各种F-盒蛋白质)缔合，且进一步与E2泛素结合酶(UBC)缔合。 [0220] 通常，泛素通过一系列催化步骤附接到靶蛋白。泛素首先由泛素活化酶E1活化。E1酶催化两个反应-羧酸酯的ATP依赖性腺苷酸化，随后是与E1的内部半胱氨酸形成硫代 羧酸酯。此后为将Ub/Ub1转移到E2酶的活性半胱氨酸的转硫醇反应。接着E2通常在E3 连接酶的帮助下直接将Ub/Ub1转移到靶蛋白的靶赖氨酸。Ub/Ub1可通过进一步转硫醇反 应转移到HECT E3连接酶，其随后将Ub/Ub1转移到底物。在许多情况下，多轮泛素化是由 专门的E3连接酶催化，由此产生聚Ub加合物。 [0221] 泛素可通过脱泛素酶(DUB，一种蛋白酶)去除。半胱氨酸蛋白酶DUB的实例为：泛素特异性加工蛋白酶(USP/UBP)超家族、泛素C末端水解酶(UCH)超家族、卵巢肿瘤(OTU) 超家族和马查多-约瑟夫结构域(Machado-Josephin domain，MJD)超家族。 [0222] SUMO(小泛素相关性修饰蛋白)可通过小泛素相关性修饰蛋白化依赖性泛素连接酶(例如小泛素相关性修饰蛋白化依赖性E3连接酶RanBP2、Pc2和PIAS家族成员)附接。 在人类和小鼠中，SUMO家族由三个成员组成：SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3，其由单独基因编 码。SUMO结合需要连续的E1依赖性活化、E2依赖性结合和E3依赖性连接步骤。人SUMO E1 酶包含SAE1和SAE2蛋白的杂二聚体，并与SUMO-1的甘氨酸97形成硫酯键。随后，SUMO-1 通过转酯化转移到SUMO特异性E2结合酶Ubc9。Ubc9可将SUMO的羧基末端甘氨酸直接结 合到靶蛋白中的赖氨酸，所述赖氨酸位于共同基序yKxE/D中，其中y表示缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸；且x表示任何氨基酸。 [0223] SUMO可通过脱小泛素相关性修饰蛋白化蛋白或SUMO蛋白酶(例如SuPr1、SENP1(sentrin/SUMO特异性蛋白酶)或ULP(类泛素蛋白特异性蛋白酶))去除。 [0224] Nedd8(一种类泛素小蛋白修饰蛋白)可通过称为nedd化(类似于泛素化)的过程附接。Nedd化反应利用由两个亚基APP-BP1和UBA3构成的E1活化酶复合物以及E2结 合酶UBC12。Nedd化反应的已知底物是滞蛋白家族蛋白：Cul1、Cul2、Cul3、Cul4A、Cul4B和Cul5。作为SCF复合物的一部分的某些滞蛋白(例如滞蛋白-1)的Nedd化反应可能增进 E2-泛素募集到SCF，并且可能是某些E3连接酶底物的SCF进行泛素化所需的。 [0225] 去除Nedd8部分的脱nedd化反应可能由异肽酶活性(例如COP9/信号小体(CSN)和CAND1的活性)实现。 [0226] 在某些实施例中，效应结构域募集催化靶蛋白乙酰化的酶。乙酰基可通过例如PCAF/GCN5、p300/CBP、TAF250、SRC1和MOZ、TIP60或BRCA2等乙酰化酶附接，其可修饰组蛋白和/或非组蛋白蛋白。乙酰化酶可为例如TIP60、STAGA(SPT3-TAF9-GCN5/PCAF)、ATAC(含有Ada-2A)或NuA4组蛋白乙酰化酶复合物等大分子量复合物的部分，或其可与例如E2F、 TAF、p53和MyoD等转录因子缔合。 [0227] 乙酰基可通过例如HDAC1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11等脱乙酰基酶去除，由此可修饰组蛋白和/或非组蛋白蛋白。HDAC可为例如NuRD、Sin3、SMRT和N-CoR复合物等大分子量复合物的部分，或可与例如Rb、YY1、Sp1、MEF2、BRCA1、p53、c-Ski和Ikaro等转录因子缔合。 [0228] 在其它实施例中，磷酸化通常通过激酶完成。激酶将磷酸酯基从ATP或其它核苷酸经由氨基酸侧链转移到底物。大部分激酶将磷酸酯基转移到丝氨酸或苏氨酸(例如MAP 激酶、ERK、JNK和p38)，其它激酶将磷酸酯基转移到酪氨酸，且一些(双特异性激酶)将磷 酸酯基转移到全部三种氨基酸。还存在将其它氨基酸磷酸化的蛋白激酶，包括将组氨酸残 基磷酸化的组氨酸激酶。 [0229] 脱磷酸化可通过磷酸酶实现，磷酸酶通过将磷酸单酯水解成磷酸根离子和具有游离羟基或氨基的分子来去除其底物中的磷酸酯基。磷酸酶包括半胱氨酸依赖性磷酸酶 (Cysteine-Dependent Phosphatase，CDP)和金属磷酸酶。丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白质磷 酸酶包括例如PP1(α、β、γ1、γ2)、PP2(先前称为2A)、PP3(先前称为2b，也称为钙调神经磷酸酶(calcineurin))、PP2C、PP4、PP5和PP6。酪氨酸特异性磷酸酶包括例如PTP1B。 双特异性磷酸酶包括例如VHR、DUSP1-DUSP28。组氨酸磷酸酶包括例如PHP。脂质磷酸酶包 括例如PTEN。 [0230] 甲基可通过蛋白甲基化酶(例如蛋白甲基化酶I、II或III)；和PRMT1和PRMT5(蛋白精氨酸甲基转移酶1和5)添加到底物的精氨酸，得到例如单甲基或二甲基精氨 酸。甲基化酶可使用例如S-腺苷酰基-L-甲硫氨酸作为供体转移甲基。已知的蛋白质甲基 化底物包括髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)和不均一核糖核蛋白A1(hnRNP A1)。甲基化酶，称为HMT(组蛋白甲基转移酶)，例如SUV39H1、G9a、EHMT1、Trithorax、Ash1和Dot1，或其它酶，主要修饰组蛋白，尤其赖氨酸和精氨酸残基，产生单-、二-或三甲基化底物。 [0231] 脱甲基化可通过例如LSD1、JMJD或JHDM等脱甲基酶实现。脱甲基酶的已知靶为例如组蛋白。 [0232] 碳水化合物部分可通过例如GlcNAc转移酶(GnTI、II、II、IV、V)、半乳糖转移酶、葡糖醛酸转移酶、唾液酸转移酶、木糖转移酶、岩藻糖转移酶和甘露糖转移酶等糖基转移酶添加到蛋白质或脂质。糖基转移酶将单糖单元从活化的糖磷酸酯转移到受体分子，例 如酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸，以得到O连接的糖蛋白，或转移到天冬酰胺以得到N连接的糖 蛋白。甘露糖基可转移到色氨酸以产生C-甘露糖基色氨酸。糖基转移的结果可为单糖糖 苷、寡糖或多糖。糖基转移酶的常见供体为例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-GlcNAc、 UDP-GalNAc、UDP-木糖、UDP-葡糖醛酸、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖和CMP-唾液酸。也可使 用脂质连接的糖基供体，其中脂质常常为萜类化合物，例如长萜醇或多萜醇。 [0233] 碳水化合物可通过催化糖的糖苷键联水解的糖苷酶(糖苷水解酶)从蛋白质或脂质去除。 [0234] 异戊二烯化是通常在半胱氨酸残基处发生的蛋白质的脂质翻译后修饰。异戊二烯基转移酶所识别的特定序列由CaaX盒(对于法呢基转移酶FTase和香叶烯基转移酶 1(GGTase1))或Rab GTPase的C末端半胱氨酸(在香叶烯基转移酶2(GGTase2)的情况下) 组成。锚定(anchor)可属于法呢基(3个异戊二烯基单元)或香叶酰基香叶酰基(4个异 戊二烯基单元)类型。此修饰允许芘基化(pyrenylated)蛋白的膜附接或缔合。法呢基化 涉及法呢基转移酶(FTase)将法呢基从法呢基焦磷酸(FPP)转移到底物，例如Ras蛋白。相 关酶，香叶烯基转移酶I(GGTase I)，将香叶酰基香叶酰基转移到底物，例如K和N-Ras。 [0235] 所属领域技术人员将理解，本文所述任何修饰都可在靶生物分子上的一个或一个以上位点(或靶氨基酸)处发生。举例来说，靶实体可在多个位点，即1、2、、3、4或更多个位点处磷酸化。对于泛素，化学部分可以单体或多聚体形式附接到相同位点，并且同一氨基酸靶位点可经相同化学部分修饰一次或一次以上，例如单-、二-或三-甲基化。 [0236] 还应理解，化学部分的添加、去除或置换可对靶生物分子具有不同影响。这些影响中有许多是此项技术中众所周知的。一些修饰可例如促进活化靶生物分子以进行某一功能，一些修饰可具有相反作用，例如保护底物免于降解或促使其降解。 [0237] 举例来说，SUMO-1和泛素可竞争靶生物分子上的相同位点，并且可具有相反作用。靶生物分子的聚泛素化可导致26S蛋白酶体引起的降解，而SUMO化可保护靶生物分子免于 降解(此为例如由IκB可知)。肿瘤抑制蛋白Rb的特定位点上DNA损伤诱导性乙酰化可 防止这些位点磷酸化(例如借助CDK)并使Rb保持活性构象。E2F1转录因子特定位点的磷 酸化(例如借助ATM/ATR)促进E2F1乙酰化(例如借助CBP/p/CAF)。 [0238] 一些糖基表位的高表达促进侵袭和转移，例如在N连接结构中分支的β6GlcNAc；O连接结构中的唾液酸-Tn；N连接、O连接或脂质连接结构中的唾液酸-Lex、唾液酸-Lea 和Ley；脂质连接结构中的GM2、GD3和唾液酸-Gb5。其它糖基表位的高表达抑制肿瘤发展，例如与β6GlcNAc竞争的β4GlcNAc；与包括唾液酸-Lex和唾液酸-Lea在内的唾液酸化 结构竞争的组织血型A和B；与唾液酸-Gb5竞争的Gb5。 [0239] 举例来说，与恶性肿瘤相关的一种常见糖基化改变是由GnT-V活性增强引起的N连接结构的增强的β6GlcNAc侧链分支，以及由GnT-III合成的中和性β4GlcNAc(平分型 GlcNAc)。两个糖基表位的水平由GnT-V与GnT-III之间的平衡决定。增强GnT-III基因可 抑制β6GlcNAc分支，其可引起转移的抑制。在转移期间，一个靶可能为E-钙粘素，其中增强的β4GlcNAc减少β6GlcNAc分支，引起钙粘素依赖性细胞-细胞粘附增强并由此抑制 转移。包含特异性结合GnT-III的效应结构域和特异性结合E-钙粘素的靶向结构域的本 发明双功能肽被用于将GnTIII系栓到癌细胞中的E-钙粘素，引起E-钙粘素上β4GlcNAc 修饰增加和转移的抑制。 [0240] 此外，此项技术中众所周知某些修饰引起其它酶随后募集到经修饰靶生物分子，由此添加或去除其它修饰。举例来说，p53积累和活化是通过例如磷酸化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰调节。Ser15、Thr18、Ser20和Ser37磷酸化通过破坏p53与MDM2之间的相 互作用使p53稳定，而据报导，p53的C末端，例如Ser315和Ser392处磷酸化调节p53的 低聚作用状态和序列特异性DNA结合能力。 [0241] 包括ATM(毛细血管扩张性共济失调突变)和ATR(ATM-和Rad3相关性)的PI3K家族主要负责p53磷酸化。ATM主要响应照射和化疗药物将Ser15磷酸化，而ATR响应UV 和复制抑制剂特定地磷酸化Ser15和Ser37残基。 [0242] p53磷酸化引起后续乙酰化。举例来说，N末端丝氨酸，例如Ser15、Ser33和Ser37磷酸化募集p300/CBP和PCAF以响应DNA损伤诱导p53乙酰化。p53的Ser20或Thr18磷酸化可使p300-p53复合物稳定，并由此诱导p53乙酰化。p300/CBP将p53的K305、K372、 K373、K381和K382乙酰化，而PCAF将p53的K320乙酰化。Tip60响应DNA损伤特定地将 p53的K120乙酰化。p53乙酰化可通过抑制由MDM2介导的p53泛素化增加p53序列特异 性DNA结合能力或增强其稳定作用。 [0243] 包含特异性结合ATM或ATR的效应结构域和特异性结合p53的靶向结构域的本发明双功能肽被用于将PI3激酶系栓到癌细胞中的p53(其中p53因突变而未完全失活)，以 促进磷酸化和随后的p53乙酰化，从而使p53稳定和活化。 [0244] 包含特异性结合p300或PCAF的效应结构域和特异性结合p53的靶向结构域的本发明双功能肽被用于将乙酰化酶系栓到癌细胞中的p53(其中p53因突变而未完全失活)， 以促进p53乙酰化，从而使p53稳定和活化。 [0245] 在一些实施例中，效应生物分子添加、去除或置换靶生物分子一个或一个以上氨基酸位点上的一个或一个以上化学部分。在某些实施例中，所述修饰引起所需的靶生物分 子命运改变，例如活化、去活化、细胞内定位的改变、稳定、失稳、底物特异性或酶保真性的改变，或者靶生物分子蛋白质折叠的改变。 [0246] 因此，应理解，通过控制一种或一种以上特定翻译后修饰，可控制靶生物分子的许多特征，例如靶生物分子的酶活性、底物特异性、细胞内定位、降解、半衰期、定位、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用和稳定性。在某些实施例中，靶生物分子的这 些命运改变引起带有靶生物分子的细胞的命运改变。 [0247] 在某些实施例中，可使用本发明的双功能钉接肽将效应生物分子与靶生物分子系栓在一起以改变靶生物分子的折叠状态。举例来说，某些新生多肽链可在蛋白质折叠过程 期间碰到一些问题。不当折叠或错误折叠的蛋白质可能丧失其某些或全部活性；可能得到 异常活性；可能错误定位于细胞内；或可能形成破坏的蛋白质聚集体。已知在许多疾病，尤其新生儿或脑部疾病的发生中牵涉到错误折叠的蛋白质。举例来说，错误折叠的α-突触 核蛋白与帕金森氏病(Parkinson′s Disease)相关。 [0248] 在某些实施例中，可使用本发明的双功能钉接肽将伴侣蛋白系栓到错误折叠的蛋白或有错误折叠风险的蛋白质。伴侣蛋白也可系栓到蛋白质复合物以帮助形成复合物。存 在数个伴侣蛋白家族，例如40kDa热休克蛋白(HSP40；DnaJ)、60kDa热休克蛋白(HSP60； GroEL)、70kDa热休克蛋白(HSP70；DnaK)、90kDa热休克蛋白(HSP90；HtpG)和100kDa热 休克蛋白(HSP100；Clp)。其它伴侣蛋白包括BiP、GRP94、GRP170、钙联蛋白(calnexin)、钙网蛋白(calreticulin)、HSP47、ERp29、蛋白质二硫键异构酶、肽基脯氨酰顺反异构酶和ERp57。 [0249] 本发明提供一种治疗疾病、病症或病况的方法，其包含对诊断患有或易患所述疾病、病症或病况的个体投予治疗有效量的本发明双功能多肽或其医药学上可接受的形式。 可通过投予本发明的双功能多肽治疗的示范性疾病、病症或病况包含增生性、神经性、免疫性、内分泌性、心血管、血液科和发炎性疾病、病症或病况，以及以过早或不想要的细胞死亡为特征的病况。 [0250] 本文中使用的增生性疾病、病况或病症包括(但不限于)癌症、造血系统赘生性病症、增生性乳房疾病、增生性肺病、增生性结肠病症、增生性肝部病症和增生性卵巢病症。 [0251] 可通过上述方法治疗的癌症的实例包括癌瘤、肉瘤或转移性病症、乳癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食道癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm′s tumor)、子宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少枝胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)。 [0252] 可通过上述方法治疗的造血系统赘生性病症的实例包括由骨髓、淋巴或红系细胞或者其前体细胞引起的涉及造血系统源性增殖性/赘生性细胞的疾病。在某些实施例中， 所述疾病由例如成红细胞性白血病和急性原始巨核细胞白血病等分化不良的急性白血病 引起。其它示范性骨髓病症包括(但不限于)急性早幼骨髓性白血病(acute promyeloid leukemia，APML)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)和慢性骨髓 性白血病(CML)(评述于：维克库斯L.(Vaickus，L.)(1991)肿瘤学与血液学评论(Crit Rev.in Oncol./Hemotol.)11：267-97)；淋巴恶性肿瘤包括(但不限于)急性淋巴细胞性 白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)(其包括B系ALL和T系ALL)、慢性淋巴 细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞性白血病(prolymphocytic leukemia，PLL)、毛细胞白 血病(hairy cell leukemia，HLL)和瓦尔登史特朗姆氏巨球蛋白学症(Waldenstrom′s macroglobulinemia，WM)。恶性淋巴瘤的其它形式包括(但不限于)非霍奇金氏淋巴瘤 和其变化形式、周围T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤 (CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金氏病和瑞德-史登伯氏病(Reed-Stemberg disease)。 [0253] 可通过上述方法治疗的增生性乳房疾病的实例包括上皮增生症、硬化性腺病和小管道乳头状瘤；肿瘤，例如间质瘤，例如纤维腺瘤、叶状肿瘤和肉瘤，以及上皮肿瘤，例如大管道乳头状瘤；乳房癌，包括原位(非侵袭性)癌，其包括原位腺管癌(包括佩吉特氏病 (Paget′s disease))和原位叶状癌，以及侵袭性(浸润性)癌，包括(但不限于)侵袭性 腺管癌、侵袭性叶状癌、髓样癌、胶样(粘液)癌、小管癌和侵袭性乳头状癌，和未分类恶性赘瘤。男性乳房病症包括(但不限于)男性乳房发育症和癌瘤。 [0254] 可通过上述方法治疗的增生性肺部病症的实例包括(但不限于)支气管癌，包括肿瘤伴随综合症、细支气管肺泡癌、神经内分泌肿瘤，例如支气管类癌、未分类肿瘤和转移性肿瘤；胸膜病状，包括发炎性胸膜积液、非发炎性胸膜积液、气胸，和胸膜肿瘤，包括孤立性纤维肿瘤(胸膜纤维瘤)和恶性间皮瘤。 [0255] 可通过上述方法治疗的增生性结肠病症的实例包括(但不限于)非赘生性息肉、腺瘤、家族性综合症、结直肠癌发生、结直肠癌和类癌肿瘤。 [0256] 可通过上述方法治疗的增生性肝部病症的实例包括(但不限于)结节性增生、腺瘤和恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肿瘤。 [0257] 可通过上述方法治疗的增生性卵巢病症的实例包括(但不限于)卵巢肿瘤，例如体腔上皮肿瘤、浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、内膜样肿瘤、透明细胞腺癌、囊腺纤维瘤、布伦纳肿瘤(brenner tumor)、表面上皮肿瘤；生殖细胞肿瘤，例如成熟(良性)畸胎瘤、单胚层性畸胎瘤、未成熟恶性畸胎瘤、恶性胚细胞瘤、内胚窦瘤、绒毛膜癌；性索间质肿瘤，例如粒层细胞-鞘细胞肿瘤、卵泡膜纤维瘤、睾丸母细胞瘤、希尔细胞肿瘤(hill cell tumor)和性 腺胚细胞瘤；和转移性肿瘤，例如库肯勃肿瘤(Krukenberg tumor)。 [0258] 本文所述双功能多肽也可用于治疗、预防或诊断以过度活性的细胞死亡或因生理性伤害引起的细胞死亡为特征的病况。以过早或不想要的细胞死亡或者不想要的或过度细 胞增殖为特征的病况的一些实例包括(但不限于)细胞减少/发育不全、非细胞/再生障 碍性或细胞过多/增生性病况。一些实例包括造血系统病症，包括(但不限于)范可尼贫 血(fanconi anemia)、再生障碍性贫血、地中海贫血、先天性中性粒细胞减少症、骨髓发育不良。用于减少细胞凋亡的本发明多肽可用于治疗与不需要的细胞死亡水平有关的病症。 因此，本发明的抗细胞凋亡肽可用于治疗与病毒感染(例如与人免疫缺陷病毒(HIV)感染 有关的感染)有关的病症，例如导致细胞死亡的病症。 [0259] 多种神经性疾病是以特定神经元集合逐渐丧失为特征，且抗细胞凋亡肽可用于治疗这些病症。所述病症包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏病、肌萎 缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)视网膜色素变性、脊髓性肌萎缩 和各种形式的小脑退化。这些疾病中的细胞丧失不会诱导发炎性反应，并且细胞凋亡可能 为细胞死亡的机制。此外，多种造血系统疾病与血液细胞产生减少有关。这些病症包括与 慢性疾病相关的贫血、再生障碍性贫血、慢性中性粒细胞减少症和骨髓增生异常综合症。血液细胞产生病症，例如骨髓增生异常综合症和再生障碍性贫血的一些形式，与骨髓内凋亡 的细胞死亡增加有关。这些病症可由促进细胞凋亡的基因活化、基质细胞或造血存活因子 后天缺乏或毒素和免疫反应介体的直接作用引起。与细胞死亡相关的两种常见病症为心肌 梗塞和中风。在这两种病症中，在血流急性丧失情形下产生的局部缺血的中心区域内的细 胞可能会因坏死而迅速死亡。然而，在中心缺血区外，细胞经历较长时间段死亡，并且形态上看起来为由细胞凋亡引起的死亡。本发明的抗细胞凋亡肽可用于治疗所有此类与不合需 要的细胞死亡有关的病症。 [0260] 可用本文所述双功能多肽治疗的神经病症的一些实例包括(但不限于)阿尔茨海默氏病、唐氏综合症(Down′s Syndrome)、荷兰型遗传性脑出血性淀粉样变(Dutch Type Hereditary Cerebral Hemorrhage Amyloidosis)、反应性淀粉样变、家族性淀粉样肾病伴荨麻疹和耳聋、穆-韦二氏综合症(Muckle-Wells Syndrome)、特发性骨髓瘤；巨球蛋白血 症相关性骨髓瘤、家族性淀粉样多发性神经病变、家族性淀粉样、孤立性心脏淀粉样变性、老年全身性淀粉样变性、成年发作的糖尿病、胰岛素瘤、孤立性心房淀粉样变性、甲状腺髓样癌、家族性淀粉样变性、遗传性脑出血伴淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病变、痒病、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)、格斯特曼施特劳斯纳-查恩克综合症 (Gerstmann Straussler-Scheinker Syndrome)、牛海绵状脑病、朊病毒介导的疾病、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、皮克氏病(Pick′s disease)、肌萎缩性侧索硬化症 (ALS)、帕金森氏病和路易体病(Lewy Body Disease)。 [0261] 可用本文所述双功能多肽治疗的内分泌性病症的一些实例包括(但不限于)糖尿病、甲状腺功能过低、垂体功能减退、甲状旁腺功能减退、性腺机能减退、不育症等。 [0262] 可用本文所述多肽治疗的免疫性病症的一些实例包括(但不限于)器官移植排斥、关节炎、狼疮、IBD、克隆氏病(Crohn′s disease)、哮喘、多发性硬化症、糖尿病、移植物抗宿主疾病、自体免疫疾病、牛皮癣、类风湿性关节炎等。 [0263] 可用本发明多肽治疗或预防的心血管病症的实例包括(但不限于)动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、血栓形成、动脉瘤、心脏衰竭、缺血性心脏病、心绞痛、心源性猝死、高血压性心脏病；非冠状血管疾病，例如小动脉硬化、小血管疾病、肾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂过多、黄瘤病、哮喘、高血压、肺气肿和慢性肺病；或与介入手术有关的心血管病况(“手术性血管外伤”)，例如血管成形术、分路、支架、合成或天然切除移植物、留置导管、瓣膜或其它可移植装置放置后再狭窄。 [0264] 可使用本发明的双功能多肽通过将本文所述的细胞实体(例如蛋白质)系栓在一起来治疗上述疾病、病症或病况。 [0265] 医药组合物 [0266] 本发明提供包含本发明双功能多肽或其医药学上可接受的形式以及医药学上可接受的赋形剂的医药组合物。所述医药组合物可任选包含一种或一种以上其它生物活性物 质。根据一些实施例，提供一种将包含本发明组合物的医药组合物投予有需要个体的方法。 在一些实施例中，本发明组合物被投予人类。为达成本发明的目的，短语“活性成分”一般是指本文所述的本发明的双功能多肽。 [0267] 尽管本文提供的关于医药组合物的描述主要涉及适于投予人类的医药组合物，但所属领域技术人员将了解，所述组合物一般适于投予所有种类的动物。修饰适于投予人类 的医药组合物以使所述组合物适于投予各种动物已得到充分了解，并且一般兽医药理学家 可以只利用常规实验(如果需要的话)就设计和/或进行所述修饰。预期可投予本发明医 药组合物的个体包括(但不限于)人类和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关 的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫和/或狗；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，例如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。 [0268] 本文所述医药组合物的调配物可通过药理学领域中任何已知或此后研发的方法制备。一般说来，所述制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或一种以上其它辅助成分缔合，随后在必要时和/或视需要，使产物成形和/或包装成所需的单剂量单 元或多剂量单元。 [0269] 本发明的医药组合物可以成批、单一单位剂量和/或多个单一单位剂量形式制备、包装和/或销售。本文中使用的“单位剂量”是包含预定量活性成分的医药组合物的个别量。活性成分的量一般等于将投予个体的活性成分的剂量，和/或所述剂量适宜的一部 分，例如所述剂量的一半或三分之一。 [0270] 本发明医药组合物中活性成分、医药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量将视所治疗的个体的特性、体格和/或病况且进一步视待投予所述组合物的途径而 变化。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。 [0271] 本发明的医药调配物可另外包含医药学上可接受的赋形剂，如本文所使用，所述赋形剂包括适于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。雷氏药学大全(Remington′s The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.吉纳罗 (A.R.Gennaro)，(利平科特·威廉斯&威尔金斯工作室(Lippincott，Williams&Wilkins)， 马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)，2006)中揭示了用于调配医药组合物的各种赋形剂以 及其已知的制备技术。除非任何常规赋形剂介质例如因产生任何不合需要的生物学作用， 或者另外以有害的方式与医药组合物中的任何其它组分相互作用而与物质或其衍生物不 相容，否则所述赋形剂的使用都涵盖在本发明的范围内。 [0272] 在一些实施例中，医药学上可接受的赋形剂为至少95％、96％、97％、98％、99％或100％纯。在一些实施例中，赋形剂被批准用于人类和兽医应用。在一些实施例中，赋形剂获美国食品和药品管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些 实施例中，赋形剂为医药级。在一些实施例中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。 [0273] 用于制造医药组合物的医药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。所述赋形剂可任选包括在本发明的调配物中。根据配方设计师的判断，所述组合物中可存在例如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂等赋形剂。 [0274] 示范性稀释剂包括(但不限于)碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和其组合。 [0275] 示范性造粒剂和/或分散剂包括(但不限于)马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵(natural sponge)、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮)(交联聚维酮(crospovidone))、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素(croscarmellose))、甲基纤维素、预糊化淀粉(淀粉1500)、微晶 淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(维格姆(Veegum))、月桂基硫酸钠、季铵化合物等和其组合。 [0276] 示范性表面活性剂和/或乳化剂包括(但不限于)天然乳化剂{例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、角叉菜(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶状粘土{例如，膨润土[硅酸铝]和维格姆[硅酸 镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇{例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、单硬脂酸三醋精、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer) {例如羧聚乙烯(carboxy polymethylene)、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合 物)、角叉菜胶、纤维素衍生物{例如羧甲基纤维素钠、粉末状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨糖醇酐脂肪酸酯{例如聚氧化乙烯山梨 糖醇酐单月桂酸酯[吐温20(Tween 20)]、聚氧化乙烯山梨糖醇酐[吐温60]、聚氧化乙烯 山梨糖醇酐单油酸酯[吐温80]、山梨糖醇酐单棕榈酸酯[斯潘40(Span40)]、山梨糖醇酐 单硬脂酸酯[斯潘60]、山梨糖醇酐三硬脂酸酯[斯潘65]、单油酸甘油酯、山梨糖醇酐单 油酸酯[斯潘80])、聚氧化乙烯酯(例如聚氧化乙烯单硬脂酸酯[密尔吉45(Myrj 45)]、 聚氧化乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和索洛托(Solutol))、蔗糖 脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，克林莫佛(Cremophor))、聚氧化乙烯醚(例如，聚氧 化乙烯月桂基醚[布里吉30(Brij 30)])、聚(乙烯吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三 乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、普流尼克F 68(Pluronic F 68)、泊洛沙姆188(Poloxamer 188)、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、 西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、多库酯钠 (docusate sodium)等，和/或其组合。 [0277] 示范性粘合剂包括(但不限于)淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊浆)、明胶、糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)、天然和合成胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰藓提取物(extract of Irish moss)、潘瓦尔(panwar)胶、印度胶(ghatti gum)、isapol皮的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝(维格姆)和落叶松阿拉伯半乳聚糖(larch arabogalactan))、海藻酸盐、聚氧化乙烯、聚 乙二醇、无机钙盐、硅酸、聚甲基丙烯酸酯、蜡、水、醇等，和其组合。 [0278] 示范性防腐剂可包括抗氧化剂、螯合剂、抗菌防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其它防腐剂。示范性抗氧化剂包括(但不限于)α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠。示范性螯合剂包括乙二胺四乙 酸(EDTA)、单水合柠檬酸、依地酸二钠(disodium edetate)、依地酸二钾、依地酸、富马 酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。示范性抗菌防腐剂包括(但不限于) 苯扎氯铵、苄索氯胺(benzethonium chloride)、苯甲醇、布罗泊尔(bronopol)、西曲溴铵(cetrimide)、西吡氯铵、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪唑烷脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和硫柳汞(thimerosal)。示范性抗真菌防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲 酸丁酯(butyl paraben)、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和山梨酸。示范性醇防腐剂包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚系化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和苯乙醇。示范性酸性防腐剂包括(但不限于)维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙 酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和植酸。其它防腐剂包括(但不限于)生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸迪特奥希姆(deteroxime mesylate)、西曲溴铵、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、格莱丹特+(Glydant Plus)、酚耐(Phenonip)、对羟基苯甲酸甲酯、杰马115(Germall 115)、极美II(Germaben II)、尼奥龙(Neolone)、卡松(Kathon)和优斯(Euxyl)。在某些实施例中，防腐剂为抗氧化剂。在其它实施例中，防腐剂为螯合剂。 [0279] 示范性缓冲剂包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、碱式磷酸钙(calcium hydroxide phosphate)、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗生理盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、乙醇等，和其组合。 [0280] 示范性润滑剂包括(但不限于)硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯(glyceryl behanate)、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等，和其组合。。 [0281] 示范性油包括(但不限于)杏仁油(almond，apricot kernel)、鳄梨油、巴巴苏仁油(babassu)、香柠檬油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、春黄菊油、芥花籽油、黄蒿油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸苗油(emu)、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇(geraniol)、葫芦油(gourd)、葡萄籽油、榛子油、海索油(hyssop)、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴油(jojoba)、夏威夷核油(kukui nut)、杂薰衣草油、熏衣草油、柠檬油、山苍子油(litsea cubeba)、澳洲坚果油(macademia nut)、锦葵油(mallow)、芒果籽油、白芒花籽油(meadowfoam seed)、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、深海鱼油(orange roughy)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油(sasquana)、香薄荷油(savoury)、沙棘油、芝麻油、牛油脂、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿蜜花油(tsubaki)、香根油(vetiver)、核桃油和小麦胚芽油。示范性油包括(但不限于)硬脂酸丁酯、辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、环甲聚硅氧烷、癸二酸二乙酯、二甲聚硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和其组合。 [0282] 供经口和不经肠投予的液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含此项技术中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨糖醇酐脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。在不经肠投药的某些实施例中，本发明的结合物与增溶剂混合，所述增溶剂例如克林莫佛、醇类、油类、改性油类、二醇类、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和其组合。 [0283] 可根据已知技术使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂调配可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂可为无毒不经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无 菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如1，3-丁二醇溶液。可使用的可接受的媒剂和溶剂有水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮 介质。为此，可以使用包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯在内的任何温和的不挥发性油。另外，也可使用脂肪酸(例如油酸)来制备可注射物。 [0285] 为延长药物作用，通常需要减缓皮下或肌肉内注射的药物的吸收。这可以使用具有弱水溶性的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速 率，而其溶解速率又可取决于晶体尺寸和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮于油媒剂中来延缓不经肠投予的药物形式的吸收。 [0286] 经直肠或阴道投予的组合物通常为栓剂，其可通过将本发明结合物与合适的无刺激性赋形剂(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述赋形剂在环境温度下为固 体，但在体温下为液体，并因此在直肠或阴道腔中熔解并释放活性成分。 [0287] 供经口投予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在所述固体剂型中，将活性成分与至少一种惰性医药学上可接受的赋形剂(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)阻溶剂，例如石蜡；f)吸收加速剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠；和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可包含缓冲剂。 [0288] 使用例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂，可将类似类型的固体组合物用作软和硬填充明胶胶囊中的填充物。可制备具有包衣和外壳(例如肠衣和医药调配 领域中众所周知的其它包衣)的片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂固体剂型。其可任选包含乳浊剂，并且可具有使其仅仅或优先在肠道的某部分中任选以延缓方式释放活性成分的组 成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。使用例如乳糖或奶糖以及高分子量聚 乙二醇等赋形剂，可将类似类型的固体组合物用作软和硬填充明胶胶囊中的填充物。 [0289] 活性成分可与一种或一种以上上文所述的赋形剂一起呈微封装的形式。可制备具有包衣和外壳(例如肠衣、控制释放包衣和医药调配领域中众所周知的其它包衣)的片剂、 糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂固体剂型。在所述固体剂型中，可将活性成分与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。在正常生产时，所述剂型可包含除惰性稀释剂外的其 它物质，例如，压片润滑剂和其它压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，剂型可包含缓冲剂。其可任选包含乳浊剂，并且可具有使其仅仅或优先在肠道的某部分中任选以延缓方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物 质和蜡。 [0290] 供局部和/或透皮投予本发明结合物的剂型可包括油膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和/或贴片。一般来说，在无菌条件下，将活性组分与医药学上可接受的赋形剂和/或需要时任何所需防腐剂和/或缓冲剂混合。此外，本发明涵盖使用透皮贴片，其通常具有使活性成分控制递送到身体的额外优势。举例来说，可通过将活性成分溶解和/或分散于适当介质中来制备所述剂型。或者或另外，可通过提供速率控制薄膜 和/或通过将活性成分分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。 [0291] 用于皮内递送本文所述的医药组合物的适当装置包括短针装置，例如美国专利 4,886,499、5,190,521、5,328,483、5,527,288、4,270,537、5,015,235、5,141,496 和 5,417,662中所述的装置。可通过限制针有效穿透进入皮肤中的长度的装置来投予皮内 组合物，所述装置例如PCT公开案WO 99/34850中所述的装置和其功能等效装置。射流 式注射装置可为合适的，其经由液体射流式注射器(jet injector)和/或经由刺入角质 层并产生到达真皮的射流的针将液体疫苗递送到真皮。射流式注射装置例如描述于美国 专 利 5,480,381、5,599,302、5,334,144、5,993,412、5,649,912、5,569,189、5,704,911、 5,383,851、5,893,397、5,466,220、5,339,163、5,312,335、5,503,627、5,064,413、 5,520,639、4,596,556、4,790,824、4,941,880、4,940,460；以及PCT公开案WO 97/37705和WO 97/13537中。使用压缩气体使粉末形式的疫苗加速穿过皮肤外层到达真皮的弹道粉末 (ballistic powder)/粒子递送装置是合适的。或者或另外，可将常规注射器用于皮内投药的经典曼托法(classical mantoux method)中。 [0292] 适于局部投予的调配物包括(但不限于)液体和/或半液体制剂，例如擦剂、洗液、水包油和/或油包水乳液(例如乳膏、油膏和/或糊剂)，和/或溶液和/或悬浮液。可 局部投予的调配物例如可包含约1％到约10％(w/w)活性成分，但活性成分的浓度可高至 活性成分于溶剂中的溶解极限。供局部投予的调配物可进一步包含一种或一种以上本文中 所述的其它成分。 [0293] 本发明的医药组合物可以适于经由口腔投予肺部的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可包含干燥粒子，其包含活性成分且具有在约0.5到约7纳米或约1到 约6纳米范围内的直径。所述组合物宜为干粉形式，以便使用包含干粉储器的装置(可将 推进剂流导向所述干粉储器以使粉末分散)和/或使用自动推进溶剂/粉末分配容器(诸 如，在密封容器中包含溶解和/或悬浮于低沸点推进剂中的活性成分的装置)投予。所述 粉末包含粒子，其中至少98重量％的粒子具有大于0.5纳米的直径且至少95数量％的粒 子具有小于7纳米的直径。或者，至少95重量％的粒子具有大于1纳米的直径且至少90 数量％的粒子具有小于6纳米的直径。干粉组合物可包括例如糖等固体细粉稀释剂，并且 宜以单位剂型提供。 [0294] 低沸点推进剂一般包括在大气压力下沸点低于65°F的液体推进剂。一般来说，推进剂可构成50到99.9％(w/w)的组合物，且活性成分可构成0.1到20％(w/w)的组合 物。推进剂可进一步包含其它成分，例如液体非离子型和/或固体阴离子型表面活性剂，和/或固体稀释剂(其粒度可与包含活性成分的粒子具有相同数量级)。 [0295] 调配用于肺部递送的本发明医药组合物可提供溶液和/或悬浮液小液滴形式的活性成分。所述调配物可以包含活性成分的任选无菌的水性和/或稀醇溶液和/或悬浮液 形式制备、包装和/或销售，并且宜使用任何喷雾和/或雾化装置投予。所述调配物可进一 步包含一种或一种以上其它成分，包括(但不限于)调味剂(例如糖精钠)、挥发性油、缓冲 剂、表面活性剂和/或防腐剂(例如羟基苯甲酸甲酯)。此投药途径所提供的小液滴可具有 在约0.1到约200纳米范围内的平均直径。 [0296] 本文描述为适用于肺部递送的调配物适用于鼻内递送本发明的医药组合物。适于鼻内投予的另一调配物是包含活性成分且具有约0.2到500微米的平均粒子的粗粉。可按 鼻吸的方式，即通过从保持靠近鼻孔的粉末容器迅速吸入通过鼻道，来投予所述调配物。 [0297] 适于经鼻投予的调配物例如可包含约少到0.1％(w/w)且高达100％(w/w)的活性成分，并且可包含一种或一种以上本文所述的其它成分。本发明的医药组合物可以适于 经口腔投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物例如可为使用常规方法制得 的片剂和/或锭剂的形式，并且例如可具有0.1到20％(w/w)的活性成分，余量包含口服可 溶解和/或可降解的组合物以及任选一种或一种以上本文所述的其它成分。另外，适于口 腔投予的调配物可包含包括活性成分的粉末，和/或气雾化和/或雾化溶液和/或悬浮液。 当所述粉末状、气雾化和/或气雾化调配物分散时，其可具有在约0.1到约200纳米范围内 的平均粒子和/或小液滴尺寸，并且可进一步包含一种或一种以上本文所述的其它成分。 [0298] 本发明的医药组合物可以适于眼部投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可例如为滴眼液形式，其例如包括0.1/1.0％(w/w)活性成分于水性或油性液体 赋形剂中的溶液和/或悬浮液。所述滴液可进一步包含缓冲剂、盐和/或一种或一种以上 本文中所述的其它成分。其它可经眼部投予的有用调配物包括包含呈微晶形式和/或脂质 体制剂形式的活性成分的调配物。滴耳液和/或滴眼液都涵盖在本发明的范围内。 [0299] 医药剂调配和/或制造总则可见于例如雷明顿：药学科学和实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)第21版，利平科特·威廉斯与威尔金斯工作室 (Lippincott Williams&Wilkins)，2005中。 [0300] 投药 [0301] 在一些实施例中，在诊断患有疾病、病症和/或病况之前、同时和/或之后，将治疗有效量的本发明医药组合物递送到患者和/或生物体。在一些实施例中，在疾病、病症和/或病况的症状发作之前、同时和/或之后，将治疗量的本发明组合物递送到患者和/或生物 体。在一些实施例中，本发明结合物的量足以治疗、减轻、改善、缓解所述疾病、病症和/或病况的一种或一种以上症状或特征；延缓其发作；抑制其发展；降低其严重程度；和/或降低其发生率。 [0302] 可以使用治疗有效的任何投药量和任何投药途径，根据本发明方法，投予所述组合物。所需确切量将视个体的种类、年龄和一般情况、感染的严重程度、特定组合物、其投药模式、其活性模式等随不同个体而变化。为便利投药和剂量均匀，通常将本发明组合物调配成剂量单位形式。然而，应了解，本发明组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断的范围内确定。任何特定个体或生物体的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括 所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的特定活性成分的活性；所使用的特定组合物； 个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定活性成分的投药时间、投药途径和排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定活性成分组合使用或同时使用的药物；和医学 领域中众所周知的类似因素。 [0303] 本发明的医药组合物可通过任何途径投予。在一些实施例中，本发明的医药组合物是经由多种途径投予，包括经口、静脉内、肌肉内、关节内、髓内、鞘内、皮下、室内(intraventricular)、透皮、皮内(interdermal)、直肠、阴道内、腹膜内、局部(例如通过散剂、油膏、乳膏和/或滴液)、粘膜、鼻、口腔、肠、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或以经口喷雾、鼻喷雾和/或气雾剂形式投予。具体说来，预期的途径为全身静脉内注射、经由血液和/或淋巴供应区域性投予和/或直接投予受影响部位。一般说来，最适 宜的投药途径将取决于多种因素，包括药剂的性质(例如，其于胃肠道环境中的稳定性)、 个体的情况(例如，个体是否能耐受经口投药)等。目前，最常使用经口和/或鼻喷雾和/ 或气雾剂途径将治疗剂直接递送到肺和/或呼吸系统。然而，本发明涵盖通过考虑药物递 送科学中的可能进展的任何适宜途径来递送本发明的医药组合物。 [0304] 在某些实施例中，本发明的双功能多肽可按足以递送每天每公斤个体体重约0.001mg到约100mg、约0.01mg到约50m g、约0.1mg到约40mg、约0.5mg到约30mg、约 0.01mg到约10m g、约0.1mg到约10mg或约1mg到约25mg的剂量水平一天投予一次或一 次以上，以获得所需的治疗作用。所需剂量可每日递送三次、每日两次、每日一次、每两日一次、每三日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在某些实施例中，所需剂量可使用多次投药(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次投药)递送。 [0305] 应理解，本发明的双功能多肽和医药组合物可用于组合疗法中。用于组合方案中的疗法(治疗剂或程序)的特定组合应考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及打算达成 的所需治疗作用。应理解，所用疗法可实现达成相同目的的所需作用(例如，适用于检测肿瘤的本发明结合物可与适用于检测肿瘤的另一药剂同时投予)，或其可实现不同作用(例 如，控制任何副作用)。 [0306] 本发明医药组合物可单独投予，或与一种或一种以上其它治疗剂组合投予。“与……组合”不打算表示所述药剂必须同时投予和/或经调配以一起递送，但这些递送方法都在本发明的范围内。组合物可在投予一种或一种以上其它所需治疗剂或医疗程序的同 时、之前或之后投予。总的说来，各药剂将根据确定用于所述药剂的剂量和/或时程投予。 另外，本发明涵盖递送本发明医药组合物与可改良其生物可用性、降低和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在体内的分布的药剂的组合。 [0307] 用于组合方案中的疗法(治疗剂和/或程序)的特定组合应考虑所需治疗剂和/或程序的相容性，和/或打算达成的所需治疗作用。应理解，所用疗法可对同一病症达成所需作用(例如，本发明多肽可与用于治疗相同病症的另一生物活性剂同时投予)，和/或其 可达成不同作用(例如，控制任何副作用)。在一些实施例中，将本发明多肽与获美国食品 和药品管理局批准的另一生物活性剂一起投予。 [0308] 应进一步理解，此组合中所利用的生物活性剂可以单一组合物形式一起投予，或以不同组合物形式分开投予。 [0309] 一般来说，预期组合中所利用的生物活性剂将以不超过单独利用这些生物活性剂的量的量利用。在一些实施例中，组合中所利用的量将小于单独利用的量。 [0310] 在一些实施例中，本发明的医药组合物可与适用于治疗、减轻、改善、缓解癌症的一种或一种以上症状或特征；延缓其发作；抑制其发展；降低其严重程度和/或减少其发生率的任何生物活性剂或治疗方案组合投予。举例来说，本发明组合物可与传统的癌症疗法组合投予，所述传统癌症疗法包括(但不限于)手术、化疗、放射疗法、激素疗法、免疫疗法、辅助或替代性疗法和这些疗法的任何组合。 [0311] 在一些实施例中，本发明组合物与手术组合投予以去除肿瘤。由于在患者身体其余部分最少损伤或无损伤情况下完全去除肿瘤通常是癌症治疗的目标，故通常进行手术以 物理方式去除部分或全部肿瘤。如果手术不能完全去除肿瘤，那么可采用其它疗法(例如 化疗、放射疗法、激素疗法、免疫疗法、辅助或替代性疗法)。 [0312] 在一些实施例中，本发明的组合物与放射疗法组合投予。放射疗法(也称为放疗(radiotherapy)、X射线疗法或照射)是使用电离辐射来杀死癌症细胞和收缩肿瘤。放射 疗法可用于治疗几乎任何类型的实体肿瘤，包括脑、乳房、子宫颈、喉、肺、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫的癌症，或软组织肉瘤。放射可用于治疗白血病和淋巴瘤。放射疗法可经由外部光束放射疗法(external beam radiotherapy，EBRT)经外部投予或经由短距放射疗法 (brachytherapy)经内部投予。通常，放射疗法的作用是局部的，并局限于所治疗的区域。 放射疗法通过破坏治疗区域(例如靶器官、组织和/或细胞)中肿瘤细胞遗传物质，防止肿 瘤细胞生长和分裂来损伤或破坏这些肿瘤细胞。一般说来，放射疗法尝试破坏尽可能多的 肿瘤细胞，同时限制对附近健康组织的伤害。因此，通常投予多次剂量，以使健康组织在各部分之间恢复。 [0313] 在一些实施例中，本发明组合物与免疫疗法组合投予。免疫疗法是使用针对肿瘤的免疫机制，其可用于各种形式的癌症，例如乳癌(例如曲妥珠单 抗(trastuzumab) )、白血病(例如吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin) )和非霍奇金氏淋巴瘤(例如利妥昔单抗(rituximab) )。在一些实施例中，免疫疗法药剂是针对相关癌症细胞特有的蛋白质的单克隆抗体。在一些实施例中，免疫疗法药剂是调节免疫系统反应的细胞因子。在一些实施例中，免疫疗法药剂可为疫苗。 [0314] 在一些实施例中，可投予疫苗以预防癌症和/或延缓癌症发作。在一些实施例中，癌症疫苗通过防止致癌感染物引起的感染来预防癌症和/或延缓癌症发作。在一些实 施例中，癌症疫苗通过发动针对癌症特异性表位的免疫反应来预防癌症和/或延缓癌症发 作。以癌症疫苗为例，针对16和18型HPV的实验疫苗在预防这些类型HPV感染方面显示 出100％成功率，并因此能够预防大多数子宫颈癌病例(哈普(Harper)等人，2004，柳叶刀 (Lancet)，364：1757)。 [0315] 在一些实施例中，本发明组合物与辅助和替代性药物治疗组合投予。一些示范性辅助措施包括(但不限于)植物性药物(例如使用槲寄生提取物与传统化疗的组合来治疗 实体肿瘤)；用于控制化疗相关性恶心和呕吐以及控制手术相关性疼痛的针刺术；祈祷；用以帮助缓解疼痛或改良情绪的心理学方法(例如“成像(imaging)”或冥想)。一些示范性 替代性措施包括(但不限于)饮食和其它生活方式的改变(例如基于植物的饮食、葡萄饮 食和卷心菜饮食)。 [0316] 在一些实施例中，本发明组合物与通常与令人不快、令人不适和/或具有有害副作用的本文所述的任何传统癌症治疗组合投予。举例来说，慢性疼痛通常由癌症本身 或治疗(即手术、放射、化疗)引起的持续组织损伤所致。或者或另外，所述疗法通常 伴有脱发、恶心、呕吐、腹泻、便秘、贫血、营养不良、免疫系统抑制、感染、败血病、出血、继发性赘生物、心脏毒性、肝毒性、肾毒性、耳毒性等。因此，与本文所述任何传统癌症治 疗组合投予的本发明组合物也可与适用于治疗、减轻、改善、缓解癌症治疗的一种或一 种以上副作用；延缓其发作；抑制其发展；降低其严重程度；和/或减少其发生率的任何 治疗剂或治疗方案组合投予。举例来说，疼痛可用阿片类物质和/或镇痛药(例如吗 啡(morphine)、羟可酮(oxycodone)、止吐药等)治疗；恶心和呕吐可用5-HT3抑制剂 (例如多拉司琼(dolasetron) 格拉司琼(granisetron) 昂丹司琼 (ondansetron) 帕洛诺司琼(palonsetron) )和/或P物质抑制剂(例 如阿瑞匹坦(aprepitant) )治疗；免疫抑制可通过输血治疗；感染和/或败血 病可用抗生素(例如青霉素类(penicillins)、四环素类(tetracyclines)、头孢菌素类 (cephalosporins)、磺酰胺类、氨基糖苷类等)治疗；等等。 [0317] 在一些实施例中，本发明组合物可与适用于诊断癌症的一种或一种以上症状或特征(例如检测肿瘤的存在和/或定位肿瘤)的任何治疗剂或治疗方案组合投予，和/或本发 明的诊断方法可与所述治疗剂或治疗方案组合进行。在一些实施例中，本发明结合物可与 一种或一种以上其它诊断剂组合使用。举个例子，用于检测肿瘤的结合物可与适用于检测 肿瘤的其它药剂组合投予。举例来说，本发明结合物可与传统组织活检、随后免疫组织化学染色和血清学测试(例如前列腺血清抗原测试)组合投予。或者或另外，本发明结合物可与 用于计算机断层成像(computed tomography，CT)扫描和/或MRI中的造影剂(contrasting agent)组合投予。 [0318] 制备和合成双功能钉接或接结肽的方法 [0319] 在某些实施例中，从新设计和合成本发明双功能钉接或接结肽的靶向和效应结构域A和E。在某些实施例中，靶向和效应结构域A和E包含一种或一种以上非天然氨基酸 (表1和2)。在某些实施例中，靶向和效应结构域A和E可通过交联部分如本文所述进行 钉接或接结，以使A和E结构域的二级机构稳定。 [0320] 一般说来，这些稳定二级结构的合成涉及(1)由所选数量的天然或非天然氨基酸合成肽，其中所述肽包含至少两个能够经历C-C键形成反应的反应性部分；和(2)使所述肽 与试剂接触以产生至少一种交联剂并实现特定二级结构基序(例如α-螺旋)的稳定。 [0321] 所属领域技术人员将认识到，所选氨基酸结构(天然或非天然)的数量、立体化学和类型将取决于待制备的二级结构的大小和形状(例如α-螺旋的长度)、特定氨基酸产生 需要模拟的二级结构基序的能力。待制备的二级结构取决于所需生物活性，即以足以具有 特异性且同时追踪效应生物分子和靶生物分子两种生物分子的亲和力靶向效应生物分子 或靶生物分子的能力。 [0322] 应理解，交联部分的数量不限于1个或2个，相反，必要时且当与待产生的所需结构和活性相容时，所用交联部分的数量可随靶向和/或效应结构域的长度而变化。 [0323] 本发明双功能多肽的合成首先涉及选择所需的氨基酸和氨基酸类似物序列和数量。所属领域技术人员将认识到，所选氨基酸结构(天然或非天然)的数量、立体化学和类 型将取决于待制备的多肽的大小、特定氨基酸产生所需结构基序(例如α-螺旋)以及需 要模拟以产生有效结合靶或效应生物分子的蛋白质结构域的任何特定基序的能力。 [0324] 一旦选定氨基酸，就可使用标准脱除保护基和偶合反应实现本发明多肽的合成。肽键形成和多肽合成是所属领域技术人员众所周知的技术，并且涵盖固相和溶液相方法； 一般参看博丹斯基(Bodanszky)和博丹斯基，肽合成实践(The Practice of Peptide Synthesis)，施普林格-维拉格出版公司(Springer-Verlag)，柏林(Berlin)，1984；安 塞顿(Atherton)和夏帕德(Sheppard)，固相肽合成：实践方法(Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach)，牛津大学出版社(Oxford University Press) 的IRL出版社，牛津(Oxford)，英格兰(England)，1989，以及斯特沃特(Stewart)和杨 (Young)，固相肽合成(Solid phase Peptide Synthesis)，第2版，皮尔斯化学品公司 (Pierce Chemical Company)，罗克福德(Rockford)，1984，各文献的完整内容以引用的 方式并入本文中。在溶液相和固相技术中，必须考虑保护基的选择，以及待利用的特定偶 合技术。有关溶液相和固相反应的肽合成技术的详细论述，参看生物有机化学：肽和蛋白 质(Bioorganic chemistry：Peptides and Proteins)，赫克特(Hecht)，牛津大学出版社 (Oxford University Press)，纽约(New York)：1998，其完整内容以引用的方式并入本文中。 [0325] 在某些实施例中，所述方法包含本发明双功能多肽的溶液相合成。如上文所述，溶液相合成是众所周知的用于构造多肽的技术。示范性溶液相合成包含以下步骤：(1)提供N末端经适合的氨基保护基保护的氨基酸；(2)提供C末端经适合的羧酸保护基保护的氨基 酸；(3)使N经保护的氨基酸与C经保护的氨基酸偶合；(4)脱除偶合反应产物的保护基； 以及(5)重复步骤(3)到(4)，直到获得所需多肽，其中在上述任一步骤偶合的氨基酸中至 少两个各自包含至少一个末端不饱和氨基酸侧链，且至少一个α，α-双取代氨基酸包含 两个末端不饱和氨基酸侧链。在上述合成过程期间，各种参数可变化，包括(但不限于)具 有末端不饱和侧链的氨基酸的放置、氨基酸的立体化学、末端不饱和侧链的长度和官能性，以及所利用的氨基酸残基。 [0326] 在某些实施例中，所述方法包含本发明双功能多肽或其部分的固相合成。如上文所述，固相合成是众所周知的用于构造多肽的技术。示范性固相合成包含以下步骤：(1)提供结合树脂的氨基酸；(2)脱除结合树脂的氨基酸的保护基；(3)使氨基酸与脱除保护基的 结合树脂的氨基酸偶合；(4)重复步骤(3)，直到获得所需肽，其中在上述任一步骤偶合的 氨基酸中至少两个各自包含至少一个末端不饱和氨基酸侧链，且至少一个α，α-双取代 氨基酸包含两个末端不饱和氨基酸侧链。在上述合成过程期间，各种参数可变化，包括(但不限于)具有末端不饱和侧链的氨基酸的放置、氨基酸的立体化学、末端不饱和侧链的长 度和官能性，以及所利用的氨基酸残基。 [0327] 在使用适宜技术合成所需多肽后，使多肽与特定催化剂接触以促进多肽的“钉接”或“接结”。举例来说，可使结合树脂的多肽与催化剂接触以促进“钉接”或“接结”，或者所述多肽可先从树脂裂解，随后与催化剂接触以促进“接结”。 [0328] 不同氨基酸具有不同的形成不同二级结构的倾向。举例来说，甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)都具有特别高的形成α-螺旋的倾向。相比之下，脯氨酸(P)和甘氨酸(G)是α-螺旋的破坏者。 [0329] 在某些实施例中，所述一个或一个以上反应步骤进一步包含使用偶合剂。示范性偶合剂包括(但不限于)六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)-磷鎓盐(BOP)、 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-磷鎓盐(PyBOP)、六氟磷酸溴-三-吡咯 烷磷鎓盐(PyBroP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N，N′-羰基二 咪唑(CDI)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、1-羟基-7-氮 杂苯并三唑(HOAt)、1-羟基-7-苯并三唑(HOBt)、六氟磷酸2-(7-氮杂-1H-苯并三 唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HATU)、六氟磷酸2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3， 3-四甲基铵(HCTU)、六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HBTU)、四氟 硼酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲(TATU)、四氟硼酸2-(1H-苯 并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(TBTU)、四氟硼酸N，N，N′，N′-四甲基-O-(3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3-基)铀(TDBTU)和四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-1，1， 3，3-四甲基铀(TSTU))。 [0330] 在某些实施例中，上述步骤(iv)的反应进一步包含适合的碱。适合的碱包括(但不限于)碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、四丁基氢氧化铵、苯甲基三甲基氢氧化铵、三乙基苯甲基氢氧化铵、1，1，3，3-四甲基胍、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、N-甲基吗啉、二异丙基乙胺(DIPEA)、四甲基乙二胺(TMEDA)、吡啶(Py)、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)或三乙胺(NEt3)。 [0331] 在某些实施例中，一个或一个以上反应步骤是在适合的介质中进行。适合的介质是溶剂或溶剂混合物，其与组合的反应搭配物和试剂组合以促进其间反应的进展。适合的 溶剂可溶解一种或一种以上反应组分，或者适合的溶剂可促进一种或一种以上反应组分 的悬浮；一般参看马奇氏高等有机化学：反应、机制和结构(March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure)，M.B.史密斯(M.B.Smith)和J.马 奇(J.March)，第5版，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons)，2001，以及有机转化大全(Comprehensive Organic Transformations)，R.C.拉罗克(R.C.Larock)，第2版，约翰 威立父子出版公司，1999，各文献的完整内容以引用的方式并入本文中。适合的溶剂包括 醚、卤化烃、芳香族溶剂、极性非质子性溶剂或其混合物。在其它实施例中，溶剂是乙醚、二噁烷、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、乙腈(ACN)、氯仿、甲苯、苯、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或其混合物。 [0332] 在其它实施例中，一个或一个以上反应步骤是在适合的温度下，例如在约0℃与约100℃之间进行。 [0333] 在某些实施例中，一个或一个以上反应步骤涉及催化剂。所属领域技术人员将认识到，可利用多种催化剂。特定催化剂的选择将随所用反应条件和特定肽中存在的官能团 而变化。在某些实施例中，催化剂是闭环复分解(ring closing metathesis，RCM)催化剂。 在某些实施例中，RCM催化剂是钨(W)、钼(Mo)或钌(Ru)催化剂。在某些实施例中，RCM催 化剂是钌催化剂。适合的RCM催化剂描述于以下文献中：参看格拉布(Grubbs)等人，化学研究述评(Acc.Chem.Res.)1995，28，446-452；美国专利第5,811,515号；夏洛克(Schrock) 等人，有机金属(Organometallics)(1982)1 1645；盖里文(Gallivan)等人，四面廖通讯 (Tetrahedron Letters)(2005)46：2577-2580；福斯特纳(Furstner)等人，美国化学协会 杂志(J.Am.Chem.Soc.)(1999)121：9453；和欧洲化学杂志(Chem.Eur.J.)(2001)7：5299，各文献的完整内容以引用的方式并入本文中。 [0334] 在某些实施例中，RCM催化剂是夏洛克催化剂(Schrock catalyst)、格拉布催化剂(Grubbs catalyst)、格拉布-霍维达催化剂(Grubbs-Hoveyda catalyst)、贝查特催化剂TM (Blechart Catalyst)、Neolyst Ml或福斯特纳催化剂(Furstner catalyst)。 [0335] 也将理解，除RCM催化剂外，还可利用能够促进碳-碳键形成的其它试剂。举例来说，可利用的其它反应包括(但不限于)钯偶合反应、过渡金属催化的交叉偶合反应、频那 醇偶合(末端醛)、锆氢化反应(hydrozirconation)(末端炔烃)、亲核加成反应和NHK(野 崎-桧山-岸反应(Nozaki-Hiyama-Kishi)；福斯特纳等人，美国化学协会杂志1996，118， 12349)偶合反应。因此，首先将适宜的反应性部分并入所需氨基酸或非天然氨基酸中，随后使肽经历反应条件以实现“钉接”或“接结”，随后使所需二级结构稳定。 [0336] 另一方面，本发明提供一种合成本发明多肽的方法，其包含以下步骤：(1)提供所选数量的氨基酸，所述氨基酸包含(i)至少两个氨基酸，其各自包含至少一个末端不饱和氨基酸侧链，和(ii)至少一个α，α-双取代氨基酸，其包含两个末端不饱和氨基酸侧链； (2)使所选数量的氨基酸偶合在一起以产生第一肽；以及(3)用适合的催化剂处理第一肽， 以提供钉接或接结肽。 [0337] 在某些实施例中，特别排除二乙烯基氨基酸作为“包含两个末端不饱和氨基酸侧链的α，α-双取代氨基酸”。 [0338] 在某些实施例中，每一末端不饱和氨基酸侧链对闭环复分解反应具有反应性。在某些实施例中，适合的催化剂是环复分解催化剂。在某些实施例中，闭环复分解催化剂可通过上述方法产生至少两个交联环。视所选氨基酸的性质和其在肽链中的特定位置而定，本 发明的接结肽可包含至少2、3、4、5、6或7个交联，并且可包含一个或一个以上组成性/结构异构体(即具有相同分子量但具有不同连接性的化合物)。 [0339] 在某些实施例中，所述合成方法产生一种接结产物作为优选产物。本文中使用的“优选产物”是指作为主要成分存在于异构体混合物中的一种组成性异构体。在某些实施例中，“优选产物”是指作为占异构体混合物至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、98％或99％的组分存在的一种组成性异构体。 [0340] 合成方法可进一步经修改以通过以下步骤包括至少三个交联钉：(1)提供所选数量的天然或非天然氨基酸，其中所述数量包含：(i)至少四个氨基酸，其各自包含至少一个末端不饱和氨基酸侧链，和(ii)至少一个α，α-双取代氨基酸，其包含两个末端不饱和氨基酸侧链；(2)使所选数量的氨基酸偶合在一起以产生第一肽；以及(3)用适合的催化剂处 理第一肽。 [0341] 此外，所述合成方法可经修改以通过以下步骤包括至少三个交联钉：(1)提供所选数量的天然或非天然氨基酸，其中所述数量包含：(i)至少两个氨基酸，其各自包含至少一个末端不饱和氨基酸侧链，和(ii)至少两个α，α-双取代氨基酸，其各自包含两个末端不饱和氨基酸侧链；(2)使所选数量的氨基酸偶合在一起以产生第一肽；以及(3)用适合的 催化剂处理第一肽。 [0342] 本发明涵盖任何和所有类型的修改，以便在本发明的多肽中提供至少2、3、4、5、6或7个交联钉。 [0343] 包含1到2个末端不饱和氨基酸侧链的上述氨基酸由此并入多肽链中以便提供最接近的末端不饱和侧链。这些最接近的末端不饱和侧链可在多肽任何给定构象中彼此处于 相同平面中或处于相同的多肽链侧。在用适合的催化剂处理时，这些最接近的侧链经由“钉接”彼此反应以提供接结的、构象稳定的多肽。在某些实施例中，最接近的末端不饱和侧链被布置成使所得“钉”不干扰接结多肽的生物/治疗活性。 [0344] 其它合成修饰 [0345] 在如上文所述多肽“接结”后，所述方法可进一步包含其它合成修饰。可进行任何化学或生物修饰。在某些实施例中，所述修饰包括交联的官能团(例如由复分解反应提供的双键)的还原反应、氧化反应和亲核或亲电子加成反应，以提供经合成修饰的接结多肽。 其它修饰可包括接结多肽或经合成修饰的接结多肽在接结多肽骨架上任何位置处(例如 在接结多肽的N末端、接结多肽的C末端处、在接结多肽的氨基酸侧链上，或在一个或一个 以上经修饰或未经修饰的接结位点(即形成钉))与生物活性剂、标记或诊断剂的结合。所 述修饰可用于将肽或生物活性剂递送到细胞、组织或器官。所述修饰可允许靶向特定类型 的细胞或组织。 [0346] 因此，在某些实施例中，上述合成方法进一步包含：(vii)在适合条件下用适合的反应剂处理多肽，以提供经合成修饰的接结多肽。 [0347] 所属领域技术人员将理解，可采用多种反应、条件和“适合的反应剂”来促进所述转化，因此可预期多种反应、条件和反应剂；一般参看马奇氏高等有机化学：反应、机制和结构，M.B.史密斯和J.马奇，第5版，约翰威立父子出版公司，2001；高等有机化学，第B部分：反应和合成(Advanced Organic Chemistry，Part B：Reactions and Synthesis)，卡雷(Carey)和撒德伯格(Sundberg)，第3版，派拉蒙出版社(Plenum Press)，纽约(New York)，1993；和有机转化大全，R.C.拉罗克，第2版，约翰威立父子出版公司，1999，各文献的完整内容以引用的方式并入本文中。示范性“适合的反应剂”可为与多重键(例如双键 或三键)反应的任何试剂。在某些实施例中，适合的反应剂能够例如经由氢化反应、双羟化反应(osmylation)、水解反应(单-或双-)、胺化反应、卤化反应、环加成反应(例如环丙 烷化、氮杂环丙烷化、环氧化)、羟-汞化反应和/或硼氢化反应与双键或三键反应，以提供官能化单键或双键。所属领域技术人员将清楚地认识到，上述这些转化将引入与特定的稳 定结构和所需生物相互作用相容的官能团；所述官能团包括(但不限于)氢；环状或无环、 分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；取代或未取代的羟基；取代或未取代的氨基；取代或未取代的硫醇、卤基；氰基；硝基；叠氮基；亚氨基；氧代；和硫酮基。 [0348] 另一方面，在某些实施例中，所述方法进一步包含用适合的反应剂处理多肽以提供经合成修饰的接结多肽，以及用生物活性剂处理经修饰的接结多肽以提供结合于生物活 性剂的经修饰接结多肽。 [0349] 另一方面，在某些实施例中，上述方法进一步包含用适合的试剂处理多肽以提供经合成修饰的接结多肽，以及用诊断剂处理经修饰的接结多肽以提供结合于诊断剂的经修 饰接结多肽。 [0350] 试剂(例如标记、诊断剂、生物活性剂)与本发明多肽的结合可以多种不同的方式实现。所述试剂可直接或间接共价结合到多肽的钉接位点或多肽链的N末端或C末端。或 者，所述试剂可直接或间接非共价结合到多肽的钉接位点或多肽链的N末端或C末端。间 接共价结合是借助于一个或一个以上共价键进行。间接非共价结合是借助于一个或一个以 上非共价键进行。结合也可经由非共价和共价力/键的组合进行。所述试剂也可通过共价 或非共价连接基团结合。 [0351] 任何适合的键都可用于生物活性剂和/或诊断剂与本发明的具有创造性的多肽的结合中。所述键包括酰胺键联、酯键联、二硫键联、碳-碳键、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、酰肼等。在一些实施例中，所述键在生理条件下可裂解(例如酶促可裂解，用高或低pH、用热、光、超声波、x射线等可裂解)。然而，在一些实施例中，所述键不可裂解。 [0352] 新颖钉接或接结多肽的组合合成 [0353] 所属领域技术人员还将理解，上述合成方法也可用于钉接或接结多肽的组合合成。尽管组合合成技术可在溶液中应用，但在固相上使用分裂-汇集技术(split-and-pool technique)进行组合技术较为常见。在组合合成过程期间，各种参数可变化，包括(但不限于)具有末端不饱和侧链的氨基酸的放置、氨基酸的立体化学、末端不饱和侧链的长度和 官能性，以及所利用的氨基酸残基。 [0354] 一方面，本发明提供用于合成如上文所述的钉接或接结多肽的文库的方法，其包含(1)提供结合树脂的氨基酸的集合；(2)脱除所述结合树脂的氨基酸中每一者的保护基； (3)将所述脱除保护基的结合树脂的氨基酸的集合分成n个相等的部分，其中n表示待偶 合的不同类型氨基酸的数量；(4)使n种类型氨基酸中每一者与脱除保护基的氨基酸偶合； (5)将n部分中每一者组合在一起；以及(6)重复步骤(2)到(5)，直到获得所需多肽，其中 在上述任一步骤偶合的氨基酸中至少两个各自包含至少一个末端不饱和氨基酸侧链，且至 少一个α，α-双取代氨基酸包含两个末端不饱和氨基酸侧链。在合成所需多肽后，可使结合树脂的多肽与催化剂接触以促进“接结”，或者所述多肽可先从树脂裂解，随后与催化剂接触以促进“接结”。 [0355] 所属领域技术人员将理解，在形成所需的稳定结构后，具有稳定二级结构的化合物文库可进一步在特定官能部分处发生变化。举例来说，游离或潜伏氨基酸官能团可变化，或者或另外，交联剂上存在的游离或潜伏官能团可变化。在特别优选的实施例中，在一个实例中，通过引入羟基部分可增加稳定结构的亲水性。所属领域技术人员将认识到，所述变化反应将经选择以引入与特定的稳定结构和所需生物相互作用相容的官能团，并且这些官能 团包括(但不限于)氢；环状或无环、分支或未分支、取代或未取代的脂肪族基；环状或无 环、分支或未分支、取代或未取代的杂脂肪族基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的酰基；取代或未取代的羟基；取代或未取代的氨基；取代或未取代的硫醇；卤基；氰基；硝基；叠氮基；亚氨基；氧代；和硫酮基。 [0356] 本发明双功能钉接肽的靶向和效应结构域A和E可通过此项技术中已知的任何方法设计。举例来说，可根据文献中已知的结合或相互作用结构域设计A和B。良好表征的病 毒和细胞癌基因(例如c-Myc、Ras)、肿瘤抑制蛋白(例如p53、Rb)、转录因子(例如HIF、 E2F)、修饰酶(例如泛素连接酶、乙酰化酶、磷酸酶、甲基化酶)、结构蛋白、信号传导受体和信号传导路径分子(例如β-连环蛋白)、生长因子(例如EGFR)的许多相互作用结构域是 此项技术中已知的。 [0357] 效应结构域可经设计成例如结合于和募集辅阻遏蛋白，例如Groucho/TLE1、SHARP、NCoR、NCoR2、SMRT、BCoR等。举例来说，转录因子中发现且已知对将Groucho/TLE1辅阻遏蛋白募集到靶启动子至关重要且足够的成锯齿状同源(Eh1)结构域可用于设计效 应结构域。 [0358] 在另一实施例中，可使用结合Sin-3的PAH结构域并因而保留Sin-3阻遏蛋白复合物的Mad1的两亲α-螺旋来设计效应结构域。在另一实施例中，根据能够结合和募集 MDM2或MDMX的FXXFF基序或根据p53活化结构域1(Ac-LSQETFSDLWKLLPE-CONH2(SEQ ID NO：35))设计效应结构域(E)。 [0359] 在另一实施例中，效应结构域(E)经设计以结合和募集属于核输出机器(例如输出蛋白(exportin)，例如CRM1)的分子。 [0360] 在另一实施例中，效应结构域(E)经设计为包含或模拟核定位序列(NLS)以结合核输入蛋白(例如已知靶向和结合Impα的NLS序列)的信号肽或小分子形式。NLS序列 的实例为SV40 T抗原：Ac-PKKKRKVE-CONH2(SEQ ID NO：42)；核质蛋白(Nucleoplasmin)： Ac-KRPAATKKAGQAKKKKLD-CONH2(SEQ ID NO：43)；和 c-Myc：Ac-PAAKRVKLD-CONH2(SEQ ID NO：44)(格里奇D(Gorlich D)和库台U.(Kutay U.)细胞以及发育生物学观察(Annu.Rev. Cell Dev.Biol.)1999，15：607-60)。 [0361] 在另一实施例中，效应结构域(E)经设计为能够结合和募集特定转录辅活化蛋白或基础转录设备组分(例如TAFII蛋白或RNA聚合酶)的肽或小分子形式，或根据具有两 个作为转录因子靶的不同结合位点的CBP/p300的KIX结构域的效应结构域以定位和保留 辅活化蛋白。这些结构域可包括p53AD1：Ac-LSQETFSDLWKLLPE-CONH2(SEQID NO：45)；p53 AD2：Ac-MLSPDDIEQWFTEDPG-CONH2(SEQ ID NO：46)；MLL：Ac-ILPSDIMDFVLKNTP-CONH2(SEQ ID NO：47)；c-Jun：Ac-LASPELERLIIQSSN-CONH2(SEQ ID NO：48)；HLTV-TAX：Ac-YIDGFVIGSALQFLIPRLP-CONH2(SEQ ID NO：49)；c-MYB：Ac-KEKRIKELELLLMSTENELKG-CONH2(SEQ ID NO： 50)；pKID ：Ac-ILSRRPSYRKILNDLSSDAPG-CONH2(SEQ ID NO：51)，或来源于p-KID，其中发现的任何丝氨酸残基，尤其Ser133都可经磷酸化，如天然pKID:KIX相互作用中所见的情形 一般。 [0362] 在另一实施例中，设计的效应结构域(E)包含能够结合和募集特定翻译后修饰酶或包括激酶、乙酰基转移酶、磷酸酶、糖基转移酶、脂质转移酶等的复合物的肽或小分子以改变转录因子功能。 [0363] 在另一实施例中，靶向结构域是根据能够结合Notch:CSL转录因子复合物的转录因子靶向配体(例如SAHM1)设计。 [0364] 也可根据可用的晶体学数据或来自公开的亲和筛选(例如噬菌体呈现)的数据合理地设计高亲和力靶向和效应结构域(A和E)。 [0365] 可获得本发明双功能钉接肽的靶向和效应结构域A和E以用于使用例如高通量亲和筛选所需的任何蛋白质。举例来说，靶向结构域可设计成缔合或结合任何候选癌基因、肿瘤抑制蛋白、转录因子(例如NF-κB和AP-1转录因子家族)、STAT家族成员、类固醇受体、 Ets因子、ATF家族成员、基础螺旋-环-螺旋转录因子、端粒酶、生长因子和生长因子受体。 这些因子可能例如为错误功能的、错误定位的、失调的、异常活性、无活性或错误折叠的，并且可引起细胞转化、细胞命运改变、去分化、细胞凋亡、坏死、异常细胞信号传导或引起个体疾病状态的其它改变。与本发明双功能钉接肽的一个靶向结构域缔合的这些候选蛋白质接 着可系栓到本文所述的效应生物分子，例如泛素连接酶、DUB、乙酰化酶、脱乙酰基酶、激酶磷酸酶、甲基化酶、脱甲基酶、糖基转移酶、糖苷酶或伴侣蛋白。在某些实施例中，靶向和效应结构域可与已知生物活性多肽(例如已知与靶生物分子或效应生物分子结合或缔合的 多肽)实质上类似或同源。 [0366] 在某些实施例中，使用此项技术中已知的任何高通量亲和筛选法(例如噬菌体呈现)或如图15和16中所述，针对高结合亲和力和结合特异性以及活性选择包含一个或一 个以上非天然氨基酸和/或一个或一个以上交联部分的靶向和效应结构域A和E。 [0367] 在某些实施例中，靶向和效应结构域A和E通过连接子L共价缔合。此连接子可具有任何长度或其它特征，并且在最低限度上包含两个可与靶向和效应结构域A和E的多 肽链化学相互作用(且共价结合)的反应性末端基团。 [0368] 在一些实施例中，连接子L可包含天然或非天然氨基酸和/或可包含具有末端反应性基团的其它分子。举例来说，连接子可包含PEG(聚乙二醇)和NHS或顺丁烯二酰亚胺 反应性末端基团，例如SM(PEG)n琥珀酰亚胺基-([N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]-n-乙二 醇)。将理解，连接子L的长度可变化，并且可根据分别连接靶向和效应结构域A和E必需 的所需柔性或刚性设计。使用多种连接子和/或官能团使多肽A与多肽E缔合的共价结合 策略和适合反应条件的实例陈述于图27到32中。在某些实施例中，产生硫醇-顺丁烯二 酰亚胺结合物。在其它实施例中，由叠氮化物与炔烃反应产生1，4-或1，5-三唑结合物。 [0369] 靶向和效应结构域A与E的距离可根据数个参数随连接子L的长度而变化，所述参数包括(但不限于)：1)相应靶生物分子和效应生物分子的分子大小，和/或2)效应生 物分子的催化位点与靶生物分子上修饰位点之间的相对分子距离，和/或3)效应生物分子 和靶生物分子上由靶向结构域A和E结合的位点的相对距离，和/或4)双功能钉接肽的细 胞渗透性，和/或5)双功能钉接肽的生物利用率，和/或6)双功能钉接肽的稳定性，和/ 或其它结构或化学考虑。 [0370] 实例 [0371] 实例1：用于降解β-连环蛋白的双功能钉接肽 [0372] β-连环蛋白是Wnt信号传导路径的必需组分。典型的Wnt路径在胚胎发育、干细胞生长和肿瘤产生方面起到关键作用。刺激Wnt路径导致β-连环蛋白与核中的Tcf和 BCL9缔合，由此引起Wnt靶基因的转活化。细胞溶质中β-连环蛋白的水平受β-连环蛋白 破坏复合物调节。在不存在Wnt信号的情况下，β-连环蛋白磷酸化，使其在SCF E3泛素连 接酶复合物作用下泛素化，且随后被26S蛋白酶体降解(图1)。在存在Wnt信号的情况下， 所述破坏复合物受抑制且细胞溶质中β-连环蛋白水平增大，使其转位到核中，在此β-连 环蛋白与Tcf和其它转录因子相互作用以活化靶基因。此路径各组分的遗传畸变与多种癌 症有关[贝克尔(Barker)和克莱文思(Clevers)，NRDD，5，998-1014(2006)]。由于大部分 结肠癌是由β-连环蛋白过量积累引起，故Wnt信号传导路径可能是开发Wnt信号传导抑 制剂以治疗癌症的良好靶。已经解析出β-连环蛋白的分子结构[撒佩罗(Sampietro)等 人，分子细胞(Mol.Cell)24，293-300(2006)]。已经鉴别并解析出β-连环蛋白与转录辅活化蛋白Bcl9和DNA结合的转活化蛋白Tcf-4相互作用的位点的晶体结构为三元复合物[撒 佩罗等人，分子细胞，24，293-300(2006)]。举例来说，BCL9β-连环蛋白结合结构域(CBD)形成α螺旋，其结合于β-连环蛋白的第一个犰狳重复序列(armadillo repeat)。在许多 癌症中，常常发现涉及β-连环蛋白泛素化和降解的蛋白质的突变，引起异常β-连环蛋白 水平(图2)。举例来说，大部分结直肠癌具有使β-连环蛋白稳定且活化β-连环蛋白靶 基因并导致癌症的腺瘤样结肠息肉(adenomatous polyposis coli，APC)基因或β-连环 蛋白基因突变。 [0373] 使用双功能钉接肽，通过带有β-连环蛋白破坏路径突变(例如突变或截短的腺瘤样结肠息肉APC)的癌细胞的聚泛素化来恢复β-连环蛋白破坏。双功能钉接肽具有两 个部分：靶向和效应结构域。靶向结构域是β-连环蛋白结合部分，且效应结构域是E3泛 素连接酶募集部分。E3泛素连接酶结合部分募集接近β-连环蛋白的E3泛素连接酶并由 此促进β-连环蛋白的聚泛素化(图3)。在β-连环蛋白的臂结构域中存在数个表面暴露 的赖氨酸残基(图4)。 [0374] 适合的双功能钉接肽在体外转染到癌细胞，例如结肠癌细胞(SW480、DLD-1和HT29、HCT-116)、乳癌细胞(MCF7)或前列腺癌细胞(PC3、LNCAP)中，并借助针对可溶性和/或膜结合(细胞溶质和/或核)β-连环蛋白水平的降低或β-连环蛋白聚泛素化形式的 出现的蛋白免疫印迹(western blot)分析且使用检测共转染的LEF/TCF靶基因的下调的 报告子分析法(例如荧光素酶)来筛选经转染细胞。通过使用β-连环蛋白特异性抗体和 标准染色方案的免疫荧光法来跟踪β-连环蛋白的细胞破坏。使用塞来昔布(CELECOXIB) 作为正对照。 [0375] 测试数种双功能钉接肽恢复β-连环蛋白聚泛素化的能力：Bcl 9-SAH p53-8和Tcf4-SAH p53。hDM2是众所周知的经由泛素化促进p53降解的E3连接酶。预先合成钉接肽 SAHp53作为结合hDM2的显性负对照。SAHp53-8用作E3连接酶募集部分(效应结构域)以 使hDM2接近β-连环蛋白。Bcl-9和Tcf4肽具有可钉接的α-螺旋结构。Bcl-9或Tcf4 肽与SAH p53-8融合。所得双功能肽桥接β-连环蛋白和hDM2，并由此促进β-连环蛋白 的泛素化(图5和6)。 [0376] 产生具有不同定向的双功能钉接肽。在设计双功能钉接肽时，SAH p53-8被放在N末端或C末端处(图7)。随后筛选肽以选出最佳定向。合成以下双功能肽： [0377] 第1组：SAH p53-8-Bcl 9 [0378] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(Ahx)n-SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF(SEQ ID NO：1) [0379] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(Ahx)n-SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF(SEQ ID NO：2) [0380] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(Ahx)n-SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF(SEQ ID NO：3) [0381] n＝2-4，Ahx：氨基己酸 [0382] 第2组：Bcl 9-SAH p53-8 [0383] SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF-(Ahx)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：4) [0384] SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF-(Ahx)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：5) [0385] SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF-(Ahx)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：6) [0386] n＝2-4，Ahx：氨基己酸 [0387] 第3组：SAH p53-8-Bcl 9 [0388] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(PEG)n-SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF(SEQ ID NO：7) [0389] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(PEG)n-SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF(SEQ ID NO：8) [0390] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(PEG)n-SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF(SEQ ID NO：9) [0391] n＝2-4，PEG：聚乙二醇 [0392] 第4组：Bcl 9-SAH p53-8 [0393] SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF-(PEG)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：10) [0394] SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF-(PEG)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：11) [0395] SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF-(PEG)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：12) [0396] n＝2-4，PEG：聚乙二醇 [0397] 范围为2到4个残基的氨基己酸(Ahx)或聚乙二醇(PEG)用作连接子以连接两个钉接肽(图8和9)。Ahx连接子的最佳长度是根据生物化学以及基于细胞的分析法凭经验 确定。 [0398] 第5组：SAH p53-8-Tcf-4 [0399] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(Ahx)n-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVN(SEQ ID NO：13) [0400] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(Ahx)n-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ER8DLADVKS5SLVN(SEQ ID NO：14) [0401] n＝2-4，Ahx：氨基己酸，β-Ala：β-丙氨酸 [0402] 第6组：Tcf-4-SAH p53-8 [0403] DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVN-(Ahx)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：15) [0404] DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ER8DLADVKS5SLVN-(Ahx)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：16) [0405] n＝2-4，Ahx：氨基己酸，β-Ala：β-丙氨酸 [0406] 第7组：SAH p53-8-Tcf-4 [0407] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(PEG)n-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVN(SEQ ID NO：17) [0408] QSQQTFR8NLWRLLS5QN-(PEG)n-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ER8DLADVKS5SLVN(SEQ ID NO：18) [0409] 第8组：Tcf-4-SAH p53-8 [0410] DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVN-(PEG)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：19) [0411] DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ER8DLADVKS5SLVN-(PEG)n-QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO：20) [0412] 范围为2到4个残基的氨基己酸(Ahx)或聚乙二醇(PEG)用作连接子以连接两个钉接肽(图10和11)。Ahx连接子的最佳长度是根据生物化学以及基于细胞的分析法凭经 验确定。 [0413] 使用异功能交联剂将两个肽结构域接合在一起。NHS酯攻击肽1上的伯胺，形成酰胺键，且顺丁烯二酰亚胺基与游离硫醇基(例如肽2上的半胱氨酸)反应(图12)。图13 绘示NHS与顺丁烯二酰亚胺之间的典型间隔子，范围为2到24个单元。使用此类交联剂的 益处在于，由于半胱氨酸可放在肽2的任一端(如果肽1已反应)，故交联的产物肽无需呈 特定定向。图14绘示利用NHS-顺丁烯二酰亚胺交联剂，两个功能肽的接合可呈N到C或 N到N定向，只要在肽的N末端或C末端处并入半胱氨酸即可。这使得区段交联呈两种定 向： [0414] 定向1： [0415] SAH p53-8-CDELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVN(SEQ ID NO：21) [0416] SAH p53-8-CDELISFKDEGEQE(β-Ala)2ER8DLADVKS5SLVN(SEQ ID NO：22) [0417] 定向2： [0418] SAH p53-8-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVNC(SEQ ID NO：23) [0419] SAH p53-8-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ER8DLADVKS5SLVNC(SEQ ID NO：24) [0420] 实例2：获得高亲和力靶向和效应结构域的筛选程序 [0421] 使用各种方法针对高亲和力结合筛选双功能钉接肽： [0422] 1)钉接肽的合成文库：此类筛选的目的是鉴别能够结合于特定蛋白质的钉接肽序列。文库是通过分裂-汇集合成法构造。肽序列是在珠粒上合成(分裂和汇集)，且其由 恒定亚基(例如p53、TCF4或轴蛋白(Axin)源性钉接肽)和可变亚基构成(图15)。可变 亚基可根据i，i+4和i，i+7架构设计(X＝随机氨基酸)，例如： [0423] i，i+4：XXX-S5-XXS-S5-XX 1 [0424] i，i+7：XXX-R8-XXSSXX-S5 2 [0425] 组装类似于序列2的组合文库。对于X，选择较少的10个氨基酸的集合(R、Q、F、L、A、W、V、S、H、Y)。组装的序列是由埃德曼降解法(Edman degradation)确定。筛选染料标记的靶蛋白与珠粒相互作用的能力(图15)。通过埃德曼测序读出碰撞(hit)序列。在 另一方法(图16)中，使用恒定区来介导与酶的结合(例如p53-MDM2相互作用)。归因于 酶活性，结合于可变序列的第二蛋白质可经修饰。在随后的步骤中，检测诱导的修饰并将其用作选择标准。 [0426] 2)噬菌体呈现：在M13噬菌体的pIII外壳蛋白上表达模板螺旋肽APP。使用编码全部20种天然存在氨基酸的所有密码子使至少10个位置随机化。通过淘选鉴别出正确序 列(Positives)。通过易错PCR优化序列。使用合成肽确定高亲和力碰撞。 [0428] 实例3：用于双功能肽中的轴蛋白源性钉接α-螺旋 [0429] 合成其它变化的双功能肽： [0430] SAH p53-8-DELISFKDEGEQE(β-Ala)2ERDLS5DVKS5SLVNC(SEQ ID NO：23) [0431] Tcf-4：Kd为约100nM，与实例1中相同。使用轴蛋白源性钉接α-螺旋(ENPESILDEHVQRVMR，SEQ ID NO：25，Kd为约3μM)。 [0432] SAH p53-8-NPE-S5-ILD-S5-HVQRVMR(SEQ ID NO：26) [0433] SAH p53-8-NPESILD-S5-HVQ-S5-VMR(SEQ ID NO：27) [0434] SAH p53-8-NPE-R8-ILDEHV-R5-RVMR(SEQ ID NO：28) [0435] 亲和力相比非钉接的野生型序列SEQ ID NO：25(Kd为约3μM)有所增加。此外，这些较短的全螺旋(all-helical)肽展现比由一个螺旋和一个未结构化的亚基组成的TCF4源性序列高的细胞渗透性。 [0436] 实例4：用于降解c-Myc的双功能钉接肽 [0437] c-Myc是细胞生长、蛋白质合成和代谢所涉及的基因的主要调节蛋白以及关键的细胞周期正调节蛋白。其在约30％的全部人类肿瘤中不当活化，并因此被认为是继K-Ras 之后人类癌症中第二种最常活化的癌蛋白[参看自然评论：分子细胞生物学(Nat.Rev. Mol.Cell Biol.)9，810-5(2008)；自然(Nature)455，679-83(2008)；自然评论：分子细胞生物学，6，635-45(2005)；自然评论：分子细胞生物学，5，805-10]。就结构来说，c-Myc是碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH-Zip)转录因子家族的成员。C-Myc本身是一种单 体蛋白，但其能调节基因表达的能力取决于与bHLH-Zip家族的搭配蛋白(即Mad、Max和 Mxi-1)形成DNA结合杂二聚体。已知c-Myc的结构[奈尔(Nair)和布雷(Burley)，细胞 (Cell)112，193-205(2003)]。Max特定地与c-Myc二聚化，且c-Myc/Max杂二聚体起转录活 化蛋白的作用，结合E-盒六核苷酸基序。Mad和Mxi-1拮抗c-Myc/Max杂二聚体的细胞周 期促进活性。Mad和Mxi可与Max杂二聚化，夺去搭配物的c-Myc。Max/Mad或Max/Mxi-1 搭配物无法活化或积极地阻遏转录，引起生长抑制、静止和/或细胞分化状态。Max蛋白具 有代谢稳定性，并且组成性表达，而c-Myc、Mad和Mxi-1响应细胞中有丝分裂刺激的水平而不稳定。 [0438] c-Myc活性和稳定性通过磷酸化和泛素化调节。举例来说，c-Myc的Thr58磷酸化增加可经由泛素化蛋白酶体的降解作用诱导c-Myc降解。负责降解c-Myc的E3连接酶复 合物是与F-盒蛋白FBW7缔合的SCF复合物。Fbxw7(又称Fbw7、Sel-10、hCdc4或hAgo) 诱导细胞周期正调节蛋白(例如c-Myc、c-Jun、细胞周期素E(cyclin E)和Notch)降解。 在一小组人类癌症中FBXW7通常发生突变。 [0439] 举例来说，由蛋白酶体引起的降解减少所致的c-myc水平增加可导致癌症。然而，活性异常的SCF(例如由Skp2过表达引起)也可引起癌症，因为SCF也靶向用于蛋白酶体KIP1 KIP1 降解的p27 。p27 是细胞周期素依赖性激酶(例如CDK1和CDK2)的抑制剂，并且是重 要的细胞周期负调节蛋白。p27CKI降解导致肿瘤侵袭性增加以及数类人类癌症预后恶化。 [0440] 使用本文所述的双功能肽使SCF或另一E3连接酶特异性靶向c-Myc的主要益处KIP1 在于，可特异性诱导c-Myc降解，同时不会诱导例如p27 等其它因子降解。 [0441] 合成的包含靶向结构域和效应结构域的双功能肽将c-Myc和E3连接酶系栓在一起以促进c-Myc降解。此外，合成的包含靶向结构域和效应结构域的双功能肽将c-Myc和 增加c-Myc磷酸化(例如Thr58磷酸化)的激酶系栓在一起以促进c-Myc降解。另外，合 成的包含靶向结构域和效应结构域的双功能肽将Max组成性(意思指与促有丝分裂刺激物 无关)系栓到Mad或Mxi-1以夺去其活化搭配物的c-Myc并使c-Myc失活。 [0442] 实例5：用于降解HIF的双功能钉接肽 [0443] 缺氧诱导因子(HIF)是控制血管生成、葡萄糖利用和缺氧应激抗性所涉及的基因的转录调节蛋白。相信HIF对于实体肿瘤的生长至关重要，因为逃离缺氧诱导的细胞凋亡 是形成大于十分之几毫米的肿块必需的前提条件。近来，已经了解到HIF在能量利用方面 也具有深远影响，上调了其通常保持静止的细胞状态中糖解基因的表达。由此产生一个 值得关注的可能性，即HIF抑制将适用于治疗实体和血源性癌症。HIF是包含一单位可诱 导亚基HIF-1α和称为ARNT或HIF-1β的组成性亚基的杂二聚体。两个亚基都是碱性螺 旋-环-螺旋结构家族(bHLH)的成员，因此结构与cMyc相关，但两个HIF亚基都没有c-Myc 的亮氨酸拉链基序。 [0444] HIFα活性受由氧代谷氨酸依赖性加双氧酶PHD 1-3和称为因子抑制HIF(FIH)的蛋白质引起的两个特定脯氨酰基残基和一个关键的天冬酰胺酰基残基的酶促氧依赖性羟 基化调节。脯氨酰基羟基化引起范希佩尔-林道(von Hippel-Lindau，VHL)复合物介导的 HIFα泛素化以及随后由蛋白酶体引起的降解。类似地，天冬酰胺酰基羟基化抑制HIFα链 募集CBP/p300辅活化蛋白(布鲁克(Bruick)和麦克耐特(McKnight)，2002)。VHL基因失 活(例如由突变引起)与高度血管化的肿瘤的产生有关。 [0445] 合成的包含靶向结构域和效应结构域的双功能肽将HIF-1α或HIF-1β与E3连接酶系栓在一起以促进HIF-1α或HIF-1β降解。 [0446] 实例6：用于促进突变Ras的GTP酶功能的双功能肽 [0447] Ras是一种小GTP结合蛋白，其通过受体到有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的路径起到调节基因表达、细胞生长和分化的控制的分子开关的作用。在30％的人类癌症中 观察到人类Ras基因(H-、N-和K-Ras)的致癌突变。胰腺、结肠和肺肿瘤常常与Ras突变 有关。在K-Ras基因中已经检测到大部分突变，并且其通常涉及编码的GTP酶中占据GTP 水解作用催化位点的三个氨基酸位置(12、13或61)中一者的错义取代。Ras的突变形式保 持结合GTP，并转导细胞增殖的组成性信号。 [0448] Ras GTP酶的固有催化活性无效，并且需要GTP酶活化蛋白(GAP)起到断开开关的作用。已经鉴别出四种类型的Ras特异性GAP，包括p120Ras GAP、神经纤维瘤蛋白 (neurofibromin，NF-1)、SynGAP和GAP1家族。Ras突变取代导致固有的GTP酶活性降低， 以及对由Ras特异性GAP引起的GTP酶刺激的抗性。 [0449] 致癌的Ras中GTP酶缺陷部分地基于Ras的谷氨酰胺61，其活化水分子以供亲核攻击，且其被任何其它氨基酸取代将消除固有的和GAP刺激的GTP酶活性。Ras-RasGAP复 合物的晶体结构揭露，甘氨酸12或甘氨酸13的任何突变安置了一个侧链，其置换了谷氨酰 胺61并在空间上阻碍GAP的催化性‘精氨酸指’(R789)，导致固有的和GAP刺激的GTP酶 活性的丧失[斯查菲克(Scheffzek)等人，科学(Science)，(1997)277：333-338]，但Ras 脯氨酸12突变体例外，其活化固有的GTP酶活性。Ras脯氨酸12无法转化培养的细胞，表 明致癌Ras突变体的GTP酶活性的部分恢复可能防止癌发生。 [0450] 当前设计用于靶向Ras的基于小分子的疗法是基于酶FT酶的抑制作用。FT酶催化Ras的COOH末端法呢基化，这是一种对于Ras功能至关重要的翻译后修饰。然而，这些 抑制剂不能选择性靶向Ras的致癌形式，并且可能破坏正常细胞所需的野生型Ras的功能。 费希贝奇(Fischbach)等人[癌症研穷(Cancer Research)(2003)63，4089-4094]显示，二 磷酸核苷激酶(Ndk，人类同系物NM23)是一种复分解抑制蛋白，其有效地使常常在人类癌 症中观察到的Ras的数种致癌形式(包括RasD12)失活，并且不会明显地影响野生型Ras 或Ras相关性Rho GTP酶的活化形式。 [0451] 本发明的双功能肽可用于将GAP和/或Ndk系栓到突变的Ras以促进GTP酶功能。 [0452] 实例7：用于STAT磷酸化的双功能肽 [0453] 在替代性方法中，可使用本发明的双功能肽直接修饰Ras和/或c-Myc的下游效应物，例如STAT3和STAT5。STAT3和STAT5在许多癌症中，例如在Ras和/或c-Myc转化 的癌症中磷酸化并具有活性。在某些癌症中，致癌性Ras或c-Myc失活引起STAT3和STAT5 脱磷酸化以及癌症的抑制。本发明的双功能肽可用于将特定磷酸酶系栓到STAT3和/或 STAT5以使STAT3和/或STAT5脱磷酸化。 [0454] 实例8：通过靶向泛素化降解转录因子 [0455] 效应结构域(E)被设计为能够结合和募集泛素-连接酶蛋白(例如MDM2或FBXW7)的信号肽或小分子形式。如果例如靶蛋白上的野生型泛素化位点发生了突变，并且例如在 β-连环蛋白、Notch和c-Myc中这些位点不再发生泛素化，那么结合效应结构域(E)的泛 素-连接酶蛋白与结合靶向结构域(A)的转录因子(或转录因子复合物)接近会导致泛素 化作用增强或泛素化作用恢复。转录因子泛素化引起蛋白酶体的降解作用(参看图17)。 举例来说，效应结构域(E)是根据以下设计：能够结合和募集MDM2或MDMX的含FXXFF基序 的钉接肽；p53活化结构域1：Ac-LSQETFSDLWKLLPE-CONH2(SEQID NO：35)，其可经钉接和/或可包含非天然氨基酸；能够结合MDM2的小分子，例如纽特林-3(Nutlin-3)；或能够结合 FBXW7E3-泛素连接酶的肽。以下钉接肽可用作效应结构域： [0456] Ac-LSQETFS*LWK*LPE-CONH2(SEQ ID NO：36) [0457] Ac-QSQQTF#NLWRKK*QN-CONH2(SEQ ID NO：37) [0458] Ac-QSQQTF*NLW*KKQN-CONH2(SEQ ID NO：38) [0459] Ac-LSQNTFS*LWK*LPQ-CONH2(SEQ ID NO：39) [0460] 其中“*”是非天然氨基酸S5，且“#”是非天然氨基酸R8。按任何布置，这些氨基酸都为交联的。 [0461] 靶向结构域A的任何部分都可通过连接子L连接到效应结构域E的任何部分。举例来说，键联是N末端到N末端，键联是C末端到N末端，键联是C末端到C末端，或键联是 通过一个或两个肽的内部氨基酸进行。键联通常按避免干扰肽的结合活性和/或避免干扰 肽的钉接的方式定位。连接子可为蛋白质或非蛋白质的。连接子可为共价键(例如碳-碳 键、二硫键、碳-杂原子键)，或其可为聚合物连接子(例如聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯)。连接子可包含氨基烷酸的单体、二聚体或聚合物，或连接子可包含氨基烷酸(例如甘 氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸)。举例来说，连接子可包含氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物，或聚乙二醇部分(PEG)。连接子可包含氨基 酸。连接子可包括官能化部分以便利肽中的亲核基团(例如硫醇、氨基)附接到连接子。连 接子可包括顺丁烯二酰亚胺基团或NHS酯，或连接子同时包括NHS酯和顺丁烯二酰亚胺基 团。 [0462] 实例9：通过募集辅阻遏蛋白阻遏转录因子靶基因 [0463] 效应结构域(E)被设计为能够结合和募集辅阻遏蛋白组蛋白去乙酰化酶(HDAC)或其它常见转录阻遏蛋白的结构域的形式，由此对转录因子靶基因启动子施加活性阻遏作 用和/或通过外在改变，例如通过HDAC介导的染色质凝聚施加阻遏作用(参看图18)。效 应结构域(E)被设计为能够结合例如Groucho/TLE1、SHARP、NCoR、NCoR2、SMRT、BCoR等辅阻遏蛋白的信号肽或小分子形式。 [0464] 举例来说，设计的成锯齿状同源(Eh1)结构域可见于转录因子中且已知对于将Groucho/TLE1辅阻遏蛋白募集到靶启动子是至关重要且足够的。此结构域依赖于短肽序列 实现相互作用：Ac-TPFYIEDILG-CONH2(SEQ ID NO：40)。系栓到“A”的此结构域的“E”肽或拟肽物发生靶-基因阻遏。 [0465] 在另一实例中，设计出结合Sin-3的PAH结构域并因而保留Sin-3阻遏性复合物的Mad1的两亲α-螺旋(参看图24A)。所述肽序列的天然或钉接变体用作有效的“E”结 构域： [0466] Ac-VRMNIQMLLEAADYLERRER-CONH2(SEQ ID NO：41)。 [0467] 来自Mad1的钉接“E”结构域的实例： [0468] Ac-VRMNIQMLLEA*DYL*RRER-CONH2(SEQ ID NO：67) [0469] Ac-VRMNIQM*LEA*DYLERRER-CONH2(SEQ ID NO：68) [0470] Ac-VRMNIQML#EAADYL*RRER-CONH2(SEQ ID NO：69) [0471] Ac-VRM*IQM*LEAADYLERRER-CONH2(SEQ ID NO：70) [0472] 其中“*”是非天然氨基酸S5，且“#”是非天然氨基酸R8。按任何布置，这些氨基酸都是交联的。 [0473] 实例10：通过用含核输出序列(NES)的双功能肽进行靶向核输出来抑制转录因子 [0474] 效应结构域(E)被设计为能够结合和募集核输出机器的结构域形式，由此靶向“A”转录因子复合物以便核输出到细胞溶质。由例如CRM1等输出蛋白进行的主动输出通过在空间上妨碍转录因子功能来使转录因子特异性基因表达程序失去能力(参看图19)。效 应结构域“E”被设计为能够结合例如CRM1(输出蛋白1)等核输出蛋白的信号肽或小分子 的形式。已经发现了许多与CRM1相互作用的NES结构域，并且所述结构域通常由具有5到 6个残基疏水性核心的10到20个残基肽组成。举例来说，已经发现的输出多种融合蛋白 货物(cargo)的登革病毒(dengue virus)NS5蛋白中的HR3结构域就是此类结构域。制备 肽Ac-LLTKPWDIIPMVTQMAM-CONH2(SEQ ID NO：71)的“E”融合物，其促进靶转录因子的核输出(劳林森SM(Rawlinson SM)等人.J.B.C..2009，284，15589-97)。与CRM1相互作用的 得到良好表征的短NES的另一实例是来自HIV-1REV蛋白的活化结构域。经显示，“E”融合 物：Ac-CLRRLERLTL-CONH2(SEQ ID NO：72)促进融合蛋白的输出，且此外，突变体(LE变为DL)是无活性的，表明特异性相互作用。(费舍尔U(Fischer U)等人，细胞(Cell)，1995， 82，475-83)。 [0475] 实例11：通过用含核定位序列(NLS)的双功能肽进行靶向核输入来活化转录因子 [0476] 效应结构域(E)被设计为包含或模拟核定位序列(NLS)以结合核输入蛋白的信号肽或小分子的形式(参看图20)。设计出已知靶向和结合Impα的NLS肽。 [0477] 示范性NLS序列为： [0478] SV40T抗原：Ac-PKKKRKVE-CONH2(SEQ ID NO：42)； [0479] 核质蛋白：Ac-KRPAATKKAGQAKKKKLD-CONH2(SEQ ID NO：43)； [0480] c-Myc：Ac-PAAKRVKLD-CONH2(SEQ ID NO：44)。 [0481] (格里奇D和库台U.，细胞以及发育生物学观察，1999，15：607-60)。 [0482] 实例12：通过募集辅活化蛋白活化合成转录因子 [0483] 效应结构域(E)被设计为能够结合和募集特定转录辅活化蛋白或基础转录设备组分的肽或小分子的形式。合成转录活化能够增加由特定转录因子驱使的基因表达或使例 如因突变而受到不当抑制的转录因子恢复到基础基因表达水平(参看图21)。 [0484] 设计出包含或模拟辅活化蛋白结合结构域的信号肽或小分子。另外，设计出能够特异性识别和募集基础转录蛋白(例如TAFII蛋白和/或RNA聚合酶)的分子作为野生型， 或通过非天然氨基酸和肽钉接进行合成修饰。具体说来，CBP/p300的KIX结构域具有两个 作为转录因子靶的不同结合位点以定位和保留辅活化蛋白(参看图24B)。靶向这些结合位 点的适合的α-螺旋肽“E”结构域包括： [0485] p53AD1：Ac-LSQETFSDLWKLLPE-CONH2(SEQ ID NO：45) [0486] p53AD2：Ac-MLSPDDIEQWFTEDPG-CONH2(SEQ ID NO：46) [0487] MLL：Ac-ILP SDIMDFVLKNTP-CONH2(SEQ ID NO：47) [0488] c-Jun：Ac-LASPELERLIIQSSN-CONH2(SEQ ID NO：48) [0489] HLTV-TAX：Ac-YIDGFVIGSALQFLIPRLP-CONH2(SEQ ID NO：49) [0490] c-MYB：Ac-KEKRIKELELLLMSTENELKG-CONH2(SEQ ID NO：50) [0491] pKID：Ac-ILSRRP SYRKILNDLS SDAPG-CONH2(SEQ ID NO：51) [0492] 源自c-Myb的钉接“E”肽为： [0493] Ac-KEKRIKELEL*LMS*ENELKG-CONH2(SEQ ID NO：52) [0494] Ac-KEKRIK*LEL*LMSTENELKG-CONH2(SEQ ID NO：53) [0495] Ac-KE*RIK*LELLLMSTENELKG-CONH2(SEQ ID NO：54) [0496] Ac-KEKRIK#LELLLM*TENELKG-CONH2(SEQ ID NO：55) [0497] K*KRI*ELELLLMSTENELKG(SEQ ID NO：73) [0498] K*KRI*RLELLLMSTENELKG(SEQ ID NO：74) [0499] KE*RIK*LELLLMSTENELKG(SEQ ID NO：75) [0500] KR*RIK*LELLLMSTENELKG(SEQ ID NO：76) [0501] KE*RIKELE*LLMSTENELKG(SEQ ID NO：77) [0502] KE*RIKRLE*LLMSTENELKG(SEQ ID NO：78) [0503] KR*RIKELE*LLMSTENELKG(SEQ ID NO：79) [0504] KEKRIKELELLLMSTE*ELK*(SEQ ID NO：80) [0505] 源自MLL的钉接“E”肽为： [0506] Ac-*ILP*DIMDFVLKNTP-CONH2(SEQ ID NO：56) [0507] Ac-ILP*DIM*FVLKNTP-CONH2(SEQ ID NO：57) [0508] Ac-ILPSDIM*FVL*NTP-CONH2(SEQ ID NO：58) [0509] Ac-ILPSDIMDFV*KNT*-CONH2(SEQ ID NO：59) [0510] Ac-#ILPSDI*DFVLKNTP-CONH2(SEQ ID NO：60) [0511] ILP*DIM*FVLKNT(SEQ ID NO：81) [0512] ILP*RIM*FVLKNT(SEQ ID NO：82) [0513] ILPSDIM*FVL*NT(SEQ ID NO：83) [0514] ILP SRIM*FVL*NT(SEQ ID NO：84) [0515] 源自p-KID的钉接“E”肽(其中任何丝氨酸残基，尤其Ser133，可如天然pKID:KIX相互作用中存在的一般磷酸化)为： [0516] Ac-ILSRRPSY*KIL*DLSSDAPG-CONH2(SEQ ID NO：61) [0517] Ac-ILSRRPSYRKIL*DLS*DAPG-CONH2(SEQ ID NO：62) [0518] Ac-ILSR*PSY*KILNDLSSDAPG-CONH2(SEQ ID NO：63) [0519] Ac-ILSRRPSYR*ILN*LSSDAPG-CONH2(SEQ ID NO：64) [0520] Ac-ILSRRP#YRKILN*LSSDAPG-CONH2(SEQ ID NO：65) [0521] Ac-ILSRRPSYRKILNDLSSDAPG-CONH2(SEQ ID NO：66) [0522] 其中“*”是非天然氨基酸S5，且“#”是非天然氨基酸R8。按任何布置，这些氨基酸都是交联的。 [0523] 实例13：通过系栓的效应结构域进行的一般转录因子翻译后修饰 [0524] 设计的效应结构域(E)包含能够结合和募集特定翻译后修饰酶或包括激酶、乙酰基转移酶、磷酸酶、糖基转移酶、脂质转移酶以及已知改变转录因子功能的其它酶的复合物(参看图22)。 [0525] 实例14：双功能钉接肽的设计和合成 [0526] 设计出转录因子靶向配体，例如SAHM1(设计的一种能够结合Notch:CSL转录因子复合物的钉接肽)作为靶向结构域(A)。举例来说，设计出SAHM1：Ac-Bala-ERLRRRI*LCR* HHST-CONH2(SEQ ID NO：73)，其中“*”为非天然氨基酸S5，其中SAHM1能够结合Notch:CSL转录复合物(WO 2008/061192，以全文引用的方式并入本文中)。 [0527] 设计出能够将细胞机器结合和募集到相关转录因子的“E”-效应结构域。所述目标是合成“A”与“E”的系栓形式，以致其在功能上具有独立结合其靶的活性。然而，通过系栓，其功能被联系起来，使得效应蛋白对相关TF产生影响。连接子合成是如图23中略述进 行。 [0528] 实例15：钉接的阻遏性结构域 [0529] 根据与Sin3缔合的效应结构域产生和分析钉接的阻遏性结构域(图24A)。Sin3蛋白是一种进化保守的阻遏蛋白，其为与HDAC活性相关的1.2MDa多蛋白辅阻遏蛋白复合 物的一部分。Sin3复合物的核心亚基包括HDAC1、HDAC2、RbAp46/48、RBP1、SAP130、BRMS1、SDS3、SAP30和SAP18。Sin3含有由100个氨基酸构成的四个保守的不完全重复序列，称为 配对的两亲螺旋(PAH)结构域，其为蛋白质-蛋白质相互作用模块。据悉，PAH1与Opi1、 Pf1、NRSF、N-CoR和SMRT相互作用。PAH2结构域例如与Mad蛋白质家族成员类Sp1阻遏 蛋白、HBP1、Pf1和酵母Ume6相互作用。肿瘤抑制物Mad抑制细胞增殖和阻遏转录的能力 8 20 取决于称为SID(Sin3相互作用结构域)的N末端NIQMLLEAADYLE 结构域。在核磁共振 实验中，Mad SID折叠为两亲螺旋形式，并接触折叠为四螺旋束形式的Sin3的PAH2结构域 (布鲁贝克K.(Brubaker，K.)等人，细胞(Cell)103，655-665(2000))。据悉，对于Mad家 族成员，SID共同序列包含以下简并序列：ΦZZΦΦXAAXXΦnXXn，其中X是任何非脯氨酸残基，Φ是大体积疏水性残基，且n是带负电荷的残基(古泽尼克(Guezennec)等人，核酸研 究(Nucl.Acid Res.)34(14)：3929-3937(2006))。 [0530] 合成肽SID1到SID9： [0531] 长SID(5-28)：VRMNIQMLLEAADYLERREREAEH(SEQ ID NO：85) [0532] 短SID(5-24)：VRMNIQMLLEAADYLERRER(SEQ ID NO：86) [0533] 共同序列：XXXΦZZΦΦXAAXXΦEX [0534] SID1：βAla-ERLRRRI*MLL*AANYLER(SEQ ID NO：87) [0535] SID2：βAla-VRRRI*MLL*AANYLER(SEQ ID NO：88) [0536] SID3：βAla-VRRRIQRLL*AAN*LER(SEQ ID NO：89) [0537] SID4：βAla-VRMNIQMLLQAANR*ERR*R(SEQ ID NO：90) [0538] SID5：βAla-VRRRIQMLLEAANK*ERR*R(SEQ ID NO：91) [0539] SID6：βAla-VRMNIQMLLQAANRLERR*REA*H(SEQ ID NO：92) [0540] SID7：βAla-VRRRIQMLLEAANKLERR*REA*H(SEQ ID NO：93) [0541] SID8：βAla-VRMNIQMLL*AAN*LER(SEQ ID NO：94) [0542] SID9：βAla-VRMNI*MLL*AANYLER(SEQ ID NO：95)， [0543] 其中“*”是非天然氨基酸S5，且这些氨基酸是交联的。图25B绘示用于测定解离常数(KD)的SID2和SID5与野生型SID的样品荧光偏振实验数据的比较。通过将FITC-SID 肽(10nM)与Sin3在含50mM NaCl、1mM DTT、10mM Tris(pH 7.4)的缓冲液中的连续稀 释液一起培育来进行Sin3结合分析。稀释和培育都是在384孔黑色平底板(康宁公司 (Corning))中进行，总体积为100μL，且培育2小时。在斯派曲米-M5(Spectramax-M5)多 标记读板器上，在λex＝485nm且λem＝525nm下测量偏振度。根据标准等式计算偏振度： P＝(V-H)/(V+H)，其中P＝偏振度，V＝垂直发射强度且H＝水平发射强度。Kd值是通过 使用Kaleidagraph将数据拟合到可变斜率S形结合曲线来测定。 [0544] 图25C绘示用结合FITC的SID系列肽处理的海拉细胞的共聚焦显微镜检查。SID2和SID5揭露稳固的细胞渗透。使海拉细胞在腔室载玻片上生长过夜。在细胞培养基中稀 释含10mM FITC-SID肽的DMSO储备液达到10μM最终浓度，连同10μM DMSO对照物。在 37℃下，在肽/媒剂溶液中培育细胞6小时，随后用培养基和PBS充分洗涤，并用4％多聚 TM 甲醛固定。用含DAPI的Vectashield 哈德赛特封片剂(Hardset)对载玻片染色。用蔡司 710(Zeiss 710)共聚焦显微镜获取图像。 [0545] 实例16：关于双功能钉接肽的共价结合策略 [0546] 图27提供经由化学连接子缔合两个钉接肽的示范性结合策略的综述(图27)。举例来说，使用硫醇(-SH)基和顺丁烯二酰亚胺基作为反应性基团以产生硫醇-顺丁烯二酰 I/II 亚胺结合物。使这些基团在pH 7.4的4∶1PBS/CH3CN溶液中反应(图30)。使用Cu 催 化剂和还原剂，在有机或水性溶剂中使叠氮(N3)基与炔基反应，获得1，4-或1，5-三唑部 分。可使用各种长度和构型的炔基/叠氮基反应性基团。 [0547] 产生偶合树脂的含顺丁烯二酰亚胺的钉接肽，使所述钉接肽的经Mmt保护的赖氨酸残基与含有1∶4∶95(体积比)三氟乙酸(TFA)∶三异丙基硅烷(TIS)∶二氯甲烷 (DCM)的溶液反应。使含有脱除保护基的胺的钉接肽与NHS-顺丁烯二酰亚胺在DMF/二异 丙基乙胺中偶合，并使用标准肽裂解和脱除保护基技术，在含有2.5∶2.5∶95(体积比) 水∶TIS∶TFA的溶液中使所得含顺丁烯二酰亚胺的钉接肽从树脂裂解(图28)。 [0548] 由偶合树脂的含半胱氨酸的经保护钉接肽产生含硫醇的钉接肽。使用标准肽裂解和脱除保护基技术，在含有2.5∶2.5∶95(体积比)水∶TIS∶TFA的溶液中使肽从树 脂释放(图29)。 [0549] 图31绘示含硫醇的钉接肽(上图)、含顺丁烯二酰亚胺的钉接肽(中图)和反应的经结合双功能钉接肽(下图)的质谱。图32绘示HPLC纯化的经结合双功能硫醇-顺丁 烯二酰亚胺钉接肽的质谱。 |
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