1.用于产生和筛选探针的高通量方法，所述方法包括下列步骤：
(a)由多核苷酸模板产生编码包括各种iLBP突变蛋白的蛋白文库的多核苷酸突变体
文库，所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸残基的iLBP或iLBP突变蛋白；
(b)表达由所述多核苷酸文库编码的iLBP突变蛋白；
(c)通过结合至固体基质而纯化所述iLBP突变蛋白；
(d)用单种荧光团在pH小于8下标记iLBP突变蛋白由此所述荧光团优先与半胱氨酸
侧链反应，或用第一种荧光团和第二种不同的荧光团标记iLBP突变蛋白，以产生探针，所
述探针通过在两种波长下荧光比例的变化而响应于分析物结合；
(e)由所述固体基质回收所述探针；
(f)在存在和不存在一组未结合的目的分析物的条件下，在荧光计中筛选回收的每种
探针，从而确定每种探针与该组未结合的目的分析物的结合，所述每种未结合的目的分析
物具有确定的未结合浓度；
(g)在存在和不存在所述未结合的分析物的条件下，观察在两种不同波长下测量的所
述探针的荧光指数比例的改变；和
(h)依据所述每种探针针对该组目的分析物的一组荧光响应，表征所述每种探针，其中
荧光团共价结合在所述半胱氨酸残基上。
2.权利要求1的方法，其中所述未结合的分析物是未结合的代谢物。
3.权利要求2的方法，其中所述未结合的代谢物是未结合的游离脂肪酸。
4.权利要求1的方法，其中由所述模板编码的iLBP是脂肪酸结合蛋白(FABP)，或其保
留了结合分析物的能力的变体。
5.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括可裂解的或不可裂解的亲和标
签的iLBP突变蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括多-组氨酸亲和标签的iLBP突
变蛋白，并且所述固体基质包括固定的金属螯合剂。
7.权利要求1的方法，其中所述优先与半胱氨酸侧链反应的荧光团选自由下列各项组
成的组：6-丙烯酰-2-二甲氨基萘、丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲
基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)、和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙
基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)。
8.权利要求1的方法，其中所述iLBP突变蛋白用第一荧光团和第二荧光团标记。
9.权利要求8的方法，其中所述第一荧光团选自由下列各项组成的组：6-丙烯
酰-2-二甲氨基萘、丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯
并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)、和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝
基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)，并且其中所述第二荧光团选自由下列各项组成的组：
Alexa Fluor染料，氟硼荧、荧光素衍生物、若丹明衍生物和德克萨斯红。
10.权利要求8的方法，其中所述标记包括使半胱氨酸与所述第一荧光团在小于或等
于8的pH下反应；并且使赖氨酸与所述第二荧光团在大于8的pH下反应。
11.权利要求8的方法，其中所述标记包括使半胱氨酸与所述第一荧光团在小于或等
于8的pH下反应；并且使所述iLBP突变蛋白的氨基端与所述第二荧光团反应。
12.权利要求1的方法，其中所述第二荧光团通过将接纳体蛋白或肽结构域添加到所
述每个iLBP突变蛋白上而提供，并且其中将所述蛋白或肽结构域然后用第二目的荧光团
标记。
13.权利要求12的方法，其中所述接纳体蛋白或肽结构域选自由下列各项组成的组：
SNAP-标签、CLIP-标签、ACP-标签或生物素化标签。
14.权利要求1的方法，其中所述文库中的所述多核苷酸突变体还包括编码荧光蛋白
的核苷酸区段。
15.权利要求12或14的方法，其中与所述探针的iLBP突变蛋白部分的荧光相比，当与
该组未结合的目的分析物中的分析物结合时，所述接纳体蛋白或肽结构域或所述荧光蛋白
在发射的荧光的强度和/或波长方面没有响应或具有显著减少的响应。
16.权利要求1的方法，其中所述分析物与载体大分子复合，所述载体大分子选自由白
蛋白、脂质结合蛋白、脂囊泡和环糊精组成的组，由此所述分析物和所述载体大分子的复合
物缓冲所述未结合分析物的浓度，从而提供对未结合分析物的水平的限制。
17.权利要求16的方法，其中所述载体大分子是白蛋白。
18.权利要求1的方法，其中步骤(d)和(e)替换为下述步骤：
洗涤结合的iLBP突变蛋白；
将所述iLBP突变蛋白从所述固体基质上去除；和
使未结合的iLBP突变蛋白与单种荧光团或两种不同的荧光团反应，以产生探针。
19.权利要求1的方法，其中所述荧光指数是在存在和不存在该组目的分析物中的每
种分析物的条件下探针的强度、极性和/或寿命。
20.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸的iLBP突变蛋白，并
且所述方法还包括在所述iLBP突变蛋白与所述荧光团缔合之前替换所有表面可及的赖氨
酸残基。
21.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸的iLBP突变蛋白，并
且所述方法还包括在所述iLBP突变蛋白与所述荧光团缔合之前替换除一个以外的所有表
面可及的赖氨酸残基。
22.权利要求20的方法，其中所述表面可及的赖氨酸残基替换为精氨酸或丙氨酸。
23.权利要求21的方法，其中所述除一个以外的所有表面可及的赖氨酸残基替换为精
氨酸或丙氨酸。
24.权利要求1的方法，其还包括鉴定具有所需特征的探针，包括：
通过下式确定R值：
R＝Fλ1/Fλ2
其中Fλ1是在第一发射波长处测量的荧光强度，所述第一发射波长处测量的荧光强
度是存在分析物的探针强度减去不存在探针的分析物的强度，Fλ2是在第二发射波长处测
量的荧光强度，所述第二发射波长处测量的荧光强度是存在分析物的探针强度减去不存在
探针的分析物的强度；
通过下式测量在存在和不存在所述分析物的条件下R之间的差异：
ΔR＝R+分析物-R0
其中R+分析物是在存在所述分析物的条件下完成的测量的比值，R0是在不存在所述分析
物的条件下完成的测量的比值；和
比较所述探针的ΔR与标准物的ΔR参照。
25.权利要求24的方法，其中所述标准物是由用来产生进行高通量筛选的突变的多核
苷酸模板所编码的蛋白制备的荧光探针。
26.权利要求24的方法，其中所述标准物是ADIFAB或ADIFAB2。
27.权利要求24的方法，其中探针用n种未结合的分析物筛选，并且寻找这样的探针，
* *
其 ΔR/ΔR参照对于所述n种未结合的分子中的一种或多种是最大的且＞0.1并且对于其
* *
余未结合的分子至少小0.1，其中 ΔR 是ΔR的绝对值。
28.权利要求27的方法，其中所述未结合的分析物是未结合的代谢物。
29.权利要求28的方法，其中所述未结合的代谢物是未结合的脂肪酸。
30.包含iLBP突变蛋白的探针，所述iLBP突变蛋白包括用荧光染料标记的单个半胱氨
酸，其中在相对应的天然脂质结合蛋白中的至少一个赖氨酸残基被替换。
31.权利要求30的探针，其中至少一个赖氨酸被替换为精氨酸或丙氨酸。
32.权利要求30所述的探针，其中所述iLBP突变蛋白包括分别用荧光染料标记的单个
半胱氨酸和单个赖氨酸。
33.权利要求32的探针，其中所述荧光染料中的一种为6-丙烯酰-2-二甲氨基萘。
34.权利要求30的探针，其中所述iLBP是脂肪酸结合蛋白。
35.权利要求30的探针，其中所述脂质结合蛋白对应于SEQ ID NO：5，其包括在选自由
8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、
70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113，115、117、119、和 126组成的组的位置处的至少一个突变，或对应于SEQ ID NO：5的同源物，其包括在与选自由
SEQ ID NO：2 的 8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、
56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、
117、119、和126组成的组的位置同源的位置处的至少一个突变。
36.权利要求35的探针，其中所有表面可及的赖氨酸残基替换为不是赖氨酸的氨基酸
残基。
37.权利要求35的探针，其中除一个外所有表面可及的赖氨酸残基替换为不是赖氨酸
的氨基酸残基。
38.权利要求36的探针，其中所述氨基酸残基是精氨酸或丙氨酸。
39.权利要求37的探针，其中所述氨基酸残基是精氨酸或丙氨酸。
40.权利要求30的探针，其中所述iLBP突变蛋白对应于SEQ ID NO：5，其包括在选自
由SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、和76组成的组的位置处插入的半胱氨酸，或对应于其同系物，其包括在与选自由SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、55、74、73、和76组成的组的位置同源的位置处插入的半胱氨酸。
41.包含iLBP突变蛋白的探针，所述探针选自由L10P7A4-L30C、L11P7B3-V26C、
L13EP16E11、L18P5G12-K27C、L50BP4E2、L50BP9D5、L61P8B12、L68P3H10、和L71AP22B3组成的组。
42.包含iLBP突变蛋白的探针，所述探针选自胆红素特异性探针L2P14F7-MGCFD-TR和
L2P14F7-KR14-MGCFD-TR。
43.融合蛋白，其包括iLBP和荧光蛋白，所述iLBP包括用荧光染料标记的单个半胱氨
酸。
44.蛋白嵌合体，其包括iLBP和接纳体蛋白或肽结构域，所述iLBP包括用荧光染料标
记的单个半胱氨酸，所述接纳体蛋白或肽结构域用不同的荧光染料标记。
45.权利要求44的蛋白嵌合体，其中所述接纳体蛋白或肽结构域选自由SNAP-标签、
CLIP-标签、ACP-标签和生物素化-标签组成的组。