[0001] 本发明涉及具有新特征的烃合成酶基因及该基因的利用。

[0002] 已知能够合成烷烃等烃的微生物。通过由该具有烃合成能力的微生物确定、分离参与烃合成的基因，可以期待开发出烃合成能力优异的重组微生物、开发出利用该重组微生物的烃合成系统等。例如，在专利文献1(WO2006/109558)中，公开了通过培养具有烃生产能力的新微细藻类椭圆微细绿藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)、属于微细绿藻(Pseudochoricystis)属或索囊藻(Choricystis)属并具有烃生产能力的微细藻类而从培养物中提取烃的方法。

[0003] 另外，在专利文献2(日本特开2010-528627号公报)中，公开了在酵母等中插入有将醛转换为烷烃的基因的重组酵母、以及利用该重组酵母的烷烃的制造方法。进而，在专利文献3(日本特表2011-520455号公报)中，公开了来源于细长聚球藻(Synechococcus elongatus)的烷烃合成酶基因、醛合成酶基因，并公开了利用它们来制造烷烃、醛的方法。进而另外，在专利文献4(日本特开平09-322780号公报)中，公开了来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的编码参与脂肪醛脱羧酶活性的蛋白质的基因，并公开了利用该基因而显示改变的表皮蜡组成的转化植物。

[0004] 进而，在非专利文献1(Process Biochemistry,41,(2006),p.1001-1014)中，关于微生物中的烃合成途径进行了记载。另外，在非专利文献2(Appl.Microbiol.Biotechnol.,(2005),66:p.486-496)中，与专利文献1同样地关于藻类的一种布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)中的烃的生物合成进行了记载。并且，在专利文献3(Proc.Natl.Acad.Sci.,(1994),Vol.91,p.10000-10004)中，公开了一种来源于家蝇的、将醛转换为烃((Z)-9-二十三烯)的细胞色素P450基因。

[0005] 然而，在非专利文献1中公开的微生物、在非专利文献3中公开的家蝇由于烷烃生产量低而无法期待在实用水平中的应用。另外，在非专利文献2、专利文献1中公开的藻类，烷烃生成反应的速度缓慢，而且在细胞内蓄积烷烃。因此，即使利用在非专利文献2、专利文献1中公开的藻类，也会存在生产烷烃需要长时间、并且需要从细胞内纯化烷烃的工序，因而不能以低成本合成烷烃这样的的问题。进而，即使利用了在专利文献4中公开的基因而制作重组体，也没有能合成烷烃的实例，由于需要未知的基因等其他因子，因此无法实用。另外，还存在即使将来源于植物的基因用于微生物也很可能无法充分发挥功能这样的问题。另外，即使利用在专利文献3中公开的来源于蓝藻的烷烃合成酶基因，烷烃合成的生产性也低，实用性非常低。

[0006] 现有技术文献

[0007] 专利文献

[0008] 专利文献1：WO2006/109558

[0009] 专利文献2：日本特开2010-528627号公报

[0010] 专利文献3：日本特表2011-520455号公报

[0011] 专利文献4：日本特开平09-322780号公报

[0012] 非专利文献

[0013] 非专利文献1：Process Biochemistry,41,(2006),p.1001-1014

[0014] 非专利文献2：Appl.Microbiol.Biotechnol.,(2005),66:p.486-496[0015] 非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.,(1994),Vol.91,p.10000-10004发明内容

[0016] 发明要解决的课题

[0017] 于是，鉴于上述实际情况，本发明的目的在于，提供具有烷烃等烃合成能力优异的新功能的烃合成酶基因及其利用。

[0018] 用于解决课题的方法

[0019] 为了达到上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，具有规定的基序序列的一组蛋白质的由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性优异，并发现，可以将编码该蛋白质的基因在烃合成中利用，从而完成了本发明。

[0020] (1)基因，编码包含具有序列号1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质。

[0021] (2)根据(1)所述的基因，其特征在于，所述蛋白质在所述序列号1所示的基序序列的C末端侧进一步具有序列号2所示的基序序列。

[0022] (3)根据(1)所述的基因，，其特征在于，所述蛋白质是下述(a)～(d)的任一种：

[0023] (a)包含序列号3～32和65～170中任一偶数号所记载的氨基酸序列的蛋白质，[0024] (b)包含在序列号3～32和65～170中任一偶数号所记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质，

[0025] (c)包含与序列号3～32和65～170中任一偶数号所记载的氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质，

[0026] (d)由与包含序列号3～32和65～170中任一奇数号所记载的碱基序列的互补链的多核苷酸的至少一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且具有由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的蛋白质。

[0027] (4)根据(3)所述的基因，其特征在于，所述序列号3～32和65～170中任一偶数号是序列号6或12，所述序列号3～32和65～170中任一奇数号是序列号5或11。

[0028] (5)根据(1)所述的基因，其特征在于，来源于克雷伯氏菌属的微生物或来源于大肠杆菌。

[0029] (6)表达载体，具有上述(1)～(5)的任一项所述的基因。

[0030] (7)转化体，是导入上述(1)～(5)的任一项所述的基因而形成的。

[0031] (8)根据(7)所述的转化体，其特征在于，以大肠杆菌或酵母为宿主。

[0032] (9)蛋白质，由上述(1)～(5)的任一项所述的基因编码。

[0033] (10)烃的制造方法，使由上述(1)～(5)的任一项所述的基因编码的蛋白质、参与所述蛋白质的由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性的辅酶、与成为所述蛋白质的所述活性的底物的醛化合物共存，由该醛化合物合成碳原子数少一个的烃。

[0034] (11)根据(10)所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将导入上述(1)～(5)的任一项所述的基因而形成的转化体在包含所述醛化合物的溶液中培养，从而使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。

[0035] (12)根据(10)所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将从导入上述(1)～(5)的任一项所述的基因而形成的转化体提取到的酶液与包含所述醛化合物的溶液混合，从而使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。

[0036] (13)根据(10)所述的烃的制造方法，其特征在于，通过将从导入上述(1)～(5)的任一项所述的基因而形成的转化体中分离到的所述蛋白质与包含所述醛化合物和所述辅酶的溶液混合，从而使所述蛋白质、所述辅酶与所述醛化合物共存。

[0037] (14)根据(10)所述的烃的制造方法，其特征在于，所述醛化合物是碳原子数为11～21的醛化合物。

[0038] (15)根据(10)所述的烃的制造方法，其特征在于，所述辅酶是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH。

[0039] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2012-040141号的说明书和/或附图中记载的内容。

[0040] 发明的效果

[0041] 根据本发明，能够提供与现有公知的醛脱羧酶基因相比，将醛化合物转换为碳原子数少一个的烃的活性优异的烃合成酶基因。通过利用本发明的烃合成酶基因，能够以醛化合物作为底物，高效率且低成本地制造烃。

[0042] 图1是显示对于来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的10种基因制作成的转化体的“由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性”的测定结果的特性图。

[0043] 图2是对于载体对照株与gene02导入株的GC/MS分析图。

[0044] 图3是显示对于大肠杆菌(E.coli)W3110株的5种基因制作成的转化体的“由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性”的测定结果的特性图。

[0045] 图4是显示利用导入了来源于克雷伯氏菌属的gene02的转化体的破碎液上清、以各种醛化合物为底物的“由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性”的测定结果的特性图。

[0046] 图5是对于载体对照株和gene02导入株，以碳原子数为14的醛化合物为底物来测定碳原子数13的烷烃的GC/MS分析图。

[0047] 图6是显示转化大肠杆菌的破碎液、纯化后的His-tag蛋白质溶液的SDS-PAGE结果的照片。

[0048] 图7是显示利用纯化后的His-tag蛋白质的体外(in vitro)烷烃合成的结果的GC/MS分析图。

[0049] 图8是显示使用NADH或NADPH作为辅酶时的烷烃合成能力的比较结果的特性图。

[0050] 图9是对于导入了gene02基因的转化酵母的GC/MS分析图。

[0051] 图10-1是显示对于来源于各种生物种的53种基因制作成的转化体的“由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性”的测定结果的特性图。

[0052] 图10-2是显示对于来源于各种生物种的53种基因制作成的转化体的“由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性”的测定结果的特性图。

[0053] 以下，利用附图和实施例更详细地说明本发明。

[0054] 本发明的烃合成基因，是编码包含具有序列号1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有“由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的活性(以下将本活性称为烃合成活性)”的蛋白质的基因。烃合成活性，是能够由醛化合物合成碳原子数少一个的烃的酶活性，可以换句话说成从醛化合物中去除羰基的酶活性。此时，烃合成活性中也可以包含作为副生成物而生成一氧化碳、二氧化碳、碳酸、甲酸以及水等的反应。

[0055] 在此，序列号1所示的基序序列是被称为醛脱氢酶的谷氨酸活性部位(描述：Aldehyde dehydrogenases glutamic acid active site)的序列。在序列号1所示的氨基酸序列中，第1个Xaa是氨基酸的单字母符号为L、I、V、M、F、G或A的任一种。另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第3个Xaa是氨基酸的单字母符号为L、I、M、S、T、A或C的任一种。进而，在序列号1所示的氨基酸序列中，第4个Xaa是氨基酸的单字母符号为G或S的任一种。进而另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第6个Xaa是氨基酸的单字母符号为K、N、L或M的任一种。进而另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第7个Xaa是氨基酸的单字母符号为S、A、D或N的任一种。进而另外，在序列号1所示的氨基酸序列中，第8个Xaa是氨基酸的单字母符号为T、A、P、F或V的任一种。

[0056] 特别是本发明的烃合成基因优选为编码包含在序列号1所示的基序序列的C末端侧进一步具有序列号2所示的基序序列的氨基酸序列、且具有烃合成活性的蛋白质的基因。在此，序列号2所示的基序序列，对应于下述氨基酸序列：在对于由作为本发明的烃合成基因的来源于克雷伯氏菌属微生物的基因所编码的多种蛋白质，将它们的氨基酸序列进行多重比对分析时，高度保守的区域的氨基酸序列。在序列号2所示的氨基酸序列中，第1个Xaa是氨基酸的单字母符号为P、A或F的任一种。另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第2个Xaa是氨基酸的单字母符号为F、H或V的任一种。进而，在序列号2所示的氨基酸序列中，第3个Xaa是氨基酸的单字母符号为G或A的任一种。在序列号2所示的氨基酸序列中，第5个Xaa可以是任意氨基酸。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第6个Xaa是氨基酸的单字母符号为K、G或R的任一种。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第7个Xaa可以是任意氨基酸。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第
10个Xaa可以是任意氨基酸。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第11个Xaa是氨基酸的单字母符号是G或H的任一种。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第12个Xaa是氨基酸的单字母符号为R、K或G的任一种。进而另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，第13个Xaa是氨基酸的单字母符号为F、D、P或A的任一种。

[0057] 进而，作为本发明的烃合成基因，可以是来源于任何生物的基因，例如，可以从革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、植物、动物中确定、分离本发明的烃合成基因。例如，作为革兰氏阴性细菌，可以举出大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。作为革兰氏阳性细菌，可以举出枯草杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。另外，作为真菌，可以举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、米曲霉(Aspergillus oryzae)。进而，作为植物，可以举出玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)。进而另外，作为动物，可以举出黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、褐鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)。可以从各种生物中分离本发明的烃合成基因而适当使用。

[0058] 更具体而言，上述的编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的醛脱氢酶基因，可以由NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)这样的收纳基因信息的数据库中检索。检索的基因可以通过ACCESSION号如下特定。

[0059] 即，作为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-12W3110的基因，可以将BAE77705、BAA35791、BAA14869、BAA14992、BAA15032、BAA16524、BAE77705、BAA15538 和BAA15073确定为本发明的烃合成基因。另外，作为来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)_F1的基因，可以将YP_001268218、YP_001265586、YP_001267408、YP_001267629、YP_001266090、YP_001270490、YP_001268439、YP_001267367、YP_001267724、YP_001269548、YP_001268395、YP_001265936、YP_001270470、YP_001266779 和YP_001270298确定为本发明的烃合成基因。

[0060] 另外，作为来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)168株的基因，可以将NP_388129、NP_389813、NP_390984、NP_388203、NP_388616、NP_391658、NP_391762、NP_391865和NP_391675确定为本发明的烃合成基因。作为来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 的 基 因，可 以 将NP_599351、NP_599725、NP_601988、NP_599302、NP_601867和NP_601908确定为本发明的烃合成基因。作为来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM20016的基因，可以将YP_001270647确定为本发明的烃合成基因。

[0061] 进而，作为来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因，可以将NP_010996、NP_011904、NP_015264、NP_013828、NP_009560、NP_015019、NP_013893、NP_013892和NP_011902确定为本发明的烃合成基因。作为来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)MYA-3404 的基 因，可 以 将XP_002548035、XP_002545751、XP_002547036、XP_002547030、XP_002550712、XP_002547024、XP_002550173、XP_002546610 和XP_002550289确定为本发明的烃合成基因。作为来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)CBS767 的 基 因，可 以 将 XP_460395、XP_457244、XP_457404、XP_457750、XP_461954、XP_462433、XP_461708和XP_462528确定为本发明的烃合成基因。作为来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的基因，可以将XP_002489360、XP_002493450、XP_002491418、XP_002493229、XP_002490175、XP_002491360和XP_002491779确定为本发明的烃合成基因。作为来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的基因，可以将NP_593172、NP_593499、NP_594582确定为本发明的烃合成基因。作为来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40的基因，可以将XP_001822148、XP_001821214、XP_001826612、XP_001817160、XP_001817372、XP_001727192、XP_001826641、XP_001827501、XP_001825957、XP_001822309、XP_001727308、XP_001818713、XP_001819060、XP_001823047、XP_001817717和XP_001821011确定为本发明的烃合成基因。

[0062] 进而另外，作为来源于玉米(Zea mays)的基因，可以将NP_001150417、NP_001105047、NP_001147173、NP_001169123、NP_001105781、NP_001157807、NP_001157804、NP_001105891、NP_001105046、NP_001105576、NP_001105589、NP_001168661、NP_001149126和NP_001148092确定为本发明的烃合成基因。作为来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因，可以将NP_564204、NP_001185399、NP_178062、NP_001189589、NP_566749、NP_190383、NP_187321、NP_190400、NP_001077676和NP_175812确定为本发明的烃合成基因。

[0063] 进而另外，作为来源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的基因，可以将NP_733183、NP_609285、NP_001014665、NP_649099、NP_001189159、NP_610285和NP_610107确定为本发明的烃合成基因。作为来源于褐鼠(Rattus norvegicus)的基因，可以将NP_001006999、XP_001067816、XP_001068348、XP_001068253、NP_113919、XP_001062926、NP_071609、NP_071852、NP_058968、NP_001011975、NP_115792、NP_001178017、NP_001178707、NP_446348、NP_071992、XP_001059375、XP_001061872和NP_001128170确定为本发明的烃合成基因。作为来源于人(Homo sapiens)的基因，可以将NP_036322、NP_001193826、NP_001029345、NP_000684、NP_000680、NP_000683、NP_000681、NP_001071、NP_000687、NP_001180409、NP_001173、NP_000682、NP_000373、NP_001154976、NP_000685和NP_000686确定为本发明的烃合成基因。

[0064] 另一方面，对于上述的编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的基因，可以将没有在NCBI这样的数据库中注册的基因组序列未知的生物的基因组序列弄清楚，基于基因组序列信息来特定。更具体而言，可以按照常规方法对克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)NBRC100048株的基因组序列进行分析，基于该基因组序列信息来特定编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的基因。

[0065] 作为本发明的烃合成基因的来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的基因，可以特定10种基因。将这10种基因方便地命名为gene01～gene10。将这些gene01～10中的编码区的碱基序列以及由其编码的氨基酸序列总结于下述表1。

[0066] 表1

[0067]基因名 碱基序列 氨基酸序列
gene01 序列号3 序列号4
gene02 序列号5 序列号6
gene03 序列号7 序列号8
gene04 序列号9 序列号10
gene05 序列号11 序列号12
gene06 序列号13 序列号14
gene07 序列号15 序列号16
gene08 序列号17 序列号18
gene09 序列号19 序列号20
gene10 序列号21 序列号22

[0068] 此外，表1中列举的来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的基因，编码具有上述序列号2所示的基序序列的蛋白质。

[0069] 另外，作为上述在NCBI数据库中注册的基因的例子，关于来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-12W3110的基因BAA14869、BAA14992、BAA16524、BAE77705以及BAA15538这5种，将编码区的碱基序列以及由其编码的氨基酸序列总结于下述表2。

[0070] 表2

[0071]基因名 碱基序列 氨基酸序列
BAA14869 序列号23 序列号24
BAA14992 序列号25 序列号26
BAA16524 序列号27 序列号28
BAE77705 序列号29 序列号30
BAA15538 序列号31 序列号32

[0072] 进而，作为上述在NCBI数据库中注册的本发明的烃合成基因的例子，关于来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM20016、来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)MYA-3404、来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)CBS767、来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115、来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40、来源于玉米(Zea mays)、来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、来源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、来源于褐鼠(Rattus norvegicus)以及来源于人(Homo sapiens)的基因，将编码区的碱基序列以及由其编码的氨基酸序列总结于下述表3。此外，在表3中，在“基因名”的栏中记载了京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)中的gene ID。

[0073] 表3

[0074]

[0075]

[0076] 但是，本发明的烃合成基因不限定于以上述基因名、碱基序列以及氨基酸序列所特定的烃合成基因。

[0077] 本发明的烃合成基因还可以是编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质包含在上述的序列号3～32和65～170中任一偶数号所记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有烃合成活性。这里，所谓多个氨基酸，是指例如2～
100个、优选为2～80个、更优选为2～50个、进一步优选为2～15个氨基酸。

[0078] 另外，本发明的烃合成基因还可以是编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质包含相对于序列号3～32和65～170中任一偶数号所记载的氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、进一步优选85％以上、更优选90％以上、最优选98％以上的同一性的氨基酸序列、且具有烃合成活性。序列之间的同一性，是指以默认的设定使用BLAST、PSI-BLAST、HMMER这些序列类似性检索软件来显示两个氨基酸序列之间的一致度的值(比例)。

[0079] 进而，本发明的烃合成基因还可以是编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质由与包含序列号3～32和65～170中任一奇数号所记载的碱基序列的互补链的多核苷酸的至少一部分在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且具有烃合成活性。在此所说的“严格条件”，是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种条件，例如可以参照《分子克隆试验指南(第三版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Third Edition))适当确定。具体而言，可以根据DNA印迹(Southern blot)杂交时的温度和/或溶液中所含的盐浓度、以及DNA印迹杂交的洗涤工序时的温度和/或溶液中所含的盐浓度来设定严格度。更详细而言，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体而言，为5×SSC(83mM NaCl，83mM柠檬酸钠)、温度42℃。另外，所谓多核苷酸的至少一部分，是包括包含规定的碱基序列的互补链的多核苷酸的全部、包含该互补链的多核苷酸的全部的连续的部分两者的含义。

[0080] 此外，对规定的氨基酸序列导入变异，可以通过采用该技术领域中公知的方法改变上述烃合成基因的碱基序列来进行。对碱基序列导入变异，可以通过Kunkel法或Gapped duplex法(缺口双链体法)等公知方法或者依据这些公知方法的方法进行，例如使用利用了定点诱变法的突变导入用试剂盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名，TAKARA Bio社制))等，或者使用LA PCR体外诱变(LA PCR in vitro Mutagenesis)系列试剂盒(商品名，TAKARA Bio公司制)导入突变。另外，作为突变导入方法，可以为使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，也可以为利用以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表的放射线处理和/或紫外线处理的方法。

[0081] 关于包含规定的碱基序列的基因是否编码具有烃合成活性的蛋白质，只要制作在适当的启动子与终止子等之间插入有该基因的表达载体，使用该表达载体转化适当的宿主，测定表达的蛋白质的烃合成活性即可。在此为了测定烃合成活性，只要在包含成为底物的醛化合物的溶液中培养上述转化体，利用气相色谱/质量分析装置来测定来源于于上述醛化合物的烃(比底物的醛化合物碳原子数少一个的烃)即可。此外，在定量地测定烃合成活性时，通过气相色谱/质量分析装置定量生成的烃即可。作为醛化合物，详细内容后面叙述，例如可以利用十四醛等。

[0082] 以上说明的本发明的烃合成基因被插入到适当的表达载体中，导入到宿主中。在此，作为宿主，只要是能够表达本发明的烃合成基因的生物，就没有特别限定。作为宿主，例如可以举出，大肠杆菌(Escherichia coli)等属于埃希氏菌属的细菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)等属于芽孢杆菌属的细菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等属于假单胞菌属的细菌、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等属于根瘤菌属的细菌，可以举出包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等酵母、丝状菌等的真菌。

[0083] 以大肠杆菌等细菌为宿主时，表达载体优选在能够在该细菌中自主复制的同时，由启动子、核糖体结合序列、上述基因、转录终止序列构成。另外，在表达载体中也可以包含控制启动子活性的基因。

[0084] 作为大肠杆菌，例如可以使用大肠杆菌BL21(DE3)株、K12株、DH1株、JM109株等现有公知的任意菌株。作为大肠杆菌，特别可以使用K12株和由K12株制作成的株等所谓K株。另外，作为枯草杆菌，例如可以举出枯草杆菌168株等。

[0085] 作为启动子，只要能够在大肠杆菌等宿主中表达，则可以使用任一种。例如可以使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来源于大肠杆菌的启动子、T7启动子等来源于噬菌体的启动子。进而，还可以使用tac启动子等这种经人为设计改变的启动子。

[0086] 作为表达载体的导入方法，只要是对细菌导入DNA的方法，则没有特别限定。例如可以举出使用钙离子的方法[Cohen,S.N.,et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69:2110-2114(1972)]、电穿孔法等。

[0087] 另外，作为可以用作宿主的酵母，没有特别限定，可以举出休哈塔假丝酵母(Candida Shehatae)等假丝酵母(Candida)属酵母、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)等毕赤酵母(Pichia)属酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)等管囊酵母(Pachysolen)属酵母、酿酒酵母等酵母(Saccharomyces)属酵母以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属酵母，特别优选酿酒酵母。

[0088] 另外，在强化本发明的烃合成基因的表达时，使用转录活性高的适当启动子。作为这种启动子，没有特别限定，例如可以利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子、高渗透压应答7基因(HOR7)的启动子等。其中，丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子使下游的目标基因高表达的能力高，因而优选。此外，也可以通过使用gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白质启动子、MFα1启动子、PHO5启动子、GAP启动子、ADH启动子、AOX1启动子等而使下游的基因强表达。

[0089] 另外，作为导入上述基因的方法，也可以应用作为酵母的转化方法已知的、现有公知任意方法。具体而言，例如可以采用电穿孔法“Meth.Enzym.,194,p182(1990)”、原 生 质 球 法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)”、 乙 酸 锂 法“J.Bacteriology,153,p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics,2000 Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法实施，但不限定于此。

[0090] 如上，导入了本发明的烃合成基因的重组生物、例如重组大肠杆菌、重组酵母，通过上述烃合成基因表达，如果醛化合物和NADH等辅酶存在，则能够由该醛化合物合成烃。此时，在此由本发明的烃合成基因所编码的蛋白质能够在烃合成活性中利用NADH作为辅酶。NADH在细胞内丰富存在，因此辅酶的量不会成为烃合成反应的限速因子。所以，导入了本发明的烃合成基因的重组生物、例如重组大肠杆菌、重组酵母，能够以优异的反应效率合成烃。此外，由本发明的烃合成基因所编码的蛋白质可以使用NADH和NADPH的任一者作为辅酶。

[0091] 在此，能够合成的烃是包含链状结构的烃(链式烃)和包含环结构的烃(环式烃)两者。此外，包含链状结构的烃也可以是具有1个以上支链的结构。作为支链，可以举出甲基、乙基、丙基以及丁基(包含叔丁基)等烷基、炔基、烯基等。另外，作为支链，可以举出氯甲基、乙酰基、2-吡啶基、羟基苯基、氨基乙酰基、甲氧基、苯氧基、甲基硫基、苯基硫基等。进而，合成对象的烃可以是饱和烃(烷烃)，也可以是不饱和烃(烯烃和炔烃)。

[0092] 另一方面，作为合成对象的烃的碳原子数，没有特别限定，但优选在常温下是液体的碳原子数5～20左右。另外，作为合成对象的烃，考虑作为柴油机燃料的利用而优选碳原子数为10～20的饱和烃，特别是更优选碳原子数为12～14的饱和烃，特别是最优选碳原子数为13的饱和烃。更具体而言，作为合成对象的烃，可以举出碳原子数为12的十二烷、碳原子数为13的十三烷以及碳原子数为14的十四烷。

[0093] 此外，合成上述列举的特定的烃时，适当选择作为底物的醛化合物即可。即，由于通过烃合成活性而以醛化合物为底物来合成烃，因此，根据目标烃的结构来选择适当醛化合物即可。

[0094] 另一方面，本发明的烃合成基因也能够用于体外(in vitro)的烃的制造方法。作为一例，可以使用将导入了本发明的烃合成基因的重组生物，例如重组大肠杆菌、重组酵母破碎而得的破碎溶液，或者由破碎溶液提取包含由该烃合成基因编码的蛋白质的级分而得的提取液，在体外合成烃。即，通过在上述破碎溶液、上述提取液中添加成为底物的醛化合物(如有必要的NADH等辅酶)，能够在体外合成烃。特别是由于在上述破碎溶液、上述提取液中丰富地包含NADH等辅酶，因此，大多时候可以仅在上述破碎溶液、上述提取液中添加成为底物的醛化合物而不添加NADH等辅酶。换言之，利用本发明的烃合成基因时，能够在不需要昂贵的NADPH等辅酶的条件下高效地合成烃。

[0095] 或者，可以按照常规方法将由本发明的烃合成基因所编码的蛋白质进行粗纯化或纯化，通过将粗纯化或者纯化而得的蛋白质、成为底物的醛化合物与NADH等辅酶混合，从而在体外合成烃。在此，由本发明的烃合成基因所编码的蛋白质，在烃合成活性中可以利用NADH作为辅酶，不是必须使用昂贵的NADPH。所以，利用由本发明的烃合成基因所编码的蛋白质时，通过作为辅酶使用更廉价的NADH，从而可以在体外合成烃时实现低成本化。

[0096] 其中，合成而得的烃可以按照常规方法进行分离。例如在培养基中培养上述重组酵母，生产烃。由于合成而得的烃在培养基中合成，因此可以从利用离心分离等手段从培养基中分离出菌体后的上清级分中分离。由上清级分分离烃时，例如可以在上清级分中添加乙酸乙酯和甲醇等有机溶剂，充分搅拌。分离成水层和溶剂层，可以从溶剂层中提取烃。

[0097] 实施例

[0098] 下面，通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限定于以下的实施例。

[0099] 〔实施例1〕

[0100] 本实施例中，按照常规方法分析具有烷烃合成能力的微生物克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)NBRC100048株的基因组序列，基于该基因组序列信息，特定编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的10种基因。对于本实施例所特定的10种基因命名为gene01～10，推定其功能。将对于这10种基因推定出的功能和与序列相关的信息总结于表4。

[0101] 表4

[0102]基因名 推定功能 碱基序列 氨基酸序列
gene01 苯乙醛:NAD+氧化还原酶 序列号3 序列号4
gene02 苯乙醛:NAD+氧化还原酶 序列号5 序列号6
gene03 4-氨基丁醛:NAD+1-氧化还原酶 序列号7 序列号8
gene04 醛脱氢酶 序列号9 序列号10
gene05 琥珀酸半醛:NAD+氧化还原酶 序列号11 序列号12
gene06 琥珀酸半醛:NAD+氧化还原酶 序列号13 序列号14
gene07 甜菜碱醛:NAD+氧化还原酶 序列号15 序列号16
gene08 N-琥珀酰-L-谷氨酸5-半醛:NAD+氧化还原酶 序列号17 序列号18
gene09 (S)-乳醛:NAD+氧化还原酶 序列号19 序列号20
gene10 甜菜碱醛:NAD+氧化还原酶 序列号21 序列号22

[0103] 本实施例中，除这10种基因以外，还由大肠杆菌(E.coli)W3110株的基因组信息特定了编码具有序列号1所示的基序序列的蛋白质的基因。特别是本实施例中，着眼于所特定的基因中表5所示的以下5种基因。

[0104] 表5

[0105]基因名 推定功能 碱基序列 氨基酸序列
BAA14869 γ-Glu-γ-氨基丁醛脱氢酶,NAD(P)H-依赖 序列号23 序列号24
BAA14992 苯乙醛脱氢酶 序列号25 序列号26
BAA16524 琥珀酸半醛脱氢酶,NADP-依赖 序列号27 序列号28
BAE77705 醛脱氢酶B 序列号29 序列号30
BAA15538 琥珀酰谷氨酸半醛脱氢酶 序列号31 序列号32

[0106] 分别以克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)NBRC100048株的基因组DNA或者大肠杆菌(E.coli)W3110株的基因组DNA为模板通过PCR来扩增包含这15种基因的核酸片段。将PCR中使用的引物示于表6。其中，提取基因组DNA使用DNeasy Blood & Kit(QIAGEN公司制)。

[0107] 表6

[0108]

[0109] 此外，在这些引物上添加用于同源重组的序列(与载体同源的区域)。另外，PCR使用PfuUltra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase(Stratagene’s社制)。将PCR扩增而成的核酸片段、BamHI处理而得的pUC118质粒混合，从而在载体中插入通过同源重组扩增而成的核酸片段。此外，纯化PCR产物使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社制)，连接PCR产物使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社制)。

[0110] 用所得表达质粒转化大肠杆菌(E.coli)JM109。将转化而得的大肠杆菌在1ml LB培养基(氨苄青霉素100μg/ml)中以37℃、100转/分钟培养一夜。在3ml LB培养基(氨苄青霉素100μg/ml，Triton X-1000.1％，IPTG0.5mM以及十四醛1mM)中以10％体积接种该培养液，于30℃以100转/分钟培养24小时。

[0111] 对该培养液收集菌体(室温，6000×g，5分钟)，将1ml上清加入到玻璃制小瓶(Agilent Technologies社制)中，提供给GC/MS分析，检测由十四醛合成得到的十三烷。此外，在GC/MS分析中，作为顶空进样器，使用HP7694(Hewlett-Packard社制)，将顶空进样器分析条件示于表7，将GC/MS分析条件示于表8。

[0112] 表7

[0113]

[0114] 表8

[0115]

[0116] 将使用本实施例中所特定的、来源于克雷伯氏菌属的10种基因时的分析结果示于图1。如图1所示，可以明确，本实施例中所特定的、来源于克雷伯氏菌属的10种基因全部是具有烃合成活性的基因。另外，可以明确由gene02和gene05所编码的蛋白质具有特别优异的烃合成活性。此外，关于载体对照株和gene02导入株，将GC/MS分析的分析图例示性地示于图2。

[0117] 同样地将使用本实施例中所特定的大肠杆菌(E.coli)W3110株的5种基因时的分析结果示于图3。如图3所示，可以明确，本实施例中所特定的大肠杆菌(E.coli)W3110株的5种基因全部是具有烃合成活性的基因。另外，可以明确，由BAA14992和BAA14869所编码的蛋白质具有特别优异的烃合成活性。

[0118] 〔实施例2〕

[0119] 本实施例中，使用实施例1中作为编码烃合成活性优异的蛋白质的基因而被赋予特征的gene02，尝试体外的烷烃合成。

[0120] 具体而言，将导入了实施例1中制作的gene02的重组大肠杆菌在1ml LB培养基(氨苄青霉素100μg/ml)中以37℃、100转/分钟培养一夜。其后，在1ml LB培养基(氨苄青霉素100μg/ml，IPTG0.5mM)中以1％体积接种该培养液，以30℃、120转/分钟培养6小时。接着，将该培养液收集菌体(4℃，6000×g，3分钟)，将菌体在500μl的磷酸缓冲液(pH7.2)中悬浮后，使用超声波破碎机破碎(4℃，10分钟)细胞。接着，将所得的破碎液进行离心分离(4℃，10000×g，5分钟)，收取上清。将收取的溶液用于酶试验。

[0121] 酶反应以表9所示的反应组成在30℃下进行一夜。此外，本实施例中，作为醛化合物分别使用8种碳原子数为11～18的醛。此外，所合成的烷烃的碳原子数为比醛化合物的碳原子数少一个。

[0122] 表9

[0123]

[0124] 将合成得到的碳原子数为10～17的烷烃生成量示于图4。如图4所判断的那样，可以明确由gene02所编码的蛋白质，合成碳原子数为12～14的烷烃的能力特别优异。此外，对于载体对照株和gene02导入株，将以碳原子数为14的醛化合物作为底物测定碳原子数为13的烷烃的GC/MS分析的分析图表例示性地示于图5。

[0125] 〔实施例3〕

[0126] 本实施例中，将由实施例1中所特定的gene04所编码的蛋白质纯化，使用纯化得到的蛋白质尝试体外的烷烃合成。

[0127] 具体而言，以与实施例1同样制备的克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)NBRC100048株的基因组DNA为模板，利用一对引物(正向引物：accacagccaggatccGCGTTATGCACACCCTGGCCAGCCCGGCGCCCTG(序列号63)和反向引物：gctcgaattcggatccTCAGAACAGGCCCAGCGGCGCGGTGCCGTAGCT(序列号64))进行PCR。将PCR产物与pRSFduet-1质粒(Novagen公司制)的BamHI位点连接。此外，PCR扩增试剂盒、PCR产物的纯化试剂盒、PCR产物的连接试剂盒使用与实施例1相同的试剂盒。

[0128] 接着，在所得的表达载体中转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。将该大肠杆菌在2ml LB培养基(卡那霉素20μg/ml)中以37℃、120转/分钟培养一夜。其后，在10ml LB培养基(卡那霉素20μg/ml，IPTG0.5mM)中以1％体积接种该培养液，在37℃下培养5小时。将该培养液收集菌体(4℃，6000×g，3分钟)，在1ml磷酸缓冲液(pH7.2)中悬浮菌体后，利用超声波破碎机破碎细胞(4℃，10分钟)。

[0129] 接着，使用TALON CellThru Resin(Clontech社制)从所得破碎液中进行His-tag蛋白质的纯化。对于用连接有gene04的pRSFduet-1质粒转化而得的大肠杆菌的破碎液、用没有连接gene04的pRSFduet-1质粒转化而得的大肠杆菌的破碎液、以及包含纯化得到的His-tag蛋白质的溶液，将SDS-PAGE的结果示于图6。图6中，带1是用没有连接gene04的pRSFduet-1质粒转化而得的大肠杆菌的破碎液，带2是用连接有gene04的pRSFduet-1质粒转化而得的大肠杆菌的破碎液，带3是包含纯化得到的His-tag蛋白质的溶液。如图6所示，可以明确能够在由gene04的碱基序列预测的蛋白质的分子量56.6kDa的位置纯化His-tag蛋白质。

[0130] 接着，使用包含His-tag蛋白质的溶液进行体外的烷烃合成反应。酶反应以表10所示的反应组成于30℃进行一夜。另外，本实施例中，作为醛化合物使用十四醛。此外，合成的烷烃是十三烷。

[0131] 表10

[0132]

[0133] 酶反应完成后，与实施例1、2同样地通过GC/MS测定合成的烷烃。将GC/MS分析的分析图示于图7。图7中，(a)是使用上述反应液组成时的GC/MS分析的分析图，(b)是在上述反应液组成中没有加入His-tag蛋白质溶出液时的GC/MS分析的分析图，(c)是在上述反应液组成中没有加入辅酶时的GC/MS分析的分析图。如图7所示，根据本实施例可以明确，由gene04所编码的蛋白质不是在细胞提取液的状态下、而是在纯化得到的蛋白质的状态下显示出烃合成活性。

[0134] 另外，本实施例中，也对于作为辅酶使用NADPH时的烃合成活性进行了研究。即，除了作为辅酶使用NADPH之外，进行与上述例子同样的酶反应，通过GC/MS测定合成的烷烃。将该结果示于图8。由图8所判断的那样，可以明确由gene04所编码的蛋白质能够使用NADPH和NADH的任一者作为辅酶。另外，由gene04所编码的蛋白质还显示出将NADH用作辅酶时比将NADPH用作辅酶时烃合成活性优异。

[0135] 〔实施例4〕

[0136] 本实施例中，使实施例1中作为编码烃合成活性优异的蛋白质的基因而被赋予特征的gene02在酵母中表达，尝试烷烃合成。

[0137] 具体而言，以与实施例1同样制备的克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)NBRC100048株的基因组DNA为模板，使用一对引物(正向引物：aacaaacaaaggatccaaaaaaATGCGTTATGCACACCCTGGCCAGC(序列号171)和反 向引物：gtcgtattacggatccttaTCAGAACAGGCCCAGCGGCGCGGTG(序列号172))进行PCR。PCR中使用PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase(Stratagene’s社制)。

[0138] 使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社制)将经PCR扩增而得的核酸片段连接到pESCpgkgap-HIS载体(参照国际公开公报WO 2012/098662号)的BamHI位点。用所得的表达质粒转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499株。酵母的转化按照Frozen-EZ Yeast TransformationⅡKit(ZYMO RESEARCH公司制)所附带的规程进行。

[0139] 接着，将所得转化酵母的集落在1ml的SD-His液体培养基中接菌，在30℃下培养一夜(オリエンタル技研工业制IFM型，130转/分钟)后，在3ml的SD-His培养基(添加1mM十四醛)中以1％体积接种该前培养液，以30℃、100转/分钟培养2天。

[0140] 培养结束后，通过实施例1中记载的方法提供给GC/MS分析。将分析结果示于图9。如图9所示，可以判断来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)NBRC100048株的gene02基因在利用酵母作为宿主时，作为编码显示出优异的烃合成活性的蛋白质的基因发挥功能。

[0141] 〔实施例5〕

[0142] 本实施例中，对于来源于各种生物种的烷烃合成酶基因，评价烷烃合成能力。

[0143] 具体而言，对于上述表3所示的来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM20016、来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)MYA-3404、来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)CBS767、来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115、来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40、来源于玉米(Zea mays)、来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、来 源于黑 腹果 蝇(Drosophila melanogaster)、来源 于褐 鼠(Rattus norvegicus)以及来源于人(Homo sapiens)的53种基因，与实施例1同样地评价烷烃合成能力。此外，本实施例中，作为宿主使用大肠杆菌JM109。

[0144] 这53种基因的扩增中，使用下述表11所示的一对引物。

[0145] 表11

[0146]

[0147]

[0148]

[0149] 此外，对于表11所示的53种基因中来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032(NCgl0098、NCgl0463、NCgl2698、NCgl0049、NCgl2578 以 及NCgl2619)、来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM20016(Lreu_0034)以及来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(YER073W、YHR037W、YHR039C、YMR169C、YMR170C、YOR374W、YBR006W、YMR110C以及YPL061W)的基因，以由各菌株中提取出的基因组DNA作为模板。另外，对于表11所示的53种类的基因中来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)MYA-3404(CTRG_04587、CTRG_01342以 及CTRG_00532)、来 源于汉逊德巴 利酵母(Debaryomyces hansenii)CBS767(DEHA2G03740g、DEHA2G22572g以及DEHA2B10384g)、来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(PAS_chr1-3_0024、PAS_chr2-1_0853以及PAS_chr4_0043)、来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(SPAC139.05、SPAC1002.12c以及SPAC9E9.09c)、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40(AOR_1_1204144和AOR_1_1330014)以及来源于玉米(Zea mays)(100284047)的基因，以基于KEGG上的氨基酸序列化学合成而得的人工基因作为模板。进而，对于表11所示的53种基因中来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因(AT1G23800、AT1G74920、AT1G79440、AT2G24270、AT3G24503、AT3G48000以及AT1G54100)，以由ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection)购买的cDNA文库：ATCC77500作为模板。并且，对于表11所示的53种基因中来源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的基因(Dmel_CG3752、Dmel_CG7145、Dmel_CG8665、Dmel_CG11140、Dmel_CG31075、Dmel_CG4685以及Dmel_CG9629)，以由ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection)购买的cDNA文库：ATCC87285为模板。进而另外，对于表11所示的53种基因中来源于褐鼠(Rattus norvegicus)的基因(24188和641316)，以由ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection)购买的cDNA文库：ATCC77403为模板。并且，对于表11所示的53种基因中来源于人(Homo sapiens)的基因(216、219、223、224、501以及64577)，以由ATCC(American Type Culture Collection)购买的cDNA文库：
ATCC77402为模板。

[0150] 此外，PCR的条件、转化体的培养条件以及烷烃的分析法与实施例1相同。将烷烃分析的结果示于图10-1和图10-2。如图10-1和图10-2所示，可以明确上述53种基因全部是具有烃合成活性的基因。特别是可以明确，NCgl0098(试验No.1)、NCgl0049(试验No.4)、NCgl2619(试验No.6)、YER073W(试验No.8)、YOR374W(试验No.13)、YBR006W(试验No.14)、YMR110C(试验No.15)、CTRG_04587(试验No.17)、PAS_chr2-1_0853(试验No.24)、SPAC139.05(试验No.26)、AOR_1_1204144(试验No.29)以及Dmel_CG7145(试验No.40)，是具有特别优异的烃合成活性的基因。

[0151] 将本说明书中引用的全部刊物、专利以及专利申请直接作为参考引入本说明书中。