运动替斯崔纳菌、卤醇脱卤酶、基因、载体、重组菌及其应用 |
|||||||
| 申请号 | CN201410438169.5 | 申请日 | 2014-08-29 | 公开(公告)号 | CN104263713A | 公开(公告)日 | 2015-01-07 |
| 申请人 | 浙江工业大学; | 发明人 | 柳志强; 郑裕国; 薛锋; 王亚军; 万南微; 窦宾贤; 沈寅初; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种运动替斯崔纳菌、卤醇脱卤酶、基因、载体、重组菌及其应用；所述重组卤醇脱卤酶的 氨 基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述卤醇脱卤酶能够不对称催化1,3-二氯丙醇和1,3-二溴丙醇生成(S)-环 氧 氯丙烷和(S)-环氧溴丙烷，同时对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的活性要明显远高于其它卤醇脱卤酶，是目前发现的对于该底物活性最高的一种天然卤醇脱卤酶，可作为催化剂应用于制备环氧化物或 手性 环氧化物以及 阿托伐他汀 中间体，催化效率高，对映选择性强，底物适应性广，具有很好的工业应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种来源于运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405的重组卤醇脱卤酶，其特征在于：所述重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。 |
||||||
| 说明书全文 | 运动替斯崔纳菌、卤醇脱卤酶、基因、载体、重组菌及其应用(一)技术领域 [0001] 本发明涉及一种来源运动替斯崔纳菌的卤醇脱卤酶基因，含有该基因的重组表达载体和重组菌，利用重组菌制备重组酶的方法，以及该重组卤醇脱卤酶制备环氧化物、手性环氧化物、β-取代醇，以及在制备阿托伐他汀关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。(二)背景技术 [0002] 卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解有机卤化合物的关键酶之一。根据其序列同源性分为Hhe A、Hhe B和Hhe C3类。有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一，主要是由于排废以及人工合成卤化物的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物和脱卤酶降解有机卤化物已引起人们广泛的关注，在环境污染治理，特别是手性环氧化物合成方面等具有十分重要的作用。 [0003] 卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低酪氨酸的pKa值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应，可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非- - -自然亲核试剂，如N3、NO2、CN 等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的β-取代醇。因此可以用来合成一些非自然手性化合物。 [0004] 卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及β-取代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。卤醇脱卤酶已成功应用于他汀类药物关键手性中间体的合成。从目前已有的文献报道中可以知道，最适于催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的卤醇脱卤酶是来源于Agrobacterium radiobacter AD1的-3Hhe C。但是原始Hhe C活力还是很低。时空产率只有6×10 g/L/h。对Hhe C改造最成功的是来自Codexis公司的科学家，他们利用蛋白质序列-活性相关性(ProSAR)驱动的蛋白质定向进化策略对Hhe C进行了改造，经过18轮的突变，得到了一株活力非常高的突变株，其催化(S)-CHBE的活力是野生型酶的约4000倍。底物浓度为140g/L，酶量为1.2g/L，反应5h，产率为92％，ee值大于99.5％。目前能运用于工业化生产的只有此突变酶，因此挖掘对该底物具有较高催化活性的具有自主知识产权的新型卤醇脱卤酶，并将其运用于工业化生产，具有潜在的市场应用前景。 [0005] 利用卤醇脱卤酶直接不对称脱卤合成手性环氧氯丙烷的文献较少。Tetsuji等利用来源于Corynebacterium sp.N-1074中的Hhe B催化5mM 1,3-二氯丙醇生成(R)-环氧氯丙烷。反应初始阶段(R)-环氧氯丙烷的ee值最大可达90％，但随着反应的进行，ee值慢慢下降直至最终为零。 [0006] Lutje Spelberg等利用来源于Agrobacterium radiobacter AD1的卤醇脱卤酶Hhe C催化1,3-二氯丙醇或2,3-二氯-1-丙醇合成环氧氯丙烷，其ee值小于5％。 [0007] 近年来，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化形成环氧化合物及β-取代醇。目前已知的卤醇脱卤酶，仅有7种，分别来自于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)，节杆菌(Agrobacter sp.AD2)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.N-1074)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、结核杆菌(Mycobacterium sp.)、壤霉菌(Agromyces mediolanus ZJB120203)。所以对已有卤醇脱卤酶进行研究的同时，挖掘新的微生物来源的卤醇脱卤酶基因，并挖掘新型卤醇脱卤酶的应用前景是今后研究的热点。目前对卤醇脱卤酶的研究集中于发现催化反应时间短、产物产率高，对映体选择性高且副反应少的卤醇脱卤酶。(三)发明内容 [0008] 本发明目的是提供一种编码重组卤醇脱卤酶的碱基序列，编码的重组卤醇脱卤酶，同时提供了含有上述碱基序列的重组载体，以及由这种重组载体转化宿主而得到的转化体。本发明还提供了重组卤醇脱卤酶对1,3-二氯丙醇、1,3-二溴丙醇和(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯显示出高活性，利用该酶由1,3-二氯丙醇、1,3-二溴丙醇和(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯来制备(S)-环氧氯丙烷、(S)-环氧溴丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法。以及该重组卤醇脱卤酶在催化其它卤代醇生物脱卤或不对称拆分环氧化物合成手性环氧化物和β-取代醇中的应用。 [0009] 本发明采用的技术方案是： [0010] 本发明提供一种来源于运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405的重组卤醇脱卤酶，所述重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。 [0011] 本发明还提供一种所述重组卤醇脱卤酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No:1所示。 [0012] 本发明的卤醇脱卤酶基因来源于Tistrella mobilis ZJB1405。具体制备方法可为：根据Genbank中收录预测的Tistrella mobilis KA081020-065中halohydrin epoxidase A基因序列设计PCR引物。较佳的，引物1CGCCATATGATGCCTGTCACCGACACCGC(下划线为Nde I酶切位点)，引物2ATTTGCGGCCGC TTACGGCCAGCCGCCGGTG(下划线为Not I酶切位点)。然后以Tistrella mobilis ZJB1405的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得一条完整的卤醇脱卤酶全长基因序列，碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为HHDHTm，全长747bp。其中，其编码序列从第1个碱基至第744个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。 [0013] 本发明涉及一种所述编码基因构建的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发明的重组卤醇脱卤酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为pET28a(b)。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的卤醇脱卤酶基因产物与载体pGEM-T连接，获得克隆载体pGEM-T-HHDHTm，之后将克隆载体和表达载体pET28b用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的卤醇脱卤酶基因的重组表达载体pET28b-HHDHTm。 [0014] 本发明涉及一种所述重组载体构建的重组基因工程菌。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的重组卤醇脱卤酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET28b-HHDHTm转化至(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm. [0015] 本发明涉及一种所述编码基因在制备重组卤醇脱卤酶中的应用，所述的应用为：构建含所述重组卤醇脱卤酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。其包括如下步骤：培养本发明的重组工程菌，获得重组表达卤醇脱卤酶。其中，所述的重组工程菌同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组大肠杆菌所用的培养基可为本领域任何可使重组工程菌生长并产生本发明的卤醇脱卤酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组工程菌能够生长并产生本发明所述的卤醇脱卤酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌重组表达转化体接种至含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.8时，在终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组卤醇脱卤酶。 [0016] 本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在催化卤代醇制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以卤代醇为底物，在pH值为8～10的缓冲液中，于35℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述卤代醇为1,3-二氯丙醇、1,3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇、1,3-二溴-2-丙醇或2,3-二溴-2-丙醇，所述湿菌体的用量为10～50g/L缓冲液(优选20-40g/L)，所述底物的初始浓度为5～50mmol/L缓冲液(优选20-40mmol/L)。 [0017] 进一步，本发明所述催化剂(即湿菌体)按如下方法制备：将含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按体积浓度1％的接种量接入LB液体培养基中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集湿菌体。 [0018] 本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在催化卤代羟基丁酸乙酯脱卤中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以卤代羟基丁酸乙酯为底物，在pH值为7～10的缓冲液中，于35℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述卤代羟基丁酸乙酯为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，所述湿菌体的用量为10～60g/L缓冲液(优选20-40g/L)，所述底物的初始浓度为10～150g/L缓冲液(优选50-100g/L)。 [0019] 本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在催化拆分环氧化物制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以环氧化物为底物，加入亲核试剂，在pH值为4～7的缓冲液中，于35℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述环氧化物为苯基环氧乙烷或环氧氯丙烷，所述湿菌体的用量为10～50g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为10～100mmol/L缓冲液(优选20-40mmol/L)，所述亲核试剂为NaN3，NaNO2或NaCN，所述亲核试剂的加入量为20～200mmol/L缓冲液(优选50-100mmol/L)。 [0020] 上述应用中，所述的反应各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。 [0021] 本发明所用试剂和原料均市售可得。 [0022] 此外，本发明从土壤微生物中经过初筛、复筛和分离纯化，得到一种能够产卤醇脱卤酶的新菌株——--运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年5月7日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014187，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。 [0023] 本发明所述的运动替斯崔纳菌可在温度25-35℃范围内生长，在pH5-9的环境中生存。 [0024] 所述运动替斯崔纳菌ZJB1405的培养基组成：甘油1-30g/L，酵母膏1-30g/L， 蛋 白 胨 1-20g/L，(NH4)2SO40.1-3g/L，K2HPO40.1-3g/L，Na2HPO4·2H2O0.1-3g/L，NaH2PO4·12H2O0.1-3g/L，MgSO4·7H2O0.1-3g/L，NaCl0.1-3g/L，溶剂为去离子水，pH5-8，121℃灭菌20min。 [0025] 所述运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405的培养方法较佳地包括摇瓶培养：其中，所述摇瓶装液量为10％-30％(v/v)，接种量为1-8％，培养温度为20-40℃，摇床转速为100-200rpm，培养时间为24-72h，培养液离心、洗涤得到静息细胞。 [0026] 本发明的有益效果主要体现在：针对目前报道的产卤醇脱卤酶菌株和已克隆表达研究的卤醇脱卤酶较少，并且仅有Hhe C的突变体应用于工业化生产等问题。筛选到一株产卤醇脱卤酶菌株：运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis ZJB1405)。本发明的卤醇脱卤酶是首次从运动替斯崔纳菌中克隆表达得到，该卤醇脱卤酶与已确认的其它卤醇脱卤酶相似性很低(小于40％)，该卤醇脱卤酶能够不对称催化1,3-二氯丙醇(比活力：2696.7U/g)和1,3-二溴丙醇(比活力：6188.7U/g)生成(S)-环氧氯丙烷和(S)-环氧溴丙烷，且比活力和(S)-环氧氯丙烷和(S)-环氧溴丙烷的ee值都是目前最高的(>60％)。同时该原始卤醇脱卤酶和其它野生型卤醇脱卤酶相比，对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的活性要明显远高于其它卤醇脱卤酶，是目前发现的对于该底物活性最高的一种天然卤醇脱卤酶，可以不经改造直接用于工业化生产。本发明的重组卤醇脱卤酶可作为催化剂应用于制备环氧化物或手性环氧化物以及阿托伐他汀中间体，催化效率高，对映选择性强，底物适应性广，具有很好的工业应用前景。(四)附图说明 [0027] 图1为克隆载体pGEM-T-HHDHTm物理图谱； [0028] 图2为pET28b-HHDHTm重组质粒物理图谱； [0030] 图4阳性重组质粒pET28b-HHDHTm的酶切结构图；其中，1为λDNA/HindⅢ DNA Marker；2 为 pET28b-HHDHTm/Nde I 样 品；3 为 pET28b-HHDHTm/Xho I 样 品；4 为pET28b-HHDHTm/Nde I and Not I样品；5为DL2000DNA Marker片段。 [0031] 图5为卤醇脱卤酶SDS-PAGE图；1：IPTG未诱导的E.coli BL21/pET28b-HHDHTm；2：诱导的E.coli BL21/pET28b-HHDHTm；3：细胞破碎上清液,4：细胞破碎沉淀，5：蛋白质分子量Marker； (五)具体实施方式 [0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： [0033] 实施例1：运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405的获取 [0034] 本发明从浙江、江苏、福建省沿海地区取海泥等样品100余份，利用1,3-二氯丙醇或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为唯一碳源，以溴百里香酚蓝为pH指示剂，进行两轮富集筛选培养，筛选卤醇脱卤酶产生菌，通过反复筛选，分离得到一株高活力的卤醇脱卤酶产生菌。筛选的具体方法：将海泥样品用无菌水制成土壤悬浮液，取1.0mL上清液，加入到筛选培养基中，于30℃，150rpm摇床上振荡培养4天，之后取该培养液无菌生理盐水进行梯度稀-6 -7 -8释，取10 、10 、10 的梯度稀释液涂布到LB固体培养基上，置30℃恒温培养3天。挑取生长出的单菌落接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上培养2天，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗涤，收集湿菌体。湿菌体用于转化，转化条件如下：磷酸盐缓冲液(200mM，pH8.0)中加入30g/L湿菌体，1,3-二氯丙醇20mmol/L缓冲液，置于35℃水浴摇床转化2h，取1mL转化液，乙酸乙酯萃取后，取有机层进行气相检测分析。采用气相检测环氧氯丙烷的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温 90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH10.0条件下，在1min内催化1,3-二氯丙醇生成1μmol环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的生成量推知重组菌酶活。根据活力检测，得到酶活最高的一株菌株，编号ZJB1405，并进行鉴定。 [0035] 本发明筛选得到的菌株ZJB1405，按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》的生理生化鉴定，革兰氏阴性、杆状。固体平板培养基上的菌落特征：菌落颜色白色、不透明、表面光滑、湿润、边缘规则、无晕环、菌落形态中小，圆，中央凸起。 [0036] 所述筛选培养基终浓度组成：1,3-DCP2.7g/L或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙 酯 2.4g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO41g/L，Na2HPO4·2H2O1g/L，NaH2PO4·12H2O2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，CuSO4·5H2O0.01g/L，MnSO4·5H2O0.01g/L，pH6.8，溶剂为去离子水。 [0037] 所述固体LB培养基终浓度组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0，溶剂为去离子水，pH值自然。 [0038] 所述发酵培养基终浓度组成：甘油10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO41g/L，Na2HPO4·2H2O1g/L，NaH2PO4·12H2O2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl3g/L，pH7.0，溶剂为去离子水。 [0039] 筛选得到的菌株ZJB1405，进行生理生化鉴定，并按精编分子生物学实验指南方法提取染色体DNA，以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物16S-8：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和16S-1541:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA扩增菌株的16SrDNA基因，将基因产物同T载体连接后，后委托上海桑尼对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列，并进行同源性比对。基于形态、生理生化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，确定该菌为运动替斯崔纳菌，命名为运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405，此菌株已于2014年5月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2014187。 [0040] 菌株ZJB140516S rDNA序列 [0041] 1 GGGCCTTCGA CTTCCTTGTT ACGACTTCAC CCCAGTCGCT GACCTTACCG TGGACGGCTG CCTCCCTTAC [0042] 71 GGGTCAGCTC ACCGGCTTCG GGTAAAACCA ACTCCCATGG TGTGACGGGC GGTGTGTACA AGGCCCGGGA [0043] 141 ACGTATTCAC CGCGGCATGC TGTTCCGCGA TTACTAGCGA TTCCGACTTC ATGCACTCGA GTTGCAGAGT [0044] 211 ACAATCCGAA CTGAGACGAC TTTTTGAGAT TAGCTTCACC TCGCGATGTC GCTGCCCACT GTAGTCGCCA [0045] 281 TTGTAGCACG TGTGTAGCCC AGCCCATAAG GGCCATGAGG ACTTGACGTC ATCCCCACCT TCCTCCGGCT [0046] 351 TATCACCGGC AGTTTCCCTA GAGTGCCCAG CCGAACTGAT GGCAACTAAG GATGAGGGTT GCGCTCGTTG [0047] 421 CGGGACTTAA CCCAACATCT CACGACACGA GCTGACGACA GCCATGCAGC ACCTGTGTGA CGTCCGGCCG [0048] 491 AACCGAAAAC CCCGTCTCCA GGGTCGCGAC GTCCATGTCA AGGGCTGGTA AGGTTCTGCG CGTTGCTTCG [0049] 561 AATTAAACCA CATGCTCCAC CGCTTGTGCG GGCCCCCGTC AATTCCTTTG AGTTTTAACC TTGCGGCCGT [0050] 631 ACTCCCCAGG CGGAGTGCTT AACGCGTTAG CTACGACACT GCGATACTAA GTATCCCAAC GTCCAGCACT [0051] 701 CATCGTTTAC GGCGTGGACT ACCAGGGTAT CTAATCCTGT TTGCTCCCCA CGCTTTCGTG CCTCAGCGTC [0052] 771 AGTTTCGGGC CAGGCAGCCG CCTTCGCCAC CGGTGTTCTT CCCAATATCT ACGAATTTCA CCTCTACACT [0053] 841 GGGAATTCCA CTACCCTCTC CCGACTCCAG CCTACCAGTC TCAAAGCAGT TCCGGAGTTG AGCCCGGGCT [0054] 911 TTCACTTCTG ACTTGATAAG CCGCCTACGC ACGCTTTACG CCCAGTAAAT CCGAACACGC TAGCCCCCTT [0055] 981 CGTATTACGC GGCTGCTGGC ACGAAGTTAG CGGGGCTTCT TCTACGGGTA CGTCATTATC TTCCCGTCGA [0056] 1051 AAGAGCTTAC AATCGAAGAC CTTCATCACT CACGCGCATG CTGGAATCAA GCTTCGGCAA TGTCATAATC [0057] 1121 CCACTGCTGC TCCGTAGGGA GTCTGACAG [0058] 实施例2：卤醇脱卤酶目的基因的克隆 [0059] 根据Genbank中收录的预测为Tistrella mobilis酶基因序列(Genbank登录号：CP003236.1)为依据，设计PCR引物如下： [0060] 上游引物：CGCCATATGATGCCTGTCACCGACACCGC [0061] 下游引物：ATTTGCGGCCGC TTACGGCCAGCCGCCGGTG [0062] 其中，上游引物中带下划线部分为Nde I酶切位点，下游引物中带下划线部分为Not I酶切位点。 [0063] 以运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)ZJB1405的总基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL)：10×Pfu DNA Polymerase2+ Buffer10μL(Mg )，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)0.5μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各0.5μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNA Polymerase1μL，无核酸水86.5μL。 [0064] 采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃3min，然后进入温度循环94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。 [0065] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收750bp左右出现明显条带(图3)。然后用Taq酶PCR加A，再与T载体进行连接，得到克隆重组质粒pGEM-T-HHDHTm(见图1)。将该重组质粒电转化至大肠杆菌JM109中，利用菌落PCR测序，挑取阳性菌落培养送样测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为747bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。 [0066] 1 ATGCCTGTCA CCGACACCGC GCCCCGCGTG GCGCTGGTTA CCAATGCGAC CAAATATGCC [0067] 61 GGCGCCCCCA CGGTGGCGGC GCTTGCCAGC CAGGGCTGGC AGATCATCGC CCATGACGCA [0068] 121 TCCTTCACCG ACGTGGCGGC CCGTGCCGCC TGGGAGGCGG ACAACCAGGG CATGACCGCC [0069] 181 GCCGAGGCTC AGGATCCGGC CGGGTTGATC GCCGAAGTGC GCGACCGGAT GGGCGGGCTG [0070] 241 CACGGTATCG TTTCCAACGA CGCCTATCCC GCGATCCGTC GCCGTATCGA AGAGACCGAG [0071] 301 GCGGAGGCGC TGCGCGAGAT GCTGGAGGCG CTGACCGTCT TCCCCTTCGC GCTCGCCTCG [0072] 361 GCAGTGACCC CACACCTGAA GGCGCAGGGC GCCGGCGCCA TCGTGATGGT CACCTCCGCA [0073] 421 TCGCCGCGCC GTCCCTACCC GGGGTTCGCG ATGTACGCAA CCGCCCGCTC GGCCTCGACC [0074] 481 GGGCTTGCCA AGGCACTGGC GAACGAGCTG GCGCCCCATG GCATCCGGGT GAATGCCGTG [0075] 541 GCGCCGAACT TCCTCTACAG CGAGACCTAT TACCCGCGCG CCAAATGGAT CGACGATCCC [0076] 601 GCCGGTGCCG CCCGGGTGCG CGAGATGGTA CCGCTCGGCC GTCTGGGCCG GCCCGAGGAG [0077] 661 ATCGGTGAAC TGATTGCTTT CCTGCTGTCC GACAAGGCCG GCTTTGTGGT CGGCGAGACC [0078] 721 GTGGGCTTCA CCGGCGGCTG GCCGTAA [0079] 利用软件对该基因序列进行分析，推知所述卤醇脱卤酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列： [0080] 1 MPVTDTAPRV ALVTNATKYA GAPTVAALAS QGWQIIAHDA SFTDVAARAA WEADNQGMTA [0081] 61 AEAQDPAGLI AEVRDRMGGL HGIVSNDAYP AIRRRIEETE AEALREMLEA LTVFPFALAS [0082] 121 AVTPHLKAQG AGAIVMVTSA SPRRPYPGFA MYATARSAST GLAKALANEL APHGIRVNAV [0083] 181 APNFLYSETY YPRAKWIDDP AGAARVREMV PLGRLGRPEE IGELIAFLLS DKAGFVVGET [0084] 241 VGFTGGWP* [0085] 实施例3重组表达质粒和重组表达转化体的制备 [0086] 将实施例2中获得的含有卤醇脱卤酶基因克隆质粒，37℃用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切5h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)回收目标片段。在T4DNA连接酶的作用下，将目标片段与同样经Nde I和Not I酶切后的载体质粒pET28b，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28b-HHDHTm。 [0087] 将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，在含有终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。获得阳性重组转化体大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm。随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图4所示，从图4可以看出阳性重组质粒pET28b-HHDHTm单酶切在3泳道和4泳道出现单一的与预期相符的条带，双酶切后5泳道出现两条带，一条带与目的基因片段大小一致。该结果说明目的基因已经克隆至pET28b的Nde I和Not I位点。 [0088] 实施例4重组卤醇脱卤酶的表达 [0089] 将实施例3所得的重组大肠杆菌，接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD 600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集细胞(即湿菌体)，并用磷酸盐缓冲液洗涤两次，得静息细胞。将所得静息细胞悬浮于20mL pH8.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清，即为重组卤醇脱卤酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(图5)，重组蛋白在细胞中以部分可溶的形式存在，另外有部分蛋白存在于细胞碎片中。 [0090] 实施例5：卤醇脱卤酶催化1,3-二氯丙醇合成(S)-环氧氯丙烷 [0091] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以1,3-二氯丙醇为底物，进行转化反应制备环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：10mL甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0)中加入0.2g湿菌体和40mmol/L缓冲液的1,3-二氯丙醇(以不加菌体的反应体系作为对照，有0.5mmol/L消旋的环氧氯丙烷生成)，35℃摇床150r/min条件下反应1min，用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。1,3-二氯丙醇的转化率达到90％以上，(S)-环氧氯丙烷的收率达82.4％，ee值达到60.1％。 [0092] 采用气相检测环氧氯丙烷的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。 [0093] 酶活单位(U)定义为：在35℃、pH10.0条件下，在1min内催化1,3-二氯丙醇生成1μmol环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表1。 [0094] 表1：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0095]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 40.5 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 2696.7 [0096] 实施例6：卤醇脱卤酶催化2,3-二氯丙醇脱卤合成环氧氯丙烷 [0097] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以2,3-二氯丙醇为底物，进行转化反应，考察其对2,3-二氯丙醇的脱卤活性。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中加入0.4g湿菌体和20mmol/L缓冲液的2,3-二氯丙醇(以不加菌体的反应体系作为对照，无产物生成)，35℃摇床150r/min条件下反应10，20，30min取样，反应结束后，将反应液离心，取上清液进行气相分析，或将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，用气相色谱分析测定底物的转化率和酶对2,3-二氯丙醇的酶活。反应30min后2,3-二氯丙醇的转化率达到10.4％，(S)-环氧氯丙烷的收率达9.6％，ee值达到71.5％。 [0098] 采用气相检测环氧氯丙烷的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH8.0条件下，在1min内催化2,3-二氯丙醇生成1μmol环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表2。 [0099] 表2：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0100]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 6.60 [0101] 实施例7：卤醇脱卤酶催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯脱卤反应 [0102] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，进行转化反应，考察其对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱卤活性。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中加入0.2g湿菌体和20mmol/L缓冲液的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(以不加菌体的反应体系作为对照，对照无产物生成)，35℃摇床150r/min条件下反应10，20，30min取样，反应结束后，将反应液离心，取上清液进行气相分析，或将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，用气相色谱分析测定底物的转化率,30min后底物的转化率为90％，ee值达到99％。 [0103] 反应液中(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为Agilent 7890A，所用毛细管柱型号为HP-5(柱长30m，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm，填料为5％Phenyl/95％dimethylpolysiloxane)，色谱条件：柱温120℃保持4min，20℃/min程序升温至180℃，保持1min。进样口温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯保留时间为4.9min。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH8.0条件下，在1min内催化1μmol(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯脱卤所需要的酶量定义为1U。根据体系中(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的减少量推知重组菌酶活。测定结果见表3。 [0104] 表3：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0105]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 0.39 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 226.42 [0106] 实施例8：卤醇脱卤酶催化2-氯-1-苯乙醇脱卤合成苯基环氧乙烷 [0107] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以2-氯-1-苯乙醇为底物，进行转化反应，考察其对2-氯-1-苯乙醇的脱卤活性。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中加入0.2g湿菌体和20mmol/L缓冲液的2-氯-1-苯乙醇(以不加菌体的反应体系作为对照，无产物生成)，35℃摇床150r/min条件下反应10，20，30min取样，反应结束后，将反应液离心取上清液进行气相分析，或将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，用气相色谱分析测定底物的转化率和酶对2-氯-1-苯乙醇的酶活。2-氯-1-苯乙醇的转化率达到15％，30min后(R)-苯基环氧乙烷的收率达34.4％，ee值达到20.6％。 [0108] 采用气相检测苯基环氧乙烷的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温100℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH8.0条件下，在1min内催化2-氯-1-苯乙醇生成1μmol苯基环氧乙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中苯基环氧乙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表4。 [0109] 表4：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0110]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 1.19 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 80.61 [0111] 实施例9：卤醇脱卤酶催化4-氯-3-羟基丁腈脱卤反应 [0112] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以4-氯-3-羟基丁腈为底物，进行转化反应，考察其对4-氯-3-羟基丁腈的脱卤活性。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中加入0.2g湿菌体和20mmol/L缓冲液的4-氯-3-羟基丁腈(以不加菌体的反应体系作为对照，无产物生成)，35℃摇床150r/min条件下反应10，20,30min取样，反应结束后，将反应液离心，取上清液进行气相分析，或将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，用气相色谱分析测定底物的转化率和酶对4-氯-3-羟基丁腈的酶活。 30min后4-氯-3-羟基丁腈的转化率达到67％。 [0113] 采用气相色谱Agilent6890N测定，色谱柱类型：所用毛细管柱型号为HP-5(柱长30m，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm，填料为5％Phenyl/95％dimethylpolysiloxane)； 色谱条件：柱温60℃保持4min，20℃/min程序升温至160℃，保持2min。进样口温度 220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。4-氯-3-羟基丁腈保留时间为8.5min。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH8.0条件下，在1min内催化消耗 1μmol4-氯-3-羟基丁腈所需要的酶量定义为1U。根据体系中4-氯-3-羟基丁腈的消耗量推知重组菌酶活。测定结果见表5。 [0114] 表5：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0115]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 0.25 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 116.2 [0116] 实施例10：卤醇脱卤酶催化1,3-二溴-2-丙醇脱卤合成(S)-环氧溴丙烷[0117] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以1,3-二溴-2-丙醇为底物，进行转化反应，考察其对1,3-二溴-2-丙醇的脱卤活性。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液(pH10.0)中加入0.05g湿菌体和20mmol/L缓冲液的1,3-二溴-2-丙醇(以不加菌体的反应体系作为对照，有微量消旋环氧溴丙烷生成)，35℃摇床150r/min条件下反应一定时间取样，控制反应转化率在10％以内，反应结束后，将反应液离心，去上清液进行气相分析，或将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，用气相色谱分析测定底物的转化率和酶对1,3-二溴-2-丙醇的酶活。反应1.5min后，1,3-二溴-2-丙醇的转化率达到95％以上，(S)-环氧溴丙烷的收率达90.1％，ee值达到50％。 [0118] 采用气相检测环氧溴丙烷的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH8.0条件下，在1min内催化1,3-二溴丙醇生成1μmol环氧溴丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧溴丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表6。 [0119] 表6：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0120]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 80.32 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 6188.7 [0121] 实施例11：卤醇脱卤酶催化2,3-二溴-2-丙醇脱卤合成(S)-环氧溴丙烷[0122] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL211(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL211(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL211(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以2,3-二溴-2-丙醇为底物，进行转化反应，考察其对2,3-二溴-2-丙醇的脱卤活性。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液(pH10.0)中加入0.2g湿菌体和20mmol/L缓冲液的2,3-二溴-2-丙醇(以不加菌体的反应体系作为对照，有微量消旋环氧溴丙烷生成)，35℃摇床150r/min条件下反应10min取样，控制反应转化率在10％以内，反应结束后，将反应液离心，取上清液进行气相分析，或将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，用气相色谱分析测定产物(S)-环氧溴丙烷ee，和酶对2,3-二溴-2-丙醇的酶活。反应1min后底物的转化率为8％，环氧溴丙烷的收率为7.4％，ee达到90％。 [0123] 采用气相检测环氧溴丙烷的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH8.0条件下，在1min内催化2,3-二溴丙醇生成1μmol环氧溴丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧溴丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表7。 [0124] 表7：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0125]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 2.86 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 193.1 [0126] 实施例12：卤醇脱卤酶催化环氧氯丙烷的开环反应 [0127] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以环氧氯丙烷为底物，进行环氧化物的开环反应。反应体系和反应条件如下：10mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)中加入0.2g湿菌体和10mmol/L缓冲液的环氧氯丙烷为底物，20mmol/L缓冲液的亲核试剂(NaNO2)(以不加菌体的反应体系作为对照，未有环氧氯丙烷发生开环反应)，35℃摇床150r/min条件下反应60min后，将反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，检测环氧化物的转化率和选择性。获得(R)-环氧氯丙烷和1-硝基-3-氯2-丙醇。环氧氯丙烷的转化率达到91％以上，(R)-环氧溴丙烷的收率达8.2％，ee值达到90％。 [0128] 采用气相检测环氧氯丙烷的浓度和选择性，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为 1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH5.0条件下，在1min内催化环氧氯丙烷开环生成1μmol1-硝基-3-氯2-丙醇所需要的酶量定义为1U。 [0129] 根据体系中环氧氯丙烷的消耗量推知重组菌酶活。测定结果见表8。 [0130] 表8：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0131]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 0.28 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 19.1 [0132] 实施例13：卤醇脱卤酶催化苯基环氧乙烷的开环反应 [0133] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以苯基环氧乙烷为底物，进行环氧化物的开环反应。反应体系和反应条件如下：10mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)中加入0.2g湿菌体和10mmol/L缓冲液的苯基环氧乙烷为底物，20mmol/L缓冲液的亲核试剂(NaNO2)(以不加菌体的反应体系作为对照，底物未减少),35℃摇床150r/min条件下反应30min后，反应液用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入内标物，检测环氧化物的转化率和选择性。获得(S)-苯基环氧乙烷和1-硝基苯乙醇。苯基环氧乙烷的转化率为30.5％,(S)-苯基环氧乙烷的ee值为27.6％。 [0134] 采用气相检测环氧氯丙烷的浓度和选择性，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温100℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH5.0条件下，在1min内催化苯基环氧乙烷开环生成1μmol1-硝基苯乙醇所需要的酶量定义为1U。 [0135] 根据体系中苯基环氧乙烷的消耗量推知重组菌酶活。测定结果见表9。 [0136] 表9：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0137]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 0.11 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 7.5 [0138] 实施例14：(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的催化合成 [0139] 以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm湿菌体作为转化用酶，并以大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b、重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm未诱导发酵菌体作为对照菌。以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向50mL烧瓶中加入30mL50mM NaH2PO4水溶液作为缓冲液，100g/L缓冲液的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，水浴预热至40℃，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入1.5g的湿菌体(以不加菌体的反应体系作为对照，无产物生成)，用NaCN控制pH在7.8，反应6h。取样，用等体积的乙酸乙酯萃取，操作同上，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量。产物的产率达到90％，光学纯度(ee)值达到99％。 [0140] 反应液中(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为Agilent7890A，所用毛细管柱型号为HP-5(柱长30m，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm，填料为5％Phenyl/95％dimethylpolysiloxane)，色谱条件：柱温120℃保持4min，20℃/min程序升温至180℃，保持1min。进样口温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯保留时间为4.9min，产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的保留时间为6.2min。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的保留时间分别为4.9min和6.2min。酶活定义：在40℃，pH7.8条件下，每分钟催化反应生成1μmol HN所需要的酶量定义为1U。 [0141] 根据体系中HN的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表10。 [0142] 表10：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力[0143]菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells)) (E.coli)BL21(DE3) 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 6.8 (E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 459.1 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈