신경보호를 위한 방법 및 조성물

신경보호를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR NEUROPROTECTION}

연관된 출원들

본 출원은 2011년 11월 3일자로 "메니에르병(Meniere's Disease)을 치료하기 위한 조성물 및 방법"의 명칭으로 출원된 미합중국 가특허출원 제61/554,982호 및 2012년 6월 5일자로 "메니에르병을 치료하기 위한 조성물 및 방법"의 명칭으로 출원된 미합중국 가특허출원 제61/663,627호의 우선권을 주장하며, 그들 전체로 그리고 모든 목적들에 대하여 본 출원에 참조로 포함된다.

시퀀스 목록

본 출원은 "240_PCTl_ST25.txt"로 명명된 파일 내에 존재하는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 시퀀스들을 참조로 포함하며, 이는 33킬로바이트(kilobytes)의 크기이고, 이는 마이크로소프트-윈도우(MS-Windows)와 호환되는 운영체계를 갖는 아이비엠-퍼스널 컴퓨터 머신 형식(IBM-PC machine format)으로 2012년 11월 1일자로 생성되었으며, 본 출원과 함께 제출되었다.

발명의 분야

대상체의 귀 내의 뉴런의 신경보호에 사용되기 위한 그리고 와우(cochlear) 및/또는 전정(vestibular)의 기능의 손실에 대한 회복(restoration) 및/또는 수반되는 증후군들의 완화(relief)를 위한 용도가 본 출원에서 제공된다. 메니에르병 또는 유사한 질환들 및 장애들의 위험에 있거나 또는 이들로 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용한 방법 및 킷트(kits)가 또한 제공된다.

인간의 귀는 3개의 주요 구조적 구성성분들: 즉, 외이, 중이 및 내이들로 이루어지며, 이들은 함께 기능하여 음파를 신경 충격(nerve impulses)으로 전환시키며, 이는 대뇌에로 전달되고, 여기에서 이들은 소리로 인지된다. 상기 내이는 또한 균형을 유지하는 데 도움을 준다.

상기 중이 및 상기 내이의 해부학(anatomy)은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 잘 알려져 있다(예를 들면, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 Atlas of Sensory Organs: Functional and Clinical Analysis, Andrs Csillag, Humana Press (2005), pages 1-82를 참조하시오). 간단히 요약하면, 상기 중이는 고막(eardrum) 및 상기 고막을 상기 내이에로 연결하는 귓속뼈(ossicles)들로 알려진 3개의 소골을 포함하는 작은 공기-충진실(air-filled chamber)로 이루어진다.

상기 내이(미로(labyrinth))는 청력의 기관인 와우각(cochlea) 및 균형의 기관인 전정계(vestibular system)로 이루어지는 복잡한 구조이다. 상기 전정계는 위치 감각을 결정하는 구형낭(saccule)과 난형낭(utricle) 및 균형 유지에 도움을 주는 반고리관(semicircular canals)들로 이루어진다.

상기 와우각은 코르티기관(organ of Corti)을 감싸고, 이는, 부분적으로는, "내이 모세포들" 또는 "모세포들"이라고 불리우는 약 20,000개의 특화된 감각세포들로 이루어진다. 이들 세포들은 림프액(cochlear fluid) 내로 연장되는 작은 헤어라인 돌출물들(hairline projections: 섬모(cilia))을 갖는다. 상기 중이 내의 소골편들로부터 상기 내이 내의 난원창(oval window)에로 전달된 소리 진동이 상기 유체 및 섬모가 진동하도록 하는 원인이 된다. 상기 와우각의 서로 다른 부분들 내의 모세포들이 서로 다른 소리 주파수들에 반응하여 진동하고 그리고 상기 진동을 신경 충격으로 전환시키며, 이들 신경 충격은 처리(processing) 및 해석을 위하여 상기 대뇌에로 보내어진다. 내이 모세포들이 내이 지지세포(inner ear support cells)들에 의해 둘러싸여진다. 지지세포들이 기저를 이루고(underlie), 적어도 부분적으로는 상기 내이 내의 감각 모세포들을 감싸고 그리고 물리적으로 지지한다. 지지세포들의 대표적인 예들에는 이너로드(inner rod: 주상세포(pillar cells)들), 아우터로드(outer rod:주상세포들), (다이터스(Deiters)의) 내지골세포(inner phalangeal cells)들, 외지골세포(outer phalangeal cells)들, 헬드세포(cells of Held)들, 한센세포(cells of Hensen), 클라우디우스세포(cells of Claudius)들, 보에처세포(cells of Boettcher), 치간세포(interdental cells)들 및 (허치키(Huschke)의) 청각치(auditory teeth) 들이 포함된다.

나선신경절(spiral ganglion)은 와우각으로부터 대뇌에로 소리의 묘사(representation)를 전송하는 신경세포들의 군이다. 상기 나선신경절 뉴런(spiral ganglion neurons)들의 세포체(cell bodies)들이 상기 와우각의 나선구조 내에서 발견되고 그리고 중추신경계의 일부를 이룬다. 이들의 가지돌기(dendrites)들이 모세포들의 기저와 접합 접촉(synaptic contact)을 이루고, 그리고 이들의 축삭(axons)들이 서로 뭉쳐져서 제8 뇌신경(eighth cranial nerve: 전정와우신경)의 청각부(auditory portion)를 형성한다. 전정신경절(또한 스카르파신경절(Scarpa's ganglion)이라고도 알려짐)은 그의 말초돌기(peripheral processes)들이 상기 전정감각 말단기관들의 모세포들과 접합 접촉(synaptic contact)을 형성하는 이극 일차구심성뉴런(bipolar primary afferent neurons)들의 세포체(cell bodies)들을 포함하는 전정신경의 신경절이다.

미합중국 공개특허 제20090162365호 및 동 제20110112168호들은 siRNA 화합물, 이를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 그리고 세포자멸사 유전자(proapoptotic genes)들에 연관되는 질환들 및 장애들을 치료하기 위한 이들의 사용법들에 관한 것이다.

미합중국 특허 제7,825,099호는 세포자멸사 유전자를 억제하는 것에 의하여 청력 손실을 치료하는 방법에 관한 것이다.

미합중국 특허 제8,088,359호 및 미합중국 공개특허 제20120252868호들은 청력 손실 및 환청(phantom hearing)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

미합중국 공개특허 제호는 귀에 dsRNA 분자를 전달하는 비-침습적 방법(non-invasive methods)을 기술한다.

미합중국 공개특허 제20110034534호는 그 중에서도 CAPNS1을 표적하는 dsRNA 분자에 관한 것이다.

미합중국 공개특허 제20110229557호는 CASP2를 포함하여 안질환들을 치료하는 데 유용한 여러 유전자 표적들에 대한 dsRNA 분자에 관한 것이다.

국제공개특허공보 제WO2011/163436호는 RHOA를 표적하는 dsRNA를 기술한다.

이명 및 메니에르병은 전 세계 많은 개인들에 영향을 주고 그리고 현재의 치료법들은 신경성 퇴행(neuronal degeneration)의 진전(progression) 및 수반되는 청력 손실을 방지하는 데에 있어서 아직 성공적이지 못하고 있다. 손상 및 세포 사멸(예를 들면, 세포자멸사)로부터 모세포 및 나선신경절 세포와 전정신경절 세포를 포함하여 내이 뉴런들을 보호하고, 그리고 그에 의하여, 예를 들면, 메니에르병 환자들에서의 청력 손실을 감쇠시키거나 또는 억제하는 치료적 처우(therapeutic treatment)가 고도로 요구되고 있다.

따라서, 하나의 관점은 이러한 활성을 갖는 것으로 이전에는 알려지지 않은 dsRNA 화합물을 사용하여 이명 또는 메니에르병으로 고통받거나 또는 유사한 증후군들을 앓는 인간 대상체들을 포함하여 대상체의 귀 내의 뉴런의 신경보호를 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 상세한 설명은 대상체의 귀의 뉴런들에 대한, 예를 들면, 나선신경절 세포들 및 전정신경절 세포들에 대한 신경보호를 제공하기 위한 방법 및 킷트에 연관된다. 하나의 관점에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체의 귀 내의 뉴런의 신경보호에 사용하기 위하여 시퀀스 동정 번호(SEQ ID NO): 1 내지 3, 시퀀스 동정 번호: 4, 시퀀스 동정 번호: 5 내지 6 또는 시퀀스 동정 번호:7 중의 어느 하나에 규정된 시퀀스를 갖는 mRNA를 인코딩(encoding)하는 CASP2 유전자, NOX3 유전자, CAPNS1 유전자 또는 RHOA 유전자의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 RNA(double-stranded RNA ; dsRNA) 화합물이 본 출원에 기술된다. 여러 관점들에 있어서, 귀 내의 뉴런들에 대한 신경보호를 제공하는 방법이 기술되며, 상기 방법은 CASP2 유전자, NOX3 유전자, CAPNS1 유전자 또는 RHOA 유전자의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체의 귀에 투여하고 그에 의하여 상기 대상체의 귀 내의 신경세포에 대한 신경보호를 제공하도록 하는 단계가 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 뉴런은 신경절이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 뉴런은 신경절 내에 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 뉴런은 나선신경절 세포 및/또는 전정신경절이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 CASP2 유전자는 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3 중의 어느 하나에 규정되는 시퀀스를 갖는 mRNA를 인코딩한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 NOX3 유전자는 시퀀스 동정 번호: 4에 규정되는 시퀀스를 갖는 mRNA를 인코딩한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 CAPNS1 유전자는 시퀀스 동정 번호: 5 내지 6 중의 어느 하나에 규정되는 시퀀스를 갖는 mRNA를 인코딩한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 RHOA 유전자는 시퀀스 동정 번호: 7에 규정되는 시퀀스를 갖는 mRNA를 인코딩한다. 일부 구체예들에 있어서, CASP2가 바람직한 표적 유전자(target gene)이고 그리고 보다 바람직한 구체예들에 있어서, dsRNA 분자 화합물은 시퀀스 동정 번호: 8에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 센스 가닥(sense strand) 및 시퀀스 동정 번호: 9에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 안티센스 가닥(antisense strand)이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 신경보호는 뉴런 세포 사멸(neuronal cell death), 바람직하게는 세포자멸사의 약화(attenuation), 방지(prevention) 또는 감소(reduction)가 포함된다. 일부 구체예들에 따르면, 뉴런의 세포자멸사는 질환 또는 장애, 허혈(ischemia), 물리적/기계적 외상(physical/mechanical trauma), 화학약품(chemical agent) 또는 감염원(infectious agent)에의 노출, 면역반응(immunologic reaction) 또는 영양상의 불균형(nutritional imbalance)들 중의 어느 하나 또는 둘 이상에 연관된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 뉴런의 세포자멸사는 허혈과 연관된다. 일부 구체예들에 있어서, 뉴런의 세포자멸사는 질환 또는 상태와 연관된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 질환은 유전성 질환 또는 장애이다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 청각기관(auditory organs)들 내에서의 병리학적 비정상(pathological abnormality)과 연관되는 장애 및 전정기관들 내에서의 병리학적 비정상과 연관되는 장애로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 청각기관은 코르티기관이다. 상기 전정신경절은 속귀길(internal acoustic meatus)의 측방말단(lateral end)의 상부(upper part) 내에 위치되는 8번 뇌신경(the eighth cranial nerve)의 전정부(vestibular part)의 감각신경절이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 전정기관은 난형낭, 구형낭, 속귀길 및 팽대부(ampullae)로부터 선택된다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 간헐적 현기증(episodic vertigo), 청력 손실, 이명 및 이충만감(aural fullness)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환 또는 상태 또는 증후군을 앓거나 또는 그들로 발전할 위험에 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 대상체는 메니에르병으로 고통받거나 또는 그에 감수성이다.

일부 구체예들에 있어서, CASP2, NOX3, RHOA 또는 CAPNS1 유전자의 발현을 하향조절하는 dsRNA 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하고 그에 의하여 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는 메니에르병으로 고통받는 대상체를 치료하는 방법이 본 출원에서 제공된다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에 CASP2, NOX3, RHOA 또는 CAPNS1 유전자의 발현을 하향조절하는 dsRNA 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하고, 그에 의하여 메니에르병의 증후군을 약화시키는 단계를 포함하는 메니에르병으로 고통받는 대상체에 메니에르병의 증후군을 약화시키는 것이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 증후군에는 이명, 진행성 청력 손실, 내림프수종(ELH: endolymphatic hydrops), 현기증, 메스꺼움(nausea) 또는 이충만감들 중의 하나 또는 그 이상이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 메니에르병의 상기 증후군들 중의 하나 또는 그 이상의 경감(relief)을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 청력의 부분적인 회복(partial restoration) 또는 완전 회복을 제공한다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 방법 및 킷트는 대상체의 세포자멸로부터 나선신경절 및/또는 전정신경절을 구조(rescuing)하는 것이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 나선신경절 및/또는 전정신경절의 생존을 촉진(promoting)하는 것이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 대상체 내의 나선신경절 세포 또는 전정신경절 세포의 세포자멸사를 방지하는 것이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 대상체 내의 나선신경절 세포 및 또는 전정신경절 세포의 신경보호를 제공하는 것이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 대상체 내의 와우각 기능의 회복이 포함된다. 와우각 기능에는 청력의 부분적이거나 또는 완전한 회복이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법에는 대상체 내의 전정기능의 회복이 포함된다. 전정기능에는 균형의 부분적이거나 또는 완전한 회복이 포함된다.

CASP2, NOX3, RHOA 또는 CAPNS1 유전자의 발현을 하향조절하는 dsRNA 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 메니에르병으로 고통받는 대상체를 치료하기 위한 킷트가 또한 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 킷트에는 상기 대상체에 상기 dsRNA 화합물의 투여를 위한 장치; 및 선택적으로 사용에 대한 지시서(instructions)가 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 킷트에는 CASP2 유전자의 발현을 하향조절하는 dsRNA 화합물이 포함된다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 CASP2 유전자는 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3 중의 임의의 하나에 규정되는 mRNA를 인코딩한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 킷트에는 시퀀스 동정 번호: 8에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 9에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA 화합물이 제공된다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 방법 및 킷트는 각각 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3, 시퀀스 동정 번호: 4, 시퀀스 동정 번호: 5 내지 6 및 시퀀스 동정 번호: 7로 예시화된 CASP2, NOX3, CAPNSl 및 RHOA로부터 선택되는 인간 표적 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스(mRNA 시퀀스 등과 같은)를 결합하는 dsRNA(예를 들면, 짧은 간섭 핵산(short interfering nucleic acid ; siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로-RNA(micro-RNA ; miRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA ; shRNA))의 용도를 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 방법 및 킷트는 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3 중의 임의의 하나에 규정되는 인간 CASP2 mRNA를 결합하는 dsRNA 화합물의 용도를 포함한다.

바람직한 구체예들에 있어서, 상기 CASP2 dsRNA 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기에서 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 시퀀스 (5'>3') AGGAGUUCCACAUUCUGGC (시퀀스 동정 번호: 9)를 포함한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 하기의 구조를 갖는다:

여기에서 각 A, C, U 및 G는 미변성된 리보뉴클레오티드(unmodified ribonucleotide), 변성된 리보뉴클레오티드(modified ribonucleotide) 또는 독특한 성분(unconventional moiety)이고 그리고 각 연속적인 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분은 공유결합에 의하여 다음의 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분에 결합되고;

여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재(absent)이나, 그러나 존재하는 경우, 독립적으로 상기 가닥의 3' 말단이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착되는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분 또는 이들의 조합을 포함하고; 그리고

여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재이나, 그러나 존재하는 경우, 상기 센스 가닥의 5' 말단에 공유적으로 부착되는 캡핑 성분(capping moiety)이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 미변성되고 그리고 변성된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 미변성되고 그리고 변성된 리보뉴클레오티드 적어도 하나의 독특한 성분을 포함한다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA는 적어도 하나의 독특한 성분을 더 포함한다. 특정의 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 CASP2 dsRNA는 하기의 구조를 갖는다:

여기에서 각 A, C, U 및 G는 미변성되거나 또는 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고 그리고 각 연속적인 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분은 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond)에 의하여 각 연속적인 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분에 결합되고; 여기에서 상기 센스 가닥은 5' 말단으로부터 계수하여 포지션 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 19들에 미변성된 리보뉴클레오티드, 포지션 18에 L-디옥시시티딘(L-deoxycytidine)을 포함하고; 여기에서 상기 안티센스 가닥은 적어도 다섯개(5)의 교호하는 미변성되고 그리고 2'-O-메틸 당 변성된 리보뉴클레오티드(2'-O-methyl sugar modified ribonucleiotides)들을 포함하고; 그리고 여기에서 z", Z 및 Z'들은 선택적으로 부재이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 포지션 (5'>3') 1, 3, 5, 7 9, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 존재하는 2'-O-메틸 당 변성된 리보뉴클레오티드들 및 포지션들 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18 내에 미변성된 리보뉴클레오티드들을 포함하고; 바람직하게는 상기 안티센스 가닥은 포지션 (5'>3') 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 내에 2'O-메틸 당 변성된 리보뉴클레오티드들을 포함한다.

바람직한 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 하기의 구조를 갖는다:

여기에서 각 A, C, U 및 G는 미변성된 리보뉴클레오티드, 변성된 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고 그리고 각 연속적인 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분이 공유결합에 의하여 다음의 리보뉴클레오티드 또는 독특한 성분과 결합되고;

여기에서 각 Z 및 Z'는 부재이고, 여기에서 상기 센스 가닥은 5' 말단으로부터 계수하여 포지션 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 19에 미변성된 리보뉴클레오티드, 포지션 18에 L-디옥시시티딘을 포함하고, 그리고 z"가 존재하고 그리고 역전된 디옥시어베이직 성분(inverted deoxyabasic moiety)을 포함하고; 그리고

여기에서 상기 안티센스 가닥이 5' 말단으로부터 계수하여 포지션 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19 각각에 2'O-메틸 당 변성된 리보뉴클레오티드 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16 및 18 각각에 미변성된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 이 분자는 또한 1007로도 알려져 있다.

상기 dsRNA 화합물은 침습적(invasive) 및 비-침습적 전달 방법을 포함하여 임의의 통상의 투여 경로들로 투여된다. 상기 dsRNA 화합물이 그 자체로서(per se) 또는 약제학적으로 수용가능한 염으로서 투여될 수 있고 그리고 단독으로 또는 약제학적으로 수용가능한 담체(carriers), 용매(solvents), 희석제(diluents), 부형제(excipients), 보조제(adjuvants) 및 비히클(vehicles)과 조합하여 활성성분(active ingredient)로서 투여될 수 있다.

상기 dsRNA 화합물은 바람직하게는 국소적으로(topically) 또는 주사를 통하는 것을 포함하여 경고막적으로(transtympanically) 투여된다. 투여를 위하여는 액체 형태로 제조될 수 있다. 액체 조성물에는 유기 공-용매(organic co-solvents)를 수반하거나 수반함이 없이 수성 용액(aqueeous solutions), 수성 또는 유성 현탁액(aqueous or oil suspensions), 식용가능한 오일과 마찬가지로 유사한 약제학적 비히클들로의 에멀젼들이 포함된다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 투여에는 국소적 투여, 특히 외이도(ear canal)에의 국소적 투여, 고막(tympanic membrane)에로의 국소적 투여 또는 이들의 조합를 포함하여 상기 dsRNA 화합물이 상기 고막을 통과하도록 하는 것을 허용하는 것이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 상기 화합물은 점이액(eardrop)으로서 상기 고막에 적용된다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 경고막 주사(transtympanic injection)에 의하거나 또는 점이액에 의하여 투여된다.

여러 구체예들, 바람직하게는 본 발명의 상기 약제학적 조성물이 국소적으로 투여되는 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경피흡수촉진제(penetration enhancer)로도 알려진 투과도촉진제(permeability enhancer)를 더 포함한다.

여러 구체예들에 있어서, 상기 투과도촉진제는 메니에르병으로 고통받는 대상체의 귀 내의 고막을 통한 치료학적 올리고뉴클레오티드(therapeutic oligonucleotide)의 투과도를 촉진하는 임의의 화합물 또는 둘 또는 그 이상의 화합물들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 투과도촉진제는 폴리올이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리올과의 혼합물 중에 존재한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 폴리올은 글리세롤(glycerol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 말티톨(maltitol) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하나의 구체예에 따르면, 상기 폴리올은 글리세롤이다. 여러 구체예들에 있어서, 글리세롤은 상기 약제학적 조성물의 약 0.1용적% 내지 약 35용적%; 약 1용적% 내지 약 30용적%; 약 5용적% 내지 약 25용적%, 바람직하게는 약 10용적% 내지 약 20용적%의 최종 농도로 존재한다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체의 두부(subject's head)가 일측으로 기울여지고 그리고 치료되는 귀가 상방으로 향하는 경우에 상기 외이도에 적용된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 액체용 용기(receptacle)를 사용하여, 예를 들면, 방울(drop) 또는 심지(wick) 당, 예를 들면, 10 내지 100㎕의 점적기(dropper)를 사용하여 귀에 적용된다.

본 발명의 별도의 구체예는 메니에르병으로 고통받는 대상체의 치료를 위한 약물의 제조에서의 상기 조성물들 중의 임의의 것의 용도를 제공한다. 치료를 필요로 하는 대상체의 귀 내의 뉴런에 대한 신경보호를 제공하기 위한 CASP2의 발현을 억제하는 화합물이 또한 제공된다.

이제 기술될 방법, 재료 및 실시예는 단지 설명을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니고; 본 출원에서 기술되는 것들과 유사하거나 또는 등가인 재료 및 방법이 본 발명의 실시 또는 시험(testing)에 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징들 및 잇점들이 이하의 상세한 설명으로부터 그리고 특허청구범위들로부터 명백하게 될 것이다.

이 상세한 설명은 본 출원에서 여러 구체예들에서 기술된 임의의 어느 하나 및 모든 적용들 또는 조합의 변형들을 커버하는 것으로 의도된다. 비록 본 출원에서 특정의 구체예들이 설명되고 그리고 기술되기는 하였으나, 본 발명이 동일한 목적을 달성하기 위한 이들 구체예들의 특징들의 임의의 배열을 포함하는 것은 이해되어야 한다. 본 출원에서 특별히 기술되지 않는 구체예들을 형성하는 상기 특징들의 조합들은 본 상세한 설명에 대한 고찰에 의하여 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 명백할 것이다.

도 1은 야생형(wild type)(좌측 패널들) 및 Phex ^hyp-Duk 돌연변이(우측 패널들) 내이 조직(inner ear tissue)의 조직학적 절편들을 나타내는 도면이다. 화살표들은 내림프수종(Endolymphatic hydrop ; ELH)을 나타내고 있다. 좌측 바닥 패널에서, G는 나선신경절 뉴런을 의미하고, 그리고 우측 바닥 패널에서, M은 돌연변이 나선신경절 뉴런을 의미하고, Phex ^hyp-Duk 돌연변이 생쥐에서는 더 적은(G 내지 M에 비하여) 신경절들이 존재한다. Phex ^hyp-Duk 돌연변이 생쥐들은 동시적으로 내림프수종으로 발달하고 그리고 따라서 균형 문제 및 청력 손실 표현형(phenotype)으로 제공된다. 원발성 결함(primary defects)들 중의 하나는 세포 사멸 또는 자멸사에 의한 내이 신경절(전정신경절 및 나선신경절) 내의 뉴런의 손실이다.
도 2는 점이액 전달에 의한 siRNA의 안전성 평가의 실험 설계를 나타내는 도면이다. "Px"는 산후(postpartum)의 x일수를 의미한다.
도 3은 내이에로의 dsRNA 또는 비히클 점이액으로의 주간 치료(weekly treatment)가 야생형 생쥐들에서의 청각 기능에 영향을 주지 않는다는 것을 나타내는 막대그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 메니에르병의 쥣과 동물 모델(murine model)에서의 청각 기능을 보호함에 있어서의 시험 분자들의 효능을 시험하기 위한 실험 설계를 나타내는 도면이다. (P15, P29, P90 - 산후 일수; P15 이전에의 siRNA 전달은 이도(ear channel)가 폐쇄되어 있기 때문에 불가능함; P29-30 이전의 ABR 측정은 기술적으로 불가능함).
도 5a 내지 도 5d는 음성 대조(negative control ; 비히클-치료되거나 또는 siEGFP-치료된) 또는 siRNA-치료된 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들에서의 청력 기능(ABR)의 경시분석(time course analysis)을 나타내는 도면이다. 그래프 상의 데이터는 특정의 시험 소리 주파수(㎑)에서의 청성뇌간반응(Auditory-evoked brainstem response: ABR) 문턱값(db)을 나타낸다. 도 5e는 비히클-치료된 및 siEGFP-치료된 동물들에 비하여 siRNA 치료된 동물들에서의 P90에서의 ABR에서의 상대적인 개선(relative improvement)을 나타내는 막대그래프이다.
도 6a 내지 도 6f는 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐의 내이 뉴런의 조직학적 평가 및 siCASP2 (1007)에 의해 제공되는 나선신경절 및 전정신경절의 명백한 신경보호를 나타내는 도면이다. 도 6a 및 도 6b의 화살표들은 나선신경절(SG)을 나타낸다. 도 6a 및 도 6b는 비히클 치료된 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐에서의 나선신경절의 장애 및 사멸을 나타내고 그리고 도 6b 및 도 6d는 siCASP2 치료된 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐에서의 나선신경절의 구조(rescue)를 나타낸다. 도 6e 및 도 6f는 각각 비히클 치료된 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐 및 siCASP2 치료된 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐에서의 전정신경절의 조직학적 절편을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7d는 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐의 내이 뉴런의 조직학적 평가 및 비히클-치료된 및 siEGFP-치료된 동물(도 7a)들에 비하여 siCAPNS1(도 7b), siNOX3(도 7c) 및 siRHOA(도 7d)에 의해 제공된 나선신경절의 명백한 신경보호를 나타내는 도면이다.
도 8a 내지 도 8d는 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐의 내이 뉴런의 조직학적 평가 및 비히클-치료된 및 siEGFP-치료된 동물(도 8a)들에 비하여 siCAPNS1(도 8b), siNOX3(도 8c) 및 siRHOA(도 8d)에 의해 제공된 전정신경절의 명백한 신경보호를 나타내는 도면이다.
도 9a 및 도 9b는 siCASP2-치료된 귀 내의 P90에서의 나선신경절 세포의 보호를 나타내는 도면이다.

본 출원은 올리고뉴클레오티드 분자, 이를 포함하는 조성물; 메니에르병을 치료하고 그리고 요동하는 청력 손실(fluctuating hearing loss), 간헐적 현기증 및/또는 이명을 포함하여 하나 또는 그 이상의 수반되는 증후군을 완화하기 위한 이들의 사용 방법 및 킷트를 제공한다. 본 상세한 설명은 부분적으로는 카스파제 2(Caspase 2 ; CASP2), NADPH 옥시다아제 3(NADPH Oxidase 3 ; NOX3), 칼파인 S1(Calpain S1 ; CAPNS1) 및 라스 동족 유전자 족, 멤버 A(Ras homolog gene family, member A ; RHOA)로부터 선택되는 표적 유전자들 중의 어느 하나의 억제라는 발견에 기초하고 있다.

하나의 관점에 있어서, 대상체에 CASP2의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 분자의 치료학적 유효량을 투여하고 그에 의하여 나선신경절 세포 및/또는 전정신경절 세포에서의 신경보호를 제공하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 나선신경절 세포 및/또는 전정신경절 세포의 신경보호를 제공하는 방법이 본 출원에서 제공된다. 다른 관점에 있어서, 대상체에 CASP2의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 분자를 투여하고 그에 의하여 환자를 치료하는 것을 포함하는 메니에르병으로 고통받는 대상체를 치료하는 방법이 본 출원에서 제공된다. 특발성(idiopathic) 내림프수종(ELH)으로도 알려진 메니에르병은 현기증 및 이명 그리고 청력 손실을 야기하는 종국적인 뉴런 손상(neuronal damage)의 결과를 가져오는 내이의 장애이다. 메니에르병의 정확한 원인은 알려져 있지 않고 있으나, 그러나 내재하는 메카니즘은 내림프(endolymph)의 축적으로 인한 막미로(membranous labyrinth)의 왜곡인 것으로 여겨지고 있다. 내림프는 일차적으로 와우각 내의 혈관조(stria vascularis)에 의하고 그리고 또한 전정미로(vestibular labyrinth) 내의 반월평면(planum semilunatum) 및 암세포(dark cells)에 의하여 생성된다(문헌 Sajjadi H, Paparella MM. Meniere's disease. Lancet. 372(9636):406-14 참조). 내림프수종은 내림프액 공간으로부터 전정계 수로(vestibular aqueduct)를 통하여 내림프낭(endolymphatic sac)까지의 내림프의 흐름이 방해되는 경우에 일어날 수 있다. 메니에르병은 대상체의 귀의 하나 또는 둘 다에 영향을 줄 수 있다. 메니에르병과 연관되는 1차적인 병적 상태(primary morbidity)는 현기증 및 진행성 청력 손실의 약화 속성(debilitating nature)이다.

여러 구체예들에 있어서, 상기 방법은 대상체에서의 청력 손실을 약화시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 메니에르병으로 고통받는 대상체에서의 진행성 청력 손실을 방지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 세포 사멸로부터의 나선신경절 세포의 보호를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 세포 사멸로부터의 전정신경절 세포의 보호를 포함한다.

바람직한 구체예에 있어서, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간 대상체이다.

여러 구체예들에 있어서, CASP2를 하향조절하는 상기 분자는 이중-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드 등과 같은 카스파제 2 억제제, 선택적으로 siNA, 보다 바람직하게는 표 a(본 출원에서 기술되는 방법들에서 사용하기 위한 카스파제 2 올리고뉴클레오티드 시퀀스의 비-제한적인 예들) 내에 상술된 dsRNA 분자 및 특히 하기의 안티센스 시퀀스 5' AGGAGUUCCACAUUCUGGC(또한 CASP2_4로도 알려짐)을 포함하는 siNA이고, 그리고 본 출원에서 기술된 상태들 및 장애들의 치료에 사용하기 위한 약물의 제조에서의 이 올리고뉴클레오티드의 용도이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 장애는 나선신경절 사멸 또는 전정신경절 사멸을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 세포 사멸은 세포 자멸사를 포함한다.

이들 dsRNA들에 대한 부가의 정보와 마찬가지로 본 방법에서 유용한 CASP2, NOX3 또는 RHOA를 표적하거나 또는 하향조절하는 부가의 dsRNA들이 국제특허공개공보 제WO 2008/050329호 및 동 제WO 2010/048352호에 제공된다. 본 방법에서 유용한 CAPNS1을 표적하거나 또는 하향조절하는 dsRNA들의 비-제한적인 예들은 미합중국 공개특허 제20110034534호에 제공된다.

이론에 구속됨이 없이, CASP2는 특히 신경절 세포(GC) 내에서 발현되고 그리고 활성화되고 축삭손상(axonal injury)이 후속하는 세포자멸사 유전자이다. 본 양수인은 앞서 시신경 손상의 집쥐 모델(rat models)에서의 CASP2의 억제가 사멸 세포(apoptotic death)로부터의 망막 신경절 세포(retinal ganglion cells ; RGC)의 강한 구조의 결과를 가져온다는 것을 입증하였다(문헌 PMID: 21677688 참조). 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 CASP2 발현을 하향조절하거나 또는 억제하는 올리고뉴클레오티드 분자의 용도를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 NOX3 발현을 하향조절하거나 또는 억제하는 올리고뉴클레오티드 분자의 용도를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 CAPNS1 발현을 하향조절하거나 또는 억제하는 올리고뉴클레오티드 분자의 용도를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 RHOA 발현을 하향조절하거나 또는 억제하는 올리고뉴클레오티드 분자의 용도를 포함한다.

정의

편의를 위하여, 상세한 설명, 실시예들 및 특허청구범위들에서 사용되는 특정의 용어들이 본 출원에 기술된다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태들 "하나(a)", "어느(an)" 및 "그(the)"는 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 형태들을 포함한다는 것을 주목하여야 한다.

본 발명의 관점들 또는 구체예들이 마쿠시군(Markush groups)들 또는 대안들의 다른 그룹화(grouping)의 용어들로 기술되는 경우, 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 본 발명이 또한 그에 의하여 상기 군의 임의의 개개 구성원 또는 구성원들의 하위군(subgroup)의 용어들로 기술되었다는 것이 인식될 수 있을 것이다.

"억제제(inhibitor)"는 소정의 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 생성물의 활성을 감소(부분적으로 또는 완전히)시킬 수 있는 화합물이다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "억제제"는 siRNA 억제제를 포함하여 dsRNA 억제제를 의미한다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현에 대하여 용어 "억제하다", "하향-조절하다", 또는 "감소시키다"는 상기 유전자의 발현 또는 하나 또는 그 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유닛(subunits)(예를 들면, mRNA)을 인코딩하는 RNA 분자들 또는 등가의 RNA 분자들의 수준, 또는 하나 또는 그 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유닛들의 활성이 억제 인자(inhibitory factor)(핵산 분자, 예를 들면 본 출원에서 기술되는 바와 같은 구조적인 특징들을 갖는 예를 들면 siNA 등과 같은)의 부재 중에서 관측된 것 보다 낮게 감소되는 것을 의미하며; 예를 들면, 상기 발현은 억제제의 부재 중에서 관측된 것 보다 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하로 감소될 수 있다. 본 출원에서 기술되는 상기 방법 및 킷트의 일부 구체예들에 있어서, 상기 표적 유전자의 하향조절은 뉴런 세포들의 대조 개체군(control population)에 비교하여 뉴런 세포들의 개체군에서의 뉴런 세포 사멸에서의 적어도 10% 감소의 결과를 가져온다.

"이중-가닥 RNA 억제제"는 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 생성물의 활성을 소정의 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 감소시킬 수 있는 화합물이다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 siRNA, shRNA 및 합성 shRNA를 의미한다. 억제는 또한 RNAi에 대한 하향-조절 또는 침묵화(silencing)으로 언급될 수도 있다.

본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "억제하다"는 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 생성물의 활성을 소정의 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 감소시키는 것을 의미한다. 억제는 완전하거나 또는 부분적이다. 예를 들면, APP 유전자의 "억제"는 유전자 발현(전사 또는 번역) 또는 하나 또는 그 이상의 변종들의 폴리펩티드 활성 또는 이들의 SNP(단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism))의 억제를 의미한다.

시퀀스 동정 번호: 1은 호모사피엔스 카스파제 2(Homo sapiens caspase 2), 세포자살-연관 시스테인 펩티다아제(apoptosis-related cysteine peptidase ; CASP2), 전사 변종 1(transcript variant l), mRNA gi|320461578|ref|NM_032982.3|을 의미하고;

시퀀스 동정 번호: 2는 호모사피엔스 카스파제 2, 세포자살-연관 시스테인 펩티다아제(CASP2), 전사 변종 3, mRNA gi|320461587|ref|NM_032983.3|을 의미하고;

시퀀스 동정 번호: 3은 호모사피엔스 카스파제 2, 세포자살-연관 시스테인 펩티다아제(CASP2), 전사 변종 2, mRNA gi|331999981|ref|NM_001224.4|를 의미하고;

시퀀스 동정 번호: 4는 호모사피엔스 NADPH 옥시다아제 3(Homo sapiens NADPH oxidase 3 ; NOX3), mRNA gi|229331997|ref|NM_015718.2|를 의미하고;

시퀀스 동정 번호: 5는 호모사피엔스 칼파인(Homo sapiens calpain), 작은 서브유닛 1(small subunit 1)(CAPNS1), 전사 변종 1, mRNA gi|51599152|ref|NM_001749.2|를 의미하고;

시퀀스 동정 번호: 6은 호모사피엔스 칼파인, 작은 서브유닛 1(CAPNS1), 전사 변종 2, mRNA gi|51599150|ref|NM_001003962.1|을 의미하고;

시퀀스 동정 번호: 7은 호모사피엔스 라스 동족 멤버 A(RHOA), mRNA gi|50593005|ref|NM_001664.2|를 의미한다.

본 발명의 하나의 관점에는 본 출원에서 기술되는 상기 dsRNA의 "신경보호" 활성이 포함된다. 본 발명의 상기 방법은 뉴런의 손상(injury), 사멸 또는 노쇠(senescence)로부터의 보호 또는 뉴런 기능의 보호 또는 개선을 제공한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신경보호"는 신경퇴화의 진행의 지연(arrest) 및/또는 늦춤(slowing) 및/또는 약화 및/또는 역전(reversing)을 의미한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신경퇴화"는 뉴런의 진행성 손실을 의미한다. 여기에는 연결되거나 또는 인접하는 뉴런의 손실이 후속하는 뉴런의 즉각적 손실을 의미하나 이들로 제한되는 것은 아니다.

"뉴런(neuron)", "뉴런 세포(neuronal cell)", "신경 세포(nerve cell)" 및 "뉴런세포(neural cell)"(뉴런 간세포(neural progenitor cells) 및 뉴런 줄기 세포(neural stem cells)를 포함하여)들은 신경 세포들, 즉 신체의 일부로부터 다른 부분으로의 신경 충격의 전달을 담당하는 세포들을 의미하는 것으로 상호호환적으로 사용된다. 대부분의 뉴런들은 3개의 별개의 부분들: 핵을 포함하는 세포체 및 2개의 서로 다른 형태들의 세포질돌기(cytoplasmic processes)들: 즉 수상돌기(dendrites)들과 축삭(axons)들로 이루어진다. 뉴런의 수용부(receiving portion)인 수상돌기들은 대개는 상기 세포체의 고도로 분지된(highly branched), 두꺼운 연장부(thick extensions)이다. 상기 축삭은 상기 세포체로부터 다른 뉴런 또는 근육 조직 또는 선상 조직(glandular tissue)에로 신경 충격을 전도하도록 특화된 전형적으로 단일의 길고 얇은 돌기이다. 축삭은 "축삭 분지(axon collaterals)"라 불리우는 분지(side branches)들을 가질 수 있다. 축삭 분지 및 축삭은 축삭종말(telodendria)이라 불리우는 많은 미세한 필라멘트(filaments) 내로 분지되는 것에 의하여 종결될 수 있다. 축삭종말의 원위단부(distal ends)는 시냅스종말팽대부(synaptic end bulbs) 또는 축삭 종말(axonal terminals)이라 불리우며, 이는 신경전달물질(neurotransmitters)을 저장하는 시냅스소포(synaptic vesicles)를 포함한다. 축삭은 말초신경계(peripheral nervous system)에서는 쉬반세포(Schwann cells)로 형성되고 그리고 중추신경계(central nervous system)에서는 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 형성되는 수초(myelin sheath)라 불리우는 다층의(multilayered), 백색 인지질(phospholipid)의 분절화 피복(segmented covering)으로 둘러싸여질 수 있다. 이러한 피복을 포함하는 축삭은 "유수화(myelinated)" 된 것이다. 뉴런에는 감각(sensory)(구심성(afferent)) 뉴런이 포함되며, 이는 말초 내의 수용기로부터 충격을 대뇌 및 척수에로 그리고 중추신경계의 저위 중추(lower centers)로부터 고위 중추(higher centers)에로 전달한다. 뉴런은 또한 충격을 대뇌 및 척수로부터 말단 내의 실행기(effectors)에로 그리고 중추신경계의 고위 중추로부터 저위 중추에로 전달하는 운동(motor)(원심성(efferent)) 뉴런이 될 수 있다. 다른 뉴런으로는 충격을 감각 뉴런으로부터 운동 뉴런에로 전달하고 그리고 상기 중추신경계 내에 위치되는 연합뉴런(association neurons)(연결뉴런(connecting neurons) 또는 간재뉴런(interneuron))이 있다. 다발(bundles) 내로 배열되는 상기 구심성 및 원심성 뉴런의 돌기는 상기 중추신경계(CNS) 외에 위치되는 경우 "신경(nerves)"이라 불리우거나 또는 상기 중추신경계 내에 위치되는 경우 섬유로(fiber tracts)라 불리운다.

용어 "국소 투여(topical administration)" 또는 "국소 적용(topical application)"은 바람직하게는 상기 대상체의 외이도에 뿐만 아니라 또한 선택적으로 국소 투여가 적절한 고막에의 조성물의 국소 투여를 의미하는 것으로 사용된다.

용어 "귀의(otic)" 및 "청각의(auricular)"는 본 출원에서는 상호호환적으로 사용되고 그리고 대체로 외이, 중이 및 내이를 포함하여 귀 내 및/또는 주변의 조직을 의미한다.

용어 "외이도" 또는 "외이도(external auditory meatus)"는 상기 외이로부터 상기 중이까지 이어지는 관을 의미한다.

상기 "고막(tympanic membrane)"(또한 tympanum 또는 myrinx)은 상기 중이로부터 상기 외이를 분리하는 얇은 막을 의미한다.

"약제학적 조성물(pharmaceutical composition)" 또는 "귀의 약제학적 조성물(otic pharmaceutical composition)" 또는 "눈의 약제학적 조성물(ocular pharmaceutical composition)" "약제학적 제형(pharmaceutical formulation)" 또는 "약제학적 제제(pharmaceutical preparation)" 등과 같은 용어들은 본 출원에서는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 활성 화합물을 동물 또는 인간의 귀에, 특히 내이의 조직에 투여 및 전달하도록 적용된 제형들을 의미하는 것으로 상호호환적으로 사용된다.

본 출원에서 사용된 바와 같은 "치료(treatment)", "치료한다(treat)" 또는 "치료하는(treating)"은 포유동물, 특히 인간의 질환 또는 상태의 임의의 치료를 커버하며, (a) 질환 또는 상태의 경향을 가질 수 있으나 그러나 아직 질환 또는 상태를 앓는 것으로 진단되지는 않은 대상체에서의 질환 또는 상태가 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 상기 질환 또는 상태를 억제하는 것, 즉, 그의 발달 또는 진전을 약화시키거나 또는 지연시키거나 또는 늦추거나 또는 연기하는 것; (c) 상기 질환 또는 상태를 완화시키거나 및/또는 개선시키는 것, 즉, 상기 질환 또는 상태 및/또는 그의 증후군들의 퇴행(regression)을 야기하는 것; 또는 (d) 상기 질환 또는 상태를 치료하는 것, 즉 그의 발달 또는 진전을 중단시키는 것;을 포함한다. 본 발명의 상기 방법들에 의해 치료되는 대상체의 개체군(population)에는 원치 않는 상태 또는 질환으로 고통받는 대상체들과 마찬가지로 상기 상태 또는 질환의 발달에 대한 위험에 있는 대상체들이 포함된다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 수용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 치료제(therapeutic agent)에 더해 상기 제형을 포함하는 구성성분이 본 발명에 따라 치료되는 환자/대상체에 투여하기에 적절한 것을 의미한다.

"경피흡수촉진제" 또는 "투과도촉진제"는 동물 또는 인간의 귀 내의 고막을 통한 치료학적 올리고뉴클레오티드의 경피흡수를 촉진하는 화합물 또는 화합물들의 조합을 의미한다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조직"은 특정의 기능의 수행에서 통합된 유사하게 특화된 세포의 집합을 의미한다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 및 "핵산(nucleic acid)"은 상호호환적으로 사용될 수 있고 그리고 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 뉴클레오티드 시퀀스(nucleotide sequences)를 의미한다. 상기 용어들은 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analogs)로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA 둘 중의 어느 하나의 등가물(equivalents), 유사체(analogs) 같은 것들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원 전체를 통하여, mRNA 시퀀스들은 대응하는 유전자들을 대표하는 것으로서 규정된다.

"올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)" 및 "올리고머(oligomer)"는 상호호환적으로 사용되고 그리고 약 2 내지 약 50개의 뉴클레오티드들의 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 뉴클레오티드(ribonucleotide) 시퀀스를 의미한다. 각 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 독립적으로 천연 또는 합성일 수 있고 및 또는 변성되거나 미변성된 것일 수 있다. 변성들에는 올리고뉴클레오티드 내의 당 성분(sugar moiety), 염기 성분(base moiety) 및 또는 뉴클레오티드들 간의 연결(linkages)에 대한 변화가 포함된다. 본 발명의 상기 화합물은 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변성된 디옥시리보뉴클레오티드, 변성된 리보뉴클레오티드, 독특한 성분 및 이들의 조합들을 포함하는 분자들을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안티센스 및 shRNA을 포함하는 단일 가닥 분자들 및 이중-가닥 RNA(dsRNA), siNA, siRNA 및 miRNA을 포함하는 이중-가닥 분자들을 포함하는 것을 의미한다.

실질적으로 상보적(substantially complementary)은 다른 시퀀스에 대하여 약 84% 보다 더 큰 상보성(complementarity)을 의미한다. 예를 들면, 19개의 염기쌍(base pairs)으로 이루어지는 듀플렉스 영역(duplex region)에서 하나의 미스매치(mismatch)는 94.7% 상보성의 결과를 가져오고, 2개의 미스매치들은 약 89.5% 상보성의 결과를 가져오고, 그리고 3개의 미스매치들은 84.2% 사보성의 결과를 가져와서 상기 듀플렉스 영역에 실질적으로 상보성을 부여한다. 따라서 실질적으로 동일한(substantially identical)은 다른 시퀀스에 대하여 약 84% 이상의 동일성(identity)을 의미한다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 완전히 상보적(100%)이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 상기 표적 mRNA에 대하여 완전히 상보적(100%)이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 센스 안티센스 가닥은 상기 표적 mRNA에 대하여 하나의 미스매치를 포함한다. 예를 들면, 상기 안티센스 가닥의 첫 번째의 포지션 내에 A, C 또는 G를 갖는 안티센스 가닥은 첫 번째의 포지션(5') 내에 "U"를 갖도록 생성되고, 그에 의하여 상기 안티센스 가닥과 상기 표적 mRNA 사이에 하나의 미스매치를 생성한다.

"뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미하며, 이들은 천연 또는 합성일 수 있고 및 또는 변성되거나 미변성된 것일 수 있다. 변성들에는 올리고뉴클레오티드 내의 당 성분, 염기 성분 및 또는 리보뉴클레오티드들 간의 연결에 대한 변화가 포함된다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오티드"는 천연 및 합성의, 미변성된 및 변성된 리보뉴클레오티드들을 포함한다. 변성들에는 상기 올리고뉴클레오티드 내의 당 성분에 대한, 염기 성분에 대한 및/또는 리보뉴클레오티드들 간의 연결에 대한 변화가 포함된다.

상기 뉴클레오티드는 천연적으로 발생하거나 또는 합성의 변성된 염기들로부터 선택될 수 있다. 천연적으로 발생하는 염기들에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실이 포함된다. 뉴클레오티드의 변성된 염기들에는 이노신(inosine), 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌(alkyl adenine), 5-할로우라실(5-halo uracil), 5-할로시토신(5-halo cytosine), 6-아자시토신(6-aza cytosine) 및 6-아자티민(6-aza thymine), 슈도우라실(pseudo uracil), 4-티오우라실(4-thiouracil), 8-할로아데닌(8-halo adenine), 8-아미노아데닌(8-aminoadenine), 8-티올아데닌(8-thiol adenine), 8-티올알킬아데닌(8-thiolalkyl adenines), 8-히드록실아데닌(8-hydroxyl adenine) 및 다른 8-치환 아데닌(8-substituted adenines), 8-할로구아닌(8-halo guanines), 8-아미노구아닌(8-amino guanine), 8-티올구아닌(8-thiol guanine), 8-티오알킬구아닌(8-thioalkyl guanines), 8-히드록실구아닌(8-hydroxyl guanine) 및 다른 치환 구아닌, 다른 아자 및 디아자아데닌(deaza adenines), 다른 아자 및 디아자� ��아닌(deaza guanines), 5-트리플루오로메틸우라실(5-trifluoromethyl uracil) 및 5-트리플루오로시토신(5-trifluoro cytosine)이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 올리고머 내의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드는 이노신으로 치환된다.

본 발명의 일부 구체예들에 있어서, 억제 올리고뉴클레오티드 화합물(inhibitory oligonucleotide compound)는 미변성되고 그리고 변성된 뉴클레오티드 및/또는 독특한 성분을 포함한다. 상기 화합물은 당 변성, 염기 변성 및 뉴클레오티드간 연결 변성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변성된 뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 DNA 및 LNA(잠금 핵산(locked nucleic acid)), ENA(에틸렌-가교화 핵산(ethylene-bridged nucleic acid)), PNA(펩티드 핵산(peptide nucleic acid)), 아라비노사이드(arabinoside), 포스포노카르복실레이트(phosphonocarboxylate) 또는 포스피노카르복실레이트 뉴클레오티드(PACE nucleptide), 미러 뉴클레오티드(mirror nucleotide) 또는 6탄당(6 carbon sugar)을 갖는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

유사체 또는 변성이 상기 뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 기능에 실질적으로 역으로 영향을 주지 않는 한, 뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 모든 유사체들 또는 변성들이 본 발명에 대하여 사용된다. 수용가능한 변성들에는 당 부분의 변성들, 염기 부분의 변성들, 뉴클레오티드간 연결에서의 변성 및 이들의 조합들이 포함된다.

당 변성에는 당 잔기(sugar residue)의 2' 성분에 대한 변성이 포함되고 그리고 아미노, 플루오로, 알콕시, 예를 들면 메톡시, 알킬, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 이미다졸, 카르복실레이트, 티오에이트, C ₁ 내지 C ₁₀ 저급 알킬(lower alkyl), 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬, OCF3, OCN; 0-알킬, S-알킬, 또는 N-알킬; 0-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; SOCH ₃ ; S0 ₂ CH ₃ ; ON0 ₂ ; N0 ₂ , N ₃ ; 헤테로사이클로알킬(heterocycloalkyl); 헤테로사이클로알카릴(heterocycloalkaryl); 아미노알킬아미노(aminoalkylamino); 폴리알킬아미노(polyalkylamino) 또는 치환된 실릴(silyl)과 마찬가지로 다른 것들 중에서, 유럽특허 제EP 0 586 520 Bl호 또는 동 제EP 0 618 925 Bl호들에 기술된 것들이 포함된다.

하나의 구체예에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 화합물은 당 성분에 대한 2' 변성("2' 당 변성")을 포함하는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 화합물은 선택적으로 교호하는 포지션들 상의 2'0-알킬 또는 2'-플루오로 또는 2'O-알릴 또는 임의의 다른 2' 변성을 포함한다. 다른 안정화 변성(stabilizing modifications)이 또한 가능하다(예를 들면, 말단 변성(terminal modifications). 일부 구체예들에 있어서, 바람직한 2'O-알킬은 2'-메틸(메톡시) 당 변성이다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 백본(backbone)은 변성된 것이고 그리고 인산-D-리보오스 독립체(phosphate-D-ribose entities)들을 포함하나, 그러나 또한 티오인산-D-리보오스 독립체(thiophosphate-D-ribose entities)들, 트리에스터(triester), 티오에이트(thioate), 2'-5' 가교화 백본(2'-5' bridged backbone)(또한 5'-2'로도 언급될 수 있음), PACE 등을 포함할 수 있다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-짝지음 뉴클레오티 유사체(non-pairing nucleotide analog)"는 6 데스 아미노 아데노신(6 des amino adenosine: 네뷸라린(Nebularine)), 4-메틸-인돌(4-Me-indole), 3-니트로피롤(3-nitropyrrole), 5-니트로인돌(5-nitroindole), Ds, Pa, N3-메틸 리보 우라실(N3-Me ribo U), N3-메틸 리보티미딘(N3-Me riboT), N3-메틸 디옥시시토신(N3-Me dC), N3-메틸-디옥시티미딘(N3-Me-dT), N1-메틸-디옥시구아닌(Nl-Me-dG), N1-메틸-디옥시아데닌(Nl-Me-dA), N3-에틸-디옥시시토신(N3-ethyl-dC), N3-메틸 디옥시시토신(N3-Me dC)을 포함하나 이들로 제한되지 않는 비-염기 짝지음 성분(non-base pairing moiety)을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 비-염기 짝지음 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예들에 있어서, 이는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 게다가, 폴리뉴클레오티드들의 유사체들이 제조될 수 있으며 여기에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 구조가 근본적으로 변경되고 그리고 치료학적 또는 실험적 시약들로서 더 적절할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 하나의 실시예는 DNA(또는 RNA) 내의 디옥시리보오스(또는 리보오스) 인산 백본이 펩티드들 내에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 백본으로 치환된 펩티드 핵산(PNA)이다. PNA 유사체들은 효소 분해(enzymatic degradation)에 대하여 저항성이고 그리고 생체 내( in vivo ) 및 시험관 내( in vitro )에서 증가된 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 올리고뉴클레오티드들을 합성하는 데 유용한 다른 변성들에는 폴리머 백본(polymer backbones), 환형 백본(cyclic backbones), 비환형 백본(acyclic backbones), 티오인산-D-리보오스 백본(thiophosphate-D-ribose backbones), 트리에스터 백본(triester backbones), 티오에이트 백본(thioate backbones), 2'-5' 가교 백본(2'-5' bridged backbone ; 또한 2'5' 뉴클레오티드 또는 2'5' 리보뉴클레오티드[3'OH를 갖는]로도 알려진), 인공 핵산(artificial nucleic acids), 몰포리노 핵산(morpholino nucleic acids), 글리콜 핵산(glycol nucleic acid: GNA), 트레오스 핵산(threose nucleic acid: TNA), 아라비노사이드 및 미러 뉴클레오시드(mirror nucleoside: 예를 들면, 베타-D-디옥시리보뉴클레오시드 대신 베타-L-디옥시리보뉴클레오시드)들이 포함된다. LNA 뉴클레오티드들을 포함하는 siRNA 화합물들의 예들이 문헌 Elmen et al, (NAR 2005, 33(l):439-447)에 기술되어 있다.

일부 구체예들에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 화합물들은 하나 또는 그 이상의 역전된 뉴클레오티드, 예를 들면 역전된 티미딘 또는 역전된 아데닌을 사용하여 합성된다(예를 들면, 문헌 Takei, et al, 2002, JBC 277(26):23800-06을 참조하시오).

다른 변성들에는 상기 올리고뉴클레오티드들의 5' 및/또는 3' 부분에 대한 말단 변성(terminal modifications)들이 포함되고 그리고 또한 캡핑 성분들로서 알려져 있다. 이러한 말단 변성들은 뉴클레오티드, 변성된 뉴클레오티드, 지질(lipid), 펩티드, 당 및 역전된 어베이직 성분으로부터 선택된다.

때때로 본 발명에서 "어베이직 뉴클레오티드" 또는 "어베이직 뉴클레오티드 유사체(abasic nucleotide analog)"로 언급되는 것은 슈도-뉴클레오티드 또는 독특한 성분으로 보다 더 적절하게 언급된다. 뉴클레오티드는 리보오스 또는 디옥시리보오스 당, 인산 및 염기(DNA 내의 아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신; RNA 내의 아데닌, 구아닌, 우라실 또는 시토신)으로 이루어지는 핵산의 단량체성 단위(monomeric unit)이다. 변성된 뉴클레오티드에는 상기 당, 인산 및 또는 염기의 하나 또는 그 이상에서의 변성이 포함된다. 어베이직 슈도-뉴클레오티드(abasic pseudo-nucleotide)는 염기가 결여되고, 따라서 엄격히는 뉴클레오티드가 아니다.

본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "캡핑 성분"("z")에는

어베이직 리보오스 성분, 어베이직 디옥시리보오스 성분, 2' O 알킬 변성을 포함하는 변성된 어베이직 리보오스 및 어베이직 디옥시리보오스 성분들의 변성들; 역전된 어베이직 리보오스 및 어베이직 디옥시리보오스 성분들 및 이들의 변성들; C6-이미노-Pi(C6-imino-Pi); L-DNA 및 L-RNA를 포함하는 미러 뉴클레오티드; 5'O-Me 뉴클레오티드; 및 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사체들; 1-(β-D-에리쓰로푸라노실)뉴클레오티드(1-(β-D-erythrofuranosyl)nucleotide); 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보사이클릭 뉴클레오티드(carbocyclic nucleotide); 5'-아미노-알킬인산(5'-amino-alkyl phosphate); 1,3-디아미노-2-프로필인산(l,3-diamino-2-propyl phosphate), 3-아미노프로필인산(3-aminopropyl phosphate); 6-아미노헥실인산(6-aminohexyl phosphate); 12-아미노도데실인산(12-aminododecyl phosphate); 히드록시프로필인산(hydroxypropyl phosphate); 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드(1,5-anhydrohexitol nucleotide); 알파-뉴클레오티드(alpha-nucleotide); 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드(threo-pentofuranosyl nucleotide); 비환식 3',4'-세코 뉴클레오티드(acyclic 3',4'-seco nucleotide); 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드(3,4-dihydroxybutyl nucleotide); 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드(3,5-dihydroxypentyl nucleotide), 5'-5'-역전 어베이직 성분(5'-5'-inverted abasic moiety); 1,4-부탄디올인산(1,4-butanediol phosphate); 5'-아미노; 및 가교화 또는 비가교화 메틸인산 및 5'-머캅토 성분(5'-mercapto moieties)이 포함된다.

특정의 바람직한 캡핑 성분들은 어베이직 리보오스 또는 어베이직 디옥시리보오스 성분; 역전된 어베이직 리보오스 또는 어베이직 디옥시리보오스 성분; C6-아미노-Pi; L-DNA 및 L-RNA를 포함하여 미러 뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 캡핑 성분은 프로판디올(propanediol)로부터 유도되는 C3 비-뉴클레오티드 성분(C3 non-nucleotide moiety)이다.

본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "독특한 성분"은 어베이직 리보오스 성분, 어베이직 디옥시리보오스 성분, 디옥시리보뉴클레오티드, 변성된 디옥시리보뉴클레오티드, 미러 뉴클레오티드, 비-염기쌍 뉴클레오티드 유사체(non-base pairing nucleotide analog) 및 2'-5' 뉴클레오티드간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드; LNA를 포함하는 가교화된 핵산 및 에틸렌가교화 핵산을 의미한다.

본 발명의 일부 구체예들에 있어서, 바람직한 독특한 성분은 어베이직 리보오스 성분, 어베이직 디옥시리보오스 성분, 디옥시리보뉴클레오티드, 미러 뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드간 인산 결합에 의하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드이다.

어베이직 디옥시리보오스 성분에는 예를 들면 어베이직 디옥시리보오스-3'-인산(abasic deoxyribose-3'-phosphate); 1,2-디디옥시-D-리보푸라노스-3-인산(1,2-dideoxy-D-ribofuranose-3-phosphate); 1,4-안하이드로-2-디옥시-D-리비톨-3-인산(1,4-anhydro-2-deoxy-D-ribitol-3-phosphate)이 포함된다. 역전된 어베이직 디옥시리보오스 성분에는 역전된 디옥시리보어베이직(inverted deoxyriboabasic); 3',5' 역전된 디옥시어베이직 5'-인산(3',5' inverted deoxyabasic 5'-phosphate)이 포함된다.

"미러" 뉴클레오티드는 천연적으로 발생하거나 또는 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드에 대하여 역전된 키랄성(reversed chirality)을 갖는 뉴클레오티드, 즉 천연적으로 발생하는 (D-뉴클레오티드)의 거울상(L-뉴클레오티드)이며, 또한 미러 리보뉴클레오티드 및 "스피에겔머(spiegelmer)"의 경우에는 L-RNA로 언급된다. 상기 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드가 될 수 있으며, 적어도 하나의 당, 염기 및 또는 백본 변성을 더 포함할 수 있다. 미합중국 특허 제6,586,238호를 참조하시오. 또한, 미합중국 특허 제6,602,858호는 적어도 하나의 L-뉴클레오티드 치환을 포함하는 핵산 촉매를 기술하고 있다. 미러 뉴클레오티드는, 예를 들면, L-DNA(L-디옥시리보아데노신-3'-인산(미러 dA); L-디옥시리보시티딘-3'-인산(미러 dC); L-디옥시리보구아노신-3'-인산(미러 dG); L-디옥시리보티미딘-3'-인산(거울상 dT ; mirror image dT) 및 L-RNA(L-리보아데노신-3'-인산(미러 rA); L-리보시티딘-3'-인산(미러 rC); L-리보구아노신-3'-인산(미러 rG); L-리보우라실-3'-인산(미러 rU)을 포함한다.

변성된 디옥시리보뉴클레오티드에는, 예를 들면, 5' 말단 포지션(포지션 번호 1) 내의 뉴클레오티드로서 유용할 수 있는 5'OMe DNA(5-메틸-디옥시리보구아노신-3'-인산); PACE(디옥시리보아데닌 3' 포스포노아세테이트(deoxyriboadenine 3' phosphonoacetate), 디옥시리보시티딘 3' 포스포노아세테이트(deoxyribocytidine 3' phosphonoacetate), 디옥시리보구아노신 3' 포스포노아세테이트(deoxyriboguanosine 3' phosphonoacetate), 디옥시리보티미딘 3' 포스포노아세테이트(deoxyribothymidine 3' phosphonoacetate))이 포함된다.

가교화된 핵산들에는 LNA(2'-0, 4'-C-메틸렌 가교화 핵산 아데노신 3' 모노인산(2'-0, 4'-C-methylene bridged Nucleic Acid adenosine 3' monophosphate), 2'-0, 4'-C-메틸렌 가교화 핵산 5-메틸-시티딘 3' 모노인산(2'-0, 4'-C-methylene bridged Nucleic Acid 5-methyl-cytidine 3' monophosphate), 2'-0, 4'-C-메틸렌 가교화 핵산 구아노신 3' 모노인산(2'-0,4'-C-methylene bridged Nucleic Acid guanosine 3' monophosphate), 5-메틸-우리딘(또는 티미딘) 3' 모노인산(5-methyl-uridine (or thymidine) 3' monophosphate)); 및 ENA(2'-0, 4'-C-에틸렌 가교화 핵산 아데노신 3' 모노인산, 2'-0, 4'-C-에틸렌 가교화 핵산 5-메틸-시티딘 3' 모노인산, 2'-0, 4'-C-에틸렌 가교화 핵산 구아노신 3' 모노인산, 5-메틸-우리딘 (또는 티미딘) 3' 모노인산) 들이 포함된다. 하나의 관점에 따르면, 본 발명은 미변성되고 그리고 변성된 뉴클레오티드를 포함하는 억제 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 당 변성, 염기 변성 및 뉴클레오티드간 연결 변성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변성된 뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 DNA 및 ENA(에틸렌-가교화 핵산)을 포함하여 LNA(잠금 핵산) 등과 같은 변성된 뉴클레오티드; PNA(펩티드 핵산); 아라비노시드; PACE(포스포노아세테이트 및 이들의 유도체들), 미러 뉴클레오티드 또는 6탄당을 갖는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 출원에서 기술되는 상기 변성들 중의 임의의 것이 본 발명의 조성물 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드들의 제조에 사용될 수 있다. 바람직한 변성 계통도들이, 예를 들면, 국제특허 공개공보 제WO 2006/023544호, 동 제WO 2010/048352호, 동 제WO2009/116037호, 동 제WO 2009/147684호, 동 제WO 2011/066475호, 동 제WO 2011/084193호들에 기술되며, 이들 모두는 본 발명의 양수인에게 양수되었다.

카스파제 2(인간 CASP2) mRNA의 예시적인 핵산 시퀀스가, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3에 기재된 바와 같이, 도 1a 내지 도 1c에 규정된다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 주어진 시퀀스가 수 차례 변화되어 따라서 본 출원의 핵산 분자들에서 요구되는 임의의 변화들이 포함되도록 할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 본 출원에서 기술되는 상기 방법은 NOX3, CAPNS 1(칼스파인 S1(Calpain S1)) 및 RHOA를 하향 조절하는 dsRNA 분자들의 용도를 더 포함한다.

RNA 간섭 및 siNA 핵산 분자(RNA Interference and siNA Nucleic Acid Molecules)

RNA 간섭은 짧은 간섭 RNA(siRNAs)들에 의해 매개되는 동물에서의 시퀀스-특이적(sequence-specific) 전사-후 유전자 침묵화(post-transcriptional gene silencing)의 과정을 의미한다(문헌 Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al, 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al, 1999, Science, 286, 950-951 ; Lin et al, 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13: 139-141 ; and Strauss, 1999, Science, 286, 886을 참조하시오). 식물에서의 대응하는 과정(문헌 Heifetz et al., 국제공개특허공보 제WO 99/61631호 참조)은 종종 전사-후 유전자 침묵화(PTGS) 또는 RNA 침묵화(RNA silencing)로 언급된다. 전사-후 유전자 침묵화의 과정은 외래 유전자들의 발현을 방지하기 위하여 사용되는 진화학적으로 보존된 세포 방어 메카니즘(evolutionarily-conserved cellular defense mechanism)인 것으로 여겨진다(문헌 Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358 참조). 이러한 외래 유전자 발현으로부터의 보호는 상동의 단일-가닥 RNA(homologous single-stranded RNA) 또는 바이러스 게놈의 RNA(viral genomic RNA)를 특이적으로 파괴하는 세포 반응(cellular response)을 통한 숙주 게놈(host genome) 내로의 바이러스 감염으로부터 또는 전이인자 요소(transposon elements)들의 무작위 동화(random integration)로부터 유도되는 이중-가닥 RNAs(dsRNAs)들의 보호에 대한 반응으로 진화된 것일 수 있다. 세포 내에서의 dsRNA의 존재는 아직 완전히 특정되지 않은 메카니즘을 통한 RNAi 반응을 촉발한다. 이러한 메카니즘은 리보뉴클레아제 L(ribonuclease L)에 의한 mRNA의 비-특이적 분해(non-specific cleavage)의 결과를 가져오는 단백질 키나아제 PKR 및 2',5'-올리고아데닐화 합성효소(2',5'-oligoadenylate synthetase)를 원인으로 하는 인터페론 반응(interferon response) 등과 같은 이중-가닥 RNA-특이적 리보뉴클레아제(double-stranded RNA-specific ribonucleases)들을 포함하는 다른 공지된 메카니즘들과는 다를 것으로 여겨진다(예를 들면, 문헌 미합중국 특허 제6,107,094호; 동 제5,898,031호; Clemens et al, 1997, J. Interferon & Cytokine Res., 17, 503-524; Adah et al, 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189을 참조하시오).

세포 내의 긴 이중-가닥 RNA(dsRNAs)들의 존재는 다이서(dicer)라고도 언급되는 리보뉴클레아제 III 효소의 활성을 자극한다(문헌 Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293 참조). 다이서는 짧은 간섭 RNA(siRNAs)들로 알려진 dsRNA의 dsRNA의 짧은 조각들로의 가공에 포함된다(문헌 Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al, 2001, Nature, 409, 363). 다이서 활성으로부터 유도되는 짧은 간섭 RNA들은 전형적으로 약 21 내지 약 23개의 뉴클레오티드들의 길이이고 그리고 약 19개의 염기쌍 듀플렉스들을 포함한다(문헌 Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al, 2001, Genes Dev., 15, 188). 다이서는 또한 번역조절(translational control)에 연관되는 보존된 구조(conserved structure)의 전구체 RNA(precursor RNA)로부터의 21- 및 22-뉴클레오티드의 작은 일시적 RNA(small temporal RNAs ;stRNAs)들의 절제(excision)에도 연관된다(문헌 Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). 상기 RNAi 반응은 또한 통상 RNA-유발 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex ; RISC)로 언급되는 엔도뉴클레아제 복합체(endonuclease complex)를 특징으로 하며, 이는 상기 siRNA 듀플렉스의 상기 안티센스 가닥에 대한 시퀀스 보체를 갖는 단일-가닥 RNA의 분해를 매개한다. 상기 표적 RNA의 분해는 상기 siRNA 듀플렉스의 상기 안티센스 가닥에 대하여 보체인 영역의 중간에서 일어난다(문헌 Elbashir et al, 2001, Genes Dev., 15, 188).

RNAi는 다양한 계(systems)들 내에서 연구되었다. 문헌 Fire et al, (1998, Nature, 391, 806)은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 RNAi를 처음 관측하였다. 문헌 Bahramian and Zarbl, (1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283) 및 Wianny and Goetz, (1999, Nature Cell Biol., 2, 70)은 포유동물계(mammalian systems)에서 dsRNA로 매개되는 RNAi를 기술하고 있다. 문헌 Hammond et al., (2000, Nature, 404, 293)은 dsRNA로 형질감염된(transfected) 초파리(Drosophila) 세포에서의 RNAi를 기술하고 있다. 문헌 Elbashir et al, (2001, Nature, 411, 494) 및 Tuschl et al, (국제공개특허공보 제WO 01/75164호)는 합성 21-뉴클레오티드 RNA들의 듀플렉스들의 인간 배아 신장(human embryonic kidney) 및 HeLa 세포들을 포함하는 배양된 포유동물 세포 내로의 도입에 의하여 유도된 RNAi를 기술하고 있다. 초파리 배아 용해물(Drosophila embryonic lysates)에서의 최근의 연구(문헌 Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877) 및 Tuschl et al, (국제공개특허공보 제WO 01/75164호)는 효과적인 RNAi 활성을 매개하는 데 필수적인 siRNA 길이, 구조, 화학적 조성 및 시퀀스에 대한 특정의 요건들을 밝히고 있다.

핵산분자(예를 들면, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 구조적 특징들을 갖는)는 시퀀스-특이적인 방법으로 RNA 간섭 "RNAi" 또는 유전자 침묵화를 매개하는 것에 의하여 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제하거나 또는 하향 조절할 수 있다; 예를 들면, 문헌 Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al, 2001, Nature, 411, 494-498; 및 Kreutzer et al, 국제공개특허공보 제WO 00/44895호; Zernicka-Goetz et al, 국제공개특허공보 제WO 01/36646호; Fire, 국제공개특허공보 제WO 99/32619호; Plaetinck et al, 국제공개특허공보 제00/01846호; Mello and Fire, 국제공개특허공보 제WO 01/29058호; Deschamps-Depaillette, 국제공개특허공보 제WO 99/07409호; 및 Li et al, 국제공개특허공보 제WO 00/44914호; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al, 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; 및 Hall et al, 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al, 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al, 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; 및 Reinhart & Barrel, 2002, Science, 297, 1831을 참조하시오).

siNA 핵산 분자는 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥들로부터 조립될 수 있으며, 여기에서 하나의 가닥은 센스 가닥이고 그리고 다른 하나는 안티센스 가닥이고, 여기에서 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥들이 자가-상보적(self-complementary)(즉, 각 가닥이 다른 가닥 내의 뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스를 포함함); 마찬가지로 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 제공된 핵산 분자들에 대하여 본 출원에서 기술된 바와 같은 임의의 길이 및 구조를 갖는 듀플렉스 또는 이중-가닥 구조를 형성하고, 예를 들면, 여기에서 상기 이중-가닥 영역(듀플렉스 영역)은 약 15 내지 약 49개(예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개의 염기쌍들)이고; 상기 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자(즉, mRNA) 또는 그의 일부 내의 뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고 그리고 상기 센스 가닥은 상기 표적 핵산 시퀀스 또는 그의 일부에 대응하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다(예를 들면, 본 출원의 상기 핵산 분자의 약 17 내지 약 49개 또는 그 이상의 뉴클레오티드들이 상기 표적 핵산 또는 그의 일부에 상보적이다).

특정의 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 핵산 분자(예를 들면, siRN 분자)는 "RISC 길이(RISC length)" 분자가 될 수 있거나 또는 이하에서 보다 상세하게 기술되는 바와 같은 다이서 기질(Dicer substrate)이 될 수 있다. 마이크로 RNA 전구체(pre-miRNA) 등과 같은 보다 긴 분자들이 또한 RISC 내에서 작동할 수 있다.

siNA 핵산 분자는 별개의 센스 및 안티센스 시퀀스들 또는 영역들을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 센스 및 안티센스 영역들은 당해 기술분야에서 공지된 것과 같은 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 연결자(nucleotide or non-nucleotide linkers) 분자들에 의해 공유적으로 결합되거나, 또는 달리 이온 상호작용(ion interaction), 수소결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용(hydrophobic interactions) 및/또는 적층 상호작용(stacking interations)에 의하여 비-공유적으로 결합된다. 핵산 분자들은 표적 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스에 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있다. 핵산 분자들은 상기 표적 유전자의 발현의 억제를 야기하는 방법으로 표적 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스와 상호작용할 수 있다.

달리, siNA 핵산 분자는 단일의 폴리뉴클레오티드로부터 조립되고, 여기에서 상기 핵산 분자의 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역들은 핵산 염기들 또는 비=핵산-기반 연결자(들)의 수단에 의해 결합되고, 즉, 상기 안티센스 가닥과 상기 센스 가닥은 겹쳐져서 하나의 듀플렉스 영역을 형성하는(예를 들면, 당해 기술분야에서 잘 알려진 "헤어핀" 구조를 형성하는) 안티센스 영역 및 센스 영역을 갖는 하나의 단일 폴리뉴클레오티드의 일부들이다. 이러한 siNA 핵산 분자는 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역들을 갖는 듀플렉스, 비대칭 듀플렉스(asymmetric duplex), 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 여기에서 상기 안티센스 영역이 별개의 표적 핵산 분자 또는 그의 일부 내의 뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 그리고 상기 센스 영역이 상기 표적 핵산 시퀀스(예를 들면, mRNA의 시퀀스)에 대응하는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. 이러한 siNA 핵산 분자는 둘 또는 그 이상의 루프 구조(loop structures) 및 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역들을 포함하는 스템(stem)을 갖는 원형의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 여기에서 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부 내의 뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 그리고 상기 센스 영역이 상기 표적 핵산 시퀀스 또는 그의 일부에 대응하는 뉴클레오티드 시퀀스를 가지고, 그리고 여기에서 상기 원형의 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 가공되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 핵산 분자를 생성할 수 있다.

하기의 명명법은 종종 당해 기술분야에서 siNA 분자의 길이 및 오버행(overhangs)을 기술하는 데 사용되고, 그리고 본 상세한 설명 및 실시예들 전체를 통하여 사용될 수 있다. 듀플렉스에 대해 주어진 명칭은 상기 올리고머의 길이 및 오버행의 존재 또는 부재를 나타낸다. 예를 들면, "21+2" 듀플렉스는 둘 다 21개의 뉴클레오티드의 길이인 2개의 핵산 가닥들을 포함하고, 또한 21-량체(21-mer) siRNA 듀플렉스 또는 21-량체 핵산으로 종결되고 그리고 2개의 뉴클레오티드 3'-오버행을 갖는다. "21-2" 설계는 2개의 뉴클레오티드 5'-오버행을 갖는 21-량체 핵산 듀플렉스를 의미한다. 21-0 설계는 오버행을 갖지 않는(평활말단된(blunt)) 21-량체 핵산 듀플렉스이다. "21+2UU"는 2-뉴클레오티드 3'-오버행을 갖는 21-량체 듀플렉스이고 그리고 3-말단의 말단의 두 개의 뉴클레오티드들은 둘 다 우라실 잔기(U residues)들이다(이는 표적 시퀀시에 대하여 미스매치의 결과를 가져올 수 있다). 앞서 언급한 명명법은 여러 길이들의 듀플렉스 및 오버행들(19-0, 21+2, 27+2 등과 같은)의 siNA 분자들에 적용될 수 있다. 달리 그러나 유사한 명명법에 있어서, "25/27"은 2-뉴클레오티드 3'-오버행을 갖는 25개의 염기의 센스 가닥 및 27개의 염기의 안티센스 가닥을 갖는 비대칭 듀플렉스이다. "27/25"는 27개의 염기의 센스 가닥 및 25개의 염기의 안티센스 가닥을 갖는 비대칭 듀플렉스이다.

화학적 변성

특정의 관점들 및 구체예들에 있어서, 본 출원에서 제공되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, siNA 분자를 포함하는 dsRNA)는 하나 또는 그 이상의 독특한 성분들의 존재를 포함하여 하나 또는 그 이상의 변성들(또는 화학적 변성들)을 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, 이러한 변성들은 "미변성된" 리보뉴클레오티드 또는 미변성된 리보핵산이라고도 언급될 수 있는 표준 리보뉴클레오티드 또는 RNA 분자(즉, 표준 아데닌, 시토신, 우라실 또는 구아닌 성분들을 포함하는)와는 다른 분자를 만드는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 임의의 변화들을 포함한다. 아데닌, 시토신, 티민 또는 구아닌 성분들로 대표되는 2'-디옥시 당을 갖는 전통적인 DNA 염기 및 폴리뉴클레오티드는 "미변성된 디옥시리보뉴클레오티드" 또는 "미변성된 디옥시리보핵산"으로 언급될 수 있으며; 따라서, 본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "미변성된 뉴클레오티드" 또는 "미변성된 핵산"은 달리 반대하는 명백한 표시가 존재하지 않는 한, "미변성된 리보뉴클레오티드" 또는 "미변성된 리보핵산"을 의미한다. 이러한 변성들은 뉴클레오티드 당, 뉴클레오티드 염기, 뉴클레오티드 인산기 및/또는 폴리뉴클레오티드의 인산 백본 내에 존재할 수 있으며, RNA 및 DNA의 거울상 이성질체(enantiomers)를 포함한다.

특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 변성들은 분자의 RNAi 활성을 증가시키거나 및/또는 분자의 생체 내 안정성(in vivo stability), 특히 혈청 내 안정성을 증가시키거나 및/또는 분자의 생물학적 이용도(bioavailability)를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 변성들의 비-제한적인 예들에는 제한 없이 뉴클레오티드간 또는 뉴클레오티드 간 연결; 상기 핵산 분자의 임의의 포지션 및 가닥에서의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 디디옥시리보뉴클레오티드들; 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시 및 알킬로부터 바람직하게 선택되는 2'-포지션에서의 변성을 갖는 핵산(예를 들면, 리보핵산); 2'-디옥시리보뉴클레오티드, 2'-0-메틸리보뉴클레오티드, 2'-디옥시-2'-플루오로리보뉴클레오티드, "유니버설 염기" 뉴클레오티드("universal base" nucleotides), "비환식" 뉴클레오티드("acyclic" nucleotides), 5-C-메틸뉴클레오티드, 비오틴기(biotin group) 및 말단 글리세릴 및/또는 역전된 디옥시 어베이직 잔기 포함, 형광 분자(fluorescent molecules) 등과 같은 입체장해 분자(sterically hindered molecules) 등이 포함된다. 다른 뉴클레오티드 변성기(nucleotides modifiers)들에는 3'-디옥시아데노신(3'-deoxy adenosine ; 코르디셉틴(cordycepin)), 3'-아지도-3'-디옥시티미딘(3'-azido-3'-deoxythymidine ; AZT), 2',3'-디디옥시이노신(2',3'-dideoxyinosine ; ddI), 2',3'-디디옥시-3'-티아시티딘(2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine ; 3TC), 2',3'-디디하이드로-2',3'-디디옥시티미딘(2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidi-ne ; d4T) 및 3'-아지도-3'-디옥시티미딘(AZT), 2',3'-디디옥시-3'-티아시티딘(3TC) 및 2',3'-디디하이드로-2',3'-디디옥시티미딘(d4T)의 모노포스페이트 뉴클레오티드들이 포함될 수 있다. 여러 변성들에 대한 보다 상세한 설명이 이하에서 보다 상세하게 설명된다.

변성된 뉴클레오티드에는 노던 형태(Northern conformation)(예를 들면, 노던 슈도로테이션 사이클(Northern pseudorotation cycle), 예를 들면, 문헌 Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer- Verlag ed., 1984)을 참조하시오)를 갖는 것들이 포함된다. 노던 배열(northern configuration)을 갖는 뉴클레오티드들의 비-제한적인 예들에는 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오티드(예를 들면, 2'-0, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오티드(2'-0, 4'-C-methylene-(D-ribofuranosyl) nucleotides)); 2'-메톡시에톡시(MOE) 뉴클레오티드(2'-methoxy ethoxy (MOE) nucleotides); 2'-메틸-티오-에틸, 2'-디옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드(2'-methyl-thio-ethyl, 2'-deoxy-2'-fluoro nucleotides), 2'-디옥시-2'-클로로 뉴클레오티드(2'-deoxy-2'-chloro nucleotides), 2'-아지도 뉴클레오티드(2'-azido nucleotides) 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드(2'-0-methyl nucleotides)들이 포함된다. 잠금 핵산 또는 LNA들은, 예를 들면, 문헌 Elman et al., 2005; Kurreck et al., 2002; Crinelli et al., 2002; Braasch and Corey, 2001; Bondensgaard et al, 2000; Wahlestedt et al, 2000; 및 국제공개특허 제WO 00/47599호, 동 제WO 99/14226호 및 동 제WO 98/39352호 및 동 제WO 2004/083430호에 기술되었다. 하나의 구체예에 있어서, LNA는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 포함된다.

화학적 변성들에는 또한 비-잠금 핵산(unlocked nucleic acids) 또는 UNA들이 포함되며, 이들은 비-뉴클레오티드, 비환식 유사체들이고, 여기에서 C2'-C3' 결합(C2'-C3' bond)가 존재하지 않는다(비록 UNA들은 진실로 뉴클레오티드는 아님에도 불구하고, 이들은 본 출원에서 고려되는 바와 같이 "변성된" 뉴클레오티드 또는 변성된 핵산의 관점 내에 표현적으로 포함된다). 특정의 구체예들에 있어서, 오버행을 갖는 핵산 분자는 오버행 포지션(즉, 2 뉴클레오티드 오버행(2 nucleotide overhand))에 UNA들을 갖도록 변성될 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, UNA들에는 3'- 또는 5'- 말단들에 포함된다. UNA는 핵산 가닥을 따라 어느 곳에나, 즉 포지션 7에 위치될 수 있다. 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 UNA를 포함할 수 있다. 예시적인 UNA들이 문헌 Nucleic Acids Symposium Series No. 52 p. 133-134 (2008)에 기술되어 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, siNA 분자)는 하나 또는 그 이상의 UNA들; 또는 하나의 UNA를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 3'-오버행을 갖는 핵산 분자(예를 들면, siNA 분자)는 3' 오버행 내에 1 또는 2개의 UNA들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, siNA 분자)는 안티센스 가닥 내에; 예를 들면, 상기 안티센스 가닥의 포지션 6 또는 포지션 7 내에 UNA(예를 들면, 하나의 UNA)를 포함한다. 또한, 화학적 변성들에는 본 출원에서 기술되는 바와 같은 비-짝지음 뉴클레오티드 유사체(non-pairing nucleotide analogs)들이 포함된다. 화학적 변성들에는 본 출원에서 기술되는 바와 같은 독특한 성분들이 더 포함된다.

화학적 변성들에는 또한 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 부분 상에 말단 변성을 포함하며 또한 캡핑 성분으로도 알려져 있다. 이러한 말단 변성들은 뉴클레오티드, 변성된 뉴클레오티드, 지질(lipid), 펩티드 및 당으로부터 선택된다.

화학적 변성들에는 또한 6원의 "6원 고리 뉴클레오티드 유사체(six membered ring nucleotide analogs)"들이 포함된다. 6원 고리 뉴클레오티드 유사체들의 예들은 문헌 Allart, et al (Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17: 1523-1526,; 및 Perez-Perez, et al, 1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters 6: 1457-1460)에 기술되어 있다. 헥시톨(hexitol) 및 알트리톨(altritol) 뉴클레오티드 단량체(nucleotide monomers)들을 포함하는 6원 고리 뉴클레오티드 유사체들을 포함하는 올리고뉴클레오티드들이 국제특허공개 제WO 2006/047842호에 기술되어 있다.

화학적 변성들에는 또한 "미러" 뉴클레오티드들이 포함되며, 이는 정상의 천연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 비교하여 역전된 키랄성(reversed chirality)을 가지며; 즉, 미러 뉴클레오티드는 천연적으로 발생하는 D-뉴클레오티드의 "L-뉴클레오티드" 유사체일 수 있다(미합중국 특허 제6,602,858호를 참조하시오). 미러 뉴클레오티드에는, 본 출원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 포스포네이트 성분(phosphonate moiety) 등과 같은 적어도 하나의 당 또는 염기 변성 및/또는 백본 변성이 더 포함될 수 있다. 미합중국 특허 제6,602,858호는 적어도 하나의 L-뉴클레오티드 치환(L-nucleotide substitution)을 포함하는 핵산 촉매(nucleic acid catalysts)를 기술하고 있다. 미러 뉴클레오티드에는, 예를 들면, L-DNA(L-디옥시리보아데노신-3'-인산(미러 dA); L-디옥시리보시티딘-3'-인산(미러 dC); L-디옥시리보구아노신-3'-인산(미러 dG); L-디옥시리보티미딘-3'-인산(거울상 dT)) 및 L-RNA(L-리보아데노신-3'-인산(미러 rA); L-리보시티딘-3'-인산(미러 rC); L-리보구아노신-3'-인산(미러 rG); L-리보우라실-3'-인산(미러 dU)들이 포함된다.

일부 구체예들에 있어서, 변성된 리보뉴클레오티드에는 변성된 디옥시리보뉴클레오티드, 예를 들면, 5' 말단 포지션(포지션 번호 1) 내의 뉴클레오티드로서 유용할 수 있는 5'OMe DNA(5-메틸-디옥시리보구아노신-3'-인산(5-methyl-deoxyriboguanosine-3'-phosphate)); PACE(디옥시리보아데닌 3' 포스포노아세테이트(deoxyriboadenine 3' phosphonoacetate, 디옥시리보시티딘 3' 포스포노아세테이트(deoxyribocytidine 3' phosphonoacetate), 디옥시리보구아노신 3' 포스포노아세테이트(deoxyriboguanosine 3' phosphonoacetate), 디옥시리보티미딘 3' 포스포노아세테이트(deoxyribothymidine 3' phosphonoacetate) 들이 포함된다.

변성들은 본 출원에서 기술되는 핵산 분자의 하나 또는 그 이상의 가닥들 내에, 예를 들면, 상기 센스 가닥, 상기 안티센스 가닥 또는 2개의 가닥들 모두의 내에 존재할 수 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 변성들을 포함할 수 있고, 그리고 상기 센스 가닥은 단지 미변성된 RNA 만을 포함할 수 있다.

핵염기(Nucleobases)

본 출원에서 기술되는 상기 핵산의 핵염기들에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우리딘 등과 같은 미변성된 리보뉴클레오티드(퓨린(purines) 및 피리미딘(pyrimidines))가 포함될 수 있다. 하나 또는 2개의 가닥들 내의 상기 핵염기들은 티민(thymine), 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 이노신(inosine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 임의의 "유니버설 베이스" 뉴클레오티드; 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실(5-halouracil) 및 시토신, 5-프로피닐 우라실(5-propynyl uracil) 및 시토신, 6-아조 우라실(6-azo uracil), 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실)(5-uracil(pseudouracil)), 4-티오우라실(4-thiouracil), 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 하이드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌(7-methylguanine), 디아자퓨린(deazapurines), 퓨린 및 피리미딘의 헤테로사이클릭 치환 유사체, 예를 들면, 아미노티옥시 페녹사진(aminoethyoxy phenoxazine), 퓨린 및 피리미딘의 유도체(예를 들면, 1-알킬-, 1-알케닐-, 헤테로방향족- 및 1-알키닐 유도체) 및 이들의 호변이성체(tautomers), 8-옥소-N ⁶ -메틸아데닌(8-oxo-N ⁶ -methyladenine), 7-디아자크산틴(7-diazaxanthine), 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 5-메틸우라실(5-methyluracil), 5-(1-프로피닐)우라실(5-(l-propynyl)uracil), 5-(1-프로피닐)시토신(5-(l-propynyl) cytosine) 및 4,4-에타노시토신(4,4-ethanocytosine) 등과 같은 천연 및 합성의 핵염기들로 변성될 수 있다. 적절한 염기들의 다른 예들에는 2-아미노피리딘(2-aminopyridine) 및 트리아진(triazines) 등과 같은 비-퓨리닐(non-purinyl) 및 비-피리미디닐(non-pyrimidinyl) 염기들이 포함된다.

당 성분(Sugar moieties)

본 출원에서 기술되는 핵산 내의 당 성분에는 임의의 변성이 없는 2'-하이드록실-펜토푸라노실 당 성분(2'-hydroxyl-pentofuranosyl sugar moiety)이 포함될 수 있다. 달리, 당 성분은 무엇보다도, 예를 들어, 유럽특허 제EP 0 586 520 Bl호 또는 동 제EP 0 618 925 Bl호에서 기술된 바와 같은 2'-디옥시-펜토푸라노실 당 성분(2'-deoxy-pentofuranosyl sugar moiety), D-리보오스(D-ribose), 헥소스(hexose), 2'-O-알킬(2'-0-alkyl)(2'-0-메틸 및 2'-0-에틸을 포함), 즉, 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-0-알릴, 2'-S-알킬, 2'-할로겐(2'-플루오로, 클로로 및 브로모를 포함), 2'-메톡시에톡시, 2'-0-메톡시에틸, 2'-0-2-메톡시에틸, 2'-알릴옥시(-OCH ₂ CH=CH ₂ ), 2'-프로파길(2'-propargyl), 2'-프로필, 에티닐, 프로페닐, CF, 시아노, 이미다졸, 카르복실레이트, 티오에이트, 탄소수 1 내지 10의 저급 알킬(C ₁ to C ₁₀ lower alkyl), 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬, OCF ₃ , OCN, 0-, S-, 또는 N-알킬; 0-, S 또는 N-알케닐; SOCH ₃ ; S0 ₂ CH ₃ ; ON0 ₂ ; N0 ₂ , N ₃ ; 헤테로자이클로알킬(heterozycloalkyl); 헤테로자이클로알카릴(heterozycloalkaryl); 아미노알킬아미노(aminoalkylamino); 폴리알킬아미노(polyalkylamino) 또는 치환된 실릴(substituted silyl) 등과 같은 상기 펜토푸라노실 당 부위의 2' 포지션에서의 변성 등과 같이 변성될 수 있다.

알킬기에는 직쇄 알킬기(straight-chain alkyl groups)(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등), 분지-쇄 알킬기(branched-chain alkyl groups)(이소프로필, 3차-부틸, 이소부틸 등), 사이클로알킬(알리사이클릭)기(cycloalkyl (alicyclic) groups)(사이클로프로필, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸), 알킬 치환 사이클로알킬기(alkyl substituted cycloalkyl groups) 및 사이클로알킬 치환 알킬기(cycloalkyl substituted alkyl groups) 들을 포함하여 포화 지방족기(saturated aliphatic groups)들이 포함된다. 특정의 구체예들에 있어서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그의 백본 내에 6개 또는 그 이하의 탄소원자수(예를 들면, 직쇄에 대하여는 탄소수 1 내지 6, 분지쇄에 대하여는 탄소수 3 내지 6) 그리고 보다 바람직하게는 4개 또는 그 이하의 탄소원자수를 갖는다. 유사하게, 바람직한 사이클로알킬은 그들의 고리 구조 내에 3 내지 8개의 탄소원자들을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 고리 구조 내에 5 또는 6개의 탄소들을 가질 수 있다. 용어 탄소수 1 내지 6(C ₁ -C ₆ )은 1 내지 6개의 탄소원자들을 포함하는 알킬기들이 포함된다. 상기 알킬기는 상기 탄화수소 백본의 수소를 하나 또는 그 이상의 탄소들로 대체하는 치환체들을 갖는 알킬 성분 등과 같은 치환된 알킬기로 치환될 수 있다. 이러한 치환체들에는, 예를 들면, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 인산, 포스포나토, 포스피나토, 시아노, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함하여), 아실아미노(알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도를 포함하여), 아미디노, 이미노, 설프하이드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 설페이트, 알킬설피닐, 설포나토, 설파모일, 설폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로사이클릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 성분들이 포함될 수 있다. 할로겐 치환 알콕시기들의 예들에는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 클로로메톡시, 디클로로메톡시, 트리클로로메톡시 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

일부 구체예들에 있어서, 펜타푸로노실 고리(pentafuronosyl ring)는 펜타푸로노실 고리의 C2'-C3'-결합을 결여하는 비환식 유도체(acycloc derivatives)로 치환될 수 있다. 예를 들면, 비환뉴클레오티드(acyclonucleotides)는 dNMPs 내에 정상적으로 존재하는 2'-디옥시리보푸라노실 당을 2-하이드록시에톡시메틸기로 치환될 수 있다.

할로겐에는 불소, 브롬, 염소, 요오드가 포함된다.

백본(backbone)

본 출원에서 기술되는 상기 핵산의 뉴클레오시드 서브유닛(nucleoside subunits)은 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond)에 의하여 서로 결합될 수 있다. 상기 포스포디에스테르 결합은 선택적으로 다른 연결(linkages)들로 치환될 수 있다. 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 티오포스페이트-D-리보오스 개체(thiophosphate-D-ribose entities), 트리에스테르(triester), 티오에이트(thioate), 2'-5' 가교 백본(2'-5' bridged backbone)(또한 5'-2'로도 언급될 수 있음), PACE, 3'-(또는 -5')디옥시-3'-(또는 -5')티오-포스포로티오에이트(3'-(or -5')deoxy-3'-(or -5')thio-phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로셀레네이트(phosphoroselenates), 3'-(또는 -5')디옥시 포스피네이트(3'-(or -5')deoxy phosphinates), 보라노 포스페이트(borano phosphates), 3'-(또는 -5')디옥시-3'-(또는 -5')아미노 포스포르아미데이트(3'-(or -5')deoxy-3'-(or -5')amino phosphoramidates), 하이드로겐 포스포네이트(hydrogen phosphonates), 포스포네이트(phosphonates), 보라노 포스페이트 에스테르(borano phosphate esters), 포스포르아미데이트(phosphoramidates), 알킬포스포트리에� �테르(alkylphosphotriesters), 포스포트리에스테르 포스포러스 연결(phosphotriester phosphorus linkages), 5'-에톡시포스포디에스테르(5'-ethoxyphosphodiester), P-알킬옥시포스포트리에스테르(P-alkyloxyphosphotriester), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 등과 같은 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르 변성 및 비포스포러스 함유 연결들, 예를 들면, 카보네이트(carbonate), 카바메이트(carbamate), 실릴(silyl), 설퍼(sulfur), 설포네이트(sulfonate), 설폰아미드(sulfonamide), 포름아세탈(formacetal), 티오포름아세틸(thioformacetyl), 옥심(oxime), 메틸렌이미노(methyleneimino), 메틸렌메틸이미노(methylenemethylimino), 메틸렌하이드라조(methylenehydrazo), 메틸렌디메틸하이드라조(methylenedimethylhydrazo) 및 메틸렌옥시메틸이미노(methyleneoxymethylimino) 연결들.

본 출원에서 기술되는 핵산분자는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid ; PNA) 백본을 포함할 수 있다. 상기 PNA 백본은 펩티드 결합에 의하여 결합되는 반복하는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위(N-(2-aminoethyl)-glycine units)들을 포함한다. 퓨린, 피리미딘, 천연 및 합성의 염기들 등과 같은 여러 염기들이 메틸렌카르보닐 결합(methylene carbonyl bonds)에 의하여 상기 골격에 결합된다.

말단 인산(Terminal Phosphates)

말단 인산기에서 변성들이 이루어질 수 있다. 예를 들면, (1) [3-3']-역전된 디옥시리보오스([3-3']-inverted deoxyribose); (2) 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide); (3) [5'-3']-3'-디옥시리보뉴클레오티드; (4) [5'-3']-리보뉴클레오티드; (5) [5'-3']-3'-0-메틸 리보뉴클레오티드; (6) 3'-글리세릴; (7) [3'-5']-3'-디옥시리보뉴클레오티드; (8) [3'-3']-디옥시리보뉴클레오티드; (9) [5'-2']-디옥시리보뉴클레오티드; 및 (10) [5-3']-디디옥시리보뉴클레오티드를 포함하여 핵산 시퀀스의 3'-말단을 안정화시키기 위하여 서로 다른 안정화 화학(stabilization chemistries)의 비-제한적인 예들이 사용될 수 있다. 예시적인 화학적으로 변성된 말단 포스페이트기들에는 이하에 나타낸 것들이 포함된다:

하나의 관점에 있어서, 구조 (A1)을 갖는, 대상체의 귀 내의 신경들의 신경보호에 사용하기 위한 이중-가닥 핵산 분자가 제공된다:

여기에서 N 및 N' 각각은 미변성되거나 또는 변성될 수 있는 뉴클레오티드이거나 또는 독특한 성분이고;

여기에서 (N)x 및 (N')y 각각은 각 연속적인 N 또는 N'가 공유결합에 의하여 N 또는 N'에 결합되고; 여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이고, 그러나 존재하는 경우, 상기 가닥의 3' 말단이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착되는 독립적으로 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고;

여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있고, 그러나 존재하는 경우, (N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착되는 캡핑 성분이고;

x 및 y 각각은 독립적으로 18 내지 40의 정수이고;

여기에서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 대하여 상보성을 갖고; 그리고 여기에서 (N)x는 표적 mRNA에 대한 안티센스 시퀀스를 포함하고, 여기에서 상기 표적 mRNA는 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3, 시퀀스 동정 번호: 4, 시퀀스 동정 번호: 5 내지 6 또는 시퀀스 동정 번호: 7 중의 임의의 하나에 규정되는 시퀀스를 포함한다.

일부 구체예들에 있어서, x = y이고 그리고 x 및 y 각각은 19, 20, 21, 22 또는 23이다. 여러 구체예들에 있어서, x = y = 19이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 및 센스 가닥들은 염기 짝지음에 의하여 듀플렉스를 형성한다. 일부 구체예들에 있어서, (N)x 및 (N')y들은 그의 전체로서 본 출원에 참조로 포함되는 국제특허공개공보 제WO 2008/050329호, 동 제WO 2009/044392호, 동 제WO 2008/106102호, 동 제WO 2009/001359호, 동 제WO/2009/090639호에서 제공되는 올리고뉴클레오티드 쌍들이다.

일부 구체예들에 있어서, x = y이고 그리고 x 및 y 각각은 19, 20, 21, 22 또는 23이다. 여러 구체예들에 있어서, x = y =19이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 및 센스 가닥들은 염기쌍에 의하여 듀플렉스를 형성한다.

하나의 구체예에 따르면, 하기에서 규정되는 구조 (A2)를 갖는, 대상체의 귀 내의 신경의 신경보호에 사용되기 위한 변성된 핵산 분자가 제공된다:

여기에서 N2, N 및 N' 각각은 독립적으로 미변성되거나 또는 변성된 뉴클레오티드 또는 독특한 성분이고;

여기에서 (N)x 및 (N')y 각각은 각 연속적인 N 또는 N'가 공유결합에 의하여 인접하는 N 또는 N'에 결합되고;

여기에서 x 및 y 각각은 독립적으로 17 내지 39의 정수이고;

여기에서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 대하여 상보성을 갖고 그리고 (N)x는 표적 mRNA 내의 연속적인 시퀀스에 대하여 상보성을 갖고;

여기에서 N1은 (N)x에 공유적으로 결합되고 그리고 상기 표적 mRNA에 대하여 미스매치이고, 여기에서 상기 표적 mRNA는 시퀀스 동정 번호: 1 내지 3, 시퀀스 동정 번호: 4, 시퀀스 동정 번호: 5 내지 6 또는 시퀀스 동정 번호: 7 중의 임의의 하나에 규정되고;

여기에서 N1은 우리딘, 변성된 우리딘, 리보티미딘, 변성된 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 변성된 디옥시리보티미딘, 리보아데닌, 변성된 리보아데닌, 디옥시리보아데닌 또는 변성된 디옥시리보아데닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분이고;

여기에서 N1 및 N2는 염기쌍을 형성하고;

여기에서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부재이고, 그러나 존재하는 경우, 상기 가닥의 3' 말단이 존재하는 경우에 상기 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착되는 독립적으로 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 성분들 또는 이들의 조합이고; 그리고

여기에서 z"는 존재하거나 또는 부재일 수 있고, 그러나 존재하는 경우, (N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착되는 캡핑 성분이다.

일부 구체예들에 있어서, 각 연속적인 N 또는 N'를 연결하는 상기 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다.

일부 구체예들에 있어서, Z 및 Z'는 부재이다. 다른 구체예들에 있어서, Z 또는 Z' 중의 하나는 존재하고 그리고 그의 전체로서 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개특허 제WO/2011/085056호에 기술된 바와 같은 비-뉴클레오티드 오버행 성분을 포함한다.

구조 A1의 특정의 구체예들에 있어서, x=y=19이고 그리고 Z는 적어도 하나의 C3 알킬 오버행을 포함한다. 구조 A2의 특정의 구체예들에 있어서, x=y=18이고 그리고 Z는 적어도 하나의 C3 알킬 오버행을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 C3-C3 오버행은 공유결합, 바람직하게는 포스포디에스테르 결합을 경유하여 (N)x 또는 (N')y의 3' 말단에 공유적으로 부착된다. 일부 구체예들에 있어서, 제1 C3 및 제2 C3 사이의 상기 결합은 포스포디에스테르 결합이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C3Pi이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C3Ps이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C30H(OH는 하이드록시임)이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C30H이다.

여러 구체예들에 있어서, 상기 알킬 성분은 말단 아미노, 또는 말단 인산기를 포함하는 C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬 또는 C6 알킬 성분을 포함하여 알킬 유도체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 알킬 성분은 C3 알킬 또는 C3 알킬 유도체 성분이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 C3 알킬 성분은 프로판올, 프로필인산(propylphosphate), 프로필포스포로티오에이트(propylphosphorothioate) 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 C3 알킬 성분은 포스포디에스테르 결합을 경유하여 (N')y의 3' 말단 및/또는 (N)x의 3' 말단에 공유적으로 연결된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 알킬 성분은 프로판올, 프로필인산, 프로필포스포로티오에이트를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서 Z 및 Z' 각각은 독립적으로 프로판올, 프로필인산 프로필포스포로티오에이트, 이들의 조합 또는 이들의 배량(multiples)들 특히 2 또는 3개의 공유적으로 결합된 프로판올, 프로필인산, 프로필포스포로티오에이트 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, Z 및 Z' 각각은 독립적으로 프로필인산, 프로필포스포로티오에이트, 프로필포스포-프로판올(propyl phospho-propanol); 프로필포스포-프로필포스포로티오에이트(propyl phospho-propyl phosphorothioate); 프로필포스포-프로필인산(propylphospho-propyl phosphate); (프로필인산)3((propyl phosphate)3), (프로필인산)2-프로판올((propyl phosphate)2-propanol), (프로필인산)2-프로필포스포로티오에이트((propyl phosphate)2-propyl phosphorothioate) 들로부터 선택된다. 임의의 프로판 또는 프로판올 공액화 성분(propane or propanol conjugated moiety)이 Z 또는 Z' 내에 포함될 수 있다.

3' 말단 비-뉴클레오티드 성분들의 예시적인 구조들은 다음과 같다:

일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드(상기 안티센스 가닥의 포지션 1)은 상기 표적 mRNA에 대하여 미스매치된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드는 변성된 리보아데노신 또는 변성된 리보우리딘이다.

일부 구체예들에 있어서, (N)x 및 (N')y 각각은 독립적으로 3' 및 5' 말단들에서 포스포릴화(phosphorylated) 또는 비-포스포릴화(non-phosphorylated)된다.

달리 표시되지 않는 한, 본 출원에서 기술되는 상기 구조들의 바람직한 구체예들에서, 각 연속하는 N 및 N' 사이의 상기 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다.

공유결합은 하나의 뉴클레오티드 단량체를 인접하는 뉴클레오티드 단량체에 연결하는 뉴클레오티드간 결합을 의미한다. 공유결합에는, 예를 들면, 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond), 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond), P-알콕시 결합(P-alkoxy bond), P-카르복시 결합(P-carboxy bond) 등이 포함된다. RNA 및 DNA의 통상의 뉴클레오시드간 결합(normal internucleoside linkage)은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 결합이다. 특정의 바람직한 구체예들에 있어서, 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다. 공유결합에는 그 중에서도 국제특허공개공보 제WO 2004/041924호에 기술된 것 등과 같은 비-포스포러스-함유 뉴클레오시드간 결합(non-phosphorous-containing internucleoside linkages)이 포함된다. 달리 표시되지 않는 한, 본 출원에서 논의되는 상기 구조들의 바람직한 구체예들에 있어서, 각 N 및 N' 사이의 상기 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다.

상기한 구조들 전체에 대하여, 일부 구체예들에 있어서, (N)x의 올리고뉴클레오티드 시퀀스는 (N')y의 올리고뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 완전히 상보적이다. 다른 구체예들에 있어서, (N)x 및 (N')y들은 실질적으로 상보적이다. 특정의 구체예들에 있어서, (N)x는 표적 mRNA 내의 18 내지 40개의 연속적인 뉴클레오티드들에 대하여 완전히 상보적이다. 다른 구체예들에 있어서, (N)x는 표적 mRNA 내의 18 내지 40개의 연속적인 뉴클레오티드들에 대하여 실질적으로 상보적이다.

일부 구체예들에 있어서, (N)x나 (N')y의 어느 것도 3' 말단 및 5' 말단들에서 포스포릴화되지 않는다. 다른 구체예들에 있어서, (N)x 및 (N')y 중의 어느 하나 또는 둘 다는 3' 말단들에서 포스포릴화된다(3' Pi). 또 다른 구체예에 있어서, (N)x 및 (N')y 중의 어느 하나 또는 둘 다는 비-분해성 인산기들(non-cleavable phosphate groups)을 갖는 3' 말단들에서 포스포릴화된다. 또 다른 구체예에 있어서, (N)x 및 (N')y 중의 어느 하나 또는 둘 다는 분해성(cleavable) 또는 비-분해성 인산기들을 사용하여 2' 말단들에서 포스포릴화된다. 또한, 본 발명의 상기 억제 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 간극(gaps) 및/또는 하나 또는 그 이상의 틈(nicks) 및/또는 하나 또는 그 이상의 미스매치들을 포함할 수 있다. 이론에 구애됨을 희망함이 없이, 간극, 틈 및 미스매치는 상기 핵산/siRNA을 부분적으로 불안정화(destabilizing)하는 잇점을 가져, 다이서(DICER), 드로사(DROSHA) 또는 RISC 등과 같은 내인성 세포 조직(endogenous cellular machinery)에 의해 그의 억제 구성성분들로 보다 쉽게 가공될 수 있도록 할 수 있다.

이중-가닥 RNA 화합물의 합성

본 발명의 약제학적 조성물들의 제조에 유용한 상기 이중-가닥 RNA 화합물들은 리보핵산(또는 디옥시리보핵산) 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 당해 기술분야에서 잘 알려진 임의의 방법들로 합성된다. 이러한 합성은, 다른 무엇보다도, 문헌 Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1992; 48:2223-2311 ; Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 및 Caruthers, et. al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313에서 기술되고; 티오에이트의 합성은, 다른 무엇보다도, 문헌 Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402에 기술되고, RNA 분자의 합성은 문헌 Sproat, in Humana Press 2005 edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31에 기술되고 그리고 개개 하향흐름(downstream) 과정들은, 다른 무엇보다도, 문헌 Pingoud et al., in IRL Press 1989 edited by Oliver RWA; Kap. 7: 183-208에 기술된다.

다른 합성 절차들이 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 Usman et al, 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe et al, 1990, NAR., 18, 5433; Wincott et al, 1995, NAR. 23, 2677-2684; 및 Wincott et al, 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59에 기술된 절차들이 5'-말단에서의 디메톡시트리틸(dimethoxytrityl) 및 3'-말단에서의 포스포르아미다이트(phosphoramidites) 등과 같은 통상의 핵산 보호(common nucleic acid protecting) 및 짝지음기(coupling groups)들을 이용할 수 있다. 상기 변성된(예를 들면, 2'-O-메틸화) 뉴클레오티드 및 미변성된 뉴클레오티드들이 원하는 대로 포함된다.

본 발명의 상기 약제학적 조성물의 제조에 유용한 상기 올리고뉴클레오티드들이 개별적으로 합성되고 그리고 합성-후에(post-synthetically), 예를 들면, 결찰(ligation)에 의하여(문헌 Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., Patent Publication No. WO 93/23569; Shabarova et al, 1991, NAR 19, 4247; Bellon et al, 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204) 또는 합성 및/또는 탈보호화(deprotection)에 후속하여 잡종화(hybridization)에 의하여 함께 결합될 수 있다.

상용적으로 획득가능한 기계(그 중에서도, 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems)로부터 획득가능한)가 사용될 수 있고; 상기 올리고뉴클레오티드들이 본 출원에서 기술되는 상기 시퀀스들에 따라 제조된다. 화학적으로 합성된 단편(fragments)들의 오버래핑쌍(overlapping pairs)들이 당해 기술분야에서 공지된 방법들을 활용하여 결찰될 수 있다(예를 들면, 미합중국 특허 제6,121,426호를 참조하시오). 상기 가닥들이 개별적으로 합성되고 그리고 계속해서 관(tube) 내에서 서로 어닐링(annealed)된다. 계속해서, 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 상기 이중-가닥 siRNA들이 어닐링되지 않은(예를 들면, 이들 중의 하나의 과량으로 인하여) 상기 단일-가닥 올리고뉴클레오티드들로부터 분리된다. 본 발명의 상기 siRNA들 또는 siRNA 단편들의 관계에서, 둘 또는 그 이상의 이러한 시퀀스들이 본 발명에서 사용되기 위하여 합성되고 그리고 서로 결합될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제조에서 유용한 상기 이중-가닥 RNA 화합물들은 또한 예를 들면 미합중국 공개특허 제US 2004/0019001호에 기술된 바와 같은 탠덤 합성 방법론(tandem synthesis methodology)을 통하여 합성될 수 있으며, 여기에서 두 siRNA 가닥들이 단일의 인접하는 올리고뉴클레오티드 단편 또는 개열가능한 연결자로 분리된 가닥으로서 합성되며 이는 후속하여 개열되어 상기 siRNA 듀플렉스의 잡종화 및 정제를 허용하는 별개의 siRNA 단편들 또는 가닥들을 제공한다. 상기 연결자는 폴리뉴클레오티드 연결자 또는 비-뉴클레오티드 연결자로부터 선택된다.

본 발명의 상기 조성물들은 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티들을 포함하고, 이들 올리고뉴클레오티드(oligos)들은 별개로 합성되고 그리고 상기한 상세한 과정들에 따라 서로 혼합되거나 또는 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 서로 합성-후 결합되거나 또는 서로 합성될 수 있다.

약제학적 조성물(Pharmaceutical Compositions)

비록 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 화합물들이 원료 화합물(raw chemical)로서 투여되는 것이 가능하나, 이들을 약제학적 조성물로서 제공하는 것이 바람직하다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 올리고리보뉴클레오티드 화합물들이 내인성 세포내 복합체(endogenous intracellular complexes)들로 생산된다.

본 출원에서 기술되는 약제학적 조성물들은 임의의 화학적으로 변성되거나 또는 미-변성된 이중-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드 화합물을 사용하여 제조된다. 다이서 기질(Dicer substrates) 또는 비대칭 siRNA인 siRNA가 본 발명에 대하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 이중-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드 화합물들은 임의의 약제학적으로 수용가능한 염, 에스테르 또는 이러한 에스테르의 염 또는 인간을 포함하여 포유동물에의 투여에 의하여 귀의 질환, 장애 및 손상을 치료할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 용어 "약제학적으로 수용가능한 염(pharmaceutically acceptable salts)"은 생리학적으로 그리고 약제학적으로 수용가능한 염, 즉 부모 화합물(parent compound)의 소정의 생물학적 활성을 보유하고 그리고 그에 원치 않는 독성 효과(toxicological effects)를 부여하지 않는 염을 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 출원에서 기술된 구조들에서 규정된 하기의 변성들 중의 하나에 따라 화학적으로 및 또는 구조적으로 변성된 이중-가닥 RNA 화합물들을 이용하거나 또는 탠덤 siRNA(tandem siRNA) 또는 성형RNA(RNAstar)로서 제조된다(국제공개특허 공보 제WO 2007/091269호를 참조하시오). 특정의 바람직한 분자들은 CASP2, NOX3, CAPNS1 또는 RHOA를 표적하는 화학적으로 합성되고 그리고 변성된 dsRNA 분자들이다. 특정의 바람직한 분자는 CASP2_4 올리고뉴클레오티드 시퀀스를 활용하는 dsRNA이다.

본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 억제 올리고뉴클레오티드 화합물; 투과도촉진제 및 약제학적으로 수용가능한 비히클 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 조성물은 둘 또는 그 이상의 서로 다른 올리고뉴클레오티드들/siRNA 화합물들의 혼합물을 포함한다.

상기 화합물들은 지주막하(intrathecal) 및 주입 기술(infusion techniques)들과 마찬가지로, 경구적으로(orally), 피하로(subcutaneously) 또는 정맥내로(intravenous), 동맥내로(intraarterial), 근육내로(intramuscular), 복강내로(intraperitoneally), 경비로(intranasal), 경고막으로(transtympanic)를 포함하여 비경구적으로(parenterally) 투여될 수 있다. 상기 화합물들의 이식물(implants)들이 또한 유용하다. 바람직한 투여 모드(administration mode)는 경고막이다. 주사를 위한 액체 형태들이 제조될 수 있으며, 상기 용어는 피하(subcutaneous), 경피(transdermal), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 지주막하(intrathecal), 경고막(transtympanic) 주사 및 다른 비경구 투여의 경로들을 포함한다. 액체 조성물들에는 유기 공-용매와 함께 또는 없이 수성 용액(aqueous solutions), 수성 또는 유성 현탁액(suspensions), 유사한 약제학적 비히클들과 마찬가지로 가식성의 오일(edible oils)들로의 에멀젼(emulsions)들이 포함된다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 투여는 정맥내 투여가 포함된다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 투여는 국소적 투여, 특히 외이도에의 국소적 투여, 고막에의 국소적 투여 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 화합물들은 점이액으로서 고막에 적용된다. 일부 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 분자들은 경고막 주사로 또는 점이액으로 투여된다.

여러 구체예들, 특히 본 발명의 약제학적 조성물들이 국소적으로 투여되는 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경피흡수촉진제로도 알려진 투과도촉진제를 더 포함한다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 투과도촉진제는 내이의 질환, 장애 또는 손상, 바람직하게는 메니에르병으로 고통받거나 또는 그 위험이 있는 대상체의 귀 내의 피부 및/또는 고막을 통한 치료학적 올리고뉴클레오티드의 투과를 촉진하는 임의의 화합물 또는 둘 또는 그 이상의 화합물들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 경피흡수/투과도촉진제는, 이에 제한됨이 없이, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol ; PEG), 글리세롤(glycerol ; 글리세린(glycerin)), 말티톨(maltitol), 소르비톨(sorbitol) 등; 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(diethylene glycol monoethyl ether), 아존(azone), 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride ; ADBAC), 염화세틸페리디움(cetylperidium chloride), 브롬화세틸메틸암모늄(cetylmethylammonium bromide), 황산덱스트란(dextran sulfate), 라우르산(lauric acid), 멘톨(menthol), 메톡시살리실레이트(methoxysalicylate), 올레산(oleic acid), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 소듐글리콜레이트(sodium glycholate), 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate), 소듐살리실레이트(sodium salicylate), 소듐타우로콜레이트(sodium taurocholate), 소듐타우로디옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate), 설폭사이드(sulfoxides), 소듐디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 소듐글리코디옥시콜레이트(sodium glycodeoxycholate), 소듐타우로콜레이트(sodium taurocholate) 및 소듐라우� �설페이트(sodium lauryl sulfate) 등과 같은 계면활성제(surfactants), 라우레쓰-9(laureth-9), 염화세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride) 및 폴리옥시에틸렌모도알킬에테르(polyoxyethylene monoalkyl ethers), 소듐살리실레이트(sodium salicylate) 및 메톡시살리실레이트(methoxy salicylate) 등과 같은 벤조산(benzoic acids), 라우르산, 올레산, 운데카논산(undecanoic acid) 및 메틸올레이트(methyl oleate) 등과 같은 지방산, 옥타놀(octanol) 및 노나놀(nonanol) 등과 같은 지방알코올(fatty alcohols), 라우로카프람(laurocapram), 사이클로덱스트린(cyclodextrins), 티몰(thymol), 리모넨(limonene), 요소(urea), 키토산(chitosan) 및 다른 천연 및 합성 중합체 들로부터 선택된다.

특정의 구체예들에 있어서, 상기 투과도촉진제는 폴리올이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리올과의 혼합물(admixture)이다. 본 발명의 용액들 내로의 내포(inclusion)를 위한 적절한 폴리올에는 소르비톨, 만니톨 또는 자일리톨, 폴리에틸렌글리콜 및 이들의 유도체들 등과 같은 글리세롤 및 당알코올(sugar alcohols)들이 포함된다.

일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 약제학적 조성물들에는 또한 하나 또는 그 이상의 완충제(buffering agent), 보존제(preservative), 계면활성제, 담체, 용매, 희석제(diluent), 공-용매, 점도 누적/향상제(viscosity building/enhancing agent), 부형제, 보조제 및 비히클 등과 같은, 이들로 제한되지 않는, 하나 또는 그 이상의 여러 다른 약제학적으로 수용가능한 성분들이 포함된다. 특정의 구체예들에 있어서, 염화벤잘코늄 및 에데트산나트륨(disodium edetate ; EDTA) 등과 같은 승인된 보존제들이 본 발명의 상기 조성물들 내에 유효한 항생작용(antimicrobial action)에 충분한 농도인, 상기 조성물의 총 중량을 기준하여 약 0.0001 내지 0.1%의 농도로 포함된다.

하나의 구체예에 따르면, 상기 폴리올은 글리세롤이다. 여러 구체예들에 있어서, 글리세롤은 상기 약제학적 조성물의 약 0.1용적% 내지 약 35용적%; 약 1용적% 내지 약 30용적%; 약 5용적% 내지 약 25용적%, 바람직하게는 약 10용적% 내지 약 20용적%의 최종 농도로 존재한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물 내의 글리세롤의 최종 농도는 상기 약제학적 조성물의 2용적%, 2.5용적%, 5용적%, 10용적%, 12.5용적%, 15용적%, 17.5용적%, 20용적%, 22.5용적%, 25용적%, 27.5용적% 또는 약 30용적%이다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 약제학적 조성물 내의 글리세롤의 최종 농도는 상기 약제학적 조성물의 약 2중량%이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 약제학적 조성물 내의 글리세롤의 최종 농도는 상기 약제학적 조성물의 약 5용적% 또는 약 10용적%이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약제학적 조성물 내의 글리세롤의 최종 농도는 상기 약제학적 조성물의 약 20용적%이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 적용에 앞서 대략 상기 대상체의 체온으로 되며, 이는 약 30℃ 내지 약 38℃이다. 귀의 장애들을 치료하기 위한 특정의 방법들이 그의 전체로서 본 출원에 참고로 포함되는 국제특허공개공보 제WO 2011/072091호에 기술된다.

여러 구체예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 조성물들은 임의의 적절한 투여의 모드(mode)에 의한 국소 투여를 위하여 제형화된다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물들의 적절한 투여의 모드들에는 적하(instillation)(예를 들면, 점이용액(ear drop solution)의), 주사(주사가능한 제형의), 도포(deposition)(고체 또는 반고체 제형, 예를 들면, 연고, 겔의), 주입 또는 분무 등과 같은 침습적 및 비침습적인 투여의 모드들이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 조성물들은 국소적으로 적용된다. 상기 조성물을 내이 내에 위치시키기 위한 또는 상기 조성물을 주사하기 위한(예를 들면, 고막을 통항) 임의의 유효한 기구(instrument)를 사용하여 임의의 수단(예를 들면, 점적(drops), 분무(spray))에 의하여 전달(delivery)이 유효하게 될 수 있다.

본 발명은 또한 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 제제 기술(formulation techniques)들에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 방법은 본 출원에서 기술되는 바와 같이 조성물이 연장된 화학적 및/또는 물리적 안정성을 갖도록 치료학적으로 유효한 양의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물, 하나 또는 그 이상의 투과도촉진제 및 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체 또는 이들의 혼합물들을 임의의 적절한 순서로 결합하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위한 상기 방법은 치료학적으로 유효한 양의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물, 하나 또는 그 이상의 투과도촉진제, 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체 또는 이들의 혼합물 및 항균제(antibacterial agent) 및/또는 보존제를 임의의 적절한 순서로 결합하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 이중-가닥 RNA 화합물의 용해를 보조하기 위한 약물학적으로 수용가능한(pharmacologically acceptable) 계면활성제를 포함한다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 출원에서 기술되는 바와 같이 조성물이 조합요법(combination therapies)에서 유용하게 되도록 별도의 치료학적으로 활성인 약제(therapeutically active agent)를 더 포함한다. 본 발명의 일부 구체예들에 있어서, 별도의 약제학적으로 활성인 약제는 비-스테로이드성 항염증제, 코르티코스테로이드(corticosteroids), 항진균제(antifungal), 항생물질(antibiotics) 등으로부터 선택되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

다른 관점에 있어서, 본 발명은 메니에르병을 치료하기 위한, 이명(tinnitus), 내림프수종, 간헐적 현기증 및 청력 손실들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 증후군들을 약화시키기 위한; 진행성 청력 손실을 약화시키기 위한, 나선신경절 세포들의 신경보호를 제공하기 위한, 전정신경절 세포들의 신경보호를 제공하기 위한, 나선신경절 세포들의 세포자멸사를 방지하기 위한 그리고 전정신경절 세포들의 세포자멸사를 방지하기 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제공한다.

본 출원에서 기술되는 상기 분자들의 개선된 전달을 위한 조성물들은 표적 분자에의 이중-가닥 RNA 분자들의 공액화(conjugation)를 포함한다. 상기 공액화는 대개는 침묵화 활성(silencing activity)을 방해하지 않도록 하여 상기 표적하는 분자의 상기 이중-가닥 RNA의 상기 센스 가닥에의 공유적인 부착을 통하여 형성된다. 본 발명에서 유용한 잠재적인 표적하는 분자들에는 예를 들면 콜레스테롤 등과 같은 천연의 화합물들과 마찬가지로 단백질, 펩티드 및 압타머(aptamers)들이 포함된다. 항체들을 표적하기 위해서는, 프로타민 융합 단백질(protamine fusion protein)에의 공액화가 사용된다(예를 들면, 문헌 Song et al., Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Biotechnol. 2005. 23(6):709-17을 참조하시오).

환자에 상기 핵산 분자를 투여하거나 또는 분배하여 CASP2, NOX3, CAPNS1의 발현을 감소시키기 위하여 본 출원에서 제공되는 바와 같은 핵산 분자(예를 들면, siNA 분자)를 포함하는 킷트, 용기(containers) 및 제형(formulations)들이 또한 제공된다. 하나의 킷트는 적어도 하나의 용기 및 적어도 하나의 라벨(label)을 포함할 수 있다. 적절한 용기들에는, 예를 들면, 병, 바이알(vials), 주사기 및 시험관들이 포함된다. 상기 용기들은 유리, 금속 또는 플라스틱 등과 같은 다양한 재료들로 형성될 수 있다. 킷트는 연관된 지시(indications) 및/또는 안내(directions)들을 더 포함할 수 있고; 이러한 목적에 사용되기 위한 시약들 및 다른 조성물들 또는 도구(tools)들이 또한 포함될 수 있다.

상기 용기는 달리 하나의 상태를 치료(treating)하거나, 진단(diagnosis)하거나, 예측(prognosing)하거나 또는 예방(prophylaxing)하기에 유효한 조성물을 보유할 수 있고 그리고 멸균진입구(sterile access port)(예를 들면, 상기 용기는 피하주사바늘(hypodermic injection needle)에 의하여 천공될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥 내로 들어가는 용액을 담은 백(intravenous solution bag) 또는 바이알이 될 수 있음))를 가질 수 있다. 상기 조성물 내의 상기 활성제들은 CASP2, NOX3, CAPNS1에 특이적으로 결합하거나 및/또는 이들의 기능을 매개할 수 있는 핵산 분자가 될 수 있다.

하나의 킷트는 인산-완충 염수(phosphate-buffered saline), 링거액(Ringer's solution) 및/또는 덱스트로스 용액(dextrose solution) 등과 같은 약제학적으로-수용가능한 완충제를 포함하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 여과재(filters), 교반기(stirrers), 바늘, 주사기 및/또는 사용을 위한 지시 및/또는 안내가 구비된 포장 삽입물(package inserts)들을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료들을 더 포함할 수 있다.

사용에 앞서 상기 핵산 분자들이 그 안에 포장되는 단위 용량 앰플(units dosage ampoules) 또는 다회용량 용기(multidose containers)들은 기밀밀봉된 용기(hermetically sealed container)를 포함할 수 있으며, 상기 앰플 또는 용기는 그의 약제학적 유효용량(effective dose) 또는 유효용량의 배량들에 적절한 dsRNA의 양 또는 dsRNA를 포함하는 용액을 포함한다. 상기 dsRNA는 멸균 제형으로 포장되고, 그리고 상기 기밀밀봉된 용기는 사용될 때까지 상기 제형의 멸균상태(sterility)를 보존하도록 설계된다.

세포 면역 반응 요소(cellular immune response element)를 인코딩하는 시퀀스 또는 그의 단편을 포함하는 dsRNA가 그 안에 포함되는 상기 용기는 표지된 포장을 포함할 수 있고, 그리고 상기 라벨은 정부기관(governmental agency), 예를 들면, 미국식품의약국(Food and Drug Administration)에 의해 사전처방된 형태의 안내문(notice)을 포함할 수 있으며, 상기 안내문은 그 안에 인간 투여를 위한 상기 폴리뉴클레오티드 물질의 제조, 사용 또는 판매에 대한 연방법 하의 기관에 의한 승인을 반영한다.

연방법은 인간의 치료법에서의 약제학적 조성물의 사용이 연방정부의 기관에 의해 승인되어야 할 것을 요구하고 있다. 미합중국 내에서, 시행은 미국식품의약국의 책임이며, 21 USC § 301-392에서 상술되는 이러한 승인을 확보하기 위한 적절한 법규들을 발행한다. 동물의 조직으로부터 만들어지는 제품들을 포함하여 생물학적 물질에 대한 규제는 42 USC § 262 하에 제공된다. 대부분의 국가들에 의해 유사한 승인이 요구된다. 규제들은 나라마다 변할 수 있으나, 그러나 개개 절차들은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지되어 있으며, 따라서 바람직하게는 본 출원에서 제공되는 상기 조성물 및 방법들은 규제들을 따른다.

투여

본 출원에서 기술되는 상기 방법들에는 양호한 의료행위(medical practice)에 따라, 개개 환자의 임상적 상태, 치료되어야 할 질환, 투여의 위치와 방법, 투여의 계획, 환자 연령, 성별, 체중 및 의사(medical practitioners)들에게 알려진 다른 매개변수들를 고려하여, 분자들의 투여 및 복용량(dosing)이 포함된다.

"치료학적으로 유효한 용량(therapeutically effective dose)" 또는 "치료학적으로 유효한 양"은 개선된 생존율(survival rate), 보다 신속한 회복(recovery), 질환의 억제된 진행 또는 증후군 및 당해 기술분야에서 숙련된 자들에 의한 적절한 결정 방법들로 선택되는 바와 같은 다른 지표(indicators)들의 개선 또는 제거들을 포함하여 대상체 또는 그의 생리계(physiological systems)들에서의 개선을 달성하기에 유효한 약제학적 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다.

따라서 본 출원에서의 목적들을 위한 "치료학적으로 유효한 용량" 또는 "치료학적으로 유효한 양"은 당해 기술분야에서 공지된 고려사항들에 의해 결정된다. 상기 용량은 개선된 생존율 또는 보다 신속한 회복 또는 증후군 및 당해 기술분야에서 숙련된 자들에 의하여 적절하게 측정되는 바와 같은 다른 지표들의 개선 또는 제거들을 포함하나 이들에 제한되지 않는 개선을 달성하는 데 유효하여야 한다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 단일 용량(single dose) 또는 다회 용량(multiple doses)으로 투여된다.

그 중에서도, 용량은 상기 올리고뉴클레오티드의 활성, 징후(indication) 및 상기 장애의 중증도(severity)에 의해 결정되고 그리고 약제학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체 내에서 약 0.1ng 내지 약 10㎎, 약 1ng 내지 약 1㎎, 또는 약 10ng 내지 약 1㎎의 총 올리고뉴클레오티드의 용량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 조성물 내의 이중-가닥 RNA 화합물의 농도는 0.1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖의 사이, 바람직하게는 1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖ 사이, 그리고 보다 바람직하게는 5㎎/㎖ 내지 20㎎/㎖ 사이이다.

일부 구체예들에 있어서, 인간에 대한 올리고뉴클레오티드 화합물의 활성 용량(active dose)은 1 내지 4주 사이 또는 그 이상의 기간 동안 또는 심지어 대상체의 인생 동안에 1일 1회 용량 또는 1일 2 또는 3회 또는 그 이상 투여되는 단일 용량 또는 다회 용량들의 요법(regimen)에서 1일 lng/㎏체중 내지 약 20-100㎎/㎏체중, 바람직하게는 1일 약 0.01㎎ 내지 약 2-10㎎/㎏체중의 범위 이내이다.

본 발명의 상기 약제학적 조성물은 임의의 적절한 투여의 모드로 상기 대상체에 투여된다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 조성물들의 적절한 투여의 모드에는 적하(점이액의), 주사, 도포 또는 귀 내로의 분무 등과 같은 침습적 및 비-침습적 투여의 모드가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 조성물들은 점이액으로서 외이도 내로 국소적으로 투여되거나 또는 캐뉼라(cannula)를 통하여 상기 외이도 내로 주입되거나 또는 고막을 통하여 주사(경고막 주사)된다. 많은 경우들에 있어서, 투여의 모드는 개개 대상체의 다른 임상적 상태들과 마찬가지로 감염된 귀, 치료되어야 할 질환 또는 상태 또는 손상의 속성 및 중증도를 포함하여 많은 매개변수들에 의존적일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

여러 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 약제학적 조성물들은 보호 또는 치료 효과를 제공하기에 유효한 양으로 전달된다. 보호 또는 치료 효과들의 예들에는 표적 단백질 발현의 억제 또는 적어도 하나의 표적 유전자의 넉다운(knockdown)이 포함된다. 특정의 구체예들에 있어서, 적어도 하나의 표적 유전자의 발현을 억제하는 것은 상기 세포 및/또는 조직들에 신경보호 특성들을 부여한다.

따라서, 본 발명의 상기 약제학적 조성물들은 활성성분(active ingredient(s))들(즉, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 화합물)이 본 출원에서 기술되는 상기 질환들 및 상태들을 방지하거나, 억제하거나, 개선하거나(ameliorate) 또는 달리 치료하는 것을 허용하는 임의의 형태로 투여된다. 비-제한적인 실시예로서, 상기 약제학적 조성물들은 크림(cream), 폼(foam), 페이스트(paste), 연고, 에멀젼, 액체 용액(liquid solution), 겔, 스프레이(spray), 현탁액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 미소구(microspheres), 마이크로캡슐(microcapsules), 나노구(nanospheres), 나노입자(nanoparticles), 지질소포(lipid vesicles), 리포좀(liposomes), 고분자성 소포(polymeric vesicles), 패치(patches), 생물학적 삽입물(biological inserts), 에어로졸(aerosol), 고분자성 또는 고분자-형 재료(polymeric or polymeric-like material) 및/또는 제거가능한(removable) 및/또는 흡수가능한(absorbable), 용해가능한(dissolvable) 및/또는 분해가능한(degradable) 이식물(implant) 등과 같은 공지되거나 신규한 약제학적 전달 시스템 또는 장치에 적절한 임의의 형태를 포함하여 당해 기술분야에서 공지된 임의의 다른 형태들로 제형화될 수 있다. 멸균 액체 약제학적 조성물, 용액 또는 현탁액들이, 예를 들면, 유리체내(intravitreal) 또는 경고막 주사에 의하여 침습적으로; 또는, 예를 들면, 점이액, 점이폼(ear foam), 스프레이, 겔, 크림 또는 연고에 의하여 국소적으로 활용될 수 있다. 상기 액체 조성물들에는 유기 공-용매를 수반하거나 수반함이 없이 수성 용액, 수성 또는 유성 현탁액, 식용가능한 오일과 마찬가지로 유사한 약제학적 비히클들로의 에멀젼들이 포함된다.

귀 질환 및 장애(Ear Diseases and Disorders)

대상체의 귀 내의 신경들의 신경보호에 유용한 방법들 및 킷트들이 본 출원에서 기술된다. 상기 방법들 및 킷트들은 나선신경절의 신경보호를 제공하고 그에 의하여 진행성 청력 손실 및 이명을 포함하여 와우각 기능을 약화시키거나 또는 방지하는 데 유용하다. 뉴런들은 외상(trauma), 허혈, 화학약품(예를 들면, 이독소(ototoxin)), 감염원, 면역반응 또는 영양상의 불균형에 의해 야기되는 손상(injury or damage)을포함하여 여러 손상(insults)들로부터 보호될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 대상체의 귀에 CASP2 유전자, NOX3 유전자, CAPNS1 유전자 또는 RHOA 유전자의 발현을 하향조절하고 그에 의하여 상기 대상체의 귀 내의 나선신경절 세포들 및/또는 전정신경절 세포들에 대하여 신경보호를 제공하는 일정 용량의 이중-가닥 RNA(dsRNA) 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 청각계(auditory system) 및/또는 전정계의 병리학적 비정상(pathological abnormalities)들 또는 조직들의 변화들과 연관되는 질환으로 고통받는 대상체의 나선신경절 및/또는 전정신경절 내의 뉴런 세포들의 손실을 감소시키는 방법이 본 출원에서 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 투여는 신경세포들의 대조 개체군(control population)에 비하여 신경세포들의 개체군 중의 신경세포들의 사멸에서 적어도 10% 감소의 결과를 가져온다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 비정상들 또는 변화들은 특히 청각기관의 조직들의 병리학적 비정상들/변화들 및/또는 전정기관들의 조직들의 병리학적 비정상들/변화들과 연관되며, 이러한 변화들은, 예를 들면, 신경퇴화(neuronal degradation) 또는 신경세포 사멸이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 상기 CASP2 유전자를 하향조절하고 그리고 시퀀스 동정 번호: 8에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 9에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 안티센스 가닥, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 24 또는 26에 규정되는 센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 25 또는 27에 규정되는 안티센스 가닥을 포함한다.

일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 상기 방법은 대상체의 귀에 CASP2 유전자, NOX3 유전자, CAPNS1 유전자 또는 RHOA 유전자의 발현을 하향조절하고 그에 의하여 상기 대상체의 귀 내의 나선신경절 세포들 및/또는 전정신경절 세포들에 대하여 신경보호를 제공하는 일정 용량의 이중-가닥 RNA(dsRNA) 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내의 청각계 및/또는 전정계의 조직들에서의 병리학적 비정상/변화들과 연관되는 귀의 질환의 영향들을 방지하거나, 치료하거나 또는 완화하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 투여는 신경세포들의 대조 개체군에 비하여 신경세포들의 개체군 중의 신경세포들의 사멸에서 적어도 10% 감소의 결과를 가져온다. 여러 구체예들에 있어서, 상기 비정상들 또는 변화들은 특히 청각기관의 조직들의 병리학적 비정상들/변화들 및/또는 전정기관들의 조직들의 병리학적 비정상들/변화들과 연관되며, 이러한 변화들은, 예를 들면, 신경퇴화 또는 신경세포 사멸이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 상기 CASP2 유전자를 하향조절하고 그리고 시퀀스 동정 번호: 8에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 9에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 안티센스 가닥, 바람직하게는 시퀀스 동정 번호: 24 또는 26에 규정되는 센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 25 또는 27에 규정되는 안티센스 가닥을 포함한다.

본 출원에서 기술되는 문맥에서의 "이독소(ototoxin)"에 대하여는 그의 화학적 작용을 통하여 청력과 연관되는 여러 신경계의 소리 수용체(sound receptors)들의 성분의 활성을 손상시키거나(injures), 약화시키거나(impairs) 또는 억제하고(inhibits) 이들은 차례로 청력(및/또는 균형)을 약화시키는 물질을 의미한다. 이독소들에는 항종양제(antineoplastic agents), 살리실산염(salicylates), 고리 이뇨제(loop-diuretics), 퀴닌(quinines) 및 아미노글리코시드 항생제(aminoglycoside antibiotics)를 포함하여 치료제들, 음식 또는 의약들 중의 오염물들 및 환경 또는 산업 오염물들이 포함된다.

따라서 하나의 관점에 있어서, 본 출원에서 기술되는 바와 같은 dsRNA를 대상체에 투여하는 것에 의하여 상기 대상체의 귀 내의 뉴런에 대한 신경보호를 제공하고 그에 의하여 청력 손상, 장애 또는 불균형, 예를 들면, 이독소-유발 청력 손상, 장애 또는 불균형을 방지하거나, 감소시키거나 또는 치료하기 위한 방법들 및 킷트들이 제공된다.

이독성의 아미노글리코시드 항생제들에는 네오마이신(neomycin), 파로모마이신(paromomycin), 리보스타마이신(ribostamycin), 리비도마이신(lividomycin), 가나마이신(kanamycin), 아미카신(amikacin), 토브라마이신(tobramycin), 비오마이신(viomycin), 겐타마이신(gentamicin), 시소마이신(sisomicin), 네틸마이신(netilmicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 디베카신(dibekacin), 포르티마이신(fortimicin) 및 디하이드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin) 또는 이들의 조합들이 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정의 항생제들에는 심각한 독성, 특히 이독성 및 신장독성(nephrotoxicity)을 갖는 것으로 알려진 네오마이신 B(neomycin B), 가나마이신 A(kanamycin A), 가나마이신 B(kanamycin B), 겐타마이신 C1(gentamicin C1), 겐타마이신 C1a(gentamicin C1a) 및 겐타마이신 C2(gentamicin C2) 등이 포함되며, 이들은 이러한 항생제들의 유용성을 감소시킨다.

이독성은 또한 항암제에 대한 심각한 용량 제한적 부작용이다. 이독성의 항종양제들에는 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 시스플라틴(cisplatin) 및 시스플라스틴-형 화합물들 및 택솔(taxol) 및 택솔-형 화합물들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 시스플라틴-형 화합물들에는 카보플라틴(carboplatin)(파라플라틴?(Paraplatin?), 테트라플라틴(tetraplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 아로플라틴(aroplatin) 및 트랜스플라틴(transplatin) 들이 포함되며 그 중에서도 백금 기반 화학요법제(platinum based chemotherapeutics)들이다.

공지된 이독성 부작용을 갖는 이뇨제들, 특히 "고리" 이뇨제들에는 푸로세미드(furosemide), 에타크릴산(ethacrylic acid) 및 머큐리알스(mercurials)들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

이독성 퀴는들에는 전형적으로는 말라리아의 치료에 사용되는 퀴닌의 합성 치환체들이 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 청력 장애는 실데나필(sildenafil: 비아그라?(Viagra?)), 바데나필(vardenafil: 레비트라?(Levitra?)) 및 타다라필(tadalafil: 시알리스(Cialis))를 포함하여 5형 포스포디에스테라아제(type 5 phosphodiesterase: PDE-5)의 억제제들의 부작용이다.

아스피린(aspirin) 등과 같은 살리실산염들이 이명("귀 안에서의 울림(ringing)") 및 일시 청력 손실을 포함하여 이독성 부작용들을 갖는다. 더욱이, 상기 약물이 장시간(prolonged time) 동안 고용량(high doses)들로 사용되는 경우, 청력 손상이 지속성이고 그리고 비가역적이 될 수 있다.

뉴런들이 기계적 또는 물리적 외상에 의하여 손상되는 귀의 뉴런들에 대한 신경보호를 제공하는 데 유용한 방법들 및 킷트들이 또한 본 출원에서 기술된다.

여러 구체예들에 있어서, 대상체의 귀 내의 전정신경절의 신경보호를 위한 방법이 본 출원에서 제공된다. 상기 방법들 및 킷트들은 전정신경절의 세포보호를 제공하고, 그에 의하여 구역질(nausea), 균형의 손실 또는 어지럼증을 포함하여 전정 기능을 약화시거나 또는 방지하는 데 유용하다. 인간을 포함하여 대부분의 동물들에서 상기 전정감각계(vestibular sensory system)는 균형에 그리고 공간 배향 및 안정성의 감각에 기여한다.

메니에르병

또한 특발성 내림프수종(idiopathic endolymphatic hydrops ; ELH)으로도 알려진 메니에르병은 현기증과 이명을 야기하고, 종국적으로는 청력 손실을 야기하는 신경 손상의 결과를 가져오는 내이의 장애이다. 메니에르병의 원인은 불명인 채로 남아 있다. 이는 와우전정 기능장애(cochleovestibular dysfunction) 및 내림프수종(부검(post-mortem examination))으로 특징지워진다. 메니에르병의 일차적인 징후들(signs) 및 증후군들은:

a) 간헐적 현기증. 간헐적 현기증은 전형적으로 경고 없이 발생하고 그리고 대개는 약 20분 내지 2시간 또는 그 이상에서 24시간까지 지속한다. 중증의 현기증(severe vertigo)은 구열질 및 구토(vomiting)를 야기할 수 있다.

b) 청력 손실. 메니에르병에서의 청력 손실은 특히 상기 질환의 과정의 초기에 변동을 거듭할 수 있다. 종국적으로, 대부분의 사람들은 일정 정도의 영구적인 청력 손실을 경험한다. 청력 손실은 일측(unilateral) 또는 양측(bilateral)일 수 있다.

c) 이명. 이명은 귀에서의 울리거나(ringing), 윙윙거리거나(buzzing), 으르렁거리거나(roaring), 휘파람소리가 나거나(whistling) 또는 쉿쉿거리는(hissing) 소리의 인식이다. 메니에르병에 대하여는, 이명은 종종 저성조 피치(low-pitched)이다.

d) 이충만감(aural fullness). 이충만감은 귀 안에서의 충만함 또는 압력의 느낌이다.

이론에 구애됨을 희망함이 없이, 메니에르병 환자들에서 와우각모세포(cochlear hair cells)들 및 전정모세포(vestibular hair cells)들이 사멸하고, 그에 의하여 청력 손실을 야기한다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 모세포들은 내이 내에 위치되는 감각수용기들이다. 청각모세포(auditory hair cells)들은 와우각의 코르티기관 내에 위치되고, 그리고 소리를 검출하고 그리고 소리를 신경섬유들을 경유하여 대뇌에로 송출되는 전기적 신호들로 변환시키는 데 관여한다. 전정모세포들은 내이의 전정기관들(난형낭, 구형낭, 팽대부) 내에 위치된다. 이들은 머리의 위치에서의 변화를 검출하고 그리고 신호들을 대뇌에로 송출하여 신체 자세(body posture), 눈 위치(eye position) 및 균형을 유지하는 데 도움을 주도록 한다. 청각모세포들 및 전정모세포들의 부재의 경우, 음파 또는 중력으로부터 전달되는 에너지가 신경 신호들로 전환되지 않고, 그리고 청력 또는 균형 장애가 후속한다.

바람직한 구체예들에 있어서, 치료되는 상기 대상체는 온혈 동물 그리고 특히 포유동물 그리고 바람직하게는 인간이다.

"대상체를 치료하는 것(treating a subject)"은 질환 또는 상태와 연관되는 증후군들을 완화시키거나 또는 약화시키거나, 상기 질환의 발병을 지연시키거나, 질환 진전을 늦추거나, 중증도를 줄이거나 또는 상기 질환을 치료하기 위하여 또는 상기 질환이 발생하는 것을 방지하도록 하는 데 유효한 치료물질(therapeutic substance)을 대상체에 투여하는 것을 의미한다. "치료"는 치료상의 치료(therapeutic treatment) 및 예방적 또는 예방책(preventative measures) 둘 다를 의미하며, 여기에서 상기 대상체가 장애가 방지되거나 또는 질환의 진전이 늦추어지거나 또는 장애의 증후군들이 감소된다. 치료를 필요로 하는 것들d는 이미 상기 질환 또는 상태를 경험한 것들, 상기 질환 또는 상태를 가질 위험에 있거나 또는 가질 경향이 있는 것들 및 상기 질환 또는 상태가 방지되어야 하는 것들이 포함된다. 본 발명의 상기 조성물들은 메니에르병의 발병 이전에, 발병 동안에 또는 발병에 후속하여 투여된다.

대상체의 귀에 시퀀스 동정 번호: 1-3 중의 어느 하나에 규정되는 mRNA를 인코딩하는 CASP2 유전자의 발현을 하향조절하는 일정 용량의 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 투여하고, 그에 의하여 상기 대상체의 귀 내의 나선신경절 세포들 및/또는 전정신경절 세포들에 대한 신경보호를 제공하는 것을 포함하는, 청각계 및/또는 전정계 내에서의 병리학적 비정상들과 연관되는 질환으로 고통받는 대상체의 나선신경절 및/또는 전정신경절 내의 신경 세포들의 손실을 감소시키기 위한 방법이 본 출원에서 제공된다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 dsRNA 화합물은 시퀀스 동정 번호: 8에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 센스 가닥 및 시퀀스 동정 번호: 9에 규정되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다.

조합요법(Combination Therapy)

본 출원에서 기술되는 바와 같은 메니에르병 및 연관된 질환들 및 장애들을 치료하기 위한 방법들은 CASP2 유전자에로 지향되는 이중-가닥 RNA 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 본 출원에서 기술되는 신규한 약제학적 조성물들 및 요법들과 함께 메니에르병으로 고통받거나 또는 그에 영향을 받거나 또는 그에 감수성인 대상체를 치료하기 위한 공지된 치료들을 포함하는 조합요법이 본 발명의 일부로 고려된다는 것이 또한 기술된다.

"함께(in conjuction with)" 또는 "조합하여(in combination with)"에 대하여는 이는 본 발명의 상기 약제학적 조성물들의 투여에 앞서, 동시에 또는 후속하여 부가의 약제학적으로 유효한 화합물이 투여된다는 것을 의미한다. 따라서, 상기에 언급된 이러한 조합의 개개 구성요소들은 동일한 또는 별개의 약제학적 제형들로 순차적으로 또는 동시적으로 투여된다. 제2의 치료제는 임의의 적절한 경로, 예를 들면, 눈으로, 귀로, 경구로(입으로), 볼로(buccal), 흡기로(inhalation), 설하로(sublingual), 직장으로(rectal), 질로(vaginal), 요도경유로(transurethral), 코로(nasal), 국소적으로, 경피적으로(percutaneous)(즉, 피부를 통하여(transdermal)), 또는 비경구적으로(정맥내, 근육내, 피하 및 심장내(intracoronary)로를 포함하여)의 투여로 투여된다.

일부 구체예들에 있어서, 본 출원에서 기술되는 분자 및 상기 제2 치료제/조성물들은 단일 조성물 내에 또는 2 또는 그 이상의 서로 다른 약제학적 조성물들로서 동일한 경로로 투여된다. 그러나, 다른 구체예들에 있어서, 본 발명의 신규한 약제학적 조성물들과 제2 치료 조성물/치료제로의 서로 다른 투여의 경로가 가능하거나 또는 선호된다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 단독 또는 조합의 각 치료제들에 대한 최량의 투여 모드가 알려져 있다.

본 발명은 설명적인 방법으로 기술되었으며, 사용된 전문용어들이 제한이라기 보다는 오히려 설명하는 단어의 속성이어야 하는 것으로 의도된다는 것은 이해되어져야 한다.

본 발명의 많은 변형들 및 변화들이 상기한 교시들의 관점에서 가능하다. 따라서, 첨부된 특허청구범위들의 관점 내에서 본 발명이 특별히 기술된 것과는 달리 실행될 수 있다는 것은 이해되어져야 한다.

본 출원 전체를 통하여, 미합중국 특허들을 포함하여 여러 공보들이 저자 및 연도 및 특허번호들로 참조되었다. 이들 공보들 및 특허들 및 특허출원들의 상세한 설명들이 자에 본 발명이 속하는 기술분야의 상태를 보다 충분히 기술하기 위하여 그들 전체로 본 출원 내에 참조로 포함된다.

본 발명은 이하에서 실시예들을 참조하여 상세히 설명되나, 그러나 이에 제한되는 것으로서 이해되어야 하는 것은 아니다.

본 출원에서의 임의의 문헌의 인용은 그 문헌이 적절한 선행기술이거나 또는 본 출원의 임의의 청구항의 특허성에 대한 인용문헌으로서 간주됨을 인정하는 것으로서 의도되는 것은 아니다. 임의의 문헌의 내용 또는 날짜에 대한 임의의 진술은 출원 시에 출원인이 획득가능한 정보에 기초하고 있으며, 이러한 진술의 정확성에 대한 인정을 구성하지는 않는다.

실시예들

더 이상의 노력 없이, 당해 기술분야에서 숙련된 자는 앞서의 상세한 설명을 사용하여 본 발명을 그 최대한으로 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 하기의 바람직한 특정의 구체예들은 어떠한 방법으로도 특허청구된 발명의 제한이 아닌 단순히 설명으로 이해되어야 한다.

일반적인 방법들 - 분자생물학 및 면역분석

본 출원에서 특별히 기술되지는 않았으나 당해 기술분야에서 공지된 표준 분자생물학 프로토콜들은 대체로 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, New-York(1989, 1992)에서와 같은, 그리고 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988)에서와 같은, 그리고 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)에서와 같은, 그리고 Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988)에서와 같은, 그리고 Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York 그리고 Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)에서와 같은 그리고 미합중국 특허 제4,666,828호; 동 제4,683,202호; 동 제4,801,531호; 동 제5,192,659호 및 동 제5,272,057호에서 규정된 바와 같은 방법론에 따르며, 이들을 본 출원에 참조로 인용한다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 문헌 PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서와 같이 수행된다. 유세포측정기(Flow Cytometry)(FACS)와 조합한 원위치(세포 내) 중합효소연쇄반응이 특정의 DNA 및 mRNA 시퀀스들을 포함하는 세포들의 검출에 사용될 수 있다(문헌 Testoni et al., 1996, Blood 87:3822 참조). 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 및 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 방법 또한 당해 기술분야에서 공지되어 있다.

본 출원에서 특별히 기술되지는 않았으나 당해 기술분야에서 공지된 표준 유기 합성 프로토콜들은 대체로 문헌 Organic syntheses: Vol.1- 79, editors vary, J. Wiley, New York, (1941 - 2003); Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley -VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001)들에 근본적으로 따른다.

본 출원에서 특별히 기술되지는 않았으나 당해 기술분야에서 공지된 표준 의약화학 방법들(medicinal chemistry methods)은 대체로 Pergamon Press에서 발행된, 여러 저자들 및 편집자들의 시리즈물 "Comprehensive Medicinal Chemistry"들에 근본적으로 따른다.

대체로, 바람직한 면역분석(immunoassay)은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)이다. ELISA 분석은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 잘 알려져 있다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체들 둘 다 상기 분석법들에서 사용될 수 있다. 반면, 방사선면역분석법(radioimmunoassays ; RIA) 등과 같은 다른 면역분석법들이 당해 기술분야에서 공지된 바에 따라 사용될 수 있다. 획득가능한 면역분석법들이 특허 및 과학 문헌들에 집중적으로 기술되어 있다. 예를 들면, 문헌 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, New York, 1989과 마찬가지로 미합중국 특허 제3,791,932호; 동 제3,839,153호; 동 제3,850,752호; 동 제3,850,578호; 동 제3,853,987호; 동 제3,867,517호; 동 제3,879,262호; 동 제3,901,654호; 동 제3,935,074호; 동 제3,984,533호; 동 제3,996,345호; 동 제4,034,074호; 동 제4,098,876호; 동 제4,879,219호; 동 제5,011,771호 및 동 제5,281,521호들을 참조하시오.

siRNA 활성

활성이고 그리고 치료학적으로 유용한 dsRNA를 제조하는 데 유용한 상기 센스 시퀀스 및 안티센스 시퀀스들은 우선순위 알고리즘(proprietary algorithm) 또는 당해 기술분야에서 공지된 알고리즘을 사용하여 생성된다.

대체로, 약 1.5 내지 2x10 ⁵ 시험 세포들(인간 유전자들을 표적화하는 siRNA에 대한 표적헬라세포(HeLa cells)들 및/또는 293T 세포들 및 집쥐(rat)/생쥐(mouse) 유전자를 표적화하는 siRNA에 대한 NRK52 세포들(정상 집쥐 신장 원위 세관 세포) 및/또는 NMuMG 세포들(생쥐 포유동물 상피세포주))이 6웰 플레이트에 웰 당 접종되었다(70 내지 80% 합류(confluent)).

약 24시간 후, 세포들을 리포펙타민™ 2000 시약(Lipofectamine™ 2000 reagent; 인비트로겐사(Invitrogen))를 사용하여 5nM 또는 20nM의 최종 농도들로 dsRNA 분자들로 형질감염시켰다. 상기 세포들을 37℃에서 이산화탄소 배양기(C0 ₂ incubator) 내에서 72시간 동안 배양시켰다.

형질감염에 대한 양성 대조(positive control)로서, PTEN-Cy3 표지된 siRNA 분자들을 사용하였다. siRNA 활성에 대한 음성 대조(negative control)로서 GFP dsRNA 분자들을 사용하였다. 여러 화학적으로 변성된 siRNA 화합물들이 활성에 대하여 시험되었다. siRNA 활성에 대한 음성대조로서 GFP siRNA가 사용되었다.

형질감염 72시간 후, 세포들을 수확하고 그리고 세포들로부터 RNA를 추출하였다. 형광 현미경(fluorescent microscopy)으로 형질감염 효율을 시험하였다.

내인성 유전자를 발현하는 세포들 내에서의 Casp2 유전자의 정량적 중합효소연쇄반응 분석을 사용하여 특정의 선호되는 siRNA 구조들을 사용하는 유전자 발현의 억제율을 결정하였다.

대체로, 시험관 내 시험을 위하여 선택되는 특정의 시퀀스들을 갖는 siRNA들은 인간 및 비-인간의 영장류(non-human primate), 집쥐(rat) 또는 토끼 유전자들 등과 같은 제2의 종들에 대하여 특이적이다.

혈청 안정성 실험

본 발명에 따라 화학적으로 변성된 siRNA 화합물들이 하기와 같이 인간 혈청 내에서의 듀플렉스 안정성에 대하여 시험되었다:

7μM의 최종 농도의 siRNA 분자들이 37℃에서 100% 인간 혈청(시그마사 Cat# H4522) 내에서 배양되었다. (인간 혈청에 1 : 14.29로 희석된 siRNA 스톡 100μM).

서로 다른 시점들(예를 들면, 0분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 8시간, lO시간, 16시간 및 24시간)에서 5㎕를 15㎕의 1.5xTBE-적하 완충제(TBE-loading buffer; TBE: 트리스 염기(tris base), 붕산(boric acid), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 물의 혼합물로 이루어지는 완충제)에 첨가하였다. 샘플들을 액체질소 내에서 즉각적으로 동결시키고 그리고 -20℃에서 보관시켰다.

각 샘플을 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 제조된 비-변성(non-denaturing) 20% 아크릴아미드 겔 상에 적하시켰다. 상기 올리고들을 자외광(UV light) 하에서 에티디움브로마이드(ethidium bromide)로 가시화(visualized)시켰다.

실시예 1: 생쥐 내이 내에서의 CASP2의 발현

Phex ^hyp-Duk 유전학적 쥣과 동물 모델(Phex ^hyp-Duk genetic murine model)이 내림프수종(ELH) 및 진행성 청력 손실을 포함하여 인간들에서의 메니에르병의 증후군들을 모방한다. 이 모델은 그의 전체로서 본 출원에서 참조로 포함되는 문헌 Megerian et al ("A mouse model with postnatal endolymphatic hydrops and hearing loss", Hearing Res 2008; 237(l-2):90-105)에 상술되어 있다. 출생 직후, 상기 돌연변이 생쥐들은 동시적으로 전정기능 손상을 수반하는 내림프수종으로 후속하여 전정신경절 및 나선신경절 내의 뉴런들의 세포자멸사로 발전한다. 마지막으로, 전정 및 와우각 구획(vestibular and cochlear compartments)들 둘 다의 내부의 감각세포들이 퇴화하고 그리고 진행성 청력 손실 및 균형의 손실이 손상이 개시된다.

생쥐 내이 내의 CASP2의 발현이 야생형 및 Phex ^hyp-Duk 생쥐들에서 평가되었다. Casp2 단백질 수준이 3-주령(3-week old), 2-월령(2-month old) 및 3-월령 야생형 및 Phex ^hyp-Duk 돌연변이 수컷 생쥐들을 포함하는 2가지 별개의 실험들에서 정량적으로 평가되었다. 생쥐들의 내이들을 절제하고, 고정시키고, 파라핀 내에 포매하고 그리고 절단하여 나선신경절과 마찬가지로 청각 및 전정 구획의 재현(representation)을 갖는 슬라이드들을 수득하였다. 상기 슬라이드들을 사용하여 조직학적 평가에 사용하였다. 귀 하나 당 3개의 슬라이드들을 사용하여 상기 내이 내의 dsRNA 분포의 원위치 교잡화 분석(in situ hybridization analysis)에 사용하였다. Casp2 항체(산타크루즈사(Santa Cruz), SC-623)을 사용하는 상기 슬라이드의 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의하여 Casp2 단백질 발현을 평가하였고, 그리고 겨자무과산화효소(HRP) 신호들을 티라미드 증폭 시스템(Tyramid Amplification System ; TSA™, 퍼킨엘머사(PerkinElmer))으로 증폭시켰다.

모든 세포들, 특히 모세포들 내의 코르티기관(OC), 나선신경절(SG), 와우신경 및 전정감각 상피세포(황반(macular)) 염색에서 Casp2 양성 세포들이 관측되었다. 게다가, 소수의 샘플들에서, 골소강(bone lacunae)(아마도 골수) 내에서 그리고 혈관들(내피세포들) 내에서 비-특이적 염색이 발생하였다. 시험된 연령들에서 돌연변이와 야생형 사이에서 Casp2 전구체 단백질 수준들에서 차이점들이 관측되지 않았다. 염색 결과들을 본 출원에서 하기 표 1(야생형 및 Phex ^hyp-Duk 돌연변이 생쥐들의 내이들에서의 CASP2 발현 패턴)에 제공하였다.

실시예 2: 생쥐 내이에로의 siRNA 전달 및 메니에르병의 모델인 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들에서의 4가지 siRNA 분자들의 효능의 평가

대상: 메니에르병(MD)의 생쥐 모델을 사용하여 4가지 표적 유전자들의 침묵화를 위한 여러 dsRNA 분자들의 안정성 및 잠재적 치료효과를 평가하였다.

상기 Phex ^hyp-Duk 유전학적 쥣과 모델은 내림프수종 및 진행성 청력 손실을 포함하여 인간들에서의 메니에르병의 증후군들을 모방한다. 이 모델은 그 전체로서 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 Megerian et al ("A mouse model with postnatal endolymphatic hydrops and hearing loss", Hearing Res 2008; 237(l-2):90-105)에 상술되어 있다.

내이에서의 상기 dsRNA의 안정성 및 치료효과의 평가는 다음과 같이 수행되었다:

전신 상태(Ecog(Eastern Cooperative Oncology Groupscale) Performance status)의 평가;

상기 내이의 조직학적 절편들의 평가;

내이 기능(양측)의 평가;

비-침습적 청력 시험;

클릭, 8, 16 및 32㎐에서의 청각성뇌간반응(auditory brainstem response: ABR);

변조이음향방사(Distortion Product Otoacoustic Emissions ; DPOAE) - 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20㎑의 진폭;

비-침습적 전정 기능 시험;

전정유발근전위(vestibular evoked myogenic potential).

상기 연구는 두 단계들로 수행되었다:

연구 1. 정상 야생형 생쥐들에서의 파일럿 dsRNA 내이 전달 및 안정성 연구.

연구 2. 수컷 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들에서의 4가지 서로 다른 유전자들을 표적하는 dsRNA 분자들의 치료 효과의 평가.

연구 1의 대상들: 점이액들을 사용하는 비-침습적 내이 전달 및 생쥐들의 내이에서의 다중 dsRNA 투여들의 안정성의 평가.

연구 1: 연구 설계를 표 2 및 도 2에 나타내었다.

dsRNA 또는 비히클을 P15로부터 출발하여 각 3개체의 생쥐들의 7개의 그룹들에 주간 단위로 전달하였다. 시험 및 대조 물품의 최종 투여 이전일에 그리고 그들의 투여에 앞서서 기능 시험들을 수행시켰다. dsRNA 분자들의 투여에는 40 내지 60분간의 동물의 부동화(animal immobilization ; 마취)가 요구된다. 따라서, 마취를 필요로 하는 기능 시험 수행의 스케쥴의 최적화를 수행하였다. 동일 연령의 무손상의 미-처리되는 생쥐들에서의 기능 시험들이 기저 대조(baseline control)로 제공되었다.

도 3은 야생형 생쥐들의 내에의 dsRNA 또는 비히클 점이액들로의 주간 치료가 청성뇌간반응 문턱값들(ABR thresholds)에 의하여 평가된 바와 같이 청각 기능에 영향을 주지 않는다는 것을 나타내고 있다. 각 ㎑ 측정에 대하여, siRNA 치료 동물들에 대한 결과들은 좌측 상에, 미처리된 동물들은 중앙에 그리고 비히클 치료된 동물들은 우측 상에 나타내었다.

연구 2: 수컷 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들에서의 4가지 서로 다른 유전자들, CASP2, NOX3, CAPNS1 및 RHOA을 표적하는 4가지 dsRNA 분자들의 치료 효과의 파일럿 평가.

연구 대상: 기능적 및 조직학적 평가를 사용하는 것에 의하여 메니에르병의 생쥐 유전학적 모델에서의 dsRNa 시험 분자들의 효능의 평가.

연구 2: 연구 설계를 표 3(연구 2 설계) 및 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 도 4a는 Phex ^hyp-Duk /Y의 내이에서의 사건들의 대략적인 시간표(timline)를 나타내고 있다. 점선은 발병 중의 동물들 중에서의 외양 및 중등도의 일부 변동성과 함께 표현형의 발병, 중등 청력 손실(mild hearing loss(HL)), 내림프수종(ELH)의 징후, 나선신경절(SGC) 퇴화 또는 모세포 퇴화를 나타낸다. 점선에 후속하는 실선은 상기 표현형이 연령에 따라 확실하게 되는 것을 나타낸다(문헌 Hear Res. 2008 March ; 237(1-2): 90-105)로부터).

dsRNA 또는 비히클은 P15로부터 출발하여 P63까지 각 12개체의 생쥐들의 6개의 그룹들에 주간 단위로 전달하였다. 시험 및 대조 물품의 투여일 및 그리고 그들의 투여에 앞서서 매주 기능 시험들을 수행시켰다. dsRNA의 투여에는 40 내지 60분간의 동물의 부동화(마취)가 요구되고 마취를 필요로 하는 기능 시험 수행의 스케쥴의 최적화를 수행하였다. 동일 연령의 무손상의 미-처리되는 생쥐들에서의 기능 시험들이 기저 대조로 제공되었다.

집단 팽창(colony expansion)의 과정에서 동물들을 추가로 연구 그룹들에 추가하였다.

통계학적 분석을 수행하여 연령을 일치시킨(age-matched) 치료된 Phex ^hyp-Duk /생쥐와 대조 Phex ^hyp-Duk /생쥐들 간의 청각, 전정 및 거동 시험들의 결과들을 비교하였다. P<0.05는 유의미한 차이(significant difference)로 고려되었다.

종결에 의하여, 생쥐들의 내이들을 절제하고, 고정시키고, 파라핀 내에 포매하고 그리고 절단하여 나선신경절과 마찬가지로 청각 및 전정 구획의 재현을 갖도록 하였다. 내이 형태의 조직학적 평가를 위하여 슬라이드들이 사용되었다. 본 연구에서 활용된 상기 약제학적 조성물의 제조에 사용된 CASP2 dsRNA 화합물(siCASP2, QPI1007 또는 1007로도 명명된 CASP2 siRNA)은 하기에 묘사된 바와 같이 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16 및 18에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자) 및 포지션 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티들의 19-뉴클레오티드(소문자)를 포함하는 안티센스 가닥(AS, 가이드 가닥(guide strand); 및 포지션 18에 미변성된 리보뉴클레오티드들 및 하나의 L-디옥시리보뉴클레오티드(굵고 밑줄 친) 및 5' 말단에서 역전된 디옥시리보어베이직 성분(iB)을 포함하는 센스 가닥(SEN, 패신저 가닥(passenger strand))을 갖는 2개의 별개의 가닥들을 갖는 19-뉴클레오티드 평활-말단된 듀플렉스(19-nucleotide blunt-ended duplex)이다:

상기 NOX3 dsRNA 화합물(siNOX3_4)은 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자)을 포함하는 안티센스 가닥(AS, 가이드 가닥); 및 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자)을 포함하는 센스 가닥(SS, 패신저 가닥)을 갖는 2개의 별개의 가닥들을 갖는 19-올리고뉴클레오티드 평활-말단된 듀플렉스(인간, 생쥐, 집쥐-교차종)이다. 상기 센스 가닥의 3' 말단 및 상기 안티센스 가닥의 3' 말단은 비-포스포릴화되었다.

siNOX3_4

상기 CAPNS1 dsRNA 화합물(siCAPNSl_13)은 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자)을 포함하는 안티센스 가닥(AS, 가이드 가닥); 및 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자)을 포함하는 센스 가닥들을 갖는 2개의 별개의 가닥들을 갖는 19-뉴클레오티드 평활-말단된 듀플렉스이다;

siCAPNSl_13

상기 RHOA dsRNA 화합물(siRHOA_4)은 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자)을 포함하는 안티센스 가닥(AS, 가이드 가닥); 및 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 및 19에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자)을 포함하는 센스 가닥(SS, 패신저 가닥)을 갖는 2개의 별개의 가닥들을 갖는 19-뉴클레오티드 평활-말단된 듀플렉스이다;

siRHOA_4

상기 EGFP(enhanced green fluorescent protein ; 강화 녹색형광단백질) 대조 dsRNA 화합물(siEGFP_5)은 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티드들(소문자)을 포함하는 안티센스 가닥(AS, 가이드 가닥); 및 포지션 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 및 18에 2'OMe 당 변성된 리보뉴클레오티들(소문자) 및 포지션 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 미변성된 리보뉴클레오티드들(대문자)을 포함하는 센스 가닥(SS, 패신저 가닥)을 갖는 2개의 별개의 가닥들을 갖는 19-뉴클레오티드 평활-말단된 듀플렉스이다;

siEGFP_5

결과들 및 결론들

청성뇌간반응 기능 시험의 결과들: Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들은 모든 주파수들에서 명백한 청력의 손실을 나타낸다. 대부분의 청력 기능의 손실은 체계적 측정이 개시될 때인 P29 이전에 발생하고 그리고 음성 대조군에서는 추가로 악화되는 경향이 있으나, siRNA 치료군에서는 그러하지 않았다. P29에서 이미, 모든 주파수들에서 siRNA-치료된 생쥐들(P15 및 P22에 2회의 치료)에서의 청력 기능이 비히클-치료된 생쥐들에 비해 명백하게 더 좋게 나타났으며, siRNA-치료된 생쥐들에서 이로운 이러한 차이는 시간에 따라 점점 더 깊어졌다. P70부터 시작하여, 16 내지 32㎑에서의 청력 기능은 siEGFP-치료된 동물들에 비하여 모든 siRNA 치료 군에서 명백하게 더 나아졌다. P90에서의 청성뇌간반응을 도 5e에 나타내었다. 도 5a 내지 도 5e들 모두에 있어서, 흰색 사각형(open squares)을 갖는 점선(dotted line)은 비히클을 나타내고; 흰색 삼각형(open triangles)을 갖는 단선 쇄선(short dashes dashed line)은 siCASP2 치료 동물들을 나타내고; 플러스 기호("+")를 갖는 중선 쇄선(medium dashed dashed line)은 siEGFP 치료 동물들을 나타내고; 검은색 원(closed circles)을 갖는 중선 쇄선들은 siEGFP 치료 동물들을 나타내고; 별을 갖는 장선 쇄선(long dashes dashed line)은 siRHOA 치료 동물들을 나타내고; 흰색 원(open circles)을 갖는 실선(solid line)은 siCAPNSl 치료 동물들을 나타낸다. x-축은 P29 내지 P90에서의 주간 시험일들을 제공하고 그리고 y-축이 청성뇌간반응 시험의 데시벨 판독(㏈ readings)을 제공한다. y축은 4가지 시험들에서 서로 다른 축척(scale)이고, 클릭은 약 75 내지 87.5㏈이고, 8㎑는 약 60 내지 80이고, 16㎑는 약 40 내지 70이고 그리고 32㎑는 약 55 내지 75이다.

도 5e는 P90에서 시험 화합물들로 치료된 동물들에서의 청성뇌간반응에서의 개선을 나타내고 있다. 비히클과 siEGFP 사이에서 통계학적으로 유의미한 차이는 없다. 클릭: 55㏈; 8㎑에서 40㏈; 16㎑에서 35㏈; 32㎑에서 40㏈에서 정상 생쥐들에 대한 청성뇌간반응.

결론: Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들은 siCASP2, siCAPNSl, siNOX3 및 siRHOA 치료군들에서 청력 기능 보호를 나타내었다. 상기 나선신경절 및 전정신경절 뉴런들의 신경보호가 조직학적으로 입증되었다.

면역학적 염색(histological staining)의 결과들: 연구 종결에서 모든 생쥐들로부터 제조된 내이 절편들의 조직학적 분석은 대조들에 비하여 상기 siRNA 치료 생쥐들에서의 나선 및 전정신경절 세포들의 실질적으로 그리고 유의미적인 보존을 입증하였다. 이 모델에 대하여 전형적인 ELH(내림프수종) 표현형은 siRNA 치료에 의해 영향을 주지 않았다. 기대된 바와 같이, 상기 질병의 이 단계(P900에서, 모든 연구 그룹들에서 감각 상피들에서의 변화가 관측되지 않았다. 나선신경절 세포들 및 전정신경절 세포들은 비히클-치료군들에 비해 Phex ^hyp-Duk /Y 생쥐들의 dsRNA 치료된 귀들에서의 세포자멸사로부터 유의미한 보호를 나타내었다. 도 6a에 대하여 도 6b, 도 6cd에 대하여 도 6d 및 도 6e에 대하여 도 6f를 비교하시오. 검은색(왜곡된 조직)이 도 6a에서 신경절 세포 사멸의 영역들 및 도 6b에서 밀집한 신경절의 영역을 나타낸다. 상기 모델에서 와우각모세포들 및 전정모세포들은 영향을 받지 않은 것으로 나타나고 그리고 siCASP2로의 치료는 대조에 비하여 부가의 영향들을 생성하지 않았다. siCAPNSl, siNOX3 및 siRHOA 치료 동물들에서 유사한 결과들이 얻어졌다. 도 7a는 비히클-치료(좌측 패널) 또는 siEGFP-치료(우측 � ��널) Phex ^hyp-Duk 돌연변이 생쥐들로부터의 와우각 정부(cochlear apex) 내의 신경절 세포들을 나타내고 있다. 도 7b, 도 7c 및 도 7d들은 각각 siCAPNSl-, siNOX3- 및 siRHOA-치료된 동물들로부터의 와우각 정부 내의 신경절 세포들을 나타내고 있다. 모든 배율들은 63배(x63) 이었다. 도 8a는 비히클-치료(좌측 패널) 또는 siEGFP-치료(우측 패널) Phex ^hyp-Duk 돌연변이 생쥐들로부터의 전정신경절 세포들을 나타내고 있다. 도 8b, 도 8c 및 도 8d들은 각각 siCAPNSl-, siNOX3- 및 siRHOA-치료된 동물들로부터의 전정신경절 세포들을 나타내고 있다. 모든 배율들은 63배 이었다. 나선신경절 세포들의 생존율은 청력의 보존에서 절대적인 인자(critical factor)이다.

본 연구에서 생쥐들 내의 dsRNA 전달은 점이액 적용으로 달성되었다. 임상적인 설정에 있어서, 약물들의 경고막 주사는 임상적으로 일상적인 것이고 그리고 dsRNA의 전달을 위한 점이액의 사용은 가능하다. 더욱이, 본 출원에서 기술된 상기 연구들에서 활용된 상기 dsRNA는 단순히 CASP2, NOX3, CAPNSl 및 RHOA를 하향조절하는 dsRNA의 예들로 한정되는 것은 아니고, 그리고 그들 개개 유전자들을 하향조절함에 있어서 활성인 다른 시퀀스들 및 구조들을 갖는 dsRNA 종들이 본 출원에서 기술되는 상기 방법들 및 킷트들을 실행하는 데 유용하다.

본 발명은 본 출원에서 광범위하게 그리고 종합적으로 기술되었다. 상기 종합적인 기술 내에 속하는 각각의 보다 좁은 종(species)들 및 아속의 그룹화(sub-generic groupings)들 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 제거된 물질(excised material)이 본 출원에서 특별히 언급되었는 지의 여부에 무관하게, 이는 속(genus)으로부터 임의의 대상 물질을 제외하는 조건(proviso) 또는 소극적인 한정(negative limitation)을 수반하는 본 발명의 상기 종합적인 설명을 포함한다. 다른 구체예들도 하기의 특허청구범위들 내에 속한다.

<110> Quark Pharmaceuticals, Inc. FEINSTEIN, Elena <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR NEUROPROTECTION <130> 240/PCT1 <150> 61/554,982 <151> 2011-11-03 <150> 61/663,627 <151> 2012-06-25 <160> 27 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4241 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uuuugucugu ccgccgagca ccccacuuca ccccauugga ccgcgcggcc gccgcuagag 60 cucugcgccu gcgcacgcac cgggccgggg acuggguggc cuggugugug ggcgcggcag 120 ggcgcaggcg caggcgcagu gugcguccgc gucugagggg agggaugugg gggaagcgac 180 ggcccccggu uuguuugggc ugugggcggu gcgcagcgga gagcccggga aaagcgggaa 240 auggcggcgc cgagcgcggg gucuuggucc accuuccagc acaaggagcu gauggccgcu 300 gacaggggac gcaggauauu gggagugugu ggcaugcauc cucaucauca ggaaacucua 360 aaaaagaacc gaguggugcu agccaaacag cuguuguuga gcgaauuguu agaacaucuu 420 cuggagaagg acaucaucac cuuggaaaug agggagcuca uccaggccaa agugggcagu 480 uucagccaga auguggaacu ccucaacuug cugccuaaga ggggucccca agcuuuugau 540 gccuucugug aagcacugag ggagaccaag caaggccacc uggaggauau guugcucacc 600 acccuuucug ggcuucagca uguacuccca ccguugagcu gugacuacga cuu 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gcuccuggca cagaauucca ccggugcaag gagaugucug aauacugcag cacucugugc 1560 cgccaccucu accuguuccc aggacacccu cccacaugau gucaccuccc caucauccac 1620 gccaagugga agccacugga ccacaggagg ugugauagag ccuuugaucu ucaggaugca 1680 cgguuucugu ucugcccccu cagggaugug ggaaucuccc agacuuguuu ccugugccca 1740 ucaucucugc cuuugagugu gggacuccag gccagcuccu uuucugugaa gcccuuugcc 1800 uguagagcca gccuugguug gaccuauugc caggaauguu ucagcugcag uugaagagcc 1860 ugacaaguga aguuguaaac acaguguggu uauggggaga gggcauauaa auuccccaua 1920 uuuguguuca guuccagcuu uuguagaugg cacuuuagug auugcuuuua uuacauuagu 1980 uaagaugucu gagagaccau cuccuaucuu uuauuucauu cauauccucc gcccuuuuug 2040 uccuagagug agaguuugga agguguccaa auuuaaugua gacauuaucu uuuggcucug 2100 aagaagcaaa caugacuaga gacgcaccuu gcugcagugu ccagaagcgg ccugugcguu 2160 cccuucagua cugcagcgcc acccagugga aggacacucu uggcucguuu gggcucaagg 2220 caccgcagcc ugucagccaa cauugccuug cauuuguacc uuauugaucu uugcccaugg 2280 aagucucaaa gaucuuucgu ugguuguuuc ucugagcuuu guuacugaaa ugagccucgu 2340 gggga gcauc agagaaggcc aggaagaaug guguguuucc cuagacucug uaaccaccuc 2400 ucugucuuuu uccuuccuga gaaacgucca ucucucuccc uuacuauucc cacuuucauu 2460 caaucaaccu gcacuucaua ucuagauuuc uagaaaagcu uccuagcuua ucucccugcu 2520 ucauaucucu cccuucuuua ccuucauuuc auccuguugg cugcugccac caaaucuguc 2580 uagaauccug cuuuacagga ucauguaaau gcucaaagau guaauguagu ucuuuguucc 2640 ugcuuucucu uucaguauua aacucuccuu ugauauuaug uggcuuuuau uucagugcca 2700 uacauguuau uguuuucaac cuagaaaccu uuaucccugc uuaucugaaa cuucccaacu 2760 ucccuguucu uuaagacuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugagacaga gucucgcucu 2820 gucgcccagg cuggagggca guggcacgau cucagcucac ugcaagcucc aacucccggg 2880 uucacgccau ucuccugccu cagccuucca aguagcuggg acuacaggug cccgccaccg 2940 ugcccggcua auuuuuuugu auuuuuagua gagacagggu uucaccaugu uagccgggau 3000 ggucuugauc uccugaccuc augauccacc caccucagcc ucccaaagug uugggauuac 3060 aggcgugagc cacugcgccc gggcaagacc uuuuuuuaaa aaaaaaaaaa aaaaaacuuc 3120 cauucuuucu uccuccaguc uguucucaca uaacagagua guuuugguuu uuaauuuuuu 3180 uugguuguuu gcuguuuuuu guuuuuuaag gugaguucuc acuauguuuc ucagacuggu 3240 cucgaacucc uggccucaag ccaucuuccc gccucagccu cucaaauagc ugggcuuaca 3300 ggcaugagcc accacaccug gccaggauuu gguuguuuaa auauaaaucu gaucaccccc 3360 cugcuuagaa cccuucugcu uucuauuacc ccucauuuaa aauguaaacu cuucaccuug 3420 guuuaugaga acugguucuu gccuuccccu ugaaccucau uaaaugguga uuucuugcua 3480 agcuccagcc cgaguggucu ccucucagcu ucuaauuuug ugcucuuucc ugcccuuuuc 3540 cugggccuuc ucagcucucc acccccacca cucuugacuc aggugguguc cuucuuccuc 3600 aagucuugac aauucccggg cccuucaguc ccugagcagu cuacuucugu gucugucacc 3660 acaucuuguc uuuuccccuc auugcauuua uugcaguuua uauauaugcu acuuuuacuu 3720 guucauuucu gucuccccua ccaggcugua aaugagggca gaaaccuugu uuguuuuauu 3780 caccaucaug uaccaagugc uuggcacaua gugggccuuc auuaaauguu uguugaauaa 3840 aagagggaag aaggcaagcc aaccuuagcu acaauccuac cuuuugauaa aauguuccuu 3900 uugacaauau acacggauua uuauuuguac uuuguuuuuc cauguguuuu gcuuuuaucc 3960 acuggcauuu uuagcuccuu gaagacauau caugugugag auaacuuccu ucacaucucc 4020 cauggucccu agcaaa augc uaggccugua guagucaagg ugcucaauaa auauuuguuu 4080 gggugguuug ugagccuugc ugccaagucc ugccuuuggg ucgacauagu auggaaguau 4140 uugagagaga gaaccuuucc acucccacug ccaggauuuu guauugccau cgggugccaa 4200 auaaaugcuc auauuuauua cugaaaaaaa aaaaaaaaaa a 4241 <210> 2 <211> 4023 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uuuugucugu ccgccgagca ccccacuuca ccccauugga ccgcgcggcc gccgcuagag 60 cucugcgccu gcgcacgcac cgggccgggg acuggguggc cuggugugug ggcgcggcag 120 ggcgcaggcg caggcgcagu gugcguccgc gucugagggg agggaugugg gggaagcgac 180 ggcccccggu uuguuugggc ugugggcggu gcgcagcgga gagcccggga aaagcgggaa 240 auggcggcgc cgagcgcggg gucuuggucc accuuccagc acaaggagcu gauggccgcu 300 gacaggggac gcaggauauu gggagugugu ggcaugcauc cucaucauca ggaaacucua 360 aaaaagaacc gaguggugcu agccaaacag cuguuguuga gcgaauuguu agaacaucuu 420 cuggagaagg acaucaucac cuuggaaaug agggagcuca uccaggccaa agugggcagu 480 uucagccaga auguggaacu ccucaacuug cugccuaaga ggggucccca agcuuuugau 540 gccuucugug aagccuugca cuccugaauu uuaucaaaca cacuuccagc uggcauauag 60 0 guugcagucu cggccucgug gccuagcacu gguguugagc aaugugcacu ucacuggaga 660 gaaagaacug gaauuucgcu cuggagggga uguggaccac aguacucuag ucacccucuu 720 caagcuuuug ggcuaugacg uccauguucu augugaccag acugcacagg aaaugcaaga 780 gaaacugcag aauuuugcac aguuaccugc acaccgaguc acggacuccu gcaucguggc 840 acuccucucg cauggugugg agggcgccau cuauggugug gaugggaaac ugcuccagcu 900 ccaagagguu uuucagcucu uugacaacgc caacugccca agccuacaga acaaaccaaa 960 aauguucuuc auccaggccu gccguggaga ugagacugau cgugggguug accaacaaga 1020 uggaaagaac cacgcaggau ccccugggug cgaggagagu gaugccggua aagaaaaguu 1080 gccgaagaug agacugccca cgcgcucaga caugauaugc ggcuaugccu gccucaaagg 1140 gacugccgcc augcggaaca ccaaacgagg uuccugguac aucgaggcuc uugcucaagu 1200 guuuucugag cgggcuugug auaugcacgu ggccgacaug cugguuaagg ugaacgcacu 1260 uaucaaggau cgggaagguu augcuccugg cacagaauuc caccggugca aggagauguc 1320 ugaauacugc agcacucugu gccgccaccu cuaccuguuc ccaggacacc cucccacaug 1380 augucaccuc cccaucaucc acgccaagug gaagccacug gaccacagga ggugugauag 1440 agccuuugau 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cccug cuucauaucu cucccuucuu uaccuucauu ucauccuguu 2340 ggcugcugcc accaaaucug ucuagaaucc ugcuuuacag gaucauguaa augcucaaag 2400 auguaaugua guucuuuguu ccugcuuucu cuuucaguau uaaacucucc uuugauauua 2460 uguggcuuuu auuucagugc cauacauguu auuguuuuca accuagaaac cuuuaucccu 2520 gcuuaucuga aacuucccaa cuucccuguu cuuuaagacu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 2580 uuuugagaca gagucucgcu cugucgccca ggcuggaggg caguggcacg aucucagcuc 2640 acugcaagcu ccaacucccg gguucacgcc auucuccugc cucagccuuc caaguagcug 2700 ggacuacagg ugcccgccac cgugcccggc uaauuuuuuu guauuuuuag uagagacagg 2760 guuucaccau guuagccggg auggucuuga ucuccugacc ucaugaucca cccaccucag 2820 ccucccaaag uguugggauu acaggcguga gccacugcgc ccgggcaaga ccuuuuuuua 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaacu uccauucuuu cuuccuccag ucuguucuca cauaacagag 2940 uaguuuuggu uuuuaauuuu uuuugguugu uugcuguuuu uuguuuuuua aggugaguuc 3000 ucacuauguu ucucagacug gucucgaacu ccuggccuca agccaucuuc ccgccucagc 3060 cucucaaaua gcugggcuua caggcaugag ccaccacacc uggccaggau uugguuguuu 3120 aaauauaaau cugaucaccc cccugcuuag aacccuucug cuuucuauua ccccucauuu 3180 aaaauguaaa cucuucaccu ugguuuauga gaacugguuc uugccuuccc cuugaaccuc 3240 auuaaauggu gauuucuugc uaagcuccag cccgaguggu cuccucucag cuucuaauuu 3300 ugugcucuuu ccugcccuuu uccugggccu ucucagcucu ccacccccac cacucuugac 3360 ucagguggug uccuucuucc ucaagucuug acaauucccg ggcccuucag ucccugagca 3420 gucuacuucu gugucuguca ccacaucuug ucuuuucccc ucauugcauu uauugcaguu 3480 uauauauaug cuacuuuuac uuguucauuu cugucucccc uaccaggcug uaaaugaggg 3540 cagaaaccuu guuuguuuua uucaccauca uguaccaagu gcuuggcaca uagugggccu 3600 ucauuaaaug uuuguugaau aaaagaggga agaaggcaag ccaaccuuag cuacaauccu 3660 accuuuugau aaaauguucc uuuugacaau auacacggau uauuauuugu acuuuguuuu 3720 uccauguguu uugcuuuuau ccacuggcau uuuuagcucc uugaagacau aucaugugug 3780 agauaacuuc cuucacaucu cccauggucc cuagcaaaau gcuaggccug uaguagucaa 3840 ggugcucaau aaauauuugu uugggugguu ugugagccuu gcugccaagu ccugccuuug 3900 ggucgacaua guauggaagu auuugagaga gagaaccuuu ccacucccac ugccaggauu 3960 uuguauugcc aucgggugcc aaauaa 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0 uucucuuuca guauuaaacu cuccuuugau auuauguggc uuuuauuuca gugccauaca 2520 uguuauuguu uucaaccuag aaaccuuuau cccugcuuau cugaaacuuc ccaacuuccc 2580 uguucuuuaa gacuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuga gacagagucu cgcucugucg 2640 cccaggcugg agggcagugg cacgaucuca gcucacugca agcuccaacu cccggguuca 2700 cgccauucuc cugccucagc cuuccaagua gcugggacua caggugcccg ccaccgugcc 2760 cggcuaauuu uuuuguauuu uuaguagaga caggguuuca ccauguuagc cgggaugguc 2820 uugaucuccu gaccucauga uccacccacc ucagccuccc aaaguguugg gauuacaggc 2880 gugagccacu gcgcccgggc aagaccuuuu uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aacuuccauu 2940 cuuucuuccu ccagucuguu cucacauaac agaguaguuu ugguuuuuaa uuuuuuuugg 3000 uuguuugcug uuuuuuguuu uuuaagguga guucucacua uguuucucag acuggucucg 3060 aacuccuggc cucaagccau cuucccgccu cagccucuca aauagcuggg cuuacaggca 3120 ugagccacca caccuggcca ggauuugguu guuuaaauau aaaucugauc accccccugc 3180 uuagaacccu ucugcuuucu auuaccccuc auuuaaaaug uaaacucuuc accuugguuu 3240 augagaacug guucuugccu uccccuugaa ccucauuaaa uggugauuuc uugcuaagcu 3300 ccag cccgag uggucuccuc ucagcuucua auuuugugcu cuuuccugcc cuuuuccugg 3360 gccuucucag cucuccaccc ccaccacucu ugacucaggu gguguccuuc uuccucaagu 3420 cuugacaauu cccgggcccu ucagucccug agcagucuac uucugugucu gucaccacau 3480 cuugucuuuu ccccucauug cauuuauugc aguuuauaua uaugcuacuu uuacuuguuc 3540 auuucugucu ccccuaccag gcuguaaaug agggcagaaa ccuuguuugu uuuauucacc 3600 aucauguacc aagugcuugg cacauagugg gccuucauua aauguuuguu gaauaaaaga 3660 gggaagaagg caagccaacc uuagcuacaa uccuaccuuu ugauaaaaug uuccuuuuga 3720 caauauacac ggauuauuau uuguacuuug uuuuuccaug uguuuugcuu uuauccacug 3780 gcauuuuuag cuccuugaag acauaucaug ugugagauaa cuuccuucac aucucccaug 3840 gucccuagca aaaugcuagg ccuguaguag ucaaggugcu caauaaauau uuguuugggu 3900 gguuugugag ccuugcugcc aaguccugcc uuugggucga cauaguaugg aaguauuuga 3960 gagagagaac cuuuccacuc ccacugccag gauuuuguau ugccaucggg ugccaaauaa 4020 augcucauau uuauuacuga aaaaaaaaaa aaaaaaa 4057 <210> 4 <211> 4057 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 agaggaagag aacgauuuaa ggagcgaaua cuacugguaa acuaau 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gccaacugc ccaagccuac agaacaaacc aaaaauguuc uucauccagg ccugccgugg 960 aggugcuauu ggaucccuug ggcaccuccu ucuguucacu gcugccaccg ccucucuugc 1020 ucuaugagac ugaucguggg guugaccaac aagauggaaa gaaccacgca ggauccccug 1080 ggugcgagga gagugaugcc gguaaagaaa aguugccgaa gaugagacug cccacgcgcu 1140 cagacaugau augcggcuau gccugccuca aagggacugc cgccaugcgg aacaccaaac 1200 gagguuccug guacaucgag gcucuugcuc aaguguuuuc ugagcgggcu ugugauaugc 1260 acguggccga caugcugguu aaggugaacg cacuuaucaa ggaucgggaa gguuaugcuc 1320 cuggcacaga auuccaccgg ugcaaggaga ugucugaaua cugcagcacu cugugccgcc 1380 accucuaccu guucccagga cacccuccca caugauguca ccuccccauc auccacgcca 1440 aguggaagcc acuggaccac aggaggugug auagagccuu ugaucuucag gaugcacggu 1500 uucuguucug cccccucagg gaugugggaa ucucccagac uuguuuccug ugcccaucau 1560 cucugccuuu gaguguggga cuccaggcca gcuccuuuuc ugugaagccc uuugccugua 1620 gagccagccu ugguuggacc uauugccagg aauguuucag cugcaguuga agagccugac 1680 aagugaaguu guaaacacag ugugguuaug gggagagggc auauaaauuc cccauauuug 1740 uguucagu uc cagcuuuugu agauggcacu uuagugauug cuuuuauuac auuaguuaag 1800 augucugaga gaccaucucc uaucuuuuau uucauucaua uccuccgccc uuuuuguccu 1860 agagugagag uuuggaaggu guccaaauuu aauguagaca uuaucuuuug gcucugaaga 1920 agcaaacaug acuagagacg caccuugcug caguguccag aagcggccug ugcguucccu 1980 ucaguacugc agcgccaccc aguggaagga cacucuuggc ucguuugggc ucaaggcacc 2040 gcagccuguc agccaacauu gccuugcauu uguaccuuau ugaucuuugc ccauggaagu 2100 cucaaagauc uuucguuggu uguuucucug agcuuuguua cugaaaugag ccucgugggg 2160 agcaucagag aaggccagga agaauggugu guuucccuag acucuguaac caccucucug 2220 ucuuuuuccu uccugagaaa cguccaucuc ucucccuuac uauucccacu uucauucaau 2280 caaccugcac uucauaucua gauuucuaga aaagcuuccu agcuuaucuc ccugcuucau 2340 aucucucccu ucuuuaccuu cauuucaucc uguuggcugc ugccaccaaa ucugucuaga 2400 auccugcuuu acaggaucau guaaaugcuc aaagauguaa uguaguucuu uguuccugcu 2460 uucucuuuca guauuaaacu cuccuuugau auuauguggc uuuuauuuca gugccauaca 2520 uguuauuguu uucaaccuag aaaccuuuau cccugcuuau cugaaacuuc ccaacuuccc 2580 uguucuuuaa gac uuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuga gacagagucu cgcucugucg 2640 cccaggcugg agggcagugg cacgaucuca gcucacugca agcuccaacu cccggguuca 2700 cgccauucuc cugccucagc cuuccaagua gcugggacua caggugcccg ccaccgugcc 2760 cggcuaauuu uuuuguauuu uuaguagaga caggguuuca ccauguuagc cgggaugguc 2820 uugaucuccu gaccucauga uccacccacc ucagccuccc aaaguguugg gauuacaggc 2880 gugagccacu gcgcccgggc aagaccuuuu uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aacuuccauu 2940 cuuucuuccu ccagucuguu cucacauaac agaguaguuu ugguuuuuaa uuuuuuuugg 3000 uuguuugcug uuuuuuguuu uuuaagguga guucucacua uguuucucag acuggucucg 3060 aacuccuggc cucaagccau cuucccgccu cagccucuca aauagcuggg cuuacaggca 3120 ugagccacca caccuggcca ggauuugguu guuuaaauau aaaucugauc accccccugc 3180 uuagaacccu ucugcuuucu auuaccccuc auuuaaaaug uaaacucuuc accuugguuu 3240 augagaacug guucuugccu uccccuugaa ccucauuaaa uggugauuuc uugcuaagcu 3300 ccagcccgag uggucuccuc ucagcuucua auuuugugcu cuuuccugcc cuuuuccugg 3360 gccuucucag cucuccaccc ccaccacucu ugacucaggu gguguccuuc uuccucaagu 3420 cuugacaauu cccgggccc u ucagucccug agcagucuac uucugugucu gucaccacau 3480 cuugucuuuu ccccucauug cauuuauugc aguuuauaua uaugcuacuu uuacuuguuc 3540 auuucugucu ccccuaccag gcuguaaaug agggcagaaa ccuuguuugu uuuauucacc 3600 aucauguacc aagugcuugg cacauagugg gccuucauua aauguuuguu gaauaaaaga 3660 gggaagaagg caagccaacc uuagcuacaa uccuaccuuu ugauaaaaug uuccuuuuga 3720 caauauacac ggauuauuau uuguacuuug uuuuuccaug uguuuugcuu uuauccacug 3780 gcauuuuuag cuccuugaag acauaucaug ugugagauaa cuuccuucac aucucccaug 3840 gucccuagca aaaugcuagg ccuguaguag ucaaggugcu caauaaauau uuguuugggu 3900 gguuugugag ccuugcugcc aaguccugcc uuugggucga cauaguaugg aaguauuuga 3960 gagagagaac cuuuccacuc ccacugccag gauuuuguau ugccaucggg ugccaaauaa 4020 augcucauau uuauuacuga aaaaaaaaaa aaaaaaa 4057 <210> 5 <211> 1492 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgggcgacag cagggccgcg gugcaguguc cgacccgaga guugcggccu gagucaccgg 60 ccccgcccuc cggagccgga cgcugcggga ggcccgggag cggcagugga accgacuccc 120 agaacuccgg acgugugcgg cgcagugagu cgcagccaug uuccugguua acucguucuu 180 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gau ccugucugca gucacaucuu uguggggccu gcugacccac 1080 aagcuuuugu ucucucagua cuuguuaccc agcuucucaa cauccagggc ccaauuugcc 1140 cugccuggag uucccccugg cucuaggaca cucuaacaag cucuguccac gggucucccc 1200 auucccacca ggcccugcac acacccacuc cguaaccucu ccccuguacc ugugccaagc 1260 cuagcacuug ugaugccucc augccccgag ggcccucucu caguucuggg aggaugacuc 1320 cagucccugc acgcccuggc acacccuuca cgguugcuac ccaggcggcc aagcuccaga 1380 ccgugccaga cccaggugcc ccagugccuu ugucuauauu cugcucccag ccugccaggc 1440 ccaggaggaa auaaacaugc cccaguugcu gaucucuaaa aaaaaaaaaa aa 1492 <210> 6 <211> 1200 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 cgggcgacag cagggccgcg ggcaggccga cccgagaggc ggccgagcac cggccccgcc 60 cccggagccg gacgcgcggg aggcccggga gcggcaggga accgacccca gaacccggac 120 gggcggcgga gcgcagccag ccggaaccgc gaagggcggc ggcggcggcg gcgggggagg 180 cgggggccgg ggggggccgg gaaaggcgga ggccgacagc ggggccgggg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gggggaggcg gcggggcggg gaacggccag cgcaccaggc 300 ggagcacagc gccacagcga ggcggcgcgc agacaacccg gagcccccg 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gcaagcuag acgugggaag aaaaaaucug 840 ggugccuugu cuugugaaac cuugcugcaa gcacagcccu uaugcgguua auuuugaagu 900 gcuguuuauu aaucuuagug uaugauuacu ggccuuuuuc auuuaucuau aauuuaccua 960 agauuacaaa ucagaaguca ucuugcuacc aguauuuaga agccaacuau gauuauuaac 1020 gauguccaac ccgucuggcc caccaggguc cuuuugacac ugcucuaaca gcccuccucu 1080 gcacucccac cugacacacc aggcgcuaau ucaaggaauu ucuuaacuuc uugcuucuuu 1140 cuagaaagag aaacaguugg uaacuuuugu gaauuaggcu guaacuacuu uauaacuaac 1200 auguccugcc uauuaucugu cagcugcaag guacucuggu gagucaccac uucagggcuu 1260 uacuccguaa cagauuuugu uggcauagcu cugggguggg caguuuuuug aaaaugggcu 1320 caaccagaaa agcccaaguu caugcagcug uggcagaguu acaguucugu gguuucaugu 1380 uaguuaccuu auaguuacug uguaauuagu gccacuuaau guauguuacc aaaaauaaau 1440 auaucuaccc cagacuagau guaguauuuu uuguauaauu ggauuuccua auacugucau 1500 ccucaaagaa aguguauugg uuuuuuaaaa aagaaagugu auuuggaaau aaagucagau 1560 ggaaaauuca uuuuuuaaau ucccguuuug ucacuuuuuc ugauaaaaga uggccauauu 1620 accccuuuuc ggccccaugu aucucaguac cccauggagc 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