비가역적으로 억제된 CYP450 마이크로솜, 대사 경로의 효소적 표현형 분석에서의 이의 용도{IRREVERSIBLY INHIBITED CYP450 MICROSOMES, AND USES THEREOF IN ENZYMATIC PHENOTYPING OF METABOLIC PATHWAYS}
본 발명은 신규한 약물의 경우 약물 상호작용의 평가를 위한 생성물 및 방법의 연구 및 개발 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특이적 인간 사이토크롬 P450 (CYP450)에 대해 비가역적으로 억제된 분리된 마이크로솜을 제조하는 방법에 관한 것이고, 마이크로솜은 활성 성분의 대사에 대한 그 효소의 기여도를 정량하는데 이용될 것이다.
약물의 효능 및 독성은 또 다른 화합물: 약물, 환경 오염물질, 식품의 투여에 의해 개질될 수 있다. 이것이 약물 상호작용 (DDI; 약물-약물 상호작용)이다. 상이한 유형의 상호작용 메커니즘이 존재하며, 가장 중요한 것은 약동학 상호작용의 그룹에 속하는 대사 상호작용이다. 대사 약물 상호작용은, 그 중에서도, 약물 A가 B의 대사를 가속화하거나 (활성화 또는 유도) 이를 감소시킴 (억제 또는 저해)에 의해 공동 투여된 약물 B의 대사를 변형시킬 있다는 사실로서 이해된다. 이러한 대사 약물 상호작용은, 새로운 약물에 대한 개발 프로그램에 있어서, 한편으로, 활성 성분의 대사에 관여하는 효소, 및 다른 한편으로, 상기 활성 성분의 가능한 억제제 또는 유도제의 확인을 필요로 할 것이다. 간은 약물의 대사를 위한 주요 부위이다. 간세포는 사이토크롬 P450 (CYP450)을 포함하는, 대사에 필수적인 효소를 함유한다. 따라서, 사이토크롬 P450은 약물 상호작용의 예측에서 주요 표적을 구성한다. 약물 상호작용의 위험성을 예측하기 위해, 활성 성분의 대사에 대한 각 효소의 기여도를 확인하고 결정하는 것이 필요하다; 이것이 효소적 반응의 표현형 분석이다. 활성 성분의 대사에 대한 각 효소의 기여도를 추정하기 위해, 대사 경로를 표현형 분석하는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 특징적인 인간 간 마이크로솜의 뱅크의 사용은 활성 성분의 대사에 관여하는 효소의 식별을 도울 수 있다. 이러한 방법은 인간 간으로부터 수득된 마이크로솜의 적어도 15개 개개 배치로부터 주요 CYP450의 효소적 활성의 사전 특성화를 필요로 한다. 마이크로솜의 15개 배치 각각을 활성 성분과 함께 인큐베이션시켜 그 대사 속도와 그러한 동일한 마이크로솜의 각각의 사이토크롬 P450의 활성 간의 상관관계를 결정한다. 그러나, 마이크로솜 뱅크의 이용은 관여된 효소의 정량적 결정을 허용하지 않아 상관관계가 수행되기 어렵다. 활성 성분의 대사에 대한 각각의 사이토크롬 P450의 상대적 기여도를 추정하기 위해 재조합 효소가 또한 이용된다. 재조합 시스템에서 사이토크롬 P450의 발현 수준은, 종종 천연 인간 간 마이크로솜에 비해 매우 크게 증가하며, 상이하기 때문에, 인간 마이크로솜에 비해 재조합 마이크로솜에서 각각의 CYP450의 기여도를 추론하기 위해 보정 계수를 포함시킬 필요가 있다 (보정 계수 = 상대 활성 인자). 이러한 보정 계수는, 먼저, 천연 인간 마이크로솜의 존재 하에, 및 둘째, 재조합 마이크로솜의 존재 하에 시험되는 각각의 CYP450의 효소적 활성의 실험적 측정에 의해 계산되어야 한다. 이러한 접근법은 선택적 및 반-정량적 방식으로, 활성 성분의 대사에 대한 각각의 효소의 상대적 기여도를 간접적으로 평가할 수 있게 한다. 그러나, 이들의 내재성 특징으로 인해, 이러한 재조합 효소들은 간 마이크로솜에서 발견된 효소와 상이하다 (트렁케이션된 단백질 서열, 상이한 막 환경, 사이토크롬 b5와 P450 간의 상이한 커플링, 다양한 CYP450들 간의 경쟁의 부재). 효소에 대해 유도된 생물학적 억제제, 예컨대 모노클로날 항체가 활성 성분의 대사의 정량적 추정을 위해 활성 성분과 인간 간 마이크로솜 (항체가 없는 대조군에 비해)의 공동-인큐베이션 후에 이용된다. 그러나, 상당한 수의 이용된 항체는 특이성 및 억제력의 부족을 나타낸다. 마지막으로, 이러한 기법은 대사 경로의 표현형 분석에 사용하기에 번거롭다. CYP450의 화학적 억제제는 억제가 전체적이거나 연구되는 효소에 특이적인 경우 활성 성분의 대사의 억제 백분율에 의해 각각의 사이토크롬 P450의 기여도를 직접 결정하는 것을 가능하게 한다. 억제제는 효소에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합될 수 있다. 이들은 활성 성분 및 인간 간 마이크로솜과의 공동-인큐베이션 또는 예비-인큐베이션에 이용된다 (억제제가 없는 대조 조건에 비해) - 활성 성분의 산화성 대사 경로에 대한 생체내 환경의 대표적 모델. 경쟁적-타입 가역적 억제제 (가장 빈번한 유형)와 관련된 억제 수준은 인큐베이션 시간 및 기질 농도와 같은 인큐베이션 조건에 의존적이다. 또한, 표현형 분석 연구에 일반적으로 사용되는 다수의 CYP450 억제제는 단일 CYP450에 비특이적이다 (예컨대, 케토코나졸, 퀘세틴…). 결과적으로, 가역적 억제제는 사이토크롬 P450의 표현형 분석에 적합하지 않다. 그러한 방법의 단점을 해결하기 위해, 불가역적 또는 비가역적 억제제를 이용하여 생체내 조건을 대표하는 강력한 정량적 방법을 수득한다. 억제는 효소가 절대 그 활성을 회복하지 못하므로 비가역적인 것으로 언급된다; "자살" 억제로도 언급된다. 비가역적 억제제는 사이토크롬 P450에 의해 산화되어 효소에 비가역적으로 결합하는 중간 대사산물을 형성한다. 출발 화합물이 억제성은 아니지만 효소에 공유적으로 결합하는 반응성 대사산물로 활성화되기 전에 효소의 적어도 한 촉매적 사이클을 필요로 하므로, 상기 공정은 메커니즘-기반 억제를 나타내는 MBI로 일컬어진다. MBI 억제는 연구되는 사이토크롬 P450의 비가역적 억제를 특징으로 하며 기질의 농도에 의존하지 않는다. 이러한 억제제는 다음 상수를 갖는 일차 동역학에 따른다: k inact 는 최대 효소 불활성화 속도에 해당하고 K I 는 반 최대 불활성화 속도에서의 억제제의 농도에 해당한다. 비가역적 억제제를 이용하여 CYP450의 총 억제를 수득하기 위해서는 여러 조건이 조합되어야 한다: 1) 충분한 농도의 비가역적 억제제 (이의 K I 에 의존적)를 사용하는 것이 필요하다; 2) 이의 k inact 에 따라서, 억제제와 간 마이크로솜의 예비-인큐베이션 기간은 충분한 촉매적 불활성화 사이클이 발생하도록 충분하여야 한다; 3) 예비-인큐베이션 기간은 자살 억제제의 농도가 P450을 완전히 억제하기에 지나치게 낮아질 정도로 자살 억제제의 고갈을 가져와서는 안된다. CYP450의 억제가 전체적이고 특이적인 경우 (다른 P450은 억제되지 않음), 이에 따라 활성 성분의 대사에서 각각의 사이토크롬 P450의 개입을 정량적으로 결정할 수 있다. 그 후 이용된 실험 절차는 다음과 같다: 상기 언급한 장점에도 불구하고, 이러한 실험 절차에 따른 MBI의 이용은 그 이익을 제한하는 일정수의 제약을 갖는다: - 한편으로, 연구된 활성 성분의 인큐베이션 조건은 비가역적 억제제의 예비-인큐베이션을 위한 최적 조건에 의존적이다 (마이크로솜 단백질의 농도, 유기 용매의 백분율). 실제로, 활성 성분의 대사의 억제 백분율을 정확하게 측정하기 위해, 후자는 소위 초기 조건 하에 인큐베이션되어야 한다 (시간 및 단백질 농도의 함수로서 대사 속도의 선형성; 용매 백분율은 일정 수준을 초과하지 않아야 한다). 이러한 선형 실험 절차에서 최대 및 특이적 억제를 수득하기 위해, 억제제 자체는 활성 성분의 인큐베이션에 상용가능한 단백질 또는 용매 농도의 시험관내 조건 하에 사전에 인큐베이션되어야 한다. - 다른 한편으로, 예비-인큐베이션 시간은 약 70 내지 90분의 시험관내 반감기를 갖는 마이크로솜의 CYP450의 효소적 활성을 변동시킨다. 예를 들어, 최대 26%의 CYP2D6 효소적 활성의 손실이 30분 동안의 예비-인큐베이션의 경우에 관찰되고, 40분의 예비-인큐베이션 동안 최대 35% 및 60분의 예비-인큐베이션 동안 46%의 효소적 활성 손실이 관찰된다. 결과적으로, 연속 순서의 MBI의 예비-인큐베이션 및 실험 절차에 부과된 약물 후보의 인큐베이션의 지속은 이에 따라 마이크로솜의 CYP450의 시험관내 반감기와 양립될 수 없다. - 마지막으로, 하나의 CYP450에 대한 비가역적 억제제가 또한 하나 이상의 CYP450에 대해 가역적 억제를 나타내는 것이 종종 사실이다 (예를 들어, CYP1A2의 MBI 억제제는 또한 CYP2C19의 경쟁적 억제제이고, CYP2B6의 MBI 억제제는 또한 CYP2A6 및 3A4의 경쟁적 억제제이다). 따라서 상기 선형 실험 절차는, 시험관내 표현형 분석 연구를 위해, 다른 CYP450에 대해 경쟁적으로 작용할 수 있는 남아 있는 자유 억제제 부분을 만족스럽게 제거할 수 없다. 예비-인큐베이션액의 희석으로 자유 억제제의 농도를 감소시켜, 덜 비특이적인 가역적 억제를 발생시킬 수 있으나, 이는, 사실상, 인큐베이션 동안 활성 성분의 대사가 검출하기에 지나치게 낮을 그러한 방식으로 마이크로솜 단백질의 농도를 감소시킬 것이다. 결과적으로, 한편으로 활성 성분에 대한 인큐베이션 조건과 양립할 수 있는, 다른 한편으로 비가역적 억제제에 대한 인큐베이션 조건을 만드는 것이 곤란하여, 그 선형 실험 절차를 이용하는 것이 거의 불가능하다. 또한, 상기 선형 실험 절차의 경우에, 억제제의 효과를 검증하기 위해 양성 대조군으로서 시험되는 CYP450의 특이적 기질을 이용한 두 시리즈의 추가적인 인큐베이션 (비가역적 억제제의 유무)을 추가할 필요가 있다. 따라서, 이는 활성 성분 뿐만 아니라 특이적 기질의 전체가 정량될 것을 요구하는데, 이는 존재하는 많은 CYP450에 대해 시험되어야 하는 것이 사실이므로, 실험을 훨씬 번거롭게 만든다. 활성 성분의 대사에 관여하는 효소적 반응을 표현형 분석하는 방법의 개개 단점에 비추어, 효소적 반응의 상기 표현형 분석의 시험관내 연구는 종래 기재된 다양한 방법의 단점이 극복될 것을 요구한다.
따라서, 본 발명의 목적은 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜을 이용하여 활성 성분의 대사에 관여하는 효소적 반응의 표현형 분석 연구를 구현함에 있어서 고유의 문제를 극복할 수 있게 하는 대안적인 전략을 제안하는 것이다. 본 발명은, - 사이토크롬 P450을 비가역적 억제시키는 단계; - 마이크로솜 단백질을 농축시키는 단계를 포함하여, 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450 (CYP450)을 지니는 분리된 마이크로솜을 제조하는 방법에 관한 것이다. 불가역적 억제제, 비가역적 억제제, MBI 억제제, 비가역적 억제 또는 자살 억제는 효소에 공유적으로 결합할 수 있는 억제제를 의미하는 것으로 이해되고; 그렇게 억제된 효소는 이의 초기 기능적 활성을 회복할 수 없다. 보다 특히, MBI (메커니즘 기반 억제) 억제제는 효소와 직접 비가역적 결합을 형성하는 것이 아니라 오히려 이의 반응성 중간 대사산물 중 하나가 효소에 공유적으로 결합한다. 본 발명에 따른 농축의 목적은, 한편으로, 제조물에 존재하는 다른 생성물로부터 마이크로솜 단백질, 특히 자유롭게 남아 있는 과량의 비가역적 억제제 및 용매를 여과하고, 다른 한편으로, 예비-인큐베이션 단계에 의해 희석된 마이크로솜을 농축시키는 것이다. 본 발명에 따른 마이크로솜 단백질의 농축은 여과에 이어 원심분리에 의해 달성될 수 있다. 농축 단계에서의 여과 기능은 10,000 달톤 내지 40,000 달톤, 바람직하게는 30,000 달톤의 컷오프 역치를 갖는 막에서 출발하여 수득된다. 농축 단계의 농축 기능은 농축을 가능하게 하는 시스템, 예를 들어, 3000 g 내지 4000 g에서 60 내지 90분 동안, 바람직하게는 80분 동안 원심분리되는 Centricon® 시스템에 의해 수행된다. 상기 단계의 끝에, Centricon®을 거꾸로 하여 800 내지 1000 g에서 2 내지 10분 동안, 바람직하게는 5분 동안 원심분리한다. 마이크로솜 단백질의 분리 및 농축을 개선시키기 위해, 80,000 g 내지 150,000 g에서 약 60분 동안의 조건 하에 추가적인 초원심분리 단계가 수행될 수 있다 마이크로솜 단백질의 농축은 또한 상기 기재된 순서를 적어도 2회 반복함에 의해 개선될 수 있다: 여과에 이어 농축. 본 발명에 따른 마이크로솜 단백질의 농축 단계는 또한 연속적인 초원심분리에 의해 달성될 수 있다. 적어도 2회의 연속적인 초원심분리는 80,000 g 내지 150,000 g에서 60 내지 90분 동안의 조건이 필요하다. 본 발명은 1회 이상의 세척 단계가 추가된 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 마이크로솜 단백질의 농축 단계 전에 및/또는 후에 배치되는 세척 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다: - 사이토크롬 P450을 비가역적 억제시키는 단계; - 세척 단계; - 마이크로솜 단백질의 농축 단계; - 마이크로솜 단백질의 세척 단계. 본 발명에 따른 방법은 또한 하기 단계: - 사이토크롬 P450을 비가역적 억제시키는 단계; - 마이크로솜 단백질의 농축 단계; - 마이크로솜 단백질의 세척 단계; 또는 하기 단계를 포함할 수 있다: - 사이토크롬 P450을 비가역적 억제시키는 단계; - 세척 단계; - 마이크로솜 단백질의 농축 단계. 세척은 비-마이크로솜 분획을 세정하고 제거하는 단계를 의미하는 것으로 이해된다. 세척 단계는 또한 Tris HCl 완충제 pH 7.4에 마이크로솜 농축물을 용해시키는 것으로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜을 제조하는 방법의 끝에, 마이크로솜은 10 mg/ml 내지 30 mg/ml, 보다 특히 17 mg/ml 내지 25 mg/ml, 및 바람직하게는 20 mg/ml의 농도이고, 마이크로솜 단백질은 5 내지 15배만큼 농축되었다. 본 발명에 따른 분리된 불활성화된 마이크로솜을 제조하는 방법은 마이크로솜을 보존하는 최종 단계를 포함한다. 마이크로솜의 보존 단계는 바람직하게는 임의의 생물학적 단계를 중단시키기 위해, 동결보호성 용액의 존재 - 또는 부재 하에, 분리되고 정제된 마이크로솜을 매우 낮은 온도 (약 196℃)로 냉각시키는 것으로 구성된 냉동보존 단계로 구성된다. 이러한 보존 단계의 목적은 본 발명에 따른 불활성화되고 분리된 마이크로솜의 즉석 사용을 용이하게 하는 것이다. 이러한 분리된 마이크로솜의 이용은 이들을 제조한 지 수 일 내지 수 개월 후에 일어날 수 있다. 보존 단계는 어떤 방식으로든 마이크로솜의 구조적 및 기능적 속성을 변경시키지 않는다. 바람직하게는, 보존 단계는 동결 단계이다. 비가역적으로 억제되고 분리된 마이크로솜의 동결은 -80℃에서 수행된다. 제조 방법의 과정 중에 이용된 마이크로솜은 인간, 랫트, 마우스, 돼지 또는 원숭이 간 마이크로솜이다. 마이크로솜은 바람직하게는 모든 P450 효소를 함유하는 인간 간으로부터 수득된다. 개체간 가변성을 설명하기 위해 마이크로솜은 여러 공여체로부터 수득되어 마이크로솜의 풀을 형성한다. 사이토크롬 P450은 18개 서브패밀리 (CYP1, CYP2, CYP3, CYP4, CYP5, CYP7, CYP8, CYP11, CYP17, CYP19, CYP20, CYP21, CYP24, CYP26, CYP27, CYP39, CYP46, CYP51)로 구성된 동종효소의 거대 패밀리이다. 본 발명은 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450이 사이토크롬 패밀리 CYP1, CYP2, CYP3 및 CYP4로부터 선택되는 분리된 마이크로솜을 제조하는 방법에 관한 것이다. 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450은 CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5 및 CYP4F2로부터 선택된다. 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450은 바람직하게는 CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 및 CYP3A4로부터 선택된다. 본 발명에 따른 마이크로솜을 제조하는 방법에 이용된 비가역적 억제제 중에서, 예시를 위해 비제한적으로 다음이 언급될 수 있다: 본 발명은 또한 그 자체가 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450을 포함하는 분리된 마이크로솜에 관한 것이다. 본 발명에 따른 분리된 마이크로솜은 사이토크롬 패밀리 CYP1, CYP2, CYP3 및 CYP4로부터 선택되는 비가역적으로 억제된 사이토크롬을 포함한다. 본 발명은 하기 목록으로부터 선택되는 사이토크롬: CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5 및 CYP4F2이 비가역적으로 억제된 분리된 마이크로솜에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 하기 목록으로부터 선택되는 사이토크롬: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 및 CYP3A4이 비가역적으로 억제된 분리된 마이크로솜에 관한 것이다. 본 발명에 따른 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜은 바람직하게는 저온보존되거나 동결보호된다. 본 발명은 또한 해동 후 즉석 사용을 위한 동결된 형태의 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜에 관한 것이다. 분리된 마이크로솜은 본 특허 출원에 기재된 제조 방법에 따라 수득된다. 본 발명은 평가되는 활성 성분의 대사에 관여하는 효소적 반응의 표현형 분석에서의 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 활성 성분의 대사에 관여하는 효소적 반응을 표현형 분석하는 방법에 관한 것이다. 이러한 표현형 분석 방법은, - 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜을 평가되는 활성 성분과 함께 인큐베이션시키는 단계; - 활성 성분의 대사에 관여하는 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450의 기여도를 측정하는 단계를 포함한다. 인큐베이션은 활성 성분의 존재 하에, 한편으로, 본 발명에 따른 분리된 비가역적으로 억제된 간 마이크로솜 및, 다른 한편으로, 본 발명에 따라 제조된 억제되지 않은 분리된 간 마이크로솜 (대조군)으로 수행된다. 인큐베이션은 최종 인큐베이션 시점 또는 여러 인큐베이션 시점으로 일컬어지는 동역학 방식으로 모니터된다. 각 인큐베이션 시점에, 활성 성분 및/또는 대사산물을 정량한다. 활성 성분의 대사 활성 (A)은 내재성 대사 제거를 통해 (동역학 측정의 경우) 또는 변화하지 않은 활성 성분의 소실 또는 대사산물의 출현 속도를 통해 (최종 인큐베이션 시점이 선택되었다면) 억제되고 (활성 Ai) 억제되지 않은 (활성 A의 대조군) 두 조건하에 측정된다. 활성 성분의 대사 활성의 억제 백분율은 다음과 같이 계산된다: 억제 백분율 = (A-Ai)/A. 계산된 억제 백분율은 활성 성분의 대사에 관여하는 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450의 기여도에 직접 부합한다. 마지막으로, 본 발명은 - 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜; - 대조 마이크로솜을 포함하는 표현형 분석 키트에 관한 것이다. 대조 마이크로솜은 비가역적 억제제의 부재 하에 본 발명에 따른 제조 방법으로 처리된 마이크로솜인 것으로 이해된다. 바람직하게는, 표현형 분석 키트는, 한편으로, 비가역적으로 억제되고 저온보존된 분리된 마이크로솜 및, 다른 한편으로, 역시 저온보존될 수 있는 대조 마이크로솜을 포함한다. 본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 예시되며 이에 의해 제한되지 않는다.
도 1: 비가역적으로 억제된 CYP1A2 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 활성의 억제 백분율.
각각의 CYP450에 대해 연구된 특이적 활성은 페나세틴-O-데아세틸라제 (CYP1A2, 4.5 μM의 페나세틴의 인큐베이션), 쿠마린-7-하이드록실라제 (CYP2A6, 2 μM의 쿠마린의 인큐베이션), 부프로피온-하이드록실라제 (2B6, 50 μM의 부프로피온의 인큐베이션), 파클리탁셀-6α-하이드록실라제 (2C8, 4 μM의 파클리탁셀의 인큐베이션), 디클로페낙-4'-하이드록실라제 (2C9, 4 μM의 디클로페낙의 인큐베이션), 오메프라졸-5-하이드록실라제 (2C19, 5 μM의 오메프라졸의 인큐베이션), 덱스트로메토르판-O-데메틸라제 (2D6, 5 μM의 덱스트로메토르판의 인큐베이션), 클로르족사존-6-하이드록실라제 (2E1, 40 μM의 클로르족사존의 인큐베이션) 및 테스토스테론-6ß-하이드록실라제, 미다졸람-1'-하이드록실라제 및 니페디핀-환원효소 (3A4, 30 μM의 테스토스테론, 0.5 μM의 미다졸람, 10 μM의 니페디핀의 인큐베이션)의 활성에 해당한다. 억제 백분율은 퓨라필린에 의해 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 대조 마이크로솜에 대한 P450 활성의 비교에 의해 수득된다.
도 2: 인간 간의 마이크로솜 및 CYP1A2에 대한 재조합 마이크로솜에 대한 5 μM 및 10 μM의 퓨라필린의 영향.
도 3: 비가역적으로 억제된 CYP3A4 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 활성의 억제 백분율.
각각의 CYP450에 대해 연구된 특이적 활성은 도 1에 기재된 것들에 해당한다. 억제 백분율은 아자뮬린에 의해 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 대조 마이크로솜에 대한 P450 활성의 비교에 의해 수득된다.
도 4: CYP3A4 및 CYP3A5에 의한 니페디핀 및 미다졸람의 대사 (재조합 마이크로솜).
도 5: 비가역적으로 억제된 CYP3A4 마이크로솜에서 Km 및 Vmax의 미다졸람 활성의 억제 백분율.
도 6: 비가역적으로 억제된 CYP2C8 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 활성의 억제 백분율.
각각의 CYP450에 대해 연구된 특이적 활성은 아모디아퀸 하이드록실라제 (2C8, 0.5 μM의 아모디아퀸의 인큐베이션)가 첨가된 도 1에 기재된 것에 부합한다. 억제 백분율은 겜피브로질 글루쿠로나이드에 의해 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 대조 마이크로솜에 대한 P450 활성의 비교에 의해 수득된다.
도 7: 비가역적으로 억제된 CYP2C8 마이크로솜에서, 아모디아퀸 하이드록실화의 2C8-의존적 반응의 Km 및 Vmax에 해당하는 농도에서 인큐베이션된 아모디아퀸의 활성의 억제 백분율.
도 8: 비가역적으로 억제된 CYP2C9 마이크로솜에서, 디클로페낙-4'-하이드록실화의 2C9-의존적 반응의 Km 및 Vmax에 해당하는 농도에서 인큐베이션된 디클로페낙의 활성의 억제 백분율.
도 9: 비가역적으로 억제된 CYP2C9 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 활성의 억제 백분율.
각각의 CYP450에 대해 연구된 특이적 활성은 도 1에 기재된 것에 부합한다. 억제 백분율은 티에닐산에 의해 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 대조 마이크로솜에 대한 P450 활성의 비교에 의해 수득된다.
도 10: 비가역적으로 억제된 CYP2D6 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 활성의 억제 백분율. 각각의 CYP450에 대해 연구된 특이적 활성은 도 1에 기재된 것에 부합한다. 억제 백분율은 파록세틴에 의해 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 대조 마이크로솜에 대한 P450 활성의 비교에 의해 수득된다.
도 11: 비가역적으로 억제된 CYP2B6 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 활성의 억제 백분율.
각각의 CYP450에 대해 연구된 특이적 활성은 페나세틴-O-데아세틸라제 (CYP1A2, 200 μM의 페나세틴의 인큐베이션), 쿠마린-7-하이드록실라제 (CYP2A6, 20 μM의 쿠마린의 인큐베이션), 부프로피온-하이드록실라제 (2B6, 100 μM의 부프로피온의 인큐베이션), 아모디아퀸-데에틸라제 (2C8, 20 μM의 아모디아퀸의 인큐베이션), 디클로페낙-4'-하이드록실라제 (2C9, 200 μM의 디클로페낙의 인큐베이션), S-메페니토인-하이드록실라제 (2C19, 60 μM의 S-메페니토인의 인큐베이션), 덱스트로메토르판-O-데메틸라제 (2D6, 100 μM의 덱스트로메토르판의 인큐베이션), 클로르족사존-6-하이드록실라제 (2E1, 200 μM의 클로르족사존의 인큐베이션) 및 테스토스테론-6ß-하이드록실라제, 미다졸람-1'-하이드록실라제 및 니페디핀-환원효소 (3A4, 75 μM의 테스토스테론, 50 μM의 미다졸람, 50 μM의 니페디핀의 인큐베이션)의 활성에 해당한다.
억제 백분율은 티오TEPA에 의해 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 대조 마이크로솜에 대한 P450 활성의 비교에 의해 수득된다.
도 12: -80℃에서 상이한 저장 시간의 함수로서 CYP1A2 활성의 억제 백분율.
도 13: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 CYP1A2 (A), 3A4 (B), 2D6 (C) 및 이들의 대조군 (n=3)의 존재 하에 미르타자핀의 소실 동역학.
도 14: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 미르타자핀의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 15: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 3A4 (A) 및 2C8 (B) 각각 및 이들의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 로페라미드의 소실 동역학.
도 16: 분리된 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 로페라미드의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 17: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 2B6 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 부프로피온의 소실 동역학.
도 18: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 부프로피온의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 19: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 2C9 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 이부프로펜의 소실 동역학.
도 20: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 이부프로펜의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 21: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 2C9 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 셀로콕시브의 소실 동역학.
도 22: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 셀로콕시브의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 23: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 2C8 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 피오글리타존의 소실 동역학.
도 24: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 피오글리타존의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 25: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 3A4 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 보르테조밉의 소실 동역학.
도 26: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 보르테조밉의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 27: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 2C8 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 레파글리니드의 소실 동역학.
도 28: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 레파글리니드의 내재성 제거의 억제 백분율.
도 29: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜 2B6 및 이의 상응하는 대조군 (n = 3)의 존재 하에 세르트랄린의 소실 동역학.
도 30: 분리된, 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트의 존재 하에 이들의 상응하는 대조군에 비해 세르트랄린의 내재성 제거의 억제 백분율.
실시예 1: 분리된 비가역적으로 불활성화된 마이크로솜의 제조 · 생물학적 재료 마이크로솜은 모든 P450 효소를 함유하는 인간 간으로부터 수득되었다. 이들은 개체간 가변성을 설명하기 위해 여러 공여체로부터 수득되므로 마이크로솜의 풀에서 비롯된다. · 마이크로솜의 인큐베이션 비가역적으로 억제된 마이크로솜 배치의 각각의 제조를 위해, 비가역적 억제제가 동등한 부피의 용매로 대체된 차이를 지닌 대조 배치를 동일한 조건 하에 제조하였다. 연구되는 사이토크롬 P450의 비가역적 억제제 (또는 대조 배치를 위해 용매)를 Tris/HCl 완충제 pH 7.4 및 MgCl 2 에서 37℃에서 마이크로솜과 함께 교반시키며 인큐베이션시켰다. 제조물을 일반적으로 5 내지 10분 동안 예열한 후에 NADPH를 첨가하여 효소적 반응을 시작하였다. 시점 t에, 농축 단계를 진행하기 수 분 전에 반응 혼합물을 얼음에 두었다. 마이크로솜을 비가역적 억제제와 인큐베이션하는 동안 공유 결합에 의해 연결된 효소/억제제 복합체가 형성되었다. 연구되는 사이토크롬 P450은 비가역적인, 전체적 및 특이적 방식으로 억제되었다. · 비가역적으로 탈활성화된 마이크로솜의 여과 및 농축 마이크로솜과 연구되는 사이토크롬 P450의 비가역적 억제제의 인큐베이션으로부터 수득된 샘플을 여과시켰다. 이러한 단백질 여과 단계는 10,000 내지 40,000 달톤의 컷오프 역치를 갖는 막을 이용하여 수행될 수 있다. Centricon® 시스템을 이용하여 이러한 여과 단계를 수행하였다. 1회 이상의 세척 단계가 자유롭게 남아 있는 비가역적 억제제의 제거를 촉진시키기 위해 때로 필요하다. 샘플을 3000 g 내지 4000 g에서 80분 동안, 이어서 800 내지 1000 g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 마이크로솜 단백질의 농축을 최적화하기 위해 샘플을 연속하는 원심분리로 처리할 수 있다. 적절한 경우, 마이크로솜의 농축된 샘플을 그 후 초원심분리시켜 단백질의 농축을 추가로 개선시켰다. 초원심분리는 4시간 동안 80,000 g 내지 45분 동안 150,000 g의 조건 범위 하에, 바람직하게는 1시간 동안 100,000 g에서 수행된다. 단백질 농축물을 Tris/HCl 완충제 pH 7.4에 용해시킨 다음 분취시키고, -80℃에서 동결시켰다. 이러한 제조의 끝에, 활성 성분의 대사에 관여하는 효소적 반응의 표현형 분석에 즉시 사용될 수 있는 분리된 비가역적으로 불활성화된 마이크로솜이 수득되었다. 실시예 2: 주요 사이토크롬 P450의 억제 및 사이토크롬 P450의 특이적 기질에 대한 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 검증의 조건 ㆍ CYP1A2 퓨라필린은 사이토크롬 CYP1A2의 MBI 억제제 중 하나이다. CYP1A2에 대한 퓨라필린에 의한 최대 MBI 억제를 위한 실험 조건은 하기와같다: - 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질; - 10 μM의 퓨라필린; - 30분의 예비-인큐베이션 시간. 상기 조건하에 사전 억제된 마이크로솜과 CYP1A2의 특이적 기질인 페나세틴 4.5 μM (이의 Km과 동일하거나 이보다 미만인 농도)의 인큐베이션 후, 페나세틴 데아세틸라제 활성 (CYP1A1-/CYP1A2-의존적)의 억제 백분율은 83%이었다 (도 1). 나머지 17% 대사는 CYP1A1과 연관된 잔여 페나세틴 데아세틸라제 활성으로 인한 것이며, CYP1A2의 억제의 결여로 인한 것이 아님이 주지되어야 한다. 실제로, 불포화된 조건 (< 5 μM) 하에서 인큐베이션된 페나세틴은 CYP1A2에 의해 그리고 부분적으로, CYP1A1에 의해 대부분 대사되는 것으로 공지되어 있다. 인간 재조합 CYP1A2와 30분 동안 예비인큐베이션된 5 μM 내지 10 μM의 퓨라필린은 페나세틴의 전적인 CYP1A2 활성의 약 100% 억제를 야기하여, 선택된 조건하에서 이의 최대 억제력을 입증한다 (도 2). 페나세틴이 상기 조건하에 제조된 대조군 배치 및 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 존재하에 CYP1A2에 대한 이의 Km보다 훨씬 더욱 높은 농도로 인큐베이션되는 경우, 페나세틴 데아세틸라제 활성 (CYP1A1-/CYP1A2- 의존적)의 억제 백분율은 여전히 약 80%이다. 이러한 결과는, 퓨라필린에 의한 CYP1A2의 억제가 과량의 기질에 의해 영향을 받지 않으며, 경쟁적-타입 억제가 검출가능하지 않음을 입증한다. 기타 주요 CYP450 (CYP2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 및 3A4)의 특이적 기질을 퓨라필린의 특이성을 입증하기 위해, 상기 규정된 대조군 배치 및 퓨라필린에 의한 비가역적으로 억제된 인간 간의 배치의 존재하에 인큐베이션하였다. 기타 주요 CYP450의 활성이 변화되지 않은 채 유지됨이 관찰되었다. 전체적인 이들 결과는, 본 발명에 따른 CYP1A2에 있어서 분리되고 비가역적으로 및 특이적으로 억제된 마이크로솜이 활성 성분 또는 약물 후보의 대사에 대한 CYP1A2의 기여를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. ㆍ CYP3A4 아자뮬린은 사이토크롬 CYP3A4의 MBI 억제제 중 하나이다. CYP3A4의 존재하에 아자뮬린에 의한 최대 MBI 억제를 위한 실험 조건은 하기와같다: - 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질; - 5 μM의 아자뮬린; - 15분의 예비-인큐베이션 시간. 상기 상세한 조건하에 제조된 대조군 배치 및 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 존재하에 CYP3A4의 특이적 기질들인 미다졸람 0.5 μM, 테스토스테론 30 μM 및 니페디핀 10 μM (기질의 Km과 동일하거나 이보다 미만인 농도)의 인큐베이션 후, 미다졸람-1'-하이드록실라제, 테스토스테론-6ß-하이드록실라제 및 니페디핀-환원효소 (CYP3A4-/CYP3A5-의존적) 활성의 억제 백분율은 각각 81%, 96% 및 83%이었다 (도 3). 나머지 19%, 4% 및 17% 대사는 CYP3A5 활성으로 인한 것이며, CYP3A4의 억제의 결여로 인한 것이 아님이 주지되어야 한다. 실제로, 상기 3개의 특이적 기질 (및 더욱 특히, 니페디핀 및 미다졸람)이 CYP3A4에 의해 주로 대사되나, 또한 CYP3A5에 의해서도 대사됨이 공지되어 있다. 도 4는 특히 재조합 마이크로솜 (박토솜) CYP3A4 및 CYP3A5에 의한 니페디핀의 대사를 보여준다. 인간 재조합 CYP3A4와 15분 동안 예비-인큐베이션된 5 μM의 아자뮬린은 미다졸람의 전적인 CYP3A4 활성의 약 92% 억제를 야기하며, 이는 선택된 조건하에서의 이의 최대 억제력을 입증한다. CYP3A4의 특이적 기질 (미다졸람의 예를 이용함)을 CYP3A4에 대한 이들의 Km보다 훨씬 더욱 높은 농도로 본 발명에 따라 사전 제조된 마이크로솜과 인큐베이션하는 경우, CYP3A4-의존적 활성의 억제 백분율은 변화되지 않은 채 유지되었다 (도 5). 이러한 결과는, 아자뮬린에 의한 CYP3A4의 억제가 과량의 기질에 의해 영향을 받지 않으며, 경쟁적-타입 억제가 검출가능하지 않음을 입증한다. 기타 주요 CYP450 (CYP1A2, CYP2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 및 2E1)의 특이적 기질을 아자뮬린의 특이성을 입증하기 위해 상기 규정된 조건 하의 대조군 배치 및 아자뮬린에 의한 비가역적으로 억제된 인간 간 마이크로솜의 배치의 존재하에 인큐베이션하였다. 도 3은 기타 주요 CYP450의 활성이 비가역적으로 억제된 인간 마이크로솜의 배치와 대조군 배치 간에 변화되지 않은 채 유지됨을 보여주며, 이는 아자뮬린이 실제로 CYP3A4 활성에 대해 특이점임을 입증한다. 전체적인 이들 결과는, 본 발명에 따른 CYP3A4에 있어서 분리되고 비가역적으로 및 특이적으로 억제된 마이크로솜이 활성 성분 또는 약물 후보의 대사에 대한 CYP3A4의 기여를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. ㆍ CYP2C8 겜피브로질 글루쿠로나이드는 사이토크롬 CYP2C8의 MBI 억제제 중 하나이다. CYP2C8의 존재하에 겜피브로질 글루쿠로나이드에 의한 최대 MBI 억제를 위한 실험 조건은 하기와같다: - 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질; - 30 μM의 겜피브로질 글루쿠로나이드; - 30분의 예비-인큐베이션 시간. 본 발명에 따라 제조된 대조군 배치 및 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 존재하의 CYP2C8의 특이적 기질들인 아모디아퀸 0.5 μM 또는 파클리탁셀 4 μM (CYP2C8의 2 기질의 Km과 동일하거나 이보다 미만인 농도)의 인큐베이션 후, 아모디아퀸 (CYP2C8) 및 파클리탁셀-하이드록실라제 (CYP2C8-의존적) 활성의 억제 백분율은 각각 88% 및 100%이었다 (도 6). 아모디아퀸이 CYP2C8에 대한 이의 Km보다 훨씬 더욱 높은 농도로 상기 기술된 것과 동일한 조건하에 인큐베이션되는 경우, 아모디아퀸 하이드록실라제 활성의 억제 백분율은 변화되지 않은 채 유지되었다 (도 7). 이러한 결과는, 아모디아퀸에 의한 CYP2C8의 억제가 과량의 기질에 의해 영향을 받지 않으며, 경쟁적-타입 억제가 검출가능하지 않음을 입증한다. 기타 주요 CYP450의 특이적 기질을 겜피브로질 글루쿠로나이드의 특이성을 입증하기 위해 상기 규정된 조건하에 인큐베이션하였다. 도 6은, 기타 주요 CYP450의 활성이 비가역적으로 억제된 인간 마이크로솜의 배치와 대조군 배치 간에 CYP2C19의 약간의 억제를 제외하고는 변화되지 않은 채 유지됨을 보여주며, 이는 겜피브로질 글루쿠로나이드가 실제로 CYP2C8 활성에 대해 특이점임을 입증한다. 전체적인 이들 결과는, 본 발명에 따른 CYP2C8에 있어서 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜이 활성 성분 또는 약물 후보의 대사에 대한 CYP2C8의 기여를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. ㆍ CYP2C9 티에닐산은 사이토크롬 CYP2C9의 MBI 억제제 중 하나이다. CYP2C9의 존재하에 티에닐산에 의한 최대 MBI 억제를 위한 실험 조건은 하기와같다: - 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질; - 10 μM의 티에닐산; - 20분의 예비-인큐베이션 시간. 본 발명에 따라 제조된 대조군 배치 및 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 존재하의 CYP2C9의 특이적 기질인 디클로페낙 4 μM (CYP2C9에 대한 기질의 Km과 동일하거나 이보다 미만인 농도) 및 100 μM (CYP2C9에 대한 이의 Km보다 훨씬 더욱 높은 농도)의 인큐베이션 후, 디클로페낙 하이드록실라제 (CYP2C9-의존적) 활성의 억제가 각각 거의 전체 또는 92% 및 88% 억제였다 (도 8). 이러한 결과는, CYP2C9 억제가 전체 억제임을 입증할 뿐만 아니라, 과량의 기질에 의해 영향을 받지 않으며, 경쟁적-타입 억제가 검출가능하지 않음을 입증한다. 기타 주요 CYP450의 특이적 기질을 티에닐산의 특이성을 입증하기 위해 상기 규정된 조건하에 인큐베이션하였다. 도 9는 기타 주요 CYP450의 활성이 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 배치와 대조군 배치 간에 변화되지 않은 채 유지됨을 보여주며, 이는 티에닐산이 실제로 CYP2C9 활성에 대해 특이적임을 입증한다. 전체적인 이들 결과는 본 발명에 따른 CYP2C9에 있어서 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜이 활성 성분 또는 약물 후보의 대사에 대한 CYP2C9의 기여를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. ㆍ CYP2D6 파록세틴은 사이토크롬 CYP2D6의 MBI 억제제 중 하나이다. CYP2D6의 존재하에 파록세틴에 의한 최대 MBI 억제를 위한 실험 조건은 하기와같다: - 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질; - 50 μM의 파록세틴; - 30분의 예비-인큐베이션 시간. 본 발명에 따라 제조된 대조군 배치 및 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 존재하의 CYP2D6의 특이적 기질인 5 μM (기질의 Km과 동일하거나 이보다 미만인 농도) 및 50 μM (CYP2D6에 대한 이의 Km보다 훨씬 더욱 높은 농도)의 덱스트로메토르판의 인큐베이션 후, 덱스트로메토르판-O-데메틸라제 (CYP2D6-의존적) 활성의 억제는 거의 전체 또는 96% 억제였다 (도 10). 이러한 결과는, CYP2D6의 억제가 전체 억제이며, 과량의 기질에 의해 영향을 받지 않으며, 경쟁적-타입 억제가 검출가능하지 않음을 입증한다. 기타 주요 CYP450의 특이적 기질을 파록세틴의 특이성을 입증하기 위해 상기 규정된 조건하에 인큐베이션하였다. 도 10은, 모든 기타 주요 CYP450 활성 중에, CYP2D6에 더하여 단지 CYP2B6의 부프로피온 하이드록실라제-의존적 활성이 91% 억제됨을 보여주며, 이는 파록세틴이 CYP2D6 활성에 대해 완전히 특이적이지는 않음을 보여준다. 전체적인 이들 결과는 본 발명에 따라 제조된 마이크로솜이 CYP2D6 활성을 전체적으로 및 거의 특이적으로 억제 가능하게 함을 보여준다. 따라서, 이들은 새로운 약물 후보의 대사에 대한 CYP2D6/CYP2B6의 기여를 측정하는데 사용될 수 있음을 보여준다. ㆍ CYP2B6 티오TEPA는 사이토크롬 CYP2B6의 MBI 억제제 중 하나이다. CYP2B6의 존재하에 티오TEPA에 의한 최대 MBI 억제를 위한 실험 조건은 하기와 같다: - 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질; - 15 μM의 티오TEPA; - 30분의 예비-인큐베이션 시간. 본 발명에 따라 제조된 대조군 배치 및 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 존재하에 CYP2B6의 특이적 기질인 부프로피온 100μM의 인큐베이션 후, 부프로피온 하이드록실라제 (CYP2B6-의존적) 활성의 억제가 거의 전체 또는 92% 억제였다 (도 11). 이러한 결과는 CYP2B6의 억제가 전체 억제이며, 과량의 기질에 의해 영향을 받지 않으며, 경쟁적-타입 억제가 검출가능하지 않음을 입증한다. 기타 주요 CYP450의 특이적 기질을 티오TEPA의 특이성을 입증하기 위해 상기 규정된 조건하에 인큐베이션하였다. 도 11은 모든 기타 주요 CYP450 활성 중에, CYP2B6에 더하여 단지 CYP2A6의 쿠마린 하이드록실라제-의존적 활성이 64% 억제됨을 보여주며, 이는 티오TEPA가 CYP2B6 활성에 대해 완전히 특이적이지는 않음을 보여준다. 전체적인 이들 결과는 본 발명에 따라 제조된 마이크로솜이 CYP2B6 활성을 전체적으로 및 거의 특이적으로 억제 가능하게 함을 보여준다. 따라서, 이들은 새로운 약물 후보의 대사에 대한 CYP2B6/CYP2A6의 기여를 측정하는데 사용될 수 있다. 실시예 3: 분리되고, 비가역적으로 억제되고 동결에 의해 보존된 마이크로솜에서 사이토크롬 P450의 억제의 안정성 본 발명에 따라 농축되고 -80℃에서 보존된, CYP1A2에 있어서 비가역적으로 억제된, 분리된 인간 간 마이크로솜 1 mg/mL을 CYP1A2의 특이적 기질인 페나세틴 (4.5 μM)과 15분 동안 인큐베이션하였다. 억제 백분율을 본 발명에 따라 수득된 마이크로솜에 대해 측정하고 48시간, 한달 및 한달 반 동안 -80℃에서 저장하였다 (도 12). 농축 및 동결/해동 단계가 퓨라필린에 의한 CYP1A2의 MBI 억제에 영향을 끼치지 않음이 관찰되었다. 동결 및 해동 단계는 사이토크롬 P450의 비가역적 억제의 안정성에 영향을 끼치지 않았다. 실시예 4: 제노바이오틱스의 대사 경로의 효소적 표현형 분석을 위한 비가역적으로 억제된, 분리된 마이크로솜의 키트 9개 활성 성분 (미르타자핀, 로페라미드, 부프로피온, 이부프로펜, 셀로콕시브, 피오글리타존, 보르테조밉, 레파글리니드, 세르트랄린)을 상기 9개 제노바이오틱스의 대사 경로의 효소적 표현형 분석을 위해 본 발명에 따른 비가역적으로 억제된 분리된 마이크로솜의 키트에서 평가하였다. 9개 활성 성분을 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 표현형 분석 효소적 반응의 방법에 따라 평가하였다: - 평가될 활성 성분과 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 인큐베이션; - 활성 성분의 대사에 관련된 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450의 기여도 측정. 0.1 μM의 각 활성 성분을 한편으로는, CYP450 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2D6 및 3A4에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜, 및 다른 한편으로는, 본 발명에 따라 제조된, 분리되고 비억제된 간 마이크로솜 (상동 대조군)의 존재하에 MgCl 2 5 mM이 첨가된 Tris/HCl 완충제 (0.1mM, pH 7.4)에서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. NADPH 1 mM 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 인큐베이션을 동력학적 형태에 있어서 모니터링하였다. 7 min, 17 min, 30 min 및 이어서 60 min의 인큐베이션 시점에서, 인큐베이션 분취액 (100 μL)을 샘플링하고, 효소적 반응을 그 분취액에 10분 동안 얼음에 위치시킨 소정 용적의 용매 (100 μL의 메탄올)를 첨가함으로써 중단시켰다. 각 인큐베이션 시점에서, 활성 성분을 질량 분광기 (MS)에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정량화하였다. 활성 성분의 대사 활성 (A)을 억제된 (활성 Ai) 및 비-억제된 (활성 A를 갖는 대조군) 두 조건 하에서 비변화된 활성 성분의 내재성 대사 제거를 통해 측정하였다. 계산된 억제 백분율 (억제 백분율 = (A-Ai)/A)은 활성 성분의 대사에 관련된 비가역적으로 억제된 사이토크롬 P450의 기여에 직접적으로 상응한다. ㆍ 미르타자핀 미르타자핀을 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에서 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비-억제되고 제조된)의 존재하에, 3.9 내지 7.8 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 41%, 36% 및 24%의 미르타자핀의 내재성 제거의 억제가 각각 CYP450 1A2, 2D6 및 3A4에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 밝혀졌다 (도 13 및 14). 미르타자핀의 내재성 제거의 현저한 억제가 CYP450 2B6, 2C8, 2C9에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 미르타자핀의 산화적 대사는 각각 41%, 36% 및 24% 수준의 CYP450 1A2, 2D6 및 3A4를 수반한다. 주요 인간 CYP450을 과다발현하는 재조합 마이크로솜의 존재하에 2.5 내지 1000 μM의 미르타자핀의 인큐베이션 후 및 이들 CYP450 각각에 적합한 보정 계수를 측정한 후, 스트로머 (Stoermer) 등 (Metabolism of the antidepressant mirtazapine in vitro: contribution of cytochromes P-450 1A2, 2D6 and 3A4. Drug Metab Dispos. 2000; 28(10): 1168-1175)은 CYP450 1A2, 2D6 및 3A4가 미르타자핀의 대사에서 각각 41%, 39% 및 23% 관련성을 나타냈음을 보여주었다. 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로 수득된 결과는 스트로머 등에 의해 수득된 결과에 의해 확증되었다 (표 1). 본 발명에 따른 키트는, 미르타자핀의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성이 CYP450에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜 및 대조군 마이크로솜의 존재하에서의 내재성 제거의 단순 비교에 의해 추론되게 한다. 이에 반해, 미르타자핀의 효소적 경로의 표현형 분석을 위한 인간 CYP450을 과다발현하는 재조합 마이크로솜의 사용은, 한편으로는 미르타자핀의 존재하에 및 다른 한편으로는 보정 계수를 측정하기 위해 특이적 기질들 즉, 첫 번째로 인간 CYP450을 과다발현하는 재조합 마이크로솜 및 두 번째로 인간 간 마이크로솜의 존재하에 각 CYP450 활성의 특성 규정이 필요한 간접 측정을 필요로 한다. 표 1: 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜 및 인간 재조합 효소 (스트로머 등)의 키트로부터 출발하여 수득된 미르타자핀의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성 백분율 ㆍ 로페라미드 로페라미드를 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에서 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비-억제되고 제조된)의 존재하에, 14.5 내지 17.2 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거를 측정하였다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 53% 및 40%의 로페라미드의 내재성 제거의 억제가 각각 CYP450 3A4 및 2C8에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 밝혀졌다 (도 15 및 16). CYP450 1A2, 2B6, 2C9, 2D6에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 로페라미드의 내재성 제거의 현저한 억제는 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 로페라미드의 산화적 대사는 각각 53% 및 40% 수준의 CYP450 3A4 및 2C8을 수반한다. 건강한 자원자 연구는, CYP2C8의 억제제인 겜피브로실 600 mg의 경구 투여가 4 mg의 os 당 공동-투여된 로페라미드로의 노출 (AUC)을 2.2배 증가시킴을 보여준다 (Niemi et al. Itraconazole, gemfibrozil and their combination markedly raise the plasma concentrations of loperamide. Eur J Clin Pharmacol. 2006; 62: 463-472). 이러한 노출 증가는 전체 로페라미드 제거에서 55%의 CYP2C8의 추정된 관련성에 상응한다. 이러한 동일한 생체내 연구에서, 로페라미드 4 mg과 100 mg의 CYP3A4의 억제제인 이트라코나졸의 공동-투여는 3.8 배의 노출 증가를 보여주며, 이는 총 로페라미드 제거의 약 74%에 상응한다. 게다가, 테이로츠 (Tayrouz) 등 (Ritonavir increases loperamide plasma concentrations without evidence for P-glycoprotein involvement. Clin Pharmacol Ther. 2001 Nov;70(5):405-14)은, 건강한 자원자에서 로페라미드 16 mg과 600 mg의 CYP3A4의 억제제인 리토나비르의 공동-투여가 2.65 배의 노출 증가를 초래함을 보여주며, 이는 전체 로페라미드 제거의 62%에 상응한다. 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로 수득된 결과 (표 2)는 니에미 (Niemi) 등 및 테이로츠 등에 의한 임상 상황에서 기술된 데이터에 의해 확증되었다. 표 2: 건강한 자원자에서 및 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여 수득된, 로페라미드의 산화적 대사에서 CYP450에 대한 관련성 백분율 (니에미 등; 테이로츠 등) ㆍ 부프로피온 부프로피온을 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에서 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비-억제되고 제조된)의 존재하에, 6.7 내지 10.6 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 89%의 부프로피온의 내재성 제거의 억제가 CYP450 2B6에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 밝혀졌다 (도 17 및 18). 84%의 부프로피온의 내재성 제거의 억제가 CYP2D6에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 또한 관찰되었다. CYP2D6의 MBI 억제제인 파록세틴이 특이적이지 않으며 또한 CYP2B6을 억제한다는 지식하에, CYP2D6 억제가 실제로 CYP2B6의 것과 상응함이 추론된다. CYP450 1A2, 2C8, 2C9 및 3A4에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 부프로피온의 내재성 제거의 현저한 억제가 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25 % 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 부프로피온의 산화적 대사는 89 % 수준의 CYP450 2B6을 수반한다. FDA는 인간의 생체내 상호작용 연구에서 CYP2B6에 대한 가장 민감한 기질로서 부프로피온을 제안한다 (약물 개발 및 약물 상호작용에 대한 FDA 웹사이트, http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm and http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabelin 1277 g/ucm080499.htm). 본 발명에 따라 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로 수득된 결과는 FDA에 의해 기술된 데이터에 의해 확증되었다. 표 3: 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여 수득된, 부프로피온의 산화적 대사에서 CYP450에 대한 관련 백분율. ㆍ 이부프로펜 이부프로펜을 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 0.25 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에서 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비-억제되고 제조된)의 존재하에, 31 내지 54 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 90%의 이부프로펜의 내재성 제거의 억제가 CYP450 2C9에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 밝혀졌다 (도 19 및 20). CYP450 1A2, 2B6, 2D6, 2C8 및 3A4에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 이부프로펜의 내재성 제거의 현저한 억제는 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 이부프로펜의 산화적 대사는 90% 수준의 CYP450 2C7을 수반한다. 주요 인간 CYP450을 과다발현하는 재조합 마이크로솜의 존재하에 3 μM의 이부프로펜의 인큐베이션 후 그리고, 이들 CYP450 각각에 적합한 보정 계수를 측정한 후, 맥긴니티 (McGinnity) 등 (Automated definition of the enzymology of drug oxidation by the major human drug metabolizing cytochrome P450s. Drug Metab Dispos. 2000 Nov;28(11):1327-34)은, CYP450 2C9가 이부프로펜의 대사에 90%의 수준으로 관련됨을 보여주었다. 본 발명에 따른 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로 수득된 결과는 맥긴니티 등에 의해 기술된 데이터에 의해 확증되었다 (표 4). 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 마이크로솜의 내재성 제거와 대조군 마이크로솜의 내재성 제거 간의 단순 비교에 의해 이부프로펜의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성을 수립함이 연상될 것이다. 이에 반해, 재조합 마이크로솜의 사용은 절차의 다중화가 필요한 간접 측정을 필요로 한다. 추가로, 건강한 자원자에서의 연구는, 400 mg의 플루코나졸의 경구 투여가 400 mg의 os 당 공동-투여된 이부프로펜으로의 노출 (AUC)을 83% 증가시킴을 보여준다 (Hynninen et al. Effects of the Antifungals Voriconazole and Fluconazole on the Pharmacokinetics of S-(+)- and R-(-)-Ibuprofen. Antimicrob Agents Chemother. Jun 2006; 50(6): 1967-1972). 라자르 (Lazar) 등 (Drug interactions with fluconazole. Rev Infect Dis. 1990 Mar-Apr;12 Suppl 3:S327-33)은, CYP2C9의 억제제인 플루코나졸이 CYP2C9에 대해 민감한 것으로 인지된 기질인 톨부타미드로의 노출을 109% 증가시킴을 보여주었다 (fm = 80 %, Brown et al. Prediction of in vivo drug-drug interaction from in vitro data: impact of incorporating parallel pathways of drug elimination and inhibitor absorption rate constant. Br J Clin Pharmacol. 2005 Nov; 60(5):508-18). 이부프로펜 및 톨부타미드로의 노출 증가는 인간에서 동일한 억제제의 공동-투여 후 매우 유사하기 때문에, 이들 두 분자의 대사에 대한 CYP2C9의 기여가 매우 유사한 것으로 결론내릴 수 있다. 본 발명의 키트로 수득된 결과가 확인되었으며 (표 4) 임상 상황에 필적하는 이러한 시험관내 모델의 탁월한 대표성을 입증하였다. 표 4: 재조합 인간 효소 (맥긴니티 등)의 존재하에 및 건강한 대상체의 생체내 상황 (하인니넨 (Hynninen) 등, 라자르 등, 및 브라운 (Brown) 등)에서 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여, 이부프로펜의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성 백분율. ㆍ 셀로콕시브 셀로콕시브를 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비억제되고 제조됨)의 존재하에, 13.4 내지 18.9 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 81%의 셀로콕시브의 내재성 제거의 억제가 CYP450 2C9에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 밝혀졌다 (도 21 및 22). 셀로콕시브의 내재성 제거의 현저가 억제는 CYP450 1A2, 2B6, 2D6, 2C8 및 3A4에 대한 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 셀로콕시브의 산화적 대사는 81% 수준의 CYP450 2C9를 수반한다. 건강한 자원자 연구는 200 mg의 플루코나졸의 반복된 경구 투여가 200 mg의 os 당 공동-투여된 셀로콕시브로의 노출 (AUC)을 134% 증가시킴을 보여준다 (NDA020998 1998-12-31 Pharmacia). 셀로콕시브로 및 상기 언급된 톨부타미드(라자르 등)로의 노출 증가가 인간에서 플루코나졸의 공동-투여 후 매우 유사하기 때문에, 이들 두 활성 성분의 대사에 대한 CYP2C9의 기여가 매우 유사한 것으로 결론 내릴 수 있다. 브라운 등은 톨부타미드에 대한 CYP2C9의 80% 관련성을 입증하였다. 본 발명에 따른 비가역적으로 억제된, 분리된 마이크로솜의 키트로 수득된 결과는 임상 상황에 필적하는 이러한 시험관내 모델에서 우수한 대표성을 입증한다 (표 5). 표 5: 건강한 대상체의 생체내 상황에서 및 본 발명에 따른 비가역적으로 억제된, 분리된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여, 셀로콕시브의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성 백분율 (NDA020998, 라자르 등 및 브라운 등) ㆍ 피오글리타존 피오글리타존을 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 0.2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비억제되고 제조됨)의 존재하에, 43 내지 70 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 69%의 피오글리타존의 내재성 제거의 억제가 CYP450 2C8에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하여 밝혀졌다 (도 23 및 24). 피오글리타존의 내재성 제거의 현저한 억제는 CYP450 1A2, 2B6, 2D6, 2C9 및 3A4에 대한 비가역적으로 억제된 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 피오글리타존의 산화적 대사는 69% 수준의 CYP450 2C8을 수반한다. 건강한 자원자 연구는, CYP2C8의 억제제인 겜피브로질 600 mg의 반복된 경구 투여가 3 mg의 os 당 공동-투여된 피오글리타존으로의 (AUC)를 239% 증가시킴을 보여준다 (Deng et al. Effect of gemfibrozil on the pharmacokinetics of pioglitazone. Eur J Clin Pharmacol, 2005, 61, 831-6). 이러한 노출 증가는 피오글리타존의 전체 제거의 71%인 것으로 추정되는 CYP2C8의 관련성에 상응한다. 따라서, 본 발명에 따른 키트로 수득된 결과는 뎅 (Deng) 등의 임상 상황에서 기술된 데이터를 확증하였다 (표 6). 표 6: 생체내 상황에서 및 본 발명에 따른 비가역적으로 억제된, 분리된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여 수득된, 피오글리타존의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성 백분율 (뎅 등) ㆍ 보르테조밉 보르테조밉을 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 1.5 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비억제되고 제조됨)의 존재하에, 6.9 내지 11 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 73%의 보르테조밉의 내재성 제거의 억제가 CYP450 3A4에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하여 밝혀졌다 (도 25 및 26). 보르테조밉의 내재성 제거의 현저한 억제는 CYP450 1A2, 2B6, 2D6, 2C8 및2C9에 대한 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 보르테조밉의 산화적 대사는 73% 수준의 CYP450 3A4를 수반한다. 웃탐싱 (Uttamsingh) 등 (Relative contributions of the five major human cytochromes p450, 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, and 3A4, to the hepatic metabolism of the proteasome inhibitor bortezomib. Drug Metab Dipos 2005, 33 (11):1723-1728)은, 항-CYP 3A4 모노클로날 항체가 인간 간 마이크로솜에 의한 보르테조밉 (2 μM)의 대사를 79% 억제함을 보여주었다. 따라서, 본 발명에 기술된 키트로 수득된 결과는 웃탐싱 등에 의해 기술된 데이터를 확증하였다 (표 7). 표 7: 본 발명에 따라 비가역적으로 억제된 분리된 마이크로솜의 키트로부터 출발하고 그리고, 특이적 모노클로날 항체에 의해 억제된 인간 간 마이크로솜으로부터 출발하여 수득된, 보르테조밉의 산화적 대사에서 CYP450의 백분율 관련 (웃탐심 등) ㆍ 레파글리니드 레파글리니드를 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비억제되고 제조됨)의 존재하에, 38.4 내지 48.9 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 80%의 레파글리니드의 내재성 제거의 억제가 CYP450 2C8에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하여 밝혀졌다 (도 27 및 28). 레파글리니드의 내재성 제거의 현저가 억제는 CYP450 1A2, 2B6, 2D6, 2C9 및 3A4에 대한 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25% 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 레파글리니드의 산화적 대사는 80% 수준의 CYP450 2C8을 수반한다. 건강한 자원자 연구는, CYP2C8의 억제제인 겜피브로실 (최대 900 mg)의 경구 투여가 0.25 mg의 os 당 공동-투여된 레파글리니드로의 노출 (AUC)을 8.3배 증가시킴을 보여준다 (Honkalammi J. et al. Dose-Dependent Interaction between gemfibrozil and repaglinide in humans: strong inhibition of CYP2C8 with subtherapeutic gemfibrozil doses. Drug Metab Dispos, 2011, 39, 1977-1986). 이러한 노출 증가는 전체 레파글리니드 제거의 88%로 추정된 CYP2C8의 관련성에 상응한다. 본 발명에 따른 비가역적으로 억제된, 분리된 마이크로솜의 키트로 수득된 결과는 혼칼람미 제이. (Honkalammi J.) 등에 의한 임상 상황에서 기술된 데이터에 의해 확증된다 (표 8). 표 8: 건강한 대상체 P의 생체내 상황에서 및 본 발명에 따른 비가역적으로 억제된, 분리된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여 수득된, 레파글리니드의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성 백분율 (혼칼람미 제이. 등) ㆍ 세르트랄린 세르트랄린을 내재성 제거의 최적의 측정을 허용하는 0.2 mg/ml의 마이크로솜 단백질의 농도로 상기 기술된 조건하에 인큐베이션하였다. 대조군 마이크로솜 (본 발명에 따라 비억제되고 제조됨)의 존재하에, 52.5 내지 70.5 ml/min/g의 단백질의 내재성 제거가 측정되었다. 대조군 마이크로솜과 비교하여, 58%의 세르트랄린의 내재성 제거의 억제가 CYP450 2B6에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하여 밝혀졌다 (도 29 및 30). CYP2D6에 대해 비가역적으로 억제된 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 64%의 세르트랄린의 내재성 제거의 억제가 또한 관찰되었다. CYP2D6의 MBI 억제제인 파록세틴이 특이적이지 않으며 또한 CYP2B6을 억제한다는 지식하에, CYP2D6 억제는 실제로 CYP2B6의 것과 상응한 것으로 추론된다. CYP450 1A2, 2C8, 2C9 및 3A4에 대해 비가역적으로 억제된, 분리된 간 마이크로솜의 존재하에 세르트랄린의 내재성 제거의 현저한 억제는 관찰되지 않았다. 현저한 억제는 25 % 미만의 내재성 제거인 것으로 이해되며, 백분율은 간 마이크로솜에 대한 제거 측정에서 관찰된 가변성의 역치를 나타낸다. 결론적으로, 세르트랄린의 산화적 대사는 58 % 수준의 CYP450 2B6을 수반한다. 인간 간 마이크로솜 및 CYP450의 특이적 억제제의 존재하에 세르트랄린의 인큐베이션 후, 오바치 에스 (Obach S) 등 (Sertraline is metabolized by multiple cytochrome P450 enzymes, monoamine oxidases, and glucuronyl transferases in human: an in vitro study. Drug Metab Dispos. 2005 Feb;33(2):262-70)은, 주요 CYP450 중에서 CYP2B6이 15 내지 65% (인간 간의 풀에서는 60%)의 관련성으로 세르트랄린의 대사에 가장 많이 기여함을 보여주었다. 본 발명에 따라 기술된 키트로 수득된 결과는 오바치 에스 등에 의해 기술된 결과에 의해 확증된다 (표 9). 표 9: CYP450의 존재 및 부재하에 인간 간 마이크로솜 및 분리되고 비가역적으로 억제된 마이크로솜의 키트로부터 출발하여 수득된, 세르트랄린의 산화적 대사에서 CYP450의 관련성 백분율 (오바치 에스 등). 수득된 결과는, 표현형 분석 키트를 사용하여 시험관 내에서 측정된, 선택된 활성 성분의 대사에 관련된 효소의 기여도가 생체내 데이타 및/또는 기타 시험관내 모델로부터 수득된 데이터를 기반으로 하여 추정되거나 측정된 것과 매우 유사하거나 심지어 동일함을 보여준다. 임상 데이터에 필적하는, 제노바이오틱 대사 경로의 효소적 표현형 분석의 상황하에서 비가역적으로 억제되고, 분리되고 저온보존된 마이크로솜의 키트의 검증은 인간의 생체내 상황에 필적하는 이러한 시험관내 모델의 대표성을 입증한다. 추가로, 활성 성분의 대사에 대한 효소적 기여도의 직접적인 측정의 수득은, 해석의 시간 및 설비에 있어서 이로울 뿐만 아니라 또한 기타 시험관내 모델의 수행에서 조작의 다중화에 내재하는 오류를 회피한다. |
