사이토크롬 Ｐ450 효소 활성도의 고속평가용 칵테일 키트

사이토크롬 Ｐ450 효소 활성도의 고속평가용 인제 칵테일 키트{Inje cocktail kit for high-throughput evaluation of human cytochrome P450 enzyme}

도 1은 미다졸람을 단독 투여한 경우 및 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우의 CYP3A 효소의 대사활성지표(경구청소율)를 비교한 그래프이다. 각 수평선 및 바는 평균 ± 표준편차를 나타낸 것이다.

도 2는 미다졸람 경구투여 후 4시간째에 채취한 혈액검체 중 미다졸람 농도와 12시간 미다졸람 곡선하면적(AUC _0-12h )과의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 점선은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 3은 미다졸람을 단독 투여한 경우와 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우의 4시간째에 채취한 혈액검체 중 미다졸람의 농도를 비교한 그래프이다. 각 수평선과 바는 평균± 표준편차를 나타낸다.

도 4는 로사탄을 단독 투여한 경우와 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우의 CYP2C9 대사활성지표(로사탄/E-3174)를 비교한 그래프이다. 각 수평선 및 바는 평균± 표준편차를 나타낸다.

도 5는 로사탄 경구 투여후 0-8시간 사이에 채취한 뇨 시료 중 CYP2C9 효소 의 대사활성지표(로사탄/E-3174)와 혈액 검체중 중 12시간 CYP2C9 효소의 대사활성지표 (로사탄/E-3174) 곡선하면적 (AUC _0-12h )비 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 점선은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 6은 로사탄 경구 투여 후의 0-12시간 사이에 채취한 뇨 시료 중 CYP2C9 효소의 대사활성지표(로사탄/E-3147)와 혈액 검체중 중 12시간 CYP2C9 효소의 대사활성지표 (로사탄/E-3174) 곡선하면적 (AUC _0-12h )비 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 점선은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 7은 3가지의 약물 칵테일을 투여한 경우 및 5가지의 약물 칵테일을 투여한 경우의 CYP1A2 효소의 대사활성지표(파라잔틴/카페인)를 비교한 그래프이다. 각 수평선과 바는 평균± 표준편차를 나타낸다.

도 8은 카페인 경구 투여 후 4시간째에 채취한 혈액검체 중 CYP1A2 효소의 대사활성지표(파라잔틴/카페인)와 혈액검체 중 12시간 CYP1A2 효소의 대사활성지표 (파라잔틴/카페인) 곡선하면적 (AUC _0-12h ) 비 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 점선은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 9는 3가지 약물 칵테일을 투여한 경우 및 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우의 3시간째 채취한 혈액검체를 이용하여 측정한 CYP2C19 효소의 대사활성지표(오메프라졸/5-OH 오메프라졸)를 비교한 그래프이다. 각 수평선 및 바는 평균± 표준편차를 나타낸다.

도 10은 오메프라졸 경구 투여 후 3시간째에 채취한 혈액검체 중 CYP2C19 효 소의 대사활성지표(오메프라졸/5-OH 오메프라졸)와 혈액검체 중 12시간 CYP2C19 효소의 대사활성지표 (오메프라졸/5-OH 오메프라졸) 곡선하면적 (AUC _0-12h ) 비 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 점선은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 11은 오메프라졸 경구 투여 후 4시간째에 채취한 혈액검체 중 CYP2C19 효소의 대사활성지표(오메프라졸/5-OH 오메프라졸)와 혈액검체 중 12시간 CYP2C19 효소의 대사활성지표 (오메프라졸/5-OH 오메프라졸) 곡선하면적 (AUC _0-12h ) 비 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 점선은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

도 12는 3가지 약물 칵테일을 투여한 경우 및 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우의 4시간째 채취한 혈액검체를 이용하여 측정한 CYP2C19 효소의 대사활성지표(오메프라졸/5-OH 오메프라졸)를 비교한 그래프이다. 각 수평선 및 바는 평균± 표준편차를 나타낸다.

도 13은 3가지 약물 칵테일을 투여한 경우 및 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우의 뇨 시료에서의 CYP2D6 효소 대사활성지표(Log[덱스트로메톨판/덱스트로판])를 비교한 그래프이다. 각 수평선 및 바는 평균± 표준편차를 나타낸다.

본 발명은 사이토크롬 P450 효소 활성도의 고속 평가용 인제 칵테일 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 카페인, 로사탄, 오메프라졸, 덱스트로메톨판 및 미다졸람으로 이루어진 탐침약물을 포함하며 5종의 사이토크롬 P450 동종효소의 약물대사활성을 동시에 고속으로 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 효소 활성도의 고속 평가용 인제 칵테일 키트에 관한 것이다.

사이토크롬 P450(Cytorcrome P450, 이하 CYP라 함) 효소는 임상적으로 유용한 다양한 약물들의 대사에 관여하고 있으며, 인체 내에서 단일 형태가 아닌 여러 개의 동종효소들로 구성된 복합적인 형태로 존재한다. 특히, 인간에게는 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 및 3A 등의 동종효소들이 존재한다.

한편, 상기 CYP 동종효소들의 활성은 개개인 간에 다양한 차이를 보이고 있다. 개인 간의 효소 활성 차이는 주로 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphisms; SNPs)을 비롯한 다양한 유전적 다형성에 기인하고 있으며 여러 후천적인 요인들도 관련이 있다. 후천적인 요인으로는 음식물, 사이토카인, 호르몬, 여러 약물들이 있으며 이들은 약물대사효소 활성을 증가시키거나 억제할 수 있다. 이러한 CYP 동종효소의 활성 차이는 혈중 약물농도의 개인차를 초래하는 주요한 요인이 되며, 약물에 따라서는 심각한 부작용을 초래할 수도 있다. 따라서, CYP 동종효소들의 활성 평가는 매우 중요하며 약물상호작용 연구와 유전형에 따른 표현형 연구 등과 같은 학문적 분야에서 뿐 만 아니라 신약개발 등의 산업적 응용분야에 도 적용될 수 있다.

현재 약물대사효소의 활성을 측정하는 생체 내( in vivo ) 및 생체 외( in vitro ) 상의 몇 몇 기술들이 개발된 바 있다. 생체 내 기술로는 특정 CYP 효소에 선택적으로 대사되는 탐침약물(probe or marker drug)을 투여하여 각 CYP 효소에 따라 개별적으로 측정하는 방법 및 여러 가지 탐침약물들을 동시에 투여하여 약물대사효소의 활성을 측정하는 '칵테일(cocktail)'방법이 있다. 상기 두 방법은 모두 혈장 혹은 뇨에서 대사되지 않은 모약물(unchanged parent compound)과 대사물(metabolites)의 측정을 필요로 하며 각 CYP 효소에 대한 대사활성을 적절히 반영하는 대사효소 활성지표(phenotypic index)를 이용하여야 한다.

그러나, 이러한 약물들의 생체 내 사용은 약물 부작용, 분석절차, 비용 등 여러 측면에서 많은 문제를 동반할 수 있다. 따라서, CYP 효소의 대사활성 측정에 있어 적절한 탐침약물의 선택은 매우 중요하다.

최근 들어 여러 가지 탐침약물을 동시에 투여하는 칵테일 방법은 효율성과 신뢰성 측면에서 효소활성 평가를 실시간으로 가능하게 해주는 장점 때문에 최근 각광을 받고 있다. 상기 칵테일법의 가장 큰 장점은 한번의 임상시험으로 여러 경로에 있는 동종효소의 활성을 동시에 평가할 수 있다는 것이다. 이는 약물상호작용 연구나 표현형 검사에서 효소 활성의 고속평가를 가능하게 해준다. 그러나, 각 효소에 따라 개별적으로 측정하는 방법과는 달리 칵테일법 사용에 있어서 탐침약물들 사이의 약동학적 및 약력학적 상호작용은 반드시 고려되어야 한다. 예를 들면, CYP1A2 기질 약물인 카페인은 유의적으로 간의 혈류를 감소시켜 잠재적으로 높은 간추출율(high extraction rate)을 가진 물질들의 청소율을 변화시킨다는 보고가 있고, 카페인(caffeine), 클로르족사존(chlorzoxazone), 덱스트로메톨판(dextromethorphan) 및 클로로구아니드(chloroguanide) 사이에 서로 상호작용이 있음이 보고 된 바 있다. 따라서, 칵테일법을 사용하기 전에 탐침약물들의 조합에서 서로 상호작용이 없는지에 대한 확인이 필요하다. 이와 더불어 탐침약물이 다른 CYP 효소에 대해 중복으로 기질이 되는지에 대한 확인도 중요하다. 그러므로 칵테일을 설계함에 있어 약물의 선택과 대사효소 별로 효소활성지표의 적절한 선택은 매우 중요한 요소이다. 또한 적절한 분석방법의 확립도 중요하다. 칵테일법의 특성상 한번의 시험으로 대사효소활성을 평가하는 것이므로 하나의 생체시료에서 여러 약물들을 측정할 수 있는 다성분 동시 분석법이 요구되어 진다.

한편, CYP 효소의 약물대사활성을 측정하기 위한 칵테일법으로는 1997년 "피츠버그 칵테일(Pittsburgh cocktail)" 이 발표된 이후로 많은 종류의 칵테일 법이 개발된 바 있다(Frye RF et al., Clin Pharmacol Ther , 62:365-376, 1997). 현재 널리 알려진 대표적인 칵테일법으로는 "쿠퍼스타운 칵테일(Cooperstown cocktail)"과 "카롤린스카 칵테일(Karolinska cocktail)"이 있으며 이들 모두 각기 장단점을 가지고 있다(Streetman DS. et al., Clin Pharmacol Ther , 70:455-461, 2001; Christensen M. et al., Clin Pharmacol Ther , 73:517-528, 2003). 상기 쿠퍼스타운 칵테일법에서는 카페인(CYP1A2의 기질), 오메프라졸 (CYP2C19의 기질), 덱스트로메톨판(CYP2D6의 기질) 및 정맥용 미다졸람(CYP3A의 기질)을 탐침약물로 사용하였으며 상기 약물들은 상호작용이 없는 것으로 나타났다. 그러나 쿠퍼스타운 칵테 일에서처럼 정맥용 미다졸람을 사용하는 경우 위장관에 발현된 효소를 포함한 CYP3A의 대사활성을 판단 할 수 없을 뿐더러 중요한 CYP 효소인 CYP2C9의 대사활성을 평가 할 수 없다. 이를 보완하기 위하여 쿠퍼스타운 5+1 칵테일법에서는 기존의 쿠퍼스타운 칵테일에 와파린(warfarin)을 추가하여 CYP2C9의 대사활성을 평가하였다(Chainuvati S. et al., Clin Pharmacol Ther , 74:437-447, 2003). 그러나, 상기 와파린을 사용할 경우 출혈 등의 위험 요소가 존재하기 때문에 일반적으로 쓰기에는 문제가 있다.

카롤린스카 칵테일의 경우에는 탐침약물로서 카페인, 로사탄(losartan), 오메프라졸, 데브리소퀸(debrisoquin) 및 퀴닌(quinine)을 이용하여 CYP 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 및 3A의 대사활성을 각각 측정하였다. 상기 카롤린스카 칵테일은 5가지 효소의 활성을 동시에 볼 수 있다는 장점이 있지만, 데브리소퀸과 퀴닌은 국내에서 시판 허가를 받지 않은 약물로 우리나라에서 실질적으로 적용하기에 제한이 있을 뿐만 아니라 세계적으로 그 사용이 보편적이지 않다. 또한 혈압강하 작용이 있는 로사탄과 데브리소퀸의 동시 사용으로 예기치 않은 약물 부작용이 발생할 수 있다.

이에 본 발명자들은 여러 종류의 약물 대사효소 활성을 동시에 평가하면서도 기존 칵테일 방법의 문제점을 보완할 수 있는 새로운 칵테일 임상시험기술을 개발하고자 다년간 연구하던 중, 종래에 약물상호 작용이 없는 것으로 보고 된 카페인, 오메프라졸 및 덱스트로메톨판의 3가지 약물 칵테일에 경구용 미다졸람 및 로사탄 을 추가한 약물 칵테일을 개발하고 상기 약물 칵테일을 이용하면 5종의 사이토크롬 P450 동종효소의 약물대사활성을 부작용 없이 동시에 고속으로 평가할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 카페인, 로사탄, 오메프라졸, 덱스트로메톨판 및 미다졸람으로 이루어진 탐침약물을 포함하는 사이토크롬 P450 효소 활성도의 고속 평가용 인제 칵테일 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카페인, 로사탄, 오메프라졸, 덱스트로메톨판 및 미다졸람으로 이루어진 탐침약물을 포함하는 사이토크롬 P450 효소의 약물대사활성 측정용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 키트는 5가지 약물, 보다 구체적으로는 CYP1A2 효소의 탐침약물로서 카페인, CYP3A 효소의 탐침약물로서 미다졸람, CYP2C9 효소의 탐침약물로서 로사탄, CYP2C19 효소의 탐침약물로서 오메프라졸 및 CYP2D6의 탐침약물로서 덱스트로메톨판을 모두 포함하고 있는 것으로서, 상기 CYP1A2, CYP3A, CYP2C9, CYP2C19 및 CYP2D6 효소의 약물대사활성을 동시에 고속으로 측정할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기'탐침약물'이란 각각의 사이토크롬 P450 동종효소의 선택적 기질이 되는 약물로서 생체 내에서 부작용을 일으키지 않으면서도 상기 사이토크롬 P450 효소의 약물대사활성을 측정할 수 있는 것을 의미한다.

상기 탐침약물 중 하나인 카페인은 사이토크롬 P450 효소 중 CYP1A2 효소의 활성을 측정하기 위한 기질 약물로 많이 사용되어 왔다. 상기 카페인은 CYP1A2 효소에 의해 파라잔틴(paraxanthine)으로 대사된다.

상기 로사탄은 사이토크롬 P450 효소 중 CYP2C9 효소의 활성 측정에 있어서 민감도와 특이도가 높은 탐침약물로 보고 된 바 있다. 로사탄의 카르복실산 대사물인 E-3174는 유일한 활성대사물로 CYP2C9에 의해 특이적으로 생성된다. 한편, 상기 CYP2C9 효소의 활성 측정을 위한 탐침약물로는 톨부타미드(tolbutamide), 페니토인(phenytoin), 와파린(warfarin) 및 디클로레낙(diclofenac) 등이 사용되어져 왔다. 쿠퍼스타운 5+1 칵테일에서는 CYP2C9 효소 활성을 측정하기 위한 탐침약물로서 와파린을 사용하였으나 부작용으로 출혈이 있을 수 있기 때문에 매우 위험한 단점이 있었다. 또한, 확립된 대사효소활성지표가 없기 때문에 와파린의 약동학적 특성을 분석하기 위해 다량의 채혈이 불가피하였다.

상기 오메프라졸은 위궤양 치료에 널리 쓰이고 있는 약물로 부작용이 거의 없는 것으로 알려져 있으며 본 발명에서는 CYP2C19 효소의 활성을 측정하기 위한 목적으로 사용되었다. 오메프라졸은 CYP2C19 효소에 의해 5-OH 오메프라졸로 대사 된다. 상기 CYP2C19 효소활성을 측정하기 위한 탐침약물로는 메피니토인, 오메프라졸, 클로로구아니드가 사용되고 있으며 주로 메피니토인의 S/R 비가 많이 사용되어 지고 있다. 그러나 상기 메피니토인의 경우 강한 진정작용이 있으며 항진된 대사능을 가진 사람의 경우 뇨에서의 S-메피니토인 농도가 매우 낮고 S-메피니토인 중합체에 대한 뇨의 안정성이 의문시되고 있다.

상기 덱스트로메톨판은 본 발명에서 CYP2D6 효소의 탐침약물로서 사용하였으며 상기 CYP2D6 효소의 탐침약물로는 덱스트로메톨판 이외에도 코데인(codein), 메토프롤롤(metoprolol), 데시프라민(desipramine), 데브리소퀸(debrisoquin) 등이 많이 사용되고 있다. 그러나, 데브리소퀸의 경우 현재 국내에서 시판하고 있지 않은 혈압을 낮추는 활성을 가진 약물이며 데브리소퀸의 경우 본 발명에서 CYP2C9의 탐침약물로 사용한 항고혈압제인 로사탄과 상승작용을 일으켜 심각한 부작용을 초래한 위험이 있다.

상기 미다졸람은 본 발명에서 CYP3A 효소의 탐침약물로서 사용하였다. 상기 CYP3A 효소는 간뿐만 아니라 위장관계에도 많이 분포하고 있다. 그러나, 대다수의 CYP3A 효소활성측정을 위한 연구는 정맥용 미다졸람을 정맥 내로 주입하는 방법을 사용하고 있다. 상기와 같이 미다졸람을 정맥 내 주입하는 경우 위장관을 거치지 않고 바로 혈중에 약물이 분포하게 되므로 위장관에서 발현되는 CYP3A 효소에 의한 대사과정을 거치지 못하고 바로 간에서 대사가 일어나게 된다. 따라서, 위장관에서 발현된 CYP3A 효소의 활성은 전혀 반영하지 못하게 되는 것이다. 이를 고려하여 본 발명에서 상기 미다졸람은 주사제를 경구투여하는 방법을 사용하였다. 따라 서, 본 발명에서 상기 탐침약물들은 경구투여되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 상기 탐침약물은 동시에(simultaneous) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 즉, 상기 탐침약물은 한 성분을 다른 성분이 투여되기 전, 후 및/또는 다른 성분과 함께 동시에 투여될 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 탐침약물은 카페인, 로사탄, 오메프라졸 및 미다졸람을 동시에 혼합하여 투여한 다음 일정시간 후 보다 바람직하게는 4시간 후에 덱스트로메톨판을 투여할 수 있다. 상기에서 덱스트로메톨판의 투약 시간을 분리한 것은 상기 약물의 위장관 운동감소 효과를 고려한 것이였으나, 종래 문헌들을 참고로 할 때 본 발명에 따른 탐침약물을 동시에 투여하여도 큰 문제가 없을 것으로 사료된다(Streetman DS et al., Clin Pharmacol Ther , 68:375-383, 2000; Christensen M. et al., Clin Pharmacol Ther , 73:517-528, 2003).

본 발명에 따른 사이토크롬 P450 효소의 약물대사활성 측정용 키트에 포함되는 탐침약물의 용량으로는 사이토크롬 P450 효소의 활성을 평가할 수 있는 정도의 유효용량이면서도 생체 내에서 부작용을 유발하지 않은 범위의 저용량이어야 한다. 바람직하게는, 성인을 기준으로 카페인 50~200mg, 로사탄 25~100mg, 오메프라졸 10~40mg, 덱스트로메톨판 10~50mg 및 미다졸람 1~5mg을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 카페인 93mg, 로사탄 50mg, 오메프라졸 20mg, 덱스트로메톨판 30mg 및 미다졸람 2mg을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 피험자에게 미다졸람(15mg/3ml) 2mg을 100% 사과주스에 희석하여 경구로 투여하고 이때 카페인 1정(93mg), 오메프라졸 1캅셀(20mg), 로사탄 1정(50mg)을 함께 투여하였다. 투약 후 4시간 뒤 덱스트로메톨판 2정(1정당 15mg)을 물과 함께 투여하였다(실시예 2 참조).

상기 본 발명에 따른 키트를 이용하면 다음과 같은 방법에 따라 5종의 사이토크롬 P450 동종효소의 약물대사활성을 동시에 고속으로 측정할 수 있다.

(a) 포유동물에 카페인, 로사탄, 오메프라졸, 덱스트로메톨판 및 미다졸람으로 이루어진 탐침약물을 혼합 투여하고,

(b) 상기 (a) 단계의 포유동물로부터 생물학적 시료를 채취한 다음,

(c) 상기 (b) 단계의 생물학적 시료 중 상기 (a) 단계의 탐침약물 및 그 대사물의 농도를 측정하고 대사활성지표로부터 효소활성을 산출한다.

상기 (b) 단계에서 생물학적 시료는 바람직하게는 피험자의 혈액 또는 뇨 일 수 있다. 또한 상기 (b) 단계에서 피험자의 혈액 채취는 투약 후 4시간째에 수행하는 것이 바람직하며, 뇨 채취는 투약 후 0∼8시간 사이에 수행하는 것이 바람직하다.

상기 (c) 단계에서 대사활성지표는 생물학적 시료 즉, 피험자의 혈액 또는 뇨 중에서 대사되지 않은 모약물과 대사물을 측정하고 그 비율로부터 산출할 수 있 다. 본 발명에서는 사이토크롬 P450 효소의 각각의 활성을 평가하기 위해 다음과 같은 대사활성지표를 사용하였다.

CYP1A2(탐침약물: 카페인) = 투약 후 4시간째에 채취한 혈장 중 파라잔틴의 농도/카페인 농도

CYP3A(탐침약물: 미다졸람) = 투약 후 4시간째에 채취한 혈장중 미다졸람 농도

CYP2C9(탐침약물: 로사탄) = 투약 후 8시간까지 채취한 뇨 중 로사탄 농도/E-3174 농도

CYP2C19(탐침약물: 오메프라졸) = 투약 후 4시간째에 채취한 혈장 중 오메프라졸 농도/5-OH 오메프라졸 농도

CYP2D6(탐침약물: 덱스트로메톨판)= 투약 후 8시간까지 채취한 뇨 중 log[덱스트로메톨판 몰 농도/덱스트로판 몰 농도]

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서는 CYP1A2 효소 및 CYP2C19 효소의 활성을 측정하기 위한 검체로서 투약 후 4시간째 채취한 혈액을 사용하였다. 이는 본 발명의 일 실시예를 통하여 검증된 바 와 같이, 상기 4시간째에 채취한 혈액 검체에서의 약물 대사활성지표가 혈액 검체에서의 12시간 곡선하면적(AUC _0-12h ) 비와 좋은 상관성을 보여주고 있기 때문에(도 8 및 도 11 참조), 상기 4시간째에 채취한 혈액 검체는 각 효소의 약물 대사활성을 측정하기에 적합한 시료 임을 알 수 있었다.

또한 본 발명의 일 실시예에서는 CYP2D6 효소 및 CYP2C9 효소의 활성을 측정하기 위한 검체로서 투약 후 0-8시간사이에 채취한 뇨를 사용하였다. 이는 본 발명의 일 실시예를 통하여 검증된 바와 같이, 상기 0-8시간사이에 채취한 뇨 검체에서 약물 대사활성지표가 혈액 검체에서의 12시간 곡선하면적(AUC _0-12h ) 비와 좋은 상관성을 보여주고 있기 때문에(도 5 참조), 상기 8시간까지 채취한 뇨 검체는 각 효소의 약물 대사활성을 측정하기에 적합한 시료임을 알 수 있었다.

한편, 효소활성 측정을 위한 칵테일법의 제한점 중 하나는 CYP3A 효소 활성의 측정을 위해 그 탐침약물인 미다졸람을 투여한 후 경구청소율을 구하기 위하여 수회의 채혈이 요구된다는 것이다. 이는 칵테일법이 CYP 효소 활성의 고속 측정을 목적으로 한다는 점에 있어서 큰 제한점이 되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 CYP3A 효소의 활성을 측정하기 위한 검체로서 투약 후 4시간째 채취한 혈액을 사용하였다. 이는 본 발명의 일 실시예를 통하여 검증된 바 와 같이, 12명의 피험자에 대하여 미다졸람을 단독 투여한 경우와 칵테일 투여한 경우를 각각 하나의 개체로 하여 투약 후 4시간째 채취한 혈액 검체 중 미다졸람의 농도와 곡선하면적(AUC) 사이에 좋은 상관성을 보여주고 있기 때문에(도 2 참조), 상기 4시간째에 채취한 혈액 검체는 CYP3A 효소의 약물 대사활성을 측정하기에 적합한 시료임을 알 수 있었다.

한편, 본 발명자들은 본 발명에 따른 5가지 약물을 포함하는 키트에서 카페인, 오메프라졸 및 덱스트로메톨판의 동시 사용은 종래에 쿠퍼스타운 칵테일에서 서로 상호작용이 없음이 밝혀진 바 있다. 한편, 미다졸람은 정맥 투여방법을 통해 투여된 바 있으며 이는 상술한 바와 같이, 위장관에서 발현된 CYP3A 효소의 활성을 반영하지 못하는 단점이 있다. 이에 본 발명자들은 미다졸람을 경구투여하는 방법을 채택하였으며, 미다졸람의 정맥투여와 달리 경구투여시 약물 흡수부위에서 다른 약물과 상호작용의 가능성이 있기 때문에 반드시 이러한 부분의 평가가 필요하다. 본 발명의 키트 조성물에 포함되는 로사탄 역시 다른 칵테일 약물과 동시 투여하는 경우의 상호작용에 대한 평가가 필요하다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 5가지 약물 칵테일 투여가 미다졸람 단독 투여, 로사탄 단독 투여, 3가지 약물 칵테일(카페인, 오메프라졸, 덱스트로메톨판) 투여시의 각 효소의 대사활성지표를 비교하였다(실시예 5 참조).

그 결과, 본 발명에 따른 5가지 약물의 칵테일 투여와 단독 투여 및 3가지 약물 칵테일 투여시 효소의 약물대사활성은 통계적으로 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 본 발명의 5가지 약물의 칵테일 투여는 어떠한 부작용도 유발하지 않았다.

따라서, 카페인, 로사탄, 오메프라졸, 덱스트로메톨판 및 미다졸람을 동시에 탐침약물로 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 시토크롬 P450 효소의 약 물 대사활성 분석용 키트는 탐침약물 간에 상호작용을 나타내지 않으면서도 부작용이 없이 5종의 시토크롬 P450 효소의 대사활성을 동시에 측정할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 키트를 사용하는 경우 약물 투여 후 4시간 째 1회 채혈과 8시간까지의 채뇨로 시토크롬 P450 효소의 대사활성을 고속으로 간편하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

임상시험 대상자의 선정

임상시험 대상자로는 임상시험 공고를 통하여 모집된 시험 대상자 중에서 담당 의사가 피험자 배경, 신체검사, 활력증후(체온, 혈압, 맥박), 심전도 검사, 실험실 검사의 결과를 기초로 임상시험에 참여하는 것이 적합하다고 판단하고, 자유의사에 의해 임상시험에 참여하겠다는 서면 동의서를 작성한 20세 이상 45세 이하의 건강한 한국 남성지원자를 대상으로 하였다. 그 결과, 탈락 피험자를 제외한 총 12명의 피험자를 임상시험에 참가시켰다. 환자의 평균 연령은 21.3 ± 0.8세, 평균 체중은 66.8 ± 5.4㎏ 이었고, 신장은 172.8 ± 5.5㎝ 이었다. 상기 임상시험은 인제대학교 부산백병원의 임상시험심사위원회의 승인 후 시행되었다.

<실시예 2>

시험약제 및 투여방법의 확립

CYPIA2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A 효소 활성을 평가하기 위해서 카페인, 로사탄, 오메파라졸, 덱스트로메톨판 및 미다졸람을 각각의 탐침약물로 사용하였다. 각 시험약제의 성분, 제형, 명칭 및 함량은 다음과 같다(표 1).

시험약제의 투여방법으로는 상기 실시예 <1-1>에서 선정된 피험자를 대상으로 공개, 무작위배정, 균형, 라틴격자 방식의 4차원 교차시험 방법에 따라 수행하였다. 즉, 미리 작성된 무작위 배정표에 따라 총 12명의 피험자에 대해 각각 세 명씩 네 그룹으로 배정하고, A(미다졸람 2mg 단독 투여), B(로사탄 50mg 단독 투여), C(카페인 93mg, 오메프라졸 20mg 및 덱스트로메톨판 30mg으로 이루어진 칵테일 약물 투여), D(미다졸 2mg, 카페인 93mg, 오메프라졸 20mg, 로사탄 50mg 및 덱스트로메톨판 15mg으로 이루어진 칵테일 약물 투여)의 네 가지의 약물용법으로 나누어 임상시험을 수행하였다(표 2). 각 단계 사이에는 1주일의 휴약기를 두었다.

보다 구체적으로 상기에서 약물용법 A는 미다졸람(부광미다졸람 주사 15mg/3ml) 2mg을 100% 사과주스 50ml에 희석하여 경구로 투여하였으며 사용한 용기는 90ml의 물을 사용하여 각각 두 번 헹구어 복용하게 하였다. 약물용법 B는 240ml의 물과 함께 로사탄(코사정 50mg) 1정을 경구로 투여하였다. 약물용법 C는 240ml의 물과 함께 카페인(카페소프트정 93mg) 1정, 오메프라졸(로섹캅셀 20mg) 1캅셀을 투약하였고 투여 후 4시간 뒤 덱스트로메톨판(러미라정 15mg) 2정을 240ml의 물과 함께 투약하였다. 약물용법 D는 미다졸람(부광 미다졸람 주사 15mg/3ml) 2mg을 100% 사과주스 50ml에 희석하여 경구로 투여하였고 사용한 용기는 90ml의 물을 사용하여 각각 두 번 헹구어 복용하게 하였다. 이때 카페인(카페소프트정 93mg) 1정, 오메프라졸(로섹캅셀 20mg) 1캅셀, 로사탄(코사정 50mg) 1정을 함께 투약하였고 투여 후 4시간 뒤 덱스트로메톨판(러미라정 15mg) 2정을 240ml의 물과 함께 투약하였다.

그 결과, 모든 피험자가 성공적으로 임상시험을 마쳤으며, 임상시험 기간 중 약물의 단독투여 또는 칵테일 투여 시 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다.

< 실시예 3>

피험자의 뇨 및 혈장 중 약물 및 그 대사물의 농도 분석

상기 실시예 1의 피험자에게 실시예 2의 방법에 따라 약물을 투약한 후 뇨 중 덱스트로메톨판 농도 및 뇨와 혈장 시료의 로사탄의 농도를 고압액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정하였다. 또한, 혈장 시료 중 미다졸람, 카페인, 오메프라졸의 농도는 LC/MS/MS 시스템을 이용하여 분석하였으며 이중 카페인과 오메프라졸은 한번에 추출하여 동시 분석을 수행하였다.

<3-1> 뇨 및 혈액 시료의 채취

상기 실시예 1의 피험자를 대상으로 하여 혈액채취는 상박부에 거치한 정맥 내 카테터(Angiocath PlusTM, 20GA, 1.16IN, 1.1ㅧ 30mm, 보인메디컬, 한국)로부터 시행하였으며, 투약 직전 대조 혈액 10ml를 취하고 투약 후 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480, 600, 720분에 각각 10㎖의 혈액을 헤파린 처리된 튜브(Vacutainer, Becton & Dickinson사, 미국)에 채취하였다. 혈액 시료를 채혈한 후 4℃, 3000rpm에서 원심 분리한 후, 혈장을 미세원심분리 튜브(Stockwell Scientific사, 미국)에 취한 뒤 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.

뇨의 수집은 투약 직전 대조 소변 20㎖를 취하고 투약 후 0시간과 4시간 사이, 4시간과 8시간 사이, 8시간과 12시간 사이에 수집하였다. 시간별로 수집한 뇨는 메스실린더를 이용하여 부피를 측정하고 기록한 후 20㎖의 뇨를 코니칼 원심분리 튜브(BDFalcon, Becton & Dickinson사, 미국)에 취하여 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.

<3-2> 뇨 시료 중 덱스트로메톨판과 덱스트로판의 분석

뇨 시료 중의 덱스트로메톨판과 그 대사물인 덱스트로판의 농도 분석은 공지의 방법을 변형하여 HPLC를 이용하여 측정하였다(Schadel M. et al., J Clin Psychopharmacol , 15(4):263-269, 1995; Kristensen HT. J Pharm Biomed Anal , 6:211-220, 1988). HPLC 시스템은 길슨(Gilson)사의 307 펌프, 234 오토인젝터, 워터스(Waters)사의 2475 형광 검출기 및 Linchrosorb RP-8(10㎛, 200ㅧ 4mm, Merk사, 미국) 컬럼으로 구성하였다. 이동상으로는 10mM KH ₂ PO ₄ 완충액 : 메탄올 : 아세토니트릴(570 : 200 : 200, v/v)를 사용하였으며, 유속은 0.8㎖/min으로 하였다. 컬럼에서 분리된 덱스트로메톨판 및 덱스트로판은 형광 검출기(Ex 200nm, Em 304nm)를 이용하여 검출하였다.

뇨 시료 중의 덱스트로메톨판 및 덱스트로판의 농도 측정을 위해 우선 피험자로부터 채취한 소변 시료 1000㎕와 0.1M 아세트산 완충액 500㎕를 혼합하고 여기에 10,000unit β-글루쿠로니다제 50㎕를 첨가하여 18시간 동안 37℃ 수조에서 반응시켰다. 이후 반응액에 내부표준물질(Internal standard; levallorphan 5㎍/㎖) 50㎕를 첨가하고 가볍게 혼합한 후 포화 카보네이트 용액 500㎕와 헥산 : 부탄올(98 : 5, v/v) 용액 5㎖를 이어서 첨가하고 Multi Reax(Heidolph, 독일)를 사용하여 10분 동안 진탕 추출하였다. 이후 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 유기층을 새 시험관에 옮기고 Speed-Vac(Savant, 미국)을 이용하여 건조시킨 후 메탄올 200㎕에 재용해하고 25㎕를 HPLC 시스템에 주입하였다. 상기 방법에 의해 측정 가능한 덱스트로메톨판 및 덱스트로판의 정량한계 농도는 각각 5 및 100ng/㎖이었으며, 덱스트로메톨판 및 덱스트로판과 내부표준물질의 피크 면적의 비율로부터 표준검량곡선을 수득하였다. 상기 표준검량곡선은 덱스트로메톨판 및 덱스트로판에 대해 각각 5∼250ng/㎖ 및 100∼5000ng/㎖에서 직성선을 나타냈다. 상기 표준검량곡선을 이용하여 뇨 시료 중 덱스트로메톨판 및 덱스트로판의 농도를 구하였다.

<3-3> 뇨 및 혈장 시료 중 로사탄 및 E-3147 농도 분석

뇨 시료 중 로사탄 및 그 대사물인 E3147 농도 분석은 공지의 방법을 변형하여 HPLC를 이용하여 측정하였다(Gonzalez L. et al., J Chromatogr A , 949:49-60, 2002; Polinko M. et al., J Pharm Biomed Anal , 33:73-84, 2003). HPLC 시스템은 길슨(Gilson)사의 307 펌프, 234 오토인젝터, 워터스(Waters)사의 2475 형광 검출기 및 Zorbax C ₈ (5㎛, 150 ㅧ 4.6 mm, Agilent Technologies사, 미국) 컬럼으로 구성하였다. 이동상(mobile phase)은 아세토니트릴 : 0.2% 포름산(37 : 63, v/v)을 사용하였으며, 이때의 유속은 1.0㎖/min 로 하였다. 컬럼에서 분리된 로사탄 및 E-3147은 형광 검출기 (Ex. 250nm, Em 370nm)를 이용하여 검출하였다.

뇨 시료 중의 로사탄 및 E-3174의 농도측정을 위해서 우선 10㎖ 용적의 시험관에 500㎕ 0.5% 포름산 0.5㎖, 내부표준물질(Internal standard ; napthoxyacetic acid 1000ng/㎖) 25㎕을 첨가하고 가볍게 혼합한 후 CH ₂ Cl ₂ : 에테르(40 : 60, v/v) 용액 5㎖를 이어서 첨가하고 Multi Reax(Heidolph, 독일)를 사용하여 10분 동안 진탕 추출하였다. 이후 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 유기층을 새 시험관에 옮겨 Speed-Vac(Savant, 미국)을 이용하여 건조시킨 후 20% 아세토니트릴 200㎕에 재용해하고 25㎕를 HPLC 시스템에 주입하였다. 이 방법을 이용하였을 때 측정 가능한 로사틴 및 E-3174의 정량한계 농도는 5ng/㎖이었으며, 로사틴 및 E-3174과 내부표준물질의 피크 면적 비로부터 표준검량곡선을 수득하였다. 상기 표준검량곡선은 5∼1000ng/㎖에서 직선성을 보였다. 이 표준검량곡선으로부터 뇨 중 로사틴 및 E-3174의 농도를 구하였다.

혈장 시료 중 로사탄 및 E-3174의 농도는 뇨 시료 분석과 동일한 조건과 추출법을 이용하여 측정하였다. 이 방법을 이용하였을 때 측정 가능한 로사탄 및 E-3174의 정량한계 농도는 5ng/㎖이었으며, 로사탄 및 E-3174와 내부표준물질의 피크 면적 비로부터 표준검량곡선은 수득하였다. 상기 표준검량곡석은 5∼1000ng/㎖에서 직선성을 보였다. 상기 표준검량곡선을 이용하여 혈장 중 로사탄 및 E-3174의 농도를 구하였다.

<3-4> 혈장 시료 중 미다졸람, 카페인, 오메프라졸 및 그 대사물의 분석

혈장 시료의 미다졸람, 카페인, 오메프라졸 및 그 대사물의 분석은 공지의 방법을 변형하여 LC/MS/MS를 이용하여 측정하였다(Kashuba et al., Clin Pharmacol Ther , 64(3):269-277, 1998; Streetman et al., Pharmacogenetics , 10:187-216, 2000; Christensen M et al., Clin Pharmacol Ther , 73:517-528, 2003). 이때의 시스템은 Agilent 1100 series HPLC 시스템(Agilent Technologies사, 미국)과 PE SCIEX API 3000 LC/MS/MS 시스템(Applied Bio Systems사, 캐나다)을 사용하였다. HPLC 컬럼은 Luna C ₁₈ (3㎛, 2ㅧ 50mm, Phenomenex Inc. USA)을 사용하였으며, 이동상은 아세토니트릴 : 0.1% 포름산(30 : 70, v/v)을 사용하였고, 이때의 유속은 0.2 ml/min로 하였다. 모든 약물들은 ESI 방식(positive ion mode)으로 이온화한 후 MRM (multiple reaction monitoring) 모드에서 측정하였다. 약물과 대사물 각각의 MRM 분석 조건은 표 3에 나타내었다.

미다졸람 분석을 위해 우선 혈장 0.5㎖에 내부표준물질(Internal standard ; phenacetin 1 μM) 10㎕을 첨가하고 가볍게 섞은 후 2M NaOH 용액 600㎕와 디에틸에테르 : 메틸렌 클로라이드(6:4, v/v) 용액 5ml을 이어서 첨가하고 Multi Reax (Heidolph, 독일)를 사용하여 10분 동안 진탕 추출하였다. 이후 3000rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 유기층을 새 시험관에 옮겨 Speed-Vac(Savant, 미국)을 이용하여 건조시킨 후 30% 아세토니트릴 200㎕에 재용해하고 10㎕를 LC/MS/MS 시스템에 주입하였다. 상기 방법을 이용하였을 때 미다졸람의 정량한계농도는 1ng/㎖이며, 혈장검체에서 미다졸람 내부표준물질의 피크 면적 비로 부터 표준검량곡선을 수득하였다. 상기 표준검량곡선은 1∼50 ng/㎖에서 직선성을 보였다. 상기 표준검량곡선을 이용하여 혈중 미다졸람의 농도를 구하였다.

카페인, 오메프라졸 및 그 대사물의 농도 분석을 위한 추출법은 상기 미다졸람 분석 방법과 거의 동일하며 두 가지 약물을 모두 한번에 추출 하였다. 즉, 혈장 0.5㎖에 내부표준물질(Internal standard ; phenacetin 0.5μM) 10㎕을 첨가하고 가볍게 섞은 후 0.5M NaH ₂ PO ₄ 용액 1000㎕와 디에틸에테르 : 메틸렌 클로라이드 (6:4, v/v) 용액 5ml을 이어서 첨가하고 Multi Reax(Heidolph, 독일)를 사용하여 10분 동안 진탕 추출하였다. 이후 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 유기층을 새 시험관에 옮겨 Speed-Vac(Savant, 미국)을 이용하여 건조시킨 후 30% 아세토니트릴 200㎕에 재용해하고 10㎕를 LC/MS/MS 시스템에 주입하였다.

상기 방법을 이용하였을 때 측정 가능한 카페인 및 파라잔틴의 정량한계 농도는 5ng/㎖이었다. 카페인 및 파라잔틴과 내부표준물질의 피크 면적 비로부터 표준검량곡선을 수득하였다. 상기 표준검량곡선은 5∼1000ng/㎖에서 직선성을 보였다. 상기 표준검량곡선을 사용하여 혈중 카페인 및 파라잔틴의 농도를 구하였다.

오메프라졸과 5-OH 오메프라졸의 정량한계 농도는 각각 5ng/㎖ 및 1.25ng/㎖이었으며, 오메프라졸 및 5-OH 오메프라졸과 내부표준물질의 피크 면적 비로부터 표준검량곡선을 수득하였다. 상기 표준검량곡석은 각각 5∼1600ng/㎖ 및 1.25∼600ng/㎖에서 직선성을 보였다. 상기 표준검량곡선을 사용하여 혈중 오메프라졸 및 5-OH 오메프라졸의 농도를 구하였다.

<실시예 4>

CYP 효소의 대사활성 평가

<4-1> CYP 효소의 대사활성지표의 산출

CYP 효소의 대사활성을 평가하기 위하여 대상 효소에 따라 뇨 혹은 혈장 중 모약물과 대사물의 비와 약동학적 자료를 사용하여 대사활성효소지표를 산출하였다.

CYP1A2 효소의 대사활성은 카페인 투약 후 4시간째에 채취한 혈장 중 파라잔틴의 농도에 대한 카페인 농도의 비율로부터 계산하였으며(CYP1A2=4-h 혈장 파라잔틴/카페인 농도), CYP2C9 효소의 대사활성은 로사탄 투약 후 0시간∼8시간 사이에 채취한 뇨 중 로사틴 농도에 대한 E-3174 농도의 비율로부터 계산하였다(CYP2C9=0~8시간 뇨 중 로사틴 농도/E-3174 농도).

또한, CYP2C19 효소의 대사활성은 오메프라졸 투약 후 4시간째에 채취한 혈장 중 오메프라졸 농도에 대한 5-OH 오메프라졸 농도의 비율로부터 계산하였으며(CYP2C19=3-h 혈장 오메프라졸/5-OH 오메프라졸), CYP2D6 효소의 대사활성은 덱스트로메톨판 투약 후 0시간∼8시간까지 채취한 뇨 중 덱스트로메톨판의 몰 농도에 대한 덱스트로판의 몰 농도 비율의 log값으로부터 계산하였다(CYP2D6=0~8 시간 뇨 중 log[덱스트로메톨판/덱스트로판] 몰 농도 비율).

CYP3A 효소의 대사활성은 미다졸람 투약 후 4시간째에 채취한 혈장 중 미다졸람 농도로부터 계산하거나 (CYP3A=4-h 혈장 미다졸람 농도), 미다졸람의 약동학적 분석을 통한 경구청소율로서 산출하였다(CYP3A=oral clearance). 즉, 미다졸람의 약동학적 특성을 약동학분석 프로그램인 WinNonlin ^® (Pharsight Co. ver. 4.0.1)을 이용하여 비구획(non-compartment) 분석법으로부터 구하였다. 미다졸람의 소실속도상수(K _el )는 최소자승법에 의한 선형회귀분석으로부터 구했으며, 마지막 채혈 시간까지의 곡선하면적(AUC _0-last )은 사다리꼴 공식으로부터 산출하였다. 0시간에서 무한대 시간까지의 곡선하면적인 AUC _inf 는 AUC _0-last +C _last /K _el 의 수식으로부터 구하였고 경구청소율(Cl/F)은 Dose/AUC _inf 의 수식으로부터 산출하였다.

<4-2> 통계적 분석

상기 <4-1>에 기재된 방법에 따라 산출된 5가지 약물 칵테일 동시 투여 시의(약물용법 D의 경우) 대사효소활성 지표와 단독 투여(약물용법 A 및 B의 경우) 또는 3가지 약물 칵테일 투여 시(약물용법 C의 경우)의 대사효소 활성지표와의 차이를 검정하기 위하여 비모수 검정인 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon signed rank test)을 수행하였다. Shapiro-Wilk's value를 이용하여 정규성 검정을 하였으며 정규성이 확보된 자료에 대해서는 대응표본 T 검정(paired t test)을 수행하였다. 또한 두 투약 간 대사활성 차이에 대한 유의성은 각 투약 간 대사활성지표의 비에 대한 구간추정으로 검정하였다. 모든 자료는 평균과 95% 신뢰구간으로 나타내었다. 상기의 분석은 통계분석프로그램인 SAS(Ver. 8.01)와 SPSS(Ver. 10.07)를 이용하여, p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 인정하였다.

실험 결과, 개별약물의 단독 투여 혹은 3가지 약물 칵테일 투여와 5가지 약물 칵테일 투여로 얻어진 개별 대사효소활성지표의 평균, 95% 신뢰구간은 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같다.

또한, 5가지 약물 칵테일에 대한 개별약물 단독투여 또는 3가지 약물 칵테일 투여시 대사효소활성지표의 비의 평균과 95% 신뢰구간은 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같다.

<4-3> 약물의 단독투여시 및 칵테일 투여시 CYP3A 효소의 대사활성지표 비교

미다졸람 경구청소율의 경우 미다졸람 단독 투여시 평균 129L/h(95% 신뢰구간, 100∼157L/h)로 나타났고 5가지 약물 칵테일 투여시에는 평균 123L/h(95% 신뢰구간, 96∼149L/h)로 나타났다(표 4). 따라서, 미다졸람 단독 투여한 경우를 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우와 비교하여 볼 때 두 투약 간에 큰 차이가 없음을 알 수 있었다(p=0.480). 또한 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우 단독 투여한 경우와 비교시 CYP3A 효소의 대사활성이 증가하거나 감소하는 양상은 나타나지 않았다(도 1). 나아가, 5가지 약물의 칵테일 투여시에 대한 단독투여시의 경구청소율 비에 대한 95% 신뢰구간 추정에서도 0.83∼1.13으로 나타나 두 투약 간에 효소활성의 차이가 없음을 알 수 있었다(표 6).

또한 대사활성지표로써 투약 후 4시간째 혈액 검체를 사용한 비율이 적절한지 여부를 확인하고자 피험자 12명에 대하여 개별약물의 단독투여와 5가지 약물 칵테일 투여시를 각각 하나의 개체로 하여 투약 후 4시간째에 채취한 혈액 검체에서의 미다졸람의 농도와 12시간 미다졸람 곡선하면적(AUC _0-12h ) 사이의 상관성을 살펴보았다(n=24). 그 결과, r ² =0.863, p<0.001로 좋은 상관성을 보였다(도 2).

4시간째 채취한 미다졸람의 혈중 농도는 단독 투여 및 5가지 약물의 칵테일 투여시 각각 평균 1.39(95% 신뢰구간, 1.04∼1.74) 및 1.37(95% 신뢰구간, 1.03∼1.71)로 두 투약 간에 큰 차이가 없었다(P=0.875)(도 3).

<4-4> 약물의 단독투여시 및 칵테일 투여시 CYP2C9 대사효소활성지표의 비교

CYP2C9 대사효소활성지표(로사탄/E-3147)의 경우도 단독투여 및 5가지 약물의 칵테일 투여시 각각 평균 0.83(95% 신뢰구간, 0.63∼1.08) 및 0.78(95% 신뢰구간, 0.50∼1.05)로 두 투약 간 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P=0.583)(표 4). 한편, 5가지 약물의 칵테일 투여시 대사효소활성지표의 편차가 다소 증가하는 양상을 나타냈으나 전체적으로 볼 때 대사가 증가하거나 감소하는 경향을 나타내지는 않았다(도 4). 또한 대사효소활성지표 비에 대한 95% 신뢰구간 추정시 0.70∼1.24로 두 투약 간 차이를 보이지 않았으며 한쪽으로 치우치는 경향도 보이지 않았다(표 6).

나아가, 대사활성지표로써 0~8시간까지의 뇨 검체를 사용한 비율이 적절한지 여부를 확인하고자 피험자 12명에 대하여 단일 약물투여와 5가지 약물 칵테일 투여시를 각각 하나의 개체로 하여 투약 후 0~8시간 사이에 채취한 소변 검체에서의 로사탄/E-3174 비와 혈액 검체에서의 12시간 로사탄/E3174 곡선하면적(AUC _0-12h ) 비 사이의 상관성을 살펴보았다(n=24). 그 결과, r ² =0.726, p<0.001로 좋은 상관성을 보였다(도 5). 또한 추가로 수행한 8∼12시간 사이에 채취한 소변에서의 로사탄/E-3147 비와 12시간 로사탄/E-3174 곡선하면적(AUC) 비 사이에도 좋은 상관성을 보였다(r ² =0.693, p<0.001)(도 6). 따라서, 0~8시간 사이에 채취한 소변 검체 및 0~12시간 사이에 채취한 소변 검체 모두 대사활성지표의 산출을 위해 사용하는 것이 무방한 것으로 사료되었다. 한편, 시험절차상의 간편성을 고려할 때 0~8시간 사이에 채취한 소변 검체를 사용하는 것이 좀더 적절한 것으로 판단되나, 상황에 따라서 어느 것을 사용해도 큰 문제가 없을 것으로 사료되었다.

<4-5> 3가지 또는 5가지 약물의 칵테일 투여시 CYP1A2 대사효소활성지표의 비교

CYP1A2 대사효소활성지표(파라잔틴/카페인)의 경우 3가지 약물의 칵테일 투여 및 5가지 약물의 칵테일 투여시 각각 평균 0.38(95% 신뢰구간, 0.32∼0.42) 및 0.37(95% 신뢰구간, 0.28∼0.46)로 두 투약 간 비교시 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P=0.583)(표 5). 또한 CYP2C9의 경우에서와 마찬가지로 3가지 약물의 칵테일 투여시와 비교해 보면 5가지 약물의 칵테일 투여시 대사효소활성지표의 편차가 다소 증가하는 모습을 보였으나 전체적으로 볼 때 대사가 증가하거나 감소하는 경향을 나타내지 않았다(도 7). 나아가, 대사활성지표의 비에 대한 95% 신뢰구간 추정 시 0.81∼1.14로 두 투약 간 차이를 보이지 않았다(표 7).

대사활성지표로서 투약 후 4시간째 채취한 혈액검체를 사용하는 것이 적절한지 여부를 확인하고자 피험자 12명에 대하여 3가지 약물 칵테일 투여와 5가지 약물 칵테일 투여시를 각각 하나의 개체로 하여 투약 후 4시간째 채취한 혈액에서의 파라잔틴/카페인의 농도 비와 혈액 검체에서의 12시간 파라잔틴/카페인 곡선하면적(AUC _0-12h ) 비 사이의 상관성을 살펴보았다(n=24). 그 결과, r ² =0.949, p<0.001로 좋은 상관성을 보였다(도 8). 따라서, 4시간째 채취한 혈액에서의 파라잔틴/카페인의 비가 효소대사활성을 반영하는 좋은 지표임을 알 수 있었다.

<4-6> 3가지 또는 5가지 약물의 칵테일 투여시 CYP2C19 대사효소활성지표의 비교

CYP2C19 대사효소활성지표(오메프라졸/5-OH 오메프라졸)의 경우 3가지 약물 칵테일 투여 및 5가지 약물 칵테일 투여시 각각 평균 2.49(95% 신뢰구간, 1.62∼3.36) 및 2.59(95% 신뢰구간, 1.80∼3.37)로 두 투약 간 비교시 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P=0.248)(표 5).

또한 3가지 약물 칵테일을 투여한 경우와 비교시 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우 CYP2C19 효소의 대사활성이 증가하거나 감소하는 양상은 나타나지 않았다(도 9). 나아가 대사효소활성지표의 비에 대한 95% 신뢰구간 추정에서 0.81∼1.14로 두 투약간 차이를 나타내지 않았다(표 7).

대사활성지표로서 투약 후 3시간째 채취한 혈액검체를 사용하는 것이 적절한지 여부를 확인하고자 피험자 12명에 대하여 3가지 약물 칵테일 투여와 5가지 약물 칵테일 투여시를 각각 하나의 개체로 하여 투약 후 3시간째 채취한 혈액에서의 오메프라졸/5-OH 오메프라졸 농도 비와 혈액에서의 12시간 오메프라졸/5-OH 오메프라졸 곡선하면적(AUC _0-12h ) 비 사이의 상관성을 살펴보았다(n=24). 그 결과, r ² =0.865, p<0.001로 좋은 상관성을 보였다(도 10). 한편, 2시간째에 채혈한 혈액에서 1명의 피험자의 경우 오메프라졸이 검출되지 않았다. 따라서, 상기 2시간째에 채혈한 혈액은 적절하지 않은 검체로 판단되었다. 또한, 4시간째 채취한 혈액에서 오메프라졸/5-OH 오메프라졸 농도 비와 혈액 검체에서의 12시간 오메프라졸/5-OH 오메프라졸 곡선하면적(AUC _0-12h ) 비 사이의 상관성을 비교한 결과, r2=0.908, p<0.001로 좋은 상관성을 보였다(도 11). 한편, 칵테일을 탐침약물로 사용한 CYP1A2 효소 활성을 측정하기 위한 적절한 검체를 투약 후 4시간째 혈액으로 선정하였으므로 시험 편의상 CYP2C19 효소 활성을 측정하기 위한 적절한 검체로서 투약 후 4시간째에 채취한 혈액을 사용하는 것이 합리적인 것으로 판단되었다.

상기 4시간째 채취한 혈액에서 오메프라졸/5-OH 오메프라졸 농도 비는 3가지 약물 칵테일 투여 및 5가지 약물 칵테일 투여시 각각 평균 2.09(95% 신뢰구간, 1.18∼3.01) 및 2.21(95% 신뢰구간, 1.35∼3.08)로 두 투약 간 큰 차이가 없었다(P=0.328)(도 12). 또한, 3가지 약물 칵테일 투여에 대한 5가지 약물 칵테일 투여 시 비의 95% 신뢰구간이 0.89에서 1.36으로 1을 포함하므로 두 투약간 대사효소활성 지표가 차이가 없음을 알 수 있었다.

<4-7> 3가지 또는 5가지 약물의 칵테일 투여시 CYP2D6 대사효소활성지표의 비교

CYP2D6 대사활성지표(log[덱스트로메톨판/덱스트로판])의 경우 3가지 약물 칵테일 투여 및 5가지 약물 칵테일 투여시 각각 평균 -2.24(95% 신뢰구간, -26∼-1.88) 및 -2.39(95% 신뢰구간, -2.81∼-1.97)로 두 투약 간 비교 시 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P=0.136)(표 5). 또한 3가지 약물 칵테일을 투여한 경우와 비교시 5가지 약물 칵테일을 투여한 경우 CYP2D6 효소의 대사활성이 증가하거나 감소하는 양상은 나타나지 않았다(도 13). 대사효소활성지표의 비에 대한 95% 신뢰구간 추정에서 0.98∼1.15로 두 투약 간 차이를 보이지 않았다(표 7).

상기와 같은 실험결과들로부터 5가지 약물의 칵테일 투여시의 대사효소활성지표는 단독투여 또는 3가지 약물의 칵테일 투여시의 대사효소활성지표와 비교 시 통계적으로 유의한 차이를 보여주지 않았다. 또한 각 투약 간 대사효소활성지표의 비에 대한 95% 신뢰구간을 구했을 때 모두 1을 포함하므로, 각 투약 간 대사효소활성지표가 차이가 없음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 5가지 약물 칵테일을 포함하는 사이토크롬 P450 효소 활성도의 고속 평가용 인제 칵테일 키트는 탐침약물 간에 상호작용을 나타내지 않으면서도 부작용이 없이 5종의 시토크롬 P450 효소의 대사활성을 동시에 고속으로 측정할 수 있는 장점이 있다. 특히 종래 칵테일의 경우에는 와파린 등의 사용으로 인한 부작용이 발생할 수 있지만, 인제칵테일은 이러한 부작용 발생 없이 사용할 수 있다. 또한 인제 칵테일은 최소한의 침습적 시료 채취 (4시간 혈액 1회 및 8시간 뇨 1회) 만을 필요로 하고, LC/MS/MS를 이용한 동시 분석을 통해 분석시간을 단축할 수 있는 장점이 있다.