双孢蘑菇PPO基因片段及在降低PPO酶活性方面的应用 |
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| 申请号 | CN201610099122.X | 申请日 | 2016-02-23 | 公开(公告)号 | CN105567709A | 公开(公告)日 | 2016-05-11 |
| 申请人 | 浙江农林大学; | 发明人 | 李南羿; 林海萍; 杨婉玲; | ||||
| 摘要 | 一种双孢蘑菇PPO基因 片段 ，如 序列表 SEQ ID NO:1所示，该片段在降低PPO酶活性方面的应用按如下四个步骤进行：一是分离克隆双孢蘑菇PPO基因的cDNA片段序列，二是双孢蘑菇PPO基因反义表达载体的构建，三是双孢蘑菇的遗传转化，四是转基因双孢蘑菇PPO酶活性 水 平和褐变程度的试验与测定。采用本方法获得的转基因双孢蘑菇子实体中PPO酶活性水平下降41%-62%，采后储藏褐变受到抑制，实现了利用反义PPO基因调控PPO酶活性水平，抑制双孢蘑菇采后褐变的目的，应用于改良双孢蘑菇易褐变品质具有广阔的前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种PPO基因cDNA片段，其特征是该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。 |
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| 说明书全文 | 双孢蘑菇PPO基因片段及在降低PPO酶活性方面的应用技术领域背景技术[0002] 多酚氧化酶(polyphenol oxidase)简称为PPO，是导致双孢蘑菇采后褐变的关键酶。褐变可导致双孢蘑菇采后商品性下降、缩短货架期，每年因褐变导致的蘑菇采后损失率高达30％～35％。双孢蘑菇中的PPO具甲酚酶(cresolase,EC 1.14.1.18)和儿茶酚氧化酶(catecholase,EC 1.10.3.1)活性，可作用于单酚和邻苯二酚，反应产物醌类发生非酶促亲电聚合反应，形成黑色素，导致褐变。研究表明，通过降低PPO酶的活性，可以抑制果蔬类采后褐变。例如，利用低温、Cu螯合剂、光甘草素等物理化学方法抑制PPO酶的活性，可以减轻双孢蘑菇褐变，延长保鲜期。在马铃薯中，通过抑制PPO基因表达，可以抑制马铃薯中的褐变。因此，如能通过抑制PPO基因的表达来降低PPO酶的活性，实现对双孢蘑菇采后褐变的抑制，可为双孢蘑菇采后褐变的改善提供技术依据，对提高双孢蘑菇采后品质、延长保鲜期，是有益的、可行的，经检索至今未见相关的资料报道和新菌株问世。 发明内容[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种双孢蘑菇PPO基因cDNA片段及在降低PPO酶活性方面的应用。 [0004] 解决上述技术问题采用如下技术方案： [0006] 双孢蘑菇PPO基因cDNA片段及在降低PPO酶活性方面的应用按如下步骤进行： [0007] (1)分离克隆双孢蘑菇PPO基因cDNA片段序列：提取双孢蘑菇子实体总RNA，反转录合成cDNA，通过与GenBank已知的双孢蘑菇PPO基因序列进行比对设计兼并引物，利用反转录PCR获得扩增产物，扩增产物经琼脂糖凝胶回收，回收产物克隆到pMD18-T载体中并测序，利用分子生物学工具分析测序结果，与双孢蘑菇PPO基因比对，确定为PPO基因与铜结合酶活性中心的保守区片段，并命名为antiPPO； [0008] (2)双孢蘑菇反义PPO基因反义表达载体的构建：利用限制性内切酶和连接酶将antiPPO基因与经过酶切的表达载体pCamG进行连接，将antiPPO基因反向插入pCamG，获得双孢蘑菇重组双元表达载体，命名为pCamG-antiPPO； [0009] (3)双孢蘑菇的遗传转化:将上述表达载体pCamG-antiPPO利用农杆菌介导法转化双孢蘑菇，获得具有潮霉素抗性的转基因蘑菇，提取转基因蘑菇菌丝体DNA，利用特异上引物和下引物进行PCR扩增鉴定，确定获得双孢蘑菇转基因菌丝体； [0010] (4)转基因双孢蘑菇PPO酶活性水平和抗褐变程度的测定：利用粪草料二次发酵法进行栽培出菇，利用分光光度法检测转基因双孢蘑菇与未转基因蘑菇中PPO酶活性水平,转基因双孢蘑菇PPO酶活水平显著降低；转基因双孢蘑菇与未转基因对照15℃储藏时进行褐变程度的对比实验，转基因双孢蘑菇15℃储藏时褐变程度受到抑制，说明在双孢蘑菇中转入反义PPO基因，显著降低PPO酶活性水平，转基因蘑菇抗褐变品质明显改善。 [0011] 本发明的有益效果是，从双孢蘑菇中分离克隆PPO基因cDNA序列，将该基因的编码区以反向方式插入到双孢蘑菇双元表达载体并转入双孢蘑菇中，与未转基因蘑菇相比，转基因蘑菇PPO酶活性水平下降41％-62％，采后储藏褐变受到抑制，因此，本发明实现了利用反义PPO基因调控双孢蘑菇PPO酶活性水平，对改良双孢蘑菇抗褐变品质具有重要意义。附图说明 [0012] 图1为本发明所用双孢蘑菇双元表达载体pCamG-antiPPOb构建示意图。 [0013] 图2为转基因双孢蘑菇菌丝体(1)(2)和子实体(3)(4)形态图。 [0014] 图3为转基因蘑菇的PCR检测电泳图。 [0015] 图4为转基因双孢蘑菇与对照蘑菇子实体中PPO酶活性对比图。 [0016] 图5为转基因双孢蘑菇与对照蘑菇子实体15℃储藏时褐变值(L值)对比图。 具体实施方式[0018] 本PPO基因cDNA片段核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。 [0019] 双孢蘑菇PPO基因cDNA片段及在降低PPO酶活性方面的应用按如下步骤进行： [0020] (1)分离克隆双孢蘑菇反义PPO基因cDNA片段序列 [0021] 采用改良Trizol法提取双孢蘑菇子实体总RNA，将0.1g子实体液氨研磨成粉末，加入1mLTrizol试剂(Invitrogen公司)剧烈震荡混匀；冰上静置20min，12000rpm，4℃离心15min；取上清，加入1/5体积氯仿，涡旋混匀，室温静置5min，12000rpm,4℃离心20min；取上清，加入等体积氯仿，涡旋混匀，室温静置5min，12000rpm,4℃离心20min；取上清，加入1/2体积异丙醇，1/2体积高盐缓冲液(0.8M柠檬酸钠,1.2M NaCl)，倒转混匀，-20℃放置30min， 12000rpm,4℃离心20min；弃上清，加入1mL75％的乙醇，12000rpm,4℃，10min；弃上清，常温干燥；加入30μl DEPC水溶解，进行电泳及紫外分光光度计检测； [0022] 利用反转录酶将总RNA反转录合成第一链cDNA，先在DEPC处理过的1.5mL离心管中加入约1μg总RNA和1μl 0.5μg/μl的Oligo(dT)18primer,小心混匀,70℃保温5min,立即置于冰上；按次序分别加入下列试剂：4μl 5×Frist-strand Buffer，1μl dNTP mix(10mM)，2μl 100mM DTT，1μl RNase抑制剂(40U/μl)，1μl SuperScriptTM II Reverse Transcriptase，然后加DEPC水到20μl；小心混匀，室温离心5秒，将所有溶液收集到管底，42℃保温50min；72℃反应15min，冰上冷却，-20℃保存备用； [0023] 通过与GenBank已知的真菌PPO基因序列进行比对设计简并引物，再在NCBI查找并下载真菌PPO基因序列，利用Clustalx进行序列比对，根据序列相似性判断真菌PPO基因的铜结合CuA和CuB保守区，根据保守区序列设计简并引物，引物序列如下：上游引物AbPPO-F：5’-CAACGGCCTCTTCCCC(C/G)(C/G)(A/C)TGGCA(C/T)(A/C)G-3’(SEQ ID NO:3)；下游引物AbPPO-R：5’-GGTCGACGTTGCAGTGGTG(A/C)A(G/T)(A/G)(C/T)A(A/G)A A-3’(SEQ ID NO:4)。 以上述cDNA第一链为模板，通过此对引物进行PCR扩增，PCR体系如下： [0024] 10×EX Taq buffer 5μl [0025] AbPPO-F(10mM) 1μl [0026] AbPPO-R(10mM) 1μl [0027] dNTPs(200μM) 4μl [0028] EX Taq polymerase(5U/μl) 0.5μl [0029] 反转录cDNA产物 2μl [0030] PCR water 36.5μl [0031] 扩增条件为：PCR参数为：94℃3min 1cycle；94℃30sec，63℃1min，72℃1min，15cycles；94℃30sec，56℃1min，72℃1min，20cycles；72℃10min 1cycle。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，回收产物克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-antiPPOa载体，测序，获得双孢蘑菇PPO基因保守区片段；将该基因命名为antiPPO。 [0032] (2)双孢蘑菇antiPPO基因双元表达载体pCamG-antiPPO的构建 [0033] 根据步骤(1)中获得的双孢蘑菇PPO基因编码区设计引物，上游引物为antiPPO-BEII F：5’-GCAGGTCACCAACGGCCTCTTCCCCGGATGGCATCG-3’(SEQ ID NO:5)；下游引物为antiPPO-BgII R：5’-TCGAGATCT GGTCGACGTTGCAGTGGTGCAGGTAGAA-3’(SEQ ID NO:6).下划线区域的序列为附加序列，用于和表达载体的连接克隆。以步骤(1)的载体pMD18-T-antiPPOa质粒DNA为模板，扩增编码区序列，PCR体系如下： [0034] 2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25μl [0035] antiPPO-BgII F(10mM) 1μl [0036] antiPPO-BEII R(10mM) 1μl [0037] pMD18-T-antiPPOa质粒DNA(20ng/μL) 1μl [0038] PCR water 22μl [0039] 扩增条件为：94℃3min 1cycle；98℃10sec，56℃15sec，72℃5sec，35cycles；72℃10min 1cycle。PCR反应结束后按照TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段。 [0040] 回收的DNA两段加A，反应体系如下： [0041] 10×Ex Taq Buffer 1μl [0042] dNTPs(2.5mM) 0.4μl [0043] 回收DNA产物 5μl [0044] EX Taq polymerase(5U/μl) 0.2μl [0045] ddH2O 3.4μl。 [0046] 反应条件为：95℃反应2min，72℃反应15min。回收产物加A后克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-ant iPPOb载体。 [0047] 用BglⅡ和Bst EⅡ双酶切pMD18-T-antiPPOb载体，酶切体系如下： [0048] pMD18-T-antiPPOb载体质粒(200ng/μl) 10μl [0049] 10×H Buffer 5μl [0050] Bgl Ⅱ 1μl [0051] Bst E Ⅱ1μl [0052] ddH2O 33μl [0053] 37℃酶切2小时后电泳切胶回收； [0054] 用Bg1Ⅱ和Bst EⅡ双酶切pCamG载体，酶切体系如下： [0055] pCamG载体质粒(200ng/μl) 5μl [0056] 10×H Buffer 5μl [0057] Bg1 Ⅱ 1μl [0058] Bst E Ⅱ1μl [0059] ddH2O 38μl [0060] 37℃酶切2小时后电泳切胶回收； [0061] 将目的片段和载体进行连接，反应体系如下： [0062] 10×T4DNA ligase buffer 1μl [0063] T4DNA Ligase(350U/μl) 0.5μl [0064] DNA片段(100ng/μl) 4μl [0065] PCamG vector(BglⅡ/Bst EⅡ)(50ng/μl) 2μl [0066] ddH2O 2.5μl [0067] 16℃连接30min后置于冰上，取8μl反应液转化感受态细胞DH5α。测序验证重组克隆插入片段的序列信息，含有目的基因序列的正确质粒命名为pCamG-antiPPO(双元表达载体结构见图1)。 [0068] (3)双孢蘑菇的遗传转化 [0069] 将上述构建的真菌双元表达载体pCamG-antiPPO转化至农杆菌菌株LBA4404，28℃培养，挑取携带双元表达载体pCamG-antiPPO质粒的农杆菌单菌落，接种在3-5ml含50mg/L Rif和50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜，直至对数生长OD600为0.6-0.8；活化过夜的农杆菌按1：100的比例接种在相同的20～50ml YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期；取双孢蘑菇菌褶组织，切成3mm的组织块到无菌瓶中，加入农杆菌菌液，28℃120rpm振荡30min；取出外植体用无菌水反复冲洗后，滤纸吸干菌褶组织块表面水分，转入带滤纸的CM培养基上，25℃黑暗培养培养1天；菌褶转入含Hyg35mg/L和Cef 200mg/L的CM培养基上，25℃黑暗培养3-4周；待抗性菌丝体长出后，在含Hyg35mg/L和Cef 200mg/L的CM培养基上继续转管培养一次，获得潮霉素抗性菌丝体(转基因菌株见图2)。 [0070] 对获得的抗性菌丝体进行进一步的鉴定，取0.1g菌丝体，液氮研磨成粉末，加入DNA提取液(2％SDS，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，50mM EDTA,pH8.0，1％β-巯基乙醇)700μl,转入1.5ml离心管中，65℃保温50min；12000rpm，4℃离心15min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心15min；取上清，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)混匀，12000rpm离心15min；取上清液至一新离心管，加入1/10体积NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇(冰冷)，沉淀DNA，离心去上清，70％乙醇洗沉淀，干燥后溶解于100μl TE中。以潮霉素hyg序列设计引物，上游引物为5’-CTGCTCCATACAAGCCAACCA-3’(SEQ ID NO:7)，下游引物为5’-GACAGCGTCTCCGACCTGAT-3’(SEQ ID NO:8)，以上述提取到的DNA为模板，进行PCR扩增,检测到有条带(600bp)的即为阳性转化菌丝体，即转基因菌株(转基因菌株的PCR检测电泳图见图3)。转基因菌株转入麦粒培养基上培养，利用粪草料二次发酵法进行栽培出菇，获得转基因双孢蘑菇子实体。 [0071] (4)转基因双孢蘑菇PPO酶活性的变化和褐变程度测定 [0072] 取步骤(3)中获得转基因双孢蘑菇子实体冻干样品100mg，液氮研磨后加入1mL pH6.5磷酸提取缓冲液,混匀放冰上25min，12,000rpm，4℃离心10min；取0.1mL上清液，加入0.9mL底物反应液(15mmol/L L-DOPA，100mmol/L pH6.5磷酸钠缓冲液)，25℃反应2min，利用分光光度计检测波长478nm吸光值。一个PPO酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟吸光值改变0.01所需的酶量。转基因双孢蘑菇与未转基因对照PPO活性水平图见图4。 [0073] 转基因双孢蘑菇褐变程度测定：转基因双孢蘑菇和未转基因对照在15℃贮藏，用WSC-S型全自动测色色差计定期测量蘑菇菇盖褐变值L值，转基因双孢蘑菇与未转基因对照L值见图5。 [0074] 下面，将与本申请有关的附图情况说明如下： [0075] 尚需说明的是图1表示本申请所用双元表达载体pCamG-antiPPO构建示意图，其中所标记的(1)表示潮霉素抗性标记基因，(2)表示gpd启动子，(3)表示antiPPO基因，(4)表示NOS终止子，(5)表示BglⅡ酶切插入位点，(6)表示Bst EⅡ酶切插入位点。antiPPO基因位于gpd启动子下游，NOS终止子上游。 [0076] 图2为转基因双孢蘑菇不同时期的生长图，其中所标记的(1)为农杆菌侵染后的菌褶组织形态图，(2)在含潮霉素CM培养基上的双孢蘑菇抗性菌丝体形态图，(3)转基因双孢蘑菇菌丝体进行出菇培养后获得的子实体形态图，(4)转基因双孢蘑菇成熟的子实体形态图。 [0077] 图3为转基因双孢蘑菇菌丝体的PCR检测电泳图，从左侧起第一泳道为阴性对照(不含模板、只加扩增引物)，DL2000Markers分子量标记，阳性对照(含有antiPPO基因的质粒DNA)，野生型双孢蘑菇，转基因菌丝体1、2、3、4、5、6、7。图3显示出，阳性对照和转基因植株均可扩增出600bp条带，而阴性对照和未转基因双孢蘑菇均未扩增出这一条带。 [0078] 图4为转基因烟草与对照双孢蘑菇子实体PPO酶活性水平对比图，纵坐标表示PPO酶活性(单位OD/g/min)，横坐标从左侧起分别表示野生型双孢蘑菇、转基因双孢蘑菇1、2、3、4。图4显示出转基因双孢蘑菇子实体中的PPO酶活水平均低于野生型双孢蘑菇。 [0079] 图5为转基因双孢蘑菇与对照双孢蘑菇子实体15℃贮藏时菇盖L值(褐变指数)对比图，纵坐标表示菇盖表面L值(褐变指数)，横坐标从左侧分别表示野生型双孢蘑菇、转基因双孢蘑菇1、2、3、4；每一横坐标对应3个15℃储藏时间段，从左向右分别为：0d、1d、2d。图5显示出15℃储藏时转基因双孢蘑菇菇盖表面L值平均高于野生型双孢蘑菇，菇盖褐变程度低于野生型双孢蘑菇。 |
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