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합성 엽록체 전이 펩티드 {SYNTHETIC CHLOROPLAST TRANSIT PEPTIDES}
우선권 청구 본 출원은 2012년 2월 1일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제61/593,555호, 및 또한 2012년 4월 17일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제61/625,222호의 이점을 주장한다. 37 CFR § 1.821 (c) 또는 (e)에 따른 진술 - ASCII 텍스트 파일로 제출된 서열 목록 37 CFR § 1.821(c) 또는 (e)에 따라, ASCII 텍스트 버전의 서열 목록을 포함하는 파일을 본 출원과 동시에 제출하였고, 그 내용은 본원에 참고로 삽입된다. 기술분야 본 개시내용은 색소체-함유 세포의 색소체로 표적화되는 폴리펩티드를 유전적으로 코딩하고, 발현하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드를 엽록체 (예를 들어, 보다 고등 식물의 엽록체)로 표적화하는 아미노산 서열, 및/또는 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 키메라 폴리펩티드의 색소체로의 전이를 제어하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 및/또는 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
식물 세포는 특징적인 막 시스템에 의해 경계가 정해져 있고, 세포내 분화된 기능을 수행하는, 일반적으로는 "색소체"로 지칭되는 독특한 세포하 세포소기관을 포함한다. 특정 색소체는 광합성 뿐만 아니라, 특정 화학 화합물의 합성 및 저장도 담당한다. 모든 색소체는 식물의 분열 조직부에 존재하는 전색소체로부터 유래된다. 전색소체는 예를 들어, 엽록체, 에티오플라스트, 유색체, 게론토플라스트, 백색체, 아밀로플라스트, 엘라이오플라스트, 및 단백질체로 발생할 수 있다. 자기 자신의 유전 시스템 및 단백질 합성 기구를 함유하지만, 그의 발생 및 생합성 활성에서 핵-세포질 시스템과의 긴밀한 협력에 의존하는 색소체는 세포내에서 반-자율 방식으로 존재한다. 고등 식물의 광합성 잎 세포에서 가장 눈에 띄는 색소체는 엽록체이다. 엽록체의 가장 본질적인 기능은 광합성의 광-구동 반응 수행이다. 그러나, 엽록체는 또한 식물 세포에 중요한 많은 다른 생합성 과정을 수행한다. 예를 들어, 세포의 지방산들은 모두 엽록체 스트로마에 위치하는 효소에 의해, 상기 위치에서 쉽게 이용가능한 ATP, NAOPH 및 탄수화물을 이용하여 제조된다. 또한, 광-활성화된 전자의 환원력이 엽록체에서의 아질산염 (NO 2 - )의 암모니아 (NH 3 )로의 환원을 구동시킨다; 상기 암모니아는 아미노산 및 뉴클레오티드 합성을 위해 요구되는 질소를 식물에 제공한다. 엽록체는 또한 농약 산업에서 특히 중요한 과정에 참여한다. 예를 들어, 많은 제초제는 엽록체 내에서 수행되는 기능을 차단시킴으로써 작용하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구 결과, 여러 제초제의 특이적인 표적이 확인되었다. 예를 들어, 트리아진-유도 제초제는 광계 II의 32 kD 폴리펩티드 중의 그의 결합 부위로부터 플라스토퀴논 분자를 대체함으로써 광합성을 억제시킨다. 상기 32 kD 폴리펩티드는 엽록체 게놈에서 코딩되고, 세포소기관 기구에 의해 합성된다. 트리아진 제초제에 대해 저항성을 가지는 돌연변이체 식물을 수득하였다. 상기 식물은 트리아진 제초제에 의해 플라스토퀴논이 더 이상 대체될 수 없는 돌연변이체 32 kD 폴리펩티드를 포함한다. 술포닐우레아는 엽록체에서의 아세토락테이트 합성을 억제시킨다. 아세토락테이트 신타제는 이소류신 및 발린 합성에 관여한다. 글리포세이트는 방향족 아미노산의 합성에 관여하는 효소인 5-에놀 피루빌-3-포스포시키메이트 신타제 (EPSPS)의 기능을 억제시킨다. 상기 효소들 모두 핵 게놈에 의해 코딩되지만, 이들은 실제 아미노산 합성이 이루어지는 엽록체로 전위된다. 대부분의 엽록체 단백질은 식물 세포의 핵에서 코딩되고, 세포질에서 보다 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 번역 후에 엽록체로 이입된다. 외부 및 내부 외피 막을 가로질러 이루어지는 스트로마 내로의 이입은 스트로마, 틸라코이드 막, 및 틸라코이드 루멘으로 예정된 단백질 유입에 중요한 수단이다. 이입된 전구체 단백질을 틸라코이드 막 및 틸라코이드 루멘으로 국재화시키는 것은 박테리아 단백질 수송 시스템과 상동성인 두 기전을 포함하는, 4개의 독특한 기전에 의해 달성된다. 따라서, 엽록체에서 단백질 국재화를 위한 기전은 부분적으로는 원핵성 내공생체로부터 유래된 것이다 (문헌 [Cline and Henry (1996), Annu . Rev . Cell . Dev . Biol. 12:1-26]). 엽록체 발현으로 예정된 전구체 단백질은 엽록체 전이 펩티드 (CTP)로 알려져 있는 N-말단 연장부를 포함한다. 전이 펩티드는 엽록체 표면의 특이적인 인식에 중요하고, 엽록체 외피를 가로질러 거기서 엽록체 내의 다양한 서브구획 (예컨대, 스트로마, 틸라코이드, 및 틸라코이드 막)으로 이루어지는 프리-단백질의 번역 후 전위를 매개하는 데 중요하다. 상기 N-말단 전이 펩티드 서열은 엽록체 단백질의 색소체 내로의 이입에 필요한 모든 정보를 포함하고: 전이 펩티드 서열은 색소체 이입을 위해 필수적이고, 충분하다. 그의 N-말단에 자연적으로 코딩된 전이 펩티드 서열을 가지는 것으로 보고된 식물 유전자로는 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제 (RuBisCo) (문헌 [de Castro Silva-Filho et al., (1996), Plant Mol . Biol . 30:769-80]; [Schnell et al., (1991), J. Biol . Chem . 266:3335-42]); EPSPS (예컨대, 문헌 [Archer et al., (1990), J. Bioenerg . and Biomemb . 22:789-810] 및 미국 특허 6,867,293, 7,045,684, 및 Re. 36,449 참조); 트립토판 신타제 (문헌 [Zhao et al., (1995), J. Biol . Chem . 270:6081-7]); 플라스토시아닌 (문헌 [Lawrence et al., (1997), J. Biol . Chem . 272:20357-63]); 코리스메이트 신타제 (문헌 [Schmidt et al., (1993), J. Biol . Chem . 268:27447-57]); 집광 엽록소 a/b 결합 단백질 (LHBP) (문헌 [Lamppa et al., (1988), J. Biol . Chem . 263:14996-14999]); 및 아라비돕시스 탈리아나( Arabidopsis thaliana )의 엽록체 단백질 (문헌 [Lee et al., (2008), Plant Cell 20:1603-22])의 엽록체 작은 서브유닛을 포함한다. 미국 특허 공개 번호 US 2010/0071090은 클라미도모나스 속( Chlamydomonas sp . )으로부터의 특정 엽록체 표적화 펩티드를 제공한다. 그러나, 비록 독립된 구조적 모티프를 가지는 엽록체 표적화 펩티드의 독특한 서브군이 존재할 가능성도 있기는 하지만, 그의 서열 다양성 수준이 높고, 공통 또는 컨센서스 서열 모티프가 부족하기 때문에, 엽록체 표적화 펩티드에 의해 코딩되는 정보에 관한 구조상의 요건은 여전히 파악하기가 어려운 상태이다 (문헌 [Lee et al., (2008), 상기 문헌 동일). 추가로, 상기 서열 모두가 고등 식물에서 엽록체-표적화된 단백질의 이종성 발현에 유용한 것은 아니다.
개시내용 본원에서는 식물에서 폴리펩티드의 색소체 표적화를 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 합성 엽록체 전이 펩티드 (예컨대, TraP23 펩티드)를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 단자엽 또는 쌍자엽 식물에서 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하고 표적화하는 데 유용할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 합성 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 기술한다. 일부 실시양태에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 효소의 정렬로부터 수득된 참조 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다양한 유기체로부터의 부분 CTP 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 참조 EPSPS CTP 각각으로부터 수득된 인접 뉴클레오티드 서열, 또는 상기한 것들 중 임의의 것의 기능성 변이체일 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하나 초과의 CTP 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 예에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 EPSPS 효소로부터 부분 CTP 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 구체적인 예에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 EPSPS 효소로부터 수득된 인접 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 1개 이상의 EPSPS 유도 수단을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 1개 이상의 EPSPS 유도 수단을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 추가로 기술한다. 특정 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 단자엽 또는 쌍자엽 식물에서 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하고 표적화하는 데 유용할 수 있다. 본 개시물의 목적을 위해, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 EPSPS 유도 수단은 특정 합성 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 EPSPS 유도 수단은 본원에서 TraP23으로 칭해지는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에서는 또한 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질 (예를 들어 제한 없이, 식물, 식물 조직, 및 식물 세포)도 기술한다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 그의 게놈에 안정하게 통합되어 있는 상기 핵산 분자를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 생성물을 일과적으로 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 식물을 생산하기 위해 재생될 수 없는 식물 세포이다. 색소체 함유 세포의 색소체 (예를 들어, 엽록체)에서 색소체 함유 세포 (예를 들어, 식물) 중의 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방법 또한 기술한다. 특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 관심 뉴클레오티드 서열의 발현 생성물에 융합된 합성 CTP를 포함하는 전구체 융합 폴리펩티드가 식물 세포의 세포질에서 생산된 후, 이어서, 융합 폴리펩티드가 생체내에서 식물 세포의 엽록체 내로 수송되도록 할 수 있다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 식물 세포는 식물을 생산하기 위해 재생될 수 없다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법도 추가로 기술한다. 상기 트랜스제닉 식물로부터 생산된 식물 일용 생성물 (예컨대, 종자) 또한 기술한다. 상기 및 다른 특징은 첨부된 도면을 참조로 하여 진행되는, 수개의 실시양태에 관한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
도 1은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP-코딩 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, TraP23)의 특정 예를 대표하는 mRNA 분자를 도시한 것이다. 일부 실시양태에서, mRNA 분자 (예컨대, 제시된 것과 같음)는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP-코딩 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA 분자로부터 전사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열은 관심 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어, 제한 없이, 색소체로 표적화되는 마커 유전자 생성물 또는 펩티드일 수 있다.
도 2는 다중 EPSPS 엽록체 전이 펩티드 서열의 정렬을 도시한 것이다. 음영진 아미노산 잔기는 TraP23에 대해 선택된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 pDAB107640의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
도 4는 담배 잎 조직 내로의 TraP23-GFP 침투의 현미경 영상을 도시한 것이다.
도 5는 pDAB106598의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
도 6은 옥수수 원형질체의 엽록체 내로의 전위를 보여주는, 옥수수 원형질체로 형질전환된 TraP23-GFP의 현미경 영상을 도시한 것이다.
도 7은 pDAB109808의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
도 8은 pDAB107687의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
상세한 설명 I. 수개의 실시양태에 관한 개요 엽록체 전이 펩티드 (CTP) (또는 색소체 전이 펩티드)는 번역과 동시에 또는 번역 후에 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 색소체 (예를 들어, 엽록체)로 유도하는 작용을 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 내인성 엽록체 단백질 또는 이종성 단백질은 CTP를 포함하는 보다 큰 전구체 폴리펩티드와 같은 단백질의 발현에 의해 엽록체로 유도될 수 있다. 특정 실시양태에서, CTP는 예를 들어 제한 없이 상이한 유기체로부터 수득된 이종상동성 유전자로부터 하나 이상의 인접 서열을 삽입함으로써 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 효소의 정렬로부터 수득된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체로부터 유도될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 각각 CTP를 코딩하는 핵산 서열은 EPSPS 단백질 서열의 정렬로부터 단리되었다 (도 2). CTP 코딩 서열을 EPSPS 유전자 서열을 클로로P 예측 서버로 분석함으로써 단리시켰다. 문헌 [Emanuelsson et al . (1999) Protein Science 8:978-84 (cbs.dtu.dk/services/ChloroP에서 이용가능함)]. 단리된 CTP 코딩 서열의 예측된 단백질 생성물은 대략 60 내지 70 아미노산 길이 전이 펩티드이다. 이 예에서, EPSPS CTP 서열의 정렬을 참조 서열로서 사용하여 랜덤하게 아미노산을 선택함으로써 대표적인 합성 CTP를 설계하여 신규 합성 CTP를 생성하였다. 이 설계 과정은 합성 CTP의 유도체의 특징을 도시한다. 대표적인 합성 CTP는 본 개시물 전체에 걸쳐 TraP23으로서 부른다. 대표적인 합성 TraP23은 색소체 표적화 기능에 대해 시험하였고, 적어도 개별적으로 천연 CTP 서열에 대해 관찰된 것만큼 선호되는 색소체 표적화를 나타내는 것을 알아내었다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 각각 코딩하는 핵산 서열을 독립적으로 합성하고, 녹색 형광성 단백질 (GFP)을 코딩하는 행산에 작동가능하게 연결시켜 각각 키메라 TraP:GFP 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 생성하였다. 이러한 각각 키메라 TraP:GFP 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 각각 이원성 벡터 내에 도입함으로써, 각각의 TraP:GFP 코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터로 작동가능하게 연결시켰다. 또 추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP:GFP 코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터로 각각 독립적으로 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 담배 (니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana))를 일과적으로 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 TraP 각각이 GFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 독립적으로 합성하고, 작물학상 중요한 유전자 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결시켰다. TraP 서열을 제초제 내성 형질 (예컨대, dgt -28 )에 융합시켜, 키메라 TraP:DGT-28 융합 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 분자를 생성하였다. 키메라 TraP:DGT-28 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 분자를 이원성 벡터 내로 도입하여 각 TraP : dgt -28 코딩 핵산 서열을 프로모터 및 다른 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결시켰다. TraP : dgt -28 코딩 핵산 서열을 함유하는 이원성체를 사용하여 다양한 식물 종을 형질전환시켰다. DGT-28 효소의 발현 및 엽록체로의 전위의 결과로서 트랜스제닉 식물을 제초제 내성에 대하여 검정하였다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 독립적으로 합성하고, 작물학상 중요한 유전자 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결시켰다. TraP 서열을 곤충 내성 형질 (예컨대, cry2Aa )에 융합시켜, 키메라 TraP:Cry2Aa 융합 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 분자를 생성하였다. 키메라 TraP:Cry2Aa 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 분자를 이원성 벡터 내로 도입하여 각 TraP : cry2aa 코딩 핵산 서열을 프로모터 및 다른 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결시켰다. TraP : cry2aa 코딩 핵산 서열을 함유하는 이원성체를 사용하여 다양한 식물 종을 형질전환시켰다. Cry2Aa 효소의 발현 및 엽록체로의 전위의 결과로서 트랜스제닉 식물을 제초제 내성에 대하여 생물 검정하였다. 상기 상세히 설명된 실험 실시예에 비추어, 본 발명의 합성 CTP 서열, 및 그를 코딩하는 핵산을 사용하여 광범위한 색소체 함유 세포에서 임의의 폴리펩티드를 색소체로 유도할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 의해 당업자에게 이용가능한 방법에 의해서 임의의 제2 펩티드 서열의 N-말단에 융합된 합성 CTP 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드 제2 펩티드 서열의 색소체 표적화를 위해 색소체 함유 숙주 세포 내로 도입할 수 있다 (또는 발현시킬 수 있다). 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 TraP 펩티드는 천연 CTP와 비교할 경우 색소체 발현이 바람직한 펩티드의 이입 및 프로세싱 효율을 증가시킬 수 있다. II . 약어 CTP 엽록체 전이 펩티드 EPSPS 3-에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신테타제 YFP 황색 형광성 단백질 T i 종양 유도성 (A. 투메파시엔스( A. tumefaciens )로부터 유래된 플라스미드) T-DNA 전이 DNA III . 용어 본 개시내용의 다양한 실시양태에 관한 리뷰를 용이하게 하기 위해, 구체적인 용어에 관한 설명을 하기에 제공한다: 엽록체 전이 펩티드: 본원에서 사용되는 바, "엽록체 전이 펩티드" (CTP) (또는 "색소체 전이 펩티드")라는 용어는 폴리펩티드의 N-말단에 존재할 때, 폴리펩티드의 색소체 함유 세포 (예컨대, 전체 식물 또는 식물 세포 배양액에서의 식물 세포)로의 이입을 유도하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. CTP는 일반적으로 필요하며, 단백질을 숙주 세포의 색소체 (예컨대, 1차, 2차, 또는 3차 색소체, 예컨대, 엽록체) 내로의 이입을 유도하는 데 충분하다. 수개의 이용가능한 알고리즘 (예컨대, PSORT, 및 클로로P (cbs.dtu.dk/services/ChloroP에서 이용가능한)) 중 하나에 의해 추정 엽록체 전이 펩티드를 확인할 수 있다. 클로로P는 특히 CTP를 잘 예측할 수 있다 (문헌 [Emanuelsson et al., (1999), Protein Science 8:978-84]). 그러나, 기능성 CTP를 예측하는 데 있어서는 현존하는 어느 알고리즘으로도 100% 효율을 달성하지 못한다. 그러므로, 예컨대, 시험관내, 또는 생체내 방법으로, 확인된 추정 CTP가 실제로 의도된 바대로 작용하는지를 입증하는 것이 중요하다. 엽록체 전이 펩티드는 색소체가 이입되는 폴리펩티드의 N-말단에 위치할 수 있다. 상기 CTP는 번역과 동시에 또는 번역 후에 진행되는 CTP를 포함하는 폴리펩티드의 색소체로의 수송이 용이하게 이루어지도록 할 수 있다. 엽록체 전이 펩티드는 전형적으로 약 40 내지 약 100개의 아미노산을 포함하고, 상기 CTP는 특정의 공통된 특징을 포함하는 것으로 관찰되었다: 예를 들어, CTP는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 또는 글루타민)가 존재할 경우에는 그를 극소수로 함유하고; CTP의 N-말단 영역에는 하전된 아미노산인 글리신, 및 프롤린이 존재하지 않고; CTP의 중앙 영역은 또한 매우 높은 비율로 염기성 또는 히드록실화된 아미노산 (예컨대, 세린 및 트레오닌)을 함유할 가능성이 있고; CTP의 C-말단 영역은 아르기닌이 풍부하고, 양친매성 베타-시트 구조를 포함하는 능력을 가진다. 색소체 프로테아제는 CTP를 포함하는 폴리펩티드의 색소체 내로의 이입 후 상기 폴리펩티드의 나머지 부분으로부터 CTP를 절단할 수 있다. 접촉: 본원에서 사용되는 바, 핵산 분자와 관련하여 세포, 조직, 또는 유기체 (예컨대, 식물 세포; 식물 조직; 및 식물)"와 접촉하다" 또는 그"에 의해 흡수되다"라는 용어는 핵산 분자의 유기체 내로의 내재화, 예를 들어, 제한 없이, 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액을 유기체에 흡수시키는 것을 포함한다. 내인성: 본원에서 사용되는 바, "내인성"이라는 용어는 물질 (예컨대, 핵산 분자 및 폴리펩티드)이 특정의 유기체, 조직, 또는 세포내로부터 기원한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "내인성" 폴리펩티드란 보통 비유전적으로 조작된, 같은 종의 식물로부터의 같은 유형의 세포에서 발현된 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 유전자 (예를 들어, EPSPS 유전자)는 참조 CTP 서열을 얻는데 사용될 수 있다. 발현: 본원에서 사용되는 바, 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스진)의 "발현"이란, (예컨대, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함하는) 핵산 전사 단위의 코딩 정보가 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정으로, 대개는 단백질의 합성을 포함하는 것인 과정을 의미한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에의 세포, 조직, 또는 유기체 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA에서 RNA로, 이어서 단백질로 진행되는 경로 어디에서든 조절될 수 있다. 유전자 발현은 예를 들어, 중간 매개 분자, 예컨대, mRNA의 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특이 단백질 분자가 제조된 이후에 진행되는 그의 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해를 통해, 또는 그의 조합에 의해 조절된다. 유전자 발현은 당업계에 공지된 임의 방법, 예를 들어 제한 없이, 노던 블롯; RT-PCR; 웨스턴 블롯; 또는 시험관내; 계내; 및 생체내 단백질 활성 검정(들)에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 유전 물질: 본원에서 사용되는 바, "유전 물질"이라는 용어는 모든 유전자, 및 핵산 분자, 예컨대, DNA 및 RNA를 포함한다. 이종성: 본원에서 사용되는 바, "이종성"이라는 용어는 물질 (예컨대, 핵산 분자 및 폴리펩티드)이 특정의 유기체, 조직, 또는 세포내로부터 기원하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "이종성" 폴리펩티드란 보통은 비유전적으로 조작된, 같은 종의 식물로부터의 같은 유형의 세포에서 발현되지 않는 폴리펩티드 (예컨대, 같은 유기체의 다른 세포 또는 상이한 유기체의 세포에서 발현된 폴리펩티드)를 의미할 수 있다. 단리된: 본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 분자 (예컨대, 핵산 분자 및 폴리펩티드)가, 상기 분자가 자연적으로 발생된 유기체의 세포에서 보통 분자와 회합되어 있는 같은 유형의 다른 분자 (예컨대, 다른 핵산 분자 및 다른 폴리펩티드)로부터 실질적으로 분리되어 있거나, 또는 그로부터 정제되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 자연적으로 발생된 유기체의 세포에서 염색체 DNA 또는 염색체외 DNA로부터 실질적으로 분리되어 있거나, 또는 그로부터 정제되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 상기 용어는 다른 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 세포 성분이 제거되도록 생화학적으로 정제된 재조합 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 핵산 분자, 화학적으로 합성된 핵산 분자, 및 재조합적으로 제조된 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 정제된"이라는 용어는 분자가 그의 천연 상태에서는 보통 그와 회합되어 있는 다른 분자로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다. 실질적으로 정제된 분자는 조성물 중에 존재하는 우세한 종일 수 있다. 실질적으로 정제된 분자에는 천연 혼합물 중에 존재하는 용매 이외의 다른 분자가 예를 들어, 60% 이상, 75% 이상, 또는 90% 이상 존재하지 않을 수 있다. "실질적으로 정제된"이라는 용어는 그의 천연 상태로 존재하는 분자를 의미하는 것은 아니다. 핵산 분자: 본원에서 사용되는 바, "핵산 분자"라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하며, 이는 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두, 및 상기의 합성 형태 및 혼합된 중합체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 상기 두 뉴클레오티드 중 어느 것이든 한 유형의 변형된 형태를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 달리 언급되지 않는 한, 핵산 분자의 길이는 보통 10개 이상의 염기 길이이다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 이량체 (소위 탠덤) 형태, 및 핵산 분자의 전사 생성물을 포함한다. 핵산 분자는 자연적으로 발생된 뉴클레오티드, 및 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 및/또는 비자연적으로 발생된 뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형으로는 예를 들어, 표지, 메틸화, 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 중 하나 이상의 것을 유사체로 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예컨대, 비하전된 결합: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 결합: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 인터칼레이터: 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이터; 알킬레이터; 및 변형된 결합: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등을 포함한다. "핵산 분자"라는 용어는 또한 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적으로 이중체, 삼중체, 헤어핀, 환형, 및 패드록형(padlocked) 입체형태를 비롯한, 임의의 위상기하학적 입체형태도 포함한다. 본원에서 사용되는 바, DNA와 관련하여, "코딩 서열," "구조적 뉴클레오티드 서열," 또는 "구조적 핵산 분자"라는 용어는 궁극적으로는 적절한 조절 서열의 제어하에 배치되었을 때 전사 및 mRNA를 통해 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. RNA와 관련하여 "코딩 서열"이라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단의 번역 출발 코돈 및 3'-말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA; cDNA; EST; 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 분리 방법, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여; 분자 크기에 기초하거나, 또는 친화도에 의한 배제법에 의해; 상이한 용매 중의 용해도에 기초한 분별에 의해; 및 유전자 조작 방법, 예컨대, 증폭, 클로닝 및 서브클로닝에 의해 단리, 정제, 또는 부분적으로 정제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 동일성: 본원에서 사용되는 바, 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "서열 동일성" 또는 "동일성"이라는 용어는 구체화된 비교창에 걸쳐 최대로 일치하도록 정렬되었을 때, 두 서열내 잔기가 동일한 것을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "서열 동일성 비율(%)"은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열 (예컨대, 핵산 서열, 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 측정된 값을 의미할 수 있으며, 여기서, 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 비교창내 서열 중 일부는 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 비율(%)은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 구하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성 비율(%)을 구함으로써 산출된다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1981), Adv . Appl. Math . 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970), J. Mol . Biol . 48:443]; [Pearson and Lipman (1988), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988), Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989), CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al., (1988), Nucleic Adds Res . 16:10881-90]; [Huang et al., (1992), Comp . Appl . Biosci . 8:155-65]; [Pearson et al., (1994), Methods Mol . Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al., (1999), FEMS Microbiol . Lett . 174:247-50]에 기술되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 산출에 관한 상세한 고려 사항은 예컨대, 문헌 [Altschul et al., (1990), J. Mol . Biol . 215:403-10]에서 살펴볼 수 있다. 수개의 서열 분석 프로그램을 결부시켜 사용하기 위한 것으로 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴( B asic L ocal A lignment S earch Tool: BLAST™)은 미국 국립 생물 정보 센터 (미국 메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 여러 공급처로부터, 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 상기 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 측정하는 방법에 관한 설명은 인터넷상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션에서 이용가능하다. 핵산 서열 비교를 위해, 파라미터를 디폴트하는 디폴트 BLOSUM62 매트릭스를 이용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 함수가 사용될 수 있다. 참조 서열에 대해 더욱더 큰 유사성을 가지는 핵산 서열은 상기 방법으로 평가되었을 때 증가된 동일성 비율(%)을 보일 것이다. 특이적으로 하이브리드화할 수 있는/특이적으로 상보적인: 본원에서 사용되는 바, "특이적으로 하이브리드화할 수 있는" 및 '"특이적으로 상보적인"이라는 용어는 핵산 분자와 표적 핵산 분자 사이에 안정적이고, 특이적인 결합이 이루어질 수 있도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 두 핵산 분자 사이의 하이브리드화는 두 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 역평행 정렬 형성을 포함한다. 이어서, 두 분자는 반대 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여, 충분히 안정적일 경우, 당업계에 주지된 방법을 사용하여 검출가능한 이중체 분자를 형성할 수 있다. 핵산 분자는 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 것이 되기 위해 그의 표적 서열에 대하여 100% 상보적일 필요는 없다. 그러나, 특이적인 하이브리드화를 위해 존재하여야 하는 서열 상보성의 양은 사용되는 하이브리드화 조건과 함수 관계에 있다. 특정의 엄격도에 이르게 하는 하이브리드화 조건은 선택되는 하이브리드화 방법의 성질, 및 하이브리드화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 비록 세척 회수 또한 엄격성에 영향을 주기는 하지만, 일반적으로는 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충제의 이온 강도 (특별히 Na + 및/또는 Mg ++ 농도)가 하이브리드화의 엄격성을 결정지을 것이다. 특정의 엄격도를 달성하는 데 필요한 하이브리드화 조건에 관한 산출은 당업계의 숙련가에게 알려져 있고, 이는 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11]; 및 [Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization , IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산의 하이브리드화에 관한 추가의 상세한 설명 및 가이드라인은 예를 들어, 문헌 [Tijssen, 'Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes , Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993]; 및 [Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology , Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 살펴볼 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "엄격한 조건"은 하이브리드화 분자와 표적 핵산 분자내의 상동성 서열 사이에 미스매치가 20% 미만으로 존재하는 경우에만 오직 하이브리드화가 일어나게 되는 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가의 특별한 수준의 염격성을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "중간 정도의 엄격한" 조건은 20% 초과의 서열 미스매치를 포함하는 분자는 하이브리드화하지 못하게 되는 조건이고; "고도로 엄격한" 조건은 10% 초과의 미스매치를 포함하는 서열은 하이브리드화하지 못하게 되는 조건이고; "초고도로 엄격한" 조건은 5% 초과의 미스매치를 포함하는 서열은 하이브리드화하지 못하게 되는 조건이다. 하기는 대표적인, 비-제한적 하이브리드화 조건이다. (90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출하는) 고도로 엄격한 조건: 65℃에서 16시간 동안 5x SSC 완충제 중에서 하이브리드화; 매회마다 실온에서 15분 동안 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 매회마다 65℃에서 20분 동안 0.5x SSC 완충제 중에서 2회 세척. (80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출하는) 중간 정도의 엄격한 조건: 65-70℃에서 16-20시간 동안 5x-6x SSC 완충제 중에서 하이브리드화; 매회마다 실온에서 5-20분 동안 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 매회마다 55-70℃에서 30분 동안 1 x SSC 완충제 중에서 2회 세척. (50% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출하는) 비-엄격한 대조군 조건: 55℃에서 16-20시간 동안 6x SSC 완충제 중에서 하이브리드화; 매회마다 55℃에서 20-30분 동안 2x-3x SSC 완충제 중에서 2회 이상 세척. 본원에서 사용되는 바, 인접한 핵산 서열과 관련하여 "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적 상동성"이라는 용어는 인접한 뉴클레오티드 서열이 엄격한 조건하에서 참조 핵산 서열에 하이브리드화한다는 것을 의미한다. 참조 핵산 서열, 예를 들어, 서열 12와 실질적으로 상동성인 핵산 서열은 엄격한 조건 (예컨대, 상기 기재된 중간 정도의 엄격한 조건)하에서 참조 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열이다. 실질적으로 상동성인 서열은 80% 이상의 서열 동일성을 가진다. 예를 들어, 실질적으로 상동성인 서열은 약 80% 내지 100% 서열 동일성, 예컨대, 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%를 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적인 하이브리드화와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 예를 들어, 특이적인 결합이 요구되는 조건, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 핵산의 비-표적 서열에의 비-특이 결합을 피할 수 있는 충분한 정도 상보성이 존재할 때에 특이적으로 하이브리드화할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "오르토로그" (또는 "이종상동성")라는 용어는 공통 조상 뉴클레오티드 서열로부터 진화하였고, 2개 이상의 종에서 같은 작용을 보유할 수 있는 2개 이상의 종 중의 유전자를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 5' → 3' 방향으로 판독되었을 때, 서열의 모든 뉴클레오티드가 3' → 5' 방향으로 판독되었을 때, 다른 서열의 모든 뉴클레오티드와 상보적일 경우에 두 핵산 서열 분자는 "완전한 상보성"을 보인다라고 말할 수 있다. 참조 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열의 역 상보체 서열과 동일한 서열을 보일 것이다. 상기 용어 및 설명은 당업계에 잘 정의되어 있고, 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 이해된다. 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 비율(%)을 측정할 때, 정렬에 의해 제공된 주어진 위치에서의 아미노산의 아이덴티티는 정렬된 서열을 포함하는 폴리펩티드의 원하는 특성에는 영향을 주지 않으면서 상이할 수 있다는 것은 당업계의 숙련가에게 주지되어 있다. 이러한 경우, 서열 동일성(%)은 보존적으로 치환된 아미노산 사이의 유사성을 고려하여 조정될 수 있다. 이러한 조정은 주지되어 있으며, 당업자에 의해 보편적으로 사용된다. 예컨대, 문헌 [Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7]을 참조할 수 있다. 본 발명의 실시양태는 예시적인 색소체 전이 펩티드 아미노산 서열의 기능적 변이체 및 상기를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예시적인 전이 펩티드 서열의 기능적 변이체는 예를 들어, 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열의 단편 (예컨대, N-말단 또는 C-말단 단편), 또는 전장의 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열 또는 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열의 단편의 변형된 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환의 도입으로 변형될 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 작용성 측쇄, 유사한 크기, 및/또는 유사한 소수성을 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환을 도입하기 위해 같은 패밀리의 또 다른 아미노산으로 대체하는 데 사용될 수 있는 아미노산 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 아미노산 패밀리로는 하기를 포함한다: 염기성 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘); 산성 아미노산 (예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산); (생리학적 pH에서 비하전된 극성 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 및 시토신); 비-극성 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판); 베타-분지형 아미노산 (예컨대, 트레오닌, 발린, 및 이소류신); 및 방향족 아미노산 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 히스티딘). 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., (Eds.), 상기 문헌 참조]; 및 [Innis et al., PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications , 1990, Academic Press, NY, USA]를 참조할 수 있다. 작동가능하게 연결된: 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 관련이 있을 때, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열과 "작동가능하게 연결"되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 번역에 영향을 준다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합적으로 제조되었을 때, 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 같은 리딩 프렘임 내에서 일반적으로 인접해 있고, 필요할 경우, 두 단백질-코딩 영역은 결합을 통해 인접하게 된다. 그러나, 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결되도록 하기 위해 인접할 필요는 없다. 조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용될 때, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열," 또는 "제어 요소"란 전사의 시간 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 조절 서열로는 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함한다. 특정 조절 서열은 그의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절은 이중 가닥 핵산 분자의 회합된 상보적인 가닥 상에 위치할 수 있다. 2개 이상의 아미노산 서열을 참조하여 사용되는 경우, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 제1 아미노산 서열이 추가 아미노산 서열 중 하나 이상과 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 전이 펩티드 (예를 들어, CTP)는 전이 펩티드가 폴리펩티드 또는 제2 아미노산 서열의 발현 또는 트래픽킹(trafficking)에 영향을 준다면 서열 둘다를 포함하는 폴리펩티드 내에 제2 아미노산 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터: 본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 전사 출발점으로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 폴리머라제, 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여할 수 있는 DNA 영역을 의미한다. 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생적 제어하에 있는 프로모터의 예로는 특정 조직, 예컨대, 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관, 또는 후막 조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 오직 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이" 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이" 프로모터는 하나 이상의 기관내 특정 세포 유형에서, 예를 들어, 뿌리 또는 잎 중 관다발 세포에서의 발현을 주로 구동시킨다. "유도성" 프로모터는 환경 제어하에 존재할 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예로는 혐기성 조건 및 빛의 존재를 포함한다. 조직-특이, 조직-선호, 세포 유형 특이, 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건하에서 활성을 나타낼 수 있는 프로모터이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al., (1993), Plant Mol . Biol . 22:361-366]을 참조할 수 있다. 유도성 프로모터의 경우, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도는 증가하게 된다. 유도성 프로모터의 예로는 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터, 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 옥수수로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드에 의해 활성 활성이 유도될 수 있는 것인, 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (문헌 [Schena et al., (1991), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:0421]). 구성적 프로모터의 예로는 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대, CaMV로부터의 35S; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 옥수수 H3 히스톤 프로모터, 및 브라시카 나푸스( Brassica napus ) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'쪽의 Xbal/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 XbaI/NcoI 단편에 유사한 뉴클레오티드 서열) (국제 PCT 공개 번호 WO 96/30530)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 조직-특이 또는 조직-선호 프로모터가 사용될 수 있다. 조직-특이 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적인 조직에서 배타적으로, 또는 우선적으로 코딩 서열의 생성물을 제조할 수 있다. 예시적인 조직-특이 또는 조직-선호 프로모터로는 뿌리-선호 프로모터, 예컨대, 파세올린 유전자로부터의 것; 잎-특이 및 광-유도성 프로모터, 예컨대, cab 또는 루비스코 ( rubisco )로부터의 것; 또 다른-특이 프로모터, 예컨대, LAT52 로부터의 것; 화분-특이 프로모터, 예컨대, Zm13 으로부터의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대, apg 로부터의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 형질전환: 본원에서 사용되는 바, "형질전환" 또는 "형질도입"이라는 용어는하나 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 의미한다. 세포 내로 형질도입된 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 도입에 의해, 또는 에피솜 복제 의해 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포는 상기 핵산 분자에 의해 "형질전환된다." 본원에서 사용되는 바, "형질전환"이라는 용어는 핵산 분자를 상기 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기법을 포함한다. 그 예로는 바이러스 벡터를 이용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 이용한 형질전환; 전기천공 (문헌 [Fromm et al., (1986), Nature 319:791-3]); 리포펙션 (문헌 [Feigner et al., (1987), Proc . Natl. Acad . Sci . USA 84:7413-7]); 미세주입 (문헌 [Mueller et al., (1978), Cell 15:579-85]); 아그로박테리움-매개 전달 (문헌 [Fraley et al., (1983), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:4803-7]); 직접적인 DNA 흡수; 및 미세발사체 충돌 (문헌 [Klein et al., (1987), Nature 327:70])을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 트랜스진: 외인성 핵산 서열. 일부 예에서, 트랜스진은 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열일 수 있다. 특정 예에서, 트랜스진은 1개 이상의 합성 CTP를 폴리펩티드 및 1개 이상의 추가의 펩티드 서열 (예컨대, 제초제 저항성을 부여는 펩티드 서열)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 그를 위해서는 색소체 발현이 바람직할 수 있다. 상기 및 다른 예에서, 트랜스진은 트랜스진의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예컨대, 프로모터)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 유기체 (예컨대, 식물)를 언급하는 데 사용될 때, "트랜스제닉"이라는 용어는 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체를 의미한다. 일부 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체는 핵산 서열이 분자 형질전환 기법을 통해 그 안으로 도입되어 있는 유기체일 수 있다. 다른 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체는 핵산 서열이 식물에서 예를 들어, 유전자 이입 또는 타가 수분에 의해서 그 안으로 도입되어 있는 유기체일 수 있다. 수송: 본원에서 사용되는 바, "수송(들)," "표적(들)," 및 "전달(들)"이라는 용어는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 숙주 세포의 핵으로부터 숙주 세포의 색소체로의 이동을 용이하게 하는 본 발명의 특정 아미노산 서열의 특성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 (즉, 합성 CTP 서열)은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 중 약 100%, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 및/또는 약 50% 이상을 숙주 세포의 색소체로 수송할 수 있다. 벡터: 예를 들어, 형질전환된 세포를 제조하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 허용하는 핵산 서열, 예컨대, 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예로는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선별가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감소시킴으로써 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 벡터는 임의적으로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는 도움을 주는 물질 (예컨대, 리포좀, 단백질 코팅 등)을 포함한다. 구체적으로 명시, 또는 암시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 용어는 "1개 이상의"라는 것을 의미한다. 달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 당업계의 숙련가가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 분자 생물학상의 일반 용어에 관한 정의는 예를 들어, 문헌 [Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology , Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Meyers RA (ed.), Molecular Biology and Biotechnology : A Comprehensive Desk Reference , VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 살펴볼 수 있다. 달리 언급되지 아는 항, 모든 백분율(%)은 중량%이고, 모든 용매 혼합물 비율은 부피%이다. 모든 온도는 섭씨도이다. IV . 합성 CTP -코딩 서열을 포함하는 핵산 분자 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, TraP23 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 합성 엽록체 전이 펩티드는 키메라 CTP일 수 있다. 합성 CTP는 EPSPS 효소의 정렬로부터 아미노산을 랜덤하게 선택하는 것으로부터 유도될 수 있다. 도 2는 식물 EPSPS 효소로부터 단리된 CTP 서열의 정렬을 도시한 것이다. 따라서, 합성 CTP를 코딩하는 아미노산 서열은 천연 엽록체 전이 펩티드 서열의 정렬로부터 아미노산 서열을 랜덤하게 선택하는 것으로부터 유도될 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 정렬을 생성하기 위해 사용된 참조 CTP 서열의 인접 아미노산 서열은 합성 CTP를 포함할 수 있다. 당업자는 합성 CTP 서열 내에 제1 인접 아미노산 서열의 선택에 이어, 상기 유도 과정에 따라 동종성 CTP 서열의 나머지로부터 인접 아미노산의 확인 및 선택이 명백하고 자동적인 것을 이해하게 될 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 인접 아미노산 서열은 약 25 내지 약 41개 길이 (예를 들어, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 및 42개의 아미노산 길이)의 아미노산일 수 있다 상기 과정에 따른 합성 CTP 단백질 서열의 예는 서열 11로 표시된다. 유전자 코드의 축퇴성의 관점에서, 이들 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 속은 당업자에 의해 즉시 예견될 것이다. 이들 특정 예는 상이한 식물 종으로부터의 다수의 ESPSP 오르토로그 중 하나로부터 동종성 CTP의 정렬로부터의 인접 서열을 혼입함으로써 합성 CTP의 구조적 특성을 예시한다. 일부 실시양태는 합성 엽록체 전이 펩티드의 기능성 변이체, 및/또는 이를 코딩하는 핵산를 포함한다. 이러한 기능성 변이체는 예를 들어 제한 없이, 서열 11로서 전술한 합성 CTP 코딩 서열, 및/또는 이로써 코딩된 CTP; 서열 11 내에 인접 아미노산 서열을 포함하는 합성 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이로써 코딩된 CTP; 서열 12의 인접 핵산 서열을 포함하는 절두된(truncated) 합성 CTP 코딩 서열; 서열 12에 실질적으로 동종성인 인접 핵산 서열을 포함하는 절두된 합성 CTP 코딩 서열; 서열 11의 인접 아미노산 서열을 포함하는 절두된 합성 CTP; 서열 11의 인접 아미노산 서열을 포함하는 합성 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이로써 코딩된 CTP; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 11 내에 인접 아미노산 서열을 포함하는 합성 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이로써 코딩된 CTP; 및 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체 함유 세포 내에서 색소체로 유도하도록 예시되는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 11 내에 인접 아미노산 서열을 포함하는 합성 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이로써 코딩된 CTP를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 예를 들어 분자 생물학 기술에서 본 발명의 CTP 코딩 서열의 조작을 용이하게 하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 CTP 코딩 서열은 발현 벡터 내로 서열의 하부 복제를 위해 적합한 백터 내로 혼입될 수 있거나, 또는 본 발명의 CTP 코딩 서열은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 CTP 코딩 서열을 포함하는 추가 핵산 분자의 생성을 용이하게 하는 핵산 분자 내로 혼입될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 합성 CTP의 서열 중 하나 이상의 아미노산 위치는 결실될 수 있다. 예를 들어, 합성 CTP의 서열은 서열 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 위치에서 아미노산(들)이 결실되도록 변형될 수 있다. 동종성 CTP 서열의 정령은 아미노산이 합성 CTP의 기능에 영향을 미치지 않으면서 결실될 수 있는 지침을 제공하는데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 합성 엽록체 전이 펩티드는 80 미만의 아미노산 길이이다. 예를 들어, 합성 CTP는 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60 또는 미만의 아미노산 길이일 수 있다. 특정 예에서, 합성 CTP는 약 65, 약 68, 약 72 또는 약 74 아미노산 길이일 수 있다. 이들 및 추가 예에서, 합성 CTP는 서열 11에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 상기의 기능성 변이체를 포함할 수 있다. 따라서, 합성 CTP는 서열 11에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 상기의 기능성 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, 합성 CTP의 길이는 80 미만의 아미노산 길이이다. 특정 예에서, 합성 CTP는 예를 들어 서열 11 중 하나에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 합성 CTP 단백질, 예를 들어 서열 11의 TraP23 펩티드, 또는 임의의 특이적 결실 및/또는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 상술한 것들 중 임의의 것의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모두 본 개시물의 관점에서 당업자에 의해 인식될 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. 합성 CTP를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 전문가의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 합성 CTP의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, 합성 CTP는 서열 12에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에 제공된 핵산 분자에서, 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈은 예를 들어 인트론 또는 "중지"에 대한 코딩 없이도 임의의 수의 뉴클레오티드 삼중체로 분리될 수 있다. 일부 예에서, 천연 전구체 폴리펩티드 중 엽록체 전이 펩티드와 통상적으로 연관된 성숙한 단백질의 제1 아미노산을 코딩하는 서열은 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈과 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈 사이에 존재할 수 있다. 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈을 분리하는 서열은 예를 들어 임의의 서열로 이루어질 수 있으며, 코딩된 아미노산 서열은 키메라 폴리펩티드의 번역 및 그의 색소체로의 전위를 유의하게 변경시키지 않는 경향이 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 합성 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈은 그에 직접 인접한 관심 뉴클레오티드 서열의 제1 코돈과 래지스터 상태로 융합되거나, 또는 짧은 펩티드 서열, 예컨대 합성 뉴클레오티드 연결기에 의해 코딩된 것 (예를 들어, 융합을 달성하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기) 이하로 그로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 특정 숙주에서 코딩 서열의 발현을 향상시키기 위해 단일 코딩 서열에서 관심 뉴클레오티드 서열 및/또는 그에 융합된 합성 CTP 코딩 서열의 뉴클레오티드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 유전자 코드는 64개의 가능한 코돈이 중복되지만, 대부분의 유기체는 우선적으로 이들 코돈의 하부조합을 사용한다. 종에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 최적 코돈이라 부르며, 가장 빈번하게 사용되지 않는 것들은 희귀 또는 저 사용 코돈으로 분류된다. (문헌 [Zhang et al . (1991) Gene 105:61-72]). 코돈은 종종 "코돈 최적화"라 불리는 공정에서 특정 숙주의 선호하는 코돈 사용을 반영하도록 치환될 수 있다. 특정 원핵 숙주 또는 진행 숙주에 의해 선호되는 코돈을 함유하는 최적 코딩 서열은 예를 들어 번역 속도를 증가시키거나 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사를 생성하도록 제조될 수 있다 (예를 들어, 비-최적화 서열로부터 생선된 전사와 비교하여 보다 긴 반감기). 임의의 폴리펩티드는 합성 CTP 서열의 도입에 의해 색소체 함유 세포의 색소체로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 연결된 폴리펩티드-CTP 분자가 발현되는 세포에서 폴리펩티드를 색소체로 유도하기 위해 폴리펩티드는 합성 CTP 서열에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 합성 CTP 서열의 도입에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 예를 들어, 보통은 폴리펩티드가 천연적으로 발현되는 세포의 색소체에서 발현되는 것인 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 및 제한 없이, 합성 CTP 서열의 도입에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 제초제 저항성, 바이러스 저항성, 박테리아 병원체 저항성, 곤충 저항성, 선충 저항성, 또는 진균 저항성에 관여하는 폴리펩티드일 수 있다. 예컨대, 미국 특허 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071; 6,329,504; 및 6,337,431을 참조할 수 있다. 별법으로, 합성 CTP 서열의 도입에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 예를 들어, 및 제한 없이, 식물 생장력 또는 수율에 관여하는 폴리펩티드 (극한 온도, 토양 조건, 조도, 수위, 및 화학적 환경에 대한 내성에 관여하는 폴리펩티드 포함), 또는 관심 소질을 포함하는 식물을 확인하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 폴리펩티드 (예컨대, 선별가능한 마커 유전자 생성물, 종자 색상에 관여하는 폴리펩티드 등)일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 합성 CTP 서열에 연결될 수 있는, 제초제 저항성에 관여하는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 아세토락테이트 신타제 (ALS), 돌연변이화된 ALS, 및 ALS의 전구체 (예컨대, 미국 특허 5,013,659 참조); EPSPS (예컨대, 미국 특허 4,971,908 및 6,225,114 참조), 예컨대, CP4 EPSPS 또는 부류 III EPSPS; 광합성, 및 지방산, 아미노산, 오일, 카로티노이드, 테르페노이드, 전분 등의 합성을 비롯한, 색소체에 발생하는 생리학적 과정을 변형시키는 효소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 합성 엽록체 전이 펩티드에 연결될 수 있는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 제아크산틴 에폭시다제, 콜린 모노옥시게나제, 페로킬라타제, 오메가-3 지방산 데세튜라제, 글루타민 신테타제, 전분 개질 효소, 필수 아미노산, 프로비타민 A, 호르몬, Bt 독소 단백질 등의 합성에 관여하는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 언급된 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 합성 CTP에 연결된 관심 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로 발현되도록 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가로, 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자와 고도한 상동성을 가지는 유전자를 클로닝함으로써) 당업자에 의해 확인될 수 있다. 일단 상기 뉴클레오티드 서열이 확인되고 나면, 확인된 뉴클레오티드 서열, 또는 등가의 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP-코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 디자인하는 것은 간단한 과정이다. V. 합성 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 발현 일부 실시양태에서, 1개 이상의 합성 CTP, 또는 그의 기능성 등가물을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 분자(들)는 그 안에서 폴리펩티드를 발현시키기 위한 것인 세포, 조직, 또는 유기체 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 합성 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 1개 이상의 합성 CTP 및 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 1개 이상의 추가의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 색소체 함유 숙주 세포, 조직, 또는 유기체 (예컨대, 식물 세포, 식물 조직, 및 식물) 내로 도입될 수 있고, 이로써, 폴리펩티드는 색소체 함유 숙주 세포, 조직, 또는 유기체에서 핵산 분자로부터 발현될 수 있으며, 여기서, 발현된 폴리펩티드는 1개 이상의 합성 CTP 및 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 1개 이상의 추가의 펩티드 서열을 포함한다. 특정 일례에서, 상기 발현된 폴리펩티드의 합성 CTP는 1개 이상의 추가의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 숙주 세포, 조직, 또는 유기체의 색소체로 표적화하는 것을 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 당업자에게 공지된 방법들 중 임의의 임의의 한 방법에 의해 색소체 함유 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 세포, 조직, 또는 유기체 내로 도입시키기 위해 숙주 세포, 조직, 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 세포 내로 도입시키고, 핵산 분자를 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키기 위해 세포를 핵산 분자로 형질전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 세포, 예를 들어, 색소체 함유 세포 (예컨대, 식물 세포)의 형질전환에 사용될 수 있다. 발현을 개시하거나, 증진시키기 위해, 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 상기 조절 서열은 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 핵산 분자는 예를 들어, 선형 또는 폐환형 플라스미드를 비롯한, 벡터 시스템일 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 예를 들어, 벡터 내로 삽입될 수 있다. 많은 벡터들이 이러한 목적을 위해 이용될 수 있으며, 특정 벡터를 선택하는 것은 예를 들어, 벡터 내로 삽입시키고자 하는 핵산의 크기, 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 전형적으로 다양한 성분을 함유하며, 그의 아이덴티티는 벡터의 기능 (예컨대, DNA 증폭 및 DNA 발현), 및 벡터와 화합성인 특정 숙주 세포(들)에 따라 달라진다. 일부 실시양태는 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)에 작동적으로 연결된 상기 기술된 조절 서열 중 1개 이상을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 식물 세포, 조직, 또는 유기체에서 조절 서열(들)의 제어하에 발현됨으로써 폴리펩티드의 적어도 일부를 식물 세포, 조직, 또는 유기체의 색소체로 표적화하는 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 숙주 세포, 예컨대, 핵산 분자가 증폭되는 박테리아 세포, 또는 핵산 분자가 발현되는 식물 세포에서 작용하는 프로모터일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성, 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이는 모두 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있는 프로모터의 비제한적인 일례는 미국 특허 번호 제6,437,217호호 (옥수수 RS81 프로모터); 제5,641,876호 (벼 액틴 프로모터); 제6,426,446호 (옥수수 RS324 프로모터); 제6,429,362호 (옥수수 PR-1 프로모터); 제6,232,526호 (옥수수 A3 프로모터); 제6,177,611호 (옥수수 구성적 프로모터); 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호 (35S 프로모터); 제6,433,252호 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 제6,429,357호 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 제6,294,714호 (광-유도성 프로모터); 제6,140,078호 (염-유도성 프로모터); 제6,252,138호 (병원체-유도성 프로모터); 제6,175,060호 (인 결핍-유도성 프로모터); 제6,388,170호 (양방향 프로모터); 제6,635,806호 (감마-코익신 프로모터); 미국 특허 출원 시리얼 번호 제09/757,089호 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)에 의해 제공되어 있다. 추가의 예시적인 프로모터로는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (문헌 [Ebert et al., (1987), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84(16):5745-9]); 옥토파인 신타제 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )의 종양 유도성 플라스미드로 운반); 칼리모바이러스 프로모터, 예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (문헌 [Lawton et al., (1987), Plant Mol. Biol. 9:315-24]); CaMV 35S 프로모터 (문헌 [Odell et al., (1985), Nature 313:810-2]); 피그워트 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (문헌 [Walker et al., (1987), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84(19):6624-8]); 수크로스 신타제 프로모터 (문헌 [Yang and Russell (1990), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:4144-8]); R 유전자 복합체 프로모터 (문헌 [Chandler et al., (1989), Plant Cell 1:1175-83]); 엽록소 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV35S (미국 특허 번호 제5,322,938호, 제5,352,605, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호); FMV35S (미국 특허 번호 제6,051,753호, 및 제5,378,619호); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 제5,850,019호); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 제6,677,503호); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크 수탁 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al., (1982), J. Mol . Appl . Genet . 1:561-73]; [Bevan et al., (1983), Nature 304:184-7])를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이 프로모터를 포함할 수 있다. 조직-특이 프로모터는 유기체의 다른 조직과 비교하여, 프로모터가 특이적인 조직에서 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 더 높은 수준으로 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 조직-특이 프로모터의 예로는 제한 없이, 융단 조직-특이 프로모터; 수술-특이 프로모터; 화분-특이 프로모터 (예컨대, 미국 특허 번호 제7,141,424호, 및 국제 PCT 공개 번호 WO 99/042587 참조); 배주-특이 프로모터; (예컨대, 미국 특허 출원 번호 2001/047525 A1 참조); 과실-특이 프로모터 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,943,674호, 및 제5,753,475호 참조); 및 종자-특이 프로모터 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,420,034호, 및 제5,608,152호 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발생 단계-특이 프로모터 (예컨대, 발생 후기 단계에서 활성을 가진 프로모터)가 본 발명의 조성물 또는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 번역 리더 서열로서의 작용을 하는, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전하게 프로세싱된 mRNA에 존재하고, 이는 1차 전사체의 프로세싱, 및/또는 RNA의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예로는 옥수수 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 번호 제5,362,865호), 식물 바이러스 외피 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Turner and Foster (1995), Molecular Biotech . 3(3):225-36]을 참조할 수 있다. 5' UTR의 비제한적인 일례는 GmHsp (미국 특허 번호 제5,659,122호); PhDnaK (미국 특허 번호 제5,362,865호); AtAntl; TEV (문헌 [Carrington and Freed (1990), J. Virol . 64:1590-7]); 및 AGRtunos (진뱅크 수탁 번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al., (1983), Nature 304:184-7])에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 3' 비번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 상기의 서열은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 유전 요소이며, 이는 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 단부에 부가하는 작용을 한다. 폴리아데닐화 서열은 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 일례로는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al., (1983), Proc . Natl . Acad . Sci. USA 80:4803-7])이 있다. 상이한 3' 비번역 영역의 사용에 관한 일례는 문헌 [Ingelbrecht et al., (1989), Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적인 일례로 피숨 사티붐( Pisum sativum ) RbcS2 유전자로부터의 것 (Ps.RbcS2-E9; 문헌 [Coruzzi et al., (1984), EMBO J. 3:1671-9]) 및 AGRtu.nos (진뱅크 수탁 번호 E01312)를 포함한다. 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 형질전환된 세포, 예컨대, 식물 세포에 선별가능한 표현형을 부여하는 선별가능한 마커선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 선별가능한 마커는 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포를 선별하는 데에도 사용도리 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예컨대, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등.), 또는 제초제 저항성 (예컨대, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선별가능한 마커의 예로는 카나마이신 저항성을 코딩하고, 카나마이신, G418 등의 사용에 대하여 선별될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 유전자 ( ALS ); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙트로마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다중 선별가능한 마커가 이용가능하다. 상기 선별가능한 마커의 예는 예컨대, 미국 특허 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 및 6,118,047에 예시되어 있다. 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 또는 별법으로 스크리닝이 가능한 마커를 포함한다. 스크리닝이 가능한 마커는 발현을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝이 가능한 마커로는 β-글루쿠로니다제 또는 그에 대한 다양한 발색성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 uidA 유전자 (GUS) (문헌 [Jefferson et al., (1987), Plant Mol . Biol . Rep . 5:387-405]); 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (문헌 [Dellaporta et al., (1988) "Molecular cloning of the maize R- nj allele by transposon tagging with Ac ." In 18 th Stadler Genetics Symposium , P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82]); β-락타마제 유전자 (문헌 [Sutcliffe et al., (1978), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 75:3737-41]); 그에 대한 다양한 발색성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예컨대, 발색성 세팔로스포린인 PADAC); 루시퍼라제 유전자 (문헌 [Ow et al., (1986), Science 234:856-9]); 발색성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (문헌 [Zukowski et al., (1983), Gene 46(2-3):247-55]); 아밀라제 유전자 (문헌 [Ikatu et al., (1990), Bio / Technol . 8:241-2]); 티로신을, 결국에는멜라닌으로 축합되는 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (문헌 [Katz et al., (1983), J. Gen . Microbiol . 129:2703-14]); 및 α-갈락토시다제를 포함한다. 숙주 세포를 형질전환시키는 데 적합한 방법은 DNA를 예를 들어, 및 제한 없이, 원형질체의 형질전환에 의해 (예컨대, 미국 특허 5,508,184 참조); 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예컨대, 문헌 [Potrykus et al., (1985), Mol . Gen . Genet . 199:183-8] 참조); 전기천공에 의해 (예컨대, 미국 특허 5,384,253 참조); 탄화규소 섬유를 이용한 교반에 의해 (예컨대, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예컨대, 미국 특허 5,563,055, 5,591,616, 5,693,512, 5,824,877, 5,981,840, 및 6,384,301 참조); 및 DNA 코팅된 입자의 가속화 등에 의해 (예컨대, 미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865) 세포 내로 도입시킬 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 예컨대, 상기와 같은 기법을 적용함으로써 사실상 임의 종의 세포를 안정하게 형질전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종일 경우, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 상기 기법들 중 임의의 것을 사용하여 예를 들어, 트랜스제닉 식물의 게놈 중에 하나 이상의 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 제조할 수 있다. 발현 벡터를 식물 내로 도입시키는 데 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. A. 투메파시엔스( A. tumefaciens ) 및 A. 리조게네스( A. rhizogenes )는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자를 보유한다. Ti (종양 유도성)-플라스미드는 T-DNA로 알려져 있는 큰 세그먼트를 포함하는데, 상기 세그먼트는 형질전환된 식물로 전달된다. Ti 플라스미드의 또 다른 세그먼트인 vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복부와 경계를 이룬다. 일부 변형된 이원성 벡터에서, 종양 유도성 유전자는 결실되어 있고, vir 영역의 작용을 이용하여 T-DNA 경계부 서열과 경계를 이루는 외래 DNA를 전달한다. T-영역은 또한 예를 들어, 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선별가능한 마커, 및 예컨대, 합성 CTP-코딩 핵산과 같은, 전달용 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 A. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,536,475호, 제4,693,977호, 제4,886,937호, 및 제5,501,967호; 및 유럽 특허 EP 0 122 791), 또는 A. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된 것이다. 추가의 식물 형질전환 벡터는 예를 들어, 및 제한 없이, 문헌 [Herrera-Estrella et al., (1983), Nature 303:209-13]; [Bevan et al., (1983), Nature 304:184-7]; [Klee et al., (1985), Bio / Technol . 3:637-42]; 및 유럽 특허 EP 0 120 516에 기술되어 있는 것; 및 상기 중 임의의 것으로부터 유래된 것을 포함한다. 천연적으로 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대, 시노리조비움( Sinorhizobium ), 리조비움( Rhizobium ), 및 메조리조비움( Mesorhizobium )은 다수의 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개하기 위해 변형될 수 있다. 상기의 식물-관련 공생 박테리아는 무장 해제된 Ti 플라스미드 및 적합한 이원성 벡터, 둘 모두를 획득함으로써 유전자 전달을 위한 능력을 가지게 될 수 있다. 외인성 DNA를 수용체 세포에 제공한 후, 일반적으로는 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 형질전환된 세포를 확인한다. 형질전환된 세포를 확인할 수 있는 능력을 개선시키기 위해서는 형질전환체를 생성하는 데 사용되는 벡터와 함께, 앞서 기술된 바와 같은, 선별가능한 또는 스크리닝이 가능한 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선별가능한 마커가 사용되는 경우, 형질전환된 세포는 상기 세포를 선별제 또는 선별제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 확인된다. 스크리닝이 가능한 마커가 사용되는 경우, 세포는 원하는 마커 유전자 소질에 대해 스크리닝될 수 있다. 선별제에의 노출에서 살아남은 세포, 또는 스크리닝 검정법에서 양성인 것으로 평가된 세포를 식물의 재생을 지지하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예컨대, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대, 성장 조절 인자의 포함으로 개질될 수 있다. 조직은 식물 재생의 노력을 개시하는 데 충분한 조직이 이용될 수 있을 때까지, 또는 수동식 선별 라운드를 반복한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 형태가 될 때까지 (예컨대, 2주 이상) 성장 조절 인자를 포함하는 기초 배지 상에서 유지시킨 후, 새싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 충분한 새싹 형성이 일어날 때까지 주기적으로 배양물을 옮겨 놓는다. 일단 새싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가 성장 및 성숙화를 위해 식물을 토양으로 옮겨 놓을 수 있다. 재생 식물 중 관심 핵산 분자 (예를 들어, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정법이 수행될 수 있다. 상기 검정법으로는 예를 들어, 분자 생물학 검정법, 예컨대, 써던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 핵산 서열 분석; 생화학적 검정법, 예컨대, 면역학적 수단에 의해 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯), 또는 효소 작용에 의해 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부에 대한 검정법, 예컨대, 잎 또는 뿌리 검정법; 및 재생된 전체 식물의 표현형 분석을 포함한다. 일례로, 관심 뉴클레오티드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 통합 이벤트를 분석할 수 있다. PCR 유전형 분석은 제한하는 것은 아니지만, 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어서, PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 수행하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. PCR 유전형 분석 방법은 잘 기술되어 있으며 (예컨대, 문헌 [Rios, G. et al., (2002), Plant J. 32:243-53] 참조), 임의의 식물 중 (예컨대, Z. 메이스( Z. mays ) 또는 G. 맥스( G. max )) 또는 세포 배양물을 비롯한 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 한 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA 서열을 포함한다. 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 이벤트" 또는 "통합 이벤트"로 지칭된다. 상기 트랜스제닉 식물은 삽입된 DNA 서열에 대해 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진과 관련하여 동형접합성인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 포함하는 독립 분리 개체 트랜스제닉 식물을 그 자신, 예를 들어, F 0 식물과 유성적으로 교배시켜 (자가 수정시켜) F 1 종자를 생산함으로써 수득할 수 있다. 생산된 F 1 종자 중 1/4은 트랜스진과 관련하여 동형접합성일 것이다. F 1 종자를 발아시킴으로써, 전형적으로 SNP 검정법, 또는 이형접합체와 동형접합체가 구별될 수 있게 하는 열 증폭 검정법 (즉, 접합성 검정법)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 제조한다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 1개 이상의 폴리펩티드의 카피는, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 1개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을포함하는 1개 이상의 핵산 분자(들)가 그 내부로 도입되어 있는 색소체 함유 세포에서 생산된다. 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 각 폴리펩티드는 상이한 형질전환 이벤트에 도입된 다중 핵산 서열로부터, 또는 단일 형질전환 이벤트에 도입된 단일 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 상기 폴리펩티드는 단일 프로모터의 제어하에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 복수 개의 상기 폴리펩티드는 다중 프로모터의 제어하에서 발현된다. 각각의 펩티드 서열이 색소체로 표적화되는 것인, 다중 펩티드 서열을 포함하는 단일 폴리펩티드가 발현될 수 있다. 재조합 핵산 분자를 이용한 식물의 직접적인 형질전환 이외에도, 트랜스제닉 식물은 1개 이상의 트랜스제닉 이벤트를 가지는 제1 식물을 상기 이벤트를 포함하지 않는 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 쉽게 형질전환되는 제1 식물 계통 내로 도입함으로써 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 이 트랜스제닉 식물을 제2 식물 계통과 교배시켜 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 식물 계통으로 이입시킬 수 있다. VI . 합성 엽록체 전이 펩티드-유도된 폴리펩티드를 포함하는 식물 물질 일부 실시양태에서, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포를 포함하는 것인 식물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 식물은 식물 조직 또는 식물 세포의 형질전환, 및 전체 식물의 재생에 의해 제조될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 식물은 상업적 공급원으로부터, 또는 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 생식질로의 유입을 통해 수득될 수 있다. 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포를 포함하는 식물 물질 또한 제공한다. 상기 식물 물질은 식물 세포를 포함하는 식물로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 물질은 하기 특징들 중 하나 이상의 것을 나타낸다: 식물의 세포에서 폴리펩티드 발현; 식물의 세포의 색소체에서 폴리펩티드의 일부를 발현; 식물 세포의 세포질부터 세포의 색소체로의 폴리펩티드 이입; 식물의 세포에서 폴리펩티드의 색소체-특이 발현; 및/또는 식물의 세포에서 폴리펩티드의 국재화. 상기 식물은 코딩된 폴리펩티드의 발현 이외에 하나 이상의 바람직한 소질을 추가로 가질 수 있다. 상기 소질로는 예를 들어, 곤충, 다른 해충, 및 질환 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 안정성, 수율 또는 저장 기간 증진; 환경상의 내성; 제약 생산; 산업적 제품 생산; 및 영양상 증진을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 또는 단자엽일 수 있다. 본 방법에서 사용될 수 있는 쌍자엽 식물의 비제한적인 일례로 아라비돕시스, 알팔파, 콩류, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 양상치, 멜론, 완두콩, 고추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 평지씨, 시금치, 대두, 애호박, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 및 수박을 포함한다. 본 방법에서 사용될 수 있는 단자엽 식물이 비제한적인 일례로 옥수수, 브라시카( Brassica ), 양파, 벼, 수수, 소맥, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 라이밀, 스위치그라스, 및 잔디를 포함한다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 사용될 수 있거나, 임의 방식으로 재배될 수 있다. 일부 실시양태는 또한 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 일용품 제품, 예를 들어, 상기 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 일용품 제품을 제공한다. 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 일용품 제품으로는 예를 들어, 및 제한 없이, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물로 된 식제품, 밀, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체 곡물 또는 종자를 포함한다. 하나 이상의 일용품 또는 일용품 제품 중에서 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것은 사실상 일용품 또는 일용품 제품은 적어도 부분적으로는 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물로부터 제조되었다는 것을 나타내는 증거가 된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 일용품 제품은 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 검출가능한 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 일용품 제품은 예를 들어, 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 식품 또는 사료를 제조함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 합성 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 그의 게놈 내에 제한 없이, 그로부터 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 이벤트; 살충 단백질 (예컨대, 바실러스 투린지엔시스( Bacillus thuringiensis ) 살충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예컨대, 글리포세이트에 대해 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형 {예컨대, 수율 중가, 지방산 대사 변경, 또는 세포질적 웅성 불임성의 복원)에 기여하는 유전자를 비롯한, 1개 이상의 다른 트랜스제닉 이벤트를 그의 게놈 내에 포함할 수 있다. VII . 합성 엽록체 이식 펩티드를 매개로 한 유전자 생성물의 색소체로의 국재화 본 발명의 일부 실시양태는 유전자 생성물을 발현하고/거나, 그를 색소체 (예컨대, 엽록체)로 국재화시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 유전자 생성물은 마커 유전자 생성물, 예를 들어, 형광성 분자일 수 있다. 합성 CTP를 또한 포함하는 폴리펩티드의 일부로서 유전자 생성물의 발현은 특정 합성 CTP 서열의 색소체-국재화 능력을 평가하기 위한 시스템을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 CTP-포함 폴리펩티드의 일부로서 마커 유전자 생성물의 발현을 이용하여 마커 유전자 생성물의 발현을, 폴리펩티드가 발현되는 세포의 색소체로 표적화한다. 특정 실시양태에서, 상기 마커 유전자 생성물을 숙주 세포의 색소체(들)에서 국재화된다. 예를 들어, 마커 유전자 생성물은 숙주 세포의 세포질 또는 다른 세포소기관에서보다는 색소체(들) 중에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있거나; 마커 유전자 생성물은 색소체(들) 중에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현될 수 있거나; 마커 유전자 생성물은 본질적으로 색소체(들)에서만 발현될 수 있거나; 또는 마커 유전자 생성물은 전체적으로 색소체(들)에서 발현될 수 있고, 따라서, 세포질 또는 비-색소체 세포소기관에서의 발현은 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자 생성물에 작동가능하게 연결된, 합성 CTP의 기능적인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 기능적인 변이체 펩티드의 특징을 평가한다. 예를 들어, 1개 이상의 보존적 돌연변이(들)를 합성 CTP 내로 도입함으로써 합성 CTP의 서열은 달라질 수 있고, 생성된 변이체 펩티드를 마커 유전자 생성물에 연결할수 있다. 적합한 숙주 세포 (예를 들어, 발현 구축물 중의 하나 이상의 조절 요소가 작동가능한 세포)에서 발현시킨 후, 마커 유전자 생성물의 발현을 측정할 수 있다. 참조 합성 CTP-마커 구축물과 변이체 펩티드-마커 구축물 사이의 마커 유전자 생성물의 세포하 국재화를 비교함으로써, 변이체 펩티드가 예를 들어, 더 큰 색소체 국재화, 또는 실질적으로 동일한 색소체 국재화를 제공하는지 여부를 측정할 수 있다. 이러한 변이체는 기능성 변이체로서 간주될 수 있다. 더 큰 소성의 국재화를 제공하는 합성 CTP의 기능성 변이체를 확인하기 위해, 상기 변이체 중의 돌연변이를 추가의 합성 CTP의 변이체 내로 도입할 수 있다. 다중 회차의 상기 평가 과정을 수행하고, 이어서, 순차적으로 합성 CTP 서열에 확인된 바람직한 돌연변이를 도입시킴으로써 합성 CTP 서열을 최적화시키기 위한 반복적인 과정을 얻을 수 있다. 상기 최적화된 합성 CTP 서열, 및 상기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 최적화된 합성 CTP 서열이 추가의 돌연변이에 의해 추가로 최적화될 수 있는지 여부와는 상관없이 본 발명의 일부인 것으로 간주된다. 본원에 인용된 공개공보, 특허 및 특허 출원을 비롯한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시물의 명백한 상세한 설명과 불일치하지 않는 정도로 참고로 본원에 삽입되고, 또한 각 참고 문헌이 참고문헌으로써 개별적으로 및 구체적으로 나타나고 그의 전체가 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 삽입된다. 본원에서 논의된 참고 문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공하는 것이다. 본원의 어느 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 상기 개시내용보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 하기 실시예는 특정의 특별한 특징 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공되는 것이다. 이러한 실시예는, 본 개시내용을 기술되는 특별한 특징 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되서는 안된다. 실시예 실시예 1: 합성 엽록체 전이 펩티드 ( TraP ) 서열의 디자인 및 제조 색소체는 고등 식물 종에서 관찰되는 세포질 세포소기관으로서, 이는 모든 식물 조직에 존재한다. 엽록체는 필수적인 생리 작용을 담당하는 녹색 광합성 조직에서 관찰되는 특정 유형의 색소체이다. 예를 들어, 상기의 한 생리 작용으로는 식물이 필요로 하는 방향족 아미노산의 합성이 있다. 핵 코딩된 효소는 상기 생합성 경로에서 요구되며, 이는 세포질로부터 엽록체의 내부로 수송된다. 이들 핵 코딩된 효소는 보통 엽록체 막과 상호작용하는 N-말단 전이 펩티드를 가지며, 이를 통해 상기 펩티드의 엽록체의 스트로마로의 수송은 용이하게 이루어질 수 있다 (문헌 Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio . 10:440-447]). 이입시, 스트로마 펩티다제는 전이 펩티드를 절단하고, 이로써 성숙한 기능성 단백질이 엽록체 내에 이입된다 (문헌 문헌 [Richter S, Lamppa GK. (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio . 147:33-43]). 엽록체 전이 펩티드는 길이, 조성 및 구조에 있어 고도의 분기성을 띠는 가변 서열이다 (문헌 [Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio . 10:440 - 447]). 엽록체 전이 펩티드의 서열 유사성은 다른 식물 종으로부터의 상동성 단백질 중에서 유의적으로 분기한다. 전형적으로 프로세싱된 성숙한 기능성 단백질과 비교하였을 때, 상이한 식물 종으로부터 수득된 상동성 단백질은 전형적으로 상대적으로 고수준의 서열 유사성을 공유한다는 점을 고려해 보면, 엽록체 전이 펩티드 사이의 분기량은 예측되지 못한다. 신규한 합성 엽록체 전이 펩티드 서열을 디자인하고, 제조하고, 플랜타( planta )내 시험을 수행하였다. 신규한 합성 엽록체 전이 펩티드는 엽록체내 작물학상 중요한 단백질의 이입을 위해 효과적인 전위 및 프로세싱 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 처음에는, http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/에서 이용가능한 클로로P™ 컴퓨터 프로그램을 통해 상이한 식물 종으로부터의 천연 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 단백질 서열을 분석함으로써 추정 엽록체 전이 펩티드 서열을 확인하였다 (문헌 [Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science 8; 978-984]). 엽록체 전이 펩티드 서열 정렬을 이용하여, 신규한 합성 엽록체 전이 펩티드를 아미노산을 랜덤하게 선택함으로써 디자인하여 신규 합성 추정 엽록체 전이 펩티드 서열을 생성하였다. 새롭게 디자인된 합성 엽록체 전이 펩티드의 예시적인 서열은 TraP23 (서열 11)이다. 신규 합성 엽록체 전이 펩티드를 다중 검정을 통해 시험한 결과, 이는 일과성 플랜타내 발현 시스템을 트랜스제닉 방식으로 작물학상 중요한 트랜스진 서열에 융합된 유전자 발현 요소를 포함하는 안정한 형질전환 이벤트로서 포함하였다. 실시예 2: 합성 엽록체 전이 펩티드 ( TraP ) 서열에 대한 일과성 플랜타내 시험 담배 일과성 검정: Trap23 합성 엽록체 전이 펩티드 서열을 일과성 플랜타내 분석을 통해 초기에 시험하였다. Trap23v2 ( 서열 12 ) 합성 엽록체 전이 펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하였다. 생성 구축물은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하였다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; 문헌 [Callis, et al., (1990) J. Biol . Chem . , 265: 12486-12493]), TraP- 녹색 형광성 단백질 융합 유전자 (TraP-GFP; 미국 특허 7,678,893), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3' 비번역 구역 (AtuORF23 3'UTR; 미국 특허 5,428,147)로 구성된다. 제2 PUT는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; 문헌 [Verdaguer et al . , (1996) Plant Molecular Biology , 31:1129-1139]), dsm -2 (문헌 [DSM2; 미국 특허 출원 2011/0107455), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 구역 (AtuORF1 3'UTR; 문헌 [Huang et al ., (1990) J. Bacteriol . , 172:1814-1822])로 구성된다. 구축물 pDAB107640는 TraP23 v2 합성 엽록체 전이 펩티드를 함유한다 (도 3). 구축물은 제한 효소 소화 및 시퀸싱을 통해 확인되었다. 마지막으로, 구축물은 아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환되었고, 글리세롤 스톡으로서 저장되었다. 아그로박테리움 글리세롤 스톡으로부터, 냉동된 배양액으로 가득찬 루프를 14 ml 멸균 튜브 중 YPD 2 ml (100 μg/ml 스펙티노마이신)에 접종시켰다. 접종된 배지를 200 rpm으로 진탕하며 28℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날 배양액 약 100 μl를 사용하여 멸균한 125 ml 트리-배플형(tri-baffled) 플라스크에 YPD 25 ml (100 μg/ml 스펙티노마이신)에 접종시키고, 200 rpm으로 진탕하며 28℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날 배양액을 멸균한 ddH 2 0 (pH 8.0) 중 OD 600 0.5로 희석하였다. 희석된 아그로박테리움 균주를 P19 헬퍼(helper) 단백질을 함유한 제2 아그로박테리움 균주와 1:1의 비율로 혼합하였다. 담배 잎 침투를 위해 문헌 [Voinnet O, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D., (2003)]의 방법으로 배양액을 사용하였다. 토마토 덤불 성장 위축 바이러스의 p19 단백질에 의해 유전자 침묵의 억제에 기초한 식물에서 향상된 발현 시스템 (문헌 [ The Plant Journal , 33:949-956]). 침투된 담배 식물을 분석될 때까지 적어도 3일 동안 24℃에서 16시간의 명기로 설정된 콘비론(Conviron)™에 두었다. 현미경 결과: 아그로박테리움-침투 담배 잎을 식물로부터 절단하고, 탈수를 방지하기 위해 물과 함께 페트리 접시에 두었다. 침투된 담배 잎은 다크 리더 핸드 램프™(Dark Reader Hand Lamp; 클래어 케미칼 리서치 코포레이션; 미국 콜로라도주 돌로레스)를 사용하여 제자리에 유지된 롱-패스(long-pass) 필터 유리를 사용하는 청색광 여기 하에 관찰하여 GFP 보고 단백질을 성공적으로 발현시킨 잎의 비손상 영역을 확인하였다. 구체적으로 확인된 잎 영역을 잎으로부터 해부하고, 공초점 현미경 (레이카(Leica) TCS-SP5 AOBS™; 미국 일리노이주 버팔로 그로브)에 의해 영상화하기 위해 물에 탑재하였다. GFP 보고 단백질을 다중선 아르곤 이온 레이저를 사용하여 514 nm 레이저 선에 의해 여기시켰다. 검출 슬릿의 폭은 배경 잎 자동 형광을 배제하기 위해 비 발현(암색) 대조 잎 샘플을 사용하여 조정하였다. 엽록소 자발형광은 엽록체 국재화의 결정을 위한 형광성 보고 단백질 신호에 직접 비교를 위해 제2 채널에서 동시에 수집하였다. 현미경 영상 결과는 TraP23 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 GFP 형광성 단백질이 담배 세포의 세포질에 위치한 엽록체 내에 검출가능한 양의 GFP 단백질을 축정하지 않았음을 나타내었다 (도 4). 웨스턴 블롯 결과: 침투된 담배 식물의 샐플을 웨스턴 블롯팅을 통해 분석하였다. 잎 천공물을 수집하고 비드-밀링하였다. 약 100 내지 200 mg의 잎 물질을 2개의 BB (강철 볼; 데이지; 미국 애리조나 로저스) 및 PBST 500 ml와 3분 동안 클레코(Kleco)™ 비드 밀에서 혼합하였다. 이어서, 샘플을 원심분리기에 4℃에서 14,000 xg으로 스핀다운하였다. 상청액을 제거하고, 웨스턴 블롯 또는 면역침강법을 통해 직접 분석하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 피어스 다이렉트 아이피 키트(Pierce Direct IP kit)™ (써모 사이언티픽; 미국 일리노이주 락포드)를 사용하여 면역침감법을 수행하였다. 대략, 안티-GFP 50 μg을 수지로 감쌌다. 샘플을 4℃에서 수지와 함께 밤새 인큐베이팅시켰다. 이어서, 샘플을 세척하고, 다음날 아침에 용리시키고, 동일한 부피의 2X 8M 우레아 샘플 완충액을 배합한 후 샘플을 5분간 끓임으로써 분석을 준비하였다. 끓인 샘플을 40분 동안 MOPS 완충액에서 4 내지 12% SDS-비스 트리스 겔(SDS-Bis Tris gel)에서 수행하였다. 이어서, 겔을 제조업자의 프로토콜에 따라 이비트로겐 아이블롯™(Invitrogen iBlot; 라이프 테크놀로지스; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 블롯팅하였다. 블롯팅된 막을 PBS-트윈 용액 중에 5% 무지방 분유를 사용하여 10분 동안 블록킹하였다. 막을 1시간 동안 PBS-트윈 용액 중에 5% 무지방 분유에서 1:1000 희석으로 사용된 1차 항체(토끼의 단일클론 안티-GFP)로 탐침하였다. 이어서, 모든 미결합 1차 항체를 제거하기 위해 막을 PBS-트윈으로 5분 동안 3회 세정하였다. 막을 60분 동안 1:1000 희석으로 사용된 염소 항체 (라이프 테크놀로지스) 중 2차 단일클론 항-토끼로 탐침하였다. 막을 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 써모 BCIP/NBT 기질을 첨가함으로써 전개하였다. 색도 기질이 5 내지 10분 동안 전개시킨 후, 블롯을 물로 세정하고 건조시켰다. 웨스턴 블롯 결과는 GFP 단백질이 침투 담배 세포에서 발현되었음을 나타내었다. pDAB107640 침투 담배 식물 잎 조직은 GFP 항체에 반응하고, 엽록체 전이 펩티드를 함유하지 않은 GFP 대조군으로부터 수득된 GFP 단백질 밴드에 크기가 당량인 단백질 밴드의 존재에 의해 나타난 바와 같이 GFP 단백질을 발현시켰다. 게다가, 이 결과는 TraP 합성 엽록체 전이 펩티드가 처리되고 GFP 단백질로부터 분해되었음을 나타내었다. TraP23-GFP 구축물은 대조군 GFP 단백질보다 더 큰 분자량인 사전 처리된 단백질 밴드를 발현시켰다. 대조군 GFP에 크기가 당량인 웨스턴 블롯 상의 밴드의 존재는 TraP23 엽록체 전이 펩티드 서열이 처리되었고, 이로써 GFP 대조군에 대응하는 분자량 크기로 GFP의 크기를 감소시켰음을 나타내었다. 옥수수 원형질체 일과성 검정 : 옥수수 원형질체 일과성 플랜타내 검정을 통해 시험하기 위해서 Trap23 v2 합성 엽록체 전이 펩티드 서열 (서열 12)을 녹색 형광성 단백질 유전자의 상류에 클로닝하고, 구축물 pDAB106598 (도 5) 내로 도입하였다. 생성된 구축물은 하기 식물 전사 단위 (PTU)를 포함하였다. 제1 PTU는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 (ZmUbil 프로모터, 문헌 [Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology , 18:675-689), TraP- 녹색 형광성 단백질 융합 유전자 (TraP23-GFP; 미국 특허 번호 제7,678,893호), 및 제아 메이스 퍼옥시다제 5 3' 비번역 영역 (ZmPer5 3'UTR; 미국 특허 번호 제6384207호)으로 구성되었다. 제한 효소 분해 및 서열 분석을 통해 구축물을 확인하였다. 제아 메이스 변종 B104의 종자를 트윈 20을 2-3 방울 함유하는, 50% 클로록스(Clorox) (3% 차아염소산나트륨) 중에서 약 20분 동안 왕성하게 진탕시켜 표면을 멸균시켰다. 종자를 멸균 증류수로 철저하게 세정하였다. 멸균 종자를 피타트레이스(Phytatrays) 또는 유사한 유형의 박스 중 ½ MS 배지 상에 플레이팅하고, 암실 (28℃)에서 12 내지 20일 동안 성장시켰다. 옥수수 원형질체 일과성 검정을 사용하여 B104-옥수수의 잎으로 옥수수 원형질체를 수득하고, 형질감염시켰다. 상기 옥수수 원형질체 검정은 문헌 [Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen, J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols , 2:1565-1572]에 기술된 시스템의 변형법이다. 문헌 [Yoo et al., (2007)]에 기술되어 있는 바와 같이 용액을 제조하되, 단, 예외적으로, 하기 실험에서 사용된 만닛톨의 농도를 0.6 M로 변경하였다. 실온에서 약 40 ㎍의 플라스미드 DNA (pDAB106598)를 함유하는 2 ml 미세원심분리관에 원형질체를 첨가함으로써 100 내지 500 ㎕의 원형질체 (1-5x10 5 )의 형질감염을 완료하였다. 바람직하게는 DNA의 부피를 원형질체 부피의 약 10% 부피로 유지시켰다. 원형질체 및 DNA를 가끔씩 5분간의 인큐베이션 기간 동안 혼합하였다. 동량의 PEG 용액을 원형질체 및 DNA에 한번에 2 방울씩 천천히 첨가하였고, PEG 용액을 적가하는 그 중간 시간에 혼합하였다. 가끔씩 온화하게 혼합해 주면서, 약 10분 동안 상기 관을 인큐베이션시켰다. 이어서, 1 ml의 W5+ 용액을 첨가하고, 상기 관을 수회에 걸쳐 도립시켜 혼합하였다. 상기 관(들)을 4℃ 온도에서 75 xg로 5분 동안 원심분리하였다. 최종적으로, 상청액을 제거하고, 펠릿을 1 ml의 WI 용액 중에 재현탁시키고, 원형질체를 소형 페트리 플레이트 (35 x 10 mm) 또는 6웰 다중 웰 플레이트에 놓고, 암실에서 실온하에 밤새도록 인큐베이션시켰다. 12시간 동안 인큐베이션시킨 후, 현미경 검사에 의해 GFP의 형광을 관찰하였다. 앞서 기술된 현미경 검사 조건을 영상화하는 데 사용하였다. 현미경 검사 영상화 결과, TraP23 합성 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 GFP 형광성 단백질은 옥수수 세포의 세포질의 엽록체 내로 전위되지 않은 대조군 GFP 형광성 단백질과 비교하여 옥수수 세포의 세포질에 위치하는 엽록체 내에 축적되어 있는것으로 나타났다 (도 6). 상기 현미경 검사 영상화 결과는 GFP 단백질의 엽록체 내로의 전위는 TraP23 키메라 엽록체 전이 펩티드의 결과였다는 것을 제안한다. 실시예 3: 아라비돕시스에서 작물학상 중요한 트랜스진을 발현시키기 위한 합성 엽록체 전이 펩티드 ( TraP ) 서열 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli )의 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 신타제 효소 (EPSP 신타제) 중 단일 아미노산 돌연변이 (G96A)는 글리포세이트 비감응성을 유발할 수 있다 (문헌 [Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)]). 상기 돌연변이가 글리포세이트에 대한 내성을 부여하지만, 이는 또한 EPSP 신타제와 그의 천연 기질, 포스포에놀피루베이트 (PEP)의 결합에 악영향을 주는 것으로 알려져 있다. 상기로부터 초래된 결합률 변화로 인해 돌연변이화된 효소는 글리포세이트에 대한 플랜타내 내성을 제공하기에는 부적합화될 수 있다. NCBI 진뱅크 데이터베이스를 E. 콜라이( E. coli ) 버전의 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 G96A 돌연변이의 것과 유사한, EPSP 신타제 효소내 위치에 알라닌을 천연적으로 포함하는 EPSP 신타제 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 인실리코 스크린닝을 수행하였다 (문헌 [Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)]). 상기 위치에 천연 알라닌을 함유하는 것으로 확인된 한 효소는 스트렙토마이세스 스비세우스( Streptomyces sviceus ) ATCC29083으로부터의 DGT-28 (진뱅크 ACC 번호 ZP_06917240.1)였다. 추가의 인실리코 데이터 마이닝을 통해 DGT-28과 더 큰 상동성을 가지는, 3가지 다른 독특한 스트렙토마이세스 효소: DGT-31 (진뱅크 ACC 번호 YP_004922608.1); DGT-32 (진뱅크 ACC 번호 ZP_04696613); 및 DGT-33 (진뱅크 ACC 번호 NC_010572)이 밝혀졌다. 이들 효소들은 각각 E. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 G96A 돌연변이의 것과 유사한, EPSP 신타제 효소내 위치에 천연 알라닌을 포함한다. 상이한 유기체로부터의 EPSP 신타제 단백질의 길이는 상이하기 때문에, E. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 번호 매김이 다른 유기체로부터의 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 번호 매김과 반드시 일치하는 것은 아니다. 글리포세이트 내성 또는 PEP 기질 친화성과 관련하여 상기 확인된 EPSP 신타제 효소의 특징에 대해서는 앞서 규명되지 않았다. 추가로 상기 EPSP 신타제 효소는 신 부류의 EPSP 신타제 효소를 나타내며, 이는 앞서 기술된 부류 I (추가로 미국 특허 번호 RE39247에 기술된 식물 유래 서열), II (추가로 미국 특허 번호 RE39247에 기술된 박테리아 유래 서열), 및 III (추가로 국제 특허 출원 WO 2006/110586에 기술된 박테리아 유래 서열) EPSP 신타제 효소를 특징을 규명하는 데 사용된 어떤 서열 모티프도 포함하지 않는다. 부류 I EPSP 신타제 효소와 비교함으로써 신규한 DGT-28, DGT-31, DGT-32, 및 DGT-33 효소를 글리포세이트 내성 및 PEP 기질 친화성에 대하여 특징을 규명하였다. 하기 부류 I 효소; 글리신 맥스( Glycine max )로부터의 DGT-1, 브라시카 나푸스로부터의 DGT-3 (진뱅크 ACC 번호 P17688), 및 트리티쿰 아에스티붐( Triticum aestivum )으로부터의 DGT-7 (진뱅크 ACC 번호 EU977181)은 비교를 위한 것이었다. 부류 I EPSP 신타제 효소 및 그의 돌연변이체 변이체를 합성하고 평가하였다. 식물 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 돌연변이는 E. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소로부터의 G96A 돌연변이의 것과 유사한, EPSP 신타제 효소내 위치에서 이루어진 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이로 구성된다. 추가로, 문헌 [Funke et al., (2009)]에 기술되어 있는 바와 같이, E. 콜라이의 EPSP 신타제 중 아미노산 97 (T→I) 및 아미노산 101 (P→S)의 것과 유사한, 상기 부류 I EPSP 신타제 효소내 위치에 트레오닌에서 이소류신으로의, 및 프롤린에서 세린으로의 돌연변이가 도입되었다. DGT -28, DGT -31, DGT -32, 및 DGT -33 : 새로 디자인된, 쌍자엽 식물의 최적화된 dgt -28 v5 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 14로 열거되어 있다. 새로 디자인된, 단자엽 식물의 최적화된 dgt -28 v6 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 15로 열거되어 있다; 제2 아미노산 위치에 알라닌을 도입하여 제한 효소 부위를 도입함으로써 상기 서열을 약간 변형시켰다. 생성된 DNA 서열은 바람직한 염기 조성인, 보다 고도한 코돈 다양성을 가지고, 전략상 배치된 제한 효소 인식 부위를 포함하며, 유전자의 전사, 또는 생성물 mRNA의 번역을 방해할 수 있는 서열은 포함하지 않았다. 추가 서열, 예컨대, 6-프레임 종결 (코딩 서열의 3' 단부에 첨가된, 6개의 리딩 프레임 모두에 위치하는 종결 코돈), 및 클로닝을 위한 5' 제한 부위를 함유하는, 서열 14 및 서열 15를 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업적 공급업체 (DNA2.0: 미국 캘리포니아주 멘로 파크)가 수행하였다. 이어서, 하기 실시예에 기술되는 바와 같이, 합성 핵산 분자를 발현 벡터로 클로닝하고, 식물 또는 박테리아를 형질전환시켰다. 유사한 코돈 최적화 전략법을 사용하여 dgt -1. dgt -3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt -3 v4 (T174I; P178S), dgt -7 v4 (T168I; P172S), dgt -32 v3 , dgt-33 v3 , 및 dgt -31 v3 을 디자인하였다. 코돈 최적화된 버전의 상기 유전자들을 각각 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 및 서열 23으로서 열거한다. 식물 이원성 벡터 구축 . 프레임내 융합체로서 dgt -28에 결합된 엽록체 전이 펩티드 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 진입 벡터의 구축에 표준 클로닝 방법을 사용하였다. 인-퓨전™ 어드벤티지 테크놀러지(IN-FUSION™ Advantage Technology) (클로테크(Clontech: 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))를 이용하여 dgt -28에 융합된 전이 펩티드 (TraP)를 포함하는 진입 벡터를 조립하였다. 융합의 결과로서, 제1 아미노산인 메티오닌을 dgt - 28 로부터 제고하였다. 전이 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열 TraP4 v2 (서열 24), TraP5 v2 (서열 25), TraP8 v2 (서열 26), TraP9 v2 (서열 27), TraP12 v2 (서열 28), 및 TraP13 v2 (서열 29)를 각각 DNA2.0 (미국 캘리포니아주 멘로 파크)에 의해 합성하고, 독특한 AccI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 이하의, dgt -28의 5' 단부 단편에 융합시켰다. 다양한 TraP 및 dgt - 28 발현 카세트를 포함하는 이원성 플라스미드를 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 v2; 문헌 [Callis, et al., (1990) J. Biol. Che ., 265: 12486-12493])에 의해 구동시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR vl; 미국 특허 번호 제5,428,147호) 측면에 배치시켰다. 조립된 TraP 및 dgt -28 발현 카세트를 게이트웨이 ® 테크놀러지(GATEWAY ® Technology) (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 조작하고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 통해 식물 내로 형질전환시켰다. 제한 엔도뉴클레아제를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) (NEB: 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하고, DNA 결찰을 위해 T4 DNA 리가제 (인비트로겐)를 사용하였다. 선별가능한 마커 카세트 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus) 프로모터 (CsVMV v2; 문헌 [Verdaguer et al., (1996) Plant Mol . Biol ., 31: 1129-1139]) - DSM -2 (미국 특허 출원 번호 2007/086813) - 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6; 문헌 [Huang et al., (1990) J. Bacteriol . 172:1814-1822])을 포함하는 단일 목적지 벡터 내로 한 진입 벡터를 조립하기 위해 GATEWAY ® LR CLONASE ® (GATEWAY ® LR CLONASE ® ) 효소 믹스 (인비트로겐)를 사용하여 게이트웨이 반응을 수행하였다. 뉴클레오스핀 ® 플라스미드 키트(NUCLEOSPIN ® Plasmid Kit) (마슈레-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc.: 미국 펜실베이니아주 베슬리헴)) 또는 플라스미드 미디 키트(Plasmid Midi Kit) (퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 공급업체의 설명서에 따라 플라스미드 제조를 수행하였다. 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후, 퀴아퀵™ 겔 익스트렉션 키트(QIAquick™ Gel Extraction Kit) (퀴아젠)을 사용하여 DNA 단편을 단리시켰다. 먼저, 조립된 플라스미드 모두의 콜로니를 미니프렙 DNA의 제한 분해에 의해 스크리닝하였다. 선별된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열 분석 업체 (유로핀스™ MWG 오페론(Eurofins™ MWG Operon: 미국 앨라배마주 헌츠빌))에 의해 서열 분석하였다. 시퀀서™(SEQUENCHER™) 소프트웨어 (진 코즈 코포레이션(Gene Codes Corp.: 미국 미시건주 앤 아버))를 이용하여 서열 데이터를 조립하고, 분석하였다. 하기 이원성 구축물은 다양한 TraP: dgt -28 융합 유전자 서열을 발현하는데: pDAB107527은 TraP4 v2 dgt -28 v5 (서열 30)를 포함하고; pDAB105530은 TraP5 v2: dgt-28 v5 (서열 31)를 포함하고; pDAB105531은 TraP8 v2: dgt -28 v5 (서열 32)를 포함하고; PDAB105532는 TraP9 v2: dgt -28 v5 (서열 33)를 포함하고; pDAB105533은 TraP12 v2: dgt -28 v5 (서열 34)를 포함하고; pDAB105534는 TraP13 v2: dgt -28 v5 (서열 35)를 포함한다. 제1 코돈 (GCA)을 (GCT)로 변경하여 pDAB105534의 dgt -28 v5 서열을 변형시켰다. 추가의 식물 이원성 벡터 구축 . 상기 기술된 것과 유사한 클로닝 전략법을 사용하여 dgt -31, dgt -32, dgt -33, dgt -1, dgt -3, 및 dgt -7 을 함유하는 이원성 플라스미드를 구축하였다. 미생물 유래 유전자; dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33을 앞서 기술된 상이한 엽록체 전이 펩티드와 융합시켰다. 하기 엽록체 전이 펩티드를 사용하였다; TraP14 v2 (서열 36), TraP23 v2 (서열 37), TraP24 v2 (서열 38). pDAB107532는 TraP14 v2에 융합된 dgt -32 v3 (서열 39)을 함유하고, pDAB107534는 TraP24 v2에 융합된 dgt -33 v3 (서열 40)을 함유하고, pDAB107533은 TraP23 v2에 융합된 dgt -31 v3 (서열 41)을 함유하였다. dgt 발현 카세트를 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터 v2)에 의해 구동시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR v1) 측면에 배치시켰다. 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV v2) - DSM -2 -아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6)을 포함하는 DSM-2 선별가능한 마커 카세트 또한 이원성 벡터에 존재하였다. dgt-31 v3, dgt-32 v3, 및 dgt -33 v3 이 앞서 기술된 앞서 기술된 엽록체 전이 펩티드 서열에 융합되어 있는 추가의 이원성체를 구축하였다. 예를 들어, TraP8 v2 서열을 dgt-31 v3, dgt-32 v3, 및 dgt -33 v3 에 융합시키고, 상기 기술된 바와 같이 이원성 벡터로 클로닝하였다. 부류 I 유전자 ( dgt -1, dgt -3 , 및 dgt -7 )를 포함하는 이원성 벡터를 구축하였다. 하기 이원성 벡터를 구축하고, 식물 내로 형질전환시켰다: 미국 특허출원 공개 번호 2009/0064376에 기술되어 있는 바와 같이 니코티아나 타바쿰( Nicotiana tabacum ) 오스모틴(Osmotin) 서열 측면에 위치하는, 미국 특허출원 공개 번호 2011/0124503에 기술되어 있는 바와 같은 dgt -1 v4 서열을 포함하는 pDAB4104; pDAB102715; pDAB102716; pDAB102717; 및 pDAB102785. dgt -28 , dgt -31 , dgt -32 , 및 dgt -33 에 융합된 다양한 TraP 엽록체 전이 펩티드를 부류 I 유전자에 부가하지 않았는데, 그 이유는 상기 식물 유래 서열이 천연 식물 엽록체 전이 펩티드를 가지고 있기 때문이다. 상기 벡터는 하기 표 1에서 추가로 상세하게 기술된다.
아라비돕시스 탈리아나 형질전환. 문헌 [Clough and Bent (1998)]로부터의 화아 침지(floral dip) 방법을 사용하여 아라비돕시스를 형질전환시켰다. 상기 기술된 이원성 플라스미드 중 하나를 포함하는 선별된 아그로박테리움 콜로니를 사용하여, 스펙트로마이신 (100 mg/L) 및 카나마이신 (50 mg/L)을 함유하는 하나 이상의 100 mL YEP 브로쓰 예비-배양물에 접종하였다. 배양물을 225 rpm으로 일정하게 교반하면서 28℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 세포를 실온에서 대략 5,000 xg으로 10분 동안 펠릿화하고, 생성된 상청액은 폐기하였다. 세포 펠릿을 5% (w/v) 수크로스, 10 ㎍/L 6-벤질아미노퓨린, 및 0.04% 실웨트(Silwet)™ L-77을 함유하는 400 mL 침윤 배지에 온화하게 재현탁시켰다. 대략 1개월된 식물을 온화하게 교반시키면서 5-10분 동안 상기 배지에 침지시켰다. 식물을 측면으로 눕히고, 2-3시간 동안 투명 또는 불투명 비닐 봉지로 덮은 후, 직립시켰다. 식물을 22℃에서 16시간 명기/8시간 암기인 광주기로 성장시켰다. 침지 후 대략 4주 경과하였을 때, 종자를 수거하였다. 형질전환된 식물 선별 . 새로 수거된 T 1 종자 [ dgt 및 DSM -2 발현 카세트 포함]를 실온에서 7일 동안 건조시켰다. T 1 종자를 26.5 x 51 cm 발아 트레이에 파종하였는데, 이들 각각은, 앞서 40 mL의 0.1% 아가로스 용액 중에 현탁시키고, 4℃에서 2일 동안 보관하여 휴면 요건을 완료하고, 확실하게 동조 종자 발아가 이루어진, 200 mg 분취량의 계층화된 T 1 종자 (~10,000개의 종자)를 받았다. 선샤인 믹스 LP5(Sunshine Mix LP5)를 미세 질석으로 덮고, 습윤화될 때까지 호그랜드(Hoagland)의 용액을 이용하여 저면 관수를 수행한 후, 중력 배수시켰다. 피펫을 이용하여 각 40 mL 분취량의 계층화된 종자를 질석 상에 고르게 파종시키고, 4-5일 동안 습도 유지용 돔으로 덮어 놓았다. (공동으로 형질전환된 DSM -2 유전자 선별을 위해) 발아 후 글루포시네이트 분무를 이용하여 1차 형질전환체 선별을 수행하기 1일 전 돔을 제거하였다. 식재 후 7일째 (DAP: 식재 후의 경과일수: days after planting) 및 11 DAP에, T 1 식물 (각각 자엽 및 2-4-lf 단계)에 0.2% 리버티(Liberty) 제초제 용액 (200 g ai/L 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언시즈(Bayer Crop Sciences: 미국 미주리주 캔자스주))을 10 mL/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 데빌비스(DeVilbiss) 압축 공기 분무 팁을 이용하여 분무함으로써 글루포시네이트 1회 시용당 280 g ai/ha의 유효 비율로 전달하였다. 최종 분무 후 4-7일이 경과하였을 때 생존 식물 (활발하게 성장하는 식물)을 확인하고, 화분용 배지 (메트로 믹스(Metro Mix) 360)로 제조된 3 인치 (7.6 cms) 포트로 개별적으로 이식시켰다. 이식시킨 식물을 온실 (22±5℃, 50±30% RH, 14 h 명기: 10 암기, 최소 500 μE//㎡s 1 자연광 + 보충광)에서 재배하였다. 글리포세이트 내성 유전자가 식물의 게놈 내로 안정하게 통합되었는지를 확인하기 위해 생존한 T 1 식물에 대한 분자적 확인 분석을 완료하였다. 분자적 확인 . pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533, 또는 pDAB105534로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 게놈 내에 dgt -28 및 DSM -2 트랜스진이 존재하는지를 확인하였다. 가수분해 프로브 검정법, 유전자 발현 카세트 PCR (식물 전사 단위 PCR - PTU PCR로도 기술된다), 써던 블롯 분석, 및 정량적 역전사 PCR 분석을 통해 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하였다. 먼저 택맨™과 유사한 가수분해 프로브 검정법을 통해 T 1 아라비돕시스 식물을 스크리닝하여 DSM -2 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. 유전자 발현 카세트 PCR을 통해 이벤트를 스크리닝함으로써 dgt 발현 카세트가 재배열 없이 식물 게놈 내로 완전하게 통합되었는지 여부를 측정하였다. 상기 연구로부터 작성된 데이터를 사용하여 트랜스진 카피수를 측정하고, 자가 수정 및 T 2 세대로의 진행을 위해 최상인 아라비돕시스 이벤트를 확인하였다. 진행된 T 2 아라비돕시스 식물 또한 가수분해 프로브 검정법을 통해 스크리닝함으로써 식물 염색체내 DSM -2 및 dgt 유전자의 존재를 확인하고, 그의 카피수를 추정하였다. 최종적으로, 써던 블롯 검정법을 사용하여 T 1 아라비돕시스 식물의 서브세트 상에서의 카피수 추정치를 확인하였다. 유사한 검정법을 사용하여 pDAB41014로 형질전환된 식물로부터의 dgt -1 트랜스진의 존재, pDAB107532로 형질전환된 식물로부터의 dgt -32 트랜스진의 존재, pDAB107534로 형질전환된 식물로부터의 dgt -33 트랜스진의 존재, pDAB107533으로 형질전환된 식물로부터의 dgt -31 트랜스진의 존재, pDAB102715로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재, pDAB102716으로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재, pDAB102717로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재, 및 pDAB102785로 형질전환된 식물로부터의 dgt -7 트랜스진의 존재를 확인하였다. 가수분해 프로브 검정법 . 하기 기술되는 가수분해 프로브 검정법을 이용하여 T 1 및 T 2 아라비돕시스 식물에서 카피수를 측정하였다. 다양한 개수의 트랜스진을 포함하는 식물을 확인하고, 후속 글리포세이트 내성 연구를 진행시켰다. 조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 클레코(KLECO)™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크.(Environ Metal INC., 미국 오레곤주 스위트 홈)를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 바이오스프린트(Biosprint)™ 96 식물 키트 (퀴아젠™, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 게놈 DNA를 콴트-잇™ 피코 그린 DNA 어세이 키트(QUANT-IT™ PICO GREEN DNA ASSAY KIT) (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 가수분해 프로브 검정법을 수행하기 위해 바이오로보트3000™(BIOROBOT3000)™ 자동 액체 핸들러 (퀴아젠: 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 정량화된 게놈 DNA를 약 2 ng/㎕로 조정하였다. 라이트사이클러(LIGHTCYCLER) ® 480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언� ��(Roche Applied Science: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 이용하여 실시간 PCR에 의해 가수분해 프로브 검정법에 의한 트랜스진 카피수 측정을 수행하였다. DSM -2, dgt -28 및 내부 참조 유전자인 TAFII15 (진뱅크 ID: NC 003075; 문헌 [Duarte et al., (201) BMC Evol . Biol ., 10:61])에 대한 검정법을 디자인하였다. 증폭을 위해, 라이트사이클러 ® 480 프로브 마스터 믹스(LIGHTCYCLER ® 480 Probes Master mix) (로슈 어플라이드 사이언스: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 0.1 μM의, DSM -2 및 dgt -28 에 대한 각 프라이머, 0.4 μM의, TAFII15 에 대한 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 멀티플렉스 반응물 중에서 1 X 최종 농도로 제조하였다. 표 2. 60℃에서 40초 동안 연장시키고, 형광을 획득하는 2단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치 (Ct) 평균값을 사용하였다. 상대 콴트 모듈을 이용하여 라이트사이클러™ 소프트웨어 출시 1.5를 사용함으로써 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초하는 것이다. 이를 위해 각 진행당 단일 카피 교정기 및 공지된 2개의 카피 체크로부터 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. T 1 및 T 2 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에 대해 가수분해 프로브 스크린의 카피수 결과를 측정하였다.
써던 블롯 분석을 통한 dgt -28 통합 확인 . 써던 블롯 분석을 사용하여 삽입된 T-가닥 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고, dgt -28 을 포함한 이벤트를 확인하였다. 데이터를 작성하여 아라비돕시스 게놈 내의 트랜스진 삽입체의 통합 및 완전성을 입증하였다. 써던 블롯 데이터를 사용하여 T-가닥 DNA의 무손상 카피의 단순 통합을 확인하였다. dgt -28 유전자 발현 카세트에 특이적인 PCR 증폭 프로브를 사용하여 상세한 써던 블롯 분석을 수행하였다. 특이 제한 효소로 분해된 게놈 DNA와 프로브의 하이브리드화를 통해 특정 분자량의 게놈 DNA 단편을 확인하였으며, 특정 분자량의 패턴을 이용하여 다음 세대로의 진행을 위한 전장의 단순 삽입 T 1 트랜스제닉 이벤트를 확인하였다. 조직 샘플을 2 mL 원뿔형 관 (에펜도르프(Eppendorf)™)에 수집하고, 2일 동안 동결 건조시켰다. 클렉코(KLECKO)™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 CTAB 단리화 방법을 사용하여 단리시켰다. 퀴아젠™ 게놈 팁스(Qiagen™ Genomic Tips) 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추가로 정제하였다. 게놈 DNA를 콴트-잇™ 피코 그린 DNA 어세이 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 일정한 농도로 유지시키기 위해 정량화된 게놈 DNA를 4 ㎍으로 조정하였다. 각 샘플에 대해 4 ㎍의 게놈 DNA를 제한 효소 SwaI (뉴 잉글랜드 바이오랩스: 미국 매사추세츠주 베벌리)로 완전하게 분해하고, 25℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, NsiI 를 반응물을 첨가하고, 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 퀵 프리시피테이션 솔루션(Quick Precipitation Solution)™ (에지 바이오시스템즈(Edge Biosystems: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)으로 침강시켜 분해된 DNA를 농축시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 65℃에서 1시간 동안 25 ㎕의 물 중에 재현탁시켰다. 1 X TAE에서 제조된 0.8% 아가로스 겔 상에 재현탁된 샘플을 로딩하고, 1X TAE 완충제 중 1.1 V/cm로 밤새도록 전기영동시켰다. 겔을 순차적으로 30분 동안 변성 (0.2 M NaOH/0.6 M NaCl), 및 30분 동안 중화 (0.5 M 트리스-HCl (pH 7.5)/1.5 M NaCl)시켰다. 크로마토그래피용 종이 윅 및 종이 타올을 이용함으로써, 처리된 임모빌론(IMMOBILON)™ NY+ 전달 막 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌러리카) 상의 겔을 통해 20 X SSC 용액을 밤새도록 수동적으로 위킹시킴으로써 DNA 단편을 나일론 막으로 전달하였다. 전달 후, 막을 2X SSC로 단시간 동안 세척하고, 스트라타링커(STRATALINKER)™ 1800 (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야))과 교차 결합시키고, 80℃에서 3시간 동안 진공 베이킹시켰다. 모델 400 하이브리드화 인큐베이터 (로빈스 사이언티픽(Robbins Scientific: 미국 캘리포니아주 서니배일))를 사용하여 유리 롤러 병 중 65℃에서 1시간 동안 사전 하이브리드화 용액 (퍼펙트 Hyb 플러스(Perfect Hyb plus), 시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스))과 함께 블롯을 인큐베이션시켰다. 전체 코딩 서열을 포함하는 PCR 단편으로부터 프로브를 제조하였다. 랜덤 RT 프라임 IT(Random RT Prime IT) 표지화 키트 (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라호야)를 통해 α 32 P-dCTP로 표지화시켰다. 변성된 프로브를 1 ml당 1 블롯마다 대략 2 x 10 6 개의 계수로 하이브리드화 완충제에 직접 첨가하면서 블롯을 65℃에서 밤새도록 하이브리드화시켰다. 하이브리드화시킨 후, 블롯을 65℃에서 40분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 순차적으로 세척하였다. 최종적으로, 블롯을 보관 포스포르 영상화 스크린에 노출시키고, 몰레큘라 다이나믹스 스톰 860(Molecular Dynamics Storm 860)™ 영상화 시스템에 노출시켰다. 본 연구에서 완료된 써던 블롯 분석을 사용하여 카피수를 측정하고, 선택된 이벤트가 아라비돕시스의 게놈내에 dgt -28 트랜스진을 함유하였다는 것을 확인하였다. PCR 분석을 통한 dgt -28 유전자 발현 카세트 확인 . 종점 PCR 반응에 의해 T 1 식물 이벤트에 포함되어 있는 dgt -28 유전자 발현 카세트의 존재를 검출하였다. dgt-28 유전자 발현 카세트의 AtUbi10 프로모터 v2 및 AtuORF23 3'UTR v1 영역에 특이적인 프라이머 ( 하기 표 3 )를 검출에 사용하였다.
PCR 반응은 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 표준 3단계 PCR 사이클링 프로토콜을 필요로 하였다. PCR 반응 모두 하기 PCR 조건을 사용하여 완료하였다: 94℃에서 3분, 이어서, 94℃에서 30초 동안, 60℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 3분 동안 진행되는 사이클 35회. 제조사의 설명서에 따라 EX-TAQ™ PCR 키트 (다카라 바이오테크놀러지 인크.(TaKaRa Biotechnology Inc.: 일본 시가 오츠))를 이용하여 반응을 완료하였다. 마지막 사이클을 진행한 후, 반응물을 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. TAE 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 앰플리콘 크기를 측정하였다. 예상된 크기의 PCR 앰플리콘이 전자의 유전자 발현 카세트의 존재가 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트의 게놈 내에 존재하였다는 것으로 나타내었다. 정량적 역전사 PCR 분석을 통한 dgt -28 상대적인 전사 확인 . dgt -28 트랜스제닉 식물의 조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 80℃에서 냉동시켰다. 클레코™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크.: 미국 오레곤주 스위트 홈)를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 전체 RNA를 퀴아젠™ Rneasy 96 키트 (퀴아젠™, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여, 칼럼 상에서의 임의적인 DnaseI 처리를 포함하는 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 상기 단계에 이어서 용리된 전체 RNA를 추가의 DnaseI (암비온(Ambion)™: 미국 텍사스주 오스틴) 처리를 진행하였다. 올리고뉴클레오티드, TVN을 첨가하면서, 하이 케파시티 cDNA 리버스 트랜스크립션(High Capacity cDNA Reverse Transcription)™ 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 텍사스주 오스틴))를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 주형으로서 전체 RNA를 사용함으로써 cDNA 합성을 수행하였다. 가수분해 프로브 검정법에 의해 발현 정량화를 완료하였고, 이는 라이트사이클러 ® 480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 이용하여 실시간 PCR에 의해 수행되었다. 라이트사이클러 ® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0(LIGHTCYCLER ® Probe Design Software 2.0)을 사용하여 dgt -28 및 내부 참조 유전자인 내부 참조 유전자 "비공지 단백질" (진뱅크 수탁 번호 AT4G24610)에 대한 검정법을 디자인하였다. 증폭을 위해 라이트사이클러 ® 480 프로브 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 0.4 μM의 각 프라이머, 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 싱글플렉스 반응물 중에서 1 X 최종 농도로 제조하였다. 표 4.
60℃에서 40초 동안 연장시키고, 형광을 획득하는 2단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 3중으로 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치 (Ct) 평균값을 사용하였다. 확실하게 어떤 gDNA 오염도 존재하지 않도록 하기 위해 각 샘플에 대한 (-) 역전사 반응을 진행하였다. ΔΔCt 방법에 기초하여 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였다. 반접합성 및 동형접합성인 것으로 측정된 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트 중의 dgt -28 의 상대적인 발현을 상기 검정법을 사용하여 측정하였다. dgt -28 mRNA의 상대적인 전사 수준은 내부 대조군보다 2.5배 내지 207.5배 더 높은 범위였다. 상기 데이터는 dgt -28 트랜스제닉 식물이 작용성 dgt -28 유전자 발현 카세트를 포함하고, 식물은 dgt -28 트랜스진을 전사시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 웨스턴 블롯팅 분석 . 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물로부터 수득한 잎 샘플에서 DGT-28을 검출하였다. dgt -28 트랜스제닉 식물로부터의 식물 추출물 및 DGT-28 단백질 표준을 90℃에서 10분 동안 DTT를 함유하는 뉴페이지(NUPAGE) ® LDS 샘플 완충제 (인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)와 함께 인큐베이션시키고, 아크릴아미드 프리캐스트 겔에서 전기영동 방식으로 분리하였다. 이어서, 제조사의 프로토콜을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막 상에 전기 전달하였다. 웨스턴브리즈 ® 블록팅 믹스(WESTERNBREEZE ® Blocking Mix) (인비트로겐)를 이용하여 차단시킨 후, 항-DGT-28 항혈청에 이어서, 염소 항-토끼 포스파타제에 의해 DGT-28 단백질을 검출하였다. 화학 발광 기질 BCIP/NBT 웨스턴 애널리시스 리에이젼트(Western Analysis Reagent) (KPL: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)에 의해 검출된 단백질을 시각화하였다. 웨스턴 블롯을 통한 무손상 DGT-28 단백질의 제조는 검정된 dgt -28 트랜스제닉 식물이 DGT-28 단백질을 발현하였다는 것을 나타내었다. dgt -28 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 T 1 아라비돕시스 식물에 글리포세이트 비율을 달리하면서 분무하였다. 본 연구에서는 비율을 증가시키면서 시용시킴으로써 상대적인 저항성 수준을 측정하였다 (105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 비-형질전환된 아라비돕시스를 제어할 글리포세이트의 전형적인 1X 사용률은 420 g ae/ha이다. 암모늄 술페이트를 첨가한 글리포세이트 제제는 187 L/ha로 보정된 트랙 분무기를 사용하여 T 1 식물에 시용되었다. 본 연구에서 사용된 T 1 아라비돕시스 식물은 dgt -28 트랜스진에 대한 카피수에 있어 가변적이었다. 카피수가 낮은 dgt -28 T 1 아라비돕시스 식물은 자가 수분시키고, 이를 사용하여 T 2 식물을 제조하였다. 하기 표 5에는 도출된 dgt -28 트랜스제닉 식물을 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt -1, 및 야생형 대조군과 비교한 것이 제시되어 있다. 하기 표 6에는 도출된 dgt -32 , 및 dgt -33 을 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt -1, 및 야생형 대조군과 비교한 것이 제시되어 있다. 하기 표 7에는 글리포세이트 비율이 1,680 g ae/ha일 때, 신규한 박테리아 EPSP 신타제 효소를 부류 I EPSP 신타제 효소 및 대조군과 비교한 것이 제시되어 있다. 형질전환된 dgt -28 아라비돕시스 식물의 글리포세이트 선별에 대한 결과 먼저, 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 비형질전환된 종자 배경으로부터 아라비돕시스 T 1 형질전환체를 선별하였다. 3개의 플랫 또는 30,000개의 종자를 각 T 1 구축물에 대해 분석하였다. 상기에서 선별된 T 1 식물을 분자에 의해 특징을 규명하고, 이어서, 다양한 카피수의 대표적인 식물을 개별 포트에 이식시키고, 앞서 기술된 바와 같이 시판용 글리포세이트를 다양한 비율로 분무하였다. 처리 후 2주째 (WAT)의 시각적 손상률(%)로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 표에 나타나 있으며, 여기 표에는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나 (<20%), 중간 정도의 손상을 보이거나 (20-40%), 심각한 손상을 보이는 (>40%) 개별 식물이 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스 (재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. 식물 반응 수준은 다양하였다. 이러한 변동은 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서, 관심 유전자의 카피수는 식물마다 다르다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 트랜스진을 함유하는 일부 식물은 글리포세이트에 대해 내성을 띠지 않았고; 이들 식물이 트랜스진을 발현하였는지 여부를 측정하는 철저한 분석은 완료되지 않았다는 점에 주의하였다. T 1 아라비돕시스 식물 내에 트랜스진이 높은 카피수로 존재하면 트랜스진 침묵화가 일어나거나, 또는 dgt -28 트랜스진의 존재에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 감수성을 초래하는 다른 후생적 효과가 일어날 가능성이 있다. 글리포세이트 비율 1,680 g ae/ha에 대한 전체 집단의 평균 손상율(%)이 표 7에 제시되어 있으며, 이를 통해 dgt -3, dgt -7, dgt -28, dgt -32, 및 dgt -33 대 dgt-1 및 야생형 대조군으로 형질전환된 식물들 사이의 유의적인 차이가 입증된다. 신규한 박테리아 EPSP 신타제에 의해 제공되는 내성은 특이적인 효소에 따라 달랐다. 예상외로, DGT-28, DGT-32, 및 DGT-33이 글리포세이트에 대하여 유의적인 내성을 제공하였다. dgt 유전자는 시험된 모든 전이 펩티드에 걸쳐 개별 T 1 아라비돕시스 식물에 제조체 저항성을 부여하였다. 따라서, 추가의 엽록체 전이 펩티드 (즉, TraP8 - dgt -32 또는 TraP8 - dgt -33 )를 사용하는 것이 주어진 처리 내에서 보고된 것과 유사한 손상 수준으로 글리포세이트에 대한 보호를 제공할 것이다.
선별가능한 마커로서의 dgt -28 . 상기 기술된 아라비돕시스로 형질전환된 식물을 이용하여 글리포세이트 선별제를 위한 선별가능한 마커로서의 dgt -28 의 용도를 시험하였다. 대략 50개의 T 4 세대 아라비돕시스 종자 ( dgt - 28 의에 대해 동형접합성)를 대략 (글리포세이트에 감수성인) 대략 5,000개의 야생형 종자에 스파이킹하였다. 종자를 발아시키고, 묘목에 선택 용량의 글리포세이트를 분무하였다. 여러 개의 글리포세이트 처리를 비교하였다; 각 트레이의 식물은 하기 처리 방식 중 하나로 1 또는 2회의 시용 시간에 글리포세이트를 받았다: 7 DAP (식재 후의 경과일수), 11 DAP, 또는 7 이어서, 11 DAP. 모든 식물은 또한 같은 형질전환 벡터 중에 글루포시네이트 저항성 유전자를 함유하는 바, 글리포세이트로 선별되는 dgt-28 함유 식물을 글루포시네이트로 선별되는 DSM -2 또는 pat 함유 식물과 직접 비교할 수 있다. 앞서 기술된 바와 같이 데빌비스™ 분무 팁을 이용하여 글루포시네이트 처리를 적용시켰다. dgt -28 을 함유하는 트랜스제닉 식물은 17 DAP에서 "저항성" 또는 "감수성"인 것으로 확인되었다. 식재 후 7일째 및 11일째 (DAP) 26.25-1,680 g ae/ha로 글리포세이트 시용 처리하였을 때, dgt -28 을 함유하는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물이 효과적으로 선별되는 것으로 나타났다. 감수성 및 저항성 식물을 계수하였으며, 글리포세이트 내성 식물의 개수가, 식재된, dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 종자의 원 개수와 상관 관계가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 dgt -28 이 형질전환된 아라비돕시스 집단에 대한 대안적 선별가능한 마커로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 나타내다. 유전가능성 . 확인된 트랜스제닉 T 1 아라비돕시스 이벤트를 자가 수분시켜 T 2 종자를 수득하였다. 상기 종자는, 글루포시네이트 (200 g ae/ha)를 함유하는 이그나이트(Ignite)™ 제초제를 100개의 무작위 T 2 형제에 시용하여 시험된 자손이었다. (187 L/ha의 시용률로 트랙 분무기를 이용하여) 분무 시용하기 이전에 각각의 개별 T 2 식물을 7.5 ㎠ 포트에 이식시켰다. T 1 패밀리 (T 2 식물)는 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바 (P > 0.05), 멘델의 유전 법칙(Mendelian inheritance)에 따라 우성으로 유전되는 단일 유전자좌에 대해, 예상되는 바와 같이, 3개의 저항성 모델:1개의 감수성 모델로 분리되었다. 예상된 멘델의 유전 법칙에 따라 분리된 T 1 패밀리의 비율은 하기 표 8에 도시되어 있으며, 이는 dgt -28 소질은 멘델의 유전 법칙을 통해 T 2 세대로 계대된다는 것을 입증한다. 5 내지 15개의 T 2 개체 (T 3 종자)로부터 종자를 수집하였다. 3-4개의 무작위로 선택된 T 2 패밀리 각각으로부터의 25개의 T 3 형제는 앞서 기술된 바와 같이 시험된 자손이었다. 데이터에서는 어떤 분리도 나타나지 않았고, 이는 dgt -28 및 dgt -3 이 염색체 내에 안정하게 통합되어 있으며, 이는 멘델 양식으로 3세대 이상으로까지 유전된다는 것을 입증하였다.
T 2 아라비돕시스 데이터 . dgt -28 트랜스진을 낮은 카피수로 함유하는, 선별된 T 1 아라비돕시스 이벤트의 제2 세대 식물 (T 2 )을 글리포세이트 내성에 대하여 추가로 특징을 규명하였다. 앞서 기술된 바와 같이 글리포세이트를 시용하였다. 처리 후 2주째 (WAT)의 시각적 손상률(%)로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나 (<20%), 중간 정도의 손상을 보이거나 (20-40%), 심각한 손상을 보이는 (>40%) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스 (재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. T 2 세대에서, 반접합성 및 동형접합성 식물을 각 이벤트에 대해 시험하는 데 이용할 수 있었으며, 따라서, 이를 각 비율의 글리포세이트를 시험하는 데 포함시켰다. 한 유전자좌에 같은 2개의 대립유전자를 포함하는 동형접합성 식물과 달리, 반접합성 식물은 한 유전자좌에 상이한 2개의 대립유전자를 포함한다. 동형접합성 식물과는 비교하여 반접합성 식물의 경우, 유전자량 차이에 따른 결과로서, T 2 세대에서 글리포세이트에 대한 반응의 가변성이 예상된다. 글리포세이트에 대한 반응의 가변성은 반응의 표준 편차 및 범위에 반영된다. T 2 세대에서, 단일 카피 및 다중 카피 dgt -28 이벤트, 둘 모두를 글리포세이트 내성에 대해 특징을 규명하였다. 이벤트 내에서, 단일 카피 식물은 글리포세이트에 대하여 유사한 내성 수준을 보였다. 단일 카피 T 2 이벤트에 대한 특징적인 데이터는 하기 표 9에 제시되어 있다. TraP5 v2와 연결된 dgt -28 을 함유하는 이벤트는 다른 TraP 전이 펩티드를 함유하는 dgt -28 구축물과 비교하였을 때, 글리포세이트에 대하여 강력한 내성을 제공하지는 못했다. 그러나, dgt -28 TraP5 구축물은 비형질전환된 콜롬비아 대조군과 비교하였을 때에는 낮은 수준의 글리포세이트 내성을 제공하였다. dgt -28 카피를 2개 이상 함유하는 것으로 나타난 이벤트 글리포세이트 비율 증가에 대하여 더욱 큰 감수성을 보이는 경우가 존재하였다 (데이터는 나타내지 않음). 글리포세이트에 대한 이러한 감수성 증가는, 또한 dgt -28 트랜스진을 높은 카피수로 함유하는 T 1 식물에 대해 앞서 기술된 데이터와 유사하다. 아라비돕시스 식물 내에 트랜스진이 높은 카피수로 존재하면 트랜스진 침묵화가 일어나거나, 또는 dgt -28 트랜스진의 존재에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 감수성을 초래하는 다른 후생적 효과가 일어날 가능성이 있다. 이러한 이벤트는 TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) 및 TraP13 v2 (pDAB105534)에 연결된 dgt -28 을 함유하였다. dgt -28 이외에도, dgt -3 으로 형질전환된 T 2 아라비돕시스 이벤트는 하기 표 10에 제시되어 있다. 표 9에서 dgt -28 이벤트에 대해 기술되어 있는 바와 같이, 데이터 표는 각 구축물의 글리포세이트에 대한 반응의 특징인 대표적인 이벤트를 포함한다. dgt -3 의 특징 규명을 위해, AtUbi10 프로모터에 의해 구동되는, dgt -3 유전자와 함께 단일 PTU (식물 형질전환 단위)를 함유하는 구축물 (pDAB102716, pDAB102715)을 같은 유전자를 포함하며, 2 PTU의 유전자를 함유하는 구축물 (pDAB102719 및 pDAB102718)과 비교하였다. 2 PTU를 함유하는 구축물은 한 카피의 유전자를 구동시키는 데에는 AtUbi10 프로모터를 사용하였고, 다른 항 카피를 구동시키는 데에는 CsVMV 프로모터를 사용하였다. 트랜스진 카피를 2개 함유하는 dgt -28 트랜스제닉 식물과 dgt -3 트랜스제닉 식물을 비교하기 위해 이중 PTU 사용을 도입하였다. 오직 단일의 PTU만을 가지는 단일 카피의 T 2 dgt -3 이벤트가 시험된 단일 카피 dgt -28 이벤트보다, 글리포세이트에 대하여 더욱 큰 감수성을 보였지만, 비형질전환된 대조군보다는 내성이 더 크다는 것이 데이터를 통해 입증되었다. 2 PTU의 dgt -3 유전자를 함유하는 T 1 패밀리는 1 PTU 구축물에 비하여 글리포세이트에 대해 시각상 더 높은 수준의 내성을 제공하였다. 상기 두 경우 모두에서, T 1 패밀리를 dgt -1 및 야생형 대조군과 비교하였다. dgt -28 이 단일 카피 이벤트만큼 강력한 내성을 제공한다는 것이 T 2 데이터를 통해 입증되었다.
T 3 아라비돕시스 데이터 . dgt -28 트랜스진을 낮은 카피수로 함유하는, 선별된 T 2 아라비돕시스 이벤트의 제3 세대 식물 (T 3 )을 글리포세이트 내성에 대하여 추가로 특징을 규명하였다. 앞서 기술된 바와 같이 계통당 25개의 식물을 글리포세이트를 사용하여 선택하고, 시험한 모든 구축물로부터의 계통은 선택가능한 마커 유전자에 대해 불히하지 않았다. 앞서 기술된 바와 같이 글리포세이트를 시용하였다. 처리 후 2주째 (WAT)의 시각적 손상률(%)로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나 (<20%), 중간 정도의 손상을 보이거나 (20-40%), 심각한 손상을 보이는 (>40%) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스 (재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다.
형질전환된 식물의 선별 . 새로 수확된 T 1 종자 [ dgt -31 , dgt -32, 및 dgt -33 v1 유전자]를 실온에서 건조시키고, 시험하기 위해 인디애나폴리스로 발송하였다. T 1 종자를 26.5 x 51 cm 발아 트레이 (TO 플라스틱 인크.(TO Plastics Inc.: 미국 미네소타주 클리어워터))에 파종하였는데, 이들은, 앞서 40 mL의 0.1% 아가로스 용액 중에 현탁시키고, 4℃에서 2일 동안 보관하여 휴면 요건을 완료하고, 확실하게 동조 종자 발아가 이루어진, 200 mg 분취량의 계층화된 T 1 종자 (~10,000개의 종자)를 받았다. 선샤인 믹스 LP5 (선 그로 호르티컬쳐 인크.(Sun Gro Horticulture Inc.: 미국 워싱턴주 벨뷰))를 미세 질석으로 덮고, 습윤화될 때까지 호그랜드의 용액을 이용하여 저면 관수를 수행한 후, 중력 배수시켰다. 피펫을 이용하여 각 40 mL 분취량의 계층화된 종자를 질석 상에 고르게 파종시키고, 4-5일 동안 습도 유지용 돔 (KORD™ 프로덕츠(KORD™ Products: 캐나다 온타리오주 브라말리))으로 덮어 놓았다. (공동으로 형질전환된 dsm -2 유전자 선별을 위해) 발아 후 글루포시네이트 분무를 이용하여 1차 형질전환체 선별을 수행하기 전에, 일단 식물이 발아되고 나면 돔을 제거하였다. 식재 후 6일째 (DAP) 및 다시 10 DAP일 때, T 1 식물 (각각 자엽 및 2-4-lf 단계)에 0.1% 이그나이트™ 제초제 용액 (280 g ai/L 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언시즈: 미국 미주리주 캔자스주))을 10 mL/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 데빌비스™ 압축 공기 분무 팁을 이용하여 분무함으로써 글루포시네이트 1회 시용당 280 g ai/ha의 유효 비율로 전달하였다. 최종 분무 후 4-7일이 경과하였을 때 생존 식물 (활발하게 성장하는 식물)을 확인하고, 화분용 배지 (메트로 믹스(Metro Mix) 360™)로 제조된 3 인치 (7.6 cms) 포트로 개별적으로 이식시켰다. 카피수 분석을 위해 조직을 샘플링하기 적어도 1일 전에 식물을 온실에서 재배하였다. T 1 식물을 샘플링하고, dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 유전자에 대한 카피수 분석을 완료하였다. 이어서, 카피 범위가 각 비율 사이에 존재하도록 T 1 식물을 다양한 비율의 글리포세이트로 배정하였다. 아라비돕시스의 경우, 26.25 g ae/ha 글리포세이트가 감수성 식물을, 의미한 내성 수준을 가지는 것과 식별하는 데 효과적인 용량이다. 비율을 증가시키면서 시용시킴으로써 상대적인 저항성 수준을 측정하였다 (105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 하기 표 13에는 도출된 것을 dgt -1과 비교한 것이 제시되어 있다. 모든 글리포세이트 제초제를 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기에 의해 시용하였다. 사용된 글리포세이트는 시판용, 두란고(Durango) 디메틸아민 염 제제 (480 g ae/L, 다우 아그로사이언시즈, LLC(Dow AgroSciences, LLC))였다. 글루포시네이트 또는 글리포세이트에 대하여 내성을 보이는 카피수가 낮은 T 1 식물을 T 2 세대에서 추가로 평가하였다. dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 을 사용하여 제1 아라비돕시스 형질전환을 수행하였다. 먼저, 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 비형질전환된 종자 배경으로부터 아라비돕시스 T 1 형질전환체를 선별하였다. 3개의 플랫 또는 30,000개의 종자를 각 T 1 구축물에 대해 분석하였다. 형질전환 빈도를 계산하고, T1 dgt -31, dgt-32 , 및 dgt -33 구축물의 결과는 하기 표 12에 열거되어 있다.
이어서, 상기와 같이 선별된 T 1 식물을 개별 화분에 이식시키고, 다양한 비율의 시판용 글리포세이트를 분무하였다. 하기 표 13에서는 아라비돕시스 T 1 형질전환체에 대해 글리포세이트 저항성을 부여하는 dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 , 및 대조군 유전자의 반응을 비교하였다. 2 WAT의 시각적 손상률(%)로 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나 (<20%), 중간 정도의 손상을 보이거나 (20-40%), 심각한 손상을 보이는 (>40%) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 각 처리에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스 (재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. 음성 대조군과 비교하여 전이 펩티드 TraP23을 포함하는 DGT-31 (v1) 유전자가 개별 T 1 아라비돕시스 식물에 약간의 제초제 내성을 부여하였지만, 유전자는 전이 펩티드 TraP8에 개선된 내성을 나타내었다. DGT-32 및 DGT-33, 둘 모두 TraP8 및 그의 각각 상이한 엽록체 전이 펩티드 (각각 Tra14 및 TraP24)와 함께, 시험된 비율의 글리포세이트에 대하여 강력한 내성을 보였다. 주어진 처리 내에서, 식물 반응 수준은 매우 달랐는데, 이는 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서, 관심 유전자의 카피수는 식물마다 다르다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 중요하게는, 시험된 각 글리포세이트 비율에서 다른 것들보다 더 큰 내성을 보이는 개체가 존재하였다. 전체 집단의 평균 손상율(%)은 하기 표 13에 제시되어 있으며, 이를 통해 dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 대 dgt -1 v1 또는 야생형 대조군으로 형질전환된 식물들 사이의 유의적인 차이가 입증되었다.
옥수수 형질전환 . 옥수수의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환에 사용하기 위한 이원성 벡터를 구축하는 데 상기 기술된 바와 같은 표준 클로닝 방법을 사용하였다. 하기 표 14에는 옥수수 형질전환을 위한 것으로 구축된 벡터가 열거되어 있다. dgt -28 을 함유하는 벡터에 하기 유전 요소가 사용되었다: 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 (ZmUbi1; 미국 특허 번호 제5,510,474호)는 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 번호 제7179902호) 측면에 위치하는 dgt -28 코딩 서열을 구동시키는 데 사용되었고, 선별가능한 마커 카세트는 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 aad -1 코딩 서열 (미국 특허 번호 제7,838,733호)을 구동시키는 데 사용된 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터로 구성되었다. aad -1 코딩 서열은 페녹시 옥신 제초제, 예컨대, 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 내성 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 내성을 부여한다. dgt -28 구축물을 표준 이원성 벡터 및 아그로박테리움 초이원성 시스템 벡터 (재팬 타바코(Japan 담배: 일본 도쿄))로서 구축하였다. 표준 이원성 벡터는 pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665, 및 pDAB107665를 포함하였다. 아그로박테리움 초이원성 시스템 벡터는 pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386, 및 pDAB108387을 포함하였다. 황색 형광성 단백질 ( yfp 미국 특허 출원 2007/0298412) 리포터 유전자를 포함하는 추가의 구축물을 완성하였다. pDAB109812는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 per 5 3' 비번역 영역 (Zm per5 3'UTR; 미국 특허 번호 제7179902호) 측면에 위치하는 yfp 리포터 유전자 카세트를 포함하고, 선별가능한 마커 카세트는 aad-1 의 발현을 구동시키는 데 사용되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터 (SCBV; 미국 특허 번호 제5,994,123호)로 구성된다. pDAB101556은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 per 5 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 yfp 카세트를 포함하고, 선별가능한 마커 카세트는 aad -1 의 발현을 구동시키는 데 사용되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터로 구성된다. pDAB107698은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 dgt -28 카세트, 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 per 5 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 yfp 카세트를 포함하고, 선별가능한 마커 카세트는 aad-1 의 발현을 구동시키는 데 사용되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터 로 구성된다. 상기 3가지 구축물은 모두 표준 이원성 벡터이다.
이삭 멸균화 및 배 단리 . 옥수수 미성숙한 배를 수득하기 위해, 제아 메이스 근교계주 B104의 식물을 온실에서 성장시키고, 자가 수분 또는 동계 수분시켜 이삭을 생산하였다. 수분 후 대략 9-12일 경과하였을 때, 이삭을 수거하였다. 실험당일, 이삭을 20% 차아염소산나트륨 (5%) 용액 중에 침지시키고, 20-30분 동안 진탕시킨 후, 멸균수 중에서 3회 세정하여 표면을 멸균시켰다. 멸균 후, 미성숙한 접합성 배 (1.5-2.4 mm)를 무균 방식으로 각 이삭으로부터 절개하고, 액체 감염 배지 (LS 기초 배지, 4.43 gm/L; N6 비타민 용액 [1000X], 1.00 mL/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 수크로스, 68.5 gm/L; D(+) 글루코스, 36.0 gm/L; 10 mg/ml의 2,4-D, 150 ㎕/L)를 함유하는 미세원심분리관애 무작위적으로 분포시켰다. 주어진 실험 세트에 대해, 각 형질전환을 위해 3개의 이삭으로부터 풀링된 배를 사용하였다. 아그로박테리움 배양 개시: 상기 기술된 이원성 형질전환 벡터를 함유하는 아그로박테리움의 글리세롤 스톡을, 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트레이킹하고, 20℃에서 3-4일 동안 성장시켰다. 단일 콜로니를 채취하고, 같은 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 상에 스트레이킹하고, 28℃에서 1-2일 동안 인큐베이션시켰다. 아그로박테리움 배양 및 공동 배양 . 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 채취하고, 50 mL 1회용 관 중 10 mL의 감염 배지에 현탁시키고, 분광광도계를 사용하여 세포 밀도를 OD 600 nm = 0.2-0.4로 조정하였다. 배를 절개하면서, 아그로박테리움 배양물을 실온에서 125 rpm의 회전식 진탕기에 놓았다. 크기가 1.5-2.4 mm인 미성숙한 접합성 배를 멸균화된 옥수수 낟알로부터 단리시키고, 1 mL 감염 배지 중에 놓고, 같은 배지 중에서 1회 세척하였다. 아그로박테리움 현탁액 (2 mL)을 각 관에 첨가하고, 관을 10-15분 동안 진탕기 플랫폼 상에 놓았다. 배를 공동 배양 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔(Gelzan)™, 3.00 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo 3 , 15.0 mg/L; DMSO, 100 μM) 상에 옮겨 놓고, 배반이 위로 향하게 배향시키고, 25℃에서 3일 동안 50 μmole m -2 sec -1 조도로 24시간 명기하에서 인큐베이션시켰다. 캘러스 선별 및 추정 이벤트의 재생 . 공동 배양기 후, 배를 선별제를 함유하지 않는 휴지 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔 2.30 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5mg/ml AgNo 3 , 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮겨 놓고, 25℃에서 3일 동안 50 μmole m -2 sec -1 조도로 24시간 명기하에서 인큐베이션시켰다. 성장 억제량 반응 실험은 0.25 mM 이상의 글리포세이트 농도는 비형질전환된 B104 옥수수 계통에서 세포 성장을 억제시키는 데 충분하였다는 것을 제안하였다. 배를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 선별 1 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo 3 , 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 28℃에서 7-14일 동안 50 μmole m -2 sec -1 조도로 24시간 명기하에서 및/또는 암실에서 인큐베이션시켰다. 증식성 배발생 캘러스를 1.0 mM 글리포세이트를 함유하는 선별 2 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/mL AgNo 3 , 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L; R-할록시포프 산(Haloxyfop acid) 0.1810 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 28℃에서 14일 동안 50 μmole m -2 sec -1 조도로 24시간 명기하에서 및/또는 암실에서 인큐베이션시켰다. 상기 선별 단계를 통해 트랜스제닉 캘러스를 추가로 증식시키고, 분화시켰다. 캘러스 선별 기간은 3 내지 4주간 지속되었다. 증식성, 배발생 캘러스를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 PreReg 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 350.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.250 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 50.0 mg/L; NAA-NaOH 0.500 mg/L; ABA-EtOH 2.50 mg/L; BA 1.00 mg/L; 수크로스, 45.0 gm/L; 겔잔™ 2.50 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo 3 , 1.00 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 28℃에서 7일 동안 50 μmole m -2 sec -1 조도로 24시간 명기하에서 배양하였다. 새싹과 유사한 눈이 있는 배발생 캘러스를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 재생용 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산,100.0 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검(Gellan Gum) G434™ 3.00 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 카르베니실린, 125.0 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 7일 동안 50 μmole m -2 sec -1 조도로 24시간 명기하에서 배양하였다. 주근이 있는 작은 새싹을 식물용 트레이(phytotray) 중의 발근용 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 개질된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검 G434™ 3.00 gm/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮겨 놓고, 27℃에서 7일 동안 140-190 μmole m -2 sec -1 조도로 16/8 hr의 명기/암기하에서 인큐베이션시켰다. 상기 기술된 프로토콜을 이용하여 추정 트랜스제닉 묘목을 트랜스진 카피수에 대해 분석하고, 토양으로 옮겼다. 옥수수 식물 내의 dgt -28 및 aad -1 트랜스진의 존재에 관한 분자적 확인 . 가수분해 프로브 검정법을 통해 dgt -28 및 aad -1 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하였다. 먼저 택맨™과 유사한 가수분해 프로브 검정법을 통해 단리된 T 0 옥수수 식물을 스크리닝하여 aad -1 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. 상기 연구로부터 작성된 데이터를 사용하여 트랜스진 카피수를 측정하고, 여교배 및 T 1 세대로의 진행을 위한 트랜스제닉 옥수수 이벤트를 선별하였다. 조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 퀴아젠™ RLT 완충제 중에서 클레코™ 조직 미분기 및 스테인리스 스틸 비드 (후버 프리시젼 프로덕츠(Hoover Precision Products: 미국 조지아주 커밍)를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 바이오스프린트™ 96 식물 키트 (퀴아젠: 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 게놈 DNA를 콴트-잇™ 피코 그린 DNA 어세이 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 가수분해 프로브 검정법을 수행하기 위해 바이오로보트3000™ 자동 액체 핸들러 (퀴아젠: 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 정량화된 게놈 DNA를 약 2 ng/㎕로 조정하였다. 라이트사이클러 ® 480 시스템 (로슈 어플라이드 사이 언스: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 택맨 ® 검정법과 유사한 가수분해 프로브 검정법에 의한 트랜스진 카피수 측정을 수행하였다. 라이트사이클러 ® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 aad -1 , dgt -28 및 내부 참조 인버타제(Invertase) (진뱅크 수탁 번호 U16123.1))에 대한 검정법을 디자인하였다. 증폭을 위해 라이트사이클러 ® 480 프로브 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 0.4 μM의, aad -1 및 dgt -28 에 대한 각 프라이머, 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 멀티플렉스 반응물 중에서 1 X 최종 농도로 제조하였다 (하기 표 15). 60℃에서 40초 동안 연장시키고, 형광을 획득하는 2단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치 (Ct) 평균값을 사용하였다. 상대 콴트 모듈을 이용하여 라이트사이클러 ® 소프트웨어 출시 1.5를 사용함으로써 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초하는 것이다. 대조군은 각 진행에 포함된 단일 카피 교정기 및 공지된 2개의 카피 체크로부터 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. 하기 표 16에는 가수분해 프로브 검정법의 결과가 열거되어 있다.
dgt -28 로 형질전환된 옥수수에서의 제초제 내성 . 제아 메이스 dgt-28로 형질전환 이벤트 (T 0 )를 온실에서 순응시키고, 식물이 조직 배양물로부터 온실 성장 조건으로 이행될 때까지 (즉, 정상적으로 보이는, 2-4개의 새잎이 윤생체로부터 출현할 때까지) 성장시켰다. 식물을 온실에서 27℃에서 16시간 명기:8시간 암기인 조건하에서 성장시켰다. 이어서, 2% w/v 황산암모늄이 첨가된 (제초제 글리포세이트를 함유하는) 시판용 두란고 DMA(DURANGO DMA)™ 제제로 식물을 처리하였다. 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기를 이용하여 50 cm의 분무 높이에서 제초제를 시용하였다. 비형질전환된 옥수수 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 280 - 4,480 g ae/ha 글리포세이트의 범위로 글리포세이트를 T 0 식물에 분무하였다. 치사량은 B104 근교계에 >95%의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. T 0 dgt -28 옥수수 식물의 결과를 통해, 최대 4,480 g ae/ha까지의 비율에서 글리포세이트에 대한 내성이 달성되었다는 것이 입증되었다. T 0 세대에서는 특정 배치 유형을 사용하였다. 비형질전환된 대조군과 비교되는, 형질전환된 식물의 최소의 발육 저지 및 전반적인 식물 성장을 통해 dgt -28 이 TraP5, TraP8, 및 TraP23 엽록체 전이 펩티드에 연결되었을 때, 글리포세이트에 대한 강력한 내성을 제공한다는 것이 입증되었다. 다음 세대에서 추가로 특징을 규명하기 위해 선별된 T 0 식물을 자가 교배하거나, 여교배하였다. 100개의 선별된 dgt -28 계통 함유 T 1 식물에 140-1,120 g ae/ha 글루포시네이트 또는 105-1,680 g ae/ha 글리포세이트를 분무하였다. 선별가능한 마커 및 글리포세이트 저항성 유전자, 둘 모두를 같은 플라스미드 상에 구축하였다. 따라서, 제초제를 분무함으로써 그에 대해 한 제초제 내성 유전자가 선별되었다면, 상기 두 유전자가 존재하는 것으로 간주된다. 14 DAT일 때, 저항성 및 감수성 식물을 계수하여, 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 소질로 분리된 (3R:1S) 계통의 비율을 측정하였다. dgt -28 은 단자엽 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능하다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다. dgt -28 유전자에 의해 제공되는 내성 및 보호를 추가로 특징을 규명하기 위해 T 1 또는 F 1 생존 식물에 글리포세이트의 비율을 증가시키면서 시용하였다. dgt -28 로 형질전환된 T 0 옥수수에서의 발아 후 제초제 내성 . TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23과 연결된 dgt -28 의 T 0 이벤트를 아그로박테리움 형질전환에 의해 생성하고, 정상적으로 보이는, 2-4개의 새잎이 윤생체로부터 출현할 때까지, 조절식 성장 챔버 조건하에서 순응시켰다. 식물에 개별 식별 번호를 배정하고, dgt -28 및 aad -1 , 둘 모두의 카피수 분석을 위해 샘플링하였다. 카피수 분석에 기초하여, 식물을 단백질 발현 분석을 위해 선별하였다. 새 성장 배지가 있는 더 큰 화분으로 식물을 이식시키고, 온실에서 27℃에서 16시간 명기:8시간 암기 조건하에 성장시켰다. 이어서, 단백질 발현을 위해 샘플되지 않은 나머지 식물은 2% w/v 황산암모늄이 첨가된 시판용 두란고 DMA™ 제제 (글리포세이트)로 식물을 처리하였다. 각 식물 집단이 다양한 카피수의 T 0 이벤트를 포함하도록 처리를 분배하였다. 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기를 이용하여 50 cm의 분무 높이에서 제초제를 시용하였다. 비형질전환된 옥수수 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 280 - 4,480 g ae/ha 글리포세이트의 범위로 글리포세이트를 T 0 식물에 분무하였다. 치사량은 B104 근교계에 >95%의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. B104는 형질전환체의 유전적 배경이 되었다. T 0 dgt-28 옥수수 식물의 결과를 통해, 최대 4,480 g ae/ha까지의 비율에서 글리포세이트에 대한 내성이 달성되었다는 것이 입증되었다. 표 17. 비형질전환된 대조군과 비교되는, 형질전환된 식물의 최소의 발육 저지 및 전반적인 식물 성장을 통해 dgt -28 이 TraP5, TraP8, 및 TraP23에 연결되었을 때, 글리포세이트에 대한 강력한 내성을 제공한다는 것이 입증되었다.
표준 ELISA에 의한 단백질 발현 분석을 통해 시험된 구축물 간의 12.6 - 22.5 ng/㎠의 DGT-28 단백질의 평균 범위가 입증되었다. 온실 조건하의 F 1 세대에서의 글리포세이트 내성 확인 . 다음 세대에서 추가로 특징을 규명하기 위해 분무를 받지 않은 단일 카피 T 0 식물을 비형질전환된 배경 B104에 여교배하였다. T 1 세대에서, 글리포세이트 내성을 평가하여 dgt -28 유전자의 유전성을 확인하였다. T 1 식물의 경우, AAD-1 단백질에 대해 선별하기 위해 V1 성장 단계에서 시용하여 제초제 어슈어 II(어슈어 II)™ (35 g ae/ha 퀴잘로포프-메틸)를 시용하였다. 선별가능한 마커 및 글리포세이트 저항성 유전자, 둘 모두를 같은 플라스미드 상에 구축하였다. 따라서, 한 유전자가 선별될 경우, 두 유전자 모두 존재하는 것으로 간주된다. 7 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하고, 널(널) 식물을 집단으로부터 제거하였다. dgt -28 (v1)은 단자엽 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능하다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다. 표준 ELISA에 의한 DGT-28 단백질 및 RNA 전사체 수준에 대한 특징을 규명하기 위해 식물을 샘플링하였다. 앞서 기술된 바와 같이 560-4,480 g ae/ha 글리포세이트를 저항성 식물에 분무하였다. 데이터를 통해, 최대 4,480 g ae/ha 글리포세이트까지 엽록체 전이 펩티드 TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23에 연결된 dgt-28 의 강력한 내성이 입증되었다. 표 18.
단백질 발현 데이터를 통해, T 1 세대에서의 단백질 발현이 확립됨과 동시에, 시험된 T 1 이벤트 및 구축물 간의 42.2 - 88.2 ng/㎠의 DGT-28 단백질의 평균 범위가 입증되었다. 필드 조건하에서의 dgt -28 옥수수의 특징 규명 . 단일 카피 T1 이벤트를 필드 위치로 보내어 추가의 특징 규명을 위한 하이브리드 반접합성 종자 및 근교계 동형접합성 종자, 둘 모두를 제조하였다. 옥수수 형질전환 계통 B104 중의 T 1 이벤트를 근교계주 4XP811에 교배시켜 상기 이벤트에 대해 1:1 (반접합성:널)로 분리되는 하이브리드 집단을 생성함으로써 하이브리드 종자를 제조하였다. 생성된 종자를 별개의 두 위치로 발송하였다. 구축물 1개당 총 5개의 단일 카피 이벤트를 3중으로 임의화 완전 블록 디자인으로 각 위치에 식재하였다. 필드는 V4 성장 단계에서 글리포세이트를 시용하고, V8 성장 단계에서 시용된 식물을 별개 집단으로 분류하는 것으로 디자인되었다. 4XP811/B104 종래 하이브리드가 음성 대조군으로서 사용된다. 실험 열을 184 g ae/ha 어슈어 II™ (106 g ai/L 퀴잘로포프-메틸)로 처리하여 널 분리 개체를 제거하였다. 어슈어 II™ 시용과 관련하여 모든 실험 엔트리는 1:1 (감수성:저항성) (p=0.05)로 분리되었다. 표준 ELISA에 의해 DGT-28 단백질을 정량화하기 위하여 선별된 저항성 식물을 각 이벤트로부터 샘플링하였다. 퀴잘로포프-메틸 저항성 식물을 V4 또는 V8 성장 단계에서 2.5% w/v 황산암모늄이 첨가된 시판용 제초제 두란고 DMA™ (480 g ae/L 글리포세이트)로 처리하였다. 187 L/ha의 부피를 전달하도록 교정된 붐 분무기를 이용하여 50 cm의 분무 높이에서 제초제를 시용하였다. 비형질전환된 옥수수 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 1,120 - 4480 g ae/ha 글리포세이트의 범위로 글리포세이트를 식물에 분무하였다. 치사량은 4XP811 근교계에 >95%의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. 7, 14 및 21 DAT일 때 (처리 후 경과일수: days after treatment) 시각적 황백증 비율(%), 괴사 비율(%), 성장 억제율(%) 및 총 시각적 손상에 대해 시각적 손상 평가를 실시하였다. 평가 결과를 각 계통에 대한 비처리된 체크 및 음성 대조군과 비교하였다. 모든 평가 시점에 대한 시각적 손상 데이터를 통해, 위치 및 시용 시점, 둘 모두에서 최대 4,480 g ae/ha까지의 두란고 DMA™에 대해 강력한 내성이 입증되었다. V4 시용에 대한 대표적인 이벤트는 한 위치에서 나타났고, 이는 다른 이벤트, 시용 시점 및 위치에서의 것과 일치하였다. 표 19. TraP23에 연결된 dgt -28 을 함유하는 구축물 (pDAB107665)로부터의 한 이벤트는 AAD-1 단백질에 대한 어슈어 II™ 선별에는 내성을 보였지만, 시용된 모든 비율의 글리포세이트에 대해서는 감수성을 띠었다.
생식 성장 단계 동안 4,480 g ae/ha 글리포세이트 비율에 대한 추가의 평가를 수행하였다. 옥수수 수염, 수분 시점 및 이삭 충전 정도(ear fill)에 대한 시각적 평가 결과는 모든 구축물, 시용 시점 및 위치에 있어 각 계통에 대한 비처리된 체크와 유사하였다. DGT-28 단백질에 대한 정량화 결과를 통해 186.4 - 303.0 ng/㎠ 범위의 평균 단백질 발현이 입증되었다. 데이터를 통해, 최대 4,480 g ae/ha 글리포세이트까지 필드 조건하에서의 생식 성장 단계까지 계속된 dgt-28로 형질전환된 옥수수의 강력한 내성이 입증되었다. 데이터를 통해서는 또한 분무 내성 결과에 기초하여 DGT-28 단백질 검출 및 기능도 입증되었다. 동형접합성 상태에서 dgt -28 옥수수의 유전가능성 및 내성 확인 . T 1 S2로부터의 종자를 앞서 기술된 바와 같은 온실 조건하에서 식재하였다. 필드 조건하에서 특징이 규명된 동일한 5개의 단일 카피 계통을 동종 상태에서 특징을 규명하였다. V3 성장 단계까지 식물을 성장시키고, 1,120-4,480 g ae/ha 글리포세이트 (두란고 DMA™) 범위의 3가지 비율의 글리포세이트 및 각 처리당 4개의 복제물로 나누었다. 앞서 기술된 바와 같이 트랙 분무기로 시용하였고, 시용물은 2.0% w/v 황산암모늄 중에서 제제화되었다. 황산암모늄 시용물이 각 계통에 대한 비처리된 체크로서의 역할을 하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 처리 후 7 및 14일째 시각적 평가를 수행하였다. 데이터를 통해, 시험된 모든 이벤트에 있어 최대 4,480 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대해 강력한 내성이 입증되었다. 표 20.
필드 조건하에서는 내성을 보이지 않았던 pDAB107665로부터의 계통은 글리포세이트에 대해 내성을 띠지 않았으며, 따라서, 이는 필드에서의 관찰 결과와 일치하는 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 앞서 언급한 한 계통을 제외하면, 상기 계통으로부터의, 글리포세이트로 처리된 모든 복제물은 글리포세이트에 대해 감수성을 띠지 않았다. 그러므로, 본 데이터를 통해 멘델 방식으로 dgt -28 옥수수의 동종 집단으로의 유전가능성이 입증되었다. 표준 ELISA에 의한 DGT-28 단백질의 발현을 통해 글리포세이트에 대해 내성을 띠는 단일 카피 이벤트 간의 27.5 - 65.8 ng/㎠의 단백질 발현의 평균 범위가 입증되었다. 데이터를 통해 세대 간의 DGT-28 단백질의 기능적 단백질 및 안정성이 입증되었다. 선별가능한 마커로서의 글리포세이트의 발아 후 제초제 내성 사용 . 앞서 기술된 바와 같이, T 0 형질전환된 식물을 조직 배양물로부터 옮겨 온실에서 순응시켰다. 시험된 이벤트는 TraP5, TraP8, 및 TraP23 엽록체 전이 펩티드에 연결된 dgt -28 을 포함하였다. 상기 T 0 식물은 최대 4,480 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대해 강력한 내성을 제공하고, 비형질전환된 식물은 280 g ae/ha 정도로 낮은 농도의 글리포세이트로 방제되었다는 것이 입증되었다. 상기 데이터를 통해 dgt -28 은 280 - 4,480 g ae/ha 범위 농도의 글리포세이트를 사용하여 선별가능한 마커로서 사용될 수 있다는 것이 입증되었다. dgt -28 트랜스진을 함유하는 고정 계통의 옥수수로부터의 다수의 종자를 다수의 비형질전환된 옥수수 종자에 스파이킹하였다. 종자를 식재하고, V1-V3 발생 단계까지 성장시키고, 상기 시점에서 280-4,480 g ae/ha 범위의 선택된 용량의 글리포세이트를 묘목에 분무하였다. 7-10일 경과 후, 감수성 및 저항성 식물을 계수하였으며, 글리포세이트 내성 식물의 양은 식재된, dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 종자의 원 개수와 상관 관계가 있었다. dgt -28 옥수수의 적층 . AAD-1 단백질이 연구 목적의 dgt -28 로 형질전환된 옥수수에서 선별가능한 마커로서 사용된다. aad -1 유전자는 또한 작물에서 최대 V8 시약시까지 강력한 2,4-D 내성을 제공하는, 옥수수에서 제초제 내성 소질로서 사용될 수 있다. 구축물 pDAB107663 (TraP4:: dgt -28 ), pDAB107664 (TraP8:: dgt -28 ) 및 pDAB107666 (TraP5:: dgt -28 )으로부터의 4개의 이벤트를 글리포세이트 및 2,4-D의 탱크 믹스 시용의 내성에 대하여 특징을 규명하였다. 온실 조건하의 F 1 종자를 이용하여 특징 규명 연구를 완료하였다. 앞서 기술된 바와 같이 트랙 분무기를 이용하여 하기 비율로 시용하였다: 1,120-2,240 g ae/ha 글리포세이트 ( dgt -28 유전자에 대한 선별성), 1,120-2,240 g ae/ha 2,4-D ( aad -1 유전자에 대한 선별성), 또는 기술된 비율의 두 제초제의 탱크 혼합물. 7 및 14 DAT일 때, 식물을 등급화하였다. 2,240 g ae/ha로 제초제를 시용하였을 때의 분무 결과는 하기 표 21에 제시되어 있다.
본 결과를 통해, dgt -28 은 aad -1 과 함께 성공적으로 적층될 수 있고, 따라서, 관심 작물에 시용될 수 있는 제초제의 스펙트럼 ( dgt -28 및 aad -1 각각에 대해 글리포세이트 + 페녹시아세트산)은 증가된다는 것을 확인하였다. 생물형이 존재하는 광엽 잡초 또는 저항성 잡초를 방제하기가 어려운 경우의 작물 생산에 있어서, 적층이 관심 작물의 잡초 방제 및 보호를 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 추가의 투입 또는 산출 소질 또한 옥수수 및 다른 식물에서 dgt -28 유전자와 함께 적층될 수 있다. 대두 형질전환. 대두 자엽절 추출물의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 안정적으로 통합된 dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 대두 (글리신 맥스)를 생성하였다. 기능성 dgt -28 을 함유하는 이원성 벡터를 보유하는 무장 해제된 아그로박테리움 균주를 형질전환을 개시하는 데 사용하였다. 문헌 [Zeng et al. (Zeng P., Vadnais DA, Zhang Zt Polacco JC, (2004), Plant Cell Rep ., 22(7): 478-482)]의 변형된 ½ 자엽절 방법을 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 수행하였다. 간략하면, 대두 종자 (재배종 매버릭(cv. Maverick))를 기초 배지 상에서 발아시키고, 자엽절을 단리시키고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 새싹 개시용, 새싹 신장용, 및 발근용 배지를 아그로박테리움 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신으로 보충하였다. 제초제를 통한 선별을 사용하여 비형질전환된 새싹의 성장을 억제시켰다. 뿌리 발생을 위해 선별된 새싹을 발근용 배지로 옮겨 놓은 후, 묘목을 순응시키기 위해 배합토로 옮겨 놓았다. 선별된 묘목의 정단 소엽을 제초제로 국소적으로 (잎 페인트 기법으로) 처리하여 추정 형질전환체에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮겨 놓고, 순응시킨 후, 제초제로 잎 페인팅하여 내성에 대해 재확인하였다. 상기의 추정 형질전환된 T 0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 제초제를 통해 선별가능한 마커, 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. T 0 식물을 온실에서 자가 수정시켜 T 1 종자를 생산하였다. 제2 대두 형질전환 방법을 사용하여 추가의 트랜스제닉 대두 식물을 생산할 수 있다. 기능성 dgt -28 을 함유하는 이원성 벡터를 보유하는 무장 해제된 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다. 문헌 [Paz et al., (Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep ., 25: 206-213)의 변형된 ½ 종자 방법을 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 수행하였다. 간략하면, 염소 가스를 이용하여 성숙한 대두 종자를 밤새도록 멸균화시키고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 수행하기 전 20시간 동안 멸균 H 2 O를 흡수시켰다. 종자를 제(hilum)를 따라 세로 방향으로 ½로 절단하여 종자를 분리하고 종자 껍질을 제거하였다. 배축을 절개하고, 자엽절로부터 임의 축의 새싹/눈을 제거하였다. 생성된 ½ 종자 추출물을 아그로박테리움으로 감염시켰다. 새싹 개시용, 새싹 신장용, 및 발근용 배지를 아그로박테리움 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신으로 보충하였다. 제초제를 통한 선별을 사용하여 비형질전환된 새싹의 성장을 억제시켰다. 뿌리 발생을 위해 선별된 새싹을 발근용 배지로 옮겨 놓은 후, 묘목을 순응시키기 위해 배합토로 옮겨 놓았다. 상기의 추정 형질전환된 T 0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 제초제를 통해 선별가능한 마커, 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. 수개의 이벤트가 트랜스진을 함유하는 것으로 확인되었다. 상기 T 0 식물을 추가 분석을 위해 진행시키고, 온실에서 자가 수정시켜 T 1 종자를 생산하였다. dgt -28 로 형질전환된 T 1 대두에서의 발아 후 제초제 내성 . 앞서 기술된 스크리닝 방법에 의해 유전가능한 것으로 측정된, T 1 이벤트로부터의 종자를 온실 조건하에서 메트로-믹스 배지에 식재하였다. 1차 삼출엽이 완전하게 만개할 때까지 식물을 성장시키고, 앞서 기술된 바와 같이 pat 유전자의 선별을 위해 411 g ae/ha 이그나이트™ 280 SL로 처리하였다. 각 이벤트로부터의 저항성 식물에 고유 식별자를 배정하고, dgt -28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 식물이 충분하게 존재하였을 때, 접합성 데이터를 사용하여, 시용되는 각 비율의 글리포세이트에 2개의 반접합성 복제물 및 2개의 동형접합성 복제물을 배정함으로써 처리당 총 4개의 복제물을 허용하였다. 상기 식물을 야생형 페타이트 하바나( Petite havana ) 담배와 비교하였다. 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 이용하여 모든 식물에 분무하였다. 560-4,480 g ae/ha 범위로 두란고™ 디메틸아민 염 (DMA)을 식물에 분무하였다. 모든 시용물은 2% w/v 황산암모늄 (AMS)이 첨가된 물 중에서 제제화되었다. 처리 후 7 및 14일째 식물을 평가하였다. 전반적인 시각적 발육 저지, 황백증, 및 괴사에 관한 손상 등급을 식물에 배정하였다. T 1 세대는 분리 세대이며, 따라서, 접합성 차이에 기인하는 일부 가변적 반응이 있을 것으로 예상되었다.
T 2 세대에서 글리포세이트 비율 증가에 대한 dgt -28 보호 . 구축물당 2 내지 5개의 dgt -28 의 T 2 계통에 대하여 45개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 이전 세계에서 완료된 접합성 분석에 기초하여 동형접합성 계통을 선별하였다. 앞서 기술된 바와 같이 종자를 식재하였다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 pat 선별가능한 마커의 선별을 위해 411 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 식물에 분무하였다. 3 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다. dgt -28 에 연결된 TraP4를 함유하는 구축물 (pDAB107543 및 pDAB107548)의 경우, 시험된 12개의 계통 중 9개는 분리되지 않았으며, 이로써, T 2 세대에서 동종 계통을 확인할 수 있었다. dgt -28 에 연결된 TraP8을 함유하는 계통 (pDAB107545)은 4개의 계통 중 2개에서 분리 개체가 없는 것으로 나타났고, 이를 통해 대두에서는 적어도 2세대에 걸쳐 dgt -28 이 멘델의 유전 법칙을 따르는 것으로 입증되었다. 저항성 식물로부터 조직 샘플을 채취하고, 표준 ELISA 방법에 의해 DGT-28 단백질을 정량화하였다. 데이터를 통해 시험된 비-분리 T 2 계통의 경우, 32.8 - 107.5 ng/㎠의 DGT-28 단백질 평균 범위가 입증되었다. 구축물 pDAB107553 (TraP23:: dgt -28 )으로부터의 계통은 앞서 글루포시네이트로 선별되지 않았고, 글리포세이트의 용량 반응을 둘 모두에 대한 것으로 글리포세이트의 비율 증가에 대한 내성 및 동종성을 시험하는 데 사용하였다. 구축물 pDAB107553으로부터의 계통으로부터의 복제물은 560-4,480 g ae/ha 글리포세이트 범위의 비율에 대하여 내성을 보였고, 따라서, 이는 동종 집단이며, 적어도 2세대로 유전가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 앞서 기술된 바와 같이 560-4,480 g ae/ha 글리포세이트 범위 비율의 두란고 DMA를 2-3개의 삼출엽 대두에 시용하였다. 14 DAT일 때의 시각적 손상 데이터를 통해 T 1 세대에서 입증된 내성 결과를 확인할 수 있었다.
dgt - 28 를 이용한 벼의 형질전환 . 예시적인 형질전환 방법에서, 멸균화된 벼 종자의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 안정적으로 통합된 dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 벼 (오리자 사티바( Oryza sativa ))를 생성하였다. 기능성 dgt -28 을 함유하는 이원성 벡터를 보유하는 무장 해제된 아그로박테리움 균주를 형질전환을 개시하는 데 사용하였다. 1 M KOH를 이용하여 배양 배지를 pH 5.8로 조정하고, 2.5 g/ℓ 피타겔(Phytagel) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스))로 고형화시켰다. 배발생 캘러스를 30 ml 반고형 배지를 포함하는 100 x 20 mm 페트리 디쉬에서 배양하였다. 볏모를 마겐타(MAGENTA) 박스내 50 ml 배지 상에서 성장시켰다. 35 mL 액체 배지를 함유하는 125 ml의 삼각 플라스크 중에서 세포 현탁액을 유지시키고, 125 rpm으로 회전시켰다. 배발생 배양의 유도 및 유지를 25-26℃의 암실에서 수행하고, 식물 재생 및 전체 식물 배양은 16-h 광주기로 조광식 실내에서 수행하였다 (문헌 [Zhang et al., 1996]) 배발생 캘러스의 유도 및 유지를 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Li et al., 1993]), 500 mg/L 글루타민을 함유하도록 적합화된, 개질된 NB 기초 배지 상에서 수행하였다. 말토스 대신 30 g/L 수크로스를 포함하는 SZ 액체 배지 중에서 현탁 배양을 개시하고 유지시켰다 (문헌 [Zhang et al., 1998]). 삼투압 배지 (NBO)는 각각 0.256 M의 만닛톨 및 소르비톨이 첨가되어 있는 NB 배지로 구성되었다. 3-4주 동안 제초제 저항성 캘러스를 적절한 제초제 선별제로 보충된 NB 배지 상에서 선별하였다. 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 1 mg/l α-나프탈렌아세트산 (NAA), 5 mg/l 앱시스산 (ABA) 및 선별용 제초제를 포함하는 NB 배지로 구성된 배지 (PRH50) 상에서 1주 동안 사전-재생을 수행하였다. 트랜스제닉 새싹이 재생된 것으로 추정될 때까지, 2,4-D, 0.5 mg/l NAA, 및 선별용 제초제를 포함하는 재생 배지 (RNH50) 상에서 배양함으로써 모를 재생시켰다. 1% 수크로스 및 선별용 제초제로 보충된, 강도를 절반으로 줄인 무라시게(Murashige) 및 스쿡(Skoog) 기초 염 및 갬보르그(Gamborg's) B5 비타민을 포함하는 발근용 배지로 새싹을 옮겼다. 오리자 사티바 L. 자포니카 재배종 타이페이 309( Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309)의 성숙한 건조된 종자를 문헌 [Zhang et al., 1996]에 기술되어 있는 바와 같이 멸균화시켰다. 멸균된 성숙한 벼 종자를 암실에서 NB 배지 상에서 배양함으로써 배발생 조직을 유도하였다. 직경이 대략 1 mm인 1차 캘러스를 배반으로부터 제거하고, SZ 액체 배지 중에서의 세포 현탁을 개시하는 데 사용하였다. 이어서, 문헌 [Zhang 1996]에 기술되어 있는 바와 같이 현탁물을 유지시켰다. 이전 계대 배양 후 3-5일 경과하였을 때, 현탁물 유래 배발생 조직을 액체 배양물로부터 제거하고, 이를 NBO 삼투압 배지 상에 놓고 페트리 디쉬 전역에 걸쳐 약 2.5 cm의 환이 형성되도록 하고, 충격법 이전에 4 h 동안 배양하였다. 충격법 이후 16 내지 20시간이 경과하였을 때, 조직을 NBO 배지로부터 NBH50 선별 배지 상으로 옮기고, 충격 처리된 표면이 확실히 위로 향하게 하게, 암실에서 14-17일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 새로 형성된 캘러스를 원래의 충격 처리된 추출물로부터 분리하고, 동일 배지 상에 가깝게 놓았다. 추가로 8-12일 경과 후, 상대적으로 조밀한, 불투명 캘러스를 시각적으로 확인할 수 있었으며, 이를 암실에서 7일 동안 PRH50 사전-재생 배지로 옮겨 놓았다. 이어서, 더욱 조밀화되고 불투명해지는 성장 캘러스를 14-21일 동안 16-h 광주기하에 RNH50 재생 배지 상에서 계대 배양하였다. 재생 새싹을 ½ MSH50 배지를 함유하는 마겐타 박스로 옮겨 놓았다. 단일 추출물로부터 재생된 다중 식물은 형제인 것으로 간주하였고, 한 독립 식물 계통인 것으로 처리되었다. 식물에서 굵고 흰색의 뿌리가 발생하고, ½ MSH50 배지 상에서 왕성하게 성장하였다면, 식물을 dgt -28 유전자에 대해 양성인 것으로 평가하였다. 일단 모가 마겐타 박스의 상단부까지 도달하고 나면, 이를 1주일 동안 습도 100%하에 6 cm 화분 중의 토양으로 옮겨 놓고, 이어서, 온실의 13 cm 화분으로 이식시키기 이전에 2-3일 동안 30℃의 14-h의 명기를 가지는 성장 챔버 및 21℃의 암실로 옮겨 놓았다. 종자를 수집하고, 4℃에서 보관하기 전 1주일 동안 37℃에서 건조시켰다. dgt -28 벼의 T 0 분석 . 아그로박테리움 형질전환을 통해 수득된, 이식시킨 벼 형질전환체를 배지에 이식시키고, 온실 조건에 순응시켰다. dgt -28 의 PCR 검출을 위해 모든 식물을 샘플링하였고, 그 결과, pDAB110827 (TraP8:: dgt -28 )의 경우, 22개의 PCR 양성 이벤트, 및 pDAB110828 (TraP23:: dgt -28 )의 경우, 최소 16개의 PCR 양성 이벤트가 나타났다. PCR 양성 이벤트의 dgt -28 에 대한 써던 분석을 통해 상기 두 구축물 모두에 대한 단순 (1-2개의 카피) 이벤트가 나타났다. 선별된 T 0 이벤트의 단백질 발현을 통해 DGT-28 단백질 발현 범위는 검출 수준 이하 내지 130 ng/㎠인 것으로 입증되었다. 구축물 pDAB110828로부터의 선별된 T 0 이벤트를 앞서 기술된 바와 같이 2,240 g ae/ha 두란고 DMA™로 처리하고, 처리 후 7 및 14일째 평가하였다. 데이터를 통해 시용된 글리포세이트의 비율에 대한 강력한 내성이 입증되었다. 추가의 특징 규명을 위해 PCR 양성 식물 모두로부터 T 1 종자를 생산하였다. 벼에서의 Dgt -28 유전가능성 . 엽록체 전이 펩티드 TraP8을 함유하는 구축물 pDAB110827로부터의 4개의 dgt-28의 T 1 계통에 대하여 100개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 배지로 충전된 화분에 종자를 식재하였다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 dgt -28 유전자 선별을 위해 560 g ae/ha 두란고 DMA™을 모든 식물에 분무하였다. 7 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였으며, 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 각 구축물에 대하여 시험된 4개의 계통 중 2개가 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 소질 (3R:1S)로 분리되었다. Dgt -28 은 다중 종에서 유전가능한 글리포세이트 저항성 유전자이다. dgt -28 로 형질전환된 T 1 벼에서의 발아 후 제초제 내성 . 자손 시험에 사용된 각 이벤트로부터의 T 1 저항성 식물에 고유 식별자를 배정하고, dgt -28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이터를 사용하여, 시용되는 각 비율의 글리포세이트에 2개의 반접합성 복제물 및 2개의 동형접합성 복제물을 배정함으로써 처리당 총 4개의 복제물을 허용하였다. 상기 식물을 야생형 키타아케(kitaake) 벼와 비교하였다. 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 이용하여 모든 식물에 분무하였다. 560-2,240 g ae/ha 범위로 두란고 DMA™를 식물에 분무하였다. 모든 시용물은 2% w/v 황산암모늄 (AMS)이 첨가된 물 중에서 제제화되었다. 처리 후 7 및 14일째 식물을 평가하였다. 전반적인 시각적 발육 저지, 황백증, 및 괴사에 관한 손상 등급을 식물에 배정하였다. T 1 세대는 분리 세대이며, 따라서, 접합성 차이에 기인하는 일부 가변적 반응이 있을 것으로 예상되었다. 분무 결과를 통해, 7 DAT (처리 후 경과일수)일 때, 글리포세이트의 비율 증가에 대한 식물의 생장 손상이 검출되었다는 것이 입증되었다 (데이터는 나타내지 않음).
pDAB110827로부터 시험된 4개의 T 1 계통 모두로부터의 복제물에 대하여 DGT-28의 단백질 검출을 평가하였다. 데이터를 통해 DGT-28 평균 단백질 범위는 반접합성 복제물 및 동형접합성 복제물에 대하여 각각 20-82 ng/㎠ 및 21-209 ng/㎠인 것으로 나타났다. 상기 결과는 T 1 세대로의 안정적인 단백질 발현, 및 선별을 위해 사용된 560 g ae/ha 글리포세이트의 시용 후, 최대 2,240 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대한 dgt -28 벼의 내성을 입증한다. dgt - 28 를 이용한 담배의 형질전환 . 담배 (cv. 페타이트 하바나) 잎 조각을 dgt-28 트랜스진을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 형질전환시켰다. dgt -28 트랜스진을 함유하는 플라스미드를 포함하는 단일 콜로니를 스펙트로마이신 (50 μg/mL) 및 스트렙토마이신 (125 μg/mL)을 함유하는 4 mL의 YEP 배지에 접종하고, 190 rpm으로 진탕기 상에서 28℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 4 mL 종자 배양물을 사용하여 125 mL 배플형 엘렌마이어 플라스크 중 25 mL의 동일 배지의 배양물에 접종하였다. OD 600 = ~1.2에 도달할 때까지, 상기 배양물을 190 rpm으로 진탕시키면서 28℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 10 mL의 아그로박테리움 현탁액을 멸균 60 x 20 mm 페트리™ 디쉬에 놓았다. 피타트레이스™ (시그마: 미국 미주리주 세인트 루이스) 중 30 g/L 수크로스를 포함하는 MS 배지 (피토테크놀러지 랩스(Phytotechnology Labs: 미국 캔자스주 쇼니 미션)) 상에서 무균 방식으로 성장시킨 식물로부터 새로 절단한 잎 조각 (0.5 ㎠)을 밤새도록 배양된 아그로박테리움 배양물 10 mL에 수분 동안에 걸쳐 침지시키고, 멸균 여과지 상에서 건식 블롯팅한 후, 1 mg/L 인돌아세트산 및 1 mg/L 6-벤질아미노 퓨린이 첨가된 동일 배지 상에 놓았다. 3일 경과 후, dgt -28 트랜스진을 보유하는 아그로박테리움과 함께 공동 배양된 잎 조각을 5 mg/L 바스타(Basta)™ 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 동일 배지로 옮겨 놓았다. 3주 후, 개별 T 0 묘목을 토양으로 이식시키고, 온실로 옮겨 놓기 전 추가로 3일 동안 10 mg/L 바스타™ 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지로 옮겨 놓았다. (상기 기술된 분자 분석 프로토콜을 사용하여 확인된 것과 같은) 선별된 T 0 식물을 자가 수분시키고, 종자가 완전히 건조되었을 때, 포장낭으로부터 종자를 수집하였다. T 1 모종을 (하기 기술되는 바와 같이) 접합성 및 리포터 유전자 발현에 대해 스크리닝하고, dgt -28 트랜스진을 함유하는 선별된 식물을 확인하였다. 뿌리로부터 아가를 세척하고, 13.75 ㎠ 화분의 토양에 이식시키고, 상기 화분을 지퍼락(Ziploc) ® 백 (SC 존슨 & 손, 인크.(SC Johnson & Son, Inc.))에 놓고, 수돗물을 상기 백의 바닥쪽으로 배치시키고, 30℃ 온실에서 간접광하에 1주 동안 놓음으로써 식물을 온실로 이동시켰다. 3-7주 후, 백을 개봉하고; 식물을 수정시키고, 식물이 온실에 순응할 때까지 개봉된 백에서 성장시키고, 순응했을 때에는 백을 제거하였다. 식물을 일반 따뜻한 온실 조건 (주: 27℃, 야: 24℃, 주: 16시간, 최소 천연광 + 보충광 = 1,200 μE/㎡s 1 )하에서 성장시켰다. 번식시키기 전에, DNA 분석을 위해 T 0 식물을 샘플링하여 실시간 PCR로 삽입체 dgt -28 카피수를 측정하였다. 신선한 조직을 관에 넣고, 4℃에서 2일 동안 동결건조시켰다. 조직을 완전하게 건조시킨 후, 텅스텐 비드 (발레나이트(Valenite))를 관에 넣고, 샘플을 켈코(Kelco) 비드 밀을 사용하여 1분 동안 건식 분쇄시켰다. 이어서, 표준 DNeasy™ DNA 단리 방법을 수행하였다 (퀴아젠, DNeasy 69109). 이어서, 분취량의 DNA 추출물을 피코 그린(Pico Green) (몰레큘라 프로브스 P7589)으로 염색하고, 공지된 표준을 이용하여 형광계 (바이오테크(BioTek)™)에서 판독함으로써 농도 (ng/㎕)를 수득하였다. 주형으로서 총 100 ng 의 전체 DNA를 사용하였다. 샘플을 94℃에서 3분 동안, 이어서, 94℃에서 30초 동안, 64℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 1분 45초 동안 진행되는 사이클 35회, 이어서, 72℃에서 10분 동안으로 하여 9700 진앰프(9700 Geneamp)™ 열순환 반응기 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 PCR 반응을 수행하였다. EtBr로 염색된 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 PCR 생성물을 분석하고, 써던 블롯에 의해 확인하였다. 상이한 엽록체 전이 펩티드 서열 (TraP4, TraP8 및 TraP23)을 함유하는 3개의 구축물로부터의 1-3개의 dgt -28 유전자 카피를 가지는 5 내지 9개의 PCR 양성 이벤트를 재생시키고, 온실로 이동시켰다. 표준 ELISA에 의해 DGT-28 단백질을 정량화하기 위해 PCR 양성 식물 모두를 샘플링하였다. DGT-28 단백질이 PCR 양성 식물 모두에서 검출되었고, dgt -28 카피수가 증가함에 따라 단백질 농도가 증가하는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 담배에서의 aad -12 ( v1 ) 의 유전가능성 . 구축물당 5개의 dgt -28 의 T 1 계통에 대하여 100개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 구축물은 하기 엽록체 전이 펩티드 서열: TraP4, TraP8 또는 TraP23 중 하나를 함유하였다. 상기 예시된 아라비돕시스 방법의 것과 관련하여 매우 유사한 방식으로 종자를 계층화하고, 파종하고, 이식시키되, 단, 예외적으로, 이식하기 전 1차 선별에 의해 널 식물을 제거하지 않았다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 pat 선별가능한 마커의 선별을 위해 280 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 모든 식물에 분무하였다. 3 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다. 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 각 구축물에 대하여 시험된 5개의 계통 중 4개가 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 소질 (3R:1S)로 분리되었다. Dgt -28 은 다중 종에서 유전가능한 글리포세이트 저항성 유전자이다. dgt -28 로 형질전환된 T 1 담배에서의 발아 후 제초제 내성 . 자손 시험에 사용된 각 이벤트로부터의 T 1 저항성 식물에 고유 식별자를 배정하고, dgt -28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이터를 사용하여, 시용되는 각 비율의 글리포세이트에 2개의 반접합성 복제물 및 2개의 동형접합성 복제물을 배정함으로써 처리당 총 4개의 복제물을 허용하였다. 상기 식물을 야생형 페타이트 하바나 담배와 비교하였다. 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 이용하여 모든 식물에 분무하였다. 560-4,480 g ae/ha 범위로 두란고 DMA™를 식물에 분무하였다. 모든 시용물은 2% w/v 황산암모늄 (AMS)이 첨가된 물 중에서 제제화되었다. 처리 후 7 및 14일째 식물을 평가하였다. 전반적인 시각적 발육 저지, 황백증, 및 괴사에 관한 손상 등급을 식물에 배정하였다. T 1 세대는 분리 세대이며, 따라서, 접합성 차이에 기인하는 일부 가변적 반응이 있을 것으로 예상되었다. 분무 결과를 통해, 7 DAT (처리 후 경과일수)일 때, 글리포세이트의 비율 증가에 대한 최소의 식물의 생장 손상이 검출되었다는 것이 입증되었다 (데이터는 나타내지 않음). 14 DAT일 때, 시각적 손상 데이터를 통해 TraP8 및 TraP23을 함유하는 구축물로부터의 단일 카피 이벤트와 비교하여 TraP4를 함유하는 구축물의 단일 카피 이벤트에 따라 손상이 증가하였다는 것이 입증되었다. 표 25.
상기 결과를 통해 최대 4,480 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대한 dgt -28 의 내성 뿐만 아니라, dgt -28 유전자에 연결된 엽록체 전이 펩티드 서열에 의해 제공되는 내성의 차이도 입증되었다. T 2 세대에서 글리포세이트 비율 증가에 대한 dgt -28 보호 . 구축물당 2 내지 3개의 dgt -28 의 T 2 계통에 대하여 25개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 이전 세계에서 완료된 접합성 분석에 기초하여 동형접합성 계통을 선별하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 종자를 계층화하고, 파종하고, 이식시켰다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 pat 선별가능한 마커의 선별을 위해 280 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 모든 식물에 분무하였다. 3 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다. 각 구축물에 대해 시험된 모든 계통은 분리되지 않았으며, 이로써, T 2 세대에서 동종 계통을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 담배에서는 적어도 2세대에 걸쳐 dgt -28 이 멘델의 유전 법칙을 따르는 것으로 입증되었다. 앞서 기술된 바와 같이 420-3,360 g ae/ha 글리포세이트 범위 비율의 두란고 DMA™를 2-3개의 잎 담배에 시용하였다. 14 DAT일 때의 시각적 손상 데이터를 통해 T 1 세대에서 입증된 내성 결과를 확인할 수 있었다. TraP4를 함유하는 구축물로부터의 2개의 카피 계통으로부터 얻은 엽면 결과를 통해 TraP8 및 TraP23을 함유하는 구축물로부터의 단일 카피 계통의 것과 유사한 내성이 입증되었다 (데이터는 나타내지 않음).
데이터는 비형질전환된 대조군과 비교하여, 2세대에 걸쳐 최대 3,360 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대한 dgt -28 담배의 강력한 내성을 입증한다. 표준 DGT-28 ELISA에 의한 DGT-28 단백질의 분석을 위해, 글리포세이트 시용에 앞서 각 이벤트로부터 선별된 식물을 샘플링하였다. 데이터를 통해 구축물 간 단순 (1-2개의 카피) 계통의 DGT-28 평균 단백질 발현 범위는 72.8-114.5 ng/㎠인 것으로 입증되었다. 데이터를 통해 dgt -28 이 형질전환된 담배의 T 2 세대에서 단백질을 발현한다는 것이 입증되었고, 내성 데이터를 통해는 기능성 DGT-28 단백질이 확인되었다. 담배 ( cv . 페타이트 하바나) 중 제초제의 스펙트럼을 증가시키기 위한 dgt -28 의 적층 . 동형접합성 dgt -28 (pDAB107543 및 pDAB107545) 및 aad -12 v1 (pDAB3278) 식물 (후자에 대해서는 PCT/US2006/042133 참조, 이는 본원에 그의 전체로 참조로 삽입됨), 둘 모두를 상반 교배시키고, F 1 종자를 수집하였다. 각 유전자의 2회의 상반 교배로부터 얻은 F 1 종자를 계층화하고, 각 교배의 처리된 6개의 대표를 1,120 g ae/ha 글리포세이트 ( dgt -28 유전자에 대한 선별성), 1,120 g ae/ha 2,4-D ( aad -12 유전자에 대한 선별성), 또는 기술된 비율의 두 제초제의 탱크 혼합물로 처리하였다. 14 DAT일 때 식물을 등급화하였다. 분무 결과는 하기 표 27에 제시되어 있다.
본 결과를 통해, dgt -28 은 aad -12 (v1) 와 함께 성공적으로 적층될 수 있고, 따라서, 관심 작물에 시용될 수 있는 제초제의 스펙트럼 ( dgt -28 및 aad -12 각각에 대해 글리포세이트 + 페녹시아세트산)은 증가된다는 것을 확인하였다. 생물형이 존재하는 광엽 잡초 또는 저항성 잡초를 방제하기가 어려운 경우의 작물 생산에 있어서, 적층이 관심 작물의 잡초 방제 및 보호를 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 추가의 투입 또는 산출 소질 또한 dgt -28 유전자와 함께 적층될 수 있다. 소맥에서의 글리포세이트에 대한 저항성. DGT -28을 코딩하는 이원성 벡터의 제조 . 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 기술 및 기법을 이용하여 DGT-28 발현 및 PAT 선별 카세트를 함유하는 이원성 벡터를 디자인하고, 조립하였다. 각 DGT-28 발현 카세트는 프로모터, 5' 비번역 영역 및 제아 메이스로부터의 유비퀴틴 ( Ubi ) 유전자로부터의 인트론 (Toki te al Plant Physiology 1992, 100 1503-07), 이어서, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 유전자 (DGT-28)의 합성 버전의 5' 단부에 융합되어 있는 4개의 전이 펩티드 (TraP4, TraP8, TraP23 또는 TraP5) 중 하나로 구성된 코딩 서열을 함유하며, 이는 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것이다. DGT-28 발현 카세트는 Z. 메이스로부터의 리파제 유전자 ( Vp1 )의 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역 (UTR)로 종결되었다 (문헌 [Paek et al Mol 세포 1998 30;8(3) 336-42]). PAT 선별 카세트는 프로모터, 5' 비번역 영역 및 오리자 사티바로부터의 액틴 ( Act1 )으로부터의 인트론 (문헌 [McElroy et al., The Plant Cell 1990 2(2) 163-171])에 이어서, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스( Streptomyces viridochromogenes )로부터 단리된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자의 합성 버전으로 구성되었으며, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것이다. PAT 유전자는 포스피노트리신, 글루포시네이트, 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 신테타제의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩한다 (문헌 [Wohlleben et al., Gene 1 88, 70(1), 25-37]). 선별 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35s 유전자로부터의 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR로 종결되었다 (문헌 [Chenault et al., Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396]). 상업적 유전자 합성 업체 (진아트(GeneArt), 라이프 테크놀러지스(Life Technologies))에 의해 선별 카세트를 합성하고, 게이트웨이에서 이용가능한 이원성 벡터로 클로닝하였다. DGT-28 발현 카세트를 pDONR221로 서브클로닝하였다. 생성된 ENTRY 클론을, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 발현 카세트를 코딩하는 게이트웨이에서 이용가능한 이원성 벡터와 함께 LR 클로나제 II(LR Clonase II) (인비트로겐, 라이프 테크놀러지스)에서 사용하였다. 먼저 모든 조립된 플라스미드의 콜로니를 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (NEB; 미국 매사추세츠주 입스위치) 및 프로메가(Promega) (프로메가 코포레이션 (Promega Corporation: 미국 위스콘신주)로부터 입수한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하는 정제된 DNA의 제한 분해에 의해 스크리닝하였다. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit) (퀴아젠, 힐덴) 또는 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템(Pure Yield Plasmid Maxiprep System) (프로메가 코포레이션: 미국 위스콘신주)을 사용하여 공급업체의 설명서에 따라 플라스미드 DNA 제조를 수행하였다. ABI 생거 시퀀싱(ABI Sanger Sequencing) 및 빅 다이 터미네이터 v3.1(Big Dye Terminator v3.1) 사이클 서열 분석 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀러지스)을 이용하여 선별된 클론의 플라스미드 DNA의 서열을 분석하였다. 시퀀서(SEQUENCHER)™ 소프트웨어 (진 코드 코포레이션(Gene Codes Corporation: 미국 미시간주 앤 아버))를 이용하여 서열 데이터를 조립하고, 분석하였다. 생성된 4개의 이원성 발현 클론: pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) 및 pDAS000125 (TraP5-DGT28) 각각을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105를 형질전환시켰다. dgt -28 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 소맥 이벤트의 생산 . 문헌 [Wu et al., Transgenic Research 2008, 17:425-436]과 유사한 프로토콜에 따라 도너 소맥 계통 밥화이트(Bobwhite) MPB26RH를 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 4개의 DGT-28 발현 구축물 중 하나를 발현하는 트랜스제닉 소맥 식물을 생성하였다. PAT 선별가능한 마커에 의해 부여되는 표현형인 포스피노트리신 (PPT) 내성에 대해 추정 T 0 트랜스제닉 이벤트를 선별하고 토양으로 옮겨 놓았다. T 0 식물을 온실 억제 조건하에서 성장시키고, T 1 종자를 생산하였다. 전반적으로, 각 DGT-28 발현 구축물에 대해 약 45개의 독립 T 0 이벤트가 생성되었다. T 0 소맥 dgt -28 소맥 이벤트 글리포세이트 저항성 . T 0 이벤트를 온실에 순응시키고, 정상적으로 보이는, 2-4개의 새잎이 윤생체로부터 출현할 때까지 (식물이 조직 배양물로부터 온실 성장 조건으로 이행될 때까지) 성장시켰다. 식물을 성숙화될 때까지 온실에서 12시간의 보충광하에 25℃에서 성장시켰다. 글리포세이트 내성에 대한 1차 스크린 및 택맨 분석을 앞서 기술된 것과 동일한 조건하에서 성장시킨 T 1 식물에서 완료하였다. 데이터를 통해 추가로 특징 규명하고자 하는 유전가능한 T 1 이벤트를 측정할 수 있었다. 카피수가 낮은 (1-2개의 카피) 6개의 T 1 이벤트 및 다중 카피의 2개의 T 1 이벤트를 온실 조건하에서 재식재하고, 3 지엽기까지 성장시켰다. 비형질전환된 소맥 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 420 - 3,360 g ae/ha 범위의 시판용 글리포세이트 제제 (두란고 DMA™)를 T 1 식물에 분무하였다. 2% w/v 황산암모늄 첨가를 시용에 포함시켰다. 치사량은 밥화이트 MPB26RH 비형질전환된 대조군에 >75%의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. 제초제를 시용하였다. 본 실시예에서, 글리포세이트 시용은 T 1 세대에서 dgt -28 유전자의 분리를 측정하는 데 뿐만 아니라, 글리포세이트 수준 증가에 따른 내성을 입증하는 데 사용되었다. 처리 후 21일째 (DAT)의 시각적 손상에 대한 등급으로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 25% 미만의 시각적 손상률(%) (4), 25%-50%의 시각적 손상률(%) (3), 50%-75%의 시각적 손상률(%) (2), 및 75% 초과의 시각적 손상률(%) (1)을 보이는 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 소맥 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 점수화 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 소맥 (재배종 밥화이트 MPB26RH)이 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. T 1 세대에서, 반접합성 및 동형접합성 식물을 각 이벤트에 대해 시험하는 데 이용할 수 있었으며, 따라서, 이를 각 비율의 글리포세이트를 시험하는 데 포함시켰다. 반접합성 식물은 동형접합성 식물에서의 유전자량의 절반을 함유할 것이며, 따라서, T 1 세대에서는 글리포세이트에 대한 반응의 가변성이 예상될 수 있다. T 1 dgt -28 소맥 식물의 결과를 통해, 엽록체 전이 펩티드 TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23을 포함하는 경우, 최대 3,360 g ae/ha까지의 비율에서 글리포세이트에 대한 내성이 달성되었다는 것이 입증되었다. 표 28. 데이터는 카피수가 낮은 T 1 이벤트의 것이지만, 이는 각 구축물에 대한 집단을 대표하는 것이다.
21 DAT일 때, 저항성 및 감수성 식물을 계수하여 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 소질로 분리된 (3R:1S) 계통의 비율을 측정하였다. 표 29. dgt -28 은 단자엽 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능하다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다.
실시예 4: 옥수수에서 농업적으로 중요한 트랜스진에 대한 합성 엽록체 전이 펩티드 ( TraP ) 서열 Cry2Aa : 바실러스 투린지엔시스로부터의 Cry2Aa 단백질은 헬리코베르파 지아 ( Helicoverpa zea , CEW) 및 오스트리니아 누빌랄리스 ( Ostrinia nubilalis , ECB)에 대해 활성을 보여주었다. 단일 버전의 cry2Aa 유전자 (서열 13), 옥수수에 편향된 코돈이 옥수수에서 시험되었다. 이 실험에서, Cry2Aa는 단독으로 옥수수 중 TraP23 합성 엽록체 전이 펩티드와 함께 평가되어 곤충 내성 활성을 결정하고 TraP23 합성 엽록체 전이 펩티드 서열이 옥수수 중 Cry2Aa 단백질을 발현시키는 효과를 평가하였다. Trap23 v2 합성 엽록체 전이 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 12) 및 GCA 코돈 연결기가 옥수수 식물에서의 곤충 내성 시험을 위해 cry2Aa 유전자의 상류에서 복제되고, 구축물 pDAB109808로 혼입되었다 (도 7). 생성된 구축물은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하였다. 제1 PTU는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 (ZmUbil 프로모터; 문헌 [Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689]), TraP23-cry2Aa 융합 유전자 (TraP23 Cry2Aa), 및 제아 메이스 리파제 3' 비번역 구역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 7,179,902)로 구성되었다. 제2 PTU는 사탕수수 바실리포름 바이러스 프로모터 (SCBV 프로모터; 미국 특허 6,489,462), aad-1 MSV 리더 및 알코올 데히드로게나아제 1 인트론 6 함유 제초제 내성 유전자 (AAD-1; 미국 특허 7,838,733, 및 MSV 리더 서열; Genbank Acc. No. FJ882146.1, 및 알코올 데히드로게나아제 인트론; Genbank Acc. No. EF539368.1), 및 제아 메이스 리파제 3' 비번역 구역 (ZmLip 3'UTR)으로 구성되었다. cry2Aa의 상류로 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않는 대조군 플라스미드, pDAB107687가 구축되고 연구에 포함되었다 (도 8). 플라스미드는 식물 형질전화을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 내에 도입되었다. 제아 메이스 품종 B104로부터의 이삭을 수분 후 10 내지 12일에 수확하였다. 수확된 이삭을 껍질을 벗기고 상업용 표백제 (울트라 클록스(Ultra Clorox)® 살균 표백제, 6.15% 차아염소산나트륨) 및 2 방울의 트윈 20의 20% 용액 중에 20분 동안 침지시켜 표면 멸균한 후, 층류 후드 내에서 멸균 탈이온수로 3회 세정하였다. 미성숙 접합자배 (1.8 내지 2.2 mm 길이)를 각 이삭으로부터 무균적으로 잘라 내고, 아그로박테리움 현탁액 2.0 ml를 함유하는 하나 이상의 마이크로 원심분리 튜브에 분배하고, 10% 브릭-쓰루(Break-Thru)® S233 계면활성제 2 μl를 첨가하였다. 배아 단리 활동 완료시, 배아의 튜브를 폐쇄하고 락커 플랫폼(rocker platform)에 5분 동안 두었다. 이어서, 튜브의 내용물을 공동 배양 배지의 플레이트 상에 붓고, 액체 아그로박테리움 현탁액을 멸균 1회용 이송 피펫으로 제거하였다. 배아를 함유하는 공동 배양 플레이트를 뚜껑이 열린 상태로 (lid ajar) 30분 동안 층류 후드의 배면에 두었고; 이후 현미경을 이용하여 겉을 위로 하여 배반으로 배아가 배향되었다. 이어서, 배아를 갖는 공동 배양 플레이트가 추가 15분 동안 뚜껑이 열린 상태로 층류 후드의 배면으로 되돌려놓았다. 이어서, 플레이트를 폐쇄하고, 3M 마이크로포어 테이프로 밀봉하고, 인큐베이터에 25℃에서 대략 60 μmol m-2 s-1 빛의 세기로 24 시간/일 명기로 두었다. 공동 배양 기간 후, 배아를 레스팅(Resting) 배지로 옮겼다. 36개 이하의 배가 각 플레이트로 이동하였다. 플레이트를 3M 마이크로포어 테이프로 랩핑하고 27℃에서 대략 50 μmol m-2 s-1 빛의 세기로 24 시간/일 명기로 7 내지 10일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 굳어진(Callused) 배아를 선택 I 배지로 옮겼다. 18개 이하의 굳어진 배하를 선택 I 배지의 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 마이크로포어 테이프로 랩핑하고 27℃에서 대략 50 μmol m-2 s-1 빛의 세기로 24 시간/일 명기로 7일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 굳어진 배아를 선택 II 배지로 옮겼다. 12개 이하의 굳어진 배아를 선택 II의 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 마이크로포어 테이프로 랩핑하고 27℃에서 대략 50 μmol m-2 s-1 빛의 세기로 24 시간/일 명기로 14일 동안 인큐베이팅하였다. 이 단계에서, 저항성 캘러스를 이전 재생 배지로 이동시켰다. 9개 이하의 캘러스를 각 이전 재생의 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 마이크로포어 테이프로 랩핑하고 27℃에서 대략 50 μmol m-2 s-1 빛의 세기로 24 시간/일 명기로 7일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 재생 캘러스를 피타트레이스(Phytatrays)™ 중 재생 배지로 옮기고, 28℃에서 대략 150 μmol m-2 s-1 빛의 세기로 일당 16 시간/일 명기/8시간 암기로 7-14일 동안 또는 새싹이 날 때까지 인큐베이팅하였다. 5개 이하의 캘러스를 각 피타트레이스™에 두었다. 이어서, 1차 뿌리를 갖는 작은 새싹을 단리시키고 새싹/뿌리 배지로 옮겼다. 약 6 cm 이상의 뿌리박은 묘목을 토양에 옮겨 심고 내성강화를 위해 성장 챔버로 이동시켰다. 트랜스제닉 식물을 독특한 식별자를 할당하고, 정기적으로 온실로 옮겼다. 식물은 피타트레이스™로부터 성장 배지 (프리미어 테크 호티컬쳐 (Premier Tech Horticulture), ProMix BX, 0581 P)를 채운 작은 포트로 옮겨 심었고, 식물을 적응시키는데 도움을 주기 위해 휴미돔(humidome)으로 덮었다. V3-V4 단계에 도달할 때까지, 식물을 콘비론™ 성장 챔버 (28℃/24℃, 16-시간 광주기, 50-70% RH, 200 μmol 빛의 세기)에 두었다. 이 단계는 식물을 토양 및 보다 가혹한 온도에 적응시키는데 도움이 된다. 이어서, 식물을 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 높은 광 한계치: 1200 PAR; 16시간 길이: 27℃ 명기/24℃ 암기)로 옮기고, 작은 포트로부터 5.5 인치 (14 cm)로 옮겨 심는다. 보다 큰 포트로 옮겨 심은 후 대략 1 내지 2주 후, 식물을 생물 분석을 위해 샘플링하였다. 이벤트당 하나의 식물이 생물 검정되었다. 선택 이벤트는 유전자의 카피수, 웨스턴 블롯에 의한 단백질 검출 및 생물 분석 곤충에 대한 활성에 기초하여 다음 세대로의 진전에 대해 인식하였다. 스펙티노마이신 내성 유전자를 함유하는 이벤트를 표기하였지만, 진전로부터 반드시 삭제되지 않는다. 진보를 위해 선택된 이벤트는 5 갤론 (19 L) 포트로 옮겨 심었다. 임의의 비정상적인 표현형을 추적하기 위해 주기적으로 관찰하였다. 흩어진 화분에 의한 교차 오염을 방지하기 위해 실크 발생 전에 새싹 백(bag)을 새싹 위에 두었다. 덮기 전에 실크를 생성하는 임의의 새싹을 기록하고 새싹을 제거하였다. 이어서 제2 새싹을 덮고 수분에 사용하였다. 비정상을 생성하는 식물 또는 새싹이 없는 것을 데이터베이스에 기록하였다. 실크는 수분 전날에 절단하여 화분을 수용하기 위한 편평한 브러쉬를 제공하하였고, 식물은 자발수분되었다. T 1 선택을 위한 식물을 파종 7일 후에 분무하였다. 이들은 플랫당 15개의 포트를 갖는 메트로(Metro) 360 화분용 영양토의 4 인치(10.2 cm) 포트에서 생육하였다. 묘목 성장 단계는 V1-V1.5였다. 살균처리가 불량하거나 매우 작은 식물 (윤생(whorl)은 여전히 폐쇄됨)을 함유하는 포트는 선택 평가에 포함되지 않도록 표시하였다. 이어서, 전체 식물 플랫은 트랙 분무기 적용을 위한 2차 캐리어 트레이에 두었다. 트레이는 8002E 플랫 팬 노즐 (Tee Jet)를 사용하여 표적 영역에 187 L/ha 부피를 전달하도록 보정된 만델 트랙 분무기에서 한번에 2개를 두었다. 어슈어(Assure) II (퀴잘로포프) 35 g ae/ha + 1% COC (작물 오일 농축물)의 용액을 시용을 위해 제제화하였다. 15 ml/분무 부피를 사용하여 필요한 총 분무 용액을 계산하였다. 계산; (35 g ae/ha) x (1 ha/187L) x (1 L/ 97.7 g ae 어슈어 II) = 0.192% solution or 28.74 μ1/15 ml H2O + 1 % v/v). 시용 후, 이어서 식물을 분무 랩에서 1시간 동안 건조시키고 온실에 돌려보냈다. 보다 큰 포트로 옮겨심은지 대략 1 내지 2주 후, 식물을 생물 분석을 위해 샘플링하였다. 이벤트당 하나의 식물을 생물 분석하였다. 분자 분석 스크린을 통과한 T 0 이벤트는 모두 Cry2Aa 단백질 발현 수준에 대해 분석되었다. TraP를 갖지 않는 Cry2Aa를 포함하는 대조군 구축물 pDAB107687로부터의 이벤트는 TraP23을 함유한 pDAB109808로부터의 이벤트 (0.2 ng/cm 2 )와 비교시 유의하게 높은 Cry2Aa의 평균 발현 수준 (15.0 ng/cm 2 )을 가졌다. pDAB109808의 발현의 감소된 수준에도 불구하고, 이러한 이벤트는 여전히 Cry2Aa 단백질을 발현시켰다. cry2Aa 유전자를 포함하는 T-가닥의 단일 카피를 함유하는 트랜스제틱 식물은 트랜스제닉 식물로부터 잎 위에 신생아 인시목 유충으로 수행된 생물 분석으로 곤충 호라성에 대해 시험하였다. 분석된 인시목 종은 유럽 옥수수 천공충, 오스트리니아 누빌랄리스 (휘브너) (ECB), 및 옥수수 이삭벌레, 헬리코베르파 제아 (CEW)이었다. 32 웰 트레이 (CD 인터내셔날 (CD International), 미국 뉴저지 피트만)를 2% 한천 용액으로 부분적으로 채우고, 한천을 고체화시켰다. 잎 섹션은 2개에서 대략 하나를 각 식물로부터 취하고 32 웰 트레이의 웰에 단독으로 두었다. 하나의 잎 조각을 각 웰에 넣고, 2개의 잎 조각을 식물당 및 곤충당 시험하였다. 페인트브러쉬를 사용하여 곤충이 들끓었고, 각 웰에 10개의 신생아 유충을 넣었다. 트레이를 시험 동안 배기되게 하는 천공된 점착성 뚜껑으로 밀봉하였다. 트레이는 3일 동안 28℃, 40% RH, 16시간 명기:8시간 암기에 두었다. 시험 지속 후, 단순한 %손상 스코어를 각 잎 조각에 대해 취하였다. 각 시험에 대한 손상 스코어는 평균내었고 보정 분석을 수행하기 위해 단백질 발현 분석과 동시에 사용되었다. 생물 분석의 결과는 pDAB109808 이벤트가 생물 분석에서 시험된 곤충에 대해 보호를 제공하기 때문에 TraP23 합성 엽록체 전이 펩티드 서열이 기능성이라는 것을 나타내었다. 트랜스제틱 이벤트에서, TraP (pDAB 107687) 없이 Cry2Aa 단백질을 발현시키는 식물은 시험된 모든 곤충 종에 걸쳐 Cry2Aa 단백질을 TraP23 (pDAB 109808)로 발현시키는 식물보다 유의하게 큰 평균 잎 손상을 가졌다. TraP23을 갖는 pDAB109808 이벤트는 TraP를 갖지 않는 이벤트와 비교시 더 많은 잎 손상을 갖지만, pDAB19808 이벤트는 생물 분석된 곤충에 대한 보호를 제공하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Lira, Justin Cicchillo, Robert M. Yerkes, Carla Robinson, Andrew <120> SYNTHETIC CHLOROPLAST TRANSIT PEPTIDES <130> 2971-P10295US (71607) <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Glycine max <400> 1 Met Ala Gln Val Ser Arg Val His Asn Leu Ala Gln Ser Thr Gln Ile 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Ser Asn Ser Asn Lys Leu Lys Ser Val Asn Ser Val 20 25 30 Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg Ile Pro Met 35 40 45 His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Val Gly Lys Gly Asn 50 55 60 Ser Gly Val Phe Lys Val Ser Ala Ser 65 70 <210> 2 <211> 71 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ala Gln Val Ser Arg Ile Cys Asn Gly Val Gln Asn Pro Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Ser Gln Arg Lys Ser Pro Leu Ser Val 20 25 30 Ser Leu Lys Thr Gln Gln His Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Ser 35 40 45 Trp Gly Leu Lys Lys Ser Gly Met Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Arg 50 55 60 Pro Leu Lys Val Met Ser Ser 65 70 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 3 Met Ala Gln Ser Ser Arg Ile 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Arg Ser Leu 50 55 60 Lys Val Ser Ala Ser 65 <210> 6 <211> 64 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 6 Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly Met Arg Val Arg Val Arg 35 40 45 Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val Ala Ser Ala Ser Ser Ser 50 55 60 <210> 7 <211> 57 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 7 Met Ala Met Ala Ala Ala Ala Thr Met Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ala Val Ser Leu Asp Arg Ala Ala Pro Ala Pro Ser Arg Arg Leu Pro 20 25 30 Met Pro Ala Ala Arg Pro Ala Arg Arg Gly Ala Val Arg Leu Trp Gly 35 40 45 Pro Arg Gly Ala Ala Ala Arg Ala Thr 50 55 <210> 8 <211> 68 <212> PRT <213> Allium macrostemon <400> 8 Met Glu His Thr Val Met Ala Lys Ser Thr Ile Arg Ala Pro Ser Leu 1 5 10 15 His Leu Ser Ser Ile Arg Ser Pro Arg Phe Ala Ser Ser Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Phe Val Arg Phe Gly Leu Arg Gly Asn Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Ile Gly Leu Arg Ile Gly Asn Cys Arg Arg Ala Ser Val Arg Val Leu 50 55 60 Ala Ser Leu Ala 65 <210> 9 <211> 67 <212> PRT <213> Camptotheca acuminata <400> 9 Met Ala Gln Val Ser Asn Ile Pro Asn Gly Val Gln Asn Gly His Phe 1 5 10 15 Arg Pro Asn Phe Pro Lys Thr Gln Asn Ser Val Gln Val Tyr Ser Val 20 25 30 Phe Cys Gly Ser Lys Leu Lys Ser Ser Trp Cys Leu Asn His Gly Arg 35 40 45 Val Ala Val Asn Ser Pro Val Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Arg Val 50 55 60 Ser Ala Ser 65 <210> 10 <211> 69 <212> PRT <213> Conyza canadensis <400> 10 Met Ala Val His Ile Asn Asn Ser Asn Ile Pro Ile Phe Asn Thr Ser 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Gln Asn Pro Ser Ser Lys Ser Ser Ser Phe Leu Ser 20 25 30 Phe Gly Ser Asn Phe Lys Asn Pro Leu Lys Asn Asn Asn Asn Asn Asn 35 40 45 Tyr Thr Ser Val Ser Cys Asn Val Lys Asn Asn Lys Asn Pro Phe Lys 50 55 60 Val Ser Ala Phe Ser 65 <210> 11 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TraP23 synthetic chloroplast transit peptide <400> 11 Met Ala Gln Ile Asn Lys Ser Ala Asn Gly Val Arg 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aaacttgatg caagacatac tgagagagac tgagcagttc 300 ttgaatcaga ggctgaatac ggacacgctg gcgagggtga acgctgaact cattggcctc 360 caagcgaaca ttagagagtt caatcagcaa gttgataact ttctgaaccc cacacagaat 420 ccagtgcctc tgtccatcac atcatctgtg aacacaatgc agcagctgtt cttgaatagg 480 ctgccacagt ttcagattca aggctatcaa ctgcttcttc tgcctctgtt tgctcaagct 540 gcgaacatgc acctcagctt catcagagac gtgattctga acgcagatga gtggggaatc 600 agcgctgcca ctttgaggac ctacagagat tacttgagga actatacacg cgattactca 660 aactactgca tcaacaccta tcaaacagcg tttaggggac ttaacaccag actgcacgac 720 atgcttgagt tccggactta catgttcctc aacgtctttg agtatgtctc gatttggtcc 780 ctcttcaagt atcagagcct tatggtctcc tctggtgcta acctctacgc ctcgggttcc 840 ggaccgcagc agacccagtc attcactgcc cagaactggc cattcctcta cagccttttc 900 caagtgaaca gcaactacat cttgtctggc atctctggca caaggctctc tatcacattt 960 ccgaacattg gtggcctgcc tggctccacg acgacacaca gcctcaattc cgcacgcgtc 1020 aactactcgg gtggggtctc ctccggactc attggtgcca ctaacttgaa ccataact tc 1080 aactgttcaa cggtgctgcc acccctttca actccgtttg tcagatcgtg gcttgattct 1140 ggcactgaca gagagggagt tgccacgagc accaactggc agaccgagtc cttccagacc 1200 acactttcgc tgcgctgcgg tgccttctca gcgaggggaa actcgaacta cttcccagac 1260 tacttcatac gcaacattag cggagtcccg ttggtgatcc ggaatgagga cctcaccaga 1320 cctcttcact acaatcagat acgcaacatc gaaagcccat ctgggacacc tggaggtgca 1380 agggcatact tggttagcgt tcacaaccgg aagaacaaca tctatgctgc taatgagaat 1440 gggaccatga ttcatcttgc accggaagat tacactggct tcacgatctc acccatccat 1500 gccacccaag tgaacaacca gactcgcacg ttcatctcag agaagttcgg caaccaaggt 1560 gacagcctcc gcttcgaaca gagcaacacc acagccagat acacccttag aggcaatggc 1620 aacagctaca atctctatct gagggtgtct agcattggca attcgaccat tcgggtgacg 1680 atcaatggtc gcgtttacac ggtctccaac gtcaatacga ccactaacaa tgatggggtc 1740 aatgacaatg gtgctcgctt ctccgacatc aacatcggca acatcgtcgc ttccgacaac 1800 accaatgtta cgctggacat caatgtcacc ttgaactctg gcacaccttt cgatctgatg 1860 aacatcatgt ttgtccccac caatcttcct cccctctact ga 1902 <210> 14 <211> 12 48 <212> DNA <213> Streptomyces sviceus <400> 14 atgagaggga tgccagcctt gtctttacct ggatcaaaga gtatcacagc tagggcactc 60 tttcttgctg ctgctgctga tggggttact actttggtga ggccattgag aagtgacgac 120 acagaaggat tcgctgaggg gttagttcgt ttaggctatc gtgtagggag gacacccgat 180 acttggcaag tcgatggcag accacaagga ccagcagtgg ctgaggctga cgtctactgt 240 agagacggag caaccaccgc tagattcttg ccaaccttag cagctgctgg tcacggaaca 300 tacagatttg atgcttcacc acagatgagg agacgtcctc ttttgccctt aagcagagcc 360 ttgagggatt tgggtgtcga tcttagacac gaagaagctg aaggtcatca ccctctgact 420 gtccgtgctg ctggggttga aggaggagag gttactttgg atgctggtca gtcaagtcag 480 tatctcactg ccttgttgct ccttggtccc cttacaagac aaggactgag gataagggtt 540 actgatttgg tgtcagcacc atacgtggag attacgcttg caatgatgag ggctttcgga 600 gttgaagtgg caagggaggg agatgtgttc gttgttccac ctggtggata tcgtgcaact 660 acgtatgcta tagaacccga cgcaagtact gcttcttact tcttcgcagc tgctgctttg 720 actcctggag ctgaagtgac tgtacctggg ttaggcacgg gagcacttca aggagatttg 780 ggatttgtag atgtcttaag gagaatggga gccgaggtg t ccgtaggagc tgatgcaacc 840 actgttagag gaactggtga attgcgtggc cttacagcca acatgagaga cataagtgat 900 acgatgccga ccctcgctgc aatagcaccc tttgctagtg ctccagttag aatcgaggat 960 gttgccaaca ctcgtgtcaa agaatgtgac agacttgagg cttgtgcaga gaaccttagg 1020 aggttgggag taagggttgc aacgggtccg gactggattg agatacaccc tggtccagct 1080 actggtgctc aagtcacaag ctatggtgat cacagaattg tgatgtcatt tgcagtgact 1140 ggacttcgtg tgcctgggat cagcttcgac gaccctggct gtgttcgtaa gacttttcct 1200 gggtttcacg aggctttcgc agaattgagg cgtggcattg ggagctga 1248 <210> 15 <211> 1251 <212> DNA <213> Streptomyces sviceus <400> 15 atggcaagag ggatgccagc cttgtcgctg cctggctcaa agtcgatcac ggctagagca 60 ctctttctcg cagcagcagc cgacggagtc accacgcttg tgagaccgct gcggtcagac 120 gacaccgagg gttttgcgga aggcctcgtc agactgggct atcgggttgg gaggactccc 180 gacacgtggc aagtggacgg aaggccacaa ggtccagcag ttgccgaggc tgatgtgtat 240 tgtagagacg gtgcaacaac ggctaggttc ctccccacac tcgcagctgc tggacacggg 300 acctacagat ttgatgcctc tccccagatg aggagaaggc cactgctgcc tctttctagg 360 gcttt gaggg accttggcgt tgatcttcgc cacgaggaag cggaagggca ccaccccttg 420 accgtgagag ctgctggagt cgagggaggt gaggttacac tcgatgctgg acagtcctct 480 cagtacttga cggcactgct gctgctcggt ccgctcacac gccaagggct gcggattcgc 540 gtcactgatc tggttagcgc tccgtacgtg gagattacac ttgcgatgat gagagctttt 600 ggggtcgagg ttgcacgcga aggcgacgtt ttcgtggtgc ctcctggtgg ctacagagcg 660 actacgtacg cgattgagcc agatgccagc accgcaagct acttctttgc agctgctgcg 720 ttgacacctg gagccgaggt cacagtgcct ggactcggga ccggagcgct tcaaggggat 780 ctcggcttcg tggacgtgct gcggaggatg ggtgccgagg tcagcgtggg agcagacgct 840 acgactgtta gaggcacggg tgagcttaga ggccttacag caaacatgag ggacatatcc 900 gacacgatgc cgacgcttgc tgccatcgct ccgttcgctt cagcacccgt cagaattgaa 960 gatgtggcga acactcgcgt caaagagtgc gacagacttg aagcgtgtgc cgagaacttg 1020 aggaggttgg gagtgagagt cgcaactggt ccagactgga tcgagatcca ccctggtcca 1080 gctactggag cgcaagtcac aagctatggc gaccatagga ttgttatgtc attcgcagtg 1140 accggactca gagttcctgg gatctctttc gacgaccctg gttgcgtgcg gaaaacgttc 1200 cctggcttcc acgaggcatt tgcggagctg cggagaggaa ttggttcctg a 1251 <210> 16 <211> 1599 <212> DNA <213> Glycine max <400> 16 atggctcaag tctcccgtgt tcacaatctt gctcagtcaa cccaaatctt tggacattca 60 agcaactcaa acaaactgaa gtctgtgaat tctgtctcac ttcgcccacg cctttgggga 120 gcatccaaga gtcgcatacc aatgcacaag aatgggagtt tcatgggcaa cttcaatgtt 180 gggaaaggca attctggtgt cttcaaagtt tcagcttctg ttgcagccgc agagaaaccc 240 agcacttccc ctgagattgt tcttgaaccc attaaggact tcagtggaac aatcactctg 300 cctggatcaa agagtctttc aaacagaata cttctcttgg cagctctgag tgaaggaacc 360 actgtagttg acaacctttt gtactctgaa gatattcatt acatgttggg tgctctcaga 420 actcttgggt tgagagttga agatgacaag accacaaaac aagccatagt tgaaggatgt 480 ggtgggttgt ttccaacaag caaagaatcc aaagatgaga tcaacttgtt tcttggcaat 540 gctggaattg caatgagaag cctcactgct gcagtagttg cagctggtgg gaatgcaagt 600 tatgtccttg atggtgtccc cagaatgagg gaaaggccca tcggtgacct tgtggctggc 660 ctgaaacagc ttggagcaga tgttgattgc ttcttgggca caaactgccc tccagtgaga 720 gtgaatggga agggaggttt gcctggtgga aaggtcaaac tgagtggatc agtctctt cc 780 cagtatctga ctgccttgct catggctgcc cctctggctt tgggtgatgt ggagattgaa 840 atagtggaca agttgatttc tgttccatat gtggaaatga ccctcaaact catggagagg 900 tttggagttt ctgttgaaca ttctggcaac tgggatcgtt tccttgtaca tggaggtcag 960 aagtacaaaa gccctggcaa tgcctttgtt gaaggggatg caagctctgc ttcctatctc 1020 ttggctgggg ctgccatcac tggtgggacc atcactgtga atggctgtgg cacctcatcc 1080 cttcaaggtg atgtaaagtt tgcagaggtc ttggagaaaa tgggtgccaa ggtcacctgg 1140 tctgagaaca gtgtaactgt gtctggacct cccagagact tcagtggcag aaaggttctc 1200 cgtggaattg atgtgaacat gaacaagatg ccagatgtgg ccatgaccct cgctgttgta 1260 gccctgtttg caaatggacc aactgcaatc cgtgatgttg cttcatggag ggtgaaggag 1320 acagagagga tgattgccat ttgcacagaa ctccgcaaac ttggtgcaac agttgaagag 1380 ggaccagatt actgtgtgat aaccccacct gagaagctca atgtgacagc cattgacacc 1440 tatgatgacc acagaatggc aatggctttc tcccttgctg cctgtggtga tgtgcctgtg 1500 actatcaaag accctgggtg cacaaggaag acatttccag actactttga agttttggag 1560 aggttgacaa agcactgagt agttagctta atcacctag 1599 <210> 17 <211> 1551 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 17 atggctcaat cttcaaggat ttgccacggt gttcagaacc cttgtgtgat catatccaat 60 ctcagtaaga gcaatcagaa caaatcaccc ttctctgtct ccctcaaaac tcatcaacca 120 cgtgcatcta gttggggatt gaagaaaagt gggacaatgc tgaacggatc agtcattagg 180 cctgtaaagg ttacagcctc tgtgtccacg agtgaaaagg caagcgagat cgtcttacaa 240 ccgattagag aaatctctgg gcttatcaag ttgcctggct ccaaatcact ctccaatagg 300 atacttcttt tggctgcact gagtgaaggc acaactgttg tggacaactt gctcaactcc 360 gatgatatca actacatgct tgacgccttg aagaagttag gactcaatgt ggagagagat 420 agcgttaaca atcgtgctgt cgtagaagga tgtggtggca tctttcctgc atctctggat 480 tctaagagcg acatcgagct ttacttgggc aatgctgcaa cagccatgag accgttaact 540 gctgctgtta ccgcagctgg aggaaatgct agttatgtgc ttgatggtgt tccaagaatg 600 agggaaaggc caatagggga tttggtcgtc ggactgaaac agctcggtgc tgacgttgaa 660 tgtactttag gcacaaactg tcctcccgtg cgtgttaacg caaatggtgg actgcctggt 720 ggaaaggtca agttgtctgg ctccatttcc agtcaatacc ttacggcttt gctcatggct 780 gcaccacttg ccttaggtga tgtggagatt gagatcattg acaagctcat a tctgttccg 840 tacgtggaaa tgacacttaa gctgatggaa agattcggag tttcagccga acattccgat 900 agctgggatc gtttctttgt aaagggtggg cagaagtaca agtctcctgg caatgcttat 960 gtggaaggtg acgcttcttc agctagttac ttcttggctg gtgcagccat aactggcgag 1020 acagttaccg tggaaggatg cggaactacc agcctccaag gtgatgtcaa gttcgcagag 1080 gtgttggaaa agatggggtg caaagtttcc tggacagaga actcagttac tgtaacggga 1140 cctagtaggg atgcttttgg gatgcgtcac cttagggcag ttgacgtgaa catgaacaag 1200 atgccagatg tcgctatgac tttagcagtt gtggcactgt ttgccgatgg tcctacaacg 1260 attagggacg tagcttcttg gagagtcaaa gaaactgaga ggatgatcgc catttgtact 1320 gagcttcgta agttgggtgc cacagttgaa gaagggtccg attactgcgt gattactcct 1380 ccagctaaag ttaagcctgc tgagattgat acctatgatg accacagaat ggctatggcc 1440 tttagcctcg ctgcatgtgc cgatgttcca gtcacgatca aggaccctgg ctgtactaga 1500 aagacatttc ccgactactt tcaagtgctt gagtcaatca cgaaacactg a 1551 <210> 18 <211> 1551 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 18 atggctcaat cttcaaggat ttgccacggt gttcagaacc cttgtgtgat catatccaat 60 ctcagtaaga gcaat cagaa caaatcaccc ttctctgtct ccctcaaaac tcatcaacca 120 cgtgcatcta gttggggatt gaagaaaagc ggaacaatgc tgaacggatc agtcattagg 180 cctgtaaagg ttactgcatc tgtgtccacg agtgaaaagg caagcgagat cgtcttacaa 240 ccgattagag aaatctctgg gcttatcaag ttgcctggct ccaaatcact ctccaatagg 300 atacttcttt tggctgcact gagtgaaggc acaactgttg tggacaactt gctcaactcc 360 gatgatatca actacatgct tgacgccttg aagaagttag gactcaatgt ggagagagat 420 agcgttaaca atcgtgctgt cgtagaagga tgtggtggaa tctttcctgc atctctggat 480 tctaagagcg acatcgagct ttacttgggc aatgctgcaa cagccatgag atccttaact 540 gctgctgtta ccgcagctgg tggaaatgct agttatgtgc ttgatggtgt tccaagaatg 600 agggaaaggc caatagggga tttggtcgtc ggactcaaac agctcggtgc tgacgttgaa 660 tgtactttag gcacaaactg tcctcccgtg cgtgttaacg caaatggtgg actgcctggt 720 ggaaaagtca agttgtctgg ctccatttcc agtcaatacc ttacggcttt gctcatggct 780 gcaccacttg ccttaggtga tgtggagatt gagatcattg acaagctcat atctgttccg 840 tacgtggaaa tgacacttaa gctgatggaa agattcggag tttcagccga acattccgat 900 agctgggatc gtttctttgt aaagggaggg cag aagtaca agtctcctgg aaacgcatac 960 gtggaaggtg acgcttcttc agctagttac ttcttggctg gtgcagccat aactggcgag 1020 acagttaccg tggaaggatg cggaactacc agcctccaag gtgatgtcaa gttcgcagag 1080 gtgttggaaa agatggggtg caaagtttcc tggacagaga actcagttac tgtaacggga 1140 cctagtaggg atgcttttgg gatgcgtcac cttagagccg ttgacgtgaa catgaacaag 1200 atgccagatg tcgctatgac cttagctgtg gttgcactgt ttgccgatgg tcctacaacg 1260 attagggacg tagcctcttg gagagtcaaa gaaaccgaga ggatgatcgc catttgtact 1320 gagcttcgta agttgggtgc cacagttgaa gaagggtccg attactgcgt gattactcct 1380 ccagctaaag ttaagccagc agagattgat acctatgatg accacagaat ggctatggct 1440 ttcagcctcg ctgcatgtgc cgatgttcca gtcacgatca aggaccctgg ctgtactaga 1500 aagacatttc ccgactactt tcaagtgctt gagtcaatca cgaaacactg a 1551 <210> 19 <211> 1551 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 19 atggctcaat cttcaaggat ttgccacggt gttcagaacc cttgtgtgat catatccaat 60 ctcagtaaga gcaatcagaa caaatcaccc ttctctgtct ccctgaaaac tcatcaacca 120 cgtgcatcta gttggggatt gaagaaaagt ggcacaatgc tgaacggatc agtcattagg 180 cctgtaaagg ttacagcctc tgtgtccacg agtgaaaagg caagcgagat cgtcttacaa 240 ccgattagag aaatctctgg gcttatcaag ttgcctggct ccaaatcact ctccaatagg 300 atacttcttt tggctgcact gagtgaaggg acaactgttg tggacaactt gctcaactcc 360 gatgatatca actacatgct tgacgccttg aagaagttag gactcaatgt ggagagagat 420 agcgttaaca atcgtgctgt cgtagaagga tgtggtggaa tctttcctgc atctctggat 480 tctaagagcg acatcgagct ttacttgggc aatgctggca tcgccatgag atccttaact 540 gctgctgtta ccgcagctgg tggaaatgct agttatgtgc ttgatggtgt tccaagaatg 600 agggaaaggc caatagggga tttggttgtc ggactcaaac agctcggtgc tgacgttgaa 660 tgtactttag gcacaaactg tcctcccgtg cgtgttaacg caaatggtgg actgcctggt 720 ggaaaggtca agttgtctgg ctccatttcc agtcaatacc ttacggcttt gctcatggct 780 gcaccacttg ccttaggtga tgtggagatt gagatcattg acaagctcat atctgttccg 840 tacgtggaaa tgacacttaa gctgatggaa agattcggag tttcagccga acattccgat 900 agctgggatc gtttcttcgt aaagggaggg cagaagtaca agtctcctgg gaacgcatac 960 gtggaaggtg acgcttcttc agctagttac ttcttggctg gtgcagccat aactggcgag 1020 acagttaccg tgga 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