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글리포세이트 저항성 식물 및 관련 방법
申请号 KR1020147024554 申请日 2013-02-01 公开(公告)号 KR1020140119186A 公开(公告)日 2014-10-08
申请人 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨; 发明人 리라저스틴엠; 시칠로로버트엠; 예케스칼라; 로빈슨앤드류이;
摘要 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 글리포세이트 저항성을 갖는 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 및/또는 식물 세포, 및 관련 방법이 제공된다.
权利要求
  • a) 서열 2 또는 서열 3의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    b) 서열 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자; 및
    c) 고 엄격성 조건 하에, 서열 2 또는 서열 3을 갖는 또 다른 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산 분자.
  • 제1항에 있어서, 핵산이, 식물에서의 발현을 위해 설계된 합성 서열을 포함하는 핵산 분자.
  • 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  • 제3항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 벡터.
  • 제3항에 있어서, 핵산이 프로모터와 작동가능하게 연결되는 벡터.
  • 프로모터와 작동가능하게 연결된 이종 핵산으로서 제1항의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  • 제5항에 있어서, 프로모터가 AtUbi10 프로모터인 벡터.
  • 제6항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  • 제1항의 핵산을 포함하는, 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포.
  • 제9항에 있어서, 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 및/또는 식물 세포가, 동일한 종의 야생형 식물과 비교한 경우에, 글리포세이트에 대해 내성인, 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포.
  • 제9항에 있어서, 핵산이 LGNAAT (서열 61)를 암호화하지 않고, ALLMXAPLT (서열 62)를 암호화하지 않는 (여기서, X는 알라닌, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택됨), 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포.
  • 제9항에 있어서, 핵산이 서열 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하고, 서열 1과 정렬될 때 서열 1의 위치 101에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함하는, 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포.
  • 제9항의 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 및/또는 식물 세포로부터 생성된 재생 가능한 세포의 조직 배양물.
  • 제9항의 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포로부터 생성된 원형질체.
  • 제13항에 있어서, 재생 가능한 세포가 잎, 화분, 배아, 떡잎, 배축, 분열 조직 세포, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 줄기 및 꼬투리로 이루어진 군으로부터 선택된 조직 유형으로부터 생성되는 조직 배양물.
  • 글리포세이트에 대해 저항성인, 제13항의 조직 배양물로부터 재생된 식물.
  • 제9항에 있어서, 게놈이 서열 2 또는 서열 3과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함하는, 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포.
  • a) 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포를 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키는 단계; 및
    b) 서열 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현시키는 단계
    를 포함하는, 글리포세이트에 대해 저항성인 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포를 생성시키는 방법.
  • 제18항에 있어서, 형질전환된 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포가 글리포세이트에 대해 저항성인 방법.
  • 제18항에 있어서, 폴리펩티드가 LGNAAT (서열 61)를 포함하지 않고/않거나 ALLMXAPLT (서열 62)를 포함하지 않는 (여기서, X는 알라닌, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택됨) 방법.
  • 제18항에 있어서, 서열 1과 정렬된 경우, 폴리펩티드가 서열 1의 위치 101에 상응하는 위치에 알라닌을 포함하는 방법.
  • 제18항에 있어서, 핵산 분자가 서열 2 또는 서열 3과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  • 제18항에 있어서, 핵산 분자가 서열 2 또는 서열 3을 포함하는 방법.
  • a) 제1항의 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 종자를 경작 구역 내에 심는 단계; 및
    b) 이러한 경작 구역에, 상기 식물 또는 식물 종자에 상당한 영향을 미치지 않으면서 경작 구역 내의 잡초를 방제하기에 충분한 양의 제초제를 적용하는 단계
    를 포함하는, 제초제-저항성 식물을 함유하는 경작 구역 내에서 잡초를 방제하는 방법.
  • 제24항에 있어서, 제초제가 글리포세이트인 방법.
  • 제24항에 있어서, 제1항의 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 종자가 이종 폴리펩티드를 암호화하는 제2의 핵산 분자를 포함하는 방법.
  • 제24항에 있어서, 제2의 핵산이 aad -1 또는 aad -12 를 포함하는 방법.
  • a) 식물을, 제1항의 핵산 분자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 구조물로 형질전환시키는 단계;
    b) 형질전환된 식물을 재생시키는 단계; 및
    c) 서열 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 생성하도록 핵산 분자를 발현시키는 단계
    를 포함하는, 식물에서 제초제에 대한 저항성을 부여하는 방법.
  • 제28항에 있어서, 제초제가 글리포세이트인 방법.
  • 제28항에 있어서, DNA 구조물이 식물에서 발현 가능한 이종 폴리펩티드를 암호화하는 제2의 핵산 분자를 포함하는 방법.
  • 제30항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 aad -1 또는 aad -12 를 포함하는 방법.
  • 이종 핵산으로서 제1항의 핵산 (여기서, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다)을 게놈 내로 안정적으로 통합시킨 식물.
  • 제32항에 있어서, 대두 식물인 식물.
  • 제32항에 있어서, 옥수수 식물인 식물.
  • 제32항에 있어서, 밀, 옥수수, 대두, 담배, 브라키아리아, 벼, 기장, 보리, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지, 알팔파, 면, 당근, 감자, 사탕무, 참마, 상추, 시금치, 페투니아, 장미, 국화, 잔디풀, 소나무, 전나무, 가문비나무, 중금속 축적성 식물, 해바라기, 홍화, 평지씨 및 아라비도프시스 ( Arabidopsis )로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물.
  • 제32항에 있어서, 아스파라구스 (Asparagus), 아베나 (Avena), 브라키아리아 (Brachiaria), 브라시카 (Brassica), 시트루스 (Citrus), 시트룰루스 (Citrullus), 캅시쿰 (Capsicum), 쿠쿠르비타 (Cucurbita), 다우쿠스 (Daucus), 에리게론 (Erigeron), 글리시네 (Glycine), 고시퓸 (Gossypium), 호르데움 (Hordeum), 헬리안투스 (Helianthus), 락투카 (Lactuca), 롤륨 (Lolium), 리코페르시콘 (Lycopersicon), 말루스 (Malus), 만니호트 (Manihot), 니코티아나 (Nicotiana), 오리초프라그무스 (Orychophragmus), 오리자 (Oryza), 페르세아 (Persea), 파세올루스 (Phaseolus), 피숨 (Pisum), 피루스 (Pyrus), 프루누스 (Prunus), 라파누스 (Raphanus), 세칼레 (Secale), 솔라눔 (Solanum), 소르굼 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum), 비티스 (Vitis), 비그나 (Vigna), 및 제아 (Zea) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 종인 식물.
  • 제6항에 있어서, 식물을 생성하도록 재생 가능하지 않은 숙주 세포.
  • 제9항에 있어서, 식물을 생성하도록 재생 가능하지 않은 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포.
  • 제18항에 있어서, 식물을 생성하도록 재생 가능하지 않은 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 또는 식물 세포가 형질전환되는 방법.
    • 说明书全文

    글리포세이트 저항성 식물 및 관련 방법 {GLYPHOSATE RESISTANT PLANTS AND ASSOCIATED METHODS}

    우선권 주장

    본 출원은 2012년 2월 1일에 출원된 미국 가출원 제61/593,555호 및 2012년 4월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/625,222호의 이익을 주장한다.

    37 CFR § 1.821(c) 또는 (e)에 따르는 진술서 - ASCII 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록

    37 CFR § 1.821(c) 또는 (e)에 따라서, 서열 목록의 ASCII 텍스트 버전을 함유하는 파일이 본 출원과 동시에 제출되었으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

    기술 분야

    본 개시내용은 DGT-14를 포함하는 신규하고도 독특한 식물 뿐만 아니라 관련 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 N-(포스포노메틸) 글리신의 대사에 관여하는 신규 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 및 이를 확인하는 방법에 관한 것이다. 특별한 실시양태는 외래 폴리펩티드 및/또는 핵산을 포함하는 식물, 식물 부분 및 식물 세포에 관한 것이다.

    잡초 종은 경작지에서 오랜 기간 동안 문제가 되어 왔었다. 잡초 방제가 한때는 노동 집약적인 작업이긴 하였지만, 효율적으로 잡초를 사멸시키는 화학 제초제의 입수 용이성으로 인해 보다 용이하게 이루어져 왔다. 제초제의 광범위한 사용은 개선된 작물 품종 및 비료와 함께, 농업 분야에서 "녹색 혁명"에 상당한 기여를 하였다. 특히 유용한 제초제는 광범위한 제초 활성 스펙트럼을 갖는 것이다. 불행하게도, 광범위한 스펙트럼 제초제는 전형적으로, 이러한 제초제에 노출된 농작물에 대해 해로운 효과를 지니고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 한 가지 방법은 특정의 광범위한 스펙트럼 제초제에 대해 내성이 있는 식물을 생산하는 것이다.

    광범위한 스펙트럼 제초제의 한 예는 글리포세이트로서 공지되기도 한 N-포스포노메틸-글리신이다. 글리포세이트는, 예를 들어 무경운 농업 (no-till farming)에서 농작물 재배에 앞서 잡초를 방제하기 위해 전세계 농부들에 의해 널리 사용되어 왔다. 또한, 글리포세이트는 생산 주기 사이 또는 윤작 사이의 자발적 식물 및 잡초를 방제해 주는 효율적 수단이다. 글리포세이트는 사용 후에 토양 속에 잔재하지 않으며, 농업에서 사용할 수 있는 환경상 가장 안전하면서도 광범위하게 유효한 화학 제초제 중의 하나인 것으로 널리 간주되고 있다.

    글리포세이트는 시킴산(shikimic acid) 경로를 억제함으로써 식물을 사멸시킨다. 이러한 경로는 아미노산, 비타민 및 식물 호르몬을 포함한 방향족 화합물의 생합성을 유발시킨다. 글리포세이트는 효소 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(synthase) (통상적으로, "EPSP 신타제" 및 "EPSPS"로서 지칭됨)와 결합하여 이의 활성을 억제함으로써 포스포에놀피루브산 (PEP) 및 3-포스포시킴산이 5-에놀피루빌-3-포스포시킴산으로 축합되는 것을 차단시킨다.

    불행하게도, 글리포세이트에 대해 자연적으로 내성이 있는 농작물은 전혀 공지되지 않았으므로, 재배 작물에 있어서 잡초 방제를 위한 상기 제초제의 활용은 제한되어 왔다. 글리포세이트 내성 농작물을 생산하는 한 가지 방법은 이종 글리포세이트 내성 형태의 EPSPS 유전자를 암호화하는 유전자를, 유전 공학 기술을 이용하여 농작물 내로 도입하는 것이다. 화학적 돌연변이 유발을 이용하여, 글리포세이트 내성 형태의 EPSPS를 세균에서 생산하여 왔고, 상기 이종 유전자를 식물 내로 도입하여 글리포세이트 내성 식물을 생산하였다 (예를 들어, 문헌 [Comai et al., Science 221:370-71 (1983)] 참조). 이러한 이종 EPSPS 유전자는 통상적으로, 목적하는 수준의 내성을 획득하기 위해 농작물 내에서 과발현된다.

    관련 분야의 전술된 예 및 이와 관련된 제한 사항은 예시하기 위한 것이고 배타적이지 않다. 관련 분야의 기타 제한 사항은 본 명세서 판독시 당업자에게 명백해질 것이다.

    개시내용

    실시양태에서, 본 개시내용은 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 및/또는 식물 세포에 관한 것이다.

    추가 실시양태에서, 본 개시내용은 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 및/또는 식물 세포를, 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환시키고; 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 생성하도록 상기 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 글리포세이트에 대해 저항성인 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자 및/또는 식물 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.

    실시양태는 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.

    특별한 예는 서열 1과 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.

    기타 실시양태는 서열 2 또는 서열 3과 90% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 예를 들어, 벡터는 서열 2 또는 서열 3과 90% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

    실시양태는 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 글리포세이트 내성 식물 및 식물 세포를 포함한다.

    부가 실시양태는 글리포세이트 저항성 식물을 함유하는 경작지 또는 경작 구역에서 잡초를 방제하는 방법을 포함하는데, 이러한 방법은 서열 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 종자를 경작지 또는 경작 구역 내에 심고; 이러한 경작지 또는 경작 구역에, 상기 식물에 상당한 영향을 미치지 않으면서 이 경작지에서 잡초를 방제하기에 충분한 양의 글리포세이트를 적용하는 것을 포함할 수 있다.

    일부 실시양태에서, 본 개시내용은 글리포세이트에 대해 저항성인 식물의 조직 배양에 사용하기 위한 재생 가능한 세포에 관한 것이다. 이러한 조직 배양은 전술된 글리포세이트-저항성 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생시킬 수 있고, 또한 전술된 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생시킬 수 있다. 상기 조직 배양에서 재생 가능한 세포는, 예를 들어 배아, 원형질체, 분열 조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리 및 줄기일 수 있다. 특별한 실시양태는 상기 개시내용의 실시양태의 조직 배양으로부터 재생된 식물에 관한 것이다.

    일부 실시양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 글리포세이트에 대해 저항성인 식물 세포주를 생성하는 데 사용하기 위한, 식물을 생성하도록 재생 가능하지 않은 세포에 관한 것이다. 기타 실시양태에서, 본 개시내용은 부분적으로 이러한 세포를 포함하는 식물에 관한 것이다.

    특정 실시양태에서, 본 개시내용은 경작 구역 내에 심은 작물에 다수의 제초제를 적용하는 것에 관한 것이다. 다수의 제초제를 적용하는 것에 덧붙여 글리포세이트를 맨 위에 적용하는 것은 상이한 제초제 특성을 활용하는 것이기 때문에, 그러한 잡초 방제는 융통성과 경제성 측면 둘 다에 있어서 개선된 조합을 제공하였다. 예를 들어, 개개의 제초제는 경작 구역 내에서 서로 상이한 수명을 지니고 있는데, 즉 일부 제초제는 이들을 상기 구역에 적용한 후에도 비교적 장시간 동안 지속적으로 유효한 반면, 기타 제초제는 다른 화합물 및/또는 비-활성 화합물로 신속하게 붕괴된다. 특별한 실시양태에 따르는 개선된 제초제 적용 시스템은 글리포세이트와 다수의 제초제의 사용을 허용하기 때문에, 재배자는 특별한 상황에 사용하기 위한 특별한 제초제의 선별을 조정할 수 있다.

    기타 실시양태에서, 본 개시내용은 다음에 기재되는 바와 같은 1종 초과의 제초제 또는 제초제 부류 또는 아부류에 대해 내성인 식물을 제조 및 사용하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 특별한 실시양태에서, 글리포세이트와 1종 이상의 기타 제초제 (또는 제초제 부류 또는 아부류) 또는 화학물질 (또는 또 다른 화학물질의 부류 또는 아부류) (예를 들어, 살진균제, 살충제, 식물 성장 조절제 등) 둘 다에 대해 내성인 식물이 제공된다. 이러한 식물은, 예를 들어 농작물을 다수의 제초제로 처리하는 것을 포함하는 방법에 사용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 제초제 또는 제초제의 조합물 (각각 상이한 작용 방식을 통하여 작용하는 제초제의 조합물 포함), 또는 1종 이상의 제초제와 1종 이상의 기타 화학물질 (살진균제, 살충제, 식물 성장 조절제 등 포함)의 조합물로의 처리에 내성인, 제초제 저항성 식물을 제공한다. 이러한 방식으로, 본 개시내용은 잡초를 선택적으로 방제하는, 농작물을 기르는 개선된 방법을 기재하고 있다.

    한 실시양태에서, 제초제 저항성 식물은 글리포세이트에 대한 내성을 부여해주는 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 내성을 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 전술된 내용에 따르면, 제초제 내성 형질; 곤충 저항성 형질; 작물학적 형질; 질환 저항성 형질; 변형된 지방산 형질; 또는 감소된 피테이트 형질로 이루어진 군으로부터 선택된 형질을 식물에 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 제3의 핵산 분자를 포함하는 식물이 제공된다.

    또 다른 실시양태에서, 제초제-저항성 식물은 글리포세이트에 대한 내성을 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산 분자, 및 글루포시네이트에 대한 내성을 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 예는 제초제 내성 형질, 곤충 저항성 형질, 작물학적 형질, 질환 저항성 형질, 변형된 지방산 형질, 또는 감소된 피테이트 형질을 식물에 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 제3의 핵산 분자를 포함하는 제초제-저항성 식물을 포함한다.

    또 다른 실시양태에서, 제초제 저항성 식물은 글리포세이트에 대한 내성을 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 효소 (문헌 [Miki et al., 1990 Theor . Appl . Genet . 80:449] 참조)로서 공지되기도 한 아세토락테이트 신타제 (ALS) (문헌 [Lee et al., 1988 EMBO J . 7:1241] 참조)를 억제하는 제초제에 대한 내성을 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 추가로, 제초제 내성 형질, 곤충 저항성 형질, 작물학적 형질, 질환 저항성 형질, 변형된 지방산 형질, 또는 감소된 피테이트 형질을 식물에 부여해주는 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 제3의 핵산 분자를 포함하는 식물이 제공된다.

    또 다른 실시양태에서, 임의의 핵산 분자가 임의의 다른 핵산 분자와 조합되거나 "스택되어(stacked)" 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 부가의 저항성 또는 내성을 제공하고/하거나, 선택 곤충 또는 질환에 대한 저항성 및/또는 영양 향상, 및/또는 개선된 작물학적 특징, 및/또는 사료, 식품, 산업, 약제 또는 기타 용도에 유용한 기타 생성물 또는 단백질을 제공할 수 있다. 실시양태는 식물 게놈 내에 둘 이상의 관심 핵산 서열을 스태킹(stacking)하는 것을 포함한다. 이러한 스택은 2가지 이상의 사건을 이용하여 통상적으로 식물 육종시키거나, 관심 서열을 함유하는 구조물로 식물을 형질전환시키거나, 트랜스제닉(transgenic) 식물을 재-형질전환시키거나, 또는 상동 재조합을 통한 표적화 통합을 통하여 새로운 형질을 부가함으로써 달성할 수 있다. 이러한 스택의 특정 예는 다음의 임의의 조합이다: dgt -14 핵산 분자, Cry34Ab1 핵산 분자, Cry35Ab1 핵산 분자, Cry1F 핵산 분자, Cry1Ac 핵산 분자, aad -12 핵산 분자, aad -1 핵산 분자, pat 핵산 분자, 및 DSM-2 핵산 분자.

    상기 언급된 예시 양태 및 실시양태 이외에도, 추가 양태 및 실시양태가 다음 설명을 연구함으로써 명백해질 것이다.

    도 1은 DGT-14 (서열 46), DGT-11 (서열 47), DGT-12 (서열 49), DGT-18 (서열 50), DGT-29 (서열 53), 및 DGT-30 (서열 52)을 기타 EPSP 신타제 효소, 예컨대 grg-23 (서열 54; 미국 특허 번호 7,834,249로부터 유래됨), 애그로박테륨 투메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens )로부터의 CP4 (서열 48; GENBANK ACC NO: AEM75108.1), 브라시카 나푸스 ( Brassica napus )로부터의 DGT-3 (서열 57; GENBANK ACC NO: P17688), 글리시네 맥스 ( Glycine max )로부터의 DGT-1 (서열 56), 트리티쿰 애스티붐 ( Triticum aestivum )으로부터의 DGT-7 (서열 55; GENBANK ACC NO: EU977181), 및 에스케리챠 콜라이 ( Escherichia coli )로부터의 aroA (서열 51; 문헌 [Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)] 참조)와 부분 서열 정렬시킨 것을 도시한 것이다. 6개 모든 DGT 효소 (DGT-14, DGT-11, DGT-12, DGT-18, DGT-30, 및 DGT-29)는 aroA EPSP 신타제 효소 아미노산 위치 96에서 보존된 알라닌을 공유하고 있다. 이러한 아미노산의 위치는 별표로써 표시되고, 아미노산 잔기는 밑줄쳐져 있다.
    도 2는 글리시네 맥스로부터의 DGT-1 (서열 59), 브라시카 나푸스로부터의 DGT-3 (서열 58; GENBANK ACC NO: P17688), 및 트리티쿰 애스티붐으로부터의 DGT-7 (서열 60; GENBANK ACC NO: EU977181)의 전장(full length) 효소의 정렬을 도시한 것이다. 글리신에서 알라닌으로 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치는 첫 번째 별표로써 표시된다. 트레오닌에서 이소루이신으로 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치는 두 번째 별표로써 표시된다. 프롤린에서 세린으로 돌연변이된 세 번째 아미노산 잔기의 위치는 세 번째 별표로써 표시된다.
    도 3은 pDAB100427의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 4는 pDAB102946의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 5는 pDAB100431의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 6은 pDAB100432의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 7은 pDAB100435의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 8은 pDAB100446의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 9는 pDAB100436의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 10은 1 mM PEP를 이용하여 DGT-1 (A) 및 DGT-7 (B) 내에 각종 돌연변이를 도입한 후에 수득한 IC 50 값을 도시한 것이다. A IC 50 곡선과 B IC 50 곡선 둘 다에 대해, 흑색 삼각형은 야생형을 나타내고, 흑색 원은 GA 돌연변이체를 나타내며, 백색 사각형은 GAPS 돌연변이체를 나타내고, 흑색 사각형은 TIPS 돌연변이체를 나타낸다.
    도 11은 pDAB107526의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 12는 pDAB102787의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 13은 pDAB105525의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 14는 pDAB105526의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 15는 pDAB105527의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 16은 pDAB105528의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
    도 17은 pDAB105529의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.

    발명을 실시하기 위한 방식(들)

    본원에 개시된 코돈-최적화 dgt -14 핵산 분자는 글리포세이트 제초제 저항성을 식물에 사용할 수 있는 광범위하게 다양한 적용에 유용하다.

    글리포세이트에 대해 저항성 또는 내성인 식물을 언급하는 경우, 이는 식물에 충분한 양의 글리포세이트를 적용하는 것이 이러한 식물에 상당한 영향을 미치지 않거나 사멸시키지 않는다는 것을 의미한다. 식물은 특별한 제초제에 대해 자연적으로 내성일 수 있거나 또는 식물은, 예를 들어 선택적으로 육종하거나 또는 트랜스유전자를 식물 게놈 내에 도입하는 것과 같이 사람의 수작업에 따른 결과로서 제초제 내성일 수 있다. "글리포세이트 저항성 식물"은 하기 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 발현하는 식물 또는 기타 유기체에 제초제 내성을 부여해주는 (즉, 식물 또는 기타 유기체를 제초제-내성으로 만드는) 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 함유하는 식물이다. 글리포세이트에 대해 저항성이거나 내성인 식물은 글리포세이트를 식물에 적용한 것으로부터 일부 최소한의 충격을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 식물의 정상적인 성장 및 발생에 있어 변경이 있을 수 있는데, 이때 식물은 스트레스 또는 질환과 연관되는 징후 또는 증상을 나타낼 수 있다. 글리포세이트에 대해 저항성이거나 내성인 식물에 글리포세이트를 적용할 경우에 비롯되는 상기 최소한의 충격은 글리포세이트에 대해 감수성인 식물에 글리포세이트를 적용할 경우에 비롯되는 부정적인 충격과 대비된다. 감수성 식물에 글리포세이트를 적용하는 것은 식물에 상당한 영향을 미칠 수 있거나 식물을 사멸시킬 수도 있다. 내성을 부여해주는 핵산 분자를 포함하는 식물에 글리포세이트를 적용하는 것은, 글리포세이트에 대한 내성을 부여해주는 핵산 분자를 포함하지 않은 식물에 적용하는 것 보다 상당히 덜한 충격을 준다.

    따라서, 식물이 적당한 대조군 식물과 비교해서, 이러한 대조군 식물에 의해 나타난 손상보다 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 또는 그 초과 정도로 적게 손상을 나타내는 경우에, 이러한 식물은 제초제 또는 기타 화학물질에 대해 내성이 있다. 이러한 방식으로, 제초제 또는 기타 화학물질에 대해 내성이 있는 식물은 적당한 대조군 식물과 비교해서 개선된 내성을 보여준다. 제초제 또는 기타 화학적 처리로부터 비롯되는 손상은 당업자에 의해 적합하게 수행된 식물 성장 또는 웰빙의 임의의 파라미터를 평가함으로써 산정한다. 손상은 육안으로 검사하고/하거나 개개의 식물 또는 식물 군의 적합한 파라미터를 통계학적으로 분석함으로써 산정할 수 있다. 따라서, 손상은, 예를 들어 식물 높이, 식물 중량, 잎 색상, 잎 길이, 개화, 생식력, 출사(silking), 수율, 종자 생산 등과 같은 파라미터를 평가함으로써 산정할 수 있다. 손상은 또한, 특별한 발생 단계 (예를 들어, 출사, 개화 또는 화분 방출)까지 소요되는 시간, 또는 식물이 특별한 화학물질 및/또는 제초제로의 처리로부터 회수될 때까지 소요된 시간을 평가함으로써 산정할 수 있다.

    이와 같이 산정하는 데 있어서, 특별한 값이 특별한 손상 정도에 배정될 수 있기 때문에, 통계학적 분석 또는 정량적 비교를 할 수 있다. 특별한 손상 정도를 설명하기 위해 일정 범위의 값을 사용하는 것은 당해 분야에 공지되어 있고, 적합한 어떠한 범위 또는 규모도 사용할 수 있다. 예를 들어, 제초제 피해 스코어 (내성 스코어로 불리기도 함)를 배정할 수 있다. 상기 표시된 바와 같이, 제초제 내성은 이러한 규모의 다른 평가로써 표시되기도 하는데, 여기서는 적당한 대조군 식물이 규모상 보다 낮은 스코어를 나타내거나 또는 적당한 대조군 식물 군이 제초제 처리에 반응하여 대상체 식물 군 보다 통계학상 더 낮은 스코어를 나타낸다.

    제초제 또는 기타 화학물질에 의해 야기된 손상은 식물을 제초제로 처리한 후 각종 시점에서 산정할 수 있다. 종종, 손상은 대조군 식물이 최대 손상을 나타내는 대략적인 시점에서 산정한다. 종종, 손상은 제초제 또는 기타 화학물질로 처리하지 않은 대조군 식물이 이러한 처리를 수행한 시기의 크기 또는 단계와 비교해서 측정 가능하게 성장하였고/하였거나 발달한 기간 후에 산정한다. 손상은 시험 식물을 제초제로 처리한 후 각종 시점, 예를 들어 12시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일, 또는 3주, 4주, 또는 그 보다 긴 시간으로 산정될 수 있다. 시험 및 대조군 식물의 처리에 반응한 차이점을 탐지할 수 있게 하는 한은 어떠한 산정 시점도 적합하다.

    특정 제초제가 식물에 대해 전혀 효과를 나타내지 않는 경우, 또는 이러한 식물이 나중에 회수되는 식물에 대해 일부 효과를 나타내는 경우 또는 유해하긴 하지만, 예를 들어 잡초에 대한 특별한 제초제의 충격에 의해 상세되는 효과를 나타내는 경우, 이러한 제초제는 식물에 "상당한 영향을 미치지" 않는다. 따라서, 예를 들어, 특정 농작물이 식물 건강 및/또는 생산성의 지표인 하나 이상의 적합한 파라미터에 있어서, 적당한 대조군 식물 (예를 들어, 처리되지 않은 농작물)과 비교해서 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 감소를 나타내는 경우, 이러한 농작물은 제초제 또는 기타 처리에 의해 "상당한 영향을 받지" 않는다. 식물 건강 및/또는 생산성의 지표인 적합한 파라미터는, 예를 들어 식물 높이, 식물 중량, 잎 길이, 특별한 발생 단계까지 소요되는 시간, 개화, 수율, 종자 생산 등을 포함한다. 파라미터의 평가는 육안 검사 및/또는 적합한 임의의 파라미터의 통계학적 분석에 의할 수 있다. 비교는 육안 검사 및/또는 통계학적 분석에 의해 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 농작물이 하나 이상의 파라미터에 있어서 감소를 나타내긴 하지만, 이러한 감소가 사실상 일시적이고 식물이 1주, 2주, 3주, 4주 또는 6주 이내에 완전히 회복되는 경우에는, 이러한 농작물이 제초제 또는 기타 처리에 의해 "상당한 손상을 입지" 않는다.

    역으로 말하면, 식물이 식물 건강 및/또는 생산성의 지표인 하나 이상의 적합한 파라미터에 있어서, 적당한 대조군 식물 (예를 들어, 동일한 종의 처리되지 않은 잡초)과 비교해서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 150%, 또는 170% 초과의 감소를 나타내는 경우, 이러한 식물은 제초제 또는 기타 처리에 의해 상당한 영향을 받거나 손상을 입는다. 따라서, 식물이 하나 이상의 파라미터에서 감소를 나타내고 이러한 식물이 1주, 2주, 3주, 4주 또는 6주 이내에 완전히 회복되지 않는 경우에는, 상기 식물이 상당히 손상된 것이다.

    제초제 또는 기타 화학물질 처리로부터 비롯된 식물의 손상은 당업자에 의해 기타 적당한 방법의 육안 검사에 의해 산정하고, 적합한 파라미터의 통계학적 분석에 의해 평가한다. 평가되는 식물은 "시험 식물"로서 지칭된다. 전형적으로, 적당한 대조군 식물은 제초제 내성에 관하여 평가받고 있는 식물 (즉, "시험 식물")과 동일한 제초제-내성 폴리펩티드(들)를 발현하긴 하지만, 제초제로 처리된 적이 없는 것이다.

    달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련된 분야에서 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 본 출원 (정의 포함)이 통제할 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본원에서 언급된 모든 공개공보, 특허 및 기타 참고 문헌은 특허 또는 특허 공개공보의 특정 섹션만이 참조로 포함된다고 표시되지 않는 한은, 각각의 개별적 공개공보 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고도 개별적으로 표시되는 것처럼 모든 목적을 위해 그들의 전문이 참조로 포함된다.

    본 개시내용을 추가로 명확히 하기 위해, 다음 용어, 약어 및 정의가 제공된다.

    본원에 사용된 용어 "포함하는", "갖는" 또는 "함유하는", 또는 그의 기타 모든 변이는 배타적이지 않거나 또는 제한을 두지 않을 것이다. 예를 들어, 요소 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품 또는 장치는 반드시 이들 요소로만 제한되는 것이 아니라, 명확하게 열거하지 않았거나 또는 상기 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품 또는 장치에 고유한 기타 요소들을 포함할 수도 있다. 추가로, 달리 명확하게 언급하지 않는 한, "또는"은 포괄적인 '또는'을 지칭하는 것이지, 배타적인 '또는'을 지칭하는 것은 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 어느 하나에 의해 만족된다: A는 참이고 (또는 존재하고) B는 거짓이며 (또는 존재하지 않으며), A는 거짓이고 (또는 존재하지 않고) B는 참이며 (또는 존재하며), A와 B 둘다가 참이다 (또는 존재한다).

    본 개시내용의 실시양태의 요소 또는 성분에 선행하는 부정관사 "a" 및 "an"은 예의 개수, 요소 또는 성분의 개수에 관해 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서 "a" 또는 "an"은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 판독해야 하고, 요소 또는 성분의 단수 형태는 그 숫자가 명백하게 단수를 의미하지 않는 한 복수를 포함하기도 한다.

    본원에 사용된 바와 같은 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비-제한적 용어이고, 특별한 발명의 임의의 단일 실시양태를 지칭하기 위한 것이 아닐 뿐만 아니라 본 출원에 개시된 바와 같은 가능한 모든 실시양태를 포괄한다.

    "제초제"는 식물에게 일시적 또는 영구적 피해를 유발시키는 화학물질이다. 본 개시내용의 각종 방법 및 조성물에 이용될 수 있는 제초제의 비-제한적 예는 본원의 다른 곳에서 추가로 상세히 논의된다. 제초제를 식물 내로 혼입할 수 있거나, 또는 이것을 식물 또는 그의 세포 내로 혼입시키지 않고서 식물에 대해 작용할 수 있다. "활성 성분"은 제초제의 식물 독성에 대해 주로 책임이 있는 제초제 제제 내의 화학물질이고, 이는 제품 라벨에 있는 활성 성분으로서 확인되는 것이다. 제품 라벨 정보는 미국 환경 보호 기구로부터 이용가능하고, oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own에서 온라인으로 업데이트되며; 제품 라벨 정보는 또한, www.cdms.net에서 온라인으로 이용가능하다. 용어 "산 당량"은 제초제성 활성 모 산으로서의 비율 또는 양을 나타낸다.

    본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물"은 식물의 어떠한 후손, 세포, 조직 또는 부분도 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산, 핵산 단편, 변이체 또는 그의 유도체, 또는 구조물, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 포괄하기 위한 것이다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편 (비번역 5' 및 3' 서열 및 암호화 서열 포함)을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 어떠한 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA; 단일 가닥 또는 보다 전형적으로, 이중 가닥일 수 있거나 또는 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 이들 용어는 또한, 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 포괄한다.

    폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 이것이 그의 천연 환경으로부터 제거된 경우에는 "단리된" 것으로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 벡터 내에 함유된 글리포세이트 내성 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 추가 예는 이종 숙주 세포 내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드, 또는 용액 중의 정제된 (부분적 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 포함한다. 본 개시내용의 실시양태에 따르는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기 분자를 추가로 포함한다. DNA의 중합체 형태의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 구성될 수 있다.

    용어 "유전자"는 암호화 서열 이전 (5' 비-암호화 서열) 및 다음 (3' 비-암호화 서열)의 조절 서열을 임의로 포함한, RNA 또는 단백질인 기능성 생성물 분자를 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다.

    본원에 사용된 용어 "암호화 영역"은 특이적 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. "적합한 조절 서열"은 암호화 서열의 상류 (5' 비-암호화 서열), 암호화 서열 이내에, 또는 암호화 서열의 하류 (3' 비-암호화 서열)에 위치하고, 관련된 암호화 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 효과기 결합 부위 및 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다.

    본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단수 "폴리펩티드" 뿐만 아니라 복수 "폴리펩티드" 및 그의 단편을 포괄하기 위한 것이고, 아미드 결합 (펩티드 결합으로서 공지되기도 함)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 모든 쇄(들)를 지칭하고, 구체적 길이의 생성물을 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄(들)를 지칭하기 위해 사용된 기타 어떠한 용어도 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 중 어느 것과도 상호 교환적으로 사용될 수 있거나 이들 용어 대신 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학적 합성을 포함한 어떠한 방식에 의해서도 생성될 수 있다.

    "단리된" 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 자연 환경 내에 있지 않은 폴리펩티드일 것이다. 특별한 수준의 정제가 요구되지 않는다. 따라서, "단리된"에 대한 언급은 본원에 기재된 바와 같이 "사람의 수작업"이 관여한 것을 의미한다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합 폴리펩티드 및 단백질은 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 간주되는데, 이들은 적합한 어떠한 기술에 의해서도 분리되거나, 분획화되거나, 또는 부분적 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드이기 때문이다.

    본원에 사용된 "천연"은 존재할 경우, 그의 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드의 형태를 지칭한다.

    본원에 사용된 "내인성"은 유기체 내의 또는 유기체의 게놈 내의 그의 자연 위치에 있는 천연 형태의 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "내인성 폴리뉴클레오티드"은 유기체의 게놈 내의 그의 자연 위치에 있는 천연 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 그의 자연 위치에 있는 천연 유전자를 포함한다. "내인성 폴리펩티드"는 유기체 내의 그의 자연 위치에 있는 천연 폴리펩티드를 포함한다.

    본원에 사용된 "이종"은 숙주 유기체 내에 정상적으로는 발견되지 않지만, 숙주 유기체 내로 도입되는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "이종 폴리뉴클레오티드"는 상응하는 천연 폴리뉴클레오티드와는 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입되는 천연 암호화 영역 또는 그의 일부를 포함한다. "이종 유전자"는 상응하는 천연 유전자와는 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입되는 천연 암호화 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 예를 들어, 이종 유전자는 천연 숙주 내로 재도입되는 비-천연 조절 영역을 포함한 키메라 유전자의 일부인 천연 암호화 영역을 포함할 수 있다. "이종 폴리펩티드"는 상응하는 천연 폴리펩티드와는 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입되는 천연 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 대상 유전자 및 단백질을 다른 유전자 및 단백질과 융합시켜 키메라 또는 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 본 발명의 개시내용의 실시양태에 따라서 유용한 유전자 및 단백질은 구체적으로 예시된 전장 서열뿐만 아니라 이들 서열, 그의 변이체, 돌연변이체, 키메라 및 융합물의 일부, 절편 및/또는 단편 (연속되는 단편, 및 전장 분자와 비교해서 내부 및/또는 말단 결실물 포함)을 포함한다.

    본원에 사용된 용어 "변형"은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 저하되거나, 실질적으로 제거되거나 또는 제거된 활성을 가져다주는, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 상의 변화뿐만 아니라 폴리펩티드의 저하되거나, 실질적으로 제거되거나 또는 제거된 활성을 가져다주는, 본원에 개시된 폴리펩티드 상의 변화를 지칭할 수 있다. 또 다른 한편, 용어 "변형"은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 증가되거나 증강된 활성을 가져다주는, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 상의 변화뿐만 아니라 폴리펩티드의 증가되거나 증강된 활성을 가져다주는, 본원에 개시된 폴리펩티드 상의 변화를 지칭할 수 있다. 이러한 변화는 결실, 돌연변이 (예를 들어, 자발적 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, 돌연변이 유발 유전자에 의해 야기된 돌연변이 유발, 또는 트랜스포손(transposon) 돌연변이 유발), 치환, 삽임, 하향-조절, 세포내 위치 변경, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상태 변경 (예를 들어, 메틸화, 인산화 또는 유비퀴틴화), 조인자의 제거, 안티센스 RNA/DNA의 도입, 간섭 RNA/DNA의 도입, 화학적 변형, 공유 변형, 자외선 또는 X-선으로의 조사, 상동 재조합, 유사분열 재조합, 프로모터 대체 방법, 및/또는 그의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 변형시킬 수 있는 지를 결정하는 데 있어서의 지침은 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 효모 또는 세균성)의 서열과 비교하고, 고 상동성 영역 (보존된 영역) 또는 컨센서스 서열 내에서 수행된 변형 수를 최대화함으로써 알아낼 수 있다.

    본원에 사용된 용어 "유도체"는 본 발명의 개시내용에 제시된 서열의 변형을 지칭한다. 이러한 변형의 예시는 작물 종 내에 본원에 개시된 암호화 서열의 기능을 보유하거나, 약간 변형시키거나 또는 증가시키는, 본원에 개시된 암호화 서열의 핵산 서열과 관계된 1개 이상의 염기의 치환, 삽입 및/또는 결실일 것이다. 이러한 유도체는, 예를 들어 서열 구조를 예측하고 최적화하기 위한 컴퓨터 모델링 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 따라서, 용어 "유도체"는 본원에 개시된 암호화 서열과 상당한 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하므로, 이들은 본 발명의 개시내용의 실시양태의 DGT-14를 생성하는 데 사용하기 위한 상기 개시된 작용기를 가질 수 있다.

    본원에 사용된 용어 "변이체"는, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 예컨대 돌연변이 유발을 이용하여 창출된 아미노산 삽입, 결실, 돌연변이 및 치환에 의해 본 개시내용의 실시양태의 구체적으로 인용된 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 관심 활성을 파괴하지 않으면서 아미노산 잔기를 대체, 부가 또는 결실시킬 수 있는지를 결정하는 데 있어서의 지침은 특별한 폴리펩티드의 서열을 상동 폴리폴리펩티드의 서열과 비교하고, 고 상동성 영역 (보존된 영역)에서 수행된 아미노산 서열 변화 수를 최소화하거나 또는 아미노산을 컨센서스 서열로 대체함으로써 알아낼 수 있다. 본 발명의 개시내용의 실시양태의 단백질은 이들이 목적하는 기능적 활성을 보유하고 있는 한은 치환된 아미노산을 가질 수 있다. "변이체" 유전자는 예시된 단백질과 동일한 단백질, 또는 예시된 단백질과 등가 또는 유사한 활성을 갖는 등가 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

    용어 "변이체 단백질" 및 "등가 단백질"은 표적 기질 및 등가 서열에 대항하여, 예시된 단백질과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 생물학적/기능적 활성을 갖는 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 "등가" 서열에 대한 언급은 상당한 정도로 활성에 불리한 영향을 미치지 않거나 또는 활성을 개선시키는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 서열을 지칭한다. 활성을 보유하고 있는 단편이 또한, 이러한 정의에 포함된다. 예시된 단백질의 상응하는 단편과 동일하거나 유사한 기능 또는 활성을 보유하고 있는 단편 및 기타 등가물이 본 발명의 개시내용의 실시양태의 범위 내에 있다.

    변이체 유전자를 사용하여 변이체 단백질을 생성할 수 있고; 재조합 숙주를 사용하여 변이체 단백질을 생성할 수 있다. 이들 "유전자 셔플링(gene shuffling)" 기술을 이용하여, 본원에 예시된 임의의 서열의 5, 10 또는 20개의 인접한 잔기 (아미노산 또는 뉴클레오티드)를 포함하는 등가 유전자 및 단백질을 구축할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 유전자 셔플링 기술은, 예를 들어 예시되거나 제안된 서열 (또는 그의 보체 (완전 보체)) 중 임의의 서열 내의 절편 (동일한 크기의 절편)에 상응하는, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 또는 293개의 인접한 잔기 (아미노산 또는 뉴클레오티드)를 갖는 등가물을 수득하도록 조정할 수 있다. 유사한 크기의 절편, 특히 보존된 영역에 대한 절편을 또한 프로브 및/또는 프라이머로서 사용할 수 있다.

    "셔플링" 전략은 관심 단백질의 결정 구조 및 원자 3-D (3차원) 좌표를 수득 및 조사한 후에 설계하고 표적화할 수 있다. 따라서, "초점을 맞춘 셔플링"은 변형시키기에 이상적인 단백질의 특정 절편, 예컨대 표면-노출된 절편을 겨냥할 수 있고, 바람직하게는 단백질 폴딩 및 본질적 3-D 구조적 완전성과 관련되는 내부 절편은 아니다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,605,793에는 무작위 또는 초점을 맞춘 단편화 후에 DNA 리어셈블리를 사용함으로써 부가의 분자 다양성을 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 이는 전형적으로, 2개 이상의 상이한 DNA 분자의 단편 (목적하는 크기의 단편)을 혼합한 다음, 복원 주기를 반복하는 것을 포함하는 유전자 "셔플링"으로서 지칭될 수 있다. 이는 출발 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 개선시킬 수 있다. 그 결과는 개선된 활성, 변경된 기질 특이성, 증가된 효소 안정성, 변경된 입체 특이성, 또는 기타 특징을 갖는 키메라 단백질이다.

    아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체시킨 (즉, 보존적 아미노산 대체) 결과일 수 있거나, 또는 이는 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체시킨 (즉, 비-보존적 아미노산 대체) 결과일 수 있다. 아미노산은 다음 부류로 분류할 수 있다: 비-극성, 전하를 띠지 않는 극성, 염기성 및 산성. "보존적" 아미노산 치환은 관여한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 또는 양친매성 성질에 있어서의 유사성을 기준으로 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 글리신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며; 양전하를 띤 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음전하를 띤 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

    또 다른 한편, "비-보존적" 아미노산 치환은 이들 아미노산 중 어느 것의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 또는 양친매성 성질에 있어서의 차이를 선택함으로써 수행될 수 있다. "삽입" 또는 "결실"은 재조합 단백질에 의해 구조적으로 또는 기능적으로 관용되기 때문에 변이 범위 이내일 수 있다. 허용된 변이는 재조합 DNA 기술을 이용하여 폴리펩티드 분자 내에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 조직적으로 수행한 다음, 이로써 생성되는 재조합 변이체를 대상으로 하여 활성에 관하여 검정함으로써 실험적으로 결정할 수 있다.

    효소의 "활성 부위"에 대한 특이적 변화는 활성 또는 입체 특이성에 대하여 고유 기능성에 영향을 미치도록 이루어질 수 있다 (문헌 [Muller et. al., "Structural basis for the enantiospecificities of R- and S-specific phenoxypropionate/alpha-ketoglutarate dioxygenases," Protein Sci . (2006)] 참조). 예를 들어, 공지된 tauD 결정 구조를 모델 디옥시게나제로서 사용하여, 그의 고유 기질 타우린과 결합되어 있는 동안 활성 부위 잔기를 결정하였다 (문헌 [Elkins et al. (2002) "X-ray crystal structure of Escherichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates," Biochemistry 41(16):5185-5192] 참조). 효소 활성 부위의 설계 가능성 및 서열 최적화에 관해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다 (문헌 [Chakrabarti et al., PNAS (Aug. 23, 2005), 102(34):12035-12040] 참조).

    단백질의 각종 특성 및 3차원적 특색은 또한, 이러한 단백질의 활성/기능성에 불리한 영향을 미치지 않으면서도 변화시킬 수 있다. 상기 분자의 활성 및/또는 3차원적 입체배치에 불리한 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환을 용인하고/만들 수 있다. 아미노산은 다음 부류로 분류할 수 있다: 비-극성, 전하를 띠지 않는 극성, 염기성 및 산성. 한 부류의 아미노산을 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 대체하는 보존적 치환은, 이러한 치환이 화합물의 생물학적 활성에 불리하지 않는 한은 본 발명의 개시내용의 실시양태의 범위 내에 속한다. 서열 수준에서는 상이하지만, 동일하거나 유사한 전체 본질적 3차원적 구조, 표면 전하 분포도 등을 보유하고 있는 변이체 단백질을 설계할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 7,058,515]; [Larson et al., Protein Sci . 2002 11: 2804-2813, "Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles"]; [Crameri et al., Nature Biotechnology 15, 436-438 (1997), "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling"]; [Stemmer, WPC1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 91: 10747-10751]; [Stemmer, WPC1994. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370: 389-391]; [Stemmer, WPC1995. Searching sequence space. Bio / Technology 13: 549-553]; [Crameri, A., Cwirla, S. and Stemmer, WPC1996. Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling. Nature Medicine 2: 100-103]; 및 [Crameri, A., Whitehorn, EA, Tate, E. and Stemmer, WPC 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319] 참조).

    DGT-14 (합성 헤어핀)에 가장 적합한 5' 또는 3' UTR의 컴퓨터를 이용한 설계는 또한, 본 발명의 개시내용의 실시양태의 범위 내에서 수행할 수 있다. 일반적으로 컴퓨터 모델링뿐만 아니라 유전자 셔플링 및 지향 진화는 본원의 다른 곳에서 논의된다. 컴퓨터 모델링 및 UTR에 관해서 보다 구체적으로, 본 발명의 개시내용에 따라서 5' 및 3' UTR 유도체를 예측/평가하는 데 사용하기 위한 컴퓨터 모델링 기술은 제네틱스 코포레이션 그룹 (Genetics Corporation Group; 미국 위스콘신주 매디슨)으로부터 입수 가능한 MFoId 버전 3.1 (문헌 [Zucker et al., "Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide," in RNA Biochemistry and Biotechnology , 11-43, J. Barciszewski & BFC Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999)]; [Zucker et al., "Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure," J. Mol . Biol . 288, 911-940 (1999)]; [Zucker et al., "RNA Secondary Structure Prediction," in Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry , S. Beaucage, DE Bergstrom, GD Glick, and RA Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)] 참조); 원시 코드로서 자유롭게 배포되고 웹사이트 genetics.wustl.edu/eddy/software/에 접근함으로써 다운로드받을 수 있는 COVE (공분산 모델을 이용한 RNA 구조 분석 (확률 문맥 자유 문법 방법)) v.2.4.2 (문헌 [Eddy & Durbin, Nucl . Acids Res . 1994, 22: 2079-2088] 참조); 및 또한, 자유롭게 배포되고 웹사이트 bioinf.au.dk. FOLDALIGN/에서 다운로드받기 위해 이용 가능한 FOLDALIGN (문헌 ["Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences," J. Grodkin, LJ Heyer and GD Stormo. Nucleic Acids Research , Vol. 25, no. 18 pp. 3724-3732, 1997]; ["Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences," J. Gorodkin, LJ Heyer, and GD Stormo. ISMB 5;120-123, 1997] 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    전장 유전자의 단편은 표준 과정에 따라서 시판중인 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 이용하여 만들 수 있다. 예를 들어, Bbs I 와 같은 효소 또는 부위-유도 돌연변이 유발을 사용하여 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 조직적으로 절단 제거할 수 있다. 또한, 활성 단편을 암호화하는 부분 유전자는 각종 제한 효소를 이용하여 수득할 수 있다. 프로테아제를 사용하여 이들 단백질의 활성 단편을 직접 수득할 수 있다.

    단백질을 절단할 수 있고 기능적 활성을 여전히 보유하고 있다는 것은 본원에 개시된 바와 같은 개시내용의 실시양태의 범위 내이다. "절단된 단백질"이란, 단백질의 일부가 절단 제거되긴 하지만 나머지 절단된 단백질은 보유되고 있고, 절단 후에도 목적 활성을 나타낼 수 있다는 것을 의미한다. 절단은 각종 프로테아제에 의해 달성될 수 있다. 더우기, 분자 생물학 기술을 이용하여, 효과적으로 절단된 단백질을 생성할 수 있는데, 여기서는 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 분해 또는 당업자에게 이용 가능한 기타 기술을 통하여, 상기 단백질을 암호화하는 DNA 염기를 제거한다. 절단 후, 상기 단백질을 이종 시스템, 예컨대 이. 콜라이 ( E. coli ), 바쿨로바이러스, 식물-이용 바이러스성 시스템, 효모 등에서 발현시킨 다음, 본원에 개시된 바와 같은 제초제 내성 생물학적 검정에 놓아두어 활성을 결정할 수 있다. 절단된 단백질은 전장 전체 서열 보다는 덜하긴 하지만 기능적 활성을 보유하도록 성공적으로 생성될 수 있다는 사실은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Bt 단백질은 절단된 (코어 단백질) 형태로 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hofte et al. (1989), and Adang et al. (1985)] 참조). 본원에 사용된 용어 "단백질"은 기능적으로 활성인 절단물을 포함할 수 있다.

    일부 경우, 특히 식물에서 발현하는 경우, 절단된 단백질을 발현하는 절단된 유전자를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 바람직한 절단된 유전자는 전형적으로, 전장 단백질의 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%를 암호화할 것이다.

    용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 그의 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 또는 자연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경학적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 당업자는 인지하고 있다. 유전자가 대부분의 시간에 대부분의 세포 유형에서 발현되게 해주는 프로모터는 통상적으로 "구성적 프로모터"로서 지칭된다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 규정되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수도 있다는 것을 추가로 인식해야 한다.

    용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록, 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 연합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 특정 암호화 서열의 발현을 수행할 수 있는 경우 (예를 들어, 암호화 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다), 이러한 프로모터는 상기 암호화 서열과 작동가능하게 연결된다. 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.

    본원에 사용된 용어 "발현"은 본 개시내용의 실시양태의 핵산 단편으로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적 축적을 지칭한다. 발현은 또한, mRNA가 폴리펩티드로 번역되는 것을 지칭할 수 있다.

    본원에 사용된 용어 "과발현"은 동일하거나 관련된 유전자의 내인성 발현 보다 더 높은 발현을 지칭한다. 이종 유전자는 그의 발현이 필적하는 내인성 유전자의 발현 보다 더 높을 경우에 과발현된다.

    본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 또는 단편을 숙주 유기체 내로 전이 및 통합시켜, 유전적으로 안정한 유전(inheritance)을 생성시키는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다. 공지된 형질전환 방법은 애그로박테륨 투메파시엔스-매개된 또는 애그로박테륨 리조게네스 ( Agrobacterium rhizogenes )-매개된 형질전환, 인산칼슘 형질전환, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 소노포레이션(sonoporation)), 리포솜 형질전환, 미세주사, 있는 그대로의 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 바이오리스틱스(biolistics) (극미립자 충격), 탄화규소 WHISKERS 매개된 형질전환, 에어로솔 비밍(beaming), 또는 PEG 형질전환 뿐만 아니라 기타 가능한 방법을 포함한다.

    본원에 사용된 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 세포의 중추 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 수반하고, 통상적으로 환상 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 어떠한 공급원으로부터도 유래된, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 환상의, 자기 복제성 서열, 게놈 통합성 서열, 파아지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있는데, 여기서는 수많은 뉴클레오티드 서열이, 적당한 3' 비번역 서열과 함께, 선택된 유전자 생성물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구조물 내로 재조합되거나 이와 연결되어 있었다.

    본원에 사용된 용어 "코돈 축중(codon degeneracy)"은 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용해 주는 유전 코드 상의 본질을 지칭한다. 당업자는 소정의 아미노산을 명시하기 위해 뉴클레오티드 코돈을 활용하는 데 있어서 특이적 숙주 세포에 의해 나타낸 "코돈-편향"을 잘 알고 있다. 따라서, 숙주 세포에서의 개선된 발현을 위해 유전자를 합성하는 경우, 그의 코돈 활용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 활용 빈도에 도달하도록 상기 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.

    용어 "코돈-최적화"는 이것이 각종 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자를 지칭하기 때문에, 상기 용어는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 숙주 유기체의 특유의 코돈 활용을 반영하기 위해 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자 내의 코돈 변경을 지칭한다. 이러한 최적화는 1개 이상, 또는 1개 초과, 또는 상당 수의 코돈을, 그 유기체의 유전자에 보다 빈번하게 사용되는 1개 이상의 코돈으로 대체하는 것을 포함한다.

    어느 폴리펩티드 쇄의 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열 내의 편차는 상기 유전자를 암호화하는 서열 내에서의 변이를 감안한 것이다. 각 코돈은 3개의 뉴클레오티드로 이루어지고, DNA를 포함하는 뉴클레오티드는 4개의 특이적 염기로 제한되기 때문에, 64개의 뉴클레오티드 조합이 가능한데, 이중 61개가 아미노산을 암호화한다 (나머지 3개의 코돈은 번역을 종료하는 신호를 암호화한다). 어느 아미노산을 암호화하는 어느 코돈을 보여주는 "유전 암호"는 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있다. 그 결과, 많은 아미노산이 1개 초과의 코돈에 의해 설계된다. 예를 들어, 아미노산 알라닌 및 프롤린은 4개의 삼중체에 의해 암호화되고, 세린 및 아르기닌은 6개의 삼중체에 의해 암호화되는 반면, 트립토판 및 메티오닌은 단지 1개의 삼중체에 의해 암호화된다. 이러한 축중은 DNA에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 광범위하게 다양하게 하기 위해 DNA 염기 조성을 감안한 것이다.

    많은 유기체는 성장하는 펩티드 쇄 중의 특별한 아미노산의 삽입물을 암호화하기 위해 특별한 코돈을 사용하기 위한 편향을 표시한다. 유기체들 간의 코돈 활용 상의 차이인 코돈 선호도 또는 코돈 편향은 유전 암호의 축중에 의해 부여되고, 이는 많은 유기체 간에도 널리 보고되었다. 코돈 편향은 종종, 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관이 있는데, 이는 결국 특히, 번역되는 코돈의 특성 및 특별한 전이 RNA (tRNA) 분자의 이용 가능성에 좌우되는 것으로 여겨진다. 세포 중에 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로, 펩티드 합성에 가장 자주 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 코돈 최적화에 의거하여 소정의 유기체 내에서의 최적 유전자 발현을 위해 유전자를 조정하거나 설계할 수 있다.

    광범위한 동물, 식물 및 미생물 종에 이용 가능한 다수의 유전자 서열이 제공된다면, 상대적 코돈 활용 빈도를 계산할 수 있다. 코돈 활용 표는, 예를 들어 www.kazusa.or.jp/codon/에서 입수 가능한 "코돈 활용 데이터베이스"에서 용이하게 입수 가능하고, 이들 표는 수많은 방식으로 적응시킬 수 있다 (문헌 [Nakamura et al. Nucl . Acids Res . 28:292 (2000)] 참조). 이러한 표 또는 유사한 표를 이용함으로써, 당업자는 상기 빈도를 어떠한 소정의 폴리펩티드 서열에도 적용하여, 이러한 폴리펩티드를 암호화하지만 소정의 종에 대해 최적의 코돈을 이용하는 코돈-최적화 암호화 영역의 합성 핵산 단편을 설계 및 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 상기 개시내용의 코돈 최적화 형태의 dgt -14 및/또는 기타 보조 단백질에 관한 것이다.

    식물에서 이종 유전자의 고 발현을 수득하기 위해서는, 이들 유전자가 식물 세포에서 보다 효율적으로 발현되도록 상기 유전자를 설계 및 재조작하는 것이 바람직할 수 있고, 특히 세균성 유전자가 쌍떡잎 식물 세포에서뿐만 아니라 외떡잎 식물 세포 둘 다에서 발현되도록 요망하는 경우에 바람직할 수 있다. DGT-14를 암호화하는 야생형 유전자를 단리하였고, 예측되는 아미노산 서열을 암호화하는 천연 뉴클레오티드 서열은 유전자은행 승인 번호 ZP_01452683 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 알아낼 수 있다. 유전자은행 승인 번호 ZP_01452683의 아미노산 잔기 111에서 글리신을 알라닌으로 변형시킨 변형을 포함하는, 상기 암호화된 단백질 서열이 서열 1로서 개시된다.

    본 개시내용의 실시양태는 식물에서 발현하도록 합성 dgt -14 유전자 서열을 설계한, dgt -14의 변형에 관한 것이다. 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 둘 다에서 동일한 DGT-14 단백질을 발현하도록 최적화 dgt -14 유전자를 설계하는 것은 최적의 발현을 위해 상기 유전자의 단백질 암호화 영역을 재조작하는 것과 함께 제시된다. 본원에는 DGT-14 폴리펩티드를 암호화하는 최적화 뉴클레오티드 서열이 기재되어 있다. 이러한 2개의 식물 최적화 dgt -14 뉴클레오티드 서열이 서열 2 및 서열 3에 제시되어 있다. 변형된 뉴클레오티드 서열은 서열 2에 대해서는 쌍떡잎 식물 최적화 dgt -14로서 지칭되거나 또는 서열 3에 대해서는 외떡잎 식물 최적화 dgt -14로서 지칭되고 식물체에서 글리포세이트에 대한 내성을 제공한다.

    서열 2의 dgt -14 핵산 분자를 최적화하여 쌍떡잎 식물에서의 발현을 개선시켰다. 서열 3의 dgt -14 핵산 분자를 최적화하여 외떡잎 식물에서의 발현을 개선시켰다. 외떡잎 식물 활용 및 쌍떡잎 식물 활용 중 어느 하나에 대한 편향을 갖는 코돈에 의해 단백질이 암호화되도록 재설계하였다는 점에서 바람직한 코돈 활용을 근거로 하여 코돈 활용을 선택하였고, 유해한 서열 및 불필요한 제한 부위를 제거하여 DGT-14 폴리펩티드의 전사/번역 효율을 증가시켰고 DNA 조작 단계를 촉진시켰다. 그렇게 함으로써, 식물에서의 DGT-14의 발현이 개선될 것이고, DGT-14는 글리포세이트 적용에 대한 저항성을 제공할 것이다.

    마찬가지로, 서열 4의 dgt -14 (v6) 핵산 분자를 최적화하여 에스케리챠 콜라이에서의 발현을 개선시켰다. 이. 콜라이 활용에 대한 편향을 갖는 코돈에 의해 단백질이 암호화되도록 dgt -14를 재설계하였다는 점에서 바람직한 이. 콜라이 코돈 활용을 근거로 하여 코돈 활용을 선택하였다. 상기와 같이 재설계하는 동안, 유해한 서열 및 불필요한 제한 부위를 제거하여 DGT-14 암호화 서열의 전사/번역 효율을 증가시켰고 DNA 조작 단계를 촉진시켰다. 그렇게 함으로써, 이. 콜라이에서 DGT-14가 발현되면, DGT-14의 효소적 성상 확인을 위한 강건한 단백질 발현이 유발된다.

    당해 분야에 공지된 바와 같은 용어 "퍼센트 동일성" (또는 "% 동일성")은 2개 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들 간의 관계인데, 이는 이들 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라서 폴리펩티드 서열들 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 간의 서열 상관성 정도를 의미하는데, 이는 일련의 상기 서열들 간의 정합물에 의해 결정되는 바와 같다. "동일성" 및 "유사성"은 다음 문헌에 개시된 것을 포함하지만 그에 제한되지 않는, 공지된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다 (문헌 [1.) Computational Molecular Biology (Lesk, AM, Ed.) Oxford University: NY (1988)]; [2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, DW, Ed.) Academic: NY (1993)]; [3.) Computer Analysis of Sequence Data , Part I (Griffin, AM, and Griffin, HG, Eds.) Humania: NJ (1994)]; [4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987)]; 및 [5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991)] 참조).

    핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 특정 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고/하거나 그렇게 함으로써 암호화된 아미노산 서열을 결정하고, 이들 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열을 또한, 이러한 방식으로 결정하고 비교할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응도를 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열)은 그들의 % 동일성을 결정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든 아니면 아미노산 서열이든지 간에, 2개 서열의 % 동일성은 정렬된 2개 서열 간의 정확한 정합물 수를 가장 짧은 서열 길이로 나눈 다음, 100을 곱한 것이다 (문헌 [Russell, R., and Barton, G., "Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds," J. Mol . Biol . 244, 332-350 (1994), at p. 337] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다).

    또한, 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. 서열 정렬 및 % 동일성 계산은, 예를 들어 벡터 NTI ® 스위트(suite)의 AlignX 프로그램 [인비트로젠 (Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)] 또는 LASERGENE 생물 정보학 컴퓨팅 스위트의 MegAlign™ 프로그램 [DNASTAR 인크. (DNASTAR Inc.; 미국 위스콘신주 매디슨)]을 사용하여 수행할 수 있다. 서열의 다중 정렬은 클러스탈 (Clustal) V 표지된 정렬 방법에 상응하는 "클러스탈 V 정렬 방법"을 포함하고 (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS . 5:151-153 (1989)]; [Higgins, DG et al., Comput . Appl . Biosci ., 8:189-191 (1992)]에 기재됨), LASERGENE 생물 정보학 컴퓨팅 스위트의 MegAlign™ 프로그램 (DNASTAR 인크.)에서 알아낸 알고리즘의 몇 가지 변종을 포괄하는 "클러스탈 정렬 방법"을 사용하여 수행한다. 다중 정렬하는 경우, 디폴트 값은 GAP PENALTY=10 및 GAP LENGTH PENALTY=10에 상응한다. 클러스탈 방법을 이용하여 단백질 서열의 % 동일성을 계산하고 쌍을 이뤄 정렬시키기 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. 클러스탈 V 프로그램을 이용하여 서열들을 정렬시킨 후, 동일한 프로그램 내의 "서열 거리" 표를 살펴봄으로써 "% 동일성"을 수득하는 것이 가능하다. 부가적으로, "클러스탈 W 정렬 방법"은 입수 가능하고, 클러스탈 W 표지된 정렬 방법에 상응하며 (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS . 5:151-153 (1989)]; [Higgins, DG et al., Comput . Appl. Biosci . 8:189-191(1992)]에 기재됨), LASERGENE 생물 정보학 컴퓨팅 스위트의 MegAlign™ v6.1 프로그램 (DNASTAR 인크.)에서 알아낼 수 있다. 다중 정렬을 위한 디폴트 파라미터 (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, 지연 분기 서열 (%)=30, DNA 전이 중량=0.5, 단백질 중량 매트릭스=고네트 (Gonnet) 시리즈, DNA 중량 매트릭스=IUB). 클러스탈 W 프로그램을 사용하여 상기 서열들을 정렬시킨 후, 동일한 프로그램 내의 "서열 거리" 표를 살펴봄으로써 "% 동일성"을 수득하는 것이 가능하다.

    고 수준의 서열 동일성이 기타 종으로부터 폴리펩티드를 확인하는 데 유용하다는 것은 당업자에게 널리 인식되어 있는데, 이러한 폴리펩티드는 동일하거나 유사한 기능 또는 활성을 갖는다. % 동일성의 유용한 예는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 포함하지만 이에 제한되지 않거나, 또는 55%에서 100%까지의 어떠한 정수 %, 예컨대 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%도 본 발명의 개시내용의 실시양태를 기재하는 데 유용할 수 있다. 적합한 핵산 단편은 상기 상동성을 가질 뿐만 아니라 전형적으로 50개 이상의 아미노산, 바람직하게 100개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게 150개 이상의 아미노산, 보다 더 바람직하게 200개 이상의 아미노산, 및 가장 바람직하게 250개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다.

    용어 "서열 분석용 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 분석하는 데 유용한 모든 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석용 프로그램"은 상업적으로 입수 가능하거나 또는 독립적으로 개발할 수 있다. 전형적인 서열 분석용 프로그램은 1.) GCG 프로그램 스위트 (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG); 미국 위스콘신주 매디슨); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (문헌 [Altschul et al., J. Mol . Biol ., 215:403-410 (1990)] 참조); 3.) DNASTAR (DNASTAR, 인크.; 미국 위스콘신주 매디슨); 4.) 시켄처(Sequencher) [진 코드즈 코포레이션 (Gene Codes Corporation; 미국 미시간주 앤 아버)]; 및 5.) 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘을 도입한 FASTA 프로그램 (문헌 [WR Pearson, Comput . Methods Genome Res . , [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY] 참조)을 포함할 것이지만, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 맥락 내에서, 서열 분석용 소프트웨어를 분석에 사용하는 경우, 이러한 분석 결과는 달리 명시되지 않는 한 참조된 프로그램의 "디폴트 값"을 기준으로 할 것이란 사실을 인지해야 할 것이다. 본원에 사용된 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 본래 상기 소프트웨어와 함께 부하되는 파라미터 또는 값의 임의의 세트도 의미할 것이다.

    혼성화 기술과 관련된 경우, 공지된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를, 선택된 유기체로부터의 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편 집단 (즉, 게놈 또는 cDNA 라이브러리) 내에 존재하는 기타 상응하는 뉴클레오티드 서열과 선택적으로 혼성화되는 프로브로서 사용할 수 있다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, 플라스미드 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, PCR 증폭된 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 또는 기타 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 이는 탐지 가능한 군, 예컨대 32 P 또는 기타 임의의 탐지 가능한 마커로도 표지시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 혼성화시키기 위한 프로브는 본 개시내용의 실시양태의 DNA 서열에 근거하여 합성 올리고뉴클레오티드를 표지시킴으로써 만들 수 있다. 혼성화용 프로브를 제조하는 방법 및 cDNA 및 게놈 라이브러리를 구축하는 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고 개시되어 있다 (문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조).

    본 발명의 개시내용의 실시양태의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열과 혼성화된다. 통상적인 어떠한 핵산 혼성화 또는 증폭 방법도 사용하여, 특정 샘플 중의 트랜스제닉 사건으로부터 DNA의 존재를 확인할 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 상황 하에서 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자는, 이들 두 분자가 역평행의 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 여겨진다. 2개 핵산 분자가 보체 상보성을 나타낸다면 특정 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 "보체"인 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자들 중의 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 대해 상보적인 경우, 이들 분자는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 여겨진다. 완전한 상보성을 나타내는 분자는 일반적으로, 통상적인 "고-엄격성" 조건 하에 서로 어닐링된 채로 있을 수 있기에 충분한 안정성을 수반하면서 서로 혼성화될 것이다. 통상적인 고-엄격성 조건은 문헌 ([Sambrook et al., 1989] 참조)에 기재되어 있다.

    2개 분자가 적어도 통상적인 "저-엄격성" 조건 하에 서로 어닐링된 채로 있을 수 있기에 충분한 안정성을 수반하면서 서로 혼성화될 수 있다면, 이들 두 분자는 "최소한의 상보성"을 나타내는 것으로 여겨진다. 통상적인 저-엄격성 조건은 문헌 ([Sambrook et al., 1989] 참조)에 기재되어 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 제공되기 위해서는, 이용된 특별한 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 해주는 최소한의 서열 상보성을 나타내기만 하면 된다.

    혼성화의 엄격성에 영향을 미치는 요인는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매, 예컨대 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 혼성화 엄격성은 보다 고온, 보다 낮은 이온 강도 및 보다 낮은 용매 농도에 의해 증가된다.

    용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격성 조건"은 문헌 ([Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55]; [Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 and 9.56-9.58] 참조)에 논의된 특이적 혼성화 과정에 의해 핵산 프로브를 표적 핵산 (즉, 특별한 관심 핵산 서열)과 혼성화하는 것과 관련해서 기능적으로 규정된다.

    전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만 Na + 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na + 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에는 약 30℃ 이상이고 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과 뉴클레오티드)의 경우에는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한, 포름아미드와 같은 탈안정화제를 부가함으로써 달성할 수 있다. 예시되는 저 엄격성 조건은 37℃ 하에서 30 내지 35% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS (소듐 도데실 술페이트)의 완충제 용액을 이용하여 혼성화하고, 50 내지 55℃ 하에 1X 내지 2X SSC (20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M 트리소듐 시트레이트)에서 세척하는 것을 포함한다. 예시되는 중간 수준의 엄격성 조건은 37℃ 하에 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS에서 혼성화하고, 55 내지 60℃ 하에 0.5X 내지 1X SSC에서 세척하는 것을 포함한다. 예시되는 고 수준의 엄격성 조건은 37℃ 하에 50% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS에서 혼성화하고, 60 내지 65℃ 하에 0.1X SSC에서 세척하는 것을 포함한다.

    특이성은 전형적으로, 혼성화 후 세척의 함수인데, 그의 결정적 요인은 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. DNA-DNA 혼성체의 경우, T m 은 방정식 T m = 81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form.)-500/L (여기서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA 중의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 비율 (%)이며, %form.은 혼성화 용액 중의 포름아미드의 비율 (%)이고, L은 혼성체의 염기쌍 길이이다)으로부터 근사치를 계산할 수 있다 (문헌 [Meinkoth and Wahl, 1984] 참조). T m 은 상보성 표적 서열의 50%가 완벽하게 부합된 프로브와 혼성화될 때의 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에)이다. T m 은 부정합물의 각 1%에 대해 약 1℃씩 감소되므로; T m , 혼성화 및/또는 세척 조건은 목적하는 동일성의 서열이 혼성화되도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 90% 동일성을 지닌 서열을 추구하고자 하는 경우, T m 은 10℃ 강하될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH 하에 특이적 서열 및 그의 보체에 대한 열 융점 (T m ) 보다 약 5℃ 더 낮도록 선택한다. 그러나, 고도로 엄격한 조건은 열 융점 (T m ) 보다 1, 2, 3 또는 4℃ 더 낮은 온도 하에 혼성화 및/또는 세척하는 것을 이용할 수 있고; 중간 수준의 엄격한 조건은 열 융점 (T m ) 보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은 온도 하에 혼성화 및/또는 세척하는 것을 이용할 수 있으며; 저 엄격한 조건은 열 융점 (T m ) 보다 11 내지 20℃ 더 낮은 온도 하에 혼성화 및/또는 세척하는 것을 이용할 수 있다. 상기 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 목적하는 T m 을 이용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격성 상의 변동이 본질적으로 설명된다는 것을 이해할 것이다. 목적하는 부정합 정도로 인해, 45℃ 미만 (수용액) 또는 32℃ 미만 (포름아미드 용액)의 T m 이 유발된다면, SSC 농도를 증가시켜 보다 고온을 사용할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 관한 광범위한 지침은 문헌 ([(1997) Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology , pages 2-40, Third Edit. (1997)] 및 [Sambrook et al. (1989)] 참조)에서 알아낼 수 있다.

    본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 및 [Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology , published by Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)] 참조).

    본원에 개시된 재조합 숙주의 유전자 조작은 표준 유전적 기술 및 스크리닝을 이용하여 수행할 수 있고, 유전자 조작에 적합한 어떠한 숙주 세포에서도 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 재조합 숙주 세포는 유전적 변형 및 재조합 유전자 발현에 유용한 어떠한 유기체 또는 미생물 숙주일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 숙주는 모든 고등 식물 (쌍떡잎 식물과 외떡잎 식물 둘 다 포함), 및 소모성 식물 (농작물 및 그들의 오일을 위해 사용된 식물 포함)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 어떠한 식물 종 또는 식물 세포도 다음에 추가로 기재되는 바와 같이 선택할 수 있다.

    일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용에 따라서 유전적으로 변형시킨 식물 (예를 들어, 식물 숙주 세포)은 모든 고등 식물 (쌍떡잎 식물과 외떡잎 식물 둘 다 포함), 및 특히 소모성 식물 (농작물 포함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 식물은, 예를 들어 알팔파, 대두, 면, 평지씨 (캐놀라로서 기재되기도 함), 아마씨, 옥수수, 벼, 브라키아리아(brachiaria), 밀, 홍화, 수수, 사탕무, 해바라기, 담배 및 잔디풀을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 어떠한 식물 종 또는 식물 세포도 선택할 수 있다. 실시양태에서, 본원에 사용된 식물 세포, 및 그로부터 성장되거나 유래된 식물은 평지씨 (브라시카 나푸스); 갓 (indian mustard) [브라시카 준세아 ( Brassica juncea )]; 에티오피아 겨자 (Ethiopian mustard) [브라시카 카리나타 ( Brassica carinata )]; 순무 (turnip) [브라시카 라파 ( Brassica rapa )]; 양배추 [브라시카 올레라세아 ( Brassica oleracea )]; 대두 (글리시네 맥스); 아마씨/아마 [리눔 우시타티시뭄 ( Linum usitatissimum )]; 옥수수 [제아 매이스 ( Zea mays )]; 홍화 [카르타무스 틴크토리우스 ( Carthamus tinctorius )]; 해바라기 [헬리안투스 안누우스 ( Helianthus annuus )]; 담배 [니코티아나 타바쿰 ( Nicotiana tabacum )]; 아라비도프시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana ); 브라질 호두 (Brazil nut) [베톨레티아 엑셀사 ( Betholettia excelsa )]; 피마자 [리시누스 콤무니스 ( Ricinus communis )]; 코코넛 [코쿠스 누시페라 ( Cocus nucifera )]; 고수풀 [코리안드룸 사티붐 ( Coriandrum sativum )]; 면 [고시퓸 종 ( Gossypium spp . )]; 땅콩 [아라키스 히포개아 ( Arachis hypogaea )]; 조조바 (jojoba) [시몬드시아 키넨시스 ( Simmondsia chinensis )]; 야자유 [엘래이스 귀네에이스 ( Elaeis guineeis )]; 올리브 [올레아 에우르패아 ( Olea eurpaea )]; 벼 [오리자 사티바 ( Oryza sativa )]; 스쿼시 (squash) [쿠쿠르비타 맥시마 ( Cucurbita maxima )]; 보리 [호르데움 불가레 ( Hordeum vulgare )]; 사탕수수 [삭카룸 오피시나룸 ( Saccharum officinarum )]; 벼 (오리자 사티바); 밀 [트리티쿰 두룸 ( Triticum durum ) 및 트리티쿰 애스티붐 ( Triticum aestivum )을 포함한 트리티쿰 종 ( Triticum spp . )]; 및 개구리밥 [렘나세애 종 ( Lemnaceae sp .)]으로부터 수득 가능한 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 식물 종 내에서의 유전적 배경은 다양할 수 있다.

    본원에 사용된 "식물 부분"은 종자 (성숙 종자 및 미성숙 종자 포함), 식물 삽목, 식물 세포, 식물 세포 배양물, 식물 기관, 화분, 배아, 꽃, 과실, 어린 가지, 잎, 뿌리, 줄기, 외식편 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 식물 부분도 포함한다. 식물 세포는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포, 또는 무른 갤러스와 같은 세포 응집체, 또는 배양된 세포의 형태일 수 있거나, 또는 보다 고도로 조직된 단위, 예를 들어 식물 조직, 식물 기관 또는 식물의 일부일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질체, 배우자 생산 세포, 또는 완전 세포로 재생될 수 있는 세포 또는 세포 컬렉션일 수 있다. 따라서, 다수 식물 세포를 포함하고 완전 식물로 재생될 수 있는 종자는 본 개시내용의 목적상 식물 세포로 간주된다. 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 원형질체, 캘러스, 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직되는 식물 세포의 기타 어떠한 군일 수도 있다. 식물의 특히 유용한 부분은 수확 가능한 부분 및 자손 식물의 증식에 유용한 부분을 포함한다. 식물의 수확 가능한 부분은 식물의 유용한 어떠한 부분일 수도 있는데, 예를 들어 꽃, 화분, 묘목, 괴경, 잎, 줄기, 과실, 종자, 뿌리 등일 수 있다. 증식에 유용한 식물의 부분은, 예를 들어 종자, 과실, 삽목, 묘목, 괴경, 근경 등을 포함한다. 조직 배양물은 바람직하게, 전술된 근친계 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생시킬 수 있고, 전술된 근친계 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생시킬 수 있을 것이다. 이와는 달리, 일부 식물 세포는 식물을 생성하도록 재생될 수 없다. 바람직하게, 이러한 조직 배양물 중의 재생 가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 생사, 꽃, 씨알맹이, 이삭, 옥수수속, 겉껍질 또는 꽃자루일 것이다. 추가로, 본 발명의 개시내용의 실시양태는 상기 개시내용의 실시양태의 조직 배양물로부터 재생된 식물을 제공한다.

    유전적으로 변형된 식물을 생산하는 것과 관련하여, 식물의 유전 공학 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라 외떡잎 식물에 대한 생물학적 및 생리적 형질전환 프로토콜을 포함한, 식물 형질전환을 위한 수많은 방법이 개발되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999)]; [Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology , Glick, BR and Thompson, JE Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)] 참조). 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환, 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은, 예를 들어 다음 문헌에서 이용 가능하다 (문헌 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology , Glick, BR and Thompson, JE Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)] 참조).

    DNA를 식물 숙주 세포 내로 삽입하기 위한 다수의 기술이 이용 가능하다. 이들 기술은 형질전환 작용제로서 애그로박테륨 투메파시엔스 또는 애그로박테륨 리조게네스를 사용하여 비무장 (disarmed) T-DNA로 형질전환시키는 것, 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 소노포레이션), 리포솜 형질전환, 미세주사, 있는 그대로의 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 바이오리스틱스 (극미립자 충격), 탄화규소 WHISKERS™ 매개된 형질전환, 에어로솔 비밍, 또는 PEG 형질전환뿐만 아니라 기타 가능한 방법을 포함한다.

    예를 들어, DNA 구조물은 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사와 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 DNA 구조물은 DNA 입자 충격과 같은 바이오리스틱 방법을 이용하여 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 식물 세포 형질전환을 위한 부가 방법은 탄화규소 WHISKERS 매개된 DNA 흡수를 통한 미세주사를 포함한다 (문헌 [Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418] 참조). 또 다른 한편, DNA 구조물은 나노입자 형질전환을 통하여 식물 세포 내로 도입할 수 있다 (예를 들어, [미국 특허 출원 번호 12/245,685] 참조; 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).

    또 다른 공지된 식물 형질전환 방법은 DNA를 미소발사체의 표면 상에 운반하는, 미소발사체-매개된 형질전환이다. 이러한 방법에서는, 미소발사체가 식물 세포 벽 및 막을 침투하기에 충분한 속도로 이를 가속화시켜 주는 바이오리스틱 장치를 이용하여 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입시킨다 (문헌 [Sanford et al., Part. Sci . Technol . 5:27 (1987)], [Sanford, JC, Trends Biotech . 6:299 (1988)], [Sanford, JC, Physiol . Plant 79:206 (1990)], [Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)] 참조).

    또 다른 한편, 유전자 전이 및 형질전환 방법은 염화칼슘 침전을 통한 원형질체 형질전환, 있는 그대로의 DNA의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)- 또는 전기천공-매개된 흡수 (문헌 [Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722], [Potrykus et al. (1985) Molec . Gen . Genet . 199:169-177]; [Fromm et al. (1985) Proc . Nat . Acad. Sci . USA 82:5824-5828]; 및 [Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 (문헌 [D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505] 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    발현 벡터를 식물 내로 도입하기 위해 광범위하게 활용되고 있는 방법은 애그로박테륨의 자연 형질전환 시스템에 근거하고 있다 (문헌 [Horsch et al., Science 227:1229 (1985)] 참조). 에이. 투메파시엔스 ( A. tumefaciens ) 및 에이. 리조게네스 ( A. rhizogenes )는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키기에 유용한 것으로 공지된 식물 병원성 토양 세균이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각, 식물의 유전적 형질전환에 대해 책임이 있는 유전자를 수반한다 (문헌 [Kado, CI, Crit . Rev . Plant . Sci . 10:1 (1991)] 참조). 애그로박테륨 벡터 시스템 및 애그로박테륨-매개된 유전자 전이를 위한 방법에 관한 설명은 또한, 예를 들어 다음 문헌에서 이용 가능하다 (문헌 [Gruber et al., 상기 참조], [Miki et al., 상기 참조], [Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 [미국 특허 번호 4,940,838 및 5,464,763] 참조).

    애그로박테륨을 상기 형질전환에 사용할 경우, 삽입시키고자 하는 DNA는 특수 플라스미드, 즉 중간 벡터 또는 이원성 벡터 내로 클로닝해야 한다. 중간 벡터는 그 자체가 애그로박테륨에서 복제할 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드를 통하여 (접합) 애그로박테륨 투메파시엔스 내로 전이될 수 있다. 일본 담배 슈퍼바이너리(Japan Tobacco Superbinary) 시스템이 이러한 시스템의 한 예이다 (문헌 [Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2 nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41]; 및 [Komori et al., (2007) Plant Physiol . 145:1155-1160] 참조). 이원성 벡터는 그 자체가 이. 콜라이와 애그로박테륨 둘 다에서 복제할 수 있다. 이는 선별 마커 유전자, 및 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 의해 프레임되는 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이는 애그로박테륨 내로 직접 형질전환될 수 있다 (문헌 [Holsters, 1978] 참조). 숙주 세포로서 사용된 애그로박테륨은 vir 영역을 수반하는 플라스미드를 포함해야 한다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한, T-DNA의 전이에 필요한 vir 영역을 포함한다. 이러한 vir 영역은 T-DNA를 식물 세포 내로 전이시키는 데 필요하다. 부가의 T-DNA를 함유할 수 있다.

    애그로박테륨 투메파시엔스 숙주의 독력 기능은 식물 세포가 이원성 T DNA 벡터 (문헌 [Bevan (1984) Nuc . Acid Res . 12:8711-8721] 참조) 또는 공동 배양 과정 (문헌 [Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231] 참조)를 이용하여 상기 세균에 의해 감염되는 경우에, 이러한 식물 세포 DNA 내로 상기 구조물 및 인접한 마커를 함유하는 T-가닥을 삽입하는 것을 지시할 것이다. 일반적으로, 애그로박테륨 형질전환 시스템을 사용하여 쌍떡잎 식물을 조작한다 (문헌 [Bevan et al. (1982) Ann . Rev. Genet 16:357-384]; [Rogers et al. (1986) Methods Enzymol . 118:627-641] 참조). 애그로박테륨 형질전환 시스템을 또한 사용하여 DNA를 외떡잎 식물 및 식물 세포로 형질전환시킬 수 있을 뿐만 아니라 전이시킬 수 있다 (문헌 [미국 특허 번호 5,591,616]; [Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041]; [Hooykass Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764]; [Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179]; [Boulton et al. (1989) Plant Mol . Biol . 12:31-40]; 및 [Gould et al. (1991) Plant Physiol . 95:426-434] 참조). 상기 유전적 구조물을 식물 세포 내로 도입한 후, 식물 세포는 성장할 수 있고, 어린 가지 및 뿌리와 같은 분화성 조직의 출현시 성숙한 식물이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 식물이 생성될 수 있다. 식물을 재생시키기 위한 방법론은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 문헌 ([ Plant Cell and Tissue Culture , 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers] 및 [ Plant Cell Culture Protocols ( Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press] 참조)에서 알아낼 수 있다. 본원에 기재된 유전적으로 변형된 식물을 발효 배지에서 배양하거나 또는 토양과 같은 적합한 배지에서 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 고등 식물에 적합한 성장 배지는 모든 식물용 성장 배지를 포함할 수 있는데, 이는 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지해주는 기타 모든 미립자 배지 (예를 들어, 질석, 펄라이트 등) 또는 수경 재배 뿐만 아니라 적합한 빛, 물, 및 고등 식물의 성장을 최적화시켜 주는 영양 보충제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    상기 형질전환 기술 중 어느 것에 의해 생성되는 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고 있으므로 목적하는 표현형을 갖는 완전 식물을 재생시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 조직 배양 성장 배지 중의 특정 식물 호르몬의 조작에 좌우되는데, 전형적으로 이는 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입시킨 살생제 및/또는 제초제 마커에 좌우된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 다음 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture , pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants , Plant Protoplasts , pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985] 참조). 재생은 또한, 식물 캘러스, 외식편, 기관, 화분, 배양 또는 그의 부분으로부터 수득할 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로, 문헌 ([Klee et al. (1987) Ann . Rev . of Plant Phys . 38:467-486] 참조)에 기재되어 있다.

    기타 실시양태에서, 형질전환되는 식물 세포는 특정 식물을 생성하기 위해 재생될 수 없다. 이러한 세포는, 예를 들어 관련 표현형, 예를 들어 제초제 저항성을 갖는 식물 세포주를 발생시키는 데 이용될 수 있다.

    식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여 본질적으로 어떠한 식물에 대해서도 목적하는 형질을 부여할 수 있다. 본 발명의 개시내용의 핵산 구조물 및 상기 언급된 각종 형질전환 방법을 이용하여 본원에 기재된 목적하는 생리학적 및 작물학적 특징을 위해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작하기 위한 표적 식물 및 식물 세포는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물, 예컨대 낟알 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과실 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 뿌리 채소 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물 (예를 들어, 상추, 시금치)을 포함한 작물; 개화 식물 (예를 들어, 페투니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 전나무, 가문비나무); 식물환경 복원에 사용된 식물 (예를 들어, 중금속 축적성 식물)); 오일 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지씨); 및 실험용으로 사용된 식물 (예를 들어, 아라비도프시스)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 상기 개시된 방법 및 조성물은 아스파라구스 (Asparagus), 아베나 (Avena), 브라시카 (Brassica), 시트루스 (Citrus), 시트룰루스 (Citrullus), 캅시쿰 (Capsicum), 쿠쿠르비타 (Cucurbita), 다우쿠스 (Daucus), 에리게론 (Erigeron), 글리시네 (Glycine), 고시퓸 (Gossypium), 호르데움 (Hordeum), 락투카 (Lactuca), 롤륨 (Lolium), 리코페르시콘 (Lycopersicon), 말루스 (Malus), 만니호트 (Manihot), 니코티아나 (Nicotiana), 오리초프라그무스 (Orychophragmus), 오리자 (Oryza), 페르세아 (Persea), 파세올루스 (Phaseolus), 피숨 (Pisum), 피루스 (Pyrus), 프루누스 (Prunus), 라파누스 (Raphanus), 세칼레 (Secale), 솔라눔 (Solanum), 소르굼 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum), 비티스 (Vitis), 비그나 (Vigna), 및 제아 매이스 속으로부터의 종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 광범위한 식물 전반에 걸쳐 사용된다.

    형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물은 형질전환성 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화된 형질을 알아보기 위해 상기 조작된 식물 재료를 선별 또는 스크리닝함으로써 확인 및 단리할 수 있다. 예를 들어, 형질전환성 유전자 구조물이 저항성을 부여한 항생제 또는 제조체의 억제량을 함유하는 배지 상에서 상기 조작된 식물 재료를 성장시킴으로써 선별을 수행할 수 있다. 추가로, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한, 재조합 핵산 구조물 상에 존재할 수 있는 모든 가시적 마커 유전자 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제 또는 gfp 유전자)의 활성을 알아보기 위해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이러한 선별 및 스크리닝 방법론은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

    핵산을 세포 내로 삽입하는 맥락에서 도입된 용어는 상기 세포 내로의 형질전환을 포함할 뿐만 아니라 통상적인 식물 육종 기술에서와 같이, 상기 서열을 갖는 식물을 또 다른 식물과 교배시켜 제2 식물이 이종 서열을 함유하도록 하는 것을 포함한다. 이러한 육종 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 식물 육종 기술에 관한 논의는 다음 문헌을 참조할 수 있다 (문헌 [Poehlman (1995) Breeding Field Crops , AVI Publication Co., Westport Conn, 4 th Edit] 참조). 역교배 방법을 이용하여 유전자를 식물 내로 도입할 수 있다. 이러한 기술은 형질을 식물 내로 도입하기 위해 수십 년간 사용되어 왔다. 널리 공지되어 있는 상기 및 기타 식물 육종 방법론에 관한 기재의 예는 참고 문헌, 예컨대 문헌 ([Poehlman, supra, and Plant Breeding Methodology , edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988)] 참조)에서 알아낼 수 있다. 전형적인 역교배 프로토콜에서는, 관심있는 원래 품종 (반복친)을, 전이시키고자 하는 관심 단일 유전자를 수반하는 제2 품종 (일회친)과 교배시킨다. 이어서, 이러한 교배로부터 생성된 자손을 반복친과 다시 교배시키고, 특정 식물이 수득될 때까지 상기 공정을 반복하는데, 일회친으로부터의 단일 전이된 유전자 이외에도, 반복친의 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징들이 본질적으로 모두 상기 전환된 식물에서 회수된다.

    특정 실시양태는 적어도 하나의 부모로서 상기 개시내용의 실시양태의 식물을 사용하여 교배물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 특별한 실시양태는 하나 또는 양 부모로서 본원에 예시된 식물 중 어느 것을 갖는 F 1 혼성체 식물에 관한 것이다. 다른 실시양태는 이러한 F 1 혼성체에 의해 생성된 종자에 관한 것이다. 또한 다른 실시양태는 예시된 식물을 상이한 (예를 들어, 근친계 부모) 식물과 교배시키고, 이로써 생성된 혼성체 종자를 수확함으로써 F 1 혼성체 종자를 생성하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태는 교배 어미 나무 (female parent) 또는 아비 나무 (male parent)인 예시된 식물에 관한 것이다. 이로써 생성된 식물의 특징은 부모 식물을 충분히 검토함으로써 개선시킬 수 있다.

    본 발명의 개시내용의 실시양태의 dgt -14 폴리뉴클레오티드를 함유하는 트랜스제닉 식물은 본원에 언급된 식물 주 (line)들 중 어느 하나의 종자로부터 성장한 식물로 이루어진 제1 부모 식물을 제2 부모 식물과 첫 번째 유성 교배함으로써, 복수 개의 제1 자손 식물을 생성시킨 다음; 글리포세이트에 대해 저항성인 제1 자손 식물을 선별하고; 이러한 제1 자손 식물을 자가 생식시킴으로써, 복수 개의 제2 자손 식물을 생성시킨 다음; 이러한 제2 자손 식물로부터 글리포세이트에 대해 저항성인 식물을 선별함으로써 번식시킬 수 있다. 이들 단계는 제1 자손 식물 또는 제2 자손 식물을 제2 부모 식물 또는 제3 부모 식물과 역교배하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 특별한 실시양태의 종자를 포함하는 작물 또는 그의 자손을 심을 수 있다.

    2가지 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 교배하여, 2개의 독립적으로 분리되고 부가된 외인성 유전자를 함유하는 자손을 생산할 수 있다는 것을 또한 인지해야 한다. 적당한 자손의 자가 생식으로 인해, 부가된 외인성 유전자 둘 다에 대해 동형접합성인 식물이 생산될 수 있다. 영양 증식과 마찬가지로, 부모 식물과의 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종 교배가 또한 고려된다. 상이한 형질 및 작물을 위해 흔히 사용되고 있는 기타 육종 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 단순히 선천성이고, 고도로 유전 가능한 형질을 위해 유전자를 바람직한 동형접합성 재배종 또는 근친계 (이는 반복친이다) 내로 전이시키기 위해 역교배 육종을 사용하여 왔다. 전이시키고자 하는 형질의 공급원을 공여친 (donor parent)이라고 부른다. 이로써 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 공여친으로부터 전이된 바람직한 형질을 갖고 있는 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 공여친의 표현형을 보유하고 있는 개체를 선별하고, 반복친과 반복적으로 교배 (역교배)하였다. 이로써 생성된 부모는 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 공여친으로부터 전이된 바람직한 형질을 갖고 있는 것으로 예상된다.

    본원에 기재된 바와 같은 dgt -14 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 핵산을, 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 형질전환시키기 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 벡터는 원핵성 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 진핵성 벡터일 수 있다. dgt -14 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산을 또한, 식물 세포에 투여하기 위해 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 때때로, 이. 콜라이에서 기능적인 (예를 들어, 항체를 유발시키기 위한 단백질의 생산, DNA 서열 분석, 삽입물의 구축, 핵산 양 획득) 벡터를 갖는 것이 바람직할 수 있다.

    DGT-14 단백질을 발현시키기 위해, dgt -14 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 전형적으로, 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적합한 세균성 및 진핵성 프로모터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3 rd ed., 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990)]; 및 [ Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra.)] 참조). dgt -14 서열을 발현시키기 위한 세균성 발현 시스템은, 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 종 ( Bacillus sp. ), 및 살로넬라 ( Salmonella )에서 이용 가능하다 (문헌 [Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템을 위한 키트가 시판중이다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵성 발현 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 또한 시판중이다.

    유전 정보를 세포 내로 수송하기 위해 사용된 특별한 발현 벡터는, DGT-14 단백질의 의도된 용도, 예를 들어 식물, 동물, 세균, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. 표준 세균성 및 동물 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 공개공보 20050064474A1 및 국제 특허 공개공보 WO 05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809에 상세히 기재되어 있다. 표준 형질감염 방법을 사용하여 다량의 단백질을 발현하는 세균성 세포주를 생성시킨 다음, 표준 기술을 이용하여 이를 정제할 수 있다.

    dgt -14 암호화 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용된 프로모터는 특별한 적용에 좌우된다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성적 프로모터가 전형적으로, DGT-14 단백질의 발현 및 정제를 위해 사용된다. 바람직한 식물 프로모터의 비-제한적 예는 에이. 탈리아나 ( A. thaliana ) 유비퀴틴-10 (ubi-10) (문헌 [Callis, et al., 1990, J. Biol . Chem . , 265:12486-12493] 참조); 에이. 투메파시엔스 만노핀 신타제 (Δmas) (문헌 [Petolino et al., 미국 특허 번호 6,730,824] 참조); 및/또는 카사바 베인 모자이크 바이러스 (Cassava Vein Mosaic Virus) (CsVMV) (문헌 [Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139] 참조)로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다.

    본원에 개시된 방법에서, 식물에서의 유전자 발현을 지시하는 수많은 프로모터를 이용할 수 있다. 이러한 프로모터는 구성적, 화학적으로 조절된, 유도성, 조직-특이적, 및 종자-선호 프로모터로부터 선택될 수 있다.

    구성적 프로모터는, 예를 들어 코어 콜리플라워 모자이크 바이러스 (core Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터 (문헌 [Odell et al. (1985) Nature 313:810-812] 참조); 벼 액틴 프로모터 (문헌 [McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171] 참조); 옥수수 유비퀴틴 프로모터 (문헌 [미국 특허 번호 5,510,474]; [Christensen et al. (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632] 및 [Christensen et al. (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689] 참조); pEMU 프로모터 (문헌 [Last et al. (1991) Theor . Appl . Genet . 81:581-588] 참조); ALS 프로모터 (문헌 [미국 특허 번호 5,659,026] 참조); 옥수수 히스톤 프로모터 (문헌 [Chaboute et al. Plant Molecular Biology , 8:179-191 (1987)] 참조) 등을 포함한다.

    이용 가능한 식물 화합성 프로모터의 범위는 조직 특이적 및 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 조절 요소는 유도인자에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화시킬 수 있는 것이다. 유도인자의 부재 하에서는, 상기 DNA 서열 또는 유전자가 전사되지 않을 것이다. 전형적으로, 전사를 활성화시키기 위해 유도성 조절 요소와 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하는데, 이는 이어서 유도인자에 의해 직접 또는 간접적으로 활성 형태로 전환된다. 유도인자는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사물, 성장 조절인자, 제초제 또는 페놀계 화합물, 또는 열, 한기, 염 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 부여되거나 또는 바이러스와 같은 병원체 또는 질환 유발제의 작용을 통하여 간접적으로 부여된 생리학적 스트레스일 수 있다. 전형적으로, 전사를 활성화시키기 위해 유도성 조절 요소와 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하는데, 이는 이어서 유도인자에 의해 직접 또는 간접적으로 활성 형태로 전환된다. 유도인자는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사물, 성장 조절인자, 제초제 또는 페놀계 화합물, 또는 열, 한기, 염 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 부여되거나 또는 바이러스와 같은 병원체 또는 질환 유발제의 작용을 통하여 간접적으로 부여된 생리학적 스트레스일 수 있다. 유도성 조절 요소를 함유하는 식물 세포는, 유도인자를 이러한 세포 또는 식물에 외부적으로 적용함으로써, 예컨대 분무, 살수, 가열 또는 유사한 방법에 의해 적용함으로써 유도인자에 노출시킬 수 있다.

    어떠한 유도성 프로모터도 본 발명의 개시내용의 실시양태에 사용할 수 있다 (문헌 [Ward et al. Plant Mol . Biol . 22: 361-366 (1993)] 참조). 예시되는 유도성 프로모터는 엑디손 (ecdysone) 수용체 프로모터 ([미국 특허 번호 6,504,082] 참조); 구리에 반응하는 ACE1 시스템으로부터의 프로모터 (문헌 [Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)] 참조); 벤젠술폰아미드 제초제 독성 완화제에 반응하는 옥수수로부터의 In2-1 및 In2-2 유전자 (문헌 [미국 특허 번호 5,364,780]; [Hershey et al., Mol . Gen . Genetics 227: 229-237 (1991)] 및 [Gatz et al., Mol . Gen . Genetics 243: 32-38 (1994)] 참조); Tn10으로부터의 Tet 억제인자 (문헌 [Gatz et al., Mol . Gen . Genet . 227: 229-237 (1991)] 참조); 또는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 프로모터 (그의 전사 활성은 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도된다) (문헌 [Schena et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88: 10421 (1991)] 및 [McNellis et al., (1998) Plant J . 14(2):247-257] 참조); 잡초 발아 전에 이용하는 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터 ([미국 특허 번호 5,965,387 및 국제 특허 출원 공개공보 WO 93/001294] 참조); 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터 (문헌 [Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System," Biosci Biotechnol Biochem . 2011 Sep 23; 75(9):1796-800] 참조)를 포함한다. 관심있는 기타 화학물질-조절된 프로모터는 테트라사이클린-유도성 및 테트라사이클린-억제성 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gatz et al., (1991) Mol . Gen . Genet . 227:229-237] 및 [미국 특허 번호 5,814,618 및 5,789,156] 참조).

    관심있는 기타 조절 가능한 프로모터는 한기 반응성 조절 요소 또는 열 쇼크 조절 요소 (그의 전사는 각각 한기 또는 열에 대한 노출에 반응하여 수행될 수 있다) (문헌 [Takahashi et al., Plant Physiol . 99:383-390, 1992] 참조); 혐기성 조건에 의해 유도 가능한, 알콜 데히드로게나제 유전자의 프로모터 (문헌 [Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982)]; [Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)] 참조); 및 완두 rbcS 유전자 또는 완두 psaDb 유전자로부터 유래된 광-유도성 프로모터 (문헌 [Yamamoto et al. (1997) Plant J . 12(2):255-265] 참조); 광-유도성 조절 요소 (문헌 [Feinbaum et al., Mol . Gen . Genet . 226:449, 1991]; [Lam and Chua, Science 248:471, 1990]; [Matsuoka et al. (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90(20):9586-9590]; [Orozco et al. (1993) Plant Mol . Bio . 23(6):1129-1138] 참조), 식물 호르몬 유도성 조절 요소 (문헌 [Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol . Biol . 15:905, 1990]; [Kares et al., Plant Mol . Biol . 15:225, 1990] 참조) 등을 포함한다. 유도성 조절 요소는 또한, 벤젠술폰아미드 제초제 독성 완화제에 반응하는, 옥수수 In2-1 또는 In2-2 유전자의 프로모터 (문헌 [Hershey et al., Mol . Gen . Genet . 227:229-237, 1991]; [Gatz et al., Mol. Gen . Genet . 243:32-38, 1994] 참조), 및 트랜스포손 Tn10의 Tet 억제인자 (문헌 [Gatz et al., Mol . Gen . Genet . 227:229-237, 1991] 참조)일 수 있다. 스트레스 유도성 프로모터는 염/수 스트레스-유도성 프로모터, 예컨대 P5CS (문헌 [Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89] 참조); 한기-유도성 프로모터, 예컨대 cor15a (문헌 [Hajela et al. (1990) Plant Physiol . 93:1246-1252] 참조), cor15b (문헌 [Wilhelm et al. (1993) Plant Mol . Biol . 23:1073-1077] 참조), wsc120 (문헌 [Ouellet et al. (1998) FEBS Lett . 423-324-328] 참조), ci7 (문헌 [Kirch et al. (1997) Plant Mol . Biol . 33:897-909] 참조), ci21A (문헌 [Schneider et al. (1997) Plant Physiol . 113:335-45] 참조); 가뭄-유도성 프로모터, 예컨대 Trg-31 (문헌 [Chaudhary et al (1996) Plant Mol . Biol . 30:1247-57] 참조), rd29 (문헌 [Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291] 참조); 삼투압 유도성 프로모터, 예컨대 Rab17 (문헌 [Vilardell et al. (1991) Plant Mol . Biol . 17:985-93] 참조) 및 오스모틴(osmotin) (문헌 [Raghothama et al. (1993) Plant Mol. Biol . 23:1117-28] 참조); 및 열 유도성 프로모터, 예컨대 열 쇼크 단백질 (문헌 [Barros et al. (1992) Plant Mol . 19:665-75]; [Marrs et al. (1993) Dev . Genet . 14:27-41] 참조), smHSP (문헌 [Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338] 참조), 및 파슬리 유비퀴틴 프로모터로부터의 열-쇼크 유도성 요소 (문헌 [WO 03/102198] 참조)를 포함한다. 기타 스트레스-유도성 프로모터는 rip2 ([미국 특허 번호 5,332,808 및 미국 공개공보 2003/0217393] 참조) 및 rd29a (문헌 [Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol . Gen . Genetics 236:331-340] 참조)를 포함한다. 애그로박테륨 pMAS 프로모터 (문헌 [Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J . 4(3):495-505] 참조) 및 애그로박테륨 ORF13 프로모터 (문헌 [Hansen et al., (1997) Mol . Gen . Genet . 254(3):337-343] 참조)를 포함한 특정 프로모터는 상처에 의해 유도 가능하다.

    조직-선호 프로모터를 활용하여 특별한 식물 조직 내에서의 증강된 전사 및/또는 발현을 표적으로 할 수 있다. 선호 발현을 언급하는 경우, 이는 다른 식물 조직에서 보다 특별한 식물 조직에서 보다 고 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 이들 유형의 프로모터의 예는 파세올린(phaseolin) 프로모터에 의해 제공된 것 (문헌 [Bustos et al.1989. The Plant Cell Vol. 1, 839-853] 참조), 및 옥수수 글로불린-1 유전자에 의해 제공된 것 (문헌 [Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972] 참조)과 같은 종자 선호 발현을 포함한다. 쌍떡잎 식물의 경우, 종자-선호 프로모터는 콩 β-파세올린, 나핀, β-콘글리시닌, 대두 렉틴, 크루시페린 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 외떡잎 식물의 경우, 종자-선호 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인(zein), 22 kDa 제인, 27 kDa 제인, γ-제인, 왁시, 쉬룬켄 (shrunken) 1, 쉬룬켄 2, 글로불린 1 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 종자-선호 프로모터는 또한, 주로 종자 내의 특이적 조직에 대해서 유전자 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어 γ-제인의 내유-선호 프로모터, 담배로부터의 잠재성 프로모터 (문헌 [Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J . 4: 567-577] 참조), 옥수수로부터의 P-유전자 프로모터 (문헌 [Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7:1149-1158], [Erratum in Plant Cell 1997, 1:109] 참조), 옥수수로부터의 글로불린-1 프로모터 (문헌 [Belenger and Kriz.1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972] 참조), 및 옥수수 씨알맹이의 종피 또는 깍지에 대한 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어 과피-특이적 글루타민 신테타제 프로모터 (문헌 [Muhitch et al.,2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase 1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872] 참조)를 포함한다.

    프로모터 이외에도, 발현 벡터는 전형적으로, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 핵산을 발현시키는 데 필요한 모든 부가 요소를 함유하는 발현 카세트 또는 전사 단위를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예를 들어 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결을 위해 필요한 신호를 함유한다. 상기 카세트의 부가 요소는, 예를 들어 증강인자 및 이종 스플라이싱 신호를 포함할 수 있다.

    또한 유전자의 의도된 용도에 따라서, 벡터의 기타 성분이 포함될 수도 있다. 그의 예는 선별성 마커, 표적화 또는 조절 서열, 전이 펩티드 서열, 예컨대 최적화 전이 펩티드 서열 ([미국 특허 번호 5,510,471] 참조), 안정화 서열, 예컨대 RB7 MAR (문헌 [Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol . Biol ., 34: 687-692] 및 [WO9727207] 참조) 또는 리더 서열, 인트론 등을 포함한다. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자의 일반적인 설명 및 예는 다음 문헌에서 발견할 수 있다 (문헌 [Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology , Glick et al. eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)] 참조). 적당한 발현 벡터의 선택은 숙주, 및 발현 벡터를 숙주 내로 도입하는 방법에 좌우될 것이다. 발현 카세트는 또한, 발현 카세트는 관심있는 이종 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에, 식물에서 기능적인 전사 및 번역 종결 영역을 포함할 것이다. 이러한 종결 영역은 본 발명의 개시내용의 실시양태의 프로모터 뉴클레오티드 서열과 함께 천연일 수 있거나, 관심 DNA 서열과 함께 천연일 수 있거나 또는 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 편리한 종결 영역, 예컨대 옥토파인 (octopine) 신타제 및 노팔린 신타제 (nos) 종결 영역은 에이. 투메파시엔스의 Ti-플라스미드로부터 입수 가능하다 (문헌 [Depicker et al., Mol . and Appl . Genet . 1:561-573 (1982)] 및 [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)]; [Guerineau et al. Mol . Gen . Genet . 262:141-144 (1991)]; [Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991)]; [Sanfacon et al. Genes Dev . 5:141-149 (1991)]; [Mogen et al. Plant Cell 2:1261-1272 (1990)]; [Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990)]; [Ballas et al. Nucleic Acids Res . 17:7891-7903 (1989)]; [Joshi et al. Nucleic Acid Res . 15:9627-9639 (1987)] 참조).

    발현 카세트는 부가적으로, 5' 리더 서열을 함유할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 증강시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 피코르나바이러스 리더, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비암호화 영역) (문헌 [Elroy-Stein et al. Proc . Nat . Acad . Sci . USA 86:6126-6130 (1989)] 참조); 포티바이러스(potyvirus) 리더, 예를 들어 TEV 리더 (담배 에치 바이러스) (문헌 [Carrington and Freed Journal of Virology , 64:1590-1597 (1990)] 참조), MDMV 리더 (옥수수 드워프 모자이크 바이러스) (문헌 [Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)] 참조); 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (문헌 [Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991)] 참조); 알팔파 모자이크 바이러스의 외피 단백질 mRNA로부터의 비번역 리더 (AMV RNA 4) (문헌 [Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987)] 참조); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (문헌 [Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA , pages 237-256] 참조); 및 옥수수 백화 반점 바이러스 리더 (MCMV) (문헌 [Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991)] 참조)를 포함한다 (또한, 문헌 [Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987)] 참조).

    구조물은 또한, 인트론과 같이 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증강시키는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 한 인트론의 예는 아라비도프시스 탈리아나의 히스톤 H3.III 변이체의 유전자 II의 첫 번째 인트론이다 (문헌 [Chaubet et al. Journal of Molecular Biology , 225:569-574 (1992)] 참조).

    특별한 세포 소기관, 특히 색소체, 녹말체 또는 내형질 세망에 대해 유도되거나, 또는 세포의 표면에서 분비되거나 세포외적으로 분비된 이종 뉴클레오티드 서열의 발현 생성물을 갖는 것이 바람직한 경우에는, 발현 카세트가 전이 펩티드에 대한 암호화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 전이 펩티드는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 아실 캐리어 단백질에 대한 전이 펩티드; RUBISCO, 식물 EPSP 신타제 및 헬리안투스 안누우스의 소형 소단위 (문헌 [Lebrun et al. 미국 특허 번호 5,510,417] 참조); 제아 매이스 브리틀(Brittle)-1 엽록체 전이 펩티드 (문헌 [Nelson et al. Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998)]; [Sullivan et al. Plant Cell 3(12):1337-48]; [Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84]; [Sullivan et al., J. Biol . Chem . (1992) 267(26):18999-9004] 참조) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 키메라 엽록체 전이 펩티드, 예컨대 최적화 전이 펩티드 ([미국 특허 번호 5,510,471] 참조)가 당해 분야에 공지되어 있다. 부가의 엽록체 전이 펩티드는 앞서 미국 특허 번호 5,717,084; 5,728,925에 기재되어 있다. 당업자는 특별한 세포 소기관에 대한 생성물을 발현하는 데 이용 가능한 많은 선택 사항을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들어, 보리 알파 아밀라제 서열을 종종 사용하여 내형질 세망에 대한 발현을 지시한다 (문헌 [Rogers, J. Biol . Chem . 260:3731-3738 (1985)] 참조).

    재조합 DNA 기술을 사용하는 것은, 예를 들어 숙주 세포 내에서의 핵산 분자의 카피 수, 그를 이용하여 핵산 분자가 전사되는 효율성, 이로써 생성되는 전사체가 번역되는 효율성 및 번역 후 변형의 효율성을 조작함으로써, 형질감염된 핵산 분자의 발현 제어를 개선시킬 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 부가적으로, 프로모터 서열은 천연 프로모터와 비교해서 발현 수준을 개선시키도록 유전적으로 조작할 수도 있다. 핵산 분자의 발현을 제어하는 데 유용한 재조합 기술은 핵산 분자를 하나 이상의 숙주 세포 염색체 내로 안정적으로 통합시키는 것, 벡터 안정성 서열을 플라스미드에 부가하는 것, 전사 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 작동인자, 증강인자)를 치환 또는 변형시키는 것, 번역 제어 신호 (예를 들어, 리보솜 결합 부위, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 또는 코작(Kozak) 서열)를 치환 또는 변형시키는 것, 숙주 세포의 코돈 활용에 상응하도록 핵산 분자를 변형시키는 것, 및 전사체를 불안정하게 만드는 서열을 결실시키는 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

    형질전환된 세포 또는 조직 또는 식물 부분 또는 식물을 선별하기 위한 리포터 또는 마커 유전자가 형질전환 벡터에 포함될 수 있다. 선별성 마커의 예는 항대사제, 예컨대 제초제 또는 항생제에 대한 저항성을 부여해주는 것, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여해주는 디히드로폴레이트 환원효소 (문헌 [Reiss, Plant Physiol . (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994]; [Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983]; [Meijer et al., Plant Mol . Biol . 16:807-820, 1991] 참조); 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 저항성을 부여해주는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (문헌 [Herrera-Estrella, EMBO J . 2:987-995, 1983] 및 [Fraley et al. Proc . Natl . Acad . Sci USA 80:4803 (1983)] 참조) 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여해주는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (문헌 [Marsh, Gene 32:481-485, 1984]; [Waldron et al., Plant Mol. Biol . 5:103-108, 1985]; [Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995] 참조); 세포가 트립토판 대신 인돌을 활용할 수 있게 해주는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 활용할 수 있게 해주는 hisD (문헌 [Hartman, Proc . Natl. Acad . Sci ., USA 85:8047, 1988] 참조); 세포가 만노스를 활용할 수 있게 해주는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (문헌 [WO 94/20627] 참조); 오르니틴 데카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴 (DFMO)에 대한 저항성을 부여해주는 오르니틴 데카르복실라제 (문헌 [McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology , Cold Spring Harbor Laboratory ed.] 참조); 및 블라스티시딘 S에 대한 저항성을 부여해주는, 아스페르길루스 테레우스 ( Aspergillus terreus )로부터의 데아미나제 (문헌 [Tamura, Biosci . Biotechnol . Biochem . 59:2336-2338, 1995] 참조)를 포함한다.

    부가의 선별성 마커는, 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여해주는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (문헌 [Lee et al., EMBO J . 7:1241-1248, 1988] 참조), 아트라진에 대한 저항성을 부여해주는 돌연변이체 psbA (문헌 [Smeda et al., Plant Physiol . 103:911-917, 1993] 참조), 또는 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제(protoporphyrinogen oxidase) ([미국 특허 번호 5,767,373] 참조), 또는 글루포시네이트와 같은 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 기타 마커를 포함한다. 적합한 선별성 마커 유전자의 예는 클로람페니콜에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Herrera Estrella et al., EMBO J . 2:987-992, 1983] 참조); 스트렙토마이신에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Jones et al., Mol . Gen . Genet . 210:86-91, 1987] 참조); 스펙티노마이신에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res . 5:131-137, 1996] 참조); 블레오마이신에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Hille et al., Plant Mol . Biol . 7:171-176, 1990] 참조); 술폰아미드에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Guerineau et al., Plant Mol . Biol . 15:127-136, 1990] 참조); 브로목시닐(bromoxynil)에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Stalker et al., Science 242:419-423, 1988] 참조); 글리포세이트에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [Shaw et al., Science 233:478-481, 1986] 참조); 포스피노트리신에 대한 저항성을 암호화하는 유전자 (문헌 [DeBlock et al., EMBO J . 6:2513-2518, 1987] 참조) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    선택적 유전자의 사용을 위한 한 가지 선택 사항은 글루포시네이트-저항성 암호화 DNA이고, 한 실시양태에서는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터의 제어 하의, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 ( pat ), 옥수수 최적화 pat 유전자 또는 bar 유전자일 수 있다. 이들 유전자는 비알라포스에 대한 저항성을 부여해준다 (문헌 [Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37)]; [Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990]; [Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993]; [White et al., Nucl . Acids Res . 18:1062, 1990]; [Spencer et al., Theor . Appl . Genet . 79:625-631, 1990]; 및 [Anzai et al., Mol . Gen . Gen . 219:492, 1989] 참조). pat 유전자의 버전은 미국 특허 번호 6,096,947에 기재된 옥수수 최적화 pat 유전자이다.

    또한, 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 세포의 확인을 촉진시켜 주는 마커를 이용할 수 있다. 스코어링 가능하거나 스크리닝 가능한 마커가 유용한데, 여기서는 서열의 존재로 인해 측정 가능한 생성물이 생성되고, 식물 세포의 붕괴를 수반하지 않으면서 상기 생성물이 생성될 수 있다. 그의 예는 β-글루쿠로니다제, 또는 그에 대한 각종 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 암호화하는 uidA 유전자 (GUS) (예를 들어, [미국 특허 번호 5,268,463 및 5,599,670] 참조); 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (문헌 [Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907] 참조); 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 사용된 마커는 베타-카로텐 또는 프로비타민 A이다 (문헌 [Ye et al., Science 287:303-305- (2000)] 참조). 상기 유전자를 사용하여 벼의 영양을 증대시켜 왔지만, 이러한 경우에는 이를 스크리닝 가능한 마커로서 대신 이용하고 있고, 관심 유전자와 연결된 유전자의 존재는 제공된 금색에 의해 탐지된다. 상기 유전자가 식물에 대한 그의 영양적 기여를 위해 사용되는 상황과는 달리, 제조 목적을 위해서는 보다 적은 양의 단백질도 충분하다. 기타 스크리닝 가능한 마커는 일반적으로 안토시아닌/플라보노이드 유전자 (문헌 [Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127] 참조)를 포함하는데, 이는 예를 들어, 식물 조직 내에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생성을 조절하는 생성물을 암호화하는 R-유전자 자리 유전자 (문헌 [Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function , Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)] 참조); 플라보노이드 색소의 생합성을 제어하는 유전자, 예컨대 옥수수 C1 유전자 (문헌 [Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179]; [Scheffler et al. Mol . Gen. Genet . (1994) 242:40-48] 참조) 및 옥수수 C2 (문헌 [Wienand et al., Mol . Gen. Genet . (1986) 203:202-207] 참조); B 유전자 (문헌 [Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183] 참조), p1 유전자 (문헌 [Grotewold et al., Proc . Natl. Acad . Sci USA (1991) 88:4587-4591]; [Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553]; [Sidorenko et al., Plant Mol . Biol . (1999) 39:11-19] 참조); 청동 유전자 자리 유전자 (문헌 [Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197]; [Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049] 참조)를 포함한다.

    적합한 마커의 추가 예는 시안 형광성 단백질 (CYP) 유전자 (문헌 [Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54] 및 [Kato et al. (2002) Plant Physiol . 129: 913-42] 참조), 황색 형광성 단백질 유전자 [에브로젠 (Evrogen)으로부터의 PHIYFP™] (문헌 [Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54] 참조); 루시퍼라제를 암호화하는 lux 유전자 (그의 존재는, 예를 들어 X-선 필름, 신틸레이션 계수, 형광성 분광 광도 측정법, 저-광도 비디오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 멀티웰 발광법을 이용하여 탐지할 수 있다) (문헌 [Teeri et al. (1989) EMBO J . 8:343] 참조); 녹색 형광성 단백질 (GFP) 유전자 (문헌 [Sheen et al., Plant J . (1995) 8(5):777-84] 참조); 및 DsRed2 (여기서, 마커 유전자로 형질전환시킨 식물 세포는 적색이므로, 가시적으로 선별 가능하다) (문헌 [Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2):286-293] 참조)를 포함한다. 부가 예는 그에 대한 각종 발색 기질이 공지된 효소 (예를 들어, 발색 세팔로스포린인 PADAC)를 암호화하는 β-락타마제 유전자 (문헌 [Sutcliffe, Proc . Natl . Acad . Sci . USA . (1978) 75:3737] 참조); 발색 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 암호화하는 xylE 유전자 (문헌 [Zukowsky et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA . (1983) 80:1101] 참조); α-아밀라제 유전자 (문헌 [Ikuta et al., Biotech . (1990) 8:241] 참조); 및 티로신을 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 암호화하여, 결국에는 용이하게 탐지 가능한 화합물 멜라닌을 형성하도록 축합되는 티로시나제 유전자 (문헌 [Katz et al., J. Gen . Microbiol . (1983) 129:2703] 참조)를 포함한다. 명백하게도, 이러한 많은 마커는 입수 가능하고, 당업자에게 공지되어 있다.

    특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열을 임의로, 또 다른 관심 뉴클레오티드 서열과 조합할 수 있다. 용어 "관심 뉴클레오티드 서열"은 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 분자 뿐만 아니라 전사된 RNA 분자일 수 있는 핵산 분자 (이는 또한, 폴리뉴클레오티드로서 지칭될 수 있다)를 지칭할 뿐만 아니라 전체 유전자를 구성하지 않고 폴리펩티드 또는 단백질을 반드시 암호화하지 않는 핵산 분자 (예를 들어, 프로모터)를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 부가의 저항성 또는 내성을 제공하고/하거나, 선택 곤충 또는 질환 및/또는 영양 향상에 대한 저항성, 및/또는 개선된 작물학적 특징, 및/또는 사료, 식물, 산업, 제약 또는 기타 용도에 유용한 단백질 또는 기타 생성물을 제공하는 또 다른 핵산 분자와 조합하거나 또는 "스태킹"될 수 있다. 식물 게놈 내의 2개 이상의 관심 핵산 서열의 "스태킹"은, 예를 들어 2가지 이상의 사건을 이용한 통상적인 식물 육종, 식물을 관심 서열을 함유하는 구조물로 형질전환시키는 것, 트랜스제닉 식물을 재형질전환시키는 것, 또는 상동 재조합을 통한 표적화 통합을 통하여 새로운 형질을 부가하는 것을 이용하여 달성할 수 있다.

    이러한 관심 뉴클레오티드 서열은 다음에 제공된 예를 포함하지만, 그에 제한되지 않는다:

    1. 병충해 또는 질환에 대한 저항성을 부여해주는 유전자 또는 암호화 서열 (예를 들어, iRNA)

    (A) 식물 질환 저항성 유전자. 식물 방어는 종종, 식물 내의 질환 저항성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 상응하는 비병원성 (Avr) 유전자의 생성물 간의 특이적 상호 작용에 의해 활성화된다. 식물 품종을 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환시켜, 특이적 병원체 균주에 대해 저항성인 식물을 조작할 수 있다. 이러한 유전자의 예는 클라도스포륨 풀붐 ( Cladosporium fulvum )에 대한 저항성의 경우, 토마토 Cf-9 유전자 (문헌 [Jones et al., 1994 Science 266:789] 참조); 슈도모나스 시린개 ( Pseudomonas syringae ) pv. 토마토에 대한 저항성의 경우, 단백질 키나제를 암호화하는 토마토 Pto 유전자 (문헌 [Martin et al., 1993 Science 262:1432] 참조); 및 슈도모나스 시린개에 대한 저항성의 경우 아라비도프시스 RSSP2 유전자 (문헌 [Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089] 참조)를 포함한다.

    (B) 바실루스 투린기엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) 단백질, 그의 유도체 또는 그 위에 모델링된 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자 (문헌 [Geiser et al., 1986 Gene 48:109] 참조) 및 식물 생장과 관계된 살충성 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . 93:5389-94] 참조)의 뉴클레오티드 서열. 더우기, δ-내독소 유전자를 암호화하는 DNA 분자는 ATCC 승인 번호 40098, 67136, 31995 및 31998 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입할 수 있다.

    (C) 렉틴, 예컨대 몇 가지 클리비아 미니아타 ( Clivia miniata ) 만노스-결합성 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Van Damme et al., 1994 Plant Molec . Biol . 24:825] 참조).

    (D) 비타민 결합성 단백질, 예컨대 곤충 병충해에 대항하여 유충을 죽이는 약제로서 유용한 아비딘 및 아비딘 상동체 ([미국 특허 번호 5,659,026] 참조).

    (E) 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 이러한 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (문헌 [Abe et al., 1987 J. Biol. Chem . 262:16793] 참조), 담배 프로테이나제 억제제 I (문헌 [Huub et al., 1993 Plant Molec . Biol . 21:985] 참조), 및 α-아밀라제 억제제 (문헌 [Sumitani et al., 1993 Biosci . Biotech . Biochem . 57:1243] 참조)를 포함한다.

    (F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 및 유충 호르몬, 그의 변이체, 그 위에 기초한 유사작용제, 또는 그의 길항제 또는 작동제, 예컨대 유충 호르몬의 불활성인자인, 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제의 바쿨로바이러스 발현 (문헌 [Hammock et al., 1990 Nature 344:458] 참조).

    (G) 발현시, 병든 해충의 생리학을 붕괴시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드 (문헌 [ J. Biol . Chem . 269:9] 참조). 이러한 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (문헌 [Regan, 1994] 참조), 디플롭테라 푼크타타 ( Diploptera punctata )에서 확인된 알로스타틴 (문헌 [Pratt, 1989] 참조), 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 ([미국 특허 번호 5,266,361] 참조)를 포함한다.

    (H) 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생산된 곤충-특이적 사독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 (문헌 [Pang, 1992 Gene 116:165] 참조).

    (I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체, 또는 살충 활성을 지닌 또 다른 비-단백질 분자의 과축적에 대해 책임이 있는 효소.

    (J) 생물학상 활성 분자의 변형 (번역 후 변형 포함)에 관여한 효소; 예를 들어, 자연적이든 합성이든지 간에, 당분해성 효소, 단백질 분해성 효소, 지질 분해성 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제. 이러한 유전자의 예는 칼라스 유전자 (문헌 [PCT 공개 출원 WO93/02197] 참조), 키나제-암호화 서열 (이는, 예를 들어 승인 번호 3999637 및 67152 하에 ATCC로부터 수득할 수 있다), 담배 구충 키티나제 (문헌 [Kramer et al., 1993 Insect Molec . Biol . 23:691] 참조), 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (문헌 [Kawalleck et al., 1993 Plant Molec . Biol . 21:673] 참조)를 포함한다.

    (K) 신호 변환을 자극하는 분자. 이러한 분자의 예는 녹두 칼모둘린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Botella et al., 1994 Plant Molec . Biol . 24:757] 참조) 및 옥수수 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Griess et al., 1994 Plant Physiol . 104:1467] 참조).

    (L) 소수성 순간 펩티드 ([미국 특허 번호 5,659,026 및 5,607,914] 참조) (후자 특허는 질환 저항성을 부여해주는 합성 항미생물성 펩티드를 교시한다).

    (M) 채널 형성자 또는 채널 차단자인 막 투과효소, 예컨대 트랜스제닉 담배 식물이 슈도모나스 솔라나세아룸 ( Pseudomonas solanacearum )에 대해 저항성이 되게 하는 세크로핀-β 용해성 펩티드 유사체 (문헌 [Jaynes et al., 1993 Plant Sci . 89:43] 참조).

    (N) 바이러스-침습성 단백질 또는 그로부터 유래된 복합 독소. 예를 들어, 바이러스 외피 단백질이 형질전환된 식물 세포에 축적되는 것이, 바이러스성 감염 및/또는 외피 단백질 유전자가 유래되는 바이러스 뿐만 아니라 관련 바이러스에 의해 수행된 질환 발생에 대한 저항성을 부여해준다. 외피 단백질-매개된 저항성은 식물을 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 스트리크 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 에치 바이러스, 담배 래틀(rattle) 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대항하여 형질전환시킬 때 부여되었다 (예를 들어, 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann . Rev . Phytopathol . 28:451] 참조).

    (O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충 장기에서의 결정적 대사 기능을 표적화하는 항체는, 악영향을 받은 효소를 불활성화시켜 곤충을 사멸시킬 것이다 (예를 들어, 문헌 [Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Intl. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzymatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments] 참조).

    (P) 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호된다는 것을 보여주는 바이러스-특이적 항체 (예를 들어, 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469] 참조).

    (Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산된 발육-저지 단백질. 따라서, 진균성 엔도 α-1,4-D 폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균성 집락화 및 식물 영양분 방출을 촉진시킨다 (문헌 [(Lamb et al., 1992) Bio / Technology 10:1436] 참조). 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제성 단백질을 암호화하는 유전자의 클로닝 및 성상 확인은 다음 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Toubart et al. (1992 Plant J . 2:367)] 참조).

    (R) 식물에 의해 자연에서 생산된 발육-저지 단백질, 예컨대 진균성 질환에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 (문헌 [(Longemann et al., 1992). Bio / Technology 10:3305] 참조).

    (S) RNA 간섭 (여기서는, RNA 분자를 사용하여 표적 유전자의 발현을 억제한다). 한 예에서의 RNA 분자는 부분적 또는 완전히 이중 가닥이고, 이는 억제 반응을 촉발시켜 dsRNA를 저분자 간섭 RNA로 절단시킨 다음, 상동 mRNA를 붕괴시키는 표적화 복합체 내로 혼입된다 (예를 들어, 문헌 [Fire et al., 미국 특허 번호 6,506,559]; [Graham et al., 미국 특허 번호 6,573,099] 참조).

    2. 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 유전자

    (A) 생장점 또는 분열 조직을 억제하는 제초제, 예컨대 이미다잘리논, 술폰아닐리드 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 유전자. 이러한 범주 내의 예시 유전자는 AHAS 효소로서 공지되기도 한 돌연변이체 ALS 효소를 암호화한다 (문헌 [Lee et al., 1988 EMBO J . 7:1241] 참조).

    (B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해 부여되거나, 또는 유전자, 예컨대 GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 기타 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 ( pat 및 bar 유전자; DSM-2), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 암호화 유전자)에 의한 대사 불활성화를 통하여 부여된 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 하나 이상의 부가 유전자 (예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP 형태의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,940,835 참조). 돌연변이체 aroA 유전자를 암호화하는 DNA 분자는 ATCC 승인 번호 39256 하에 수득할 수 있고, 상기 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 포스피노트리신아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 출원 번호 0 242 246에 제공된다. 문헌 ([De Greef et al. (1989) Bio / Technology 7:61] 참조)에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생성이 기재되어 있다. 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온에 대한 저항성을 부여해주는 예시 유전자, 예컨대 세톡시딤 및 할옥시폽은 다음 문헌에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다 (문헌 [Marshall et al. (1992) Theor . Appl . Genet . 83:435] 참조).

    (C) 광합성을 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 유전자, 예컨대 트리아진 ( psbA 및 gs + 유전자) 및 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자). 문헌 ([Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169] 참조)에는 클라미도모나스 ( Chlamydomonas )를 형질전환시키기 위해 돌연변이체 psbA 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하는 것이 기재되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 승인 번호 53435, 67441 및 67442 하에 입수 가능하다. 글루타치온 S-트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 ([Hayes et al. (1992) Biochem. J . 285:173] 참조)에 기재되어 있다.

    (D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)를 호모젠티세이트로 형질전환시키는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)와 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 효소. 이는 제초제, 예컨대 이속사졸 (문헌 [EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659], [미국 특허 번호 5,424,276] 참조), 특히 옥수수에 대한 선택적 제초제인 이속사플루톨, 디케토니트릴 (문헌 [EP496630, EP496631] 참조), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (문헌 [EP625505, EP625508], [미국 특허 번호 5,506,195] 참조), 특히 술코트리온 및 피라졸리네이트를 포함한다. 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자가 상기 제초제에 대한 내성 또는 저항성을 제공할 수 있는데, 이는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원 공개 번호 20030066102에 기재된 유전자를 포함한다.

    (E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 유전자, 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 부여해줄 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 미국 특허 번호 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 ( aad -1) 유전자를 포함한다.

    (F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 유전자, 및 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루록시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여해줄 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 ( aad -12)를 포함한다.

    (G) 디캄바(Dicamba)에 대한 저항성 또는 내성을 암호화하는 유전자 (예를 들어, [미국 특허 공개 번호 20030135879] 참조).

    (H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 ([미국 특허 번호 5,767,373] 참조).

    (I) 포토시스템 II 반응 센터 (PS II)의 코어 단백질과 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대, 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대, 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (문헌 [Brussian et al., (1989) EMBO J . 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).

    3. 가치-부가된 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자

    (A) 예를 들어, 옥수수 또는 브라시카를 안티센스 유전자 또는 스테아로일-ACP 불포화효소로 형질전환시켜 상기 식물의 스테아르산 함량을 증가시킴으로써 변형된 지방산 대사 (문헌 [Knultzon et al., 1992 Proc . Nat . Acad . Sci . USA 89:2624] 참조).

    (B) 감소된 피테이트 함량

    (1) 피타제-암호화 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니거 ( Aspergillus niger ) 피타제 유전자 (문헌 [Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87] 참조)의 도입은 피테이트의 붕괴를 증강시켜, 보다 자유로운 포스페이트를 형질전환된 식물에 부가시켜 준다.

    (2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자를 도입할 수 있다. 옥수수에서, 이는 예를 들어, 저 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에 대해 책임이 있는 단일 대립 유전자와 연관된 DNA를 클로닝 및 재도입함으로써 달성할 수 있다 (문헌 [Raboy et al., 1990 Maydica 35:383] 참조).

    (C) 예를 들어, 식물을, 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환시킴으로써 수행된 변형된 탄수화물 조성. 이러한 효소의 예는 스트렙토코쿠스 무쿠스 ( Streptococcus mucus ) 프럭토실트랜스퍼라제 유전자 (문헌 [Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol . 170:810] 참조), 바실루스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis ) 레반수크라제 유전자 (문헌 [Steinmetz et al., 1985 Mol . Gen. Genet . 200:220] 참조), 바실루스 리케니포르미스 ( Bacillus licheniformis ) α-아밀라제 (문헌 [Pen et al., 1992 Bio / Technology 10:292] 참조), 토마토 전화효소 유전자 (문헌 [Elliot et al., 1993] 참조), 보리 아밀라제 유전자 (문헌 [Sogaard et al., 1993 J. Biol . Chem . 268:22480] 참조), 및 옥수수 내배엽 전분 분지화 효소 II (문헌 [Fisher et al., 1993 Plant Physiol . 102:10450] 참조)를 포함한다.

    관심 서열은 또한, 상동 재조합을 통하여 식물 게놈의 예정 구역 내로 도입된 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동 재조합을 통하여 식물 세포의 특이적 염색체 부위 내에서 폴리뉴클레오티드 서열을 안정적으로 통합시키기 위한 방법은 당해 분야에 보고되었다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0111188 A1에 기재된 바와 같은 부위 특이적 통합은 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 염색체 표적 내로 도입하는 것을 매개하기 위해 재조합효소 또는 인테그라제를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 국제 특허 출원 번호 WO 2008/021207에는 게놈의 특이적 위치 내에서 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 안정적으로 통합시키기 위한 아연 핑거 매개된 상동 재조합이 기재되어 있다. 미국 특허 번호 6,720,475에 기재된 바와 같은 FLP/FRT, 또는 미국 특허 번호 5,658,772에 기재된 바와 같은 CRE/LOX와 같은 재조합효소의 사용을 활용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 특이적 염색체 부위 내로 안정적으로 통합시킬 수 있다. 최종적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드를 특이적 염색체 위치 내로 표적화하기 위해 메가뉴클레아제를 사용하는 것은 다음 문헌에 기재되었다 (문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060] 참조).

    식물 세포 내에서 부위 특이적 통합시키기 위한 기타 각종 방법이 일반적으로 공지되어 있고 적용 가능하다 (문헌 [Kumar et al., Trends in Plant Sci . 6(4) (2001) pp. 155-159] 참조). 더우기, 몇 가지 원핵 및 하등 진핵 유기체에서 확인된 바 있는 부위-특이적 재조합 시스템을 식물에서 사용하기 위해 적용할 수 있다. 이러한 시스템의 예는 효모 지고삭카로마이세스 로욱시이 ( Zygosaccharomyces rouxii )의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 재조합효소 시스템 (문헌 [Araki et al. (1985) J. Mol . Biol . 182: 191-203] 참조), 및 파아지 Mu의 Gin/gix 시스템 (문헌 [Maeser and Kahlmann (1991) Mol . Gen . Genet . 230: 170-176] 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    본 개시내용의 특정 실시양태의 핵산 분자와 연계해서 각종 검정을 이용할 수 있다. 다음 기술이 각종 상황에 유용하고, 한 양태에서는, 식물 세포에서 암호화된 핵산 분자 및/또는 폴리펩티드의 존재를 탐지하는 데 유용하다. 예를 들어, 상기 분자의 존재는 서열의 프라이머 또는 프로브의 사용, 암호화된 단백질을 탐지하기 위한 ELISA 검정, 단백질을 탐지하기 위한 웨스턴 블롯(Western blot), 또는 RNA 또는 DNA를 탐지하기 위한 노던(Northern) 또는 서던(Southern) 블롯을 포함한 각종 방식으로 결정할 수 있다. 효소 DGT-14를 탐지하기 위한 효소적 검정을 이용할 수 있다. 추가로, 당해 분야에서 인식된 과정을 이용하여, DGT-14 단백질의 존재를 탐지할 수 있는 항체를 생성시킬 수 있다. 계내 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색과 같은 부가 기술을 또한 사용하여, 특이적 식물 기관 및 조직 내에서의 재조합 구조물의 존재 또는 발현을 탐지할 수 있다. 트랜스유전자는 식물의 일부 조직 또는 일부 발생 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스유전자는 실질적으로 그의 전체 생활 주기를 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 어떠한 조합 발현 방식도 또한 적용 가능하다.

    서던 분석이 흔히 사용되는 탐지 방법인데, 여기서는 DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 아가로스 겔 상에서 분획화하여 DNA를 분자량 별로 분리한 다음, 나일론 막으로 옮겼다. 그 다음, 이를 32 P (또는 기타 프로브 표지)로 방사성 표지시킨 프로브 단편과 혼성화하고, SDS 용액에서 세척한다.

    마찬가지로, 노던 분석은 유사한 프로토콜을 효율적으로 사용하는데, 여기서는 RNA를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 아가로스 겔 상에서 분획화하여 RNA를 분자량 별로 분리한 다음, 나일론 막으로 옮겼다. 그 다음, 이를 32 P (또는 기타 프로브 표지)로 방사성 표지시킨 프로브 단편과 혼성화하고, SDS 용액에서 세척한다. 관심 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 분석은 상대적 발현 수준을 표시할 수 있다. 전형적으로, 이러한 mRNA가 존재하거나 또는 mRNA의 양이 증가된 경우, 상응하는 트랜스유전자가 발현된 것으로 추정할 수 있다. 노던 분석, 또는 기타 mRNA 분석 프로토콜을 사용하여 도입된 트랜스유전자 또는 천연 유전자의 발현 수준을 결정할 수 있다.

    웨스턴 분석에서는, DNA/RNA를 단리하는 대신, 관심 단백질을 추출하고, 이를 아크릴아미드 겔 상에 놓아둔다. 이어서, 상기 단백질을 막 상에 블롯팅하고, 표지화 물질과 접촉시킨다 (예를 들어, 문헌 [Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification" Molecular Breeding 3:291-306 (1997)]; [Towbin et al, (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications" Proc Natl Acad Sci USA 76(9): 4350-4354]; [Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure" Proc Natl Acad Sci USA 76(7): 3116-3120] 참조).

    본 개시내용의 실시양태의 핵산 분자, 또는 그의 절편을 PCR 증폭용 프라이머로서 사용할 수 있다. PCR 증폭을 수행하는 데 있어서, 특정 정도의 부정합이 프라이머와 주형 간에 용인될 수 있다. 따라서, 예시된 프라이머의 돌연변이, 결실 및 삽입 (특히, 5' 말단으로의 뉴클레오티드의 부가)이 본 발명의 개시내용의 범위 내에 속한다. 돌연변이, 삽입 및 결실은 당업자에게 공지된 방법에 의해 소정의 프라이머로 생성시킬 수 있다.

    탐지 방법의 또 다른 예는 문헌 ([Winge, Innov . Pharma . Tech . 00:18-24, 2000] 참조)에 기재된 바와 같은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 기술이다. 이러한 방법에서는, 인접한 게놈 DNA 및 삽입 DNA 연접부와 중복되는 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 관심 영역 (삽입된 서열 내의 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열 내의 하나의 프라이머)으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물과 혼성화하고, 이를 DNA 중합효소, ATP, 술푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재하에 항온 배양한다. DNTP를 개별적으로 가하는데, 이러한 혼입으로 인해, 측정되는 광 신호가 발생한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 연장으로 인한 트랜스유전자 삽입체/플랭킹 서열의 존재를 표시한다. (이러한 기술은 초기 서열 분석을 위해 사용되는 것이지만, 특이적 유전자가 공지된 경우에는 이를 탐지하기 위한 것이 아니다).

    서열 탐지에 사용하기 위한 분자 비콘(Beacon)이 보고되었다. 간략하게 설명하면, 플랭킹 게놈 및 삽입 DNA 연접부와 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계한다. FRET 프로브의 독특한 구조로 인해, 형광성 부분과 켄칭 부분이 아주 근접하여 유지되는 2차 구조를 함유하는 것이 생성된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열 내의 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열 내의 하나의 프라이머)를 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환시킨다. 성공적인 PCR 증폭 이후, FRET 프로브(들)를 표적 서열과 혼성화시키면, 프로브 2차 구조가 제거되고 형광성 부분과 켄칭 부분이 공간적으로 분리된다. 형광성 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 플랭킹 게놈/트랜스유전자 삽입체 서열이 존재한다는 것을 표시한다.

    TAQMAN ® [라이프 테크놀로지스 (Life Technologies; 미국 캘리포니아주 포스터 시티)]로서 공지되기도 한 가수분해 프로브 검정은 DNA 서열의 존재를 탐지하고 정량화하는 방법이다. 간략하게 설명하면, 트랜스유전자 내에 하나의 올리고를 수반하고 사건-특이적 탐지를 위해 플랭킹 게놈 서열 내에 하나의 올리고를 수반하는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열 내의 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열 내의 하나의 프라이머)를 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환시킨다. FRET 프로브를 혼성화시키면, 절단이 이루어져 형광성 부분이 FRET 프로브 상의 켄칭 부분으로부터 제거 방출된다. 형광성 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 플랭킹/트랜스유전자 삽입체 서열이 존재한다는 것을 표시한다.

    ELISA 또는 효소 결합 면역검정이 1971년 이래로 공지되어 왔다. 일반적으로, 완충제에 가용화된 항원을 플라스틱 표면 상에 코팅한다. 혈청을 가한 경우, 항체를 고체 상 위의 항원에 부착시킬 수 있다. 이들 항체의 존재 또는 부재는 효소와 접합시킨 경우에 입증할 수 있다. 적당한 기질을 부가하는 것이, 정량화될 수 있는 결합된 접합체의 양을 탐지해줄 것이다. 통상의 ELISA 검정은 바이오티닐화 항-(단백질) 폴리클로날 항체 및 알칼리성 포스포타제 접합체를 사용하는 것이다. 예를 들어, 락카제 수준의 정량적 결정을 위해 사용된 ELISA는 상업적으로 수득된 폴리클로날 토끼 항체를 활용하는 항체 샌드위치 검정일 수 있다. 이 항체를 탐지를 위해 알칼리성 포스파타제와 접합시킨다. 또 다른 예에서, 트립신 또는 트립시노겐을 탐지하는 ELISA 검정은 바이오티닐화 항-트립신 또는 항-트립시노겐 폴리클로날 항체 및 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 접합체를 이용한다.

    N-(포스포노메틸) 글리신을 포함하는 조성물인 글리포세이트는 제초제에 광범위하게 사용되고 있는 성분이다. 글리포세이트는 전형적으로, 수성 액상 농축물, 고형 농축물, 에멀션 또는 마이크로에멀션 중의 염으로서 제제화된다. 제제 중 어느 것에 따라서도 사용될 수 있는 글리포세이트의 적합한 염 형태는, 예를 들어 알칼리 금속 염, 예를 들어 소듐 및 포타슘 염, 암모늄 염, 디-암모늄 염, 예컨대 디메틸암모늄, 알킬아민 염, 예를 들어 디메틸아민 및 이소프로필아민 염, 알칸올아민 염, 예를 들어 에탄올아민 염, 알킬술포늄 염, 예를 들어 트리메틸술포늄 염, 술폭소늄 염, 및 그의 혼합물 또는 조합물을 포함한다. 글리포세이트의 상업용 제제의 예는 다음을 제한없이 포함한다: GLYPHOMAX ® , GLYPHOMAX ® XRT, GLYPHOMAX ® PLUS, DURANGO ® , ROUNDUP ULTRA ® , ROUNDUP ULTRAMAX ® , ROUNDUP ® CT, ROUNDUP ® EXTRA, ROUNDUP ® BIOACTIVE, ROUNDUP ® BIOFORCE, RODEO ® , POLARIS ® , SPARK ® , ACCORD ® SP, ACCORD ® XRT, 및 ACCORD ® CONCENTRATE (이들 모두는 글리포세이트를 그의 이소프로필암모늄 염 (IPA)으로서 함유한다); ROUNDUP ® DRY 및 RIVAL™ (이는 글리포세이트를 그의 암모늄 염으로서 함유한다); ROUNDUP ® GEOFORCE (소듐 글리포세이트 제제); TOUCHDOWN™ (글리포세이트 트리메슘 염 제제), TOUCHDOWN IQ™ (글리포세이트 디암모늄 염 제제), TOUCHDOWN TOTAL IQ™ (포타슘 글리포세이트 제제), 및 ROUNDUP WEATHERMAX ® (포타슘 글리포세이트 제제). 글리포세이트 제제는 독성 완화제, 계면활성제 및 아주반트를 포함할 수 있다. 글리포세이트 제초제 제제에 대해 저항성인 식물 또는 식물 세포를 제공하는 것이 각종 적용에 유용할 수 있는데, 이러한 저항성을 갖는 식물 세포는 경작 구역 내의 잡초를 방제하기 위해 사용되는 충분한 양의 글리포세이트에 대한 노출을 견딜 수 있다. 천연 세균성 dgt -14 뉴클레오티드 서열의 변형은, 식물 세포 내에서 발현되는 경우 제초제 글리포세이트에 대한 개선된 저항성을 제공할 수 있다.

    글리포세이트는 다양한 식물 발생 단계 전반에 걸친 출현으로부터 과도한 식물에 적용할 수 있다. 글리포세이트 제초제성 제제와 병용해서 사용된 글리포세이트 내성 식물 품종은 미국 및 전세계에 걸쳐 작물 생산에 있어서 잡초 관리를 위한 표준 프로그램이 되어 왔다. 글리포세이트 내성 형질 (예를 들어, dgt -14)을 사용하는 데 있어서의 재배자의 주요 이점은 그것이 탁월한 작물 안전성을 수반하고 파종전 제초제 적용에 덜 의존적으로 불필요한 식물 및 풀 (즉, "잡초")을 방제해주는, 광범위한 스펙트럼의 발아 후 제초제인 글리포세이트의 간단하고도 편리한 적용을 허용해준다는 것이다. 기타 이점은 무경운에 보다 우수하게 적합하고, 저하된 경운 시스템을 포함한다. 글리포세이트 내성 작물은 잡초 관리에 대한 선택 사항을 확장시켰고, 잡초 방제 실시를 보다 용이하고, 비용이 덜 들며 보다 융통성 있게 만들었다. 재배자는 제초제를 적용하기 위해 들판을 가로지르는 이동 수가 더 적어졌을 뿐만 아니라 경작 이동 수도 더 적어져서 연료를 절약하고 토양 침식을 감소시킬 수 있다고 보고하였다. 따라서, 글리포세이트-내성 작물은 필요한 화학물질 잡초 방제 효율을 증가시킴과 동시에 제초제에 의해 부여된 환경학적 위험을 감소시킨다.

    따라서, 각종 실시양태에서, 글리포세이트 저항성 식물을 함유하는 경작 구역 내에서 잡초를 선택적으로 방제하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 잡초의 성장을 제어하기에 충분한 양의 제초제 글리포세이트를 작물 잎 및 잡초에 적용하는 것을 포함한다.

    고려된 제초제 조성물 (즉, 미립형 고형 농축물, 또는 액상 농축물, 또는 또 다른 한편, 즉시 사용형 또는 탱크-혼합 조성물)에 존재하는 글리포세이트의 상대적 양은, 예를 들어 방제하고자 하는 잡초 종 및 적용 방법을 포함한 많은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 그러나, 일반적으로 언급하면, 상기 제초제 조성물에 사용된, 글리포세이트 및 임의로, 계면활성제 및/또는 일부 기타 아주반트 또는 부가제 (본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같음)의 농도는 경작 구역 내에서 잡초를 방제하기에 충분하다.

    부가적으로, 상기 제초제 조성물에 사용된, 글리포세이트 및 임의로, 계면활성제 및/또는 일부 기타 아주반트 또는 부가제 (본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같음)의 농도는 경작 구역 내에서 잡초 재성장의 제어를 제공하기에 충분하다.

    따라서, 액상 농축물 조성물은 글리포세이트를 1 리터당 약 50 그램 이상, 약 75 그램 이상, 또는 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 또는 700 그램 (산 당량 또는 ae) 이상의 농도로 포함하도록 제제화된다. 글리포세이트 농도는, 예를 들어 1 리터당 약 50 내지 약 680 그램 (ae), 1 리터당 약 100 내지 약 600 그램 (ae)(gpl), 1 리터당 약 250 내지 약 600 그램 (ae), 또는 1 리터당 약 360 내지 약 540 그램 (ae)의 범위이다. 글리포세이트 농축물의 총 중량을 기준으로 한 중량 %로서 표현되는 경우, 액상 농축물은 약 10 중량% 이상의 글리포세이트 (산 당량 또는 ae), 약 15 중량% 이상, 또는 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 또는 68 중량% ae 이상을 포함한다. 글리포세이트 농도는, 예를 들어 약 10 중량% 내지 약 70 중량% ae, 약 20 중량% 내지 약 68 중량% ae, 또는 약 25 중량% 내지 약 45 중량% ae의 범위이다. 농축물을 즉시 사용 조성물로서 적용하는 경우, 글리포세이트 농도는 전형적으로 약 1 중량% 내지 약 3 중량% ae, 및 약 1 중량% 내지 약 2 중량% ae이다.

    글리포세이트 농축물의 총 중량을 기준으로 한 중량 %로서 표현되는 경우, 고형 농축물 조성물은 글리포세이트를 약 5 중량% 이상의 글리포세이트 (산 당량 또는 ae), 약 20 중량% ae 이상, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 중량% ae 이상의 농도로 포함하도록 제제화한다. 글리포세이트 농도는, 예를 들어 약 5 중량% 내지 약 97 중량% ae, 약 30 중량% 내지 약 85 중량% ae, 또는 약 50 중량% 내지 약 75 중량% ae의 범위이다.

    분무 조성물은 1 에이커당 분무 조성물 약 1 갤런 (3.8 L) 이상, 1 에이커당 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 갤런 (75.7 L) 이상을 적용하도록 제제화된다. 분무 조성물의 분무 용적은, 예를 들어 항공 살포의 경우에는, 1 에이커당 약 1 갤런 (3.8 L) 내지 약 100 갤런 (380 L), 1 에이커당 약 2 갤런 (7.6 L) 내지 약 40 갤런 (151.4 L), 및 1 에이커당 약 2 갤런 (7.6 L) 내지 약 5 갤런 (18.9 L)의 범위이고, 지상 살포의 경우에는 1 에이커당 약 5 갤런 (18.9 L) 내지 약 20 갤런 (75.7 L)의 범위이다.

    또 다른 한편, 글리포세이트 제초제 조성물은 목적하는 적용 희석도로 이미 제제화되어 (즉, "즉시 사용형" 조성물) 최종 사용자에게 공급되거나 또는 최종 사용자가 물에서 희석, 분산 또는 용해시켜야 하는 것으로 (즉, "농축물" 조성물) 제공될 수 있다. 이러한 예비-제제화 농축물은 액체 또는 미립형 고체일 수 있다.

    글리포세이트가 주로 염의 형태로 존재하는 수성 상, 및 비교적 수불용성인 제2의 제초제 활성 성분을 임의로 함유하는 비-수성 상을 갖는 액상 농축물 제제를 이용할 수 있다. 이러한 제제는 예시적으로, 에멀션 (매크로 및 마이크로에멀션, 유중수, 수중유 및 수중 유중수 유형 포함), 현탁제 및 현탁에멀션을 포함한다. 비-수성 상은 임의로, 마이크로캡슐화 성분, 예를 들어 마이크로캡슐화 제초제를 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 비-수성 상을 갖는 제제에서 전체로서의 조성물 중의 글리포세이트의 농도(ae)는 수성 농축물 제제에 대해 본원에서 인용된 범위 이내이다.

    제초제 분무 조성물은 이것이 적용을 위해 준비 제작되든지 아니면 액상 글리포세이트 농축물을 추가 희석하거나 또는 미립 고형 글리포세이트 농축물에 물을 부가하는 것으로부터 비롯되든지 간에, 수성 용제 또는 분산제로서 적용된다는 것을 인지해야 한다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "수성"은 존재하는 우세 용매가 물인 한은 일부 소량의 비-수성 용매의 존재를 배제하는 것은 아니다.

    본 개시내용의 실시양태는 특정 작물 (예를 들어, 트랜스제닉 글리포세이트 저항성 식물)을 함유하는 경작 구역 내에서 잡초 또는 불필요한 생장을 사멸 또는 방제하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 글리포세이트를 탱크 혼합물로서 적용하고, 제초상 충분한 양의 탱크 혼합물을, 글리포세이트에 내성이 있도록 유전적으로 형질전환시킨 식물의 잎에 적용하며, 이와 동시에 상기 식물에 아주 근접하여 성장하고 있는 잡초의 잎에 적용하는 것을 포함한다. 이러한 사용 방법으로, 제초제 내성 식물에게는 실질적으로 해를 입히지 않고서도 잡초 또는 불필요한 생장을 제어한다.

    본 개시내용의 실시양태에서, 수성 글리포세이트 조성물을 식물의 잎 조직에 적용하여 광범위한 불필요한 식물 (1년생 및 다년생 풀 및 활엽 잡초 종 포함)을 사멸시키거나 그의 생장을 제어할 수 있는데, 이는 식물의 잎 조직에 수성 글리포세이트 조성물을 적용함으로써 이루어진다. 이러한 식물은, 예를 들어 알팔파, 대두, 면, 평지씨, 아마씨, 옥수수, 벼, 브라키아리아, 밀, 홍화, 수수, 사탕무, 해바라기, 담배 및 잔디풀을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 어떠한 식물 종 또는 식물 세포도 선택할 수 있다. 실시양태에서, 본원에 사용된 식물 세포, 및 그로부터 성장되거나 유래된 식물은 평지씨 (브라시카 나푸스); 갓 (브라시카 준세아); 에티오피아 겨자 (브라시카 카리나타); 순무 (브라시카 라파); 양배추 (브라시카 올레라세아); 대두 (글리시네 맥스); 아마씨/아마 (리눔 우시타티시뭄); 옥수수 (제아 매이스); 홍화 (카르타무스 틴크토리우스); 해바라기 (헬리안투스 안누우스); 담배 (니코티아나 타바쿰); 아라비도프시스 탈리아나; 브라질 호두 (베톨레티아 엑셀사); 피마자 (리시누스 콤무니스); 코코넛 (코쿠스 누시페라); 고수풀 (코리안드룸 사티붐); 면 (고시퓸 종); 땅콩 (아라키스 히포개아); 조조바 (시몬드시아 키넨시스); 야자유 (엘래이스 귀네에이스); 올리브 (올레아 에우르패아); 벼 (오리자 사티바); 스쿼시 (쿠쿠르비타 맥시마); 보리 (호르데움 불가레); 사탕수수 (사카룸 오피시나룸); 벼 (오리자 사티바); 밀 (트리티쿰 두룸 및 트리티쿰 애스티붐을 포함한 트리티쿰 종); 및 개구리밥 (렘나세애 종)으로부터 수득 가능한 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 식물 종 내에서의 유전적 배경은 다양할 수 있다.

    제초제 조성물은 목적하는 생물학적 결과, 즉 글리포세이트 내성 농작물에 상당한 영향을 미치지 않고서 잡초 생장의 제어를 제공하기에 충분한 비율로 식물에 적용한다. 이들 적용 비율은 통상적으로, 처리된 단위 면적당 글리포세이트의 양 (예를 들어, 헥타르당 그램 (g/ha))으로서 표현된다. "상당한 효과"를 구성하는 것은 조성물을 연구하고, 개발하며, 판매하고 사용하는 사람의 기준 및 실시에 따라서 다양하고, 조성물에 대해 상당히 유효한 적용 비율의 선택은 당업자의 기술 수준 내이다. 전형적으로, 생장 감소 또는 사망률로써 측정된 바와 같은 잡초 종의 85% 방제를 제공하기 위해 단위 면적당 적용된 조성물의 양이 종종, 상업적 비율을 규정하기 위해 사용된다.

    경작 구역 내에서 잡초를 방제하기에 충분한 수많은 글리포세이트 제초제 적용 비율의 선택은 통상의 농업 과학자의 기술 수준 내이다. 당업자는 마찬가지로, 개별적 식물 상태, 기후 및 생장 조건 뿐만 아니라 상기 조성물 중의 특이적 활성 성분 및 그들의 중량비가 본원에 개시된 방법을 실시하는 데 있어서 달성된 제초제 유효성 정도에 영향을 미칠 것이란 사실을 인식할 것이다.

    제초제 분무 조성물은 항공 살포 및 지상 살포 기술 [예를 들어, 그라운드 붐(ground boom), 핸드 분무기, 로프 윅(rope-wick) 등]을 포함한, 당업자에게 널리 공지되어 있는 적당한 모든 방법을 통하여 처리하고자 하는 식물의 잎에 적용할 수 있다.

    필요에 따라, 사용자는 하나 이상의 아주반트를 본 개시내용의 조성물과 혼합하고, 살포 조성물을 제조하는 경우에는 희석용 물과 혼합할 수 있다. 이러한 아주반트는 제초제 효능을 추가로 증강시킬 목적으로 부가의 계면활성제 및/또는 무기 염, 예컨대 황산암모늄을 포함할 수 있다.

    추가의 개선책은 또한, 식물을 추가로 보호하고/하거나 더 많은 제초제에 대한 교차 저항성을 부가하기 위해 적당한 독성 완화제와 함께 사용하는 것을 포함한다. 독성 완화제는 전형적으로, cP450를 활성화/발현시킴으로써 식물의 면역계를 증가시키는 작용을 한다. 독성 완화제는 잡초 방제 효능은 손상시키지 않으면서도, 생리학적 또는 분자 기전에 의해 농작물에 대한 제초제의 세포독성을 저하시키는 화학적 작용제이다.

    제초제 독성 완화제는 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시오메트리닐, 디클로르미드, 디시클로논, 디에톨레이트, 펜클로라졸, 펜클로림, 플루라졸, 플룩소페님, 푸릴라졸, 이속사디펜, 메펜피르, 메페네이트, 나프탈릭 무수물, 및 옥사베트리닐을 포함한다. 식물 활성화제 (그의 방어 기전을 활성화시킴으로써 식물을 보호해주는 새로운 부류의 화합물)를 또한, 본 발명의 개시내용의 실시양태에 사용할 수 있다. 이들은 아시벤졸라르 및 프로베나졸을 포함한다.

    상업화된 독성 완화제는 파종 전에 혼입되거나 또는 출아 전에 적용된 티오카르바메이트 및 클로로아세트아닐리드 계열의 제초제에 대항하여, 굵은 종자 풀 작물, 예컨대 옥수수, 수수 및 습윤-파종 벼를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 독성 완화제는 또한, 아릴옥시페녹시프로피오네이트 및 술포닐우레아 제초제의 발아 후 적용에 대항하여 겨울철 곡물 (예컨대, 밀)을 보호하기 위해 개발되었다. 술포닐우레아, 이미다졸리논, 시클로헥산디온, 이속사졸 및 트리케톤 제초제에 대항하여 옥수수 및 벼를 보호하기 위해 독성 완화제를 사용하는 것 또한 널리 정립되었다. 독성 완화된 식물에서 독성 완화제-유도된 제초제 번역 증강은 독성 완화제 작용에 관여한 주요 기전으로서 널리 허용되고 있다. 독성 완화제는 조인자, 예컨대 글루타치온 및 제초제-번역성 효소, 예컨대 글루타치온 S-트랜스퍼라제, 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 및 글루코실 트랜스퍼라제를 유도시킨다 (문헌 [Hatzios KK, Burgos N (2004) "Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners," Weed Science : Vol. 52, No. 3 pp. 454- 467] 참조). 본 명세서에서 인용된 모든 공개공보 및 공개된 특허 문헌은 마치 각각의 개별적 공개공보 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 참조로 포함된다고 표시한 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

    본 발명의 개시내용의 실시양태는 다음 실시예에 추가로 규정된다. 이들 실시예는 단지 예시적으로 제공된다는 것을 인지해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 개시내용의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 그를 각종 활용 및 조건에 적응시키기 위해 본 개시내용의 실시양태의 각종 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본원에 제시되고 기재된 것 이외에도, 본 개시내용의 실시양태의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속할 것이다. 다음은 예시 목적으로 제공되며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것은 아니다.

    실시예

    실시예 1: 돌연변이체 EPSP 신타제

    에스케리챠 콜라이 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 신타제 효소 (EPSP 신타제)에서의 단일 아미노산 돌연변이 (G96A)로 인해, 글리포세이트 무감각이 유발될 수 있다 (문헌 [Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)] 참조). 이러한 돌연변이가 글리포세이트에 대한 내성을 부여하긴 하지만, 이는 EPSP 신타제와 그의 천연 기질인 포스포에놀피루베이트 (PEP)와의 결합에 불리한 영향을 미치는 것으로 공지되기도 한다. 이로써 생성되는, 기질 결합 효율 상의 변화는 돌연변이된 효소가 글리포세이트에 대한 식물체내 내성을 제공하는 데 부적합한 것으로 만들 수 있다.

    NCBI 유전자은행 데이터베이스를 대상으로 하여, EPSP 신타제 효소의 이. 콜라이 버전 내로 도입된 G96A 돌연변이의 위치와 유사한, 상기 EPSP 신타제 효소 내의 위치에 알라닌을 자연적으로 함유하는 EPSP 신타제 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열을 알아보기 위해 (문헌 [Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)] 참조), 또는 유사한 G96A 위치에서 글리신에 알라닌을 도입함으로써 변경시킬 수 있었던 EPSP 신타제 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열을 알아보기 위해 인실리코( in silico )로 스크리닝하였다.

    확인된 한 효소는 매리프로푼두스 페로옥시단스 ( Mariprofundus ferrooxydans )로부터의 DGT-14 (GENBANK ACC NO: ZP_01452683)였다. 추가의 인실리코 데이터 마이닝(mining) 결과, DGT-11 (GENBANK ACC NO: YP_989551.1), DGT-12 (GENBANK ACC NO: ZP_01622155.1), DGT-18 (GENBANK ACC NO: NP_928909.1), DGT-29 (GENBANK ACC NO: YP_322772.1), 및 DGT-30 (GENBANK ACC NO: ZP_02156189.1)으로서 표지된, DGT-14와 상동성을 나타내는 5개의 기타 독특한 효소가 밝혀졌다. 이들 효소 중 하나인 DGT-11 (서열 5)은 EPSP 신타제 효소의 이. 콜라이 버전 내로 도입된 G96A 돌연변이의 위치와 유사한, 상기 EPSP 신타제 효소 내의 위치에 천연 알라닌을 함유하고 있다. 상이한 유기체로부터의 EPSP 신타제 단백질은 길이가 상이하기 때문에, EPSP 신타제 효소의 이. 콜라이 버전에 대한 돌연변이의 넘버링이, 기타 유기체로부터의 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 넘버링과 반드시 상응하지 않는다. 글리신 아미노산 잔기에 도입된 알라닌으로 돌연변이되었거나 천연의 상기 확인된 EPSP 신타제 효소는 글리포세이트 내성 또는 PEP 기질 친화성과 관련하여 기존에 명확히 규명되지 않았다.

    신규한 DGT-14, DGT-12, DGT-18, DGT-29 및 DGT-30 효소를 수득하였고, 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이를, EPSP 신타제 효소의 이. 콜라이 버전에 대해 기재된 G96A 위치와 유사한 위치에서 EPSP 신타제 효소 내로 도입하였다. 아미노산 잔기 101에서 GENBANK ACC NO: ZP_01452683의 내인성 글리신을 대체하기 위해 알라닌을 도입함으로써 DGT-14 단백질 서열을 변형시켰는데, 이로써 서열 1이 생성되었다. 아미노산 잔기 111에서 GENBANK ACC NO: ZP_01622155.1의 내인성 글리신을 대체하기 위해 알라닌을 도입함으로써 DGT-12 단백질 서열을 변형시켰는데, 이로써 서열 7이 생성되었다. 아미노산 잔기 96에서 GENBANK ACC NO: NP_928909.1의 내인성 글리신을 대체하기 위해 알라닌을 도입함으로써 DGT-18 단백질 서열을 변형시켰는데, 이로써 서열 9가 생성되었다. 아미노산 잔기 96에서 GENBANK ACC NO: YP_322772.1의 내인성 글리신을 대체하기 위해 알라닌을 도입함으로써 DGT-29 단백질 서열을 변형시켰는데, 이로써 서열 11이 생성되었다. 아미노산 잔기 96에서 GENBANK ACC NO: ZP_02156189.1의 내인성 글리신을 대체하기 위해 알라닌을 도입함으로써 DGT-30 단백질 서열을 변형시켰는데, 이로써 서열 13이 생성되었다.

    상기 변형된 EPSP 신타제 효소, 및 천연 DGT-11 EPSP 신타제 효소를 대상으로 하여, 부류 I EPSP 신타제 효소와 비교함으로써 글리포세이트 내성 및 PEP 기질 친화성에 관하여 명확히 규명하였다. 다음 부류 I 효소를 비교물로서 사용하였다: 글리시네 맥스로부터의 DGT-1, 브라시카 나푸스로부터의 DGT-3 (GENBANK ACC NO: P17688), 및 트리티쿰 애스티붐으로부터의 DGT-7 (GENBANK ACC NO: EU977181). 부류 I EPSP 신타제 효소 및 그의 돌연변이체 변이체를 합성하고 평가하였다. 식물 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 돌연변이는 상기 효소의 이. 콜라이 버전으로부터의 G96A 돌연변이의 위치와 유사한 위치에서 EPSP 신타제 효소 내에 만들어진, 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이로 이루어졌다. 또한, 트레오닌에서 이소루이신으로의 돌연변이 및 프롤린에서 세린으로의 돌연변이를, 문헌 ([Funke et al., (2009)] 참조)에 기재된 바와 같이 이. 콜라이의 EPSP 신타제에서 아미노산 97 (T에서 I로의 돌연변이) 및 아미노산 101 (P에서 S로의 돌연변이)의 위치와 유사한 위치에서 상기 부류 I EPSP 신타제 효소 내에 도입하였다.

    도 1은 DGT-14, DGT-11, DGT-12, DGT-18, DGT-29 및 DGT-30을 기타 EPSP 신타제 효소와 부분 서열 정렬시킨 것을 도시한 것이다. DGT-14, DGT-12, DGT-18, DGT-29 및 DGT-30에 대해 글리신을 알라닌으로 변형시킨 결과로서, 이들 DGT 효소는 aroA EPSP 신타제 효소 아미노산 위치 96에서 보존된 알라닌을 공유하고 있다. 이러한 아미노산의 위치는 별표로써 표시되고, 아미노산 잔기는 밑줄처져 있다.

    도 2는 DGT-1, DGT-3, 및 DGT-7 효소의 정렬을 도시한 것이다. 글리신에서 알라닌으로 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치는 첫 번째 별표로써 표시된다. 트레오닌에서 이소루이신으로 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치는 두 번째 별표로써 표시된다. 프롤린에서 세린으로 돌연변이된 세 번째 아미노산 잔기의 위치는 세 번째 별표로써 표시된다. 이들 돌연변이를 DGT-1, DGT-3, 및 DGT-7의 상이한 버전 내로 도입하였다. 상기 돌연변이를 함유하는 유전자의 상이한 버전은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.

    실시예 2: 식물 및 세균에서 발현시키기 위한 서열의 최적화

    매리프로푼두스 페로옥시단스로부터의 DGT-14 암호화 서열을 분석한 결과, 최적의 식물 발현에 해로운 것으로 여겨졌던 몇 가지 서열 모티프의 존재 뿐만 아니라 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물에서 발현하기 위한 비-최적 코돈 조성의 존재가 밝혀졌다. 본 발명의 개시내용의 실시양태는 쌍떡잎 식물 또는 외떡잎 식물에서 최적으로 발현될 수 있는 DNA 서열을 생성시키기 위해 DGT-14를 암호화하는 식물 최적화 유전자의 설계를 제공하는데, 여기서는 서열 변형이 번역 또는 전사를 방해하지 않는다.

    유전 암호의 중복성/축중 (즉, 일부 아미노산은 1개 초과의 코돈에 의해 명시된다)에 의해 부여된 가소성으로 인해, 상이한 유기체 또는 유기체 부류에서의 게놈의 진화는 동의 코돈의 차별적 활용을 유발시켰다. 이러한 "코돈 편향"은 단백질 암호화 영역의 평균 염기 조성에 반영된다. 예를 들어, 비교적 저 함량의 G+C를 지닌 게놈을 갖는 유기체는 동의 코돈의 세 번째 위치에 A 또는 T를 갖는 더 많은 코돈을 활용하는 반면, 보다 고 함량의 G+C를 갖는 유기체는 세 번째 위치에 G 또는 C를 갖는 더 많은 코돈을 활용한다. 추가로, mRNA 내에서 "소수(minor)" 코돈의 존재는, 특히 이러한 소수 코돈에 상응하는 전하를 띤 tRNA의 상대적 존재도가 낮을 경우, 그 mRNA의 절대 번역 비율을 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이 추론의 확장은 개별적 소수 코돈에 의한 번역 비율의 감소가 적어도 다중 소수 코돈에 대해 가산적일 것이란 사실이다. 따라서, 소수 코돈의 상대적 고 함량을 갖는 mRNA는 이와 상응하게 낮은 번역 비율을 가질 것이다. 이러한 비율은 상응하게 저 수준의 암호화된 단백질에 의해 반영될 수 있었다.

    쌍떡잎 식물 또는 외떡잎 식물 (예컨대, 면, 캐놀라, 담배, 옥수수, 대두, 밀 및 벼)에서의 발현을 위해 DGT-14를 암호화하는 유전자를 조작하는데 있어서, 예상되는 숙주 식물(들)의 코돈 편향은, 예를 들어 식물 게놈의 코돈 분포도 또는 각종 식물 유전자의 단백질 암호화 영역에 관한 정보를 알아내기 위하여 공개적으로 입수 가능한 DNA 서열 데이터베이스를 사용함으로써 결정할 수 있다. 코돈 편향은 식물이 그의 단백질의 아미노산을 암호화하기 위해 사용하는, 코돈의 통계학적 분포이다. 쌍떡잎 식물 또는 외떡잎 식물 (옥수수)에 대해 선호되는 코돈 활용이 표 1에 제시되어 있다.

    코돈 편향은 모든 아미노산에 대한 코돈과 비교해서 단일 코돈이 사용되는 빈도로서 계산될 수 있다. 또 다른 한편, 코돈 편향은 특별한 아미노산에 대한 다른 모든 코돈 (동의 코돈)과 비교해서, 이러한 특별한 아미노산을 암호화하기 위해 단일 코돈이 사용되는 빈도로서 계산될 수 있다. 식물 발현을 위한 암호화 영역을 설계하는 데 있어서, 식물에 의해 선호되는 1차 코돈 ("제1 선택") 뿐만 아니라 다중 선택이 존재하는 경우에는, 선호 코돈의 제2, 제3, 제4 등의 선택을 결정해야 한다. 이어서, 동일한 DGT-14 펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 새로운 DNA 서열을 설계할 수 있지만, 이러한 새로운 DNA 서열은, 아미노산 서열 내의 각 위치에 아미노산을 명시하기 위해 식물 코돈을 치환함으로써 (제1 선호, 제2 선호, 제3 선호, 또는 제4 선호 등) 본래의 DNA 서열과 상이하다. 그 다음, 상기 새로운 서열을 대상으로 하여, 상기 변형에 의해 창출될지도 모르는 제한 효소 부위에 관하여 분석하였다. 이로써 확인된 부위는, 코돈을 제1, 제2, 제3 또는 제4 선택 선호 코돈으로 대체함으로써 추가로 변형시킨다. 관심 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있었던 서열 내의 기타 부위는 줄기 루프 구조, 엑손:인트론 연접부 (5' 또는 3'), 폴리 A 부가 신호, 또는 RNA 중합효소 종결 신호이고; 이들 부위는 식물 코돈을 치환시킴으로써 제거한다. 이 서열을 추가로 분석하고 변형시켜 TA 또는 CG 이중체의 빈도를 감소시킨다. 이러한 이중체 이외에도, 동일한 약 6개 초과 잔기를 갖는 G 또는 C 서열 블록은 상기 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이들 블록은 제1 또는 제2 선택 등의 코돈을 그 다음 선호 선택 코돈으로 대체함으로써 변형시키는 것이 유리할 수 있다.

    따라서, 각종 방법을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 유전자를 생성시킬 수 있다. 이러한 접근방식의 한 예가 PCT 출원 WO 97/13402에 추가로 예시된다. 따라서, 본 발명의 개시내용의 dgt -14 유전자와 기능적으로 등가인 합성 유전자를 사용하여 숙주 (식물 포함)를 형질전환시킬 수 있다. 합성 유전자의 생성에 관한 부가의 지침은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,380,831에서 알아낼 수 있다.

    dgt -14를 암호화하는 식물-최적화 유전자를 조작하기 위하여, 특별한 숙주 식물에 대한 단백질 암호화 서열로부터 편집된 코돈 편향 표로부터 정립된 중복 유전 암호를 활용하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 설계하였다. 표 1에서, 칼럼 D 및 I는 외떡잎 식물 (옥수수)의 암호화 영역에서 발견된 바와 같이, 각 아미노산에 대한 동의 코돈의 분포도 (그 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 활용 %)를 나타낸다. 칼럼 E 및 J는 쌍떡잎 식물의 암호화 영역에서 발견된 바와 같이, 각 아미노산에 대한 동의 코돈의 분포도 (그 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 활용 %)를 나타낸다. 일부 아미노산에 대한 일부 동의 코돈은 식물 유전자에서 매우 드물게 발견된다 (예를 들어, CGG). 통상적으로, 특정 코돈이 어느 한 식물 유형의 유전자 내의 관련 아미노산을 암호화하는 시간의 약 10% 이하에서 표현되는 경우, 이러한 코돈은 드물게 사용되는 것으로 간주되었다 (표 1의 칼럼 C 및 H에서 DNU로써 표시됨). 특정 아미노산에 대한 나머지 코돈 선택의 분포도의 균형을 맞추기 위해, 다음 식을 이용하여 각 코돈에 대한 가중 평균 표현을 계산하였다:

    C1의 가중 평균 % = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + 등) x %C1 x 100

    상기에서, C1은 해당 코돈이고, %C2, %C3 등은 표 1의 나머지 동의 코돈의 쌍떡잎 식물에 대한 % 값의 평균을 나타낸다 (관련 코돈에 대한 평균 % 값은 칼럼 C 및 H로부터 취한다). 각 코돈에 대한 가중 평균 % 값은 표 1의 칼럼 C 및 H에 제시된다.

    쌍떡잎 식물 유전자 내에서 발견되고 자주 사용되는 코돈의 균형잡힌 코돈 분포도를 이용하여, 쌍떡잎 식물에서의 최적의 발현을 위한, 본질적으로 DGT-14 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 새로운 DNA 서열을 설계하였다. 외떡잎 식물 유전자 내에서 발견되고 자주 사용되는 코돈의 균형잡힌 코돈 분포도를 이용하여, 외떡잎 식물에서의 최적의 발현을 위한, 본질적으로 DGT-14 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 제2의 DNA 서열을 설계하였다. 이러한 2개의 신규 DNA 서열은 단백질 아미노산 서열 내의 각 위치에 적당한 아미노산을 명시하기 위해 식물 코돈을 치환시킴으로써 (제1 선호, 제2 선호, 제3 선호 또는 제4 선호) dgt -14를 암호화하는 본래의 DNA 서열과는 상이하다. 식물-최적화 DNA 서열의 설계는 아미노산 잔기 101에서 내인성 글리신을 대체하기 위해 알라닌을 도입함으로써 변형시켰던 DGT-14 단백질 서열 (GENBANK ACC NO: ZP_01452683)의 단백질 서열을 역번역시킴으로써 개시되었다. 표 1, 칼럼 E 및 J로부터 구축된 쌍떡잎 식물 코돈 편향 표를 이용하여 서열 1을 역번역하였다. 표 1, 칼럼 D 및 I로부터 구축된 외떡잎 식물 코돈 편향 표를 이용하여 서열 1의 제2 역번역을 완료하였다. 이어서, 제한 효소 인식 부위를 제거 또는 부가하고, 고도로 안정적인 가닥내 2차 구조를 제거하며, 식물에서 조작된 유전자의 클로닝 조작 또는 발현에 해로울 수도 있는 기타 서열을 제거하기 위해 코돈 변화를 보완함으로써 (전반적인 가중 평균 코돈 표현을 보유하면서), 상기 개시 서열을 변형시켰다. 그 다음, 상기 DNA 서열을 대상으로 하여, 상기 변형에 의해 창출될지도 모르는 제한 효소 인식 부위에 관하여 재분석하였다. 이로써 확인된 부위는, 관련 코돈을 제1, 제2, 제3 또는 제4 선택 선호 코돈으로 대체함으로써 추가로 변형시켰다. 관심 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있었던 서열 내의 기타 부위는 엑손:인트론 연접부 (5' 또는 3'), 폴리 A 부가 신호, 또는 RNA 중합효소 종결 신호를 포함한다. 이와 같이 변형된 서열을 추가로 분석하고 추가로 변형시켜 TA 또는 CG 이중체의 빈도를 감소시키고, TG 또는 CT 이중체의 빈도를 증가시켰다. 이들 이중체 이외에도, [G+C] 또는 [A+T]의 약 6개 초과의 연속되는 잔기를 갖는 서열 블록은 상기 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이들 서열 블록은 또한, 제1 또는 제2 선택 등의 코돈을 기타 선호 선택 코돈으로 대체함으로써 변형시켰다. 드물게 사용된 코돈은 유전자 설계에 있어서 상당한 정도로 포함되지 않으므로, 코돈 조성 그 자체보다는 상이한 설계 기준을 수용하는 데 필요할 경우에만 사용된다 (예를 들어, 제한 효소 인식 부위의 부가 또는 결실).

    새로이 설계된, 쌍떡잎 식물 최적화 dgt -14 v2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 2에 열거되어 있다. 새로이 설계된, 외떡잎 식물 최적화 dgt -14 v5 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 3에 열거되어 있다. 이로써 생성된 DNA 서열은 보다 고도의 코돈 다양성, 목적하는 염기 조성을 갖고, 전략적으로 배치된 제한 효소 인식 부위를 함유하며, 유전자의 전사 또는 생성물 mRNA의 번역을 간섭할 수도 있는 서열은 결여된다.

    일단 식물-최적화 DNA 서열이 종이 상에서 또는 인실리코로 설계되면, 상기 설계된 서열과 서열상 정확하게 상응하는 실제적 DNA 분자를 실험실에서 합성할 수 있다. 이러한 합성 핵산 분자를 클로닝할 수 있고, 그렇지 않으면 이들 분자가 자연 또는 천연 공급원으로부터 바로 유래되는 것처럼 조작할 수 있다. 부가 서열, 예컨대 6-프레임 정지 (암호화 서열의 3' 말단에 부가되는 6개 모든 판독 프레임에 위치한 정지 코돈) 및 클로닝하기 위한 5' 제한 부위를 함유하는 서열 2 또는 서열 3을 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업적 공급업자 (DNA2.0; 미국 캘리포니아주 멘로 파크)에 의해 수행되었다. 그 다음, 이러한 합성 핵산 분자를 발현 벡터 내로 클로닝하고, 다음 실시예에 기재된 바와 같이 식물 또는 세균 내로 형질전환시켰다.

    세균에서의 발현을 위한 최적화

    에스케리챠 콜라이 세포에서의 발현을 위해 최적화되는 서열 1의 DGT-14 단백질을 암호화하는 새로운 DNA 서열을 설계하였다. 이. 콜라이 최적화 DNA 서열의 설계는 젠아트 (GeneArt; 독일 로겐부르크)로부터의 독점적 코돈 최적화 프로토콜을 이용하여, 서열 1의 단백질 서열을 역번역시킴으로써 개시하였다. 제한 효소 인식 부위를 제거 또는 부가하고, 고도로 안정적인 가닥내 2차 구조를 제거하며, 상기 조작된 유전자의 클로닝 조작 또는 발현에 해로울 수도 있는 기타 서열을 제거하기 위해 코돈 변화를 보완함으로써 (전반적인 가중 평균 코돈 표현을 보유하면서), 상기 개시 서열을 변형시켰다. 암호화 영역 내에서 피하는 상기 해로운 서열의 예는 16S 리보솜성 RNA 결합성 서열 ("샤인-달가르노 서열"), 예컨대 AGGAGG인데, 이는, 예를 들어 2개의 연속되는 아르기닌 아미노산을 암호화할 수 있었지만, 유전자내 (및 이에 따라서, 바람직하지 못한) 번역 개시 신호로서 제공될 수도 있다. 서열 1의 단백질을 암호화하는 이. 콜라이 편향된 dgt -14 v6 DNA 서열이 서열 4로서 제공된다.

    클로닝을 촉진시키고 반드시 효율적인 번역 개시를 위하여, 5' 말단 NdeI 제한 효소 인식 서열을 ATG 번역 출발 코돈의 상류에 놓아두었다. 또한, 클로닝을 촉진시키고 반드시 적당한 번역 종결을 위하여, 2개의 TAA 번역 정지 코돈 및 XhoI 제한 효소 인식 부위를 암호화하는 염기를 암호화 영역의 3' 말단에 포함시켰다. 서열 4를 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업적 공급업자인 젠아트에 의해 수행되었다.

    유사한 에스케리챠 콜라이 코돈 최적화 전략을 사용하여 dgt -11 v6, dgt -12 v6, dgt -18 v6, dgt -29 v6, 및 dgt -30 v6을 설계하였다. 이들 유전자의 에스케리챠 콜라이 코돈 최적화 버전은 각각 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 및 서열 14로서 열거된다.

    실시예 3: 글리포세이트에 대한 내성을 부여해주는 유전자의 세균성 발현을 위한 벡터의 구축

    이. 콜라이 발현을 위한 dgt -14의 pET 발현 벡터의 구축

    시험관내 시험을 위해, dgt -14 v6 이. 콜라이 최적화 유전자 서열 (서열 3)을 합성 및 클로닝에 대해 젠아트에 아웃소싱하였다. 이와 같이 합성된 dgt -14 v6 유전자 서열을, 부가된 Nde I 및 Xho I 제한 부위를 통하여 pET28 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 구축은 N-말단 6X His 태그 및 트롬빈 결합성 모티프를 도입하였다. 이로써 생성된 구조물은 pDAB100427로서 표지되었다 (도 3).

    아미노산 잔기 101의 글리신 잔기에 도입한 알라닌의 역할을 확인하기 위하여, 합성 dgt -14 v6 상에서 부위 유도 돌연변이 유발을 수행하였다. 스트라타젠 (Stratagene; 미국 캘리포니아주 산타 클라라)으로부터의 퀵 체인지 (Quick Change) II® 키트를 사용하여 상기 돌연변이 유발을 수행하였다. 아미노산 스위치를 만들기 위하여 다음 프라이머를 설계하였다: DGT14 MutF: (서열 15 5' ggATgCCggTAATgCAggAACCTgTgTTCgTCTgATgg), DGT14 MutR: (서열 16 5' CCATCAgACgAACACAggTTCCTgCATTACCggCATCC). 주형 DNA로서 pDAB100427 ( dgt -14 v6)을 사용하여 퀵체인지 프로토콜에 따라서 PCR 반응을 설정하였다. 격세 유전된 dgt -14 v1 야생형 서열 (서열 17)을 함유하는 구조물은 pDAB102945 (도 4)로 명명되었고, DNA 서열 분석을 통하여 확인하였다.

    부가 구조물, 이. 콜라이 발현을 위한 pET 발현 벡터

    시험관내 시험을 위해, dgt -11 v6, dgt -12 v6, dgt -18 v6, dgt -29 v6, 및 dgt -30 v6 유전자 서열을 합성 및 클로닝에 대해 젠아트에 아웃소싱하였다. 이와 같이 합성된 유전자를 pET28 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 구조물은 dgt -11 v6을 함유하는 pDAB100431 (도 5), dgt -11 v6을 함유하는 pDAB100432 (도 6), dgt -18 v6을 함유하는 pDAB100435 (도 7), dgt -29 v6을 함유하는 pDAB100446 (도 8), 및 dgt -30 v6을 함유하는 pDAB100436 (도 9)으로서 표지하였다.

    dgt -1, dgt -3 및 dgt -7을 함유하는 부가 구조물을 합성하였다. 이들 구조물을 dgt -1 v5, dgt -1 v6, dgt -1 v7, dgt -1 v8, dgt -3 v6, dgt -3 v7, dgt -3 v8, dgt -7 v5, dgt -7 v6, dgt -7 v7, 및 dgt -7 v8 유전자 서열의 시험관내 시험을 위해 사용하였고, 이를 합성 및 클로닝에 대해 젠아트에 아웃소싱하였다. 이와 같이 합성된 유전자를 pET28 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 구조물은 dgt -1 v5를 함유하는 pDAB102028, dgt -1 v6을 함유하는 pDAB102029, dgt -1 v7을 함유하는 pDAB102032, dgt -1 v8을 함유하는 pDAB102034, dgt -3 v6을 함유하는 pDAB100429, dgt -3 v7을 함유하는 pDAB100442, dgt -3 v8을 함유하는 pDAB100430, dgt -7 v5를 함유하는 pDAB102036, dgt -7 v6을 함유하는 pDAB102038, dgt -7 v7을 함유하는 pDAB102040, 및 dgt -7 v8을 함유하는 pDAB102042로서 표지되었다. 이들 구조물, 및 발현되는 DGT 단백질 서열은 미국 특허 출원 번호 11975658 (그의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.

    실시예 4: 시험관내 생화학적 효소 역학 검정

    재조합 DGT 효소의 과발현 및 정제

    재조합 DGT 단백질을 상기 언급된 구조물로부터 로세타2 (Rosetta2™) (DE3) 세포 [노바겐 (Novagen; 미국 위스콘신주 매디슨)]에서 과발현시켰다. 단일 집락을 사용하여, 37℃ 하에 밤새 배양한, 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) 및 카나마이신 (50 ㎍/ml)을 함유하는 LB의 50 ml 발효균 배양물을 접종하였다. 밤새 배양물을 사용하여 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) 및 카나마이신 (50 ㎍/ml)을 함유하는 LB 1 L를 접종하였다. 이 배양물을 37℃ 하에 OD 600 = 0.6이 되도록 성장시킨 다음, 빙수 욕 내에 10분 동안 놓아두었다. 최종 농도 500 μM이 될 때까지 IPTG를 부가함으로써, 표적 단백질의 발현을 달성하였다. 20℃ 하에 밤새 유도를 진행시킨 다음, 20분 동안 8,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 수거하였다. 세포 펠릿을 정제용으로 필요할 때까지 -80℃ 하에 저장하였다. 모든 정제 단계를 4℃ 하에 수행하였다.

    1 L 배양물로부터의 세포 펠릿을 20 내지 30 ml 완충액 A (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 mM 이미다졸, 및 5% 글리세롤)에 재현탁시켰다. 이어서, COMPLETE™ 프로테아제 억제제 칵테일 [1 정제/50 ml; 로슈 (Roche; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)] 및 리소자임 [1 mg/ml; 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich; 미국 미조리주 세인트루이스)]를 가하고, 현탁액을 20분 동안 교반시켰다. 브랜슨 소니파이어(Branson Sonifier) 250 (3 x 60초 파열)를 이용하여 세포 용해를 수행한 다음, 45분 동안 16,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 세포 부스러기를 제거하였다. 5 ml HisTrap FF 조 칼럼을 이용하여 고정화 금속 친화 크로마토그래피 (IMAC)를 통하여 1 단계로 균질하게 되도록 DGT 효소를 정제하였다. 상기 칼럼을 완충액 A에서 평형시키고, 샘플을 동일한 완충액에 부하하였다. 그 다음, 이 칼럼을 10 칼럼 용적의 완충액 A로 세척한 다음, 25 칼럼 용적에 걸쳐 0 내지 100% 완충액 B (50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 500 mM 이미다졸, 및 5% 글리세롤) 선형 구배로 용출시켰다. SDS-PAGE 분석에 의해 판단된 바와 같이, 표적 단백질을 함유하는 분획을, 10 kDa 분자량 컷-오프(cut-off) (MWCO)가 장착된 밀리포어(Millipore) 초원심분리 장치를 이용하여 2.5 ml가 되도록 농축시켰다. 정제된 DGT 효소를, PD-10 칼럼 [GE 헬스케어 (GE Healthcare)]을 이용하여 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 및 5% 글리세롤로 완충액 교환시킨 다음, 연속해서 약 1 ml가 되도록 농축시켰다. 샘플을 전형적으로 1:50으로 희석시키고, 자외선 가시 스펙트럼을 캐리50 바이오 (Cary50 Bio) 자외선 가시 분광광도계 상에서 240 내지 700 nm으로부터 기록하였다. 이어서, 이론적 흡광 계수를 사용하여, 280 nm 하에서의 흡광도를 기준으로 하여 단백질 농도를 계산하였다 (ExPASy; 스위스 제네바).

    식물 및 세균성 DGT 효소의 시험관내 역학적 성상 확인

    야생형 (WT) 및 돌연변이체 DGT의 효소 활성을 문헌 ([Lanzetta et al., (1979). Lanzetta P., Alvarez L., Reinach P., and Candia O., (1979) Anal Bioch ., 100:95-97] 참조)에 기재된 변형된 과정에서 무기 인산염 (P i ) 생성에 의해 측정하였다. 검정을 스펙트라-맥스(Spectra-Max) 190 판 판독기 [몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니베일)] 상에서 총 50 ㎕으로 96-웰 판 포맷에서 수행하였다. 전형적인 검정은 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 및 1 mM S3P를 함유하였다. PEP 및 글리포세이트 농도는 표시된 바대로 다양하였다. 글리포세이트는 유리 산으로서 시그마(Sigma)로부터 수득하였고, 이를 ddH 2 O에 재현탁시켰다. 혼합물이 중성 pH로 될 때까지 KOH를 부가함으로써 글리포세이트를 가용화하였다. 0.01 내지 1 μM로 다양한 농도 하의 DGT 효소를 부가함으로써 검정을 개시하였다. 말라카이트 그린(malachite green):암모늄 몰리브데이트 용액의 3:1 혼합물 235 ㎕를 부가함으로써 반응을 종결시켰다. 색 현상을 완료한 후 (대략 1분), 660 nm 하에서의 흡광도 변화를 기록하고, 형성된 P i 의 양을 표준 곡선으로부터 계산하였다. 효소가 결여된 대조 반응물을 이용하여 배경 흡광도를 교정하였다. 고 농도의 PEP (> 2 mM) 및 글리포세이트 (> 30 mM)는 상기 탐지 방법을 이용하여 상당 량의 배경 흡광도에 기여한다. K m 및 V max 의 결정 (방정식 1)을 감안한 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식에 상기 데이터를 피팅하고, IC 50 은 방정식 2 (여기서, y 는 상대 활성이고, s 는 힐(Hill) 계수이다) 로부터 결정하였다. 그라피트 버전(GraFit version) 5™ 소프트웨어 [에리타쿠스 소프트웨어 리미티드 (Erithacus Software Limited; 영국 홀리)]를 이용하여 데이터를 분석하였다.

    경쟁적 억제인자에 대한 IC 50 값은 기질의 농도에 따라서 변할 것이므로, 표 2에서의 IC 50 값은 1 mM PEP 및 60 μM PEP에서 수득하였다 (식물 중에서 세포내 PEP 농도의 추정치). 동일한 농도의 PEP에서 측정된 IC 50 값만을 비교해야 한다. 부가적으로, 고도로 내성인 효소의 IC 50 값은 란제타(Lanzetta)의 방법에 의해 정확하게 결정될 수 없었으므로, 상대 활성을 기준으로 하여 추정하였다.

    식물 DGT 의 역학

    돌연변이되지 않은 천연 서열을 수반한 2개 효소, DGT-1 v5 및 DGT-7 v5를 먼저 시험하여, 글리포세이트 민감성에 대한 기준선 파라미터를 정립하였다. 양 단백질은 PEP (약 70 μM)에 대한 낮은 K m 값을 표시하였고, 1 mM PEP에서 약 20 μM의 IC 50 값 (표 2)을 나타내면서 글리포세이트에 대해 민감성이었다. DGT-1 v6, DGT-3 v6, 및 DGT-7 v6에 대해 관찰된 바와 같이, G에서 A로의 단일 점 돌연변이는 글리포세이트에 대한 내성을 상당히 개선시켰지만 (8 내지 21 mM의 IC 50 값), PEP에 대한 K m 을 또한 약 8배 증가시켰다. 모든 식물 유래된 DGT에 대한 이중 돌연변이 (GAPS) (DGT-1 v7, DGT-3 v7, 및 DGT-7 v7) 또한, 글리포세이트 내성을 증강시켰지만, 또 다시 PEP K m 에 있어서 상당한 상승이 유발되었다 (표 2). TIPS 돌연변이체 (DGT-1 v8, DGT-3 v8, 및 DGT-7 v8)는 중간 농도의 글리포세이트 (3 내지 6 mM)에 대해 내성이 있었지만, GA 및 GAPS 돌연변이체와는 달리, K m 수준은 6 내지 200 μM로 야생형 단백질과 근접하게 유지되었다. 도 10은 상기 명시된 돌연변이의 도입시 DGT-1 (A) 및 DGT-7 (B)에 대한 글리포세이트 내성 상의 이동을 입증해준다. PEP 농도는 DGT-7 v8에 대해 상승된 IC 50 (>80 mM)을 초래할 것으로 예상되는, 도 10에 도시된 데이터를 가져다 주는 실험에 대해 1 mM로 유지하였다. 보다 저 수준의 PEP가 글리포세이트에 대한 상대적 내성을 변경시켰는지를 결정하기 위해 추가의 과정을 수행하였다. PEP의 생리학상 관련 수준은 5 내지 60 μM의 범위이다. 60 μM PEP를 이용하는 경우, IC 50 값은 상당히 감소하였는데 (3.6 mM), 이는 미카엘리스-멘텐 역학으로부터 예측되고 표 2에 나타낸 바와 같이, 초기 결정이 과량의 PEP에 의해 영향을 받았다는 것을 제안하고 있다.

    도 10은 1 mM PEP를 이용하여 DGT-1 (A) 및 DGT-7 (B) 내에 각종 돌연변이를 도입한 후에 수득한 IC 50 값을 도시한 것이다. A IC 50 곡선과 B IC 50 곡선 둘 다에 대해, 흑색 삼각형은 야생형을 나타내고, 흑색 원은 GA 돌연변이체를 나타내며, 백색 사각형은 GAPS 돌연변이체를 나타내고, 흑색 사각형은 TIPS 돌연변이체를 나타낸다.

    세균성 DGT 의 역학

    돌연변이된 DGT-14 v6 (G101A 돌연변이) 효소는 가장 바람직한 전반적 역학 파라미터 및 글리포세이트에 대한 내성을 보유하였다 ( k cat / K m 및 상승된 IC 50 ). 상기 효소는 농도 >80 mM에서 글리포세이트에 대해 내성이었고, 3 x 10 4 M -1 s -1 의 촉매적 효율을 표시하였다. 예상된 바와 같이, 야생형 DGT-14 v1 효소는 상당히 더 낮은 0.44 mM의 IC 50 (60 μM PEP 하에), PEP에 대한 K m 208.6 μM을 표시하였다. 천연 또는 야생형 효소는 또한, 고 촉매적 효율 (5.3 x 10 4 M -1 s -1 )을 표시하였다. 상기 데이터는 비록 DGT-14 v1이 DGT-14 v6과 비교해서 글리포세이트에 대해 더 민감할지라도, 이는 천연 식물 효소의 내성 수준 보다 더 큰 일부 타고난 내성 수준을 보유하고 있다는 것을 입증해준다. 아미노산 잔기 101에서 글리신 대신 알라닌 잔기를 도입한 결과로서, IC 50 은 1 mM PEP에서는 약 20.16 mM에서 >80.00 mM로 이동하였고, 60 uM PEP에서는 0.44 mM에서 > .80 mM로 이동하였다. PEP의 생리학상 관련 수준은 5 내지 60 μM의 범위이다. 마찬가지로, 아미노산 101에서 글리신 대신 알라닌 잔기를 도입하면, PEP에 대한 K m 이 208.6 μM에서 352.5 μM으로 증가하였다. G101A 돌연변이를 도입하면, DGT-14 v6에 대한 글리포세이트 내성이 개선되었다.

    부가적으로, 5개의 기타 세균성 효소를 대상으로 하여, 그들의 글리포세이트에 대한 내성에 관하여 또한 평가하였다. 야생형 단백질 서열을 포함하고 자연 알라닌 아미노산 잔기를 보유하고 있는 DGT-11 v6을 제외하고는 모두 글리신에서 알라닌으로 돌연변이된 변이체였다. 역학 파라미터 및 IC 50 값이 표 2에 기재되어 있다. DGT-11 v6, DGT-12 v6, DGT-18 v6, DGT-29 v6, 및 DGT-30 v6 효소는 1 mM PEP 하에 각각 9.98 mM, 4.00 mM, 33.25mM, 80 mM, 및 15.55 mM의 농도에서 글리포세이트에 대해 내성이었다. 알라닌 아미노산 잔기를 보유하는 효소에 대한 역학 파라미터 및 내성은 글리신 아미노산 잔기를 보유하는 천연 또는 야생형 식물 효소 (DGT-1 v5 및 DGT-7 v5) 보다 더 높다. DGT-11 v6, DGT-12 v6, DGT-18 v6, DGT-29 v6, 및 DGT-30 v6은 이들 효소가 글리포세이트에 대해 내성이라는 것을 표시하는 역학 파라미터를 보유하였다.

    실시예 5: 식물 형질전환 벡터의 클로닝

    식물 이원성 벡터 구축

    프레임내 융합으로서 dgt -14와 연결된 엽록체 전이 펩티드 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 진입 벡터를 구축하는 데 있어서 표준 클로닝 방법을 사용하였다. dgt -14와 융합된 엽록체 전이 펩티드 (TraP)를 함유하는 진입 벡터는, IN-FUSION™ 어드밴티지 테크놀로지 (Advantage Technology) [클론텍 (Clontech; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)]를 이용하여 어셈블리하였다. 전이 펩티드 TraP4 v5 (서열 18), TraP5 v1 (서열 19), TraP5 v2 (서열 20), TraP8 v2 (서열 21), TraP9 v2 (서열 22), TraP12 v2 (서열 23), 및 TraP13 v2 (서열 24)를 각각 DNA2.0 (미국 캘리포니아주 멘로 파크)에 의해 합성하였고, 독특한 AccI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위까지 및 이를 포함한 dgt -14의 5' 말단 단편과 융합시켰다.

    각종 TraP 및 dgt -14 발현 카세트를 함유한 이원성 플라스미드는 아라비도프시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10; 문헌 [Callis, et al., (1990) J. Biol . Chem ., 265: 12486-12493] 참조)에 의해 구동시켰고, 애그로박테륨 투메파시엔스 개방 판독 프레임 23 3'-비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR; [미국 특허 번호 5,428,147] 참조)에 의해 플랭킹하였다.

    상기와 같이 어셈블리된 TraP 및 dgt -14 발현 카세트를, GATEWAY ® 테크놀로지 (인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 조작하였고, 이를 애그로박테륨-매개된 식물 형질전환을 통하여 식물 내로 형질전환시켰다. 제한 엔도뉴클레아제를 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England BioLabs) (NEB; 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 수득하였고, DNA 연결을 위해 T4 DNA 리가제 (인비트로젠)를 사용하였다. 선별성 마커 카세트 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV; 문헌 [Verdaguer et al., (1996) Plant Mol . Biol ., 31: 1129-1139] 참조) - DSM -2 ([미국 특허 출원 번호 2007/086813] 참조) - 애그로박테륨 투메파시엔스 개방 판독 프레임 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3'UTR; 문헌 [Huang et al., (1990) J. Bacteriol . 172:1814-1822] 참조)을 함유한 단일 도착 벡터 내로 하나의 진입 벡터를 어셈블리하기 위해 GATEWAY ® LR CLONASE ® 효소 혼합물 (인비트로젠)을 이용하여 게이트웨이(Gateway) 반응을 수행하였다. 공급업자의 지시에 따라서 NUCLEOSPIN ® 플라스미드 키트 [마커리-나겔 인크. (Macherey-Nagel Inc.; 미국 펜실베니아주 베슬리헴)] 또는 플라스미드 미디 키트 (Plasmid Midi Kit™) [퀴아젠 (Qiagen)]을 이용하여 플라스미드 제조를 수행하였다. 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 QIA퀵 겔 추출 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit™) (퀴아젠)를 사용하여 DNA 단편을 단리하였다.

    어셈블리된 모든 플라스미드의 집락을 미니프렙 DNA의 제한 분해에 의해 초기에 스크리닝하였다. 선별된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열 분석 판매회사 [유로핀스 MWG 오페론 (Eurofins MWG Operon; 미국 앨리배마주 헌츠빌)]에 의해 서열 분석하였다. 서열 데이터를 어셈블리하고, SEQUENCHER™ 소프트웨어 [젠 코드즈 코포레이션 (Gene Codes Corp.; 미국 미시간주 앤 아버)]를 이용하여 분석하였다.

    다음 이원성 구조물은 각종 TraP: dgt -14 융합 유전자 서열을 발현한다: pDAB107526 (도 11)은 TraP4 v5: dgt -14 v2 (서열 25)를 함유하고; pDAB102787 (도 12)은 TraP5 v1: dgt -14 v2 (서열 26)를 함유하며; pDAB105525 (도 13)는 TraP5 v2: dgt -14 v2 (서열 27)를 함유하고; pDAB105526 (도 14)은 TraP8 v2: dgt -14 v2 (서열 28)를 함유하며; pDAB105527 (도 15)은 TraP9 v2: dgt -14 v2 (서열 29)를 함유하고; pDAB105528 (도 16)은 TraP12 v2: dgt -14 v2 (서열 30)를 함유하며; pDAB105529 (도 17)는 TraP13 v2: dgt -14 v2 (서열 31)를 함유한다.

    프레임내 융합물을 구축하는 경우, dgt -14 암호화 서열의 처음 메티오닌 잔기에 대한 작은 변형을 만들었다. 예를 들어, 메티오닌을 pDAB105529, pDAB017526, pDAB105525, pDAB105526, pDAB105527, 및 pDAB105528 내의 dgt -14 암호화 서열에서 알라닌으로 변경하였다. pDAB102787에서는 메티오닌을 변경하지 않은 채로 두었다. 이러한 변형을 도입하여 엽록체 전이 펩티드 뒤에 있는 dgt -14 암호화 서열의 클로닝을 촉진시켰고, 상기 언급된 서열 목록은 상기 변형된 아미노산 잔기를 함유한다.

    실시예 6: 아라비도프시스 내로의 형질전환 및 선별

    아라비도프시스 탈리아나 형질전환

    문헌 ([Clough and Bent (1998)] 참조)으로부터의 플로럴 딥(floral dip) 방법을 이용하여 아라비도프시스를 형질전환시켰다. 상기 언급된 이원성 플라스미드 중 하나를 함유하는 선별된 애그로박테륨 집락을 사용하여, 스펙티노마이신 (100 mg/L) 및 카나마이신 (50 mg/L)을 함유하는 YEP 육즙의 하나 이상의 100 ml 예비-배양물을 접종하였다. 이 배양물을 225 rpm으로 일정하게 진탕시키면서 28℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 세포를 실온 하에 10분 동안 대략 5000 xg으로 펠릿화하고, 이로써 생성되는 상등액을 폐기하였다. 세포 펠릿을, 다음을 함유하는 400 ml 던킹(dunking) 배지에 온화하게 재현탁시켰다: 5% (w/v) 슈크로스, 10 ㎍/L 6-벤질아미노퓨린 및 0.04% 실웨트(Silwet) L-77. 대략 1개월생 식물을 온화하게 진탕시키면서 5 내지 10분 동안 상기 배지에 침지시켰다. 이 식물을 옆으로 눕혀 내려놓고, 투명하거나 불투명한 플라스틱 봉지로 2 내지 3시간 동안 덮어놓은 다음, 수직으로 세워 놓았다. 이 식물을 16시간 조명/8시간 암실의 광주기를 이용하여 22℃ 하에 성장시켰다. 침지시킨지 대략 4시간 후에, 종자를 수확하였다.

    형질전환된 식물의 선별

    새롭게 수확한 T 1 종자 [ dgt -14 및 DSM -2 발현 카세트를 함유함]를 실온 하에 7일 동안 건조하게 하였다. T 1 종자를 26.5 x 51-cm 발아 트레이 (이러한 트레이 각각은 40 ml의 0.1% 아가로스 용액에 이미 현탁시킨 층화 T 1 종자 (약 10,000개 종자)의 200 mg 분취액을 수용한다)에 파종하고, 4℃ 하에 2일 동안 저장하여 휴면 필요조건을 완성하였고, 반드시 동시에 종자가 발아되게 하였다.

    선샤인 믹스 (Sunshine Mix) LP5를 미세한 질석으로 덮고, 호글랜드(Hoagland) 용액으로 습윤될 때까지 저면 관개한 다음 (subirrigate), 중력 배수하게 두었다. 각 40 ml 분취액의 층화 종자를, 피펫을 이용하여 상기 질석 위로 균일하게 파종하고, 4 내지 5일 동안 습도 돔으로 덮었다. 글루포시네이트 발아 후 분무 (공동-형질전환된 DSM -2 유전자에 대해 선별함)를 이용하여 초기 형질전환체 선별하기 1일 전에 돔을 제거하였다.

    재식 후 7일 [재식 후 일수 (DAP)] 및 다시 11 DAP에, T 1 식물 (각각 떡잎 및 2-4-lf 단계)을, 1회 적용당 280 g ai/ha 글루포시네이트의 유효 비율로 전달하기 위해 데빌비스(DeVilbiss) 압착 공기 분무 팁을 이용하여 10 ml/트레이 (703 L/ha)의 분무 용적으로 리버티(Liberty) 제초제 0.2% 용액 (200 g ai/L 글루포시네이트; 바이엘 크롭 사이언시즈 (Bayer Crop Sciences; 미국 미주리주 캔자스 시티))으로 분무하였다. 최종 분무한 후 4 내지 7일에 생존자 (활동적으로 생장하는 식물)를 확인하였고, 포팅 배지 [메트로 믹스 (Metro Mix) 360]를 이용하여 준비한 3-인치 (7.6 cm) 포트 내로 개별적으로 옮겨 심었다. 옮겨 심은 식물을 3 내지 4일 동안 습도 돔으로 덮고, 앞서와 같이 22℃ 생장 챔버 내에 놓아두거나 또는 온실로 직접 이동시켰다. 이어서, 돔을 제거하고, 식물을 온실 (22±5℃, 50±30% RH, 14 h 조명:10 h 암실, 최소 500 μE/m2s1 자연 + 보충 광)에서 길렀다. 생존하는 T 1 식물 상에서 분자 확인 분석을 완료하여, 글리포세이트 내성 유전자가 식물의 게놈 내로 안정적으로 통합되었다는 것을 확인하였다.

    분자 확인

    pDAB105525, pDAB105526, pDAB105527, pDAB105528, pDAB105529, pDAB102787로 형질전환시킨 아라비도프시스 식물의 게놈 내에서의 dgt -14 및 DSM -2 트랜스유전자의 존재를 확인하였다. T 1 아라비도프시스 식물 내에서의 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 존재는 TAQMAN™과 유사한 가수분해 프로브 검정을 통하여 초기에 스크리닝하여 DSM -2 및 dgt -14 트랜스유전자의 존재를 확인하였다. 유전자 발현 카세트 PCR을 통하여 사건을 스크리닝하여, dgt -14 발현 카세트가 재배열 없이 식물 게놈 내로 완전하게 통합되었는지를 결정하였다. 이들 연구로부터 발생된 데이터를 사용하여 트랜스유전자 카피 수를 결정하고, 자가 수정 및 T 2 세대로의 발전에 대한 선별 아라비도프시스 사건을 확인하였다. 이와 같이 발전된 T 2 아라비도프시스 식물을 또한, 가수분해 프로브 검정을 통하여 스크리닝하여 식물 염색체 내에서의 DSM -2 및 dgt -14 유전자의 존재를 확인하고, 그의 카피 수를 추정하였다. 그 다음, 서던 블롯 검정을 사용하여 T 1 아라비도프시스 식물의 서브세트 상에서 추정된 카피 수를 확인하였다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 검정은 상기 사건이 DGT-14 단백질을 발현시켰다는 것을 검증하였다.

    가수분해 프로브 검정

    다음에 기재되는 가수분해 프로브 검정을 이용하여 T 1 및 T 2 아라비도프시스 식물에서 카피 수를 결정하였다. 다양한 수의 트랜스유전자를 갖는 식물을 확인하였고, 후속 글리포세이트 내성 연구를 위해 진전시켰다.

    조직 샘플을 96-웰 판에 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. KLECO™ 조직 미분쇄기 및 텅스텐 비드 [엔비론 메탈 인크. (Environ Metal Inc.; 미국 오레곤주 스위트 홈)]를 이용하여 조직 침출을 수행하였다. 조직 침출 후, 제조업자가 제안한 프로토콜에 따라서 바이오스프린트 96 플랜트 키트 (Biosprint 96 Plant kit®) (퀴아젠; 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 고-처리량 포맷으로 게놈 DNA를 단리하였다. 게놈 DNA를 퀀트-IT 피코 그린 DNA 검정 키트 (Quant-IT Pico Green DNA Assay kit™) (몰레큘라 프로브스, 인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 정량화된 게놈 DNA를, BIOROBOT3000™ 자동화 액체 핸들러 (퀴아젠; 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 가수분해 프로브 검정을 위해 약 2 ng/㎕으로 조정하였다. 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스유전자 카피 수 결정은 LIGHTCYCLER®480 시스템 [로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)]을 이용하여 실시간 PCR함으로써 수행하였다. 검정은 DSM -2, dgt -14 및 내부 참조 유전자인 TAFII15 (Genbank ID: NC003075; 문헌 [Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61] 참조)에 대해 설계하였다.

    증폭을 위해, LIGHTCYCLER®480 프로브스 마스터 믹스 (Probes Master mix) (로슈 어플라이드 사이언스; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, DSM -2 및 dgt -14에 대한 각 프라이머 0.1 μM, TAFII15에 대한 각 프라이머 0.4 μM, 및 각 프로브 0.2 μM을 함유하는 10 ㎕ 용적 다중체 반응물에서 1 X 최종 농도로 제조하였다 (표 3). 형광 취득하면서 40초 동안 60℃ 하에 확장시키면서 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 수행하였고, 각 샘플을 분석하기 위해 평균 순환 한계 (Ct) 값을 사용하였다. 상대적 퀀트 모듈 (quant module)을 이용하는 라이트사이클러 (LightCycler®) 소프트웨어 릴리즈 1.5를 사용하여, 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초한다. 이를 위해, 단일 카피 교정기 및 공지된 2 카피 체크로부터의 게놈 DNA의 샘플을 각 수행에 포함시켰다. 가수분해 프로브 스크린의 카피 수 결과는 T 1 및 T 2 트랜스제닉 아라비도프시스 식물에 대해 결정하였다.

    서던 블롯 분석을 통한 dgt -14 통합 확인

    서던 블롯 분석을 사용하여, 삽입된 T-가닥 DNA 단편의 통합 패턴을 정립시키고, dgt -14를 함유한 사건을 확인하였다. 아라비도프시스 게놈 내의 트랜스유전자 삽입체의 통합 및 완전성을 입증하기 위한 데이터를 생성시켰다. 서던 블롯 데이터를 사용하여, T-가닥 DNA의 온전한 카피의 단순 통합을 확인하였다. dgt -14 유전자 발현 카세트에 특이적인 PCR 증폭된 프로브를 사용하여, 상세한 서던 블롯 분석을 수행하였다. 특이적 제한 효소로 분해시킨 게놈 DNA와 프로브를 혼성화시키면, 특이적 분자량의 게놈 DNA 단편이 확인되었는데, 그의 패턴을 사용하여, 다음 세대로의 진전을 위한 단순 삽입 전장 T 1 트랜스제닉 사건을 확인하였다.

    조직 샘플을 2 ml 원추형 튜브 [에펜도르프(Eppendorf)]에 수집하고 2일 동안 동결건조시켰다. KLECO™ 조직 미분쇄기 및 텅스텐 비드를 이용하여 조직 침출을 수행하였다. 조직 침출 후, CTAB 단리 과정을 이용하여 게놈 DNA를 단리하였다. 게놈 DNA를, 퀴아젠 게놈 팁스 키트를 이용하여 추가로 정제하였다. 퀀트-IT 피코 그린 DNA™ 검정 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 게놈 DNA를 정량화하였다. 정량화된 게놈 DNA를, 일관되는 농축을 위해 약 4 ㎍으로 조정하였다.

    각 샘플에 대해, 게놈 DNA 4 ㎍을 제한 효소 SwaI (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 베벌리)로 철저하게 분해시키고, 25℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, NsiI를 상기 반응물에 가하며 37℃ 하에 6시간 동안 항온 배양하였다. 이로써 분해된 DNA를, 제조업자가 제안한 프로토콜에 따라서 신속 침전 용액 (Quick Precipitation Solution™) [에지 바이오시스템즈 (Edge Biosystems; 미국 메릴랜드주 게이더스버그)]으로 침전시킴으로써 농축시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 65℃ 하의 물 25 ㎕에 1시간 동안 재현탁시켰다. 재현탁된 샘플을 1X TAE에서 제조된 0.8% 아가로스 겔 상으로 부하하고, 1X TAE 완충액 중에서 1.1 V/cm으로 밤새 전기영동시켰다. 이 겔을 30분 동안 순차적으로 변성시키고 (0.2 M NaOH / 0.6 M NaCl), 30분 동안 중화시켰다 (0.5 M 트리스-HCl (pH 7.5) / 1.5 M NaCl).

    DNA 단편을 나일론 막으로 옮기는 것은, 크로마토그래피 종이 윅(wick) 및 종이 타월을 사용함으로써 처리된 IMMOBILON™ NY+ 전이 막 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카) 상으로 겔을 통하여 20X SSC 용액을 밤새 수동적으로 윅킹함으로써 수행하였다. 이와 같이 옮긴 후, 상기 막을 2X SSC로 간단하게 세척하고, STRATALINKER™ 1800 (스트라타젠; 미국 캘리포니아주 라 호이아)과 가교 결합시킨 다음, 80℃ 하에 3시간 동안 진공 베이킹하였다.

    블롯을, 모델 400 혼성화 항온 배양기 [로빈스 사이언티픽 (Robbins Scientific; 미국 캘리포니아주 서니베일)]를 이용하여 유리 롤러 병에서 65℃ 하에 1시간 동안 예비-혼성화 용액 [퍼펙트 하이브 플러스 (Perfect Hyb plus), 시그마; 미국 미주리주 세인트루이스]과 함께 항온 배양하였다. 전체 암호화 서열을 함유하는 PCR 단편으로부터 프로브를 제조하였다. QIAEX II 겔 추출 키트™를 이용하여 PCR 앰플리콘(amplicon)을 정제하고, 랜덤 RT 프라임 IT™ 표지화 키트 (스트라젠; 미국 캘리포니아주 라 호이아)를 통하여 α32P-dCTP로 표지시켰다. 블롯을 65℃ 하에 밤새 변성 프로브를 직접 부가하면서 혼성화 완충액과 대략 2 백만개 계수치/블롯/ml로 혼성화하였다. 혼성화한 후, 블롯을 65℃ 하에 40분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 순차적으로 세척하였다. 최종적으로, 상기 블롯을 저장 인광체 영상화 스크린에 노출시키고, 몰레큘라 다이나믹스 스톰 (Molecular Dynamics Storm) 860™ 영상화 시스템을 이용하여 영상화하였다.

    이 연구에서 완료한 서던 블롯 분석물을 사용하여 카피 수를 결정하고, 선택된 사건이 아라비도프시스의 게놈 내에 dgt -14 트랜스유전자를 함유하였다는 것을 확인하였다.

    PCR 분석을 통한 dgt -14 유전자 발현 카세트 확인

    T 1 식물 사건에 함유된 dgt -14 유전자 발현 카세트의 존재는 종말 점 PCR 반응에 의해 탐지하였다. dgt -14 유전자 발현 카세트의 AtUbi10 프로모터 v2 및 AtuORF23 3'UTR v1 영역에 대해 특이적인 프라이머 (표 4 참조)를 탐지에 사용하였다.

    PCR 반응은 상기 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 표준 3 단계 PCR 사이클링 프로토콜을 요구하였다. 모든 PCR 반응은 다음 PCR 조건을 이용하여 완료하였다: 94℃에서 3분 동안에 이어 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 3분 동안 35 주기. 이들 반응은 제조업자의 지시에 따라서 EX-TAQ PCR™ 키트 [다카라 바이오테크놀로지 인크. (TaKaRa Biotechnology Inc.; 일본 시가현 오츠)]를 이용하여 완료하였다. 최종 주기 후, 상기 반응물을 72℃ 하에 10분 동안 항온 배양하였다. TAE 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 PCR 앰플리콘 크기를 결정하였다. 예상된 크기의 PCR 앰플리콘은 전장 유전자 발현 카세트가 트랜스제닉 아라비도프시스 사건의 게놈에 존재한다는 것을 표시하였다.

    정량적 역전사 PCR 분석을 통한 dgt -14 상대 전사 확인

    dgt -14 트랜스제닉 식물의 조직 샘플을 96-웰 판에 수집하고, 80℃ 하에 냉동시켰다. KLECO™ 조직 미분쇄기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크.; 미국 오레곤주 스위트 홈)를 이용하여 조직 침출을 수행하였다. 조직 침출 후, 제조업자가 제안한 프로토콜 (칼럼 상에서의 임의의 DnaseI 처리를 포함함)에 따라서 퀴아젠 알네아시(Rneasy) 96™ 키트 (퀴아젠; 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 고-처리량 포맷으로 총 RNA를 단리하였다. 이 단계 이후, 용출된 총 RNA의 부가 DnaseI [앰비온 (Ambion; 미국 텍사스주 오스틴)] 처리를 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 TVN을 부가하면서 제조업자가 제안한 과정에 따라서 고 용량 cDNA 역전사™ 키트 [어플라이드 바이오시스템즈 ((Applied Biosystems; 미국 텍사스주 오스틴)]를 이용하여 주형으로서 총 RNA를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 발현의 정량화는 가수분해 프로브 검정에 의해 완료하였고, LIGHTCYCLER®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 사용하여 실시간 PCR함으로써 수행하였다. LIGHTCYCLER® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 이용하여 dgt -14 및 내부 참조 유전자 "공지되지 않은 단백질" (유전자 은행 승인 번호: AT4G24610)에 대한 검정을 설계하였다. 증폭을 위해, LIGHTCYCLER®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 각 프라이머 0.4 μM, 및 각 프로브 0.2 μM을 함유하 는 10 ㎕ 용적 단일체(singleplex) 반응물에서 1 X 최종 농도로 제조하였다 (표 5).

    형광 취득하면서 40초 동안 60℃ 하에 확장시키면서 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 세 번 되풀이 하여 수행하였고, 각 샘플을 분석하기 위해 평균 순환 한계 (Ct) 값을 사용하였다. 마이너스 역전사 반응을 각 샘플에 대해 수행하여 반드시 gDNA 오염물이 존재하지 않도록 하였다. 실시간 PCR 데이터의 분석은 ΔΔCt 방법에 기초하여 수행하였다. 이러한 검정을 이용하여, 반접합성 및 동형접합성인 것으로 결정된 트랜스제닉 아라비도프시스 사건 내에서 dgt -14의 상대적 발현을 결정하였다. dgt -14 mRNA의 상대적 전사 수준은 내부 대조군 보다 25.3배 내지 313.7배 더 높은 범위였다. 이들 데이터는 dgt -14 트랜스제닉 식물이 기능적 dgt -14 유전자 발현 카세트를 함유하였고, 상기 식물이 dgt -14 트랜스유전자를 전사할 수 있었다는 것을 표시한다.

    웨스턴 블롯팅 분석

    DGT-14를 트랜스제닉 아라비도프시스 탈리아나 식물로부터 수득한 잎 샘플에서 탐지하였다. dgt -14 트랜스제닉 식물로부터의 식물 추출물, 및 DGT-14 단백질 표준물을 90℃ 하에 5분 동안 8 M 우레아 변성 샘플 완충제와 함께 항온 배양하고, 아크릴아미드 프리캐스트(precast) 겔에서 전기영동적으로 분리시켰다. 이어서, 제조업자의 프로토콜을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막 상으로 전기-전이시켰다. WESTERNBREEZE® 차단용 혼합물 (인비트로젠)로 차단시킨 후, DGT-14 단백질을 항-DGT-14 항혈청에 이어 염소 항-토끼 포스파타제에 의해 탐지하였다. 이와 같이 탐지된 단백질을 화학발광 기질 BCIP/NBT 웨스턴 분석용 시약 (KPL; 미국 메릴랜드주 게이더스버그)에 의해 가시화하였다. 웨스턴 블롯을 통한 온전한 DGT-14 단백질의 생성은 검정된 dgt -14 트랜스제닉 식물이 상기 DGT-14 단백질을 발현하였다는 것을 표시하였다.

    실시예 7: 글리포세이트 내성

    dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 트랜스제닉 T 1 아라비도프시스 식물에 글리포세이트를 상이한 비율로 분무하였다. 다양한 농도의 글리포세이트 비율 (상승된 비율 포함)의 분포를 본 연구에 적용하여 상대적 저항성 수준을 결정하였다 (105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 글리포세이트의 전형적인 1X 필드 활용 비율은 1,120 g ae/ha이다. 본 연구에 사용된 T 1 아라비도프시스 식물은 dgt -14 트랜스유전자에 대한 카피 수에 있어 가변적이었다. 상기 언급된 분자 확인 검정을 이용하여 저 카피 수의 dgt -14 T 1 아라비도프시스 식물을 확인하였고, 자가 수분하며, 이를 사용하여 T 2 식물을 생산하였다. 표 6은 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt -1 (그의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 번호 12558351에 기재된 바와 같음)을 포함하는 대조군 식물, 및 야생형 대조군과 비교해서, dgt -14 트랜스제닉 식물에 대한 저항성을 나타낸다.

    형질전환된 dgt -14 아라비도프시스 식물의 글리포세이트 선별 결과

    아라비도프시스 T 1 형질전환체를 먼저, 글루포시네이트 선별 계획을 이용하여 형질전환되지 않은 종자의 배경으로부터 선별하였다. 3개의 플랫 또는 30,000개 종자를 대상으로 하여 각 T 1 구조물에 대해 분석하였다. 상기 선별된 T 1 식물을 분자별로 명확히 규명하고, 이 식물을 연속해서 개별 포트에 옮겨 심고, 앞서 기재된 바와 같은 상업적 글리포세이트를 다양한 비율로 분무하였다. 이들 식물의 용량 반응은 처리 후 2주 [처리 후 주 (WAT)] % 가시적 피해로 제시된다. 데이터는 거의 또는 전혀 피해가 없거나 (<20%), 중간 정도의 피해가 있거나 (20 내지 40%), 또는 심각한 피해가 있는 (>40%) 개별 식물을 나타내는 표로 제시된다. 아라비도프시스 형질전환에 사용된 각 구조물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제시된다. 개별 반응의 범위가 또한, 각 비율 및 형질전환에 대해 마지막 칼럼에 표시된다. 야생형, 형질전환되지 않은 아라비도프시스 [cv 콜룸비아 (Columbia)]가 글리포세이트 민감성 대조군으로서 제공되었다.

    식물 반응 수준은 T 1 아라비도프시스 식물에서 다양하였다. 이러한 변동은 각 식물이 독립적인 형질전환 사건을 나타내므로, 관심 유전자의 카피 수가 식물마다 다양하다는 사실에 기여할 수 있다. 다양한 비율의 글리포세이트에 대해 dgt -1 및 형질전환되지 않은 야생형 대조군과 비교해서 엽록체 전이 펩티드와 연결된 dgt -14 구조물 각각에 의해 제공된 내성을 입증하기 위해, 비율별 전반적인 집단 피해 평균이 표 6에 제시된다. 사건은 TraP8 v2 (pDAB105526), TraP9 v2 (pDAB105527), TraP12 v2 (pDAB105528) 및 TraP13 v2 (pDAB105529)와 연결된 dgt -14를 함유하였다. T 1 식물의 글리포세이트 선별로부터의 데이터는 dgt -14가 이들 엽록체 전이 펩티드와 연결될 때, 고 수준의 글리포세이트에 대한 강건한 내성이 제공되었다는 것을 입증하였다. 비교적으로 말하면, TraP4 v5 (pDAB107526), TraP5 v2 (pDAB105525), 및 TraP5 v1 (pDAB102787)과 연결된 dgt -14는 고 농도의 글리포세이트의 처리에 대한 내성을 제공하지 못하였지만, 이들 구조물은 동일한 비율의 글리포세이트로 처리한, 형질전환되지 않은 (또는 야생형) 대조군 보다 더 내성이었다. 또한, 3개 이상의 카피의 dgt -14를 함유하는 것으로 나타난 사건이 상승된 비율의 글리포세이트에 대해 더 감수성이었던 경우가 있었다. 이들 경우는 표 6에 나타낸 % 가시적 피해 범위 내에서 입증된다. 아라비도프시스 식물 내에 고 카피 수의 트랜스유전자가 존재하는 것이, dgt -14 트랜스유전자의 존재에도 불구하고 글리포세이트에 대한 민감성을 초래하는 트랜스유전자 억제 또는 기타 후생적 효과를 유발시키는 것으로 예상된다.

    저 카피 수의 트랜스유전자 삽입물 (1 내지 3개 카피 수)을 함유하는 것으로 확인된, 선별된 T 1 아라비도프시스 식물을 자가 수정하여, 글리포세이트 내성을 부가 산정하기 위한 제2 세대를 생성시켰다. 1 내지 3개 카피 수의 dgt -14 트랜스유전자를 함유한 제2 세대 아라비도프시스 식물 (T 2 )을 대상으로 하여, 글리포세이트 내성 및 글루포시네이트 내성 (글루포시네이트 내성은 PAT 발현 카세트가 온전한 것이었고 T 1 식물의 자가 생식 동안 재배열을 진행하지 않았다는 것을 표시하였다)에 관하여 추가로 명확히 규명하였다. 이러한 T 2 세대에서는, 반접합성 및 동형접합성 식물이 각 사건에 대한 시험에 이용 가능하였으므로, 시험관 각 비율의 글리포세이트에 포함되었다. 반접합성 식물은 특정 유전자 자리에 동일한 2개의 대립유전자를 함유하는 동형접합성 식물과 비교해서 특정 유전자 자리에 2개의 상이한 대립유전자를 함유한다. 앞서 기재된 분자 분석 프로토콜을 이용하여 T 2 식물의 카피 수 및 배수성 수준을 확인하였다. 마찬가지로, 앞서 기재된 바와 같은 방법 및 비율을 이용하여 글리포세이트를 적용하였다. 상기 식물의 용량 반응은 처리 후 2주 (WAT) % 가시적 피해로 제시된다. 데이터는 거의 또는 전혀 피해가 없거나 (<20%), 중간 정도의 피해가 있거나 (20 내지 40%), 또는 심각한 피해가 있는 (>40%) 개체의 히스토그램으로서 제시된다. 아라비도프시스 형질전환에 사용된 각 구조물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제시된다. 개별 반응의 범위가 또한, 각 비율 및 형질전환에 대해 마지막 칼럼에 표시된다. 야생형, 형질전환되지 않은 아라비도프시스 (cv. 콜룸비아)가 글리포세이트 민감성 대조군으로서 제공되었다. 또한, 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt -1 (그의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 번호 12558351에 기재된 바와 같음)을 포함하는 식물이 양성 대조군으로서 포함되었다.

    T 2 세대에서는, 단일 카피와 저 카피 (2개 또는 3개 카피) 둘 다의 dgt -14 사건을 대상으로 하여, 글리포세이트 내성에 관하여 명확히 규명하였다. 다양한 비율의 글리포세이트에 대해 dgt -1 및 형질전환되지 않은 야생형 대조군과 비교해서 엽록체 전이 펩티드와 연결된 dgt -14 구조물 각각에 의해 제공된 내성을 입증하기 위해, 비율별 전반적인 집단 피해 평균이 표 7에 제시된다. T 2 세대 사건은 TraP8 v2 (pDAB105526), TraP9 v2 (pDAB105527), TraP12 v2 (pDAB105528) 및 TraP13 v2 (pDAB105529)와 연결된 dgt -14를 함유하였다. 이들 사건 모두는 글리포세이트에 대해 고도로 저항성이다. 그 결과는 T 2 아라비도프시스 식물에 대한 피해 범위가, 시험되었던 모든 농도의 글리포세이트에 대해 20% 미만이었다는 사실을 표시하였다. TraP4 v5 (pDAB107526), TraP5 v2 (pDAB105525), 및 TraP5 v1 (pDAB102787)과 연결된 dgt -14를 함유하는 T 2 아라비도프시스 사건은 기타 TraP 전이 펩티드를 함유한 기타 dgt -14 구조물과 비교해서 글리포세이트에 대한 강건한 내성을 제공하지 못하였다. 그러나, TraP4 v5 (pDAB107526), TraP5 v2 (pDAB105525), 및 TraP5 v1 (pDAB102787)과 연결된 dgt -14 구조물은 형질전환되지 않은 대조군과 비교해서 상당히 더 높은, 저 수준의 글리포세이트 내성을 제공하였다. 전반적으로, 이 결과는 DGT-14를 함유하고 이를 발현하는 식물은 필드 비율의 3배 이하의 수준 (1120 g ae/ha)에서 글리포세이트에 대한 상업적 수준의 저항성을 산출하였다는 것을 보여주었다.

    저 카피 수의 트랜스유전자 삽입물 (1 내지 3개 카피 수)을 함유하는 것으로 확인된, 무작위로 선별된 T 2 아라비도프시스 식물을 자가 수정하여, 글리포세이트 내성을 부가 산정하기 위한 제3 세대를 생성시켰다. 제3 세대 (T 3 )로부터의 아라비도프시스 종자를 심고, 앞서 기재된 바와 동일한 프로토콜을 이용하여 글리포세이트 내성에 대하여 평가하였다. T 3 세대에서 시험된 사건은 동형접합성인 각 주로부터의 반복물을 함유하였다 (진화된 식물 중 어느 것이 트랜스유전자의 분리를 보여주었는지를 확인하기 위해 글루포시네이트 저항성 스크린을 사용함으로써 결정된 바와 같음). 이들 사건을 LC-MS-MS를 통하여 검정하여 상기 식물이 DGT-14 단백질을 발현하였다는 것을 확인하였다. 글리포세이트의 비율별 전반적인 집단 피해 평균에 대한 T 3 세대의 결과가 표 8에 제시되는데, 이는 다양한 비율의 글리포세이트에 대해 dgt -14 구조물 각각에 의해 제공된 글리포세이트에 대한 내성을 보여준다. 예시되는 저항성 T 3 사건은 TraP8 v2 (pDAB105526), TraP9 v2 (pDAB105527), TraP12 v2 (pDAB105528) 및 TraP13 v2 (pDAB105529)와 연결된 dgt -14를 포함하였다. 이들 사건 모두는 글리포세이트에 대해 고도로 저항성이다. 그 결과는 T 3 아라비도프시스 식물에 대한 피해 범위가, 시험되었던 모든 농도의 글리포세이트에 대해 20% 미만이었다는 사실을 표시하였다. TraP5 v2 (pDAB105525), 및 TraP5 v1 (pDAB102787)과 연결된 dgt -14를 함유하는 T 3 아라비도프시스 사건은 상이한 TraP 전이 펩티드를 함유한 기타 dgt -14 구조물과 비교해서 글리포세이트에 대한 강건한 내성을 제공하지 못하였다. 그러나, TraP5 v2 (pDAB105525), 및 TraP5 v1 (pDAB102787)과 연결된 dgt -14 구조물은 형질전환되지 않은 대조군과 비교해서 상당히 더 높은, 저 수준의 글리포세이트 내성을 제공하였다. 전반적으로, 이 결과는 DGT-14를 함유하고 이를 발현하는 식물은 필드 비율의 3배 이하의 수준 (1120 g ae/ha)에서 글리포세이트에 대한 상업적 수준의 저항성을 산출하였다는 것을 보여주었다.

    선별성 마커로서의 dgt -14

    상기 언급된 아라비도프시스 형질전환된 식물을 이용하여, 글리포세이트 선별제에 대한 선별성 마커로서의 dgt -14의 용도를 시험하였다. 대략 50개의 T 4 세대 아라비도프시스 종자 ( dgt -14에 대해 동형접합성)를 대략 5,000개의 야생형 (글리포세이트에 대해 민감성) 종자 내로 스파이킹하였다. 이들 종자를 발아시키고, 소식물체에 선택 용량의 글리포세이트를 분무하였다. 글리포세이트의 몇 가지 처리를 비교하였는데; 다음 처리 계획 중 하나에서 1회 또는 2회의 글리포세이트 적용 시기를 식물의 각 트레이에 적용하였다: 7 DAP (재식 후 일수), 11 DAP, 또는 7 DAP에 이어 11 DAP. 모든 식물은 또한, 동일한 형질전환 벡터에 글루포시네이트 저항성 유전자를 함유하기 때문에, 글리포세이트로 선별된 dgt -14 함유 식물을, 글루포시네이트로 선별된 DSM -2 또는 pat 함유 대조군 식물과 직접 비교할 수 있다.

    글리포세이트 처리를, 앞서 기재된 바와 같이 데빌비스 분무 팁을 이용하여 적용한다. dgt -14를 함유하는 트랜스제닉 식물은 "저항성" 또는 "민감성" 17 DAP로서 확인된다. 재식 후 7일 및 11일 (DAP)에 적용된 26.25 내지 1680 g ae/ha 글리포세이트의 처리는 dgt -14를 함유하는 트랜스제닉 아라비도프시스 식물에 대한 효과적인 선별을 보여준다. 민감성 및 저항성 식물을 계수하였는데, 글리포세이트 내성 식물 수가, 심어 놓은 dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 트랜스제닉 종자의 본래 수와 상관이 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 dgt -14가 형질전환된 아라비도프시스 집단에 대한 대안적 선별성 마커로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 표시한다.

    dgt -14의 유전 가능성

    확인된 트랜스제닉 T 1 아라비도프시스 사건을 자가 수분하여 T 2 종자를 생산하였다. 이들 종자는 글루포시네이트 (200 g ae/ha)를 함유하는 이그나이트 (Ignite™) 제초제를 100개의 무작위 T 2 형제들에게 적용함으로써 시험된 자손이었다. 각각의 개별 T 2 식물을 분무 적용 (187 L/ha 적용 비율의 트랙 분무기)에 앞서 7.5-㎠ 포트에 옮겨 심었다. T 1 가족 (T 2 식물)은 카이(Chi) 제곱 분석 (P > 0.05)에 의해 결정된 바와 같이 멘델 유전을 이용하여 우성적으로 유전된 단일 유전자 자리에 대하여 예상되는 3개 저항성:1개 민감성 모델로 분리되었다. 예측된 멘델 유전으로 분리된 T 1 가족의 비율 (%)은 표 9에 예시되는데, 이는 dgt -14 형질이 멘델 유전을 통하여 T 2 세대로 전달된다는 것을 입증해준다. 5 내지 15개의 T 2 개체로부터 종자를 수집하였다 (T 3 종자). 3 내지 4개의 무작위로 선별된 T 2 가족 각각으로부터의 25개 T 3 형제들은 앞서 기재된 바와 같이 시험된 자손이었다. 데이터는 전혀 분리되지 않았다는 것을 보여주므로, dgt -14가 염색체 내에 안정적으로 통합되고, 적어도 3 세대로 멘델 방식으로 유전된다는 것이 입증되었다.

    실시예 8: 부가 작물 종의 형질전환

    WO 2007/053482의 실시예 #11 또는 실시예 #13에 이미 기재된 바와 동일한 기술을 활용함으로써, 대두를 dgt -14, dgt -11, dgt -12, dgt -18, dgt -29 또는 dgt -30 유전자로 형질전환시켜 제초제 글리포세이트에 대한 고 수준의 저항성을 제공할 수 있다.

    미국 특허 번호 7,838,733의 실시예 #14 또는 WO 2007/053482 [라이트(Wright) 등]의 실시예 #12에 이미 기재된 바와 동일한 기술을 활용함으로써, 면을 dgt -14, dgt -11, dgt -12, dgt -18, dgt -29 또는 dgt -30 유전자로 형질전환시켜 제초제 글리포세이트에 대한 고 수준의 저항성을 제공할 수 있다.

    미국 특허 번호 7,838,733의 실시예 #26 또는 WO 2007/053482 (라이트 등)의 실시예 #22에 이미 기재된 바와 동일한 기술을 활용함으로써, 캐놀라를 dgt -14, dgt -11, dgt -12, dgt -18, dgt -29 또는 dgt -30 유전자로 형질전환시켜 제초제 글리포세이트에 대한 고 수준의 저항성을 제공할 수 있다.

    실시예 9: 기타 작물의 애그로박테륨 - 매개된 형질전환

    본 발명의 개시내용의 측면에서, 당해 분야에 공지되어 있는 기술을 이용하여 본 발명의 개시내용의 실시양태에 따라서 부가 작물을 형질전환시킬 수 있다. 호밀의 애그로박테륨-매개된 형질전환에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of ( Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye," Transgenic Res . 2003 Oct;12(5):587-96]을 참조한다. 수수의 애그로박테륨-매개된 형질전환에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Zhao et al., "Agrobacterium-mediated sorghum transformation," Plant Mol Biol . 2000 Dec;44(6):789-98]을 참조한다. 보리의 애그로박테륨-매개된 형질전환에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Tingay et al., "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation," The Plant Journal , (1997) 11: 1369-1376]을 참조한다. 밀의 애그로박테륨-매개된 형질전환에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Cheng et al., "Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiol . 1997 Nov;115(3):971-980]을 참조한다. 벼의 애그로박테륨-매개된 형질전환에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol . Biol . 1997 Sep;35(1-2):205-18]을 참조한다.

    이들 및 기타 식물의 라틴 명칭이 다음에 제공된다. 기타 (비-애그로박테륨) 형질전환 기술을 사용하여 dgt -14를, 예를 들어 이들 및 기타 식물 내로 형질전환시킬 수 있다는 것은 명백해야 한다. 그의 예는 옥수수 (제아 매이스), 밀 (트리티쿰 종), 벼 [오리자 종 ( Oryza spp . ) 및 지자니아 종 ( Zizania spp . )], 보리 (호르데움 종), 면 [아브로마 아우구스타 ( Abroma augusta ) 및 고시퓸 종], 대두 (글리시네 맥스), 사탕 무우 [베타 종 ( Beta spp . )], 사탕 수수 [아렌가 핀나타 ( Arenga pinnata )], 토마토 [리코페르시콘 에스쿨렌툼 ( Lycopersicon esculentum ) 및 기타 종, 피살리스 익소카르파 ( Physalis ixocarpa ), 솔라눔 인카눔 ( Solanum incanum ) 및 기타 종, 및 시포만드라 베타세아 ( Cyphomandra betacea )], 감자 [솔라눔 투베로숨 ( Solanum tuberosum )], 고구마 [이포모에아 바타타스 ( Ipomoea batatas )], 호밀 [세칼레 종 ( Secale spp . )], 후추 [캅시쿰 안누움 ( Capsicum annuum ), 차이넨스 종 ( chinense ), 및 들깨 종 ( frutescens )], 상추 [락투카 사티바 ( Lactuca sativa ), 페렌니스 ( perennis ), 및 풀켈라 ( pulchella )], 양배추 [브라시카 종 ( Brassica spp . )], 셀러리 [아퓸 그라베올렌스 ( Apium graveolens )], 가지 [솔라눔 멜론게나 ( Solanum melongena )], 땅콩 [아라키스 히포게아 ( Arachis hypogea )], 수수 [소르굼 종 ( Sorghum spp . )], 알팔파 [메디카고 사티바 ( Medicago sativa )], 당근 [다우쿠스 캐로타 ( Daucus carota )], 콩류 [파세올루스 종 ( Phaseolus spp . ) 및 기타 속], 귀리 [아베나 사티바 ( Avena sativa ) 및 스트리고사 ( strigosa )], 완두류 [피숨 ( Pisum ), 비그나 ( Vigna ), 및 테트라고놀로부스 종 ( Tetragonolobus spp . )], 해바라기 (헬리안투스 안누우스), 스쿼시 [쿠쿠르비타 종 ( Cucurbita spp . )], 오이 [쿠쿠미스 사티바 ( Cucumis sativa )], 담배 [니코티아나 종 ( Nicotiana spp . )], 아라비도프시스 (아라비도프시스 탈리아나), 잔디풀 [롤륨 ( Lolium ), 애그로스티스 ( Agrostis ), 포아 ( Poa ), 시노돈 ( Cynodon ), 및 기타 속], 클로버 [트리폴륨 ( Trifolium )], 야생 완두 [비시아 ( Vicia )]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 식물을, 예를 들어 dgt -14, dgt -11, dgt -12, dgt -18, dgt -29 및 dgt -30 유전자로 형질전환시키는 것이 본 발명의 개시내용의 실시양태에 고려된다.

    dgt -14, dgt -11, dgt -12, dgt -18, dgt -29 및 dgt -30 유전자는 많은 활엽수 및 상록수 목재 식부 시스템에서 제철 사용을 위해 중요한 글리포세이트 제초제의 적용성을 증가시킬 수 있는 잠재력을 지니고 있다. 글리포세이트 제초제 저항성 목재 종은 피해에 대한 우려 없이 이들 제초제의 과도한 사용의 융통성을 증가시킬 것이다. 이들 종은 오리나무 [알누스 종 ( Alnus spp . )], 서양물푸레나무 [프락시누스 종 ( Fraxinus spp . )], 사시나무 및 포플러 종 [포풀루스 종 ( Populus spp . )], 너도밤나무 [파구스 종 ( Fagus spp . )], 자작나무 [베툴라 종 ( Betula spp . )], 체리 [프루누스 종 ( Prunus spp . )], 유칼립투스 [유칼립투스 종 ( Eucalyptus spp . )], 히코리 (hickory) [카랴 종 ( Carya spp . )], 단풍나무 [애이서 종 ( Acer spp . )], 오크나무 [퀘르쿠스 종 ( Quercus spp . )], 및 소나무 [파이누스 종 ( Pinus spp . )]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    장식용 및 과실-보유 종에서 선택적 잡초 방제를 위해 글리포세이트 제초제 저항성을 이용하는 것 또한, 본 개시내용의 실시양태의 범위 내이다. 그의 예는 장미 [로사 종 ( Rosa spp . )], 참빗살나무 속의 관목 (burning bush) [에우오니무스 종 ( Euonymus spp . )], 페투니아 [페투니아 종 ( Petunia spp . )], 베고니아 [베고니아 종 ( Begonia spp . )], 진달래속 식물 [로도덴드론 종 ( Rhododendron spp . )], 야생사과 또는 사과 [말루스 종 ( Malus spp . )], 배 [피루스 종 ( Pyrus spp . )], 복숭아 [프루누스 종 ( Prunus spp . )], 및 금잔화 [타게테스 종 ( Tagetes spp . )]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

    실시예 10: 옥수수 형질전환

    옥수수 형질전환을 위한 DNA 구조물

    상기 언급된 바와 같은 표준 클로닝 방법을 옥수수의 애그로박테륨 투메파시엔스-매개된 형질전환에 사용하기 위한 이원성 벡터의 구축에 사용하였다. 다음 유전자 요소를, dgt -14를 함유하는 벡터에 사용하고; 제아 매이스 유비퀴틴 1 프로모터 (ZmUbi1; [미국 특허 번호 5,510,474] 참조)를 사용하여, 제아 매이스 리파제 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; [미국 특허 번호 7179902] 참조)에 의해 플랭킹되는 dgt -14 암호화 서열을 구동시키며, 선별성 마커 카세트는, 제아 매이스 리파제 3' 비번역 영역에 의해 플랭킹되는 aad -1 암호화 서열 ([미국 특허 번호 7,838,733] 참조)을 구동시키기 위해 사용되는 제아 매이스 유비퀴틴 1 프로모터로 이루어진다. 이러한 aad -1 암호화 서열은 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 내성을 부여한다. dgt -14 구조물은 표준 이원성 벡터 및 애그로박테륨 초이원성(superbinary) 시스템 벡터로서 구축된다 [저팬 토바코 (Japan Tobacco); 일본 도쿄].

    이삭 멸균 및 배아 단리

    옥수수 미성숙 배아를 수득하기 위해, 제아 매이스 근친계 B104의 식물을 온실에서 성장시키고, 자가 수분 또는 근친 수분하여 이삭을 생성시켰다. 수분 후 대략 9 내지 12일에 이삭을 수확하였다. 실험 당일, 이삭을 차아염소산나트륨 (5%)의 20% 용액에 침지시킴으로써 표면-멸균시키고, 20 내지 30분 동안 진탕시킨 다음, 멸균수에서 3회 세정하였다. 멸균시킨 후, 미성숙한 접합자 배아 (1.5 내지 2.4 mm)를 각 이삭으로부터 무균적으로 절개하고, 액상 감염 배지 (LS 기저 배지, 4.43 gm/L; N6 비타민 용액 [1000X], 1.00 ml/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 슈크로스, 68.5 gm/L; D(+) 글루코스, 36.0 gm/L; 10 mg/ml의 2,4-D, 150 ㎕/L)를 함유하는 미소-원심분리용 튜브 내로 무작위로 분배하였다. 소정의 실험 세트의 경우에는, 3개의 이삭으로부터 모은 배아를 각 형질전환에 사용하였다.

    애그로박테륨 배양 개시:

    상기 언급된 이원성 형질전환 벡터를 함유하는 애그로박테륨의 글리세롤 원액을, 적당한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 판 위에 스트리킹하고, 20℃ 하에 3 내지 4일 동안 성장시켰다. 단일 집락을 집어내고, 동일한 항생제를 함유하는 YEP 판 상으로 스트리킹한 다음, 28℃ 하에 1 내지 2일 동안 항온 배양하였다.

    애그로박테륨 배양물 및 공동-배양:

    애그로박테륨 집락을 YEP 판으로부터 취하고, 50 ml 1회용 튜브 내의 감염 배지 10 ml에 현탁시키며, 분광광도계를 이용하여 세포 밀도를 0.2 내지 0.4의 OD600 nm이 되도록 조정하였다. 애그로박테륨 배양물을 실온에서 125 rpm 하의 회전 진탕기 상에 놓아두는 동안, 배아 절개를 수행하였다. 크기가 1.5 내지 2.4 mm인 미성숙한 접합자 배아를, 멸균된 옥수수 씨알맹이로부터 단리하고, 1 ml의 감염 배지에 놓아두며, 동일한 배지에서 1회 세척하였다. 애그로박테륨 현탁액 (2 ml)을 각 튜브에 가하고, 튜브를 10 내지 15분 동안 진탕기 플랫폼 위에 놓아두었다. 이 배아를 공동-배양 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 슈크로스, 30.0 gm/L; 젤잔 (Gelzan™), 3.00 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo 3 , 15.0 mg/L; DMSO, 100 μM) 상으로 옮기고, 배반이 위를 향하도록 배향시킨 다음, 50 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 24-시간 조명 아래 25℃ 하에 3일 동안 항온 배양하였다.

    캘러스 선택 및 추정 사건의 재생

    공동-배양 기간 후, 배아를 선택제를 수반하지 않은 휴지기 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 슈크로스, 30.0 gm/L; 젤잔 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)에 옮기고, 50 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 24-시간 조명 아래 및 25℃ 하에 3일 동안 항온 배양하였다. 성장 억제 용량 반응 실험은, 형질전환되지 않은 B104 옥수수 주에서 세포 성장을 억제시키기에는 0.25 mM 이상의 글리포세이트 농도면 충분하다는 것을 제안하였다. 배아를, 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 선택 1 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 슈크로스, 30.0 gm/L; 젤잔™ 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮기고, 50 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 24-시간 조명 아래 및/또는 암실에서 28℃ 하에 7 내지 14일 동안 항온 배양하였다. 증식성 배발생 캘러스를, 1.0 mM 글리포세이트를 함유하는 선택 2 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 슈크로스, 30.0 gm/L; 젤잔™ 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L; R-할록시폽산 0.1810 mg/L) 상으로 옮기고, 50 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 24-시간 조명 아래 및/또는 암실에서 28℃ 하에 14일 동안 항온 배양하였다. 이러한 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스를 추가로 증식 및 분화시킬 수 있게 해주었다. 캘러스 선택 기간은 3주 내지 4주간 지속된다. 증식성 배발생 캘러스를, 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 프리레그(PreReg) 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 350.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.250 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 50.0 mg/L; NAA-NaOH 0.500 mg/L; ABA-EtOH 2.50 mg/L; BA 1.00 mg/L; 슈크로스, 45.0 gm/L; 젤잔™ 2.50 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 1.00 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮기고, 50 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 24-시간 조명 아래 28℃ 하에 7일 동안 배양하였다. 어린 가지-유사 싹이 있는 배발생 캘러스를, 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 재생 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100.0 mg/L; 슈크로스, 60.0 gm/L; 젤란 검 G434™ 3.00 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 카르베니실린, 125.0 mg/L) 상으로 옮기고, 50 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 24-시간 조명 아래 7일 동안 배양하였다. 주근 (primary root)이 있는 소형 어린 가지를 피토트레이(phytotray) 내의 발근 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; 슈크로스, 60.0 gm/L; 젤란 검 G434™ 3.00 gm/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)에 옮기고, 140 내지 190 μmole m -2 sec -1 광 세기에서 16/8 시간 조명/암실 아래 27℃ 하에 7일 동안 항온 배양하였다. 추정상의 트랜스제닉 소식물체를 대상으로 하여, 상기 언급된 프로토콜을 이용하여 트랜스유전자 카피 수에 관하여 분석하고, 이를 토양에 옮겼다.

    옥수수 식물 내에서의 dgt -14 및 aad -1 트랜스유전자의 존재의 분자 확인

    dgt -14 및 aad -1 폴리뉴클레오티드 서열의 존재는 가수분해 프로브 검정을 통하여 확인하였다. 단리된 T 0 옥수수 식물을 초기에, TAQMAN™과 유사한 가수분해 프로브 검정을 통하여 스크리닝하여 aad -1 및 dgt -14 트랜스유전자의 존재를 확인하였다. 이들 연구로부터 발생된 데이터를 사용하여 트랜스유전자 카피 수를 결정하고, 이 데이터를 사용하여 역교배 및 T 1 세대로의 진전을 위한 트랜스제닉 옥수수 사건을 선별하였다.

    조직 샘플을 96-웰 판에 수집하고, KLECO™ 조직 미분쇄기 및 스텐레스 강 비드 [후버 프리시존 프러덕츠 (Hoover Precision Products; 미국 조지아주 커밍)]를 이용하여 퀴아젠™ RLT 완충액 중에서 조직 침출을 수행하였다. 조직 침출 후, 제조업자가 제안한 프로토콜에 따라서 바이오스프린트 96™ 플랜트 키트 (퀴아젠; 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 고-처리량 포맷으로 게놈 DNA를 단리하였다. 게놈 DNA를 퀀트-IT 피코 그린 DNA 검정 키트™ (몰레큘라 프로브스, 인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 정량화된 게놈 DNA를, BIOROBOT3000™ 자동화 액체 핸들러 (퀴아젠; 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 가수분해 프로브 검정을 위해 약 2 ng/㎕으로 조정하였다. TAQMAN ® 검정과 유사한 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스유전자 카피 수 결정은 LIGHTCYCLER ® 480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하여 실시간 PCR함으로써 수행하였다. LIGHTCYCLER ® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 이용하여 aad -1, dgt -14 및 내부 참조 유전자 전화효소 (유전자 은행 승인 번호 U16123.1)에 대한 검정을 설계하였다. 증폭을 위해, LIGHTCYCLER ® 480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, aad -1 및 dgt -14에 대한 각 프라이머 0.4 μM, 및 각 프로브 0.2 μM을 함유하는 10 ㎕ 용적 다중체 반응물에서 1 X 최종 농도로 제조하였다. 형광 취득하면서 40초 동안 60℃ 하에 확장시키면서 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 수행하였고, 각 샘플을 분석하기 위해 평균 순환 한계 (Ct) 값을 사용하였다. 상대적 퀀트 모듈을 이용하는 라이트사이클러 ® 소프트웨어 릴리즈 1.5를 사용하여, 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초한다. 대조군은 각 수행에 포함된 공지된 2 카피 체크 및 단일 카피 교정기로부터의 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다.

    dgt -14 형질전환된 T 0 옥수수에서 발아 후 제초제 내성

    T 0 사건은 온실에 순응하도록 허용되고, 2 내지 4개의 정상적으로 보이는 새로운 잎들이 윤생체 (whorl) (즉, 조직 배양물로부터 온실 생장 조건으로 전이된 식물)로부터 발아될 때까지 성장시켰다. 식물을 온실에서 16시간 조명:8시간 암실 조건 하에 27℃에서 성장시켰다. 그 다음, 상기 식물을, 2% w/v 황산암모늄을 부가하면서 두란고(Durango) DMA™의 상업적 제제 (제초제 글리포세이트 함유)로 처리하였다. 187 L/ha의 분무 용적, 50-cm 분무 높이 하의 트랙 분무기를 이용하여 제초제 적용을 수행하였다. 형질전환되지 않은 옥수수 주에 상당한 피해를 입힐 수 있는 280 내지 4480 g ae/ha 범위의 글리포세이트를 T 0 식물에 분무하였다. 치사 용량은 B104 근친계에 >95% 피해를 입히는 비율로서 정의된다.

    T 0 dgt -14 옥수수 식물의 결과는 글리포세이트에 대한 내성이 4480 g ae/ha 이하의 비율에서 달성된다는 사실을 입증해준다. 선별된 T 0 식물을 대상으로 하여, 그 다음 세대에서의 추가의 성상 확인을 위해 자가 생식시키거나 역교배하였다. 부가 실험은 T 1 식물을 함유하는 선택된 dgt -14 주 상에서 수행되는 100개 식물 자손 시험을 포함한다. 모든 식물에, 앞서 기재된 바와 같이 140 내지 1120 g ae/ha 글루포시네이트 또는 105 내지 1680 g ae/ha 글리포세이트를 분무하였다. 선별성 마커와 글리포세이트 저항성 유전자 둘 다를 동일한 플라스미드 상에서 구축하였다. 따라서, 제초제로 분무함으로써 하나의 제초제 내성 유전자가 선별되는 경우, 양 유전자는 존재하는 것으로 여겨진다. 14 DAT에서, 저항성 및 민감성 식물을 계수하여, 카이 제곱 분석에 의해 결정된 바와 같이 단일 유전자 자리, 우성 멘델 형질 (3R:1S)로서 분리된 주의 %을 결정하였다. 이들 데이터는 dgt -14가 외떡잎 식물 종에서 강건한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전 가능하다는 것을 입증해준다. 증가된 비율의 글리포세이트를 T 1 또는 F 1 생존자에 적용하여, dgt -14 유전자에 의해 제공되는 내성 및 보호를 추가로 명확히 규명하였다.

    선별성 마커로서의 글리포세이트의 발아 후 제초제 내성 용도

    앞서 기재된 바와 같이, T 0 형질전환된 식물을 조직 배양물로부터 옮기고 온실에 순응시켰다. 시험된 사건은 몇 가지 상이한 엽록체 전이 펩티드와 연결된 dgt -14를 함유한다. 이들 T 0 식물이 4480 g ae/ha 이하의 글리포세이트에서 강건한 내성을 제공하고, 형질전환되지 않은 식물은 280 g ae/ha 정도로 낮은 농도의 글리포세이트를 이용하여 방제된다는 사실이 입증되었다. 이들 데이터는 dgt -14가 280 내지 4480 g ae/ha 범위의 글리포세이트 농도를 이용하여 선별성 마커로서 활용될 수 있다는 것을 입증해준다.

    또 다른 실시양태는 dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 고정된 옥수수 주로부터의 정해진 수의 종자를, 정해진 수의 형질전환되지 않은 옥수수 종자 내로 스파이킹하는 것을 포함한다. 상기 종자를 심고, V1 내지 V3 발생기가 될 때까지 성장시킬 수 있는데, 이때 280 내지 4480 g ae/ha 범위의 글리포세이트 선택 용량을 상기 소식물체에 분무하였다. 7 내지 10일 후, 민감성 및 저항성 식물을 계수하였는데, 글리포세이트 내성 식물 수가, 심어 놓은 dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 트랜스제닉 종자의 본래 수와 상관이 있는 것으로 밝혀졌다.

    실시예 11: 기타 형질로의 스태킹( stacking )

    곤충 저항성 (IR) 형질을 함유하는 트랜스제닉 작물은 북미 전반에 걸쳐 옥수수, 대두 및 면 식물에서 유행하고 있고, 이들 형질의 활용은 전세계적으로 확장되고 있다. 곤충 저항성과 제초제 내성 (HT) 형질을 조합한 상업적 트랜스제닉 작물이 다수의 종자 회사에 의해 개발되어 왔다. 이들은 바실루스 투린기엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) 형질 (예를 들어, 웹사이트 lifesci.sussex.ac.uk, 2006에 열거된 Bt 독소), 비-Bt 곤충 저항성 형질, 및 상기 언급된 HT 형질 중 어느 것 또는 전부를 포함한다. IR 형질을 통하여 다수의 병충해 문제를 제어할 수 있는 능력은 가치있는 상업적 제품 개념이다. 그러나, 잡초 방제 및 곤충 방제가 서로 독립적일 경우에는, 이러한 제품 개념의 편의성이 제한될 것이다. Dgt -14 단독, 또는 한 가지 이상의 부가 HT 형질을 스태킹한 dgt -14에, 신규 형질전환 사건으로서 연대해서 또는 통상적인 육종을 통하여 한 가지 이상의 부가 투입 형질 (예를 들어, 곤충 저항성, 진균 저항성, 또는 스트레스 내성 등) ([www.isb.vt.edu] 참조)을 스태킹할 수 있다. 예시되는 IR 형질에 dgt -14를 스태킹할 수 있다. IR 형질의 암호화 서열을 수득할 때, 당업자는 발현 요소 (예를 들어, 프로모터, 인트론, 3' UTR 등)를 부가할 것이고, 재조합 DNA 방법론을 통하여 IR 형질에 dgt -14를 분자적으로 스태킹할 것이다. 예시되는 IR 형질 후보는 다음을 포함한다: Cry1F ([미국 특허 번호 5,126,133; 5,188,960; 5,691,308; 6,096,708; 6,573,240; 및 6,737,273] 참조); Cry1A(c) ([미국 특허 번호 6,114,138; 5,710,020; 6,251,656; 및 6,229,004] 참조); dgt -14와의 삼중 스택으로서의 Cry1F 및 Cry1A(c); Cry34Ab(1) ([미국 특허 번호 7,323,556; 7,897,342; 7,888,495; 7,875,430; 7,932,033; 7,956,246; 6,340,593] 참조); Cry35Ab(1) ([미국 특허 번호 6,340,593; 7,323,556; 7,897,342; 7,888,495; 7,875,430; 7,932,033; 7,956,246] 참조); 또는 dgt -14와의 삼중 스택으로서의 Cry35Ab(1) 및 Cry34Ab(1). 이점은 곤충 병충해 및/또는 기타 작물학적 스트레스를 관리할 수 있는 능력과 연계된 앞서 실시예에 기재되고 dgt -14에 의해 부여된 개선된 잡초 방제를 포함한다. 따라서, 본 발명의 개시내용의 실시양태를 사용하여, 많은 작물학적 쟁점들을 유연하고도 비용면에서 효과적으로 제어할 수 있는 능력과 개선된 작물 질의 완벽한 작물학적 패키지를 제공할 수 있다.

    IR 형질과 HT 형질의 조합은 대부분의 작물학적 및 원예/장식용 작물 및 산림에 적용된다. dgt -14와, 많은 Bt 또는 비-Bt IR 유전자 중 어느 것에 의해 제공된 그의 상응하는 제초제 내성 및 곤충 저항성의 조합을, 실시예 8 및 9에 열거된 (이에 제한되지는 않는다) 작물 종에 적용할 수 있다. 잡초 방제 분야의 숙련인은 통상적인 육종 또는 유전 공학에 의해 상응하는 HT 형질 또는 IR 형질로 스태킹하고 dgt -14 형질전환시킴으로써, 언급된 각종 상업적 제초제 중 어떠한 것도 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 화학을 대표하는 제초제의 구체적 비율은 CPR (작물 보호 참조) 서적 또는 유사한 편집본에 편집된 제초제 라벨, 온라인 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp) 편집된 라벨, 또는 문헌 ([Agriliance (2005)] 참조)으로부터의 작물 보호 안내서와 같은 모든 상업적 또는 학술적 작물 보호 안내서에 의해 결정될 수 있다. 단독으로 사용되든지, 탱크 혼합되든지 아니면 순차적으로 사용되든지 간에, dgt -14에 의해 HTC에서 사용 가능한 각 대체 제초제가 본 개시내용의 실시양태의 범위 내에서 고려된다.

    실시예 12: 모든 작물에서 AAD 형질이 스태킹된 DGT -14 형질

    신규 형질전환 사건으로서 연대하거나 또는 통상적인 육종을 통하여 dgt -14 형질에 aad 형질 (예를 들어, 미국 특허 번호 7838733에 기재된 aad -1; 또는 WO 2007/053482 A2에 기재된 aad -12)을 스태킹함으로써, 잡초 방제 효능, 융통성, 및 잡초 이동과 제초제 저항성 발생을 관리할 수 있는 능력을 개선시킬 수 있다.

    작물을 aad -1로 형질전환시키면, 재배자는 아릴옥시알카노에이트 제초제를 외떡잎 작물에 선택적으로 적용할 수 있다. 이러한 외떡잎 작물은 페녹시 옥신 안전성에 관한 여지가 더 클 것이다. 또한, 페녹시 옥신은 aad -1로 형질전환시킨 쌍떡잎 작물에 선택적으로 적용할 수 있다. 작물을 aad -12로 형질전환시키면, 재배자는 피리딜옥시 옥신 및 아릴옥시알카노에이트 제초제를 쌍떡잎 작물에 선택적으로 적용하여 잡초 종을 방제할 수 있다. dgt -14에 aad -1 또는 aad -12 형질을 스태킹함으로써, 재배자는 잡초 관리를 위해 보다 광범위한 스펙트럼의 제초제를 제공받는다. 더우기, 제초제 조합을 이용하면, 잡초 종 내의 제초제 저항성을 관리하는 데 있어 보다 더 많은 융통성이 생길 것이다.

    dgt -14 형질과 aad 형질을 어떠한 외떡잎 또는 쌍떡잎 작물 종에서도 스태킹하는, 개선된 잡초 방제 선택 사항에 대한 몇 가지 시나리오가 고려될 수 있다:

    a) 대부분의 풀 및 활엽 잡초 종을 방제하기 위하여 글리포세이트를 표준 발아 후 적용 비율 (420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha)로 적용할 수 있다. dgt -14 형질은 이들 적용 비율의 글리포세이트에서 내성을 제공할 수 있다. 코니자 카나덴시스 ( Conyza canadensis )와 같은 글리포세이트 저항성 활엽 잡초 또는 글리포세이트로는 방제하기가 본질적으로 곤란한 잡초 [예를 들어, 콤멜리나 종 ( Commelina spp )]를 방제하기 위하여, 280 내지 2240 g ae/ha (바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha)의 2,4-D를 순차적으로, 탱크 혼합하여 또는 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용하여 부가 방제를 제공할 수 있다. aad -1과 aad -12 둘 다는 2,4-D에 대한 내성을 제공한다.

    또한, aad -12는 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 트리클로피르 및 플루록시피르에 대한 내성을 제공한다. 이러한 피리딜옥시 옥신 제초제를 적용하여 코니자 카나덴시스 및 콤멜리나 종과 같은 글리포세이트 저항성 활엽 잡초를 방제할 수 있다. 트리클로피르의 경우, 적용 비율은 전형적으로 70 내지 1120 g ae/ha의 범위, 보다 전형적으로 140 내지 420 g ae/ha의 범위일 것이다. 플루록시피르의 경우, 적용 비율은 전형적으로 35 내지 560 g ae/ha의 범위, 보다 전형적으로 70 내지 280 ae/ha의 범위일 것이다.

    b) 대부분의 풀 및 활엽 잡초 종을 방제하기 위하여 글리포세이트를 표준 발아 후 적용 비율 (420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha)로 적용할 수 있다. 롤륨 리기둠 ( Lolium rigidum ) 또는 엘레우시네 인디카 ( Eleusine indica )와 같은 글리포세이트 저항성 풀 종을 방제하기 위하여, 10 내지 200 g ae/ha (바람직하게 20 내지 100 g ae/ha)의 퀴잘로포프를 순차적으로, 탱크 혼합하여 또는 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용하여 유효한 방제를 제공할 수 있다. Aad -1은 퀴잘로포프에 대한 내성을 제공한다. aad -1을 작물 종에서 dgt -14와 조합하여 스태킹하면, 상기 언급된 제초제에 대해 내성인 작물이 생성될 것이다.

    c) 글리포세이트는 활엽 잡초 종 이외의 풀 종을 방제하는 데 효과적이다. Aad -1과 dgt -14 스태킹된 형질은 글리포세이트의 풀-유효 비율 (105 내지 840 g ae/ha, 보다 바람직하게 210 내지 420 g ae/ha)을 적용하는 것을 감안할 것이다. 이어서, 2,4-D (280 내지 2240 g ae/ha, 보다 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha의 비율)를 순차적으로, 탱크 혼합하거나 또는 풀-유효 비율의 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용하여, 필요한 활엽 잡초 방제를 제공할 수 있다. 퀴잘로포프와 같은 AOPP 제초제를 10 내지 200 g ae/ha (바람직하게 20 내지 100 g ae/ha 및 보다 바람직하게 20 내지 35 g ae/ha)의 비율로, 보다 강건한 풀 잡초 방제를 위해 및/또는 글리포세이트 저항성 풀의 발생을 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 낮은 비율의 글리포세이트는 또한, 활엽 잡초 방제에 일부 이득을 제공할 것이지만, 일차 방제는 2,4-D로부터 이루어질 것이다.

    d) 마찬가지로, aad -12와 dgt -14 스태킹된 형질은 글리포세이트의 풀-유효 비율 (105 내지 840 g ae/ha, 보다 바람직하게 210 내지 420 g ae/ha)을 적용하는 것을 허용할 것이다. 이어서, 2,4-D (280 내지 2240 g ae/ha, 보다 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha의 비율)를 순차적으로, 탱크 혼합하거나 또는 풀-유효 비율의 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용하여, 필요한 활엽 잡초 방제를 제공할 수 있다. 상기 언급된 비율로 사용된 트리클로피르 및 플루록시피르는 또한, 상기 처리 요법에 있어서 허용되는 구성분일 것이다. 낮은 비율의 글리포세이트는 또한, 활엽 잡초 방제에 일부 이득을 제공할 것이지만, 일차 방제는 2,4-D, 트리클로피르 또는 플루록시피르로부터 이루어질 것이다.

    잡초 방제 분야의 숙련인은 하나 이상의 상업적 아릴옥시 옥신 제초제를 단독으로 사용하거나 또는 조합하여 (순차적으로 또는 독립적으로) 사용하는 것은 작물 내로의 aad -12 형질전환에 의해 가능해진다는 것을 인식할 것이다. 마찬가지로, 1종 이상의 상업적 페녹시 옥신 제초제를 단독으로 사용하거나 또는 1종 이상의 상업적 AOPP 제초제와 조합하여 (순차적으로 또는 독립적으로) 사용하는 것은 aad -1에 의해 가능해진다. 이들 형질 중 어느 하나에 dgt -14를 스태킹하는 것은, 잡초 종의 보다 강건한 관리를 고려한 것이다. 이들 화학을 대표하는 기타 제초제의 구체적 비율은 CPR (작물 보호 참조) 서적 또는 유사한 편집본에 편집된 제초제 라벨, 온라인 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp) 편집된 라벨, 또는 문헌 ([Agriliance (2005)] 참조)으로부터의 작물 보호 안내서와 같은 어떠한 상업적 또는 학술적 작물 보호 안내서에 의해서도 결정될 수 있다. 단독으로 사용되든지, 탱크 혼합되든지 아니면 순차적으로 사용되든지 간에, aad -12, aad -1 또는 dgt -14에 의해 HTC에서 사용 가능한 각 대체 제초제가 본 개시내용의 실시양태의 범위 내에서 고려된다.

    실시예 13: 모든 작물에서 AHAS 형질이 스태킹된 DGT -14

    이미다졸리논 제초제 내성 ( AHAS )을 암호화하는 형질은 현재 북미에서 재배되고 있는 수많은 작물 (옥수수, 벼, 해바라기 및 밀을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)에 존재한다. 부가의 이미다졸리논 내성 작물 (예를 들어, 면 및 사탕무)이 개발 중에 있지만, 지금까지 상업적으로 방출되지는 않았다. 많은 이미다졸리논 제초제 (예를 들어, 이마자목스, 이마제타피르, 이마자퀸, 및 이마자픽)는 현재 각종 통상적인 작물에 선택적으로 사용되고 있다. 이마제타피르, 이마자목스 및 비-선택적 이마자피르의 사용은 AHAS 와 같은 이미다졸리논 내성 형질을 통하여 가능하였다. 지금까지 이미다졸리논 내성 HTC는 비-트랜스제닉되는 이점을 지니고 있다. 이러한 화학 부류는 또한, 상당한 토양 잔류 활성을 지니므로, 글리포세이트 또는 글루포시네이트에 의거한 시스템과는 달리, 적용 시한을 벗어나서 확장되는 잡초 방제를 제공할 수 있다. 그러나, 이미다졸리논 제초제에 의해 방제된 잡초의 스펙트럼은 글리포세이트 만큼 광범위하지 않다 (문헌 [Agriliance, 2003] 참조). 부가적으로, 이미다졸리논 제초제는 특정 작용 방식 (아세토락테이트 신타제, 즉 ALS의 억제)을 갖는데, 이에 대해 많은 잡초가 저항성을 발생하였다 (문헌 [Heap I (2004). The international survey of herbicide resistant weeds, available at www.weedscience.com] 참조). 신규 형질전환 사건으로서 연대하거나 또는 통상적인 육종을 통하여 dgt -14 형질에 이미다졸리논 내성 형질을 스태킹함으로써, 잡초 방제 효능, 융통성, 및 잡초 이동과 제초제 저항성 발생을 관리할 수 있는 능력을 개선시킬 수 있었다. 앞서 실시예에서 언급된 바와 같이, 작물을 dgt -14로 형질전환시킴으로써, 글리포세이트 제초제를 외떡잎 및 쌍떡잎 작물에 선택적으로 적용할 수 있다. dgt -14와 이미다졸리논 내성 형질을 어떠한 외떡잎 또는 쌍떡잎 작물 종에서도 스태킹하는, 개선된 잡초 방제 선택 사항에 대한 몇 가지 시나리오가 고려될 수 있다:

    a) 많은 풀 및 활엽 잡초 종을 방제하기 위하여 이마제타피르를 표준 발아 후 적용 비율 (35 내지 280 g ae/ha, 바람직하게 70 내지 140 g ae/ha)로 적용할 수 있다.

    i) 애마란투스 루디스 ( Amaranthus rudis ), 앰브로시아 트리피다 ( Ambrosia trifida ), 케노포듐 알붐 ( Chenopodium album ) (특히, 문헌 [Heap, 2004] 참조)과 같은 ALS-억제제 저항성 활엽 잡초는 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha의 비율로 탱크 혼합함으로써 방제할 수 있다.

    ii) 이포모에아 종 ( Ipomoea spp )과 같은, 이미다졸리논 제초제에 대해 본질적으로 보다 내성인 활엽 종은 또한, 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha의 비율로 탱크 혼합함으로써 방제할 수 있다.

    iii) 소르굼 할레펜세 ( Sorghum halepense ) 및 롤륨 종 ( Lolium spp . )과 같은 ALS-억제제 저항성 풀 잡초는 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha의 비율로 탱크 혼합함으로써 방제할 수 있다.

    iv) 본질적으로 내성인 풀 잡초 종 [예를 들어, 애그로피론 레펜스 ( Agropyron repens )]은 또한, 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게 560 내지 1120 g ae/ha의 비율로 탱크 혼합함으로써 방제할 수 있다.

    잡초 방제 분야의 숙련인은 통상적인 육종 또는 유전 공학에 의해 어느 이미다졸리논 내성 형질로 스태킹하고 dgt -14 형질전환시킴으로써, 각종 상업적 이미다졸리논 제초제 또는 글리포세이트 제초제 중 어느 것을 단독으로 사용하거나 또는 다중 조합하여 사용하는 것이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 이들 화학을 대표하는 기타 제초제의 구체적 비율은 CPR (작물 보호 참조) 서적 또는 유사한 편집본에 편집된 제초제 라벨, 온라인 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp) 편집된 라벨, 또는 문헌 ([Agriliance (2005)] 참조)으로부터의 작물 보호 안내서와 같은 어떠한 상업적 또는 학술적 작물 보호 안내서에 의해서도 결정될 수 있다. 단독으로 사용되든지, 탱크 혼합되든지 아니면 순차적으로 사용되든지 간에, dgt -14 및 ALS-내성 형질에 의해 HTC에서 사용 가능한 각 대체 제초제가 본 개시내용의 범위 내에 있다.

    실시예 14: 대두 형질전환

    안정적으로 통합된 dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 트랜스제닉 대두 (글리시네 맥스)는 대두 떡잎 마디 외식편의 애그로박테륨-매개된 형질전환을 통하여 생성시켰다. 기능적 dgt -14를 함유하는 이원성 벡터를 수반하는 비무장 애그로박테륨 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.

    애그로박테륨-매개된 형질전환은 다음 문헌의 변형된 반-떡잎 마디 과정을 이용하여 수행하였다 (문헌 [Zeng et al. (Zeng P., Vadnais DA, Zhang Z., Polacco JC, (2004), Plant Cell Rep ., 22(7): 478-482)] 참조). 간략하게 언급하면, 대두 종자 [cv. 마베릭 (Maverick)]를 기저 배지 상에서 발아시키고, 떡잎 마디를 단리하고, 이를 애그로박테륨으로 감염시켰다. 애그로박테륨을 제거하기 위하여, 어린 가지 개시, 어린 가지 신장 및 발근 배지에 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충시켰다. 제초제를 통한 선별을 이용하여, 형질전환되지 않은 어린 가지의 성장을 억제하였다. 선별된 어린 가지를 뿌리 발생을 위해 발근 배지에 옮긴 다음, 소식물체의 새환경 순응을 위해 토양 혼합물에 옮겼다.

    선별된 소식물체의 말단 작은 잎을 제초제로 국소 처리하여 (잎 페인트 기술) 추정상의 형질전환체에 대하여 스크리닝하였다. 이와 같이 스크리닝된 소식물체를 온실에 옮겨 새환경에 순응할 수 있게 한 다음, 제초제로 잎-페인팅하여 내성을 재확인하였다. 이들 추정상의 형질전환된 T 0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 제초제 선별성 마커 및 dgt -14 트랜스유전자의 존재를 확인하였다. T 0 식물은 온실에서 자가 수정하여 T 1 종자를 생산할 수 있었다.

    두 번째 대두 형질전환 방법을 사용하여 부가의 트랜스제닉 대두 식물을 생산할 수 있다. 기능적 dgt -14를 함유하는 이원성 벡터를 수반하는 비무장 애그로박테륨 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.

    애그로박테륨-매개된 형질전환은 다음 문헌의 변형된 반-종자 과정을 이용하여 수행하였다 (문헌 [Paz et al., (Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep ., 25: 206-213)] 참조). 간략하게 언급하면, 성숙한 대두 종자를 염소 가스로 밤새 멸균시키고, 애그로박테륨-매개된 식물 형질전환하기 20시간 전에 멸균수를 빨아들이게 하였다. 배꼽을 따라 종자를 수직 절단함으로써 반으로 절단하여 종자를 분리시키고, 종피를 제거하였다. 배아 축을 절제하고, 모든 축상 어린 가지/싹을 떡잎 마디로부터 제거하였다. 이로써 생성되는 반 종자 외식편을 애그로박테륨으로 감염시켰다. 애그로박테륨을 제거하기 위하여, 어린 가지 개시, 어린 가지 신장 및 발근 배지에 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충시켰다. 제초제성 선별을 이용하여, 형질전환되지 않은 어린 가지의 성장을 억제하였다. 선별된 어린 가지를 뿌리 발생을 위해 발근 배지에 옮긴 다음, 소식물체의 새환경 순응을 위해 토양 혼합물에 옮겼다.

    선별된 소식물체의 말단 작은 잎을 제초제로 국소 처리하여 (잎 페인트 기술) 추정상의 형질전환체에 대하여 스크리닝하였다. 이와 같이 스크리닝된 소식물체를 온실에 옮겨 새환경에 순응할 수 있게 한 다음, 제초제로 잎-페인팅하여 내성을 재확인하였다. 이들 추정상의 형질전환된 T 0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 선별성 마커 및 dgt -14 트랜스유전자의 존재를 확인하였다. 몇 가지 사건은 트랜스유전자를 함유하는 것으로서 확인되었다. 이들 T 0 식물을 추가 분석을 위해 진행시키고, 온실에서 자가 수정하여 T 1 종자를 생산할 수 있었다. dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 대두 식물을 수득하였다. dgt -14 대두 식물에 다양한 농도의 글리포세이트를 분무한 결과, 3360 g ae/ha 이하의 농도에서 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 것으로 나타났다.

    실시예 15: 벼에서 DGT -14 유전자의 형질전환

    안정적으로 통합된 dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 트랜스제닉 벼 (오리자 사티바)는 벼 떡잎 마디 외식편의 애그로박테륨-매개된 형질전환을 통하여 생성시켰다. 기능적 dgt -14를 함유하는 이원성 벡터를 수반하는 비무장 애그로박테륨 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.

    1 M KOH를 이용하여 배양 배지를 pH 5.8로 조정하고, 2.5 g/L 피타젤 (Phytagel) (시그마-알드리히; 미국 미주리주 세인트 루이스)로 고형화시켰다. 배발생 캘러스를, 40 ml 반-고체 배지를 함유하는 100 x 20 mm 페트리 디쉬에서 배양하였다. 벼 소식물체를 MAGENTA 박스 내의 50 ml 배지 상에서 성장시켰다. 세포 현탁액을, 35 ml 액체 배지를 함유하는 125 ml 원뿔형 플라스크에 유지시킨 다음, 125 rpm으로 회전시켰다. 배발생 배양물의 유도 및 유지는 25 내지 26℃ 하의 암실에서 일어나고, 식물 재생 및 완전-식물 배양은 조명 방에서 16-h 광주기로 일어난다 (문헌 [Zhang et al. 1996] 참조).

    배발생 캘러스의 유도 및 유지는 앞서 기재된 바와 같이 변형된 NB 기저 배지 상에서 수행되는데 (문헌 [Li et al. 1993] 참조), 여기서는 상기 배지가 500 mg/L 글루타민을 함유하도록 적응시킨다. 말토스 대신 30 g/L 슈크로스를 포함한 SZ 액체 배지 (문헌 [Zhang et al. 1998] 참조)에서 현탁 배양을 개시 및 유지시켰다. 삼투성 배지 (NBO)는 만니톨 및 소르비톨 각 0.256 M을 부가한 NB 배지로 이루어진다. 제초제 저항성 캘러스를, 3 내지 4주 동안 적당한 제초제 선택제가 보충된 NB 배지 상에서 선별하였다. 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 1 mg/L α-나프탈렌아세트산 (NAA), 5 mg/L 아브시스산 (ABA) 및 선택적 제초제를 수반한 NB 배지로 이루어진 배지 (PRH50) 상에서 1주 동안 예비-재생을 수행하였다. 소식물체의 재생 후, 추정상의 트랜스제닉 어린 가지가 재생될 때까지 2,4-D, 0.5 mg/L NAA, 및 선택적 제초제를 함유하는 NB 배지를 포함하는 재생 배지 (RNH50) 상에서 배양하였다. 어린 가지를, 1% 슈크로스 및 선택적 제초제가 보충된, 반-강도 무라쉬게 및 스쿠그(Murashige and Skoog) 기저 염 및 갬보르그(Gamborg)의 B5 비타민을 수반한 발근 배지로 옮겼다.

    오리자 사티바 엘. 자포니카 cv. 타이페이 (L. japonica cv. Taipei) 309의 성숙한 건조 종자를 문헌 ([Zhang et al. 1996] 참조)에 기재된 바와 같이 멸균시켰다. 멸균성의 성숙한 벼 종자를 암실에서 NB 배지 상에서 배양함으로써 배발생 조직을 유도하였다. 직경이 대략 1 mm인 일차 캘러스를 배반으로부터 꺼내고, 이를 사용하여 SZ 액체 배지에서 세포 현탁을 개시하였다. 이어서, 현탁액을 문헌 ([Zhang 1996] 참조)에 기재된 바와 같이 유지시켰다. 앞서의 계대배양 후 3 내지 5일에 액체 배지로부터 현탁액-유래된 배발생 조직을 꺼내고, 이를 NBO 삼투성 배지 상에 놓아두어 페트리 디쉬 내 전반에 걸쳐 약 2.5 cm의 원을 형성시키고, 충격에 앞서 4 h 동안 배양하였다. 충격 후 16 내지 20시간에, 조직을 NBO 배지로부터 NBH50 선택 배지 상으로 옮겨, 충격받은 표면이 반드시 위를 쳐다보게 하고, 암실에서 14 내지 17일 동안 항온 배양하였다. 이어서, 새로이 형성된 캘러스를 본래의 충격받은 외식편으로부터 분리시키고, 이를 동일한 배지 근처에 놓아두었다. 8 내지 12일이 더 지난 후, 비교적 치밀하고 불투명한 캘러스가 가시적으로 확인되었고, 이를 암실에서 7일 동안 PRH50 예비-재생 배지에 옮겼다. 이어서, 보다 치밀하고 불투명해진, 성장하고 있는 캘러스를 16-h 광주기 하에 14 내지 21일의 기간 동안 RNH50 재생 배지 상으로 계대배양하였다. 재생되고 있는 어린 가지를, 1/2 MSH50 배지를 함유하는 MAGENTA 박스에 옮겼다. 단일 외식편으로부터 재생된 다수의 식물은 형제인 것으로 간주되었고, 이를 하나의 독립된 식물 주로서 처리하였다. 특정 식물이 굵은 백색 뿌리를 생산하고, 1/2 MSH50 배지 상에서 활발하게 성장하는 경우, 이러한 식물은 dgt -14 유전자에 대해 양성으로서 스코어링된다. 일단 소식물체가 MAGENTA 박스의 상부에 도달하게 되면, 이들을 1주 동안 100% 습도 하의 6-cm 포트 내의 토양에 옮긴 다음, 온실 내의 13-cm 포트 내로 옮겨 심기 전 2 내지 3주 동안 30℃ 하의 14-h 광주기 및 21℃ 하의 암실을 수반한 성장 챔버로 이동시겼다. 종자를 수집하고, 4℃에서 저장하기에 앞서 1주 동안 37℃ 하에 건조시켰다.

    3 내지 5개 잎 단계인 추정상의 트랜스제닉 벼 소식물체에 글리포세이트 용액을 분무하였다. 일단 분무되면, 소식물체를 가스 배출 후드 밖으로 이동시키기 전 1시간 동안 건조시킬 수 있었다. 글리포세이트에 대한 민감성 또는 저항성에 관한 평가는 처리 후 10 내지 14일 [처리 후 일수 (DAT)]에 완료하였다. dgt -14 식물의 완전하게 통합된 카피를 함유하는 글리포세이트 저항성 벼 소식물체를 확인하였다. dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 벼 식물을 수득하였다. 이러한 dgt -14 벼 식물에 다양한 농도의 글리포세이트를 분무한 결과, 3360 g ae/ha 이하의 농도에서 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 것으로 나타났다.

    실시예 16: 잔디풀 형질전환 과정

    겨이삭 (creeping bentgrass)에서 dgt -14 트랜스유전자의 애그로박테륨 투메파시엔스-매개된 유전적 형질전환은 종자 (cv. Penn-A-4)로부터 개시된 배발생 캘러스를 통하여 달성하였다 (문헌 ["Efficiency of Agrobacterium tumefaciens -mediated turfgrass ( Agrostis stolonifera L) transformation" (Luo et. al., 2004)] 참조).

    외떡잎 식물 특이적 프로모터에 의해 구동된 제초제-저항성 트랜스유전자 (예를 들어, dgt -14)를 함유하는 초이원성 벡터를 정착시킨 에이. 투메파시엔스 균주로 캘러스를 감염시켰다. 전반적인 안정적 형질전환 효율은 18% 내지 45%의 범위이다. 서던 블롯 및 유전적 분석 결과, 겨이삭 게놈 내에서의 트랜스유전자 통합, 및 T 1 세대에서 상기 트랜스유전자의 정상적 전달 및 안정적 발현이 확인되었다. 모든 독립적인 형질전환 사건은 트랜스유전자의 1개 내지 3개 카피를 수반하고, 대다수 (60 내지 65%)는 외견상 재배열 없이 단지 단일 카피의 트랜스유전자 만을 함유한다.

    샌드 페이퍼로 성숙한 종자의 껍질을 벗기고, 90분 동안 격렬하게 진탕시키면서 10% (v/v) 클로록스 (Clorox™) 표백제 (6% 차아염소산 나트륨) 플러스 0.2% (v/v) 트윈(Tween) 20 (폴리소르베이트 20)에서 표면 멸균시켰다. 멸균성 증류수에서 5회 세정한 후, 상기 종자를 캘러스-유도 배지 (MS 기저 염 및 비타민, 30 g/L 슈크로스, 500 mg/L 카제인 가수분해물, 6.6 mg/L 3,6-디클로로- o -아니스산 (디캄바), 0.5 mg/L 6-벤질아미노퓨린 (BAP) 및 2 g/L 피타젤. 이 배지의 pH는 120℃ 하에 20분 동안 오토클레이빙하기 전에 5.7로 조정한다) 상에 놓아두었다.

    제조된 종자 외식편을 함유하는 배양 판을 실온 하에 암실에서 6주 동안 유지시켰다. 배발생 캘러스를 가시적으로 선별하고, 공동-배양하기 전 1주 동안 실온 하의 암실에서 신선한 캘러스-유도 배지 상에서 계대배양하였다.

    애그로박테륨 매개된-감염시키기 하루 전날, 배발생 캘러스를 1-mm 내지 2-mm 조각으로 나누고, 100 μM 아세토시린곤을 함유하는 캘러스-유도 배지 상에 놓아두었다. 이어서, dgt -14 트랜스유전자를 정착시킨 애그로박테륨 현탁액 (660 nm 하에 OD=1.0) 10 ㎕ 분취액을 각 캘러스 조각에 적용한 다음, 25℃ 하의 암실에서 3일 동안 공동-배양하였다. 이어서, 상기 캘러스를 옮기고, 세균성 성장을 억제하기 위하여 125 mg/L 세포탁심 및 250 mg/L 카르베니실린이 부가된 캘러스-유도 배지 상에서 2주 동안 배양하였다.

    트랜스제닉 식물의 선별은, 250 mg/L 세포탁심 및 제초제를 함유하는 캘러스-유도 배지로 상기 캘러스를 이동시킬 때 일어난다. 이 캘러스 재료를 3주의 선별 계대배양 간격을 이용하여 8주 동안 상기 배지 상에 유지시켰다. 이러한 선별 공정은 실온 하의 암실에서 수행하였다.

    식물 재생을 위해, 제초제-저항성 증식성 캘러스 사건을 먼저, 선별을 위해 제초제 및 세포탁심이 보충된 재생 배지 (MS 기저 배지, 30 g/L 슈크로스, 100 mg/L 미오-이노시톨, 1 mg/L BAP 및 2 g/L 피타젤)로 이동시켰다. 이들 캘러스를 실온 하의 암실에서 1주 동안 유지시킨 다음, 어린 가지를 발생시키기 위해 2 내지 3주 동안 조명 아래로 이동시켰다.

    발생된 어린 가지를 분리시키고, 이를 제초제 및 세포탁심을 함유하는 호르몬-무함유 재생 배지로 옮겨 뿌리 성장을 증진시키는 동안, 선별 압력은 유지시키고 나머지 모든 애그로박테륨 세포는 억제하였다. 이어서, 잘 발생된 뿌리 (3 내지 5주)를 갖는 소식물체를 토양에 옮기고, 온실이나 들판에서 성장시켰다.

    트랜스제닉 식물은 12월 동지 때까지 봉쇄 묘목장 내의 문 밖에서 유지시켰다 (3 내지 6개월). 이어서, 개화 결실을 촉진시킨 식물을 온실에 옮기고, 16/8 h 광주기 하에 25℃에서 유지시키며, 트랜스제닉 식물을 다른 화분 공급원으로부터 물리적으로 단리시키는 비-트랜스제닉 대조군 식물로 둘러싸이게 하였다. 이러한 트랜스제닉 식물은 온실 내로 다시 이동시킨지 3 내지 4주 후에 개화되기 시작한다. 이들 식물을 주위의 대조군 식물로부터의 화분과 이종 교배하였다. 각 개별적 트랜스제닉 식물로부터 수집된 종자를 25℃ 하의 토양에서 발아시키고, T 1 식물을 추가 분석을 위해 온실에서 성장시켰다.

    상기 언급된 프로토콜에 따라서 dgt -14 형질전환을 위해 고려되는 기타 풀은 1년생 왕포아풀 [포아 앤누아 ( Poa annua )], 바히아그래스 (Bahiagrass), 겨이삭띠 (Bentgrass), 버뮤다그래스 (Bermudagrass), 블루그래스 (Bluegrass), 나도기름새 (Bluestems), 브라키아리아, 브롬그래스 (Bromegrass), 브라운탑 벤트 (Browntop bent) [애그로스티스 카필라리에스 ( Agrostis capillaries )], 버팔로그래스 (Buffalograss), 카나리아풀 (Canary Grass), 카펫그래스 (Carpetgrass), 에레모클로아 (Centipedegrass), 츄잉스 페스큐 (Chewings fescue) [페스투카 루브라 콤무타테 ( Festuca rubra commutate )], 바랭이 (Crabgrass), 겨이삭 [애그로스티스 스톨로니페라 ( Agrostis stolonifera )], 볏이 있는 헤어그래스 (Crested hairgrass) [코엘레리아 마크란타 ( Koeleria macrantha )], 달리스그래스 (Dallisgrass), 페스큐 (Fescue), 페스톨륨 (Festolium), 하드/시프 페스큐 (Hard/sheeps fescue) [페스투카 오비나 ( Festuca ovina )], 그래머그래스 (Gramagrass), 인디안그래스 (Indiangrass), 존슨그래스 (Johnsongrass), 러브그래스 (Lovegrass), 믹스 (mixes) [에퀸 (Equine), 파스튜어 (Pasture) 등], 산야초 (Native Grasses), 오차드그래스 (Orchardgrass), 다년생 라이그래스 (Perennial ryegrass) [롤륨 페렌네 ( Lolium perenne )], 레드톱 (Redtop), 레스큐그래스 (Rescuegrass), 1년생 및 다년생 라이그래스, 호리호리하게 뻗어나가는 레드 페스큐 (Slender creeping red fescue) [페스투카 루브라 트리코필라 ( Festuca rubra trichophylla )], 매끄러운 줄기가 있는 왕포아풀 [포아 프라텐시스 ( Poa pratensis )], 세인트 오거스틴 (St. Augustine), 튼튼하게 뻗어나가는 레드 페스큐 [페스투카 루브라 루브라 ( Festuca rubra rubra )], 수단그래스 (Sudangrass), 스위치그래스 (Switchgrass), 톨 페스큐 (Tall fescue) [페스투카 아룬디나세아 ( Festuca arundinacea )], 촘촘한 헤어그래스 (Tufted hairgrass) [데스참프시아 캐스피토사 ( Deschampsia caespitosa )], 잔디풀, 휘트그래스 (Wheatgrass), 및 조이시아그래스 (Zoysiagrass)를 포함한다.

    실시예 17: 평지씨 ( 브라시카 나푸스 )에서의 DGT -14

    글리포세이트에 대한 저항성을 부여하는 dgt -14 유전자를 사용하여, 애그로박테륨-매개된 형질전환으로 브라시카 나푸스 변종 넥세라 (Nexera™) 710을 형질전환시켰다.

    브라시카 나푸스 종자를 10% 상업적 표백제로 10분 동안 표면-멸균시키고, 멸균성 증류수로 3회 세정하였다. 이어서, 상기 종자를 1/2 농도의 MS 기저 배지 (문헌 [Murashige and Skoog, 1962] 참조) 상에 놓아두고, 25℃ 및 16 hr 조명/8 hr 암실의 광주기로 설정된 성장 요법 하에 유지시켰다.

    배축 절편 (3 내지 5 mm)을 5 내지 7일생 묘목으로부터 절제하고, 전처리로서 3일 동안 캘러스 유도 배지 K1D1 (1 mg/L 키네틴 및 1 mg/L 2,4-D를 수반한 MS 배지) 상에 놓아두었다. 이어서, 상기 절편을 페트리 판 내로 옮기고, dgt -14로 구성된 구조물을 함유하는 애그로박테륨 투메파시엔스 균주로 처리하였다. 이러한 애그로박테륨 투메파시엔스를 28℃ 암실에서 150 rmp 하의 진탕기 상에서 밤새 성장시키고, 연속해서 상기 배양 배지에 재현탁시켰다.

    배축 절편을 애그로박테륨으로 30분 처리한 후, 이들 절편을 3일 동안 상기 캘러스 유도 배지 상에 다시 놓아두었다. 공동-배양한 후, 상기 절편을 1주 회수를 위해 K1D1TC (250 mg/L 카르베니실린 및 300 mg/L 티멘틴을 함유하는 캘러스 유도 배지)에 놓아두었다. 또 다른 한편, 상기 절편을 선별 배지 K1D1H1 (제초제를 수반한 상기 배지) 상에 직접 놓아두었다. 카르베니실린 및 티멘틴은 애그로박테륨을 사멸시키기 위해 사용된 항생제이다. 선별제는 형질전환된 세포의 성장을 고려한 것이다.

    단리된 독립적 사건으로부터의 캘러스 샘플을 PCR에 의해 시험하였다. dgt -14의 존재에 대해 시험 양성인 샘플을 확인하고, 재생을 위해 배지로 진행시켰다. 이어서, 굳은 배축 절편을 B3Z1H1 (MS 배지, 3 mg/L 벤질아미노 퓨린, 1 mg/L 제아틴(Zeatin), 0.5 gm/L MES [2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산], 5 mg/L 질산은, 선택적 제초제, 카르베니실린 및 티멘틴) 어린 가지 재생 배지 상에 놓아두었다. 3주 후, 어린 가지는 재생되기 시작하였다. 이러한 어린 가지를 따라 배축 절편을 B3Z1H3 배지 (MS 배지, 3 mg/L 벤질아미노 퓨린, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES [2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산], 5 mg/L 질산은, 선택적 제초제, 카르베니실린 및 티멘틴)에 3주 더 옮겼다.

    어린 가지를 배축 절편으로부터 절제하고, 어린 가지 신장 배지 MESH10 (MS, 0.5 gm/L MES, 선택적 제초제, 카르베니실린, 티멘틴)에 2 내지 4주 동안 옮겼다. 이와 같이 신장된 어린 가지를 뿌리 유도를 위해 MSI.1 (0.1 mg/L 인돌부티르산을 수반한 MS) 상에서 배양하였다. 일단 식물이 뿌리 체계를 정립하면, 이 식물을 토양 내로 옮겨 심었다. 이 식물을 온실에 옮기기 전 1 내지 2주 동안 콘비론 (Conviron™)에서 제어 환경 조건 하에 순응시켰다.

    형질전환된 T 0 식물을 온실에서 자가 수분하여 T 1 종자를 수득하였다. 이러한 T 0 식물 및 T 1 자손에 일정 범위 농도의 글리포세이트 제초제를 분무하여 dgt -14 유전자에 의한 보호 수준을 정립하였다.

    실시예 18: 담배 형질전환

    담배 [cv. 페티트 하바나 (Petit Havana)] 잎 조각을, dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 애그로박테륨 투메파시엔스를 사용하여 형질전환시켰다. dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 플라스미드를 함유하는 단일 집락을, dgt -14를 함유하는 벡터의 선별을 위해 항생제를 함유하는 YEP 배지 4 ml 내로 접종하고, 28℃ 하에 밤새 190 rpm 하의 진탕기 상에서 항온 배양하였다. 4 ml 종자 배양물을 연속해서 사용하여, 조절판이 있는 125 ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내의 동일한 배지의 25 ml 배양물을 접종하였다. 이러한 배양물을 약 1.2의 OD 600 에 도달할 때까지 190 rpm으로 진탕시키면서 28℃ 하에 항온 배양하였다. 이어서, 10 ml의 애그로박테륨 현탁액을 멸균성 60 x 20 mm 페트리™ 디쉬 내에 놓아두었다. 피타트레이(PhytaTrays) (시그마; 미국 미주리주 세인트 루이스) 내에서 30 g/L 슈크로스를 수반한 MS 배지 [피토테크놀로지 랩스 (Phytotechnology Labs; 미국 캔자스주 쇼니 미션)] 상에서 무균적으로 성장시킨 식물로부터 신선하게 절단된 잎 조각 (0.5 ㎠)을 수 분 동안 애그로박테륨의 10 ml 밤새 배양물에 침지시키고, 멸균성 필터지 상에서 건조 블롯팅한 다음, 1 mg/L 인돌아세트산 및 1 mg/L 6-벤질아미노 퓨린을 부가한 상기 동일한 배지 상에 놓아두었다. 3일이 지난 후, dgt -14 트랜스유전자를 정착시킨 애그로박테륨과 공동-배양한 잎 조작을, 5 mg/L 바스타 (Basta™) 및 250 mg/L 세포탁심을 수반한 상기 동일한 배지에 옮겼다. 3주 후, 개별적 T 0 식물을, 10 mg/L 바스타™ 및 250 mg/L 세포탁심을 수반한 MS 배지에 옮기고, 3주가 더 지난 후에, 토양에 옮겨 심고 온실로 옮겼다. 선별된 T 0 식물 (상기 언급된 분자 분석 프로토콜을 이용하여 확인된 바와 같음)을 자가 수분시킬 수 있고, 이들이 완전히 건조될 때 캡슐로부터 종자를 수집하였다. T 1 묘목을 대상으로 하여, 접합자의 특징 및 리포터 유전자 발현 (다음에 기재되는 바와 같음)에 대하여 스크리닝하고, dgt -14 트랜스유전자를 함유하는 선별된 식물을 확인하였다.

    본 개시내용의 측면이 특정 실시양태에 기재되긴 하였지만, 이는 본 개시내용의 요지 및 범위 내에서 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원은 그의 일반적 원리들을 이용하여 본 개시내용의 실시양태의 모든 변동, 용도 또는 적응을 포괄할 것이다. 추가로, 본 출원은 이들 실시양태가 속하고 첨부된 특허청구범위의 한계 내에 있는 분야에서 공지되거나 통상적인 실시의 범위 안에 있는 것으로서 본 발명의 개시내용으로부터의 상기 일탈을 포괄할 것이다.

    SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Lira, Justin Yerkes, Carla Cicchillo, Robert Robinson, Andrew <120> GLYPHOSATE RESISTANT PLANTS AND ASSOCIATED METHODS <130> 68835 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-14 sequence is a modification of GENBANK ACC NO: ZP_01452683 where the endogenous glycine was replaced with an alanine at amino acid residue 101 <400> 1 Met Ser Thr Gly Gly Thr Leu Ile Ala Gly Pro Ala Ala Gly Pro Leu 1 5 10 15 Lys Gly Glu Leu Thr Val Pro Gly Asp Lys Ser Met Ser His Arg Ser 20 25 30 Val Met Leu Ala Ala Leu Ala Asp Gly Val Thr Glu Ile His Gly Phe 35 40 45 Leu Pro Gly Glu Asp Asn Ile Ala Thr Ala Arg Met Phe Ile Asp Met 50 55 60 Gly Val Arg Ile Glu Trp Leu Asn Asp Glu Lys Thr Ser Leu Arg Val 65 70 75 80 His Gly Val Gly Leu His Gly Leu Lys Gln Pro Gln Gly Met Leu Asp 85 90 95 Ala Gly Asn Ala Ala Thr Cys Val Arg Leu Met Ala Gly Ile Leu Ala 100 105 110 Gly Gln His Phe Ser Ser Thr Val Thr Gly Asp 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Ala Ala Ala Thr Leu 325 330 335 Ala Asp Gly Glu Phe Val Leu Thr Asp Ala Glu Glu Leu Arg Val Lys 340 345 350 Glu Ser Asp Arg Ile Ala Ala Met Ala Thr Ala Leu Arg Ser Ala Gly 355 360 365 Ala Asp Ile Asp Glu Gln Pro Asp Gly Ala Val Ile Arg Gly Ile Thr 370 375 380 Asn Leu Arg Gly Asp Val Asp Val Asp Ala His Gly Asp His Arg Ile 385 390 395 400 Ala Met Ala Met Ala Val Ala Ala Gln Arg Ala Asp Gly Glu Val Arg 405 410 415 Ile His Asn Ala Ala Ala Ile Ala Thr Ser Phe Pro Asn Phe Val Gln 420 425 430 Leu Ala Gln Ser Val Gly Met Asn Val Arg Trp Ala Asp Glu Gly Glu 435 440 445 Ala <210> 2 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dicot codon optimized version of DGT-14 <400> 2 atgtcaactg gtggcactct gatagctgga ccagcagctg gaccactgaa gggagaattg 60 accgttcctg gtgacaaatc tatgtctcac agaagtgtga tgttagcagc tttggcagac 120 ggagtgacag agattcatgg attcctccct ggggaagata acatcgccac tgctcgtatg 180 ttcattgata tgggagtgag aattgagtgg ttgaatgacg aaaagacaag tctgagagtt 240 catggtgtgg gattgcatgg gcttaagcaa ccaca aggca tgttggatgc tgggaacgca 300 gctacatgtg ttagactcat ggctggcatc ttggctgggc aacacttctc ctctacagtt 360 acgggagacg cctcattgtg caagagaccc atgaagaggg tggttgatcc ggtgcgtcgt 420 atgggtgcaa aggttgaggg tggggatgat ggcaatcttc ttcccataac catctctggt 480 ggcaagctca aagctatcga ccacgtcagt gaagtcgcca gcgctcaagt caagagttgt 540 gtcctcttag ctggactgta tgcagatgga gttacaagtg taagcgagcc aaaacctact 600 cgtgatcata ctgaaagaat gttgccactg ttcggtcaac ccgtcaccgt cgcagcagac 660 ggaacgatta gccttgatcc taaggataga cttactgcac cagtcggagt tgttgacatt 720 ccagccgacc ctagtagcgc ttgtttcttt gcagtggcag cctccctcgt ggagggatct 780 gatgtgactc tgaagtcaat agggatcaat ccaagaagag acggttggag gcgtgttatg 840 aacggaatgg gagctgcttt gtctctcgaa aacgagcaga gggttggaga ggaacccgta 900 gccgatgtta gaatcagaag tggaggtctc cacgggatgc acgtggtgcc caatgacgtt 960 ccggacgcta tcgatgagtt tccagttttg ttcgctgctg caacattggc tgacggagag 1020 tttgtgttga cagatgcaga agaattgagg gttaaggaat cagatcgtat tgctgcaatg 1080 gccacagctt tacgtagtgc tggagctgat atcgatgaac agccagatgg t gccgtgata 1140 agagggatca ccaatctgag gggtgatgtg gacgtggacg ctcatggtga tcataggatt 1200 gcaatggcta tggcagtggc agctcaaaga gctgatggag aagtgagaat ccataacgct 1260 gctgctattg ccacttcatt ccctaacttc gttcaactgg ctcaatcagt cgggatgaat 1320 gtccgttggg ctgacgaggg agaggcatga 1350 <210> 3 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> monocot optimized version of dgt-14 <400> 3 atgtctacgg gaggcacact gatagctggt ccagcagctg gtccgcttaa gggtgaactc 60 actgttcctg gagacaagtc aatgagccat cgctcggtga tgctggctgc attggctgac 120 ggagtcacag agatccacgg gtttctgcct ggtgaggaca acatcgcaac agcgaggatg 180 ttcatcgaca tgggagtgag gattgagtgg ctcaacgacg aaaagacgtc gcttcgcgtt 240 catggcgtgg gtctgcatgg actgaaacaa cctcaaggga tgctggatgc tgggaacgct 300 gctacttgcg tgaggcttat ggctggaatc ttggctggcc agcacttctc aagcacggtc 360 acgggtgatg ccagcctttg caaaagaccg atgaagaggg tcgttgatcc agttaggagg 420 atgggtgcca aggtcgaggg tggcgacgac gggaatcttc tgcccataac catttccgga 480 gggaaactta aggcaatcga ccacgttagc gaagtggcct ctgcccaagt caagtcgtg c 540 gttcttctcg ctggtctgta tgccgacggt gtgacatcag tttcggagcc taagcccacg 600 agggatcaca ccgagaggat gcttcccttg ttcggacagc cagtcacggt ggcagccgac 660 ggcaccatct ccctcgaccc taaggatagg ctcactgctc cagttggcgt ggtggatatc 720 ccagccgatc cgtcatctgc ttgtttcttc gcagtcgcag cgtcacttgt cgaggggtcc 780 gacgtgactc tgaaatctat tgggatcaac ccgagacgcg acggttggag aagggtcatg 840 aacgggatgg gtgctgccct ctctctcgaa aacgagcaac gcgttggcga agagccagtg 900 gcagatgtgc ggatacgctc tggtggactt catgggatgc acgtggtgcc aaacgatgtt 960 ccggatgcaa tcgatgagtt tccagtgttg ttcgcagcag ctactcttgc tgatggtgag 1020 tttgttctga ccgacgctga agaactcaga gtgaaggaga gcgaccggat cgctgcgatg 1080 gcgacagcgc tgcggtcagc tggagccgac atagatgagc aacccgacgg tgccgtcatc 1140 agagggatca ccaacttgag aggcgacgtg gatgtggatg cccacggaga tcatcgcatc 1200 gcgatggcga tggctgtcgc agcccagagg gcagatggcg aagtcagaat ccacaacgca 1260 gctgctattg ccacatcatt tccgaacttt gtgcagctgg ctcagtccgt tggcatgaat 1320 gtgcggtggg cagatgaagg agaggcgtga 1350 <210> 4 <211> 1380 <212> DNA <213> Artif icial Sequence <220> <223> E. coli optimized version of dgt-14 <400> 4 atggcgcgcc catatgagca ccggtggcac cctgattgct ggtcctgcag ccggtccgct 60 gaaaggtgaa ctgaccgttc cgggtgataa aagcatgagc catcgtagcg ttatgctggc 120 agcactggca gatggtgtta ccgaaattca tggttttctg cctggcgaag ataatattgc 180 aaccgcacgc atgtttattg atatgggcgt gcgtattgaa tggctgaacg atgaaaaaac 240 cagcctgcgt gttcatggtg ttggtctgca tggtctgaaa cagccgcagg gtatgctgga 300 tgccggtaat gcagcaacct gtgttcgtct gatggcaggc attctggcag gccagcattt 360 tagcagcacc gttactgggg atgcaagcct gtgtaaacgt ccgatgaaac gtgttgttga 420 tccggttcgt cgtatgggtg caaaagttga aggtggtgat gatggaaatc tgctgccgat 480 taccattagc ggtggtaaac tgaaagccat tgatcatgtt agcgaagttg caagcgcaca 540 ggttaaaagc tgtgttctgc tggcaggcct gtatgcagat ggtgtgacca gcgttagcga 600 accgaaaccg acccgtgatc ataccgaacg tatgctgccg ctgtttggtc agccggttac 660 cgttgcagca gatggcacca ttagcctgga tccgaaagat cgtctgaccg caccggttgg 720 tgttgttgat attccggcag atccgagcag cgcatgtttt tttgcagtgg cagcaagcct 780 ggttgaaggt tctgatgtg a ccctgaaaag cattggtatt aatccgcgtc gtgatggttg 840 gcgtcgtgtt atgaatggta tgggtgcagc actgagcctg gaaaatgaac agcgtgttgg 900 tgaagaaccg gttgcagatg ttcgtattcg tagcggtggc ctgcatggta tgcatgttgt 960 tccgaatgat gttccggatg ccattgatga atttccggtt ctgtttgcag cagcaaccct 1020 ggccgatggt gaatttgttc tgaccgatgc agaagaactg cgcgttaaag aaagcgaccg 1080 tattgcagca atggcaaccg cactgcgtag cgcaggcgca gatattgatg aacagccgga 1140 tggtgcagtt attcgtggta ttaccaatct gcgtggtgat gttgatgttg atgcccatgg 1200 tgatcatcgt attgcaatgg caatggcagt tgcagcccag cgtgcagatg gtgaagttcg 1260 tattcataat gcagctgcaa ttgcaaccag ctttccgaat tttgttcagc tggcacagag 1320 cgttggtatg aatgttcgtt gggcagatga aggtgaagca taataactcg agttaattaa 1380 <210> 5 <211> 441 <212> PRT <213> Bartonella bacilliformis <400> 5 Met Gln Asn Ala Ile Pro Ala Thr Ala Gln Lys Ser Thr Ala Leu Ser 1 5 10 15 Gly Lys Ile Lys Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser Leu 20 25 30 Ile Leu Gly Gly Leu Ala Asn Gly Glu Thr His Ile His Gly Leu Leu 35 40 45 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atgcagaatg caattccggc aaccgcacag aaaa gcaccg cactgagcgg caaaattaaa 60 atccctggcg ataaaagcat tagccatcgt agcctgattc tgggtggtct ggcaaatggt 120 gaaacccata ttcatggtct gctggaatct gatgatattc tgcataccgc agcagcaatg 180 caggcaatgg gtgcacatat tcgcaaagaa aacggcattt ggattattcg tggcaccggt 240 aatggttgtc tgctgcaggc acagaaaccg ctgaattttg gtaatagcgc aaccggtgca 300 cgtctgatta tgggtatggt gagcagctat cacatgaaaa ccacctttac cggtgatgca 360 agcctgagca aacgtccgat ggaacgtatt ctgaatccgc tgcgtctgat gggcaccaat 420 attgaagcaa ccagcaacaa tctgccgctg accctgtatg gtccgaaaat ggcaaatccg 480 atttgttatc gtctgccgat tgcaagcgca caggttaaaa gcagcattct gctggcaagc 540 ctgaataccg caggcattac caccgttatt gaaccgattc tgacccgtga tcataccgaa 600 aaaattctgg aactgttcgg tgcaaaactg gatatcgaaa ccaataaaga aggcacccgc 660 tttattcaca tgcatggtca gccgcatctg acaggtcaga gcattgatat tccgggtgat 720 ccgagcagcg cagcatttcc gctgattgca gcactgctga ttgaagatag cgatatcatc 780 atcgaaaacg tgctgattaa tagcagccgt attggactga ttcagaccct gtgggaaatg 840 ggtgccaaaa tcgaatttct gaatcagcgt cagcagggtg gtgaaaatat tgc agatctg 900 cgtgttcgta gcagcgttct gaaaggtgtt accgttccga aagaacgtgc accgagcatg 960 attgatgaat atccggcact ggcagttgca gcagcatttg ctgaaggtaa aaccaccatg 1020 ctgggtattg aagaactgcg tgtgaaagaa agcgatcgtc tgagcaccat tgcacagggt 1080 ctgaaaatta accatgtgga ttgcgaaaaa ggtgtggatt ttctgattat ccatggccag 1140 aatagcagca aaggtctggg tggtggttgt attaaaaccc atctggatca tcgtattgcc 1200 atgtgctttc tggtttttgg tctggcaagc gaaaaaccgg ttaccattga tgatcgtcgt 1260 gttattgcaa ccagctttcc ggcatttatt ccgctgatga atcagctggg tggcaaaatc 1320 cac 1323 <210> 7 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-12 sequence is a modification of GENBANK ACC NO: ZP_01622155.1 where the endogenous glycine was replaced with an alanine at amino acid residue 111 <400> 7 Met Leu Thr Gly Ile Ile Glu Thr Lys Thr Ser Glu Ser Gln Gln Thr 1 5 10 15 Leu Ser Val Glu Pro Pro Thr Ser Gly Leu Ser Leu His Gly Ser Ile 20 25 30 Glu Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ala Leu Met Leu Gly 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Ala Ala Phe Trp Leu Val Ala Gly Ala Ile Ile Pro Gly Ser Glu Leu 260 265 270 Leu Ile Gln Asn Val Gly Val Asn Pro Thr Arg Thr Gly Ile Leu Asp 275 280 285 Ala Leu Glu Met Met Glu Ala Asp Ile Gln Leu Glu Asn Gln Arg Glu 290 295 300 Val Ala Gly Glu Pro Val Ala Asp Leu Arg Val Lys Tyr Ser Gln Leu 305 310 315 320 Lys Ala Cys Thr Leu Glu Gly Ala Leu Ile Pro Arg Leu Ile Asp Glu 325 330 335 Ile Pro Ile Leu Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Gln Gly Thr Thr Ile 340 345 350 Ile Arg Asp Ala Glu Glu Leu Arg Val Lys Glu Ser Asp Arg Ile Thr 355 360 365 Val Met Ala Ala Glu Leu Asn Arg Met Gly Ala Lys Ile Ser Glu Leu 370 375 380 Pro Asp Gly Met Glu Ile Val Gly Gly Thr Ala Leu Thr Gly Ala Glu 385 390 395 400 Val Asp Ser Tyr Thr Asp His Arg Ile Ala Met Ser Leu Ala Ile Ala 405 410 415 Ala Leu Lys Ala Ser Gly Lys Thr Thr Ile Gly Arg Ala Glu Ala Ala 420 425 430 Ser Ile Ser Tyr Pro Gln Phe Thr Thr Thr Leu Gln Gln Ile Cys Gly 435 440 445 <210> 8 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli optimized version of dgt-12 <400> 8 atgctgaccg gtatta tcga aaccaaaacc agcgaaagcc agcagaccct gagcgttgaa 60 ccgcctacca gcggtctgag cctgcatggt agcattgaaa ttccgggtga taaaagcatt 120 agccatcgtg cactgatgct gggtgcactg gcaaccggca ccaccattat tgaaggtctg 180 ctgctgggtg cagatccgcg tagcaccgca agctgtttta gccagatggg tgcacagatt 240 agcgaactga atgaaaaacg tgttgaagtg cgtggtattg gtctgggtca gctgcatgaa 300 ccgaccgcag ttctggatgc cggtaatagc gcaaccaccc tgcgtctgat gctgggcatt 360 ctggcaagcc atccggatcg tttttttacc gttaccggtg atcatagcct ggttcgtcgt 420 ccgatggatc gtgttgttaa accgctgcaa gaaatgggtg caatgatttg gggtcgtgaa 480 ggtggttctt ttgcaccgct ggcaattcag ggtcagcgtc tgaatccgat ccattataaa 540 agcccgattg caagcgcaca ggttaaaagc tgtgttctgc tggcaggcct gatggcagaa 600 ggtgaaacca ccgttaccga accggcactg agccgtgatc atagcgaacg tatgctgcgt 660 gcatttggtg caaccgttac cgtggatccg gaaacccata gcgcaaccgt tattggtccg 720 gcaaccctgc agggtcagcc ggttgttgtt cctggtgata ttagcagcgc agcattttgg 780 ctggttgccg gtgcaattat tccgggtagc gaactgctga ttcagaatgt tggtgttaat 840 ccgacccgta ccggtattct ggatgcactg gaaat gatgg aagcagatat ccagctggaa 900 aatcagcgtg aagttgccgg tgaaccggtt gcagatctgc gtgttaaata cagccagctg 960 aaagcatgta ccctggaagg tgcactgatt ccgcgtctga ttgatgaaat tccgattctg 1020 gcagttgcag caaccagcgc acagggtaca accattattc gtgatgcaga agaactgcgc 1080 gttaaagaaa gcgatcgtat taccgttatg gcagcagaac tgaatcgtat gggtgccaaa 1140 atttctgaac tgccggatgg tatggaaatt gttggtggca ccgcactgac cggtgcagaa 1200 gttgatagct ataccgatca tcgtattgca atgagcctgg ccattgcagc actgaaagca 1260 agcggtaaaa ccaccattgg tcgtgcagaa gcagcaagca ttagctatcc gcagtttacc 1320 accaccctgc agcagatttg tggt 1344 <210> 9 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-18 sequence is a modification of GENBANK ACC NO: NP_928909.1 where the endogenous glycine was replaced with an alanine at amino acid residue 96 <400> 9 Met Gln Ser Leu Met Leu Gln Pro Ile Ser Tyr Ile Asn Gly Thr Ile 1 5 10 15 Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala 20 25 30 Ala Phe Ala Lys Gly Ala Thr Cys Leu Thr Asn Leu Leu Asp Ser Asp 35 40 4 5 Asp Ile Arg His Met Leu Asn Ala Leu Ala Ala Leu Gly Ile Ser Tyr 50 55 60 Arg Leu Ser Asp Asp Arg Thr Cys Cys Glu Val Asp Gly Ile Gly Gly 65 70 75 80 Leu Ile Thr His Gln Gly Pro Ile Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Ala 85 90 95 Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Leu Cys Leu Gly Lys Asn Asp 100 105 110 Val Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His 115 120 125 Leu Val Asp Ala Leu Arg Gln Gly Gly Ala Glu Ile Asp Tyr Leu Glu 130 135 140 Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu His Val Lys Gly Gly Phe Val Gly Gly 145 150 155 160 Lys Val Met Val Asp Gly Arg Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu 165 170 175 Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Glu Asn Asp Ser Glu Ile His Ile Gln 180 185 190 Gly Glu Leu Val Ser Lys Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Leu Ala Leu Met 195 200 205 Lys Ser Phe Gly Ile Thr Ile Asn His Asp Gln Tyr Gln Ile Phe His 210 215 220 Ile Lys Gly Arg Gln Gln Tyr Val Ser Pro Gly His Tyr Leu Val Glu 225 230 235 240 Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser 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tgatgctgca gccgattagc tatattaacg gcaccattaa tctgcctggt 60 ag caaaagcg ttagcaatcg tgcactgctg ctggcagcat ttgcaaaagg tgcaacctgt 120 ctgaccaatc tgctggattc tgatgatatt cgccacatgc tgaatgcact ggcagcactg 180 ggtattagct atcgtctgtc tgatgatcgt acctgttgtg aagttgatgg tattggtggt 240 ctgattaccc atcagggtcc gattgaactg tttctgggta atgcagcaac cgcaatgcgt 300 ccgctgaccg cagcactgtg tctgggtaaa aatgatgttg ttctgaccgg tgaaccgcgt 360 atgaaagaac gtccgattgg tcatctggtt gatgcactgc gtcagggtgg tgcagaaatt 420 gattacctgg aacaggaaaa ttatccgcct ctgcatgtta aaggtggttt tgtgggtggt 480 aaagtgatgg ttgatggtcg tgttagcagc cagtttctga ccgcactgct gatggctgca 540 ccgctggcag aaaatgatag cgaaatccat attcagggtg aactggttag caaaccgtat 600 attgatatta ccctggccct gatgaaaagc tttggcatca ccattaacca tgatcagtac 660 cagatctttc atattaaagg tcgccagcag tatgtttctc cgggtcatta tctggttgaa 720 ggtgatgcaa gcagcgcaag ctattttctg gcagcagcag caattaaagg tggcaccgtt 780 cgtgttaccg gtattggtaa aaatagcctg cagggcgata ccaaatttgc aaatgtgctg 840 gaaaaaatgg gtgcaaaaat tcgttggggt gatgattttg ttgaatgtga acgtggcacc 900 ctgaccggta ttgatatgga tatgaacgaa attccggatg cagcaatgac cattgcaacc 960 accgcactgt ttgcagccgg tgaaaccgtt attcgcaaca tttataattg gcgtgtgaaa 1020 gaaaccgatc gtctgcatgc aatggcaacc gaactgcgta aagttggtgc agaagttgaa 1080 gaaggcgttg attatatccg tattacaccg cctccgcgtc tgctgcctgc agaaattggc 1140 acctataatg atcatcgtat ggccatgtgt tttagcctgg ttgcactgag cgatacaccg 1200 gttaccattc tggatccggg ttgtaccgca aaaacctttc cggattactt taatcagctg 1260 gaacgtctga gccagcgtaa aagc 1284 <210> 11 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-29 sequence is a modification of GENBANK ACC NO: YP_322772.1 where the endogenous glycine was replaced with an alanine at amino acid residue 96 <400> 11 Met Asp Thr Ile Ala Ile Pro Ala Leu Asn Arg Pro Val Asp Ala Thr 1 5 10 15 Val Glu Ile Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Val 20 25 30 Ala Ala Leu Ala Gln Gly Asp Ser Thr Leu Glu Asn Ala Leu Phe Ser 35 40 45 Glu Asp Ser Glu Tyr Phe Ala Lys Cys Val Glu Gln Leu 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aggtgatagc 120 accctggaaa atgcactgtt tagcgaagat agcgaatatt ttgcgaaatg tgtggaac ag 180 ctgggtattc cgattaccct gaatccgcat ctggcacaga ttcaggttag cggtaaaggt 240 ggtgatattc cggcaaaaca ggcagacctg tttgttggtc tggcagcaac cgcagcacgt 300 tttattaccg cactggttgc actgggtaat ggtgaatatc gtctggatgg tgttccgcgt 360 atgcgtgaac gtccgatggg tgatctggtt accgttctgc agaatagcgg cattaaaatt 420 aactttgagg gcaacagcgg ttttatgccg tataccattt atggtcagca gtttgccggt 480 ggtcattttc gtctgaaagc aaatcagacc agccagcagc tgtctgcact gctgatgatt 540 gcaccgtatg cacagcagga taccaccatt gaagttgaag gcaccctggt tagccagagc 600 tatgttaaaa tgacctgtcg tctgatggca gattttggtg ttgatgttac ccagaccgat 660 gataaccagt ttcacattaa agccggtcag cgttatcagg cacgtcatta taccattgaa 720 ccggatgcca gcaatgcaag ctattttttt gcagcagcag cagttaccgg tggtcgtgtt 780 cgtgttaatc atctgaccaa acagagctgt cagggtgata ttctgtggct gaatgtgctg 840 gaacaaatgg gttgtcaggt tctggaaggt gaagattata ccgaagtgat tggtccggaa 900 cagctgcagg gtattgatgt ggatatgaac gatatgagcg atctggttca gaccctgggt 960 gcaattgctc cgtatgcaaa ttctccggtg attattcgca acgtggaaca cattcgctat 1020 aaagaaaccg a acgtattcg tgcagttgtt accgaactgc gtcgtctggg tgttaaagtt 1080 gaagaattcg ccgatggcat gaaaattgaa ccgaccccga ttaatccggc agcaatcgaa 1140 acctatcatg atcatcgtat ggcaatggca tttgccgtta ccggtctgaa aacaccgggt 1200 attgttattc aggatccggg ttgtaccgca aaaacctttc cggattattt tacccgcttt 1260 tttaaaatga tcggccag 1278 <210> 13 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-30 sequence is a modification of GENBANK ACC NO: ZP_02156189.1 where the endogenous glycine was replaced with an alanine at amino acid residue 96 <400> 13 Met Lys Gln Leu Arg Leu Glu Pro Ile Ser Lys Val Gln Gly Thr Ile 1 5 10 15 Asn Ile Pro Gly Ser Lys Ser Ile Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala 20 25 30 Thr Leu Ala Lys Gly Thr Thr Thr Leu Thr Asn Leu Leu Asp Ala Asp 35 40 45 Asp Ile Arg Tyr Met Leu Ala Ser Leu Lys Gln Leu Gly Val Asn Tyr 50 55 60 Arg Leu Ser Asp Asn Asn Thr Val Cys Glu Leu Glu Gly Ile Gly Ala 65 70 75 80 Pro Leu Asn Ala Lys Leu 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Ser Arg Gly Ala Lys Leu Lys Gly 290 295 300 Val Asp Leu Asp Met Asn His Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr Ile Ala 305 310 315 320 Thr Val Ala Leu Phe Ala Thr Gly Thr Thr Thr Ile Arg Asn Ile Tyr 325 330 335 Asn Trp Arg Ile Lys Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala Met Ala Thr Glu 340 345 350 Leu Arg Lys Val Gly Ala Ile Val Glu Glu Gly His Asp Tyr Ile Ser 355 360 365 Ile Thr Pro Pro Ser Lys Pro His Thr Ala Glu Ile Asp Thr Tyr Asn 370 375 380 Asp His Arg Met Ala Met Cys Phe Ser Met Leu Ala Phe Ala Asp Cys 385 390 395 400 Gly Ile Thr Ile Asn Asp Pro Asp Cys Thr Ser Lys Thr Phe Pro Asn 405 410 415 Tyr Phe Gln Gln Phe Ala Ala Leu Ala Gln 420 425 <210> 14 <211> 1278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli optimized version of dgt-30 <400> 14 atgaaacagc tgcgtctgga accgattagc aaagttcagg gcaccattaa tattccgggt 60 agcaaaagca ttagcaatcg tgcactgctg ctggcaaccc tggcaaaagg caccaccacc 120 ctgaccaatc tgctggatgc agatgatatt cgttatatgc tggcctctct gaaacagctg 180 ggtgttaatt atcgtctgag cgataataat accgtttgcg aactggaagg tattggtgca 240 ccgctgaatg caaaactggc acagaccctg tttctgggta atgcagcaac cgca atgcgc 300 ccgctgtgtg cagcactgac cctgggacaa ggtgaattta ccctgacagg tgaaccgcgt 360 atggaagaac gtccgattgg tgatctggtt gatgcattac gtcagctggg tgcaagcgtt 420 acctatctga aaaatgaagg ttttccgcct ctgaccatta aagcaaccgg tctgaatgcc 480 ggtgatgttg aaattgccgg tgatctgagc agccagtttc tgaccgcact gctgatggtt 540 gcaccgctgg ctaaaggtga agtgaacatt aaaattaaag gcgaactggt gagcaaaccg 600 tatattgata tcaccattgc actgatggca cagtttggtg tggaagtgat caatcatgat 660 tatcgtcgct ttgaaattaa agccggtcag acctatgttt ctccgggtaa agttctggtt 720 gaaggtgatg caagcagcgc aagctatttt ctggcagccg gtgcaattaa aggtggtgaa 780 gtgaaagtta ccggtgttgg tcgtctgagc attcagggtg atgttaaatt tgcagatgtg 840 ctggaaaaaa tgggtgcaga tatcgaatgg ggtgatgatt atattattag ccgtggtgcg 900 aaactgaaag gtgttgatct ggatatgaac catattccgg atgcagcaat gaccattgca 960 accgttgcac tgtttgcaac cggtacaacc accattcgca acatttataa ttggcgcatt 1020 aaagaaaccg atcgtctggc agcaatggca accgaactgc gtaaagttgg tgccattgtg 1080 gaagaaggcc acgattatat tagcattacc cctccgagca aaccgcatac cgcagaaatt 1140 gatacc tata acgatcatcg tatggccatg tgttttagca tgctggcatt tgcagattgt 1200 ggcatcacca ttaatgatcc ggattgtacc agcaaaacct tcccgaatta ttttcagcag 1260 tttgcagcac tggcacag 1278 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <400> 15 ggatgccggt aatgcaggaa cctgtgttcg tctgatgg 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <400> 16 ccatcagacg aacacaggtt cctgcattac cggcatcc 38 <210> 17 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.coli optimized sequence of GENBANK ACC NO: ZP_01452683 <400> 17 atgagcaccg gtggcaccct gattgctggt cctgcagccg gtccgctgaa aggtgaactg 60 accgttccgg gtgataaaag catgagccat cgtagcgtta tgctggcagc actggcagat 120 ggtgttaccg aaattcatgg ttttctgcct ggcgaagata atattgcaac cgcacgcatg 180 tttattgata tgggcgtgcg tattgaatgg ctgaacgatg aaaaaaccag cctgcgtgtt 240 catggtgttg gtctgcatgg tctgaaacag ccgcagggta tgctggatgc cggtaatgca 300 ggaacctgtg ttcgtctgat ggcaggcatt ctggcaggcc agcattttag cagcaccgtt 360 actggggatg caa gcctgtg taaacgtccg atgaaacgtg ttgttgatcc ggttcgtcgt 420 atgggtgcaa aagttgaagg tggtgatgat ggaaatctgc tgccgattac cattagcggt 480 ggtaaactga aagccattga tcatgttagc gaagttgcaa gcgcacaggt taaaagctgt 540 gttctgctgg caggcctgta tgcagatggt gtgaccagcg ttagcgaacc gaaaccgacc 600 cgtgatcata ccgaacgtat gctgccgctg tttggtcagc cggttaccgt tgcagcagat 660 ggcaccatta gcctggatcc gaaagatcgt ctgaccgcac cggttggtgt tgttgatatt 720 ccggcagatc cgagcagcgc atgttttttt gcagtggcag caagcctggt tgaaggttct 780 gatgtgaccc tgaaaagcat tggtattaat ccgcgtcgtg atggttggcg tcgtgttatg 840 aatggtatgg gtgcagcact gagcctggaa aatgaacagc gtgttggtga agaaccggtt 900 gcagatgttc gtattcgtag cggtggcctg catggtatgc atgttgttcc gaatgatgtt 960 ccggatgcca ttgatgaatt tccggttctg tttgcagcag caaccctggc cgatggtgaa 1020 tttgttctga ccgatgcaga agaactgcgc gttaaagaaa gcgaccgtat tgcagcaatg 1080 gcaaccgcac tgcgtagcgc aggcgcagat attgatgaac agccggatgg tgcagttatt 1140 cgtggtatta ccaatctgcg tggtgatgtt gatgttgatg cccatggtga tcatcgtatt 1200 gcaatggcaa tggcagttgc agcccagc gt gcagatggtg aagttcgtat tcataatgca 1260 gctgcaattg caaccagctt tccgaatttt gttcagctgg cacagagcgt tggtatgaat 1320 gttcgttggg cagatgaagg tgaagcataa taa 1353 <210> 18 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide sequence of TraP4 v5 <400> 18 atgcttgcta gacaaggtgg aagtctgaga gcttctcaat gcaacgctgg acttgctaga 60 agagttgaag ttggtgctct tgttgttcct agacctatct ctgttaacga cgttgttcct 120 cacgtttact ctgctccact ttctgttgct agaaggtctt gctctaagtc cagcattagg 180 tccactagaa ggcttcaaac tactgtgtgc tct 213 <210> 19 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide sequence Trap5 v1 <400> 19 atgcagctcc tcaaccagcg tcaggccctg cgcctgggcc gctcttctgc tagcaagaac 60 cagcaggttg ctcctctggc ctctcgccct gcgtcttcct tgagcgtcag cgcctcgagc 120 gtcgcgccgg cgcctgcttg cagtgctccc gcgggcgcag gtcgccgcgc tgttgtcgtg 180 cgcgca 186 <210> 20 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide s equence Trap5 v2 <400> 20 atgcaactcc tgaatcagag gcaagccctg cgtcttggtc gttcatctgc ttcaaagaac 60 cagcaagttg ctccactggc ctctaggcct gcttcttcct tgagcgtcag cgcatccagc 120 gtcgcacctg cacctgcttg ctcagctcct gctggagctg gaaggcgtgc tgttgtcgtg 180 agagca 186 <210> 21 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide sequence of TraP8 v2 <400> 21 atggctcaat ctagcagaat ctgccacggt gtgcagaacc catgtgtgat catttccaat 60 ctctccaaat ccaaccagaa caaatctcct ttctcagtca gcctcaagac tcaccagcag 120 cagcgtcgtg cttaccagat atctagctgg ggattgaaga agtcaaacaa cgggtccgtg 180 attcgtccgg ttaaggca 198 <210> 22 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide sequence of TraP9 v2 <400> 22 atggcacaag ccagccgtat ctgccagaat ccatgtgtga tatccaatct ccccaaaagc 60 aaccaccgta agtccccttt ctctgtctca ctcaagacgc atcagcctag agcctcttca 120 tggggactta agaagtctgg caccatgctg aacggttcag tgattagacc cgtcaaggtg 180 acagcttctg tttccgca 198 <210> 23 <211> 2 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide sequence of TraP12 v2 <400> 23 atggcacaat ctagcagaat ctgccacggt gtgcagaacc catgtgtgat catttcaaat 60 ctctcaaagt ccaatcagaa caaatcacct ttctccgtct ccctcaagac acaccagcat 120 ccaagggcat acccgataag cagctcatgg ggactcaaga agagcggaat gactctgatt 180 ggctctgagc ttcgtcctct taaggttatg tcctctgttt ccgca 225 <210> 24 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial chloroplast transit peptide sequence of TraP13 v2 <400> 24 atggcacaag ttagcagaat ctgtaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc 60 tcaaagtcca gccaacgtaa gtctcccctc agcgtgtctc tgaaaactca gcagcccaga 120 gcttcttcat ggggtttgaa gaaatctgga acgatgctta acggctcagt cattcgtccg 180 gttaaggtga cagcctccgt ctccgct 207 <210> 25 <211> 1566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-frame fusion of TraP4 v5:dgt-14 v2 <400> 25 atgcttgcta 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caccgtcgca gcagacggaa cgattagcct tgatcctaag 900 gatagactta ctgcaccagt cggagttgtt gacattccag ccgaccctag tagcgcttgt 960 tt ctttgcag tggcagcctc cctcgtggag ggatctgatg tgactctgaa gtcaataggg 1020 atcaatccaa gaagagacgg ttggaggcgt gttatgaacg gaatgggagc tgctttgtct 1080 ctcgaaaacg agcagagggt tggagaggaa cccgtagccg atgttagaat cagaagtgga 1140 ggtctccacg ggatgcacgt ggtgcccaat gacgttccgg acgctatcga tgagtttcca 1200 gttttgttcg ctgctgcaac attggctgac ggagagtttg tgttgacaga tgcagaagaa 1260 ttgagggtta aggaatcaga tcgtattgct gcaatggcca cagctttacg tagtgctgga 1320 gctgatatcg atgaacagcc agatggtgcc gtgataagag ggatcaccaa tctgaggggt 1380 gatgtggacg tggacgctca tggtgatcat aggattgcaa tggctatggc agtggcagct 1440 caaagagctg atggagaagt gagaatccat aacgctgctg ctattgccac ttcattccct 1500 aacttcgttc aactggctca atcagtcggg atgaatgtcc gttgggctga cgagggagag 1560 gcatga 1566 <210> 26 <211> 1551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In frame fusion of TraP5 v1: dgt-14 v2 <400> 26 atgcagctcc tcaaccagcg tcaggccctg cgcctgggcc gctcttctgc tagcaagaac 60 cagcaggttg ctcctctggc ctctcgccct gcgtcttcct tgagcgtcag cgcctcgagc 120 gtcgcgccgg cgcctgcttg cag tgctccc gcgggcgcag gtcgccgcgc tgttgtcgtg 180 cgcgcagcgt catctggcgc catgtcaact ggtggcactc tgatagctgg accagcagct 240 ggaccactga agggagaatt gaccgttcct ggtgacaaat ctatgtctca cagaagtgtg 300 atgttagcag ctttggcaga cggagtgaca gagattcatg gattcctccc tggggaagat 360 aacatcgcca ctgctcgtat gttcattgat atgggagtga gaattgagtg gttgaatgac 420 gaaaagacaa gtctgagagt tcatggtgtg ggattgcatg ggcttaagca accacaaggc 480 atgttggatg ctgggaacgc agctacatgt gttagactca tggctggcat cttggctggg 540 caacacttct cctctacagt tacgggagac gcctcattgt gcaagagacc catgaagagg 600 gtggttgatc cggtgcgtcg tatgggtgca aaggttgagg gtggggatga tggcaatctt 660 cttcccataa ccatctctgg tggcaagctc aaagctatcg accacgtcag tgaagtcgcc 720 agcgctcaag tcaagagttg tgtcctctta gctggactgt atgcagatgg agttacaagt 780 gtaagcgagc caaaacctac tcgtgatcat actgaaagaa tgttgccact gttcggtcaa 840 cccgtcaccg tcgcagcaga cggaacgatt agccttgatc ctaaggatag acttactgca 900 ccagtcggag ttgttgacat tccagccgac cctagtagcg cttgtttctt tgcagtggca 960 gcctccctcg tggagggatc tgatgtgact ctgaagtcaa t agggatcaa tccaagaaga 1020 gacggttgga ggcgtgttat gaacggaatg ggagctgctt tgtctctcga aaacgagcag 1080 agggttggag aggaacccgt agccgatgtt agaatcagaa gtggaggtct ccacgggatg 1140 cacgtggtgc ccaatgacgt tccggacgct atcgatgagt ttccagtttt gttcgctgct 1200 gcaacattgg ctgacggaga gtttgtgttg acagatgcag aagaattgag ggttaaggaa 1260 tcagatcgta ttgctgcaat ggccacagct ttacgtagtg ctggagctga tatcgatgaa 1320 cagccagatg gtgccgtgat aagagggatc accaatctga ggggtgatgt ggacgtggac 1380 gctcatggtg atcataggat tgcaatggct atggcagtgg cagctcaaag agctgatgga 1440 gaagtgagaa tccataacgc tgctgctatt gccacttcat tccctaactt cgttcaactg 1500 gctcaatcag tcgggatgaa tgtccgttgg gctgacgagg gagaggcatg a 1551 <210> 27 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-frame fusion of TraP5 v2: dgt-14 v2 <400> 27 atgcaactcc tgaatcagag gcaagccctg cgtcttggtc gttcatctgc ttcaaagaac 60 cagcaagttg ctccactggc ctctaggcct gcttcttcct tgagcgtcag cgcatccagc 120 gtcgcacctg cacctgcttg ctcagctcct gctggagctg gaaggcgtgc tgttgtcgtg 180 agagcagcat caactggt gg cactctgata gctggaccag cagctggacc actgaaggga 240 gaattgaccg ttcctggtga caaatctatg tctcacagaa gtgtgatgtt agcagctttg 300 gcagacggag tgacagagat tcatggattc ctccctgggg aagataacat cgccactgct 360 cgtatgttca ttgatatggg agtgagaatt gagtggttga atgacgaaaa gacaagtctg 420 agagttcatg gtgtgggatt gcatgggctt aagcaaccac aaggcatgtt ggatgctggg 480 aacgcagcta catgtgttag actcatggct ggcatcttgg ctgggcaaca cttctcctct 540 acagttacgg gagacgcctc attgtgcaag agacccatga agagggtggt tgatccggtg 600 cgtcgtatgg gtgcaaaggt tgagggtggg gatgatggca atcttcttcc cataaccatc 660 tctggtggca agctcaaagc tatcgaccac gtcagtgaag tcgccagcgc tcaagtcaag 720 agttgtgtcc tcttagctgg actgtatgca gatggagtta caagtgtaag cgagccaaaa 780 cctactcgtg atcatactga aagaatgttg ccactgttcg gtcaacccgt caccgtcgca 840 gcagacggaa cgattagcct tgatcctaag gatagactta ctgcaccagt cggagttgtt 900 gacattccag ccgaccctag tagcgcttgt 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