Ｅ１酵素変異体およびその用途 |
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| 申请号 | JP2014534774 | 申请日 | 2012-10-05 | 公开(公告)号 | JP2015502137A | 公开(公告)日 | 2015-01-22 |
| 申请人 | ミレニアム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドMillennium Pharmaceuticals, Inc.; ミレニアム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドMillennium Pharmaceuticals, Inc.; | 发明人 | ベンジャミン ストーン アミドン，; ベンジャミン ストーン アミドン，; ジェイムズ ブラウネル，; ジェイムズ ブラウネル，; ジェイムズ エム． ギャビン，; ジェイムズ エム． ギャビン，; エリック エム． コーニッグ，; エリック エム． コーニッグ，; マイケル ディー． シンチャック，; マイケル ディー． シンチャック，; ピーター ジー． スミス，; ピーター ジー． スミス，; | ||||
| 摘要 | 本発明は、UBA3、UAE、もしくはUBA6と名付けられた単離核酸分子、または新規のE1酵素変異体タンパク質をコードする他のE1酵素変異体核酸分子、を提供する。本発明は、アンチセンス核酸分子、UBA3、UAE、もしくはUBA6、または他のE1酵素変異体の核酸分子を含有する組み換え発現ベクター、前記発現ベクターが導入されている宿主細胞、および非UBA3、UAE、もしくはUBA6、または他のE1酵素変異体遺伝子が導入または撹乱されているヒト遺伝子導入動物も提供する。本発明は、単離したUBA3、UAE、もしくはUBA6、または他のE1酵素変異体のタンパク質、融合タンパク質、 抗原 ペプチドおよび抗UBA3、抗UAE、もしくは抗UBA6 抗体 、または他のE1酵素変異体に対する抗体もさらに提供する。【選択図】図1 | ||||||
| 权利要求 | ａ） 配列番号１の変異体を含む核酸分子であって、前記変異体がヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基の変異を有する、核酸分子； ｂ） 配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも２０ヌクレオチドの断片を含む核酸分子であって、前記断片がヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基の変異を有する、核酸分子； ｃ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記変異体がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、核酸分子；並びに ｄ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、前記断片が配列番号２の少なくとも１５個の連続アミノ酸を含み、且つ断片がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドの断片をコードする核酸分子、 からなる群から選択される単離核酸分子。 請求項１に記載の変異体に特異的に結合し、その野生型核酸分子には結合しない試薬。 ベクター核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。 異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。 請求項１に記載の核酸分子を含む、培養宿主細胞。 哺乳類宿主細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。 請求項１に記載の核酸分子を発現する、培養哺乳類宿主細胞。 ａ） 配列番号１の変異体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にコードされるポリペプチドであって、前記変異体がヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基の変異を有する、ポリペプチド； ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド；並びにｃ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体の断片を含むポリペプチドであって、前記断片が配列番号２の少なくとも１５個の連続アミノ酸を含み、且つ断片がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド、 からなる群から選択される単離ポリペプチド。 異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項８に記載のポリペプチド。 配列番号２のアミノ酸配列の変異体に結合する抗体であって、前記変異体がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、抗体。 ａ） 配列番号１の変異体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にコードされるポリペプチドであって、前記変異体がヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基の変異を有する、ポリペプチド； ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド；並びにｃ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体の断片を含むポリペプチドであって、前記断片が配列番号２の少なくとも１５個の連続アミノ酸を含み、且つ断片がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド、 からなる群から選択されるポリペプチドを作製するための、 核酸分子が発現される条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養することを含む、 方法。 試料中の請求項８に記載のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、 ａ） 試料を請求項８に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物と接触させ； ｂ） 化合物が試料中のポリペプチドに結合するかどうかを決定すること、 を含む、方法。 ポリペプチドに結合する化合物が抗体である、請求項１２に記載の方法。 請求項８に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物および使用説明書を含む、キット。 試料中の請求項１に記載の核酸分子の存在を検出するための方法であって、 ａ） 試料を核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと接触させ； ｂ） 核酸プローブまたはプライマーが試料中の核酸分子に結合するかどうかを決定する、 ステップを含む、上記方法。 試料がｍＲＮＡ分子を含み、核酸プローブと接触せられる、請求項１５に記載の方法 請求項１に記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする化合物および使用説明書を含む、キット。 請求項８に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって、 ａ） 請求項８に記載のポリペプチド、または請求項８に記載のポリペプチドを発現する細胞を、試験化合物と接触させ； ｂ） ポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定する、 ステップを含む、上記方法。 以下からなる群から選択される方法によって、試験化合物のポリペプチドへの結合が検出される、請求項１８に記載の方法： ａ） 試験化合物／ポリペプチド結合の直接検出による結合の検出； ｂ） 競合結合アッセイを用いる結合の検出； ｃ） ＮＡＥ経路活性についてのアッセイを用いる結合の検出。 請求項８に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、請求項８に記載のポリペプチド、または請求項８に記載のポリペプチドを発現する細胞を、前記ポリペプチドの活性を調節するのに充分な濃度の、前記ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む、上記方法。 請求項８に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための方法であって、 ａ） 請求項８に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ； ｂ） ポリペプチドの活性に対する試験化合物の効果を判定し、それによってポリペプチドの活性を調節する化合物を同定すること、 を含む、上記方法。 試験化合物が細胞の薬剤耐性を調節するかどうかを決定するための方法であって、 ａ） 試験化合物存在下での細胞内のＵＢＡ３変異体配列の発現または活性のレベルを測定し； ｂ） 試験化合物非存在下での細胞内の耐性配列の発現または活性のレベルを測定し； ｃ） 試験化合物存在下での細胞内のＵＢＡ３変異体配列の発現または活性のレベルが、試験化合物非存在下での細胞内のＵＢＡ３変異体配列の発現レベルと異なる場合に、前記化合物を細胞の薬剤耐性の調節剤として同定すること、 を含む、上記方法。 試験細胞が薬剤耐性表現型を有するかどうかを決定するための方法であって、 ａ） 細胞内での、 ｉ） 配列番号１の変異体を含む核酸分子であって、前記変異体がヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基の変異を有する、核酸分子； ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド、 からなる群から選択されるＵＢＡ３変異体配列の発現または活性を測定し； ｂ） ステップａ）で測定されたＵＢＡ３変異体配列の発現または活性を、薬剤耐性表現型を有さない対照細胞内での耐性配列の発現または活性と比較し； ｃ） 試験細胞内のＵＢＡ３変異体配列の発現または活性が、対照細胞内のＵＢＡ３変異体配列の発現または活性と比較して異なる場合に、試験細胞が薬剤耐性表現型を有することを決定すること、 を含む、上記方法。 対象が薬剤耐性腫瘍を有するかどうか、またはそれを発達させる危険性があるかどうかを決定するための方法であって、 ａ） 対象から得られた腫瘍細胞を含む生物試料内の上方制御されたまたは下方制御されたＵＢＡ３変異体ｍＲＮＡの発現を測定し； ｂ） ステップａ）で測定されたｍＲＮＡの発現を、薬剤耐性ではない対照生物試料内のｍＲＮＡの発現と比較し； ｃ） 患者から得られた生物試料内の上方制御されたｍＲＮＡの発現が、対照生物試料内の上方制御されたｍＲＮＡの発現よりも高い場合、または、患者から得られた生物試料内の下方制御されたｍＲＮＡの減少された発現が、対照生物試料内の下方制御されたｍＲＮＡの発現よりも低い場合、患者が薬剤耐性腫瘍を有する、またはそれを発達させる危険性があることを決定すること、 を含む、上記方法。 患者における薬剤耐性腫瘍を治療するための方法であって、患者内の前記腫瘍の薬剤耐性を低減させるのに効果的なある量の上方制御されたタンパク質のアンタゴニストまたは下方制御されたタンパク質のアゴニストを前記対象に投与すること、を含む、上記方法。 薬物療法が患者において継続されるべきかどうかを決定するための方法であって、 ａ． 患者から腫瘍細胞を含む生物試料を取得し； ｂ． 患者試料内のＵＢＡ３変異体配列の発現レベルを測定し； ｃ． ステップ（ｂ）で決定された発現レベルを、薬剤感受性生物試料内のＵＢＡ３変異体配列の発現と比較し； ｄ． 患者試料内のＵＢＡ３変異体配列の発現レベルが、薬剤感受性試料内のＵＢＡ３変異体配列の発現と比較して変化している場合に、治療を中止すること、 を含む、上記方法。 ＵＢＡ３変異体配列が上方制御された配列であり、前記配列の発現が薬剤感受性試料内の前記配列の発現と比較して増加している場合に治療が中止される、請求項２６に記載の方法。 ＵＢＡ３変異体配列が下方制御された配列であり、前記配列の発現が薬剤感受性試料内の前記配列の発現と比較して減少している場合に治療が中止される、請求項２６に記載の方法。 薬物療法が患者において継続されるべきかどうかを決定するための方法であって、 ａ． 腫瘍細胞を含む第一患者生物試料および腫瘍細胞を含む第二生物試料を入手し、ここで第一試料は第二試料の前に入手され； ｂ． 第二試料内のＵＢＡ３変異体配列の発現レベルを測定し； ｃ． 第一試料内のＵＢＡ３変異体配列の発現レベルを測定し； ｄ． ステップ（ｂ）で決定されたＵＢＡ３変異体配列の発現レベルを、ステップ（ｃ）における耐性配列の発現レベルと比較し； ｅ． 第二試料の発現レベルが第一試料内の耐性配列の発現レベルと異なる場合に治療を中止すること、 を含む、上記方法。 耐性配列が上方制御された配列であり、第一試料内の前記配列の発現と比較して第二試料内の前記配列の発現が増加している場合に治療が中止される、請求項２９に記載の方法。 耐性配列が下方制御された配列であり、第一試料内の前記配列の発現と比較して第二試料内の前記配列の発現が減少している場合に治療が中止される、請求項２９に記載の方法。 患者における薬剤耐性腫瘍を治療するための方法であって、 ａ） 配列番号１の変異体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にコードされるポリペプチドであって、前記変異体がヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基の変異を有する、ポリペプチド； ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド；並びにｃ） 配列番号２のアミノ酸配列の変異体の断片を含むポリペプチドであって、前記断片が配列番号２の少なくとも１５個の連続アミノ酸を含み、断片がアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択されるアミノ酸の変異を有する、ポリペプチド、 からなる群から選択されるタンパク質の活性を低減する化合物を患者に投与することを含む、上記方法。 ａ） Ｅ１酵素の変異体を含むポリペプチドであって、前記Ｅ１酵素が、残基１２１に変異を有する配列番号２７の変異体、残基５４８に変異を有する配列番号２８の変異体、残基５８０に変異を有する配列番号２９の変異体、残基１８５に変異を有する配列番号３０の変異体、残基１８７に変異を有する配列番号３１の変異体、残基５７３に変異を有する配列番号３２の変異体、残基５４４に変異を有する配列番号３３の変異体、残基４８０に変異を有する配列番号３４の変異体、残基１３４に変異を有する配列番号３５の変異体および残基１３１に変異を有する配列番号３６の変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；並びにｂ） ａ）における変異型Ｅ１酵素の断片を含むポリペプチドであって、前記断片が変異したアミノ酸を含むＥ１酵素の少なくとも１５個の連続アミノ酸を含む、ポリペプチド、 からなる群から選択される、単離ポリペプチド。 請求項３３に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための方法であって、 ａ） 請求項３３に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ； ｂ） 前記ポリペプチドの活性に対する試験化合物の効果を決定し、それによって前記ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定すること、 を含む、上記方法。 患者における薬剤耐性腫瘍を治療する方法であって、Ｅ１酵素変異体への耐性を克服する治療有効量の薬剤を患者に投与すること、を含む、上記方法。 |
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| 说明书全文 | 関連出願の相互参照 本出願は、２０１２年２月８日に出願された米国仮特許出願番号６１／５９６，４２０および２０１１年１０月７日に出願された米国仮特許出願番号６１／５４４，８４３に対する優先権を主張するものである。 上記米国仮特許出願の内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。 配列表 ユビキチン様分子（ｕｂｌ）によるタンパク質の翻訳後修飾は細胞内の制御プロセスであり、細胞分裂、細胞情報伝達および免疫応答を含む多くの生物学的プロセスの調節に関わっている。 Ｕｂｌは、ｕｂｌのＣ末端グリシンとのイソペプチド結合を介して標的タンパク質上のリジンに、協調的な一連の酵素の作用によって共有結合している小タンパク質である。 ユビキチン様分子は標的タンパク質の分子表面を変化させ、標的のタンパク質間相互作用、酵素活性、安定性および細胞局在等の特性に影響を与え得る。 ｕｂｌを標的タンパク質に結合させる一連の酵素を調節する治療の開発により、細胞分裂および細胞情報伝達の完全性の維持に関わる種々の生化学的経路を干渉する機会が得られた。 従って、これらの酵素の阻害、およびｕｂｌ結合の下流効果の結果として生じる阻害は、細胞分裂、細胞情報伝達、および疾患機序に重要な細胞生理のいくつかの側面の完全性を干渉する方法を表すものである。 この干渉のいくつかは腫瘍細胞のアポトーシスによる死をもたらし得る。 がん治療のため等の化学療法は、通常、一種または複数種の細胞傷害性薬物または細胞分裂阻害剤を患者に投与することを含む。 がんの化学療法の目的は、形質転換細胞を含む腫瘍を個体の身体から根絶すること、または腫瘍の成長を抑制もしくは減弱することである。 がん化学療法の別の目的は、罹患した個体の健康状態の安定化（臨床管理）である。 いくつかの腫瘍は化学療法に最初は反応性を示す場合があるが、多くの場合、その最初の化学療法による治療計画は有効性が下がるか、または腫瘍成長を妨害しなくなる。 表現型または遺伝子型の特性が、いくつかの腫瘍細胞が化学療法剤の作用に抵抗することを可能にする。 アミノ酸置換の発生は、イミタニブ（ｉｍｉｔａｎｉｂ）、ゲフィチニブおよびエルロチニブを含むチロシンキナーゼ阻害剤等の抗がん剤に対する一般的な耐性形態として記載されている（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。 より最近の例としては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を有する肺がん患者において起こった、クリゾチニブ治療に続く未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）内のアミノ酸置換が挙げられる（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 クリゾチニブに対する感受性を低減したＡＬＫ内の変異は、ＥＭＬ４−ＡＬＫがんにおいて生じ得るという予測をもたらした、ＮＰＭ−ＡＬＫ転座モデルを用いる前臨床研究において最初に記述された（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。 これらのデータにより、これらの薬剤の酵素標的ががんを「駆動」すること、および阻害剤の活性が標的の阻害によるものであることが確認される。 腫瘍細胞または病原性微生物が化学療法に抵抗することを可能にする変異体の同定は、その耐性に対処する治療の開発に役立ち得る。 本発明は、Ｅ１酵素、および特定の薬剤に対する感受性が低減した変異体の分野に関する。 本発明は、Ｅ１酵素阻害剤に対する感受性が減少したＥ１酵素変異体、およびその低減した感受性を克服する阻害剤を同定する方法に関する。 本発明はまた、Ｅ１酵素遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む単離Ｅ１酵素変異体、例えば、前記ヌクレオチド変異によりＥ１酵素タンパク質内に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）が引き起こされている変異体に関する。 一つの態様では、Ｅ１酵素はＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ、ＡＰＰＢＰ１／ＮＡＥαおよびＵＢＡ３／ＮＡＥβから構成される）である。 別の態様では、Ｅ１酵素はＵＢＡ１である。 別の態様では、Ｅ１酵素はＵＢＡ６である。 本発明はまた、ＵＢＡ３遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む変異ＵＢＡ３変異体、例えば、前記ヌクレオチド変異によりＵＢＡ３タンパク質内に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）が引き起こされている変異体に関する。 本発明は、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート（図１参照）に対する感受性が低減したＵＢＡ３変異体に関する。さらに、本発明は、阻害剤に対する腫瘍試料の感受性、並びにＵＢＡ３遺伝子内の変異を検出するための方法および／またはアッセイに対する腫瘍試料の感受性を診断する分野に関する。 一つの態様では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素は、薬剤耐性腫瘍細胞内で発現されるヌクレオチド配列（薬剤耐性配列）を含む。 耐性配列（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体配列）の発現は、対照細胞（すなわち、非薬剤耐性細胞）または低薬剤耐性腫瘍細胞内の発現と比較した場合、特定の腫瘍細胞において増加（配列の上方制御）または減少（配列の下方制御）している。 薬剤耐性配列には、例えば、薬剤耐性細胞（例えば、がん細胞）の同定に関連する診断法において有用な、核酸およびポリペプチドが含まれる。 耐性配列（すなわち、耐性遺伝子、耐性ｍＲＮＡ、耐性ｃＤＮＡ、耐性ポリペプチド、および耐性タンパク質または上記いずれかの断片）は、特定の細胞型または複数の細胞型の薬剤耐性を調節（増加または低減）することができる化合物の同定を目的としたスクリーニング法においても有用である。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸配列に対応する単離核酸が提供される。 例えば、単離ポリ核酸は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素遺伝子内に少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む。 ヌクレオチド変異はさらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素タンパク質内に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換および／または欠失）をもたらし得る。 ＵＢＡ３ヌクレオチド変異を含むポリ核酸内のヌクレオチド変異は、発現されることでＵＢＡ３変異体タンパク質の少なくとも断片を含むポリペプチドを生成する可能性があり、ＮＡＥ阻害剤（例えば１−置換メチルスルファメート）に対する感受性の低減をもたらす可能性がある。 さらに、変異体ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列も包含される。 ヒトＵＢＡ３をコードする野生型ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１に示され、野生型ヒトＵＢＡ３ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２に示される。 具体的には、本発明は、変異型ＵＢＡ３ポリペプチドをコードする変異型ＵＢＡ３ヌクレオチド配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の変形）を含む単離核酸分子を提供する。 これらの単離ポリ核酸からの、および本明細書に記載の核酸分子によってコードされる変異型アミノ酸配列を有するＵＢＡ３ポリペプチドまたはその断片への、発現産物がさらに提供される。 配列表に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と実質的に相同である核酸分子およびポリペプチドが、本発明に包含される。 さらに、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の断片および実質的に相同な断片が提供される。 関連する態様において、本発明はさらに、本明細書に記載のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸分子を含む核酸構築体を提供する。 いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は天然または異種の制御配列に作動可能に連結している。 本発明は、本明細書に記載の核酸分子を組み換え発現するためのベクターおよび培養宿主細胞、並びにそのようなベクターおよび宿主細胞の作製法、並びに組換え技術により本発明のポリペプチドまたはペプチドを生成するためのそれらの使用法も提供する。 関連する態様において、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチド以外に作動可能に連結することで融合タンパク質を形成する、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体ポリペプチドまたは断片を提供する。 本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体分子は、細胞成長、細胞周期的増殖（ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および細胞間情報伝達を調節するのに有用である。 ＵＢＡ３変異体分子は、異常な細胞成長および細胞増殖、細胞周期進行または異常なシグナル伝達（例えばＮＡＥ調節物質への耐性）が存在する障害の診断および治療に有用である。 従って、一つの態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子、並びにＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体をコードする核酸の検出または単離に適したプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての核酸断片を提供する。 別の態様では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体をコードする核酸分子に対してアンチセンスである単離核酸分子が提供される。 さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体核酸、その断片または相補体は医薬組成物に組み込むことができ、その医薬組成物は所望により薬剤的に許容できる担体を含む。 本発明の別の態様は、例えば、ＮＡＥ関連障害または他の障害の治療および診断に適用可能なアッセイにおける試薬または標的として有用な、単離されたまたは組換え型のＵＢＡ３変異体タンパク質およびポリペプチド、並びにその生物学的に活性な、または抗原性の断片に関する。 別の実施形態では、本発明はＵＢＡ３変異体活性を有するＵＢＡ３ポリペプチドを提供する。 ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのＡＴＰ結合ポケット、ＮＥＤＤ８結合ポケット、ＴｈｉＦファミリードメイン、ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン、ＵＢＡＣＴドメインまたはＥ２結合ドメインを含み、且つ、所望により、ＵＢＡ３活性（例えば、本明細書に記載のＵＢＡ３活性）を有する、ＵＢＡ３変異体タンパク質である。 いくつかの実施形態では、ＵＢＡ３変異体タンパク質およびポリペプチドは、野生型ＵＢＡ３タンパク質が有する少なくとも１つの生物活性を有する。 他の実施形態では、ＵＢＡ３変異体タンパク質は、野生型ＵＢＡ３タンパク質と比較して、一つまたは複数のドメインの活性に変化を有する。 ＵＢＡ３変異体タンパク質は、ドメインの活性が減少、低減または消失されるように変化したドメインを有し得る。 さらに、ＵＢＡ３変異体タンパク質（ＵＢＡ３変異体遺伝子にコードされるタンパク質）またはその生物学的に活性な部分は医薬組成物に組み込むことが可能であり、その医薬組成物は所望により薬剤的に許容できる担体を含む。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドおよび断片と反応する（例えば、特異的または選択的に結合する）抗体および抗体断片が提供される。 抗体またはその断片は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドと、野生型ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素タンパク質とを区別することができる。 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する化合物のスクリーニング法を提供する。 一般的に、発現を調節する化合物のスクリーニングは、試験化合物の存在下および非存在下におけるＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現を測定し、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現を変化させる化合物を同定すること、を含む。 測定されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の核酸、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のポリペプチドの発現であり得る。 一般的に、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性を調節する化合物の同定法は、試験化合物の存在下および非存在下におけるポリペプチドの生物活性を測定し、ポリペプチドの活性を変化させる化合物を同定すること、を含む。 具体的には、本発明の、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素酵素またはポリ核酸または発現産物または組成物は、変異型ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の発現または活性を調節する少なくとも１つの薬剤を選択するためのプロセスにおいて使用される。 本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法に関する。 これらの方法には、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドを試験化合物と接触させるステップ、および次にそのポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定するステップが含まれる。 これらの方法の種々の実施形態において、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドへの試験化合物の結合は、試験化合物のポリペプチドへの直接的な結合を測定するアッセイを用いて、または競合結合アッセイを用いる間接的な結合を測定するアッセイを用いて、検出される。 別の態様では、本発明は、生物試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の活性の指標を検出することができる薬剤と接触させることによって、その活性の存在が生物試料中で検出される、生物試料中の耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の活性または発現の存在を検出するための方法を提供する。 例えば、本発明には、試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドの存在を検出するための方法が含まれる。 この方法は、試料をポリペプチドに選択的に結合する化合物と接触させるステップ、および次にその化合物が試料中のポリペプチドに結合するかどうかを決定するステップを特徴とする。 いくつかの場合、ポリペプチドに結合する化合物は抗体である。 別の態様では、本発明は、生物試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性の指標を検出することができる薬剤と接触させることによって、その活性の存在が生物試料中で検出される、生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性または発現の存在を検出するための方法を提供する。 本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡ（試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の存在を検出するための方法にも関する。 この方法は、試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと接触させるステップ；および次にその核酸プローブまたはプライマーが試料中の核酸分子に結合するかどうかを決定するステップ、が含まれる。 さらなる態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素のポリペプチドまたは核酸分子における遺伝子変化の有無を検出するためのアッセイ（例えば疾患診断用）を提供する。 本発明は、（ｉ）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素タンパク質をコードする遺伝子の異常な調節または変異；（ｉｉ）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素タンパク質をコードする遺伝子の誤制御；（ｉｉｉ）異常なＲＮＡスプライシング；および（ｉｖ）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素タンパク質の異常な翻訳後修飾、のうちの少なくとも１つにより特徴付けられる遺伝子損傷または遺伝子変異の有無を確認するための診断検査も提供し、ここで、前記遺伝子の野生型形態は正常なＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の活性を有するタンパク質をコードする。 別の態様では、本発明は複数のアドレス（ａｄｄｒｅｓｓ）を有する二次元アレイに関しており、それら複数のアドレスのそれぞれはそれら複数のアドレスの他のそれぞれと位置的に区別可能であり、それら複数のアドレスのそれぞれは独特な捕捉プローブ（例えば、核酸またはペプチド配列）を有している。 それら複数のアドレスのうち少なくとも１つは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の分子を認識する捕捉プローブを有する。 一実施形態では、捕捉プローブは核酸（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸配列に相補的なプローブ）である。 別の実施形態では、捕捉プローブはポリペプチド（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドに対して特異的な抗体）である。 試料を前記配列に接触させ、配列への試料の結合を検出することにより、試料を解析する方法も提供される。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドまたは核酸に選択的に結合する化合物および使用説明書を含むキットも、本発明に含まれる。 そのようなキットを使用することで、生物試料（例えば、患者から得られた細胞の試料）内の特定の細胞型または細胞が薬剤耐性であるかどうかを決定することができる。 細胞内のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列（例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチド）の発現または活性を測定し、この発現または活性を対照細胞における発現または活性と比較することにより、細胞が薬剤耐性表現型を有するかどうかを決定する方法も、本発明に含まれる。 対照細胞と比較した場合の、細胞内の上方制御されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列またはその産物の発現または活性の増加は、その細胞が薬剤耐性表現型を有することを示している。 対照細胞と比較した場合の、細胞内の下方制御されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列、その産物またはその経路内の遺伝子群の発現または活性の減少は、その細胞が薬剤耐性表現型を有することを示している。 この方法の一実施形態では、薬剤耐性はＵＢＡ３変異体配列を測定することにより（例えば、変異した残基を特徴とするエピトープと結合する抗体を用いて、本明細書に記載の変異を有する配列番号２等の、上方制御されたまたは下方制御されたＵＢＡ３変異体タンパク質を測定することにより）決定される。 別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体配列の発現は、ＵＢＡ３変異体タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＵＢＡ３変異体タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を定量化することにより、測定される。 別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体配列の活性は、ＵＢＡ３変異体タンパク質の生物活性を定量化することが可能なあらゆるアッセイを用いて、測定される。 さらに別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の配列の発現またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質の活性を測定することを含む、対象が薬剤耐性腫瘍を有するかまたはそれを発達させる危険性があるかどうかを決定するための方法を提供する。 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質の活性を調節（阻害または刺激）する、または、例えば、本明細書に記載のスクリーニングにおいて同定された化合物を用いて、細胞内のＵＢＡ３変異体の活性もしくは発現が調節されるように発現を調節（阻害または刺激）する薬剤と、細胞を接触させることを含む、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の活性を調節するための方法を提供する。 この方法は、ポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞を、ポリペプチドの活性を調節するのに充分な濃度の、ポリペプチドに結合する化合物と接触させるステップが含まれる。 一実施形態では、薬剤は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に特異的に結合する抗体である。 別の実施形態では、薬剤は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードする遺伝子の転写、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡのスプライシング、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡの翻訳を調節することにより、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現を調節する。 さらに別の実施形態では、薬剤は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡ、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードする遺伝子に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。 本発明には、細胞内のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性を調節することにより、細胞の薬剤耐性を調節するための方法も含まれる。 従って、一実施形態では、細胞内の上方制御されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の発現を低減する分子（例えば、アンチセンス核酸分子またはｓｉＲＮＡ）と細胞を接触させることにより、細胞の薬剤耐性が低減される。 別の実施形態では、細胞内の下方制御されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の発現を増加させる分子と細胞を接触させることにより、細胞の薬剤耐性が低減される。 一実施形態では、本発明の方法を使用することで、異常なＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の発現（例えば、タンパク質または核酸の発現）または活性を特徴とする障害（例えば、薬剤耐性がんまたは感染）を有する、または有することが疑われる対象を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の調節物質である薬剤（例えば、治療有効量の化合物）をその対象に投与することにより、治療する。 一実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の調節物質は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質である。 別の実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の調節物質は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸分子（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の発現を変化させる分子）である。 他の実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の調節物質は、ペプチド、ペプチド模倣薬、または他の小分子である。 異常なまたは欠損したＮＡＥの機能または発現を含む障害の例としては、限定はされないが、細胞増殖性および／もしくは細胞分化性の障害、感染症（例えば、寄生虫感染）、免疫性（例えば、炎症性）の障害または神経変性障害が挙げられる。 本発明の別の態様は、薬剤耐性腫瘍性細胞の存在に関連する障害を有する哺乳動物に対する化学療法の有効性を改善させる方法である。 この方法では、化学療法剤、および上方制御されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の配列の発現を低減させる、または下方制御されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の配列の発現を増加させる分子を、哺乳動物に同時投与することができる。 本発明の方法で試験される薬剤は、単剤であってもよいし、薬剤の組み合わせであってもよい。 例えば、本発明の方法を使用することで、単一の化学療法剤（例えばＮＡＥ阻害剤）を使用してがんを治療できるかどうか、または２つ以上の薬剤の組み合わせを使用することができるかどうかを決定することができる。 本発明は、患者における薬剤耐性腫瘍を治療するための方法も提供し、該方法は、患者における前記腫瘍の薬剤耐性を低減させるのに有効なある量の耐性配列のアンタゴニストまたはアゴニストを前記対象に投与することを含む。 別の態様では、本発明は、患者における薬剤耐性腫瘍を治療するための薬剤を製造するための、耐性配列の発現の阻害剤、またはその薬剤的に許容できる塩、またはいずれかの物質（ｅｎｔｉｔｙ）を含有する医薬組成物の用途を提供する。 別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。 本明細書に記載のものと類似のまたは等価の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、方法および材料の例を本明細書に記載する。 本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み入れられるものとする。 さらに、材料、方法、および例は例示説明に過ぎず、限定されることを意図するものではない。 一つまたは複数の本発明の実施形態の詳細が添付図面および以下の記述に記載される。 本発明の他の特徴、目的および利点は、発明を実施するための形態、配列表、図面および特許請求の範囲から明らかとなる。 １は−Ｏ−または−ＣＨ ２ −であり；Ｇ ２は−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｇ ３は−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｇ ４は−ＮＨ−、−Ｏ−または共有結合であり；Ｇ ５は置換ヘテロアリールである。 腫瘍細胞の中には、治療的投与計画の阻害効果の影響を受けにくい変異型遺伝子を有するものがある。 あるいは、腫瘍細胞の中には化学療法剤での処置により、腫瘍細胞子孫にその薬剤への耐性を付与する変異および酵素遺伝子変異体を生じるものがある。 これらの変異型遺伝子は、治療介入があったとしても、腫瘍細胞またはそれらの子孫が生存および／または増殖することを可能にし、腫瘍が存続または成長することを可能にする。 本発明は、特定の薬剤に対し低減した感受性を示すＮＡＥ変異体の発生または存在をモニタリングすること、並びに新規の治療レジームにおいて自身を有用とするのに適した特性を有する他の薬剤をスクリーニングおよび／または開発および／または設計すること、に関する。 本発明に従い、発明者らは、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート）に対するＮＡＥの感受性を低減する変異をＵＢＡ３遺伝子に有するＮＡＥ変異体を同定した（図１）。 いくつかの実施形態では、前記変異体は、一つまたは複数の他の薬剤、例えば、限定はされないが、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン）またはトポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばイリノテカン代謝産物、ＳＮ−３８）に対しては感受性である。 ユビキチンおよび他のｕｂｌは、ｕｂｌのＣ末端グリシンとのアシルアデニル酸中間体の形成を触媒する特定の酵素（Ｅ１酵素）により、活性化される（図２参照）。 次に、活性化されたｕｂｌはチオエステル結合中間体の形成を通じてＥ１酵素内の触媒作動的システイン残基に転移する。 Ｅ１−ｕｂｌ中間体およびＥ２が結合することによりチオエステル交換が起こり、ここでｕｂｌはＥ２の活性部位であるシステインに転移される。 ｕｂｌは次に、標的タンパク質内のリジン側鎖のアミノ基とのイソペプチド結合形成を介して、直接的に、またはＥ３リガーゼと共同して、標的タンパク質に結合する。 ＮＥＤＤ８（Ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ８）と名付けられたｕｂｌは、ヘテロ二量体のＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ、またＡＰＰＢＰ１−ＵＢＡ３、ＵＢＥ１Ｃ（ユビキチン活性化酵素Ｅ１Ｃ）としても知られている）により活性化され、２種のＥ２複合体化酵素（ユビキチン担体タンパク質１２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １２：ＵＢＣ１２）およびＵＢＣ１７）のうちの１つに転移し、最終的に、ユビキチン（Ｅ３）リガーゼのカリン−ＲＩＮＧサブタイプにより、カリンタンパク質へのＮＥＤＤ８のライゲーションが起こる。 ＮＥＤＤ化の機能は、多くの細胞周期タンパク質および細胞情報伝達タンパク質（例えばｐ２７およびＩ−κＢ）の代謝回転に関与するカリン型ユビキチンリガーゼの活性化である。 Ｐａｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：１９８５−９７ （２００４）を参照されたい。 ＮＡＥの阻害は、カリン−ＲＩＮＧリガーゼ介在性タンパク質代謝回転を撹乱させ、細胞（例えば、腫瘍細胞または病原性微生物（例えば寄生虫）の細胞）にアポトーシスによる死をもたらし得る。 Ｅ１活性化酵素はｕｂｌ結合経路の第一段階で機能するため；Ｅ１活性化酵素の阻害は、ｕｂｌ修飾のその下流の生物学的事象を特異的に調節する。 ＮＡＥは制御因子および触媒サブユニットから成るヘテロ二量体のＥ１活性化酵素である。 ＮＡＥ１（ＮＡＥα、アミロイドβ前駆物質タンパク質−結合タンパク質１、ＡｐｐＢｐ１、主なアイソフォームはＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３９０５、ＧｅｎＰｅｐｔ ＮＰ＿００３８９６、配列番号３を有する）は調節サブユニットであり、ＵＢＡ３（ユビキチン活性化酵素３、ＮＡＥβ、より長いアイソフォームはＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３９６８、配列番号１、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００３９５９、配列番号２）は触媒サブユニットである。 ＮＡＥはＵＢＣ１２へのＮＥＤＤ８の結合を触媒する。 ＵＢＣ１２は次にＮＥＤＤ８を、タンパク質基質上への転移のために、カリン型ユビキチンリガーゼに転移させる。 ＮＡＥは、まずＮＥＤＤ８およびＡＴＰの結合を触媒してＮＥＤＤ８−ＡＭＰ中間体（＋遊離ピロリン酸）を生成することにより、ＵＢＣ１２へのＮＥＤＤ８の結合を触媒する。 次に、ＮＥＤＤ８がＵＢＡ３（配列番号２）のＣ２３７とチオエステル結合を形成するときに、ＡＭＰが遊離する。 第二のＮＥＤＤ８がＵＢＡ３上のＮＥＤＤ８−ＡＭＰ中間体に混合されると、ＵＢＡ３は次に最初のＮＥＤＤ８をＵＢＣ１２上に転移させる。 本明細書で使用される場合、用語「Ｅ１」、「Ｅ１酵素」、または「Ｅ１活性化酵素」は、標的分子へのユビキチンまたはユビキチン様（まとめて「ｕｂｌ」）結合の活性化または促進に関与する、あるファミリーの関連ＡＴＰ依存性活性化酵素のいずれか１つを指す。 Ｅ１活性化酵素はアデニル化／チオエステル中間体形成を介して機能し、ＳＨ基転移反応を介して適切なｕｂｌを各Ｅ２複合体化酵素に転移させる。 得られる活性化型ｕｂｌ−Ｅ２は標的タンパク質へのｕｂｌの最終的な結合を促進する。 細胞情報伝達、細胞周期、およびタンパク質代謝回転に関与する種々の細胞タンパク質は、Ｅ１活性化酵素（例えば、ＮＡＥ、ＵＡＥ、ＳＡＥ）を介して制御されるｕｂｌ結合のための基質である。 文脈により特に示されない限り、用語「Ｅ１酵素」は、あらゆるＥ１活性化酵素タンパク質を指すことが意図されており、例えば、限定はされないが、ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ（ＡＰＰＢＰ１／Ｕｂａ３））、ユビキチン活性化酵素（ＵＡＥ（Ｕｂａ１））、ｓｕｍｏ活性化酵素（ＳＡＥ（Ａｏｓ１／Ｕｂａ２））、ＵＢＡ４、ＵＢＡ５、ＵＢＡ６、ＵＢＡ７、ＡＴＧ７、またはＩＳＧ１５活性化酵素（Ｕｂｅ１Ｌ）である。 用語「Ｅ１酵素阻害剤」または「Ｅ１酵素の阻害剤」は、本明細書で定義される構造を有する化合物を示すのに使用され、該阻害剤はＥ１酵素と相互作用しその酵素活性を阻害することができる。 Ｅ１酵素活性を阻害するということは、基質ペプチドまたは基質タンパク質へのユビキチン様（ｕｂｌ）結合（例えば、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、ＳＵＭＯ化）を活性化するＥ１酵素の能力を低減させることを意味する。 種々の実施形態において、Ｅ１酵素活性のそのような低減は、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％である。 種々の実施形態において、Ｅ１酵素活性を低減させるのに必要なＥ１酵素阻害剤の濃度は、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満である。 本明細書で使用される場合、用語「ＮＡＥ阻害剤」は、１−置換メチルスルファメートを意味し、例えばＭＬＮ４９２４である。 全体が参照によって本明細書に組み入れられ、そのＰＣＴ出願がＷＯ０７／０９２２１３として出願されたＬａｎｇｓｔｏｎ Ｓ． ｅｔ ａｌ． 、米国特許出願番号１１／７００，６１４は、Ｅ１活性化酵素の効果的な阻害剤である化合物（例えば、ＮＡＥ）を開示している。 これらの化合物は、インビトロおよびインビボでのＥ１活性阻害に有用であり、細胞増殖障害（例えば、がん）、およびＥ１活性と関連する他の障害（例えば、病原性感染および神経変性障害）の治療に有用である。 Ｌａｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． に記載されている化合物の１種は、４−置換（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝シクロペンチル）メチルスルファメートである。 いくつかの実施形態では、そのような阻害は選択的である、すなわち、Ｅ１酵素阻害剤は、別の無関係の生物学的効果を生むのに必要な阻害剤の濃度よりも低い濃度で、一つまたは複数のＥ１酵素（例えば、ＮＡＥ、ＵＡＥ、またはＳＡＥ）の、基質ペプチドまたは基質タンパク質へのｕｂｌ結合を促進する能力を低減させる。 いくつかのそのような実施形態では、Ｅ１酵素阻害剤は、異なるＥ１酵素の酵素活性を低減させるのに必要な阻害剤の濃度よりも低い濃度で、１種のＥ１酵素の活性を低減させる。 他の実施形態では、Ｅ１酵素阻害剤は、別のＥ１酵素、例えばがんに関与する経路の制御に関わるＥ１酵素（例えば、ＮＡＥおよびＵＡＥ）の酵素活性も低減させる。 ＭＬＮ４９２４（（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−４−｛４−［（１Ｓ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イルアミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−ヒドロキシシクロペンチル）メチルスルファメート）は、カリン−ＲＩＮＧリガーゼが介在するタンパク質代謝回転を混乱させることで、細胞タンパク質の恒常性を乱すことによる、ヒト腫瘍細胞におけるアポトーシス死をもたらす（Ｓｏｕｃｙ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７３２−７３６）。 細胞および腫瘍の異種移植片試験におけるＭＬＮ４９２４の評価は、２つの異なる作用機序を明らかにした。 １つ目は、ＭＬＮ４９２４が介在するＣＲＬ１ ＳＫＰ２およびＣＲＬ４ ＤＤＢ１基質Ｃｄｔ−１の調節不全による、ＤＮＡ再複製、ＤＮＡ損傷および細胞死の誘導である（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。 ｐ５３の状態はＤＮＡ再複製の誘導に影響を与えないが、適切な遺伝的背景に基づいて、細胞にアポトーシスまたは老化をより起こし易くさせ得ることが示されている（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ａおよびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ｂ）。 ２つ目の機序は、主に、ＣＲＬ１ βＴＲＣＰが介在するリン酸化ＩκＢαの代謝回転の調節不全による、ＮＦ−κＢ依存性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫におけるＮＦ−κＢ経路活性の阻害である（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 さらに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の前臨床モデルは、Ｃｄｔ−１調節不全、ＮＦ−κＢ阻害および活性酸素種の誘導に関連する機構によって、細胞株および初代患者芽細胞の両方においてＭＬＮ４９２４阻害に対し感受性が高い（Ｓｗｏｒｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 ＭＬＮ４９２４はＮＡＥの機構に基づいた阻害剤であり、酵素により触媒される、共有結合性のＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体を生成する（Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ３７：１０２−１１１）。 ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体は、ＮＡＥ反応サイクルにおける第一中間体であるＮＥＤＤ８アデニル酸塩と類似しているが、続く酵素内反応においてさらに利用することができない。 ＮＡＥ活性部位内でのＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体の安定性により酵素活性が遮断されることで、ＭＬＮ４９２４によるＮＥＤＤ８経路のタンパク質阻害が引き起こされる。 ＭＬＮ４９２４による選択圧後の、がんの細胞株および異種移植モデルにおけるＮＡＥのＮＡＥβ（ＵＢＡ３）サブユニット内の変異の発生が、本明細書に記載される。 いくつかの実施形態では、変異はヘテロ接合性である。 他の実施形態では、変異は大きく分けて、ＵＢＡ３（ＮＡＥβ）のＡＴＰ結合領域またはＮＥＤＤ８結合領域に影響を与える２つの種類に分類することができる。 生化学的研究により、両変異が、ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体の形成速度の低減、および該付加体のより速い解離の促進等による機構を介して、化合物の作用強度を低減させ得ることが示されている。 培養細胞および異種移植片における証拠により、阻害後の、経路阻害の低減、ＵＢＡ３（ＮＡＥβ）結合型ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体の減少、および経路活性のより速い回復が示されている。 フレームワークは、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート）、変異酵素に対する活性を有するＭＬＮ４９２４類似体等のＥ１酵素阻害剤を設計するために与えられる。 フレームワークは、Ｅ１酵素阻害剤（例えばＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート、ＭＬＮ４９２４））の処置に最初は応答するが、最終的には再発し、ＮＡＥβ内の変異による耐性を克服してしまう、患者を再処置する可能性を与える。 本発明の一態様は、ＵＢＡ３遺伝子内に少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、単離されたＮＡＥ変異体に関する。 ヌクレオチド変異はさらに、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）をＵＢＡ３タンパク質内にもたらし得る。 ヌクレオチド変異は、ＮＡＥ阻害剤（例えば１−置換メチルスルファメート）に対する感受性の低減をもたらし得る。 ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基１７１におけるアラニンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このアラニンはトレオニン（Ａ１７１Ｔ）に変異され得る。 別の実施形態では、このアラニンはアスパラギン酸（Ａ１７１Ｄ）に変異され得る。 さらに別の実施形態では、このアラニンはバリン（Ａ１７１Ｖ）に変異され得る。 他の実施形態では、このアラニンはグルタミン酸（Ａ１７１Ｅまたはセリン（Ａ１７１Ｓ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２０１におけるグリシンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。一実施形態では、このグリシンはバリン（Ｇ２０１Ｖ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２０４におけるグルタミン酸のアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。一実施形態では、このグルタミン酸はリジン（Ｅ２０４Ｋ）に変異され得る。別の実施形態では、このグルタミン酸はグリシン（Ｅ２０４Ｇ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２０５におけるグリシンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。一実施形態では、このグリシンはシステイン（Ｇ２０５Ｃ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２０９におけるアスパラギンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。一実施形態では、このアスパラギンはリジン（Ｎ２０９Ｋ）に変異され得る。別の実施形態では、このアスパラギンはアスパラギン酸（Ｎ２０９Ｄ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２１１におけるアルギニンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。一実施形態では、このアルギニンはグルタミン（Ｒ２１１Ｑ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２２８におけるチロシンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。一実施形態では、このチロシンはヒスチジン（Ｙ２２８Ｈ）に変異され得る。別の実施形態では、このチロシンはシステイン（Ｙ２２８Ｃ）に変異され得る。ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２２９におけるプロリンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このプロリンはグルタミン（Ｐ２２９Ｑ）に変異され得る。 ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基３０５におけるバリンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このバリンはアラニン（Ｖ３０５Ａ）に変異され得る。 ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基３１１におけるプロリンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このプロリンはセリン（Ｐ３１１Ｓ）に変異され得る。 一実施形態では、このプロリンはトレオニン（Ｐ３１１Ｔ）に変異され得る。 ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基３１４におけるアラニンのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このアラニンはプロリン（Ａ３１４Ｐ）に変異され得る。 ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基３２４におけるシステインのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このシステインはチロシン（Ｃ３２４Ｙ）に変異され得る。 ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２のＵＢＡ３タンパク質の残基２４９におけるシステインのアミノ酸置換）をもたらす、少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このシステインはチロシン（Ｃ２４９Ｙ）に変異され得る。 本発明のＵＢＡ３変異体は、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート）に対し、低減した感受性を示し得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の５３１〜５３３におけるＧＣＣコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得、その結果アラニンをコードしていない。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド５３１、５３２および／または５３３を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド５３１はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド５３１のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸１７１を、野生型ＵＢＡ３におけるアラニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではトレオニンにさせ得る。 ヌクレオチド５３１のグアニンをチミンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸１７１を、野生型ＵＢＡ３におけるアラニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではセリンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド５３２はグアニン、アデニンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド５３２のシトシンをアデニンに、ヌクレオチド５３３のシトシンをアデニンまたはグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸１７１を、野生型ＵＢＡ３におけるアラニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではグルタミン酸にさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の６２１〜６２３におけるＧＧＧコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド６２１、６２２および／または６２３を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド６２１はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６２１のグアニンをチミンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０１を、野生型ＵＢＡ３におけるグリシンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではバリンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６２２はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６２２のグアニンをシトシンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０１を、野生型ＵＢＡ３におけるグリシンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアラニンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の６３０〜６３２におけるＧＡＡコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド６３０、６３１および／または６３２を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド６３０はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６３０のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０４を、野生型ＵＢＡ３におけるグルタミン酸の代わりに、ＵＢＡ３変異体ではリジンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６３１はグアニン、シトシンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド６３１のアデニンをグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０４を、野生型ＵＢＡ３におけるグルタミン酸の代わりに、ＵＢＡ３変異体ではグリシンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６３２はチミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６３２のアデニンをシトシンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０４を、野生型ＵＢＡ３におけるグルタミン酸の代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアスパラギン酸にさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の６３３〜６３５におけるＧＧＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド６３３、６３４および／または６３５を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド６３３はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６３３のグアニンをチミンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０５を、野生型ＵＢＡ３におけるグリシンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではシステインにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６３４はアデニン、シトシンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド６３４のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０４を、野生型ＵＢＡ３におけるグリシンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアスパラギン酸にさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の６４５〜６４７におけるＡＡＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド６４５、６４６および／または６４７を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド６４５はグアニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６４５のアデニンをグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０９を、野生型ＵＢＡ３におけるアスパラギンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアスパラギン酸にさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６４６はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６４６のグアニンをシトシンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０９を、野生型ＵＢＡ３におけるアスパラギンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアラニンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６４７はアデニンまたはグアニンであり得る。 ヌクレオチド６４７のチミンをアデニンまたはグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２０９を、野生型ＵＢＡ３におけるアスパラギンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではリジンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の６５１〜６５３におけるＣＧＧコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド６５１、６５２および／または６５３を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド６５１はグアニンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド６５１のシトシンをグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２１１を、野生型ＵＢＡ３におけるアルギニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではグリシンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド６５２はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド６５２のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２１１を、野生型ＵＢＡ３におけるアルギニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではグルタミンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の７０２〜７０４におけるＴＡＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド７０２、７０３および／または７０４を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド７０２はグアニン、アデニンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド７０２のアデニンをシトシンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２２８を、野生型ＵＢＡ３におけるチロシンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではヒスチジンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド７０３はグアニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド７０３のアデニンをグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２２８を、野生型ＵＢＡ３におけるチロシンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではシステインにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の７０５〜７０７におけるＣＣＡコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド７０５、７０６および／または７０７を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド７０５はアデニン、グアニンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド７０５のシトシンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２２９を、野生型ＵＢＡ３におけるプロリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではトレオニンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド７０６はアデニン、チミンまたはグアニンであり得る。 ヌクレオチド７０６のシトシンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２２９を、野生型ＵＢＡ３におけるプロリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではグルタミンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の９３３〜９３５におけるＧＴＡコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド９３３、９３４および／または９３５を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド９３３はアデニン、シトシンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド９３３のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３０５を、野生型ＵＢＡ３におけるバリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではイソロイシンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド９３４はアデニン、グアニンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド９３４のチミンをシトシンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３０５を、野生型ＵＢＡ３におけるバリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアラニンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の９５１〜９５３におけるＣＣＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド９５１、９５２および／または９５３を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド９５１はアデニン、グアニンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド９５１のシトシンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３１１を、野生型ＵＢＡ３におけるプロリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではトレオニンにさせ得る。 ヌクレオチド９５１のシトシンをチミンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３１１を、野生型ＵＢＡ３におけるプロリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではセリンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド９５２はアデニン、チミンまたはグアニンであり得る。 ヌクレオチド９５２のシトシンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３１１を、野生型ＵＢＡ３におけるプロリンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではグルタミンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の９６０〜９６２におけるＧＣＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド９６０、９６１、および／または９６２を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド９６０はアデニン、シトシンまたはチミンであり得る。 ヌクレオチド９６０のグアニンをシトシンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３１４を、野生型ＵＢＡ３におけるアラニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではプロリンにさせ得る。 ヌクレオチド９６１のシトシンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３１４を、野生型ＵＢＡ３におけるアラニンの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではアスパラギン酸にさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド９６２は、アデニン、シトシンまたはグアニンであり得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の７６５〜７６７におけるＴＧＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド７６５、７６６および／または７６７を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド７６５は、グアニン、アデニンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド７６５のチミンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２４９を、野生型ＵＢＡ３におけるシステインの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではセリンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド７６６はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド７６６のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２４９を、野生型ＵＢＡ３におけるシステインの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではチロシンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド７６７はグアニンであり得る。 ヌクレオチド７６７のチミンをグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸２４９を、野生型ＵＢＡ３におけるシステインの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではトリプトファンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の９８９〜９９１におけるＴＧＴコドンにおいて変異したヌクレオチドを含み得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１の変異したヌクレオチド９８９、９９０および／または９９１を含み得る。 一実施形態では、ヌクレオチド９８９はグアニン、アデニンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド９８９のチミンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３２４を、野生型ＵＢＡ３におけるシステインの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではセリンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド９９０はアデニン、チミンまたはシトシンであり得る。 ヌクレオチド９９０のグアニンをアデニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３２４を、野生型ＵＢＡ３におけるシステインの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではチロシンにさせ得る。 別の実施形態では、ヌクレオチド９９１はグアニンであり得る。 ヌクレオチド９９１のチミンをグアニンに変化させる変異は、配列番号２のアミノ酸３２４を、野生型ＵＢＡ３におけるシステインの代わりに、ＵＢＡ３変異体ではトリプトファンにさせ得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、アミノ酸変化をもたらさない部位に変異した遺伝子型パターンを含み得る。 そのような変異は、そのタンパク質構造においては「サイレント」であるが、ヌクレオチド構造に対しては効果を有し得る。 一実施形態では、ＵＢＡ３変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換）をもたらさない少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 ヌクレオチド９６２のチミンをシトシンに変化させるＵＢＡ３変異体内の変異は、配列番号２のアミノ酸３１４をアラニンから変化させない。 本実施形態では、変異はＵＢＡ３タンパク質の発現変化をもたらし得るか、または、ＮＡＥヘテロ二量体の別の部分（例えば、ＮＡＥ１またはＵＢＡ３内の別のアミノ酸）における変異を伴い得る。 ＵＢＡ３変異体遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、ＮＡＥの他の部位（例えば、Ｅ１酵素阻害剤（例えばＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート（例えば、ＭＬＮ４９２４）））に対する耐性を付与しない部位）に、変異した遺伝子型パターンをさらに含み得る。 そのさらなる変異はサイレントであり得るか、またはＮＡＥヘテロ二量体の別の部分（例えば、ＮＡＥ１）における変異を伴い得る。 従って、ＵＢＡ３変異体核酸内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１のヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される。 一実施形態では、ＵＢＡ３変異体核酸内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１のヌクレオチド７６５、７６６および／または７６７に変化を含まない。 本実施形態では、ＵＢＡ３変異体核酸内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号１のヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される。 ＵＢＡ３変異体核酸内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号２のアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択される残基にアミノ酸変化をもたらし得る。 一実施形態では、ＵＢＡ３変異体核酸内の少なくとも１つのヌクレオチド変異は、配列番号２のアミノ酸２４９に変化を含まない。 本実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変化は、配列番号２の残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、３０５、３１１、３１４および３２４における変化からなる群から選択される。 さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される配列番号１における２つ以上のヌクレオチド変異を含むことで、ＵＢＡ３タンパク質内に２つ以上のアミノ酸置換を引き起こしている、変異ＵＢＡ３変異体にまで及ぶ。 例えば、配列番号２の残基１７１における変化は、耐性に寄与してもしなくてもよい、さらなる残基における変化を伴い得る。 一実施形態では、ＵＢＡ３内の変化はヘテロ接合性である、すなわち、細胞内のＵＢＡ３対立遺伝子にのみ存在する。 別の実施形態では、ＵＢＡ３内の変化はホモ接合性である。 他の実施形態では、変化の組み合わせは、配列番号２の残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４における変化からなる群から選択される、あらゆる２以上のアミノ酸であり得る。 あるいは、変化の組み合わせは、細胞内のＵＢＡ３の一方の対立遺伝子上における少なくとも１つの変化、および細胞内のＵＢＡ３のもう一方の対立遺伝子における別の変化を含み得る。 そのような細胞では、各変異体はヘテロ接合性であるが、野生型ＵＢＡ３は細胞内に存在しない。 ＵＢＡ３は門および種の間で高度に保存されている。 図３のアラインメントは、配列番号２のアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０９、２２８、２２９、３０５および３２４が、哺乳動物（ヒト、マーモセット、イヌ、ラット、マウス、雌ウシ、ブタ）、鳥類および魚の間で保存されていることを示している（全体として、配列番号２と８５％を下回らず同一であった）。 残基２０１、２０４、２０５および３１１は上記に列挙された種の間でのみ保存されているだけではなく、無脊椎動物、カビおよび酵母においても保存されている（全体として、配列番号２と４０％を下回らず同一であった）。 図２の１種の酵母種だけが、配列番号２のＡ１７１に対応する位置にアラニン以外の残基、Ｒ２１１に対応する位置にアルギニン以外の残基、Ｃ２４９に対応する位置にシステイン以外の残基、またはＡ３１４に対応する位置にアラニン以外の残基を有する。 Ｎ２０９のような対応する残基にアスパラギン以外の残基を有する配列の中で、保存的置換のみが存在する（グルタミン、カビおよび２種の酵母種；ヒスチジン、３番目の酵母種）。 無脊椎動物におけるＹ２２８に対応する残基でチロシンの保存的置換が存在し、カビのみがＣ３２４に対応する残基でシステインの置換を示す。 従って、本明細書に記載のヒトＵＢＡ３変異体が介在する耐性は、複数の門および種、例えば、脊椎動物、例えば、哺乳動物、および無脊椎動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト、マーモセット）、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ）、（魚）（カエル）（鳥類 無脊椎動物（蚊、シラミ）（カビ）（酵母）に対して、考慮され得る。それらの酵素を標的とする薬剤への耐性を克服する化学療法剤等の、阻害剤に関するアッセイは、図３中の酵素の各残基における変異体を使用することができる。図３中の家畜への用途は、疾患（例えば、がん）の治療に関連し得る。図３中のげっ歯類および無脊椎動物の酵素を標的とする薬剤への耐性を克服する阻害剤に関するアッセイは、有害生物駆除製品を開発するのに使用することができる。 １７１位のアラニンは、さらなる酵素または二量体酵素のサブユニット、例えば、Ｅ１活性化酵素、例えば、Ｓｕｍｏ活性化酵素（ＳＡＥ２）（配列番号２７）、ＵＢＡ１（配列番号２８（酵母）、配列番号２９（ヒト））、ＭＯＣＳ３（ＵＢＡ４、配列番号３０）、ＵＢＡ５（配列番号３１）、ＵＢＡ６（配列番号３２）、ＵＢＡ７（配列番号３３）、およびＡＴＧ７（配列番号３４）、並びに、Ｅ１酵素に構造的および機構的に関連している、すなわち、活性部位システインを有し、それらの活性化の過程で基質とのチオエステル結合を形成する他の酵素（例えば、細菌酵素のｍｏｅｂ（配列番号３５）およびｔｈｉｆ（配列番号３６））において保存されている（図４参照）。 ヒトＵＢＡ３のアラニン１７１は、ＳＡＥ２（配列番号２７）における残基１２１のアラニン、酵母ＵＢＡ１（配列番号２８）における残基５４８のアラニン、ヒトＵＢＡ１（配列番号２９）における残基５８０のアラニン、ＭＯＣＳ３（ＵＢＡ４、配列番号３０）における残基１８５のトレオニン、ＵＢＡ５（配列番号３１）における残基１８７のアラニン、ＵＢＡ６（配列番号３２）における残基５７３のアラニン、ＵＢＡ７（配列番号３３）における残基５４４のアラニン、ＡＴＧ７（配列番号３４）における残基４８０のセリン、ｍｏｅｂ（配列番号３５）における残基１３４のバリンおよびｔｈｉｆ（配列番号３６）における残基１３１のトレオニンに対応している。 それらの酵素を標的とする薬剤への耐性を克服する化学療法剤等の阻害剤に関するアッセイは、配列番号２のＡ１７１に対応し、配列番号２７では残基Ａ１２１、配列番号２８ではＡ５４８、配列番号２９ではＡ５８０、配列番号３０ではＴ１８５、配列番号３１ではＡ１８７、配列番号３２ではＡ５７３、配列番号３３ではＡ５４４、配列番号３４ではＳ４８０、配列番号３５ではＶ１３４、および配列番号３６ではＴ１３１である、残基における変異体を使用することができる。 それらの酵素を標的とする薬剤への耐性を克服する抗生物質等の阻害剤に関するアッセイは、配列番号３５においては残基Ｖ１３４であり配列番号３６においてはＴ１３１である、残基における変異体を使用することができる。 本発明の一態様は、ＵＢＡ１遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む単離ＵＢＡ１変異体に関する。 ヌクレオチド変異はさらに、ＵＢＡ１タンパク質に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）をもたらし得る。 ＵＢＡ１遺伝子内のヌクレオチド変異は、Ｅ１酵素阻害剤（例えばＮＡＥ阻害剤（例えば１−置換メチルスルファメート））に対する感受性の低減に繋がり得る。 ＵＢＡ１変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号２９のＵＢＡ１タンパク質の残基５８０におけるアラニンのアミノ酸置換）をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このアラニンはトレオニンに変異され得る（Ａ５８０Ｔ）。 別の実施形態では、このアラニンはアスパラギン酸に変異され得る（Ａ５８０Ｄ）。 本発明の別の態様は、ＵＢＡ６遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む単離ＵＢＡ６変異体に関する。 ヌクレオチド変異はさらに、ＵＢＡ６タンパク質に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）をもたらし得る。 ＵＢＡ６遺伝子内のヌクレオチド変異は、Ｅ１酵素阻害剤（例えばＮＡＥ阻害剤（例えば１−置換メチルスルファメート））に対する感受性の低減に繋がり得る。 ＵＢＡ６変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、配列番号３２のＵＢＡ６タンパク質の残基５７３におけるアラニンのアミノ酸置換）をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含み得る。 一実施形態では、このアラニンはトレオニンに変異され得る（Ａ５７３Ｔ）。 別の実施形態では、このアラニンはアスパラギン酸に変異され得る（Ａ５７３Ｄ）。 ヒトＵＢＡ３は、配列番号１のオープンリーディングフレーム（およそ塩基２１〜１４１２）の翻訳から生じ、以下の領域または他の構造的特徴を含有し得る（ＰＦＡＭ識別子、ＰＳ接頭辞およびＰＦ接頭辞ドメイン識別番号に関する一般的な情報については、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ ２８：４０５−４２０；Ｐｆａｍ：Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎｕｃ． Ａｃ． Ｒｅｓ． ３８：Ｄ２１１−２２２、およびウェルカムトラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（イギリス、ケンブリッジ、ヒンクストン）により維持されているウェブサイト；ＰｒｏＳｉｔｅ：Ｓｉｇｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎｕｃ． Ａｃ． Ｒｅｓ． ３８：１６１−１６６、およびスイスバイオインフォマティクス研究所（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、スイス、ローザンヌ）により維持されているＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバーのウェブサイトを参照）：配列番号２のおよそアミノ酸残基６９〜２１１に位置するＴｈｉＦドメイン（ＰＦＡＭ受入番号ＰＦ００８９９）；配列番号２のおよそアミノ酸残基２１６〜２６２に位置するＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン（ＰＦＡＭ受入番号ＰＦ１０５８５）；配列番号２のおよそアミノ酸残基２７０〜３３４に位置するＵＢＡＣＴドメイン（ＰＦＡＭ受入番号ＰＦ０２１３４）；配列番号２のおよそアミノ酸残基３７４〜４６２に位置するＥ２＿結合ドメイン（ＰＦＡＭ受入番号ＰＦ０８８２５）；配列番号２のおよそアミノ酸残基２３５〜２４３に位置するＰｒｏＳｉｔｅユビキチン活性化酵素特徴的配列（ＰｒｏｓｉｔｅＰＤＯＣ００４６３）。 触媒作用的システイン残基（例えば、ＮＥＤＤ８結合用）は、配列番号２の残基２３７であり得る。 ＡＴＰ結合ポケット、例えば、配列番号２のおよそアミノ酸残基１４８〜およそ１７１；ＮＥＤＤ８結合ポケット、配列番号２のおよそアミノ酸残基２０１〜およそ２２９；触媒作用的Ｃｙｓドメイン、配列番号２のおよそ残基２２９〜３０９。 一実施形態では、ＵＢＡ３変異体内の少なくとも１つの変異はＡＴＰ結合ポケットに存在し得る。 従って、このＡＴＰ結合ポケット変異は、分子（例えば、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート（例えば、ＭＬＮ４９２４）））、またはヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰγＳ、デオキシ−ＡＴＰ）、ＡＭＰ−ＰＮＰ、ＡＭＰ−アミデートおよび／または分子（例えば、ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰγＳ、デオキシ−ＡＴＰ））の加水分解物の結合性に影響を与え得る。 あるいは、ＡＴＰ結合ポケット変異は、あるＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート（例えば、ＭＬＮ４９２４））の結合性に影響を与え得るが、野生型ＵＢＡ３と比較して、変異体に対するＩＣ５０の間に２、３もしくは４倍またはそれ未満の差異を有する別のＮＡＥ阻害剤（例えば、アデノシンスルファメート）または化合物（例えば、１−置換メチルスルファメート）の結合には影響を与えない。 いくつかの実施形態では、ＵＢＡ３変異体は、表１３中のいくつかの化合物に対して耐性であり得るが、表１３中の他の化合物に対しては耐性ではない。 別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体内の少なくとも１つの変異は、ＮＥＤＤ８結合ポケット内に存在し得る。 従って、このＮＥＤＤ８結合ポケット変異は、ｕｂｌ（例えば、ＮＥＤＤ８）のＵＢＡ３への結合性、および／もしくはＮＥＤＤ８のＵＢＡ３とのチオエステル形成、および／もしくはＮＥＤＤ８のアデニル化、および／もしくは１−置換メチルスルファメート（例えば、アデノシンスルファメートまたはＭＬＮ４９２４）のＮＥＤＤ８とのチオエステル形成に影響を与え、並びに／またはＮＥＤＤ８−ＮＡＥ阻害剤（例えば、ＮＥＤＤ８−１−置換メチルスルファメート付加体）の結合性に影響を与え得る。 別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体内の少なくとも１つの変異は、ＮＡＥ１に結合するための領域内に存在し得る。 従って、この変異は、ヘテロ二量体形成およびその後の酵素活性に干渉し得る。 本明細書で使用される場合、「ＴｈｉＦドメイン」という用語には、長さが約１３５〜１４５アミノ酸残基であり、配列番号４のＴｈｉＦドメインコンセンサス配列に対する配列の有意なアラインメントを有する、アミノ酸配列が含まれる。 ＴｈｉＦドメインはＵＢＡ３へのＡＴＰ結合を介在し得る。 ＴｈｉＦドメイン（ＨＭＭ）は、ＰＦＡＭ受入番号ＰＦ００８９９を割り当てられており、配列番号２のおよそアミノ酸残基６９〜およそ２１１に存在し得る。 本明細書で使用される場合、「ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン」という用語には、長さが約４０〜５０アミノ酸残基であり、配列番号５のＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン（ＨＭＭ）コンセンサス配列に対する配列の有意なアラインメントを有する、アミノ酸配列が含まれる。 ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメインは、ＮＥＤＤ８結合およびチオエステル結合を媒介し得、配列番号２のおよそアミノ酸残基２３５〜２４３にユビキチン活性化酵素特徴的配列（ＰｒｏｓｉｔｅＰＤＯＣ００４６３）を有する。 この特徴的配列は、配列番号２のおよそアミノ酸残基２３７に活性部位システインを含む。 ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメインには、Ｐｒｏｓｉｔｅユビキチン活性化酵素特徴的配列ＰＳ００８６５（Ｐ−［ＬＩＶＭＧ］−Ｃ−Ｔ−［ＬＩＶＭ］−［ＫＲＨＡ］−ｘ−［ＦＴＮＭ］−Ｐ、配列番号６）、またはそれに相同な配列が含まれ得る。 上記特徴的配列、および本明細書に記載の他のモチーフまたは配列において、アミノ酸には標準的なＩＵＰＡＣ１文字表記が使用される。 パターン内の各要素はダッシュ（−）によって隔てられ；角括弧（［ ］）はその位置で許容される特定の残基を示し；ｘはいかなる残基もその位置で許容されることを示している。 ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン（ＨＭＭ）は、ＰＦＡＭ受入番号ＰＦ１０５８５を割り振られており、配列番号２のおよそアミノ酸残基２１６〜およそ２６０に存在し得る。 三次元空間において、ＵＢＡ３ ＡＴＰ結合部位は、配列番号２の残基およそ９９〜１２４およびおよそ１４６〜１７４を含み得る。 三次元空間において、ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８Ｃ末端（残基７１〜７６）結合部位は、配列番号２の残基約７８〜８１、１６５〜１７２、２０１〜２２９および３１０〜３４４を含み得る。 本明細書で使用される場合、「ＵＢＡＣＴドメイン」という用語には、長さが約６０〜７０アミノ酸残基であり、配列番号７のＵＢＡＣＴ ドメイン（ＨＭＭ）コンセンサス配列に対する配列の有意なアラインメントを有する、アミノ酸配列が含まれる。 ＵＢＡＣＴドメインはＮＥＤＤ８結合を介在し得る。 ＵＢＡＣＴドメイン（ＨＭＭ）はＰＦＡＭ受入番号ＰＦ０２１３４を割り振られており、配列番号２のおよそアミノ酸残基２７０〜およそ３３４に存在し得る。 本明細書で使用される場合、「Ｅ２＿結合ドメイン」または「Ｅ２結合ドメイン」という用語には、長さが約８０〜９５アミノ酸残基であり、配列番号８のＥ２＿結合ドメインコンセンサス配列に対する配列の有意なアラインメントを有する、アミノ酸配列が含まれる。 Ｅ２＿結合ドメインは、ＵＢＡ３のＥ２酵素（例えば、ＵＢＣ１２またはＵＢＥ２Ｆ）との結合を介在し得る。 ＵＢＡ３（例えば、ヒトＵＢＡ３ポリペプチド）のＥ２＿結合ドメインは、配列番号２のおよそＣ末端に位置し得る。 Ｅ２＿結合ドメイン（ＨＭＭ）はＰＦＡＭ受入番号ＰＦ０８８２５が割り振られており、配列番号２のおよそアミノ酸残基３７４〜およそ４６２に存在し得る。 ＵＢＡ３変異体タンパク質は、以下のＵＢＡ３活性のうちの一つまたは複数を有し得る：（１）ヌクレオチド（例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン５'−二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン５'−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰγＳ）、デオキシ−ＡＴＰ）、アデノシン５′−（β，γ−イミド）三リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、ＡＭＰ−アミデート、１−置換メチルスルファメート（例えば、ＭＬＮ４９２４）と結合する能力；（２）ヌクレオチド（例えばＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰγＳ、デオキシ−ＡＴＰ）を加水分解する能力；（３）ピロリン酸（ＰＰｉ）と結合する能力、（４）ＮＥＤＤ８またはＮＥＤＤ８−アデニレート類似体（例えば、アデノシル−ホスホ−ＮＥＤＤ８（ＡＰＮ））と結合する能力；（５）ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力；（６）ＮＥＤＤ８との共有結合性チオエステル結合を形成する能力；（７）Ｅ２酵素（例えば、ＵＢＣ１２またはＵＢＥ２Ｆ）と結合する能力；（８）ＮＥＤＤ８のＥ２（例えば、ＵＢＣ１２）へのＳＨ基転移を触媒する能力；（９）ＮＡＥ１と結合する能力；（１０）ＮＡＥ阻害剤−ＮＥＤＤ８付加体と強く結合する能力。 あるいは、ＵＢＡ３変異体タンパク質は、ＵＢＡ３活性のうちの一つまたは複数を実行する能力がない、またはその能力が低減している可能性がある。 一実施形態では、ＵＢＡ３変異体タンパク質は、ＭＬＮ４９２４−ＮＥＤＤ８付加体と結合するおよび／またはそれを形成する能力が、野生型ＵＢＡ３の該付加体と結合する能力と比較して、低減している可能性がある。 この変異型機能を有するＮＡＥ変異体の例は、ＡＴＰ結合ポケット（例えば、配列番号２のアラニン１７１において、もしくはその付近で異なる）および／またはＮＥＤＤ８結合間隙（例えば、配列番号２のグリシン２０１、グルタミン酸２０４、アスパラギン２０９、および／またはシステイン３２４において、もしくはその付近で異なる）に変異を有する変異体である。 別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体タンパク質（例えば、チロシン２２８において、もしくはその付近で異なる）は、ＮＥＤＤ８のＣ末端をアデニル化ドメイン内に固定する能力が低減されており、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力が低減している可能性がある。 別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体タンパク質（例えば、配列番号２のシステイン２４９において、もしくはその付近で異なる）は、ＮＡＥ１とのヘテロ二量体を形成する能力が低減している可能性がある。 ＵＢＡ３変異体について、「減少した」または「低減した」感受性への言及は、Ｅ１阻害剤に対する完全なまたは相当な耐性、および該阻害剤に対する野生型の感受性と比較しての部分的な耐性を含み、包含する。 ＵＢＡ３変異体がＵＢＡ３活性を実行する能力における低減のレベルは、野生型ＵＢＡ３と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３５倍、５０倍、１００倍またはそれ以上であり得る。 ＮＡＥ阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４）の活性、例えば、ＩＣ５０（反応速度を５０％低減させるのに必要な阻害剤の濃度）は、野生型ＵＢＡ３を含むＥ１酵素（例えば、ＮＡＥ）と比較して、ＵＢＡ３変異体を含むＥ１酵素（例えば、ＮＡＥ）に対して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３５倍、５０倍、１００倍またはそれ以上低減され得る。 別の実施形態では、野生型ＵＢＡ３のみを含む（例えば、ホモ接合である）細胞（例えば腫瘍細胞）を殺傷するのと比較して、ＵＢＡ３変異体を含む細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺傷するには、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３５倍、５０倍、１００倍またはそれ以上のＮＡＥ阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４）が必要となり得る。 ＵＢＡ３活性は、間接的な活性、例えば、ＮＥＤＤ化タンパク質のカリン環リガーゼとの相互作用により媒介される細胞シグナル伝達活性でもあり得る。 例えば、ＵＢＡ３変異体は、以下の間接活性のうちの一つまたは複数を有し得る：１）カリン環リガーゼの基質の代謝回転を媒介する能力；２）タンパク質の恒常性に関与する能力；および３）腫瘍の細胞生存を支援する能力。 間接的なＵＢＡ３活性は、Ｅ１酵素阻害剤（例えば、ＮＡＥ阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４））の存在下で阻害または低減され得る。 ＵＢＡ３変異体は、Ｅ１酵素阻害剤（例えば、ＮＡＥ阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４））の存在下で間接的なＵＢＡ３活性を有し得る。 「約」という用語は、およそ、辺り、大まかに、または前後を意味するように、本明細書では使用される。 用語「約」は、数値範囲と共に使用される場合、境界を記載の数値の上下に拡張することにより、その範囲を修飾する。 一般的に、用語「約」は、数値を記載値の上下に１０％だけ変動させて修飾するために、本明細書では使用される。 本明細書で提供される全タンパク質の受入番号は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（メリーランド州ベテスダ）により管理されるＥｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース、またはＵｎｉｐｒｏｔコンソーシアム（欧州バイオインフォマティクス研究所（イギリス、ケンブリッジ、ヒンクストン）、スイスバイオインフォマティクス研究所（スイス、ジュネーブ）およびタンパク質情報リソース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（ワシントンＤＣ））により管理されるＵｎｉＰｒｏｔデータベースを参照する。 「一つまたは複数の変異」または「少なくとも１つの変異」という表現は、本明細書で使用される場合、安定性およびコドンの実行可能性（ｃｏｄｏｎ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）の条件が満たされているという条件で、本明細書に記載の変異型ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数に応じて可能な１から最大数までの変異と等しいある数の変異を指す。 特に明記しない限り、核酸配列またはアミノ酸配列中の所望により変異した位置は、配列のそれぞれの変異可能な位置において変異を有していてもよく、ＵＢＡ３変異体は同じであっても異なっていてもよい。 本明細書で使用される場合、用語「独立して選択される」は、同じまたは異なる値が、単一の変異体における所与の変数の複数の例に選択されてもよいことを意味する。 「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニーリングするプロセスである。 ハイブリダイゼーションプロセスは、完全に溶液中で（すなわち両方の相補的核酸は溶液中に存在する）起こり得る。 そのようなプロセスに依る分子生物学的手段としては、ＰＣＲ、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定が挙げられる。 ハイブリダイゼーションプロセスは、磁気ビーズ、セファロースビーズまたはあらゆる他の樹脂もしくは一種のビーズ等のマトリックスに固定化した、相補的核酸の一方と起こすこともできる。 そのようなプロセスに依る分子生物学的手段としては、ポリ（Ａ ＋ ）ｍＲＮＡの単離が挙げられる。 ハイブリダイゼーションプロセスは、さらに、ニトロセルロースもしくはナイロン膜、スライドガラスもしくは石英ガラス（石英）スライド（後者は核酸アレイもしくはマイクロアレイとして、または核酸チップとして知られている）、金膜、ポリピロールフィルム、光ファイバー、または例えばポリアクリルアミドゲル中もしくはマイクロプレートのウェル中等の固相に固定化した相補的核酸の一方と起こすこともできる。 そのようなプロセスに依る分子生物学的手段としては、ＲＮＡおよびＤＮＡゲルブロット解析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、リバースハイブリダイゼーション並びにマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。 ハイブリダイゼーションを起こすことを目的として、核酸分子は通常、二重鎖を２本の単鎖に融解させるために、および／または一本鎖核酸からヘアピンもしくは「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）」プローブ（単一の二重標識）もしくは他の二次構造を除去するために、熱的に、化学的に（例えばＮａＯＨにより）または電気化学的に変性される。 本明細書で使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中度のストリンジェンシー、高度のストリンジェンシー、または非常に高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するものである。 ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． ， ６．３．１−６．３．６（参照により組み入れられる）にて見出すことができる。 水系および非水系の方法がその参考文献中に記載されており、どちらも使用することができる。 本明細書で示される具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続く、少なくとも５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいての２回の洗浄（洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件においては、５５℃まで上昇させることができる）における、低度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；２）約４５℃の６×ＳＳＣ、続く６０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいての一回または複数回の洗浄における、中度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；３）約４５℃の６×ＳＳＣ、続く６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいての一回または複数回の洗浄における、高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；並びに、４）６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続く６５℃の０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいての一回または複数回の洗浄における、非常に高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件。 いくつかの実施形態では、非常に高度のストリンジェンシー条件が特に断りがない限りは使用される。 本明細書で使用される場合、「自然発生的な」核酸分子とは、天然に生じる（例えば、天然タンパク質）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。 本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、完全長タンパク質（例えば、哺乳類ＵＢＡ３タンパク質）をコードするオープンリーディングフレームを含み、さらに非翻訳制御配列およびイントロンも含み得る、核酸分子を指す。 「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、前記タンパク質が由来する細胞源または組織源に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合の化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない。 一実施形態では、「実質的に含まない」という表現は、ＵＢＡ３変異体以外のタンパク質（「混入タンパク質」とも呼ばれる）、または化学前駆物質もしくはＵＢＡ３変異体以外の化学物質を、約３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満（乾燥重量）しか有さない、ＵＢＡ３変異体タンパク質の調製を意味する。 ＵＢＡ３変異体タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、組換えで生成される場合、培地を実質的に含まない場合もある（すなわち、培地は前記タンパク質調製物の体積の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満である）。 本発明には、乾燥重量で少なくとも０．０１、０．１、１．０、および１０ミリグラムの単離または精製された調製物が含まれる。 本発明はさらに、配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子も包含する。 そのような差異は、遺伝暗号の縮重によるものであり得、（本明細書で開示されるヌクレオチド配列にコードされるもの様な、同じＵＢＡ３変異体タンパク質をコードする核酸を生じる。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２に示される、少なくとも１つの、ただし５未満、１０未満、２０未満、５０未満、または１００未満のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。 「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を消失させることなく、またはそれを実質的に変化させることなく、ＵＢＡ３の野生型配列またはＵＢＡ３変異体（例えば、配列番号２の配列）から変化させることができる残基であり、一方「必須」アミノ酸残基はそのような変化をもたらす。 例えば、本発明のポリペプチド間で保存されているアミノ酸残基、例えば、種の間で最も高い程度の保存性（すなわち、高い同一性）を示す図３および図４中の残基は、必須であり、酵素活性（例えば、ＵＢＡ３の活性）のうちの一つまたは複数にとって不可欠である。 種の間で高い、または中程度に高い同一性を示すアミノ酸残基は、酵素活性に重要であるが、必須ではない場合がある残基である。 そのような残基における変異は、ＵＢＡ３の一つまたは複数の活性を損なうかまたは低減する可能性があるが、いくつかの実施形態では、変異した酵素の一つまたは複数の活性は、変化を受けた（例えば、低減された）程度に、未だに機能する。 そのような残基は、野生型酵素の構造および機構用に設計されている阻害剤に抵抗するＵＢＡ３変異体において変異している残基であり得る。 いくつかの実施形態では、酵素活性（例えば、ＵＢＡ３活性）にとって不可欠または重要な残基は、ＵＢＡ３の一つまたは複数のドメイン（例えば、ＡＴＰ結合ドメイン、ＡＴＰ結合ポケット、ＮＥＤＤ８結合ポケット、ＴｈｉＦドメイン、ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン、ＵＢＡＣＴドメイン、Ｅ２＿結合ドメイン）内に存在する場合があり、それらの残基は保存的であると予測される、すなわち、概して変化を受けにくい。 非必須アミノ酸は種の間で高い変動性を示し、変動する残基よりも、酵素機構に関連する構造的特徴の間（例えば、ドメイン（例えば、ＡＴＰ結合ドメイン、ＡＴＰ結合ポケット、ＮＥＤＤ８結合ポケット、ＴｈｉＦドメイン、ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン、ＵＢＡＣＴドメイン、Ｅ２＿結合ドメイン））の間に存在する可能性が高い。 非必須アミノ酸残基の変異は、「サイレント」であり、ＵＢＡ３活性に影響を与えない可能性がある。 「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される置換である。 類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。 これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐鎖側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。 従って、ＵＢＡ３変異体タンパク質内の予測非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーとは別のアミノ酸残基と置換される。 あるいは、別の実施形態では、ＵＢＡ３変異体のコード配列の全体または部分に沿って、飽和突然変異誘発等によって、変異を無作為に導入することができ、得られる変異タンパク質（例えば、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質）を、ＵＢＡ３生物活性についてスクリーニングすることで、活性を保持している変異体を同定することができる。 配列番号１の変異誘発の後、コードされるタンパク質を組換え的に発現させることができ、そのタンパク質の活性を決定することができる。 本明細書で使用される場合、ＵＢＡ３変異体タンパク質の「生物学的に活性な部分」には、ＵＢＡ３変異体分子およびＵＢＡ３変異体以外の分子の間の相互作用に関与する、ＵＢＡ３変異体タンパク質の断片が含まれる。 ＵＢＡ３変異体タンパク質の生物学的に活性な部分には、ＵＢＡ３変異体タンパク質のアミノ酸配列、例えば、完全長ＵＢＡ３変異体タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、ＵＢＡ３変異体タンパク質の少なくとも１つの活性を示す一つまたは複数の本明細書に記載の変異体を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列と充分に相同な、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。 典型的に、生物学的に活性な部分は、ＵＢＡ３変異体タンパク質の少なくとも１つの活性（例えば、ヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＮＥＤＤ８と結合する能力、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力、ＮＥＤＤ８とチオエステル共有結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＮＥＤＤ８のＥ２へのＳＨ基転移を触媒する能力、またはＮＡＥ１と結合する能力）を有するドメインまたはモチーフを含む。 ＵＢＡ３変異体タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、２００またはそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。 ＵＢＡ３変異体タンパク質の生物学的に活性な部分は、Ｅ１酵素阻害剤（例えば、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−メチルスルファメート（例えば、ＭＬＮ４９２４）））の存在下で、ＵＢＡ３変異体介在性活性（例えば、ヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＮＥＤＤ８と結合する能力、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力、ＮＥＤＤ８とチオエステル共有結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＮＥＤＤ８のＥ２へのＳＨ基転移を触媒する能力またはＮＡＥ１と結合する能力）を調節する薬剤を開発するための標的として、使用することができる。 配列間の相同性または配列同一性の計算（「相同性」および「同一性」という用語は本明細書では同義的に使用される）は、以下の通りに行われる。 ２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は最適な比較を目的として整列される（例えば、最適なアラインメントのために、第一および第二のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に、ギャップを挿入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。 一実施形態では、比較を目的に整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である（例えば、４６３個のアミノ酸残基を有する配列番号２のＵＢＡ３変異体アミノ酸配列に対して第二の配列を整列させる場合、少なくとも１３９、少なくとも１８５、少なくとも２３２、少なくとも２７８、少なくとも３２４、３７０、または４１７個のアミノ酸残基が整列される）。 対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドが次に比較される。 第一配列におけるある位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸の「相同性」と等しい）。 ２つの配列間の同一性パーセントは、配列間で共有される同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップの数および各ギャップの長さを考慮している。 ２配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。 一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（カリフォルニア州サンディエゴアクセルリス社で入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）＝１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）＝１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。 さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ． ＣＭＰマトリックス、並びにギャップウェイト＝４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト＝１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。 １つのパラメーター設定は、ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２、ギャップエクステンドペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）＝４、およびフレームシフトギャップペナルティ（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスである。 ２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （（１９８９） ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７）のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップレングスペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２、およびギャップペナルティ＝４を用いて決定することができる。 ３つ以上の配列の間の保存アミノ酸配列を同定するには、マルチプルアラインメントプログラムが有用であり得る。 １つのマルチプルアライメントプログラムは、Ｃｌｕｓｔａｌプログラム（１９８８（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４）にて最初に記載され、長年に亘る様々なバージョンにおいて改良された（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０を参照）である。保存残基は、各横列中の同じ位置に見ることができ、マルチプルアライメント中のそれらの位置と関連する縦列において同一であると考えることができる。本明細書の図３はＣｌｕｓｔａｌアラインメントの一例である。 本明細書に記載の核酸配列およびタンパク質配列（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を「問い合わせ配列」として使用することで、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を確認するために、公開データベースに対して検索を行うことができる。 そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。 ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア（ｓｃｏｒｅ）＝１００、ワードレングス（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことで、本発明のＵＢＡ３変異体核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。 ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことで、本発明のＵＢＡ３変異体タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。 比較を目的にギャップの入ったアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． ， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載の通りに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。 ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを使用することができる。 （国立バイオテクノロジー情報センター、メリーランド州ベテスダにより管理されるウェブサイトを参照されたい。） ヌクレオチド配列に関して、用語「実質的に同一な」は、第一の核酸配列が、第二の核酸配列中の整列されたヌクレオチドと同一な、充分または最小限の数のヌクレオチドを含有し、その結果、第一および第二のヌクレオチド配列が、共通の機能活性を有するポリペプチドをコードする、または共通の構造的ポリペプチドドメインまたは共通の機能的ポリペプチド活性をコードすることを指すために本明細書では使用される。 例えば、配列番号１に対して、少なくとも約６０％、または６５％の同一性、可能性が高くは７５％の同一性、さらに可能性が高くは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列が、実質的に同一であるとされる。 「誤発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または異常な発現」とは、本明細書で使用される場合、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルにおいて野生型と異なる遺伝子発現パターンを指す。 誤発現または異常な発現には、以下が含まれる：野生型と異なるレベルでの発現（すなわち、過剰または過小発現）；遺伝子が発現される時間または段階の点から野生型と異なる発現パターン（例えば、所定の発生期間または発生段階における発現増加または発現減少（野生型と比較））；所定の細胞型または組織型における発現減少（野生型と比較）の点から野生型と異なる発現パターン；発現されたポリペプチドの、スプライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または生物活性の点から野生型と異なる発現パターン；遺伝子の発現に対する環境刺激または細胞外刺激の影響（例えば、刺激の強さに増加または減少がある状況下での発現増加または発現減少のパターン（野生型と比較））の点から野生型と異なる発現パターン。 「薬剤耐性表現型」とは、この表現型を有さない細胞と比較した場合の、特定の用量の化合物（例えば、ＮＡＥ阻害剤（例えば、１−置換メチルスルファメート（例えば、ＭＬＮ４９２４）））へ暴露した後の生存率の増加に関連する、細胞の表現型を指す。 「薬剤耐性細胞」とは、この表現型を示す細胞を指す。 薬剤耐性は、細胞集団または腫瘍が曝されている薬剤に対して、および曝されていない他の薬剤に対して比較的耐性となる、多剤耐性として生じ得る。 「対象」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物（例えば、霊長類、ヒト）、または実験動物（例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ）、または疾病モデル（例えば、腫瘍異種移植片を有する免疫無防備状態の動物）を指し得る。 対象は非ヒト動物（例えば、ウマ、雌ウシ、ヤギ、または他の家畜）であってもよい。 「精製された細胞調製物」とは、本明細書で使用される場合、植物細胞または動物細胞の場合では、細胞のインビトロ調製物を指し、完全に無処置の植物または動物は指さない。 培養細胞または微生物細胞の場合では、精製された細胞調製物は、少なくとも１０％または少なくとも５０％の対象細胞の調製物から成る。 単離核酸分子 一つの態様では、本発明は、本明細書に記載のＥ１酵素変異体ポリペプチド（例えば、完全長ＵＢＡ３、ＵＡＥ、ＵＢＡ６）、または他のＥ１酵素変異体タンパク質またはその断片（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の生物学的に活性な部分）をコードする、単離または精製された核酸分子を提供する。 ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適した核酸断片も含まれ、これは、例えば、本発明の変異体ポリペプチド（例えばＵＢＡ３、ＵＡＥまたはＵＢＡ６変異体）をコードする核酸分子を同定するのに使用することができる。 さらに、プライマー（例えば、核酸分子を増幅または変異させるためのＰＣＲプライマー）としての使用に適した核酸断片も含まれる。 本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、並びにヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体が含まれることが意図される。 「単離された」核酸分子は、該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。 一実施形態では、「単離された」核酸は、該核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸（すなわち、核酸の５'末端および３'末端に位置する配列）に天然では隣接している、配列（例えば、タンパク質コード配列）を含まない。 例えば、種々の実施形態では、単離された耐性核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然では隣接している約５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。 さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術によって生成される場合では他の細胞性物質または培地を実質的に含まない場合があり、あるいは、化学合成される場合では化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない場合がある。 単離核酸分子は、天然の体液および／もしくは組織、またはその天然環境では存在しないものからの、少なくとも１つの精製ステップを経ている場合がある。 あるいは、変異体は、単離された体液および／もしくは組織中で維持されてもよく、またはポリ核酸形態で存在していてもよい。 典型的に、このことは、ＵＢＡ３変異体またはポリ核酸が、少なくとも１つの宿主タンパク質および／または宿主核酸を含まないことを意味している。 一般的に、変異ＵＢＡ３変異体またはポリ核酸は、インビトロ環境中に存在する。 「単離された」は、ＵＢＡ３変異体またはポリ核酸が、精製された、または均一でなければならないことを意味するものではないが、尤も、そのような調製も該用語の範囲に含まれる。 「単離された」は、単純に、特許請求の範囲から、天然物および偶然の先行技術（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ ａｎｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）を除外するのに必要とされる程度にまで、ある程度の純度まで上昇されることを意味する。 「単離された」には、対象（例えばヒトまたは動物）から直接得られた、または精製（濃縮）後の、あらゆる生体物質が含まれることが意図される。 「生体物質」は、例えば、あらゆる種類の痰、気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｅｏｌａｖａｇｅ）、血液、皮膚組織、生検、精液、リンパ球性血液培養物質（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）、コロニー、液体培養物（ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）、糞便試料、尿等であってもよい。 「生体物質」は、人工的に形質移入された（例えば、組換え型の）細胞培養物またはその液相であってもよい。 一実施形態では、本発明の単離核酸分子には、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の変異体、またはこのヌクレオチド配列のいずれかの部分が含まれる。 一実施形態では、核酸分子には、ヒトＵＢＡ３変異体タンパク質（すなわち、配列番号１の塩基２１〜１４１２のような、配列番号１の「コード領域」の変異体）、並びに５'非翻訳配列（配列番号１のヌクレオチド１〜２０）および３'非翻訳配列（配列番号１のヌクレオチド１４１３〜２１３６）をコードする配列が含まれる。 あるいは、核酸分子は、配列番号１の変異体（例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのヌクレオチド変異を有する）のコード領域のみを含む場合があり、例えば、対象配列に通常は付随するフランキング配列は含まない。 別の実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載の変異体ＵＢＡ３内に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換）をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む変異体タンパク質の変異体断片に対応する配列をコードする。 一実施形態では、単離核酸分子は、配列番号１に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の同一性を有し、本明細書に記載の変異体ＵＢＡ３中に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む。 そのような実施形態では、変異体は、本明細書に記載の少なくとも１つの変異に加えて、非必須アミノ酸残基をコードし得る。 本発明の別の態様は、上記発現産物の断片に関し、この断片は、上記アミノ酸変異（例えば、１−置換メチルスルファメートおよび／または他のＥ１酵素阻害剤に対する感受性の低減に繋がる置換）を含む。 一実施形態では、核酸断片は、少なくとも１つの変異を含む、例えば、本明細書に記載の変異型のドメイン、領域、または機能部位をコードする、例えば、変異体アミノ酸残基、例えば、アミノ酸変異、例えばアミノ酸置換をコードする、配列を含み得る。 そのような変異体断片の例としては、配列番号２の変異体ＴｈｉＦドメインのおよそアミノ酸６９〜およそ２１１、またはその断片、例えば、配列番号２のおよそ９９〜１２４およびおよそ１４６〜１７４の変異体ＡＴＰ結合部位を含む断片、または配列番号２およそアミノ酸１４８〜およそ１７１の変異体ＡＴＰ結合ポケットを含む断片、配列番号２のおよそアミノ酸２０１〜およそ２２９の変異体ＮＥＤＤ８結合ポケットを含む断片、または配列番号２のおよそアミノ酸残基２７０〜およそ３３４の変異体ＵＢＡＣＴドメインを含む断片が挙げられる。 核酸断片は、本明細書に記載の特定のドメインもしくは部位またはその断片、特に、少なくとも１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１２０または１４０のアミノ酸長であるその断片をコードし得る。 そのような核酸断片は、ＵＢＡ３変異体内に存在することによってＥ１酵素阻害剤への耐性がもたらされる変異体アミノ酸残基をコードし得る。 断片には、上記の特定のアミノ酸配列またはその断片をコードする核酸配列も含まれる。 核酸断片は、本発明より前に開示されている場合がある断片を含むと解釈されるべきではない。 本発明で使用するための核酸分子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列の変異体を有する核酸分子、またはその相補体は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離することができる。 配列番号１の核酸配列の全て、または変異型ヌクレオチドを含むその部分、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補体をハイブリダイゼーションプローブとして使用することで、ＵＢＡ３変異体核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている）を用いて単離することができる。 本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型および適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、増幅することができる。 そのようにして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化し、例えば、実施例に記載されるＤＮＡ配列解析によって特徴付けすることができる。 別の実施形態では、本発明の単離核酸分子には、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の変異体の相補体、または変異体ヌクレオチド配列の一部の相補体である核酸分子が含まれる。 他の実施形態では、本発明の核酸分子は、当該技術分野において公知の、または本明細書に記載の条件下で、配列番号１に示される変異体ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることで、安定な二重鎖を形成することができる程に、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して充分に相補的である。 本明細書に記載の耐性ＵＢＡ３タンパク質（すなわち、耐性遺伝子）をコードするＵＢＡ３変異体ヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）における耐性相同体、並びに他の種（例えば、哺乳動物、昆虫または真菌）由来の耐性核酸相同体および相同分子種の同定および／またはクローニング用に設計される、プローブおよびプライマーの生成を可能にする。 プローブ／プライマーは、典型的に、少なくとも５もしくは１０、または２００未満、１００未満、もしくは５０未満の塩基長である、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。 オリゴヌクレオチドは、典型的に、配列番号１のセンス配列またはアンチセンス配列（例えば、変異型ヌクレオチドを含む一部）の少なくとも約１２、約２０、約２５、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、またはそれ以上の連続ヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。 さらに、ＵＢＡ３ポリ核酸またはその断片中で、変異したアミノ酸残基をコードする配列を識別することができるオリゴヌクレオチドの例を、表２および表３に記載する。 耐性ヌクレオチド配列をベースとするプローブを使用することで、同じまたは同一の（ｓａｍｅ ｏｒ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）タンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。 前記プローブは、それに結合した標識基（例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、酵素補因子、化学発光剤、比色分析色素、リン光色素もしくは赤外色素、または表面増強ラマン標識もしくはプラズモン共鳴粒子（ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＰＲＰ））を含み得る。 そのようなプローブは、ＵＢＡ３変異体および本発明の耐性タンパク質の相同分子種を同定するために、対象から得た細胞試料中の耐性タンパク質をコードする核酸のレベルを測定する等により、例えば、耐性ｍＲＮＡレベルを検出することにより、またはゲノム耐性遺伝子が変異もしくは欠失されているかどうかを決定することにより、耐性配列を誤発現している細胞または組織を同定するために、診断検査キットの一部として使用することができる。 オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列増幅法によって、インビトロで作製することができる。 そのような増幅されたオリゴヌクレオチドが二重鎖である場合、所望の一本鎖オリゴヌクレオチドがエキソヌクレアーゼ活性から保護されているならば、一本鎖分子の変換は適切なエキソヌクレアーゼによって達成することができる。 あるいは、オリゴヌクレオチドは、必要であれば、適切なヌクレアーゼを使用時に後者をクローン化プラスミドから切断し、それらを例えば分子量による分画によって回収することで、対応するヌクレオチド配列を含むインサートを含む組換えプラスミドから得られる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いる、例えば、従来のホスホトリエステル法またはホスホラミダイト法を適用することによって、合成することもできる、すなわち、化学的に合成することができる。 オリゴヌクレオチドはさらに、固相オリゴヌクレオチド合成またはフォトリソグラフ合成によりスライドガラス上でインサイツ合成することができる。 本発明の核酸は、特定の発現系用に調整されているコドンを有することで選択され得る。 例えば、核酸は、配列が大腸菌、酵母、ヒト、昆虫、またはＣＨＯ細胞内での発現用に最適化されるように、少なくとも１つのコドン、または少なくとも１０％、もしくは２０％のコドンが変化されている核酸であり得る。 耐性ポリペプチドをコードする単離核酸分子は、一つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、置換、付加または欠失）がコードタンパク質に導入されるように、一つまたは複数のヌクレオチド変異（例えば、置換、付加または欠失）を耐性核酸（配列番号１の変異体）のヌクレオチド配列に導入することによって、作製することができる。 変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲによる変異誘発）によって導入することができる。 いくつかの実施形態では、変異によって本明細書に記載のアミノ酸変化がもたらされる。 他の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、変異時に耐性を生じることが報告されている一つまたは複数の予測アミノ酸残基において為される。 アンチセンス核酸分子、リボザイムおよび改変型ＵＢＡ３変異体核酸分子 別の態様では、本発明は、Ｅ１酵素変異体（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６）、または本明細書に記載の他のＥ１酵素変異体に対しアンチセンスである単離核酸分子に関する。 「アンチセンス」核酸には、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のセンス鎖に対して相補的な、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的なタンパク質をコードする「センス」核酸に対し相補的であるヌクレオチド配列が含まれ得る。 アンチセンス核酸は、ＵＢＡ３変異体センス鎖の全体に対して、またはその一部（例えば、本明細書に記載の変異型ヌクレオチドを含む一部）のみに対して、相補的であり得る。 別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＵＢＡ３変異体をコードするヌクレオチド配列のセンス鎖の「非コード領域」（例えば、５'および３'非コード領域）に対してアンチセンスである。 アンチセンス核酸は、ＵＢＡ３変異体ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であるように設計することができ、あるいは、アンチセンス核酸は、ＵＢＡ３変異体ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり得る。 例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＢＡ３変異体ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域（例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の‐１０〜＋１０の領域）に対して相補的であり得る。 別の例では、アンチセンス核酸は、本明細書に記載の変異を含む配列番号１の一部に対して相補的であり得る。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。 本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において公知の手順を用いる化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて、構築することができる。 例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然発生的なヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはアンチセンス核酸およびセンス核酸間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に改変されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。 アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向にサブクローニング化されている発現ベクターを用いて生物学的に生成することもできる（すなわち、以下の小節でさらに説明されるが、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは目的の標的核酸に対してアンチセンス配向である）。 本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、ＵＢＡ３変異体タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合することで、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、該タンパク質の発現を阻害するように、対象に投与されるか（例えば、組織部位への直接注射によって）、またはインサイツで生成される。 あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように改変した後に全身投与することができる。 全身投与に関して、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、選択された細胞表面上に発現された受容体または抗原に特異的にまたは選択的に結合するように、改変することができる。 アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。 アンチセンス分子の充分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれ得るようにベクターは構築される。 ＵＢＡ３変異体ｍＲＮＡに相補的な核酸は、例えば、ＵＢＡ３変異体の発現を妨げるように設計することができる。 そのような核酸は、転写後の遺伝子制御のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法を利用することができる。 ＲＮＡｉは、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。 ｄｓＲＮＡ分子の例は、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。 これらの低分子ｄｓＲＮＡ分子は、一ヌクレオチドの分解まで、ｓｉＲＮＡと配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の破壊を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ Ｍ ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， １５： １８８−２００）。 ｓｉＲＮＡおよび標的ｍＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、それが標的ｍＲＮＡを切断し、ｓｉＲＮＡを再利用し得ると考えられている。 ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。 ３'オーバーハング、すなわち、一方または両方のＲＮＡ鎖の３'末端から約１〜６ヌクレオチド伸びている少なくとも１つの不対ヌクレオチドが存在し得る。 ｓｉＲＮＡを設計するための技術は、例えば、ｓｉＲＮＡ試薬の提供者（例えば、サーモサイエンティフィック社のダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）部門（コロラド州ラフィエット）またはアプライドバイオシステムズ社のアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）部門（テキサス州オースティン））が管理するウェブサイト上等で、広く利用可能である。 ＵＢＡ３変異体発現を標的とするｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される塩基に変異を含む配列番号１の一部に対して相補的である。 いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長、約１９〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜２５ヌクレオチド長である。 ｓｉＲＮＡは、例えば、腫瘍または寄生虫感染を有する対象に直接的に投与することができ、例えば、リポソーム中の、または膜可溶性分子に結合した、もしくはエンドソームに内部移行する分子に結合した、例えば、標的ｍＲＮＡを含む細胞内に侵入できる形態の、ｓｉＲＮＡ分子として送達されるか、あるいはｓｉＲＮＡは、例えば、ベクターの形態で、またはウイルス性因子中にカプセル化された形態で提供され得、これは、細胞内で発現し、切断されることでｓｉＲＮＡを形成することができる。 さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子である。 αアノマー核酸分子は、通常のβユニットとは反対に、鎖が互いに平行している、相補ＲＮＡと特殊な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。 アンチセンス核酸分子は、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）も含み得る。 さらなる別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。 ＵＢＡ３変異体をコードする核酸に対し特異性を有するリボザイムは、本明細書で開示されるＵＢＡ３変異体ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１の変異体）に相補的な一つまたは複数の配列、およびｍＲＮＡ切断に関わる公知の触媒作用的配列を有する配列を含み得る（米国特許第５，０９３，２４６号またはＨａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１参照）。 例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＵＢＡ３変異体をコードするｍＲＮＡ中の切断されるヌクレオチド配列に相補的な、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。 例えば、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第５，１１６，７４２号を参照されたい。 あるいは、ＵＢＡ３変異体のｍＲＮＡを使用することで、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを、ＲＮＡ分子のプールから選択することができる。 例えば、Ｂａｒｔｅｌ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。 ＵＢＡ３変異体の遺伝子発現は、ＵＢＡ３変異体の調節領域（例えば、ＵＢＡ３変異体のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とし、標的細胞内のＵＢＡ３変異体遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成させることで、阻害することができる。 一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ （１９９１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６：５６９−８４； Ｈｅｌｅｎｅ （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ （１９９２） Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７−１５を参照されたい。 三重らせん体形成のための標的となり得る有望な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子の作製によって増加させることができる。 スイッチバック分子は、二重鎖の最初の一方の鎖と塩基対合させ、その後もう一方と塩基対合させ、プリンまたはピリミジンが二重鎖の一方の鎖に大量に存在する必要を排除するような、５'−３'、３'−５'交互方法において合成される。 ＵＢＡ３変異体の核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸塩骨格に修飾することで、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を向上させることができる。 例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾することで、ペプチド核酸を生成することができる（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４： ５−２３参照）。 本明細書で使用される場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸骨格が擬ペプチド骨格に置き換えられ、４つの天然核酸塩基のみが保持されている、核酸模倣体（例えば、ＤＮＡ模倣体）を指す。 中性のＰＮＡ骨格は、低イオン強度の条件下での、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションを可能にし得る。 ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ'Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： １４６７０−６７５に記載される、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。 ＵＢＡ３変異体核酸分子のＰＮＡは、治療的および診断的な応用に使用することができる。 例えば、ＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止を誘導するかまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現を配列特異的に調節するための、アンチセンスまたは抗原作用剤として使用することができる。 ＵＢＡ３変異体核酸分子のＰＮＡは、遺伝子の一塩基対変異の解析に（例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピング法（ＰＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＰＣＲ ｃｌａｍｐｉｎｇ）による）；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（上記Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）））と組み合わせて使用される場合には「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ塩基配列決定法もしくはハイブリダイゼーション用のプローブもしくはプライマーとして（上記Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）；上記Ｐｅｒｒｙ−Ｏ'Ｋｅｅｆｅ）、使用することもできる。 本発明には、ＵＢＡ３変異体核酸の存在を定量化するのに分子ビーコンが有用となるような、本発明のＵＢＡ３変異体核酸に対し相補的な少なくとも１つの領域、一方がフルオロフォアを有しもう一方が失活剤を有する２つの相補的領域を有する、分子ビーコンオリゴヌクレオチドのプライマー分子およびプローブ分子も含まれる。 分子ビーコン核酸は、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第５，８５４，０３３号；Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第５，８６６，３３６号、およびＬｉｖａｋ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第５，８７６，９３０号に記載されている。 単離したＥ１酵素変異体のポリペプチド 別の態様では、本発明はＥ１酵素変異体、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドを提供する。 一実施形態では、本発明のＵＢＡ３変異体のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を有し得る。 アミノ酸配列に関連して、用語「実質的に同一な」とは、第一のアミノ酸が、第二のアミノ酸配列中の整列されたアミノ酸残基と、ｉ）同一である、またはｉｉ）保存的置換である、充分なまたは最小限の数のアミノ酸残基を含有し、その結果、第一および第二のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有し得ること、を指すために本明細書では使用される。 例えば、本明細書に記載の配列番号２の変異体に対して少なくとも約７５％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列は、実質的に同一であるとされる。 別の態様では、本発明は、単離されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質、またはその断片に関する。 一実施形態では、変異ＵＢＡ３変異体タンパク質、またはその断片は、例えば、結合部位または結合ドメイン、例えば、ＴｈｉＦドメイン、ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン、ユビキチン活性化酵素特徴的配列、ＡＴＰ結合部位、ＵＢＡＣＴドメイン、ＮＥＤＤ８結合間隙もしくはＮＥＤＤ８結合部位、またはＥ２＿結合ドメイン等の、ＵＢＡ３の１つ以上の部分を含む、生物学的に活性な部分であり得る。 ＵＢＡ３変異体タンパク質の生物学的に活性な部分の用途の一例は、１つ以上の特定の機能を解析用に単離する生化学分析である。 そのような単離生化学分析の例は、ヌクレオチド結合アッセイ、例えばＡＴＰ結合アッセイ、ヌクレオチド加水分解アッセイ、ピロリン酸結合アッセイ、ピロリン酸交換アッセイ、ＮＥＤＤ８結合アッセイ、ＮＥＤＤ８アデニル化アッセイ、ＮＥＤＤ８チオエステル結合アッセイ、Ｅ２酵素結合アッセイ、ＮＥＤＤ８のＥ２酵素へのＳＨ基転移を検出もしくは測定するためのアッセイ、ＮＡＥ１結合アッセイ、または結合の堅固さもしくはＮＡＥ阻害剤−ＮＥＤＤ８付加体に対する結合の結合解離速度を測定するためのアッセイである。 別の実施形態では、単離されたＵＢＡ３変異体タンパク質、またはその断片は、抗ＵＢＡ３変異体抗体を産生させるまたは試験するための（または、より一般的には結合させるための）免疫原または抗原としての、約８〜約１５０アミノ酸の保存的配列部分（例えば、８、１０、１５、２０、５０、７０、１００またはそれ以上のアミノ酸）であり得る。 これらの実施形態では、ＵＢＡ３部分または断片を含むポリペプチドは、変異残基（例えば、Ｅ１酵素阻害剤への感受性または耐性の低減をもたらす変異残基）を含み得る。 ＵＢＡ３変異体タンパク質またはその断片は、標準的なタンパク質精製技術を用いて細胞源または組織源から単離することができる。 ＵＢＡ３変異体タンパク質またはその断片は、組換えＤＮＡ技術により生成するか、または化学的に合成することができる。 本発明のポリペプチドには、複数の遺伝子、選択的転写イベント、選択的ＲＮＡスプライシングイベント、並びに選択的な翻訳および翻訳後イベントの存在の結果生じるポリペプチドが含まれる。 一実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号２に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の同一性を有し、本明細書に記載の少なくとも１つのアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）を含む。 そのような実施形態では、変異は、本明細書に記載の少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換）に加えて、変異、例えば、非必須アミノ酸残基へのアミノ酸置換であり得る。 ポリペプチドは、ポリペプチドが天然細胞で発現される場合に存在する、実質的に同一の翻訳後修飾をもたらす系（例えば、培養細胞）、または、天然細胞には存在する翻訳後修飾（例えば、グリコシル化または切断）の変化もしくは欠落をもたらす系において、発現させることができる。 本発明には、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素遺伝子内に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換および／または欠失）を含む発現産物も含まれる。 例えば、本発明は、本明細書に記載のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換）を含む発現産物に関する。 本発明には、本明細書に記載の変異または置換に加えて、さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素にアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）を含む発現産物も包含される。 本明細書に記載のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素に少なくとも２つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む発現産物も包含される。 いくつかの実施形態では、発現産物は、配列番号２のアミノ酸残基１７１におけるアラニンの１つの置換、および本明細書に記載の少なくとも１つのさらなる置換を含む。 Ｅ１酵素変異体キメラまたは融合タンパク質 別の態様では、本発明は、Ｅ１酵素変異体、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のキメラタンパク質もしくは融合タンパク質を提供する。 本明細書で使用される場合、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」には、非変異ポリペプチドに連結された、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドまたはその変異体部分も含まれる。 「非変異ポリペプチド」とは、変異した（例えば、置換された）アミノ酸残基（例えば、本明細書に記載の変異アミノ酸残基）を含まないタンパク質またはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。 非変異ポリペプチドは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体、またはその変異部分と異なっており、同じまたは異なる生物に由来する、タンパク質、例えば、タンパク質または選択可能なその部分で有り得る。 非変異ポリペプチドは、アミノ酸変異（例えば、置換）を含まないＥ１酵素の一部、例えば、野生型ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の一部であり得る。 そのような実施形態では、アミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）を含むＥ１変異酵素の一部（例えば、結合部位または結合ドメイン）は、野生型Ｅ１酵素の異なる部分（例えば、結合部位または結合ドメイン）に融合することができる。 一実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の融合タンパク質は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の少なくとも１つ以上の生物学的に活性な部分を含む。 非変異ポリペプチドは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。 融合タンパク質は、非変異ポリペプチドのように、リガンドに対する高親和性を有する部分を含み得る。 例えば、融合タンパク質は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合している、ＧＳＴ−ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体融合タンパク質であり得る。 そのような融合タンパク質は、組換えＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の精製を容易にすることができる。 あるいは、融合タンパク質は、そのＮ末端の、ｇｐ６７バキュロウイルスエンベロープタンパク質、メリチンおよびヒト胎盤型アルカリフォスファターゼの分泌配列、ｐｈｏＡまたはプロテインＡの原核生物性分泌シグナル等を用いる、異種シグナル配列を含有するＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質であり得る。 ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用により増加させることができる。 Ｅ１酵素変異体の融合タンパク質は、例えば、非変異ポリペプチドとして、血清タンパク質の全てまたは一部、例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ）の一部、例えば、免疫グロブリンまたはヒト血清アルブミンのＦｃ領域並びに／またはヒンジＣ１およびＣ２配列を含み得る。 別の実施形態では、融合タンパク質はさらに、異種エピトープ標識を含み得る。 異種エピトープ標識の例としては、Ｈｉｓ ６標識、ＦＬＡＧ標識、ｃ−ｍｙｃ標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識、赤血球凝集素（ＨＡ）標識、Ｔ７遺伝子１０標識、Ｖ５標識、ＨＳＶ標識、およびＶＳＶ−Ｇ標識が挙げられる。 本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の融合タンパク質は、医薬組成物に組み入れて対象にインビボ投与することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の融合タンパク質を使用することで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質の生物学的利用能に影響を与えることができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体融合タンパク質は、例えば、（ｉ）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素タンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾または変異；（ｉｉ）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子の誤制御；および（ｉｉｉ）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体タンパク質の異常な翻訳後修飾によって引き起こされる障害の治療に、治療上有用であり得る。 さらに、本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体−融合タンパク質を免疫原として使用することで、抗ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の抗体を対象内で産生させること、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のリガンドを精製すること、並びに、スクリーニング検査において、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体と、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質との相互作用を阻害する分子、すなわちＥ１酵素阻害剤を同定することができる。 融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）が既にコードされている発現ベクターは市販されている。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体をコードする核酸は、融合部分がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質にインフレームで連結されているように、そのような発現ベクターにクローン化することができる。 Ｅ１酵素タンパク質の変異体 Ｅ１酵素タンパク質の変異体は、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性について、Ｅ１酵素タンパク質の変異体（例えば、切断変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。 いくつかの実施形態では、変異体は、システイン残基またはグリコシル化された残基を付加または欠失させることから生じる。 Ｅｉ酵素変異体のタンパク質コード配列の断片（例えば、Ｎ末端断片、Ｃ末端断片、または内部断片）のライブラリーは、スクリーニングおよびその後のＥ１酵素タンパク質の変異体の選択のための様々な断片群を作製するのに用いることができる。 例えば、コード配列断片のライブラリーは、耐性タンパク質コード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をニッキングが１分子につき約１回のみ生じる条件下でヌクレアーゼ処理し、その二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生させることで異なるニック入り産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、一本鎖部分をＳ１ヌクレアーゼによる処理で再形成された二本鎖から除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することによって、作製することができる。 この方法により、様々なサイズの耐性タンパク質のＮ末端のおよび内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。 選択された特性を有する遺伝子産物を求めて、点変異または切断により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、およびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法は、当該技術分野において公知である。 ライブラリー内の機能変異体の頻度を増加させる技術であるリカーシブアンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ＲＥＭ）をスクリーニング検査と組み合わせて使用することで、Ｅ１酵素変異体を同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５； Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。 細胞系アッセイを利用することで、様々なＥ１酵素変異体ライブラリーを解析することができる。 例えば、Ｅ１酵素変異体の部分またはその生物学的に活性な部分を含む発現ベクターのライブラリーを、細胞株（例えば、基質依存的にＥ１酵素活性に通常は応答する細胞株）にトランスフェクトすることができる。 トランスフェクト細胞を次に、基質と接触させ、Ｅ１酵素基質によるシグナル伝達に対する変異体の発現の効果を検出することができ、例えば、チオール転移した（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｅｄ）、例えば、ユビキチン化した、ＳＵＭＯ化した、またはＮＥＤＤ化したタンパク質とＥ３リガーゼ（例えば、カリン環リガーゼ）との相互作用により媒介される細胞間情報伝達活性を測定することができる。 例えば、Ｅ１酵素変異体（例えば、ＵＢＡ３変異体）の活性は、１）カリン環リガーゼの基質の代謝回転を媒介する能力；２）タンパク質恒常性に関与する能力；および３）腫瘍細胞生存を支援する能力によって、またはより具体的にはＥ２酵素結合もしくはＮＡＥ１結合を測定することによって、同定し測定することができる。 その後、プラスミドＤＮＡを、Ｅ１酵素阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４）の存在下でのＥ１酵素基質によるシグナル伝達の阻害、あるいは、相乗作用をスコア化する細胞から回収することができ、個々のクローンをさらに特徴付けすることがでできる。 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチド（例えば、自然発生的なＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチド（例えば、自然発生的なＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチド）の非野生型活性、例えば、アンタゴニスト、アゴニスト、またはスーパーアゴニスト（ｓｕｐｅｒ ａｇｏｎｉｓｔ）を有するペプチド）を作製するための方法に関する。 前記方法には、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドの配列を変化させること（例えば、非保存領域の一つまたは複数の残基、本明細書で開示されるドメインまたは残基の置換または欠失によって配列を変化させること）、およびその変化したポリペプチドを所望の活性について試験することが含まれる。 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドの断片または類似体を作製する方法、自然発生的なＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドの生物活性に関する。 前記方法には、配列を変化させること（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体ポリペプチドの一つまたは複数の残基の置換または欠失によって、例えば、非保存領域または本明細書に記載のドメインもしくは残基の配列を変化させることによって）、および所望の活性について変化したポリペプチドを試験することが挙げられる。 抗Ｅ１酵素変異体抗体 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体を提供する。 「抗体」という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、具体的には完全長モノクローナル抗体、免疫グロブリン、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全長抗体から形成される多特異的抗体（例えば二重特異性抗体）、および個々の抗原結合断片、例えば、ｄＡｂｓ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）' ２ 、Ｆａｂ'、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト種由来の抗体、組換え抗原結合形成体（例えば、モノボディおよびダイアボディ）が包含される。 抗体はエフェクター機能を有する場合があり、補体を固定することができる。 抗体は毒素、検出可能な標識またはイメージング剤に結合させることができる。 キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体は、反復投与、例えば、ヒト患者の治療的処置を含む適用、およびいくつかの診断的適用に有用である。 用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、その集団を構成する個々の抗体が同一である、および／または同一のエピトープと結合する抗体を指すが、ただし、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能な変異体は除外され、そのような変異体は通常少量しか存在しない。 様々な決定基（エピトープ）を対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。 修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特性を示すものであり、いかなる具体的な方法によってもその抗体の作製が必要とされていると解釈されるべきではない。 例えば、本明細書で使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）により最初に報告されたハイブリドーマ法で作製されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製されてもよい。 「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８ （１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ， ２２２：５８１−５９７ （１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。 完全長のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の抗原ペプチド断片は免疫原として使用することが可能であり、あるいは、他の免疫原（例えば、細胞、細胞溶解液、膜標本等）を用いて作製されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体を同定するのに使用することが可能である。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の抗原ペプチドは、Ｅ１酵素変異体アミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基（例えば、配列番号２、２９または３２）を含むべきであり、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のエピトープを含むべきである。 いくつかの実施形態では、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含み、本明細書に記載の、変異した（例えば、置換された）アミノ酸残基（例えば、Ｅ１酵素阻害剤に対する感受性または耐性の低減させる残基）を含む。 いくつかの実施形態では、抗原ペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４または３２４、配列番号２７のアミノ酸残基１２１、配列番号２８のアミノ酸残基５４８、配列番号２９のアミノ酸残基５８０、配列番号３０のアミノ酸残基１８５、配列番号３１のアミノ酸残基１８７、配列番号３２のアミノ酸残基５７３、配列番号３３のアミノ酸残基５４４、配列番号３４のアミノ酸残基４８０、配列番号３５のアミノ酸残基１３４または配列番号３６のアミノ酸残基１３１を含み、ここで、このアミノ酸残基はそれぞれの配列番号における野生型残基と置換されたものである。 あるいは、変異体のドメインまたは結合部位（例えばＴｈｉＦドメイン、ＵＢＡ＿ｅ１＿チオールＣｙｓドメイン、ユビキチン活性化酵素の特徴的配列、ＡＴＰ結合部位、ＵＢＡＣＴドメイン、ユビキチンもしくはＮＥＤＤ８結合間隙もしくは部位、またはＥ２＿結合ドメイン）を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の断片を使用することで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の変異体領域に対する抗体を作製することができる。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）を含むドメインまたは結合部位は、ＵＢＡ３変異体において抗体を作製するための免疫原として有用であり、配列番号２のおよそアミノ酸残基６９〜およそ２１１の、およそアミノ酸残基２３５〜２４３、アミノ酸残基およそ２１６〜およそ２６０、残基およそ９９〜１２４およびおよそ１４６〜１７４、およそ７８〜８１、１６５〜１７２、２０１〜２２９およそ３１０〜３４４、およそアミノ酸残基２７０〜およそ３３４、またはおよそアミノ酸残基３７４〜およそ４６２を含み得る。 いくつかの実施形態では、抗原ペプチドに含まれるエピトープは、タンパク質表面に位置するＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の領域（例えば、親水性領域および高い抗原性）を有する領域である。 例えば、ヒトＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質配列のＥｍｉｎｉ法による表面露出率解析（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いることで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質表面に位置している可能性が特に高く、それ故抗体産生を標的化するのに有用な表面残基を組成する可能性が高い領域を示すことができる。 いくつかの実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体は、本明細書に記載のアミノ酸変異（例えばアミノ酸置換）を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の一部に選択的に結合することができる。 例えば、抗体結合性は、変異した（例えば、置換された）残基を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素に対しては選択的であり、野生型残基を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素ポリペプチドに対しては選択的ではないであろう。 いくつかの実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体は、配列番号２の残基１７１にトレオニン、アスパラギン酸、バリン、グルタミン酸もしくはセリンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２０１にバリンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２０４にリシンもしくはグリシンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２０５にシステインを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２０９にリシンもしくはアスパラギン酸を有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２１１にグルタミンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２２８にヒスチジンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２２９にグルタミンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基３０５にアラニンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基３１１にセリンもしくはトレオニンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基３１４にプロリンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基３２４にチロシンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２の残基２４９にチロシンを有するＵＢＡ３変異体、配列番号２９の残基２８０にトレオニンを有するＵＡＥ変異体、または配列番号３２の残基５７３にトレオニンもしくはアスパラギン酸を有するＵＢＡ６変異体と結合することができる。 いくつかの実施形態では、抗体は、動物（例えば、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）を、精製したＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体抗原、またはその断片（例えば、本明細書に記載の変異した（例えば、置換された）アミノ酸残基を含む断片）、膜関連抗原、組織（例えば、組織粗調製物）、細胞全体（例えば、生細胞）、溶解細胞、または細胞画分（例えば、サイトゾル画分、核画分または膜画分）で免疫することにより作製することができる。 上記のこれらの領域のいずれか、または本明細書に記載の他の領域もしくはドメインに対して、反応性、または特異的もしくは選択的である抗体が提供される。 本発明のタンパク質の断片等の小分子ペプチドに対する抗体の場合、前記ペプチドは一般的には動物の免疫化の前に担体タンパク質に結合される。 そのようなタンパク質担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよび破傷風トキソイドが挙げられる。 ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体および霊長類化モノクローナル抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。 そのようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． 、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ， ｅｔ ａｌ． 、欧州特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、欧州特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． 、欧州特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． 、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ． 、欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２１４−２１８； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９）に記載されている方法を用いて、作製することができる。 ヒト化抗体または相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植した抗体は、ドナーＣＤＲで置換された、少なくとも１つまたは２つの、しかし通常は３つ全ての、（重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン鎖の）レシピエントＣＤＲを有する。 抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部またはＣＤＲのうちのいくつかのみで置換されていてもよく、非ヒトＣＤＲで置換されていてもよい。 ヒト化抗体がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体またはその断片に結合するのに必要なＣＤＲの数が置換されてさえいればよい。 一実施形態では、ドナーは、げっ歯類抗体（例えば、ラット抗体またはマウス抗体）であり、レシピエントはヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。 典型的に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。 一実施形態では、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、げっ歯類）である。 アクセプターフレームワークは、自然発生的な（例えば、ヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワーク、またはそれに対し約８５％またはそれより高い（例えば、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）同一性を有する配列である。 本明細書で使用される場合、用語「コンセンサス配列」とは、関連配列のファミリーにおいて最も頻繁に生じているアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ， （１９８７） Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（出版社（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）、ドイツ、ワインハイム）を参照されたい）。 あるタンパク質ファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリーの中でその位置で最も頻繁に生じているアミノ酸により占有されている。 ２つのアミノ酸が等しい頻度で生じている場合、いずれもコンセンサス配列に含むことができる。 「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。 抗体は、当該技術分野において公知の方法によりヒト化することができる。 ヒト化抗体は、抗原結合に直接的に関与していないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域に由来する等価な配列と置換することによって作製することができる。 ヒト化抗体の一般的な作製方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７， ｂｙ Ｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、およびＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ． 、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号によって提供されており、その全ての内容は参照によって本明細書に組み入れられたものとする。 それらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一方からの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全てまたは部分をコードする核酸配列を単離、操作、および発現することを含む。 そのような核酸の供給源は当業者に周知であり、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体ポリペプチドまたはその変異体断片に対する抗体を産生するハイブリドーマから得てもよい。 ヒト化抗体またはその断片をコードする組換えＤＮＡは、次に適切な発現ベクターにクローン化することができる。 ヒト化抗体またはＣＤＲ移植抗体は、免疫グロブリン鎖の１、２、または全てのＣＤＲを置換可能なＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換により、作製することができる。 例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５； Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４； Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０； Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい（その全ての内容は参照により本明細書に明示的に組み入れられたものとする）。 Ｗｉｎｔｅｒによって、本発明のヒト化抗体を作製するのに用いてもよいＣＤＲ移植法が説明されており（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号）、その内容は参照によって明確に組み入れられたものとする。 特定のアミノ酸が置換、欠失または付加されているヒト化抗体も、本発明の範囲内である。 いくつかの実施形態では、抗原への結合性を向上させる等のために、ヒト化抗体はフレームワーク領域内にアミノ酸置換を有する。 例えば、ヒト化抗体は、ドナーフレームワーク残基、またはレシピエントフレームワーク残基とは別のアミノ酸と同一のフレームワーク残基を有する。 そのような抗体を作製するために、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナーアミノ酸で置換することができる。 有用な置換位置としては、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基、またはＣＤＲと相互作用可能なアミノ酸残基（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号）が挙げられる。 ドナーからアミノ酸を選択するための判断基準は、米国特許第５，５８５，０８９号、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号のカラム１２〜１６、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号のカラム１２〜１６に記載されており、その内容は参照によって本明細書に組み入れられたものとする。 抗体をヒト化するための他の技法は、１９９２年１２月２３日に公開されたＰａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ． 、ＥＰ５１９５９６Ａ１に記載されている。 いくつかの実施形態では、完全ヒト抗体がヒト患者の治療的処置を目的に作製される。 用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖系免疫グロブリン配列由来の配列を有する抗体が含まれる。 例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ （１９９５） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３）；並びに米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，５４５，８０６号。 ヒト抗体の例としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウス（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ遺伝子改変マウス（アブジェニクス社、カリフォルニア州フリーモント）、ＨＵＭＡＢ−マウス（登録商標）、ＫＩＲＩＮ ＴＣマウス（商標）トランスクロモソーム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）マウス、ＫＭＭＯＵＳＥ（登録商標）（メダレックス社、ニュージャージー州プリンストン））、ヒトファージディスプレイライブラリー、ヒト骨髄腫細胞、またはヒトＢ細胞から得られた抗体が挙げられる。 選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を用いて作製することができる。 このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）が、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために使用される。 この技術はＪｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）に記載されている。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体は、一本鎖抗体であり得る。 一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）は、例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎｎ． Ｎ Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８０：２６３−８０；およびＲｅｉｔｅｒ （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２：２４５−５２に記載の通りに操作することができる。 一本鎖抗体を二量体化または多量体化することで、同一標的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を作製することができる。 一実施形態では、抗体はＦｃ受容体と結合する能力が低減しているか、またはその能力を持たない。 例えば、抗体は、アイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の変異体であり、Ｆｃ受容体への結合を支持せず、例えば、Ｆｃ受容体結合領域が変異されているかまたは欠失している。 抗体（またはその断片）は、細胞毒、治療薬または放射性イオン等の治療的部分に結合していてもよい。 細胞毒または細胞性剤には細胞に有害なあらゆる薬剤が含まれる。 例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２１： ７７８−７８４ （２００３）； Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １０： ７０６３−７０７０ （２００４）； Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｓｅｎｔｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．， １４ １５４−１６９ （２００８）；米国特許第７，４９８，２９８号；同第６，８８４，８６９号；同第７，０９１，１８６号；同第７，８３７，９８０号；同第７，６５９，２４１号；または米国特許出願公開第２００８０３００１９２号を参照）、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号参照）、ＣＣ−１０６５（米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号を参照）およびその類似体または相同体が挙げられる。 治療薬としては、限定はされないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、ＣＣ−１０６５、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（正式には（ｆｏｒｍｅｒｌｙ）、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（正式には（ｆｏｒｍｅｒｌｙ）、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）およびメイタンシノイド）が挙げられる。 放射性イオンとしては、限定はされないが、ヨウ素、イットリウムおよびプラセオジムが挙げられる。 本発明の結合体は所与の生物学的反応を修飾するのに使用することができ；その治療的部分は古典的な化学治療薬に限定されると解釈されるべきではない。 例えば、治療的部分は、所望の生物活性を有するタンパク質であってもポリペプチドであってもよい。 そのようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化物質）；または、生物学的応答調節物質（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｓｅ）コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子を挙げることができる。 あるいは、米国特許第４，６７６，９８０号におけるＳｅｇａｌによる記述のように、抗体を第二の抗体に結合することで、抗体ヘテロ結合体を形成させることができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いることで、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降等の標準的な技術によって、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を単離することができる。 さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体を用いることで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質（例えば、細胞溶解液中または細胞上清中）を検出して、タンパク質の存在量および発現パターンを評価することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体を診断用に用いることで、臨床検査手順の一部として組織内のタンパク質レベルをモニターすることができ、それにより、例えば、所与の治療計画の効能を決定することができる。 抗体を検出可能な物質に結合（すなわち、物理的に連結）すること（すなわち、抗体標識）により、検出を促進することができる。 検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。 適切な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の一例としてはルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、 １２５ Ｉ、 １３１ Ｉ、 ３５ Ｓまたは３ Ｈが挙げられる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に対する抗体に依存する有用な手段としては、タンパク質ゲルブロット解析、遺伝子同定を可能にする発現ライブラリーのスクリーニング、タンパク質定量法、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）およびＬＩＡ（ライン免疫検定）、タンパク質の免疫親和性精製、タンパク質の免疫沈降、並びにタンパク質の免疫学的局在決定が挙げられる。 天然のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質とのみ結合する抗体、変性したもしくは非天然のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質とのみ結合する抗体、または両方と結合する抗体は、本発明の範囲内である。 直鎖状または立体構造のエピトープを有する抗体も本発明の範囲内である。 立体構造エピトープは、天然であるが変性はしていないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に結合する抗体を同定することにより、同定できる場合がある。 組み換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子改変細胞 別の態様では、本発明には、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を含有するベクター（例えば、発現ベクター）が含まれる。 本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指し、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターが含まれ得る。 ベクターは自律増殖することができ、あるいは宿主ＤＮＡに組み入れることができる。 ウイルスベクターとしては、例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。 ベクターには、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態の、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸が含まれ得る。 いくつかの実施形態では、組み換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結した一つまたは複数の制御配列を含む。 「制御配列」という用語には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節領域（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。 制御配列は、ヌクレオチド配列、並びに組織特異的な制御および／または誘導性配列の恒常的発現を指示する配列を含む。 発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要素に依存し得る。 発現はさらに、一過性発現でも安定発現でも、あるいは制御可能な発現であってもよい。 制御可能な発現は、例えば、テトラサイクリン調節可能プロモーター、ストレス誘導性プロモーター（例えば、ヒトｈｓｐ７０遺伝子プロモーター）、メタロチオネイン（ｍｅｔｈａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、糖質コルチコイドプロモーターまたはプロゲステロンプロモーターを用いる誘導発現を含む。 プロモーターにはさらに、コアプロモーター等のＨＢＶプロモーターおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期（ＩＥ）プロモーター等の異種プロモーターが含まれ得る。 本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することで、本明細書に記載の核酸にコードされるタンパク質またはポリペプチド（例えば、融合タンパク質またはポリペプチド）（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質、融合タンパク質等）を生成することができる。 本発明の組み換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞内でのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体タンパク質の発現用に設計することができる。 例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳類細胞内で発現させることができる。 適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ， （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡにおいてさらに論じられている。 あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳することができる。 原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを有する大腸菌において行われる。 融合ベクターは、それにコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。 そのような融合ベクターは典型的には３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現の増加；２）組換えタンパク質の溶解性の増加；および３）親和性精製における、リガンドとして作用することによる、組換えタンパク質の精製の促進。 多くの場合、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質の融合部分からの分離を可能にするために、融合部分および組換えタンパク質の接合部にタンパク質切断部位が導入される。 そのような酵素、およびそれらの同族の認識配列としては、例えば、活性化第Ｘ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。 典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテク社；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ベバリー）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられる。 精製した融合タンパク質は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性アッセイ（例えば、以下に詳細に記述される、直接アッセイまたは競合アッセイ）に使用することができ、あるいは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に対して特異的または選択的な抗体を作製するのに使用することができる。 一実施形態では、本発明のレトロウイルス発現ベクター中の発現される融合タンパク質を使用することで、照射を受けたレシピエントにその後移植される骨髄細胞を感染させることができる。 十分な時間が経過した後（例えば、６週間）、対象レシピエントの病態が次に検査される。 大腸菌内の組換えタンパク質発現を最大にすることはために、組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する能力が障害された宿主細菌内でそのタンパク質を発現する（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ １１９−１２８）。 別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌内で優先的に利用されるコドンとなるように、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変化させることである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８）。 本発明の核酸配列のそのような変化は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞内での発現用ベクター（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）、または哺乳類細胞内での発現に適したベクターであり得る。 哺乳類細胞で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節タンパク質要素によりしばしば与えられる。 例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から得られる。 別の実施形態では、組換え型哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に、核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御エレメントが核酸の発現に用いられる）。 適切な組織特異的プロモーターの非限定例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ （１９８８） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：２３５−２７５）、具体的には、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ （１９８９） ＰｒｏＣ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクウェイ（ｍｉｌｋ ｗｈｅｙ）プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。 発生学的に調節されているプロモーターも包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ （１９８９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３：５３７−５４６）が挙げられる。 本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む、組み換え発現ベクターを提供する。 種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡの恒常的発現、組織特異的発現または細胞型特異的発現を指示する、アンチセンス配向でクローン化された、核酸に作動可能に連結した制御配列（例えば、ウイルス性のプロモーターおよび／またはエンハンサー）が選択され得る。 アンチセンス発現ベクターは組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態で存在し得る。 アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ． ， （１９８６） Ｒｅｖｉｅｗｓ − Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：１を参照されたい。 ベクターまたは発現ベクターはさらに、宿主細胞内で自律増殖可能であってもよく、あるいは組込み型のベクター（すなわち、完全または部分的に、且つ安定に、宿主細胞のゲノムにくみこまれたベクター）であってもよい。 いかなる他の第二のＤＮＡ断片（例えば、宿主細胞のゲノム）への、いかなる第一のＤＮＡ断片（例えば、ベクターまたはその断片）の組込みも、前記第一のＤＮＡ断片が例えば部位特異的組換え部位、またはトランスポゾンに典型的な反復配列に隣接していれば、可逆的である。 あるいは、前記部位特異的組換え部位またはトランスポゾン反復配列は、前記第二のＤＮＡ断片中に含まれており、前記第一のＤＮＡ断片に隣接している。 別の態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子、例えば、組み換え発現ベクター内のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の核酸分子、または、宿主細胞のゲノムの特定の部位への相同組換えを可能にする配列を含有するＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。 「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では同義的に使用される。 そのような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫をも指す。 変異または環境の影響により続く世代にはある種の改変が生じ得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、いずれにせよ、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。 宿主細胞は、あらゆる原核細胞または真核細胞（例えば、培養液中の細胞）であり得る。 例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質は、大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＶ−１ ｏｒｉｇｉｎ、ＳＶ−４０（ＣＯＳ）細胞）等の細菌細胞内で発現させることができる。 他の適切な宿主細胞は当業者に公知である。 従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術により、ベクターＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。 本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、当該技術分野において承認されている種々の技術を指すことが意図され、例えば、（例えば大腸菌の）熱ショックによる形質転換、接合性ＤＮＡ転移、リン酸カルシウム共沈もしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または例えばマイクロインジェクションもしくは微粒子銃によるエレクトロポレーション直接導入、またはウイルス、ビリオンもしくはウイルス粒子による導入が含まれる。 本発明の宿主細胞を用いることで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を生成（すなわち、発現）することができる。 従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を生成するための方法を提供する。 一実施形態では、前記方法は、本発明の宿主細胞（ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードする組み換え発現 ベクターが導入されている）を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質が産生されるような適切な培地中で培養することを含む。 前記方法では、選択マーカーを用いることにより、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を含む細胞を濃縮することが可能である。 別の実施形態では、前記方法はさらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を、培地または宿主細胞から単離することを含む。 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の導入遺伝子を含む、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を発現もしくは誤発現する、細胞または精製した細胞調製物に関する。 前記細胞調製物は、ヒト細胞、または非ヒト細胞（例えば、げっ歯類細胞（例えば、マウスまたはラット細胞）、ウサギ細胞、またはブタ細胞）から成り得る。 いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の細胞は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の導入遺伝子、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の異種形態、例えば、ヒト由来の遺伝子（非ヒト細胞の場合）を含む。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の導入遺伝子は、誤発現（例えば、過剰発現または低発現）され得る。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子を含む細胞は、培養液中で使用することができ、またはマウス、モルモットまたはラット等の動物宿主において（例えば、移植（例えば、腫瘍移植）で）使用することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を含む細胞の宿主内での位置は、腹腔内、皮下であるか、または散在（例えば、血流中への注射後）している場合がある。 他の実施形態では、前記１つまたは複数の細胞は、内在性のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を誤発現する遺伝子（例えば、その発現が混乱（例えば、ノックアウト）されている遺伝子）を含む。 そのような細胞は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の対立遺伝子の誤発現に関連する障害を研究するためのモデルとして、あるいは、薬物スクリーニング（例えば、変異体により付加された低い感受性または耐性を克服するＥ１阻害剤を同定するための薬物スクリーニング）で用いるためのモデルとして、機能し得る。 別の態様では、本発明は、目的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドをコードする核酸で形質転換されたヒト細胞（例えば、造血幹細胞）に関する。 内在性ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体が、その内在性ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子の発現を通常は制御しない制御配列の制御下にある細胞（例えばヒト細胞（例えば、ヒト造血細胞または線維芽細胞））も、提供される。 細胞（例えば、細胞株または微生物）内での内在性遺伝子の発現特徴は、挿入された制御エレメントが内在性ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子に機能的に連結されるように、異種ＤＮＡ制御エレメントをその細胞のゲノムに挿入することによって、改変する事ができる。 例えば、「転写が抑制されている」（例えば、通常に発現していない、または非常に低いレベルでしか発現していない）内在性のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子は、その細胞内で通常発現される遺伝子産物の発現を促進することが可能な制御エレメントを挿入することによって、活性化することができる。 例えば、Ｃｈａｐｐｅｌ、米国特許第５，２７２，０７１号；１９９１年５月１６日に公開されたＷＯ９１／０６６６７に記載されているように、標的相同組換え等の技術を用いることで、異種ＤＮＡを挿入することができる。 遺伝子導入動物 本発明は非ヒト遺伝子導入動物を提供する。 そのような動物は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の機能および／または活性を研究するのに、並びにＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性の調節剤を同定および／または評価するのに、有用である。 本明細書で使用される場合、「遺伝子導入動物」は、非ヒト動物（例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）））であり、その動物の細胞のうちの一つまたは複数は導入遺伝子を含んでいる。 遺伝子導入動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が挙げられる。 導入遺伝子は、遺伝子導入動物の細胞のゲノムへの組込みまたはその中での発生が可能な、外来性ＤＮＡまたは内在性染色体ＤＮＡの再構成（例えば、欠失）物である。 導入遺伝子は、遺伝子導入動物の一つまたは複数の細胞型または組織内でのコードされた遺伝子産物の発現を指示することができ、他の導入遺伝子（例えば、ノックアウト）は発現を低減する。 従って、遺伝子導入動物は、内在性のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子が、内在性遺伝子と、例えば、動物の発生前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外来性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変化している、動物であり得る。 イントロン配列およびポリアデニル化シグナルが導入遺伝子に含まれることで、その導入遺伝子の発現の効率が増加する可能性もある。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の発現を特定の細胞に指示するために、本発明の導入遺伝子に組織特異的制御配列が機能的に連結され得る。 そのゲノム内のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の導入遺伝子の存在、および／または動物の組織もしくは細胞内のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡの発現に基づいて、初代遺伝子導入動物を同定することができる。 その後、初代遺伝子導入動物を用いることで、その導入遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させることができる。 さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードする導入遺伝子を保有する遺伝子導入動物は、他の導入遺伝子を保有する他の遺伝子導入動物にさらに育種することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはポリペプチドは、遺伝子導入型の動物または植物において発現させることができる（例えば、該タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を、動物のゲノムに導入することができる）。 いくつかの実施形態では、核酸は組織特異的プロモーター（例えば、乳または卵に特異的なプロモーター）の制御下に置かれ、その動物により生産された乳または卵から回収される。 適切な動物はマウス、ブタ、雌ウシ、ヤギ、およびヒツジである。 本発明には、例えば、以下に記載されるような、遺伝子導入動物から得られた細胞集団も含まれる。 用途 本明細書に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗体は、以下の方法のうちの一つまたは複数において使用することができる：ａ）スクリーニング検査；ｂ）予測医療（例えば、診断検査、予後検査、モニタリング臨床試験、および薬理遺伝学）；およびｃ）処置方法（例えば、治療的および予防的）。 本発明の単離核酸分子を使用することで、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を発現させることができ（例えば、遺伝子治療応用における宿主細胞中の組み換え発現ベクターを介して）、さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡ（例えば、生物試料中）またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子における遺伝子変化を検出することができ、さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性を調節することができ、以下でさらに記述される。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を使用することで、Ｅ１酵素基質の不充分もしくは過剰な産生、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体阻害物質の産生を特徴とする障害を治療することができる。 さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を使用することで、自然発生的なＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質をスクリーニングすることができ、さらに、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性を調節する薬剤または化合物をスクリーニングすることができ、さらにＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体タンパク質の不充分もしくは過剰な産生、またはＥ１酵素野生型タンパク質と比較して低減した、異常な、もしくは望ましくない活性を有するＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質形態の産生を特徴とする障害を治療することができる（例えば、ＵＢＡ３については、ヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＮＥＤＤ８と結合する能力、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力、ＮＥＤＤ８とチオエステル共有結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＮＥＤＤ８のＥ２へのＳＨ基転移を触媒する能力もしくはＮＡＥ１と結合する能力、または発現）。 さらに、本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体を使用することで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を検出および単離することができ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の生物学的利用能を制御することができ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性を調節することができ、あるいは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の機能または発現に関連する障害を治療することができる。 目的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドと相互作用（例えば、結合）する能力について化合物を評価する方法が提供される。 前記方法には、化合物を目的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドと接触させ；目的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドと相互作用（例えば、結合または複合体形成）する化合物の能力を評価することが含まれる。 この方法は、インビトロ（例えば、無細胞系）、またはインビボ（例えば、ツーハイブリッド相互作用トラップアッセイまたは疾病モデル）で行うことができる。 この方法を使用することで、目的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドと相互作用する自然発生的な分子を同定することができる。 目的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドの天然阻害剤または合成阻害剤を発見するのにも、使用することができる。 スクリーニング法を以下にさらに詳細に記す。 スクリーニング検査 本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質に結合し、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の発現に対する、もしくはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の活性に対する刺激効果もしくは阻害効果を有し、または、例えば、Ｅ１酵素経路（例えば、ＮＡＥ経路）において、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質もしくはタンパク質の発現または活性に対する刺激効果もしくは阻害効果を有する、調節物質、すなわち、候補または試験化合物または薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、小分子または他の薬剤）を同定するための方法（「スクリーニング検査」とも呼ばれる）を提供する。 このように同定された化合物を使用することで、治療プロトコルにおいて、標的遺伝子産物（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子）の活性を調節し、標的遺伝子産物の生物学的機能を詳細に説明し（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子相互作用を撹乱する化合物を同定することができる。 一実施形態では、アッセイによって、ＭＬＮ４９２４よりもより堅固にＵＢＡ３と結合する化合物を同定することができる。 他の実施形態では、アッセイによって、配列番号２のアミノ酸残基１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４からなる群から選択される、配列番号２と異なる少なくとも１つのアミノ酸を有するＵＢＡ３変異体に結合する化合物を同定することができる。 いくつかの実施形態では、アッセイによって、Ｅ１酵素変異体（例えば、変異、例えばアミノ酸置換を有する、例えば本明細書に記載の、Ｅ１酵素）の一つまたは複数の活性を調節する化合物を同定することができる。 いくつかの例としては、Ｅ１酵素変異体（例えば、ＵＢＡ３変異体）の活性は、Ｅ３リガーゼ（例えば、カリン環リガーゼ）の基質の代謝回転を仲介する能力；タンパク質の恒常性に関与する能力；腫瘍細胞生存を支持する能力；ヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ピロリン酸と結合する能力、ＵＢＬと結合する能力、ＵＢＬをアデニル化する能力、ＵＢＬとチオエステル結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＵＢＬをＥ２酵素へとチオール基転移（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｅ）させる能力、またはＥ１酵素阻害剤−ＵＢＬ付加体への結合の堅固さもしくは結合解離速度を測定するアッセイ、であり得る。 ＵＢＡ３変異体の一つまたは複数の活性を調節する化合物を同定することができるアッセイには、ヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＮＥＤＤ８と結合する能力、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力、ＮＥＤＤ８とチオエステル共有結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＮＥＤＤ８のＥ２へのＳＨ基転移を触媒する能力、ＮＡＥ１と結合する能力、カリン環リガーゼの基質の代謝回転を媒介する能力、タンパク質恒常性に関与する能力、および／または腫瘍細胞生存を支持する能力が含まれる。 いくつかの実施形態では、ＵＢＡ３変異体が耐性を有するＥ１酵素阻害剤（例えばＮＡＥ阻害剤（例えばＭＬＮ４９２４））の存在下で活性を有する試験薬剤の存在下でＵＢＡ３変異体の活性の比較が行われ得る。 ＵＢＡ３変異体活性に関するアッセイは、実施例に記載の方法によって行うことができる。 一実施形態では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質もしくはポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分の基質である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。 別の実施形態では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分と結合する、またはその活性を調節する、候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。 本発明の試験化合物は、当該技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのうちのいずれかを用いて得ることができ、該方法としては、生物学的ライブラリー（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが新規の非ペプチド骨格を有する、酵素的分解に抵抗性であるにもかかわらず生理活性を維持している、分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８−８５参照）；空間指定可能な固相または液相並列ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。 生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。 分子ライブラリーの合成法の例は、当該技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＰｒｏＣ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９０：６９０９−１３； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰｒｏＣ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−４２６； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８−８５； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−５１に見出すことができる。 化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ， ＵＳＰ ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ '４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰｒｏＣ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：６３７８−６３８２； Ｆｅｌｉｃｉ （１９９１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０；上記Ｌａｄｎｅｒ）上に存在し得る。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のアッセイは、細胞アッセイであり得る。 細胞アッセイは、Ｅ３リガーゼの基質の代謝回転；タンパク質恒常性の維持；生存腫瘍細胞の数、Ｅ１酵素およびＥ２酵素間の相互作用量、またはＥ１酵素基質によるシグナル伝達量（例えば、チオール基転移した（例えば、ユビキチン化した、ＳＵＭＯ化した、またはＮＥＤＤ化した）タンパク質とＥ３リガーゼとの相互作用により媒介される細胞間情報伝達活性）を測定することができる。 アッセイはインビトロアッセイであり得る。 一実施形態では、アッセイは、ＵＢＡ３変異体タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞が試験化合物と接触させられ、ＵＢＡ３変異体の活性を調節する試験化合物の能力が決定される、細胞アッセイである。 ＵＢＡ３変異体の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、ヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＮＥＤＤ８と結合する能力、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力、ＮＥＤＤ８とチオエステル共有結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＮＥＤＤ８のＥ２へのＳＨ基転移を触媒する能力、ＮＡＥ１と結合する能力、カリン環リガーゼの基質の代謝回転を媒介する能力、タンパク質恒常性に関与する能力、および／または腫瘍細胞生存を支持する能力をモニタリングすることによって、達成することができる。 前記アッセイは、例えば、吸光度もしくは放射性の検出法および定量化法を用いる細胞系において、または反応時間の後に細胞を溶解し、次に細胞含有物をアッセイする系において、行うことができる。 いくつかの実施形態では、ＵＢＡ３変異体が耐性を有するＥ１酵素阻害剤（例えばＮＡＥ阻害剤（例えばＭＬＮ４９２４））の存在下で活性を有する試験薬剤の存在下でＵＢＡ３変異体の活性の比較が行われ得る。 細胞は、例えば哺乳類起源（例えば、ヒト）の細胞であり得る。 他の実施形態では、前記アッセイによって、薬剤耐性の寄生虫細胞（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）におけるＵＢＡ３に構造的または機構的に類似した酵素の変異体を調節する、試験化合物の能力を決定することができる。 化合物、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の基質に結合しているＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体を調節する、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に結合する試験化合物の能力も、評価することができる。 これは、例えば、複合体における標識化合物（例えば、基質）を検出することによってＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体への化合物（例えば、基質）の結合を決定することができるように、化合物（例えば、基質）を放射性同位元素または酵素標識と結合させることによって、達成することができる。 あるいは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を放射性同位元素または酵素標識と結合させることで、複合体においてＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質に結合しているＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を調節する試験化合物の能力をモニターすることができる。 例えば、化合物（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質）は、直接的または間接的に、 １２５ Ｉ、 １４ Ｃ、 ３５ Ｓまたは３ Ｈで標識することができる、放射性同位元素は、電波放出（ｒａｄｉｏｅｍｍｉｓｓｉｏｎ）の直接計数により、またはシンチレーション測定により、検出することができる。 あるいは、化合物は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識することができ、酵素標識は、適切な基質の生成物への変換を決定することにより検出することができる。 相互作用物のいずれかを標識してもしなくても、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体と相互作用する化合物（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の基質）の能力を評価することができる。 例えば、マイクロフィジオメーターを使用することで、化合物またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のいずれをも標識することなく、化合物と、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体との相互作用を検出することができる。 ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２。 本明細書で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光学指定ポテンショメータセンサー（ＬＡＰＳ）を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。 この酸性化速度の変化は、化合物およびＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の間の相互作用の指標として利用することができる。 さらに別の実施形態では、ポリペプチド、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触させられ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力が評価される、無細胞系アッセイが提供される。 いくつかの実施形態では、本発明のアッセイで使用されるＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の生物学的に活性な部分には、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体以外の分子との相互作用に関与する断片（例えば、表面露出率（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）が高い断片）が含まれる。 化合物が、本明細書に記載の、変異（例えばアミノ酸置換）を含むＵＢＡ３変異体またはその生物学的に活性な部分を含むポリペプチドの無細胞アッセイで測定される実施形態において、該アッセイは、ポリペプチドがヌクレオチドと結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＮＥＤＤ８と結合する能力、ＮＥＤＤ８をアデニル化する能力、ＮＥＤＤ８とチオエステル共有結合を形成する能力、Ｅ２酵素と結合する能力、ＮＥＤＤ８のＥ２へのＳＨ基転移を触媒する能力、またはＮＡＥ１と結合する能力を測定することができる。 一実施形態では、無細胞アッセイはピロリン酸交換アッセイである。 別の実施形態では、無細胞アッセイによって、ＵＢＬ−試験化合物、例えば、ＵＢＬ−Ｅ１酵素阻害剤（例えば、ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４、ＮＥＤＤ８−化合物１、ＮＥＤＤ８−アデノシンスルファメート、ユビキチン−ＭＬＮ４９２４、ユビキチン−化合物１、またはユビキチン−アデノシンスルファメート）、変異体ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素上の、およびそれから遊離した付加体の結合動態が分析される。 そのようなアッセイにより、野生型Ｅ１酵素に対するこれらの特徴を試験することもできる。 単離タンパク質（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質、またはその生物学的に活性な部分）の可溶性および／または膜結合型の形態は、本発明の無細胞アッセイで使用することができる。 タンパク質の膜結合型形態が使用される場合、可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。 そのような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴＲＩＴＯＮ （登録商標） Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ （登録商標） Ｘ−１１４、ＴＨＥＳＩＴ （登録商標） 、イソトリデシル（ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙ）ポリ（エチレングリコールエーテル） ｎ 、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ａｍｍｉｎｉｏ）］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ａｍｍｉｎｉｏ）］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸）が挙げられる。 無細胞アッセイは、反応混合物、例えば、標的遺伝子のタンパク質（例えば、変異残基を含む、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体またはその生物学的に活性な部分）および試験化合物の組成物を、その２つの成分に相互作用および結合させて、除去および／または検出可能な複合体を形成させるのに充分な条件下、且つそれに十分な時間をかけて、調製すること、を含む。 ２分子間の相互作用は、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を用いて、検出することもできる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８６８，１０３号）。 第一の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、それが放出した蛍光エネルギーが第二の「アクセプター」分子上の蛍光ラベルによって吸収され、次に、吸収されたエネルギーによって蛍光が発せられるように、選択される。 あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、単純に、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用することができる。 「アクセプター」分子の標識が「ドナー」のそれと区別可能であるように、異なる光波長を放出する標識が選択される。 標識間のエネルギー移動の効率は分子間を隔てる距離に関連しているため、分子間の空間的関係を評価することができる。 結合が分子間で起こる状況において、アッセイでの「アクセプター」分子の標識による蛍光放出は最大となるべきである。 ＦＥＴ結合事象は、都合が良いことに、当該技術分野において周知の標準的な蛍光定量的な検出手段によって（例えば、蛍光光度計を用いて）、測定することができる。 不均一時間分解蛍光（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＨＴＲＦ）アッセイを用いることで、ＵＢＡ３変異体の活性を測定することができる。 ＨＴＲＦアッセイの例およびキナーゼリン酸化アッセイ用にＨＴＲＦアッセイを適合させる方法は、シスバイオ・インターナショナル社（ＣｉｓＢｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（フランス、バニョル・シュル・セズ）の説明書に従って行うことができる。 ＨＴＲＦはキナーゼ反応ステップおよび検出ステップの２ステップを含む放射分析法の代替法である。 反応ステップでは、目的の酵素は基質（例えば、ＡＴＰ）、所望により試験化合物と結合させられる。 検出ステップでは、ユウロピウムクリプテート−標識抗体およびフルオロフォア結合型ストレプトアビジン（例えば、ＳＡ−ＸＬ６６５、シスバイオ・インターナショナル社、フランス）、または抗標識−ＸＬ６６５の溶液が、融合タンパク質へと複合体化する。 その２種の蛍光トレーサーが互いにすぐそばに接近したとき、蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）共鳴エネルギー転移が生じる。 得られるシグナル（例えば、ＸＬ−６６５特異的シグナル）は、キナーゼ基質のリン酸化の量またはレベルに比例する。 ２種のトレーサーからの放出の比率を算出することで、試験化合物干渉とは独立に、測定を行うことができる。 別の実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質が標的分子に結合する能力の決定は、リアルタイム生体分子間相互作用解析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＢＩＡ）を用いて達成することができる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ （１９９１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：６９９−７０５を参照）。 「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、生体分子特異的な相互作用を、リアルタイムで、相互作用物を全く標識することなく、検出する（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。 結合表面における質量の変化（結合事象を示す）は、表面近くの光の屈折率の変化を（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、そしてそれによる検出可能シグナルをもたらし、そのシグナルは生体分子間のリアルタイムな反応を示すものとして用いることができる。 一実施形態では、標的の遺伝子産物または試験物質は固相に固定される。 固相に固定された標的遺伝子産物／試験化合物複合体は反応の終わりに検出することができる。 いくつかの実施形態では、標的遺伝子産物は固体表面に固定することができ、（固定されていない）試験化合物は、直接的または間接的に、本明細書に記載される検出可能な標識で標識することができる。 変異（例えばアミノ酸置換）を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体、その生物学的に活性な部分、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に対する抗体またはその標的分子を固定することが、一方または両方のタンパク質の非複合体形態からの複合体形態の分離を促進するために、およびアッセイの自動化を提供するために、望ましい場合がある。 候補化合物の存在下および非存在下での、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質への試験化合物の結合、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物を容れるのに適したいかなる容器の中でも達成することができる。 そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。 一実施形態では、一方または両方のタンパク質がマトリックスに結合されるのを可能にするドメインを付加する、融合タンパク質が提供され得る。 例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の融合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミズーリ州セントルイス）またはグルタチオン被覆マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次にそれに、試験化合物、または試験化合物、および吸着させていない標的タンパク質、もしくはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質のいずれかを結合させ、複合体形成をもたらす条件下（例えば、生理的条件の塩およびｐＨ）で混合物をインキュベートする。 インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定化し、複合体を直接的または間接的に、例えば上記のように、測定する。 あるいは、複合体はマトリックスから解離させることができ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の結合レベルまたは活性レベルは標準的な技術を用いて決定することができる。 マトリックス上にＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質または標的分子を固定化する他の技術は、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用することを含む。 ビオチン化されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質または標的分子は、当該技術分野において公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、ピアスケミカルズ社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イリノイ州ロックフォード）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（ピアスケミカルズ社）のウェル内に固定することができる。 アッセイを行うために、非固定化成分を固定された成分を含有する被覆表面に加える。 反応完了後、形成した全ての複合体が固体表面上に固定されたまま維持されるような条件下で、未反応成分を除去する（例えば、洗浄により）。 固体表面に固定された複合体の検出は、いくつかの方法で達成することができる。 事前に固定化しない成分が予め標識される場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示すものである。 事前に固定化しない成分が予め標識されない場合、間接的な標識を用いることで表面に固定された複合体を検出することができる：例えば、固定化された成分に特異的または選択的な標識抗体を用いて（抗体は、続いて、直接標識することもでき、または、例えば、標識した抗Ｉｇ抗体で間接的に標識することができる）。 一実施形態では、このアッセイは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質または標的分子に対しては反応性であるが、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質のその標的分子への結合に干渉しない抗体を利用して、行うことができる。 そのような抗体はプレートのウェルに被覆することが可能で、結合していない標的またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質は、抗体結合によってウェルにトラップされる。 そのような複合体を検出する方法は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質がエピトープ標識（例えば、Ｈｉｓ ６タグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｔ７遺伝子１０タグ、Ｖ５タグ、ＨＳＶタグ、およびＶＳＶ−Ｇタグからなる群から選択される異種エピトープ標識）を含む場合に複合体を検出することに加え、ＵＢＡ３変異体タンパク質または標的分子に反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出、およびＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素連結アッセイを含む。 あるいは、無細胞系アッセイを液相で行うことができる。 そのようなアッセイでは、反応産物はいくつかの標準的な技術のいずれかによって未反応成分から分離され、例えば、限定はされないが、分画遠心法（例えば、Ｒｉｖａｓ ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ （１９９３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １８：２８４−７参照）；クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）；電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．参照）；および免疫沈降（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）が挙げられる。 そのような樹脂およびクロマトグラフ法は当業者に公知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ （１９９８） Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １１：１４１−８； Ｈａｇｅ ａｎｄ Ｔｗｅｅｄ （１９９７） Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ． ６９９：４９９−５２５を参照）。 さらに、好都合なことに、蛍光エネルギー移動を本明細書に記載のように利用することで、液体からの複合体のさらなる精製無しに、結合を検出することができる。 一実施形態では、前記アッセイは、例えば、変異（例えばアミノ酸置換）を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはその生物学的に活性な部分を含むポリペプチドを、そのポリペプチドと結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させること、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、並びにＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定すること、を含み、ここで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することには、既知の化合物と比較して、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体もしくはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する、または標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定することが含まれる。 本発明の標的遺伝子産物は、インビボで、一つまたは複数の細胞性または細胞外の高分子（例えばタンパク質（例えばＮＡＥ１、ＵＢＬまたはＥ２酵素））と相互作用し得る。 これを論じることを目的として、そのような細胞性高分子および細胞外高分子を「結合パートナー」と称する。 そのような相互作用を撹乱する、またはＥ１酵素、例えばＮＡＥ経路遺伝子の活性を撹乱する化合物は、活性を調節するのに有用であり得る。 そのような化合物には、限定はされないが、抗体、ペプチド、および小分子等の分子が含まれ得る。 本実施形態で使用するための標的遺伝子／産物は、本明細書で定義されるＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子であり得る。 別の実施形態では、本発明は、Ｅ１酵素の下流エフェクター（例えばＵＢＡ３変異体の標的分子）の活性、例えばＥ３酵素（例えばカリン環リガーゼ）の活性の調節を介して、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の活性を調節する試験化合物の能力を決定するための方法を提供する。 例えば、適切な標的に対するエフェクター分子の活性は以前に報告された通りに決定することができ、あるいは、適切な標的へのエフェクターの結合性は以前に報告された通りに決定することができる。 標的遺伝子産物およびその細胞性または細胞外結合パートナー間の相互作用に干渉する化合物を同定するために、標的遺伝子産物および結合パートナーを含有する反応混合物が、２つの産物が複合体を形成するのに充分な条件下で、およびそれに十分な時間をかけて、調製される。 阻害剤を試験するために、試験化合物の存在下および非存在下に、反応混合物が与えられる。 試験化合物は、最初に反応混合物中に含まれ得るか、または標的遺伝子およびその細胞性または細胞外の結合パートナーの添加の後の時点で添加され得る。 対照反応混合物は、試験化合物無しで、またはプラセボと共にインキュベートされる。 標的遺伝子産物および細胞性または細胞外結合パートナー間のあらゆる複合体の形成が、その後検出される。 試験化合物を含有する反応混合物中ではなく、対照反応において複合体が形成されることは、化合物が、標的遺伝子産物および相互作用的結合パートナーの相互作用に干渉することを示すものである。 さらに、試験化合物および正常な標的遺伝子産物を含有する反応混合物内での複合体形成は、試験化合物および変異型標的遺伝子産物を含有する反応混合物内での複合体形成と比較することもできる。 この比較は、正常な標的遺伝子産物ではなく変異型の相互作用を撹乱する化合物を同定することが望ましい場合に、重要となり得る。 これらのアッセイは、不均一または均一な形式で行うことができる。 不均一系アッセイは、固相上に標的遺伝子産物または結合パートナーを固定すること、および反応の終わりに固相に固定された複合体を検出すること、を含む。 均一系アッセイでは、全体の反応は液相において行われる。 いずれのアプローチにおいても、反応物を添加する順番を変えることで、試験している化合物についての異なる情報を得ることができる。 例えば、標的遺伝子、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の産物、および基質または結合パートナーの間の相互作用に（例えば、競合によって）干渉する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことで同定することができる。 あるいは、事前形成された複合体を撹乱する試験化合物、例えば、複合体から成分の１つを置換するより高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に添加することにより、試験することができる。 種々の型について、以下に簡潔に記載する。 不均一系アッセイ系において、標的遺伝子産物または相互作用的な細胞性もしくは細胞外の結合パートナーは固体表面（例えば、マイクロタイタープレート）上に固定され、固定されない種が直接的または間接的に標識される。 固定される種は非共有結合または共有結合によって固定化することができる。 あるいは、固定すべき種に対し特異的または選択的な固定化抗体を使用することで、固体表面にその種を固定することができる。 前記アッセイを行うために、固定化された種のパートナーは、試験化合物有りまたは無しで、被覆表面に曝される。 反応が完了した後、未反応成分を除去すると（例えば、洗浄により）、形成されたあらゆる複合体は固体表面に固定されたままとなる。 非固定種が事前標識されている場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示すものである。 非固定種が事前標識されていない場合、間接標識を用いることで、表面上に固定された複合体を検出することができる；例えば、最初の非固定種に対し特異的または選択的な標識抗体（抗体は次に、例えば標識化抗Ｉｇ抗体で、直接標識または間接標識することができる）を用いて。 反応成分の添加の順番により、複合体形成を阻害する、または事前形成された複合体を撹乱する試験化合物を検出することができる。 あるいは、反応を試験化合物の存在下または非存在下で液相で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離することができ、複合体を検出することができる；例えば、結合成分の１つに対し特異的または選択的な固定化された抗体を用いて、液中に形成されたあらゆる複合体を繋留し、他方のパートナーに対し特異的または選択的な標識抗体を用いて、繋留された複合体を検出する。 再度、液相への反応物の添加の順番により、複合体を阻害する、または事前形成された複合体を撹乱する試験化合物を同定することができる。 本発明の別の実施形態では、均一系アッセイを使用することができる。 例えば、標的遺伝子産物および相互作用的細胞性または細胞外結合パートナー産物の事前形成複合体が調製され、その中で、標的遺伝子産物またはそれらの結合パートナーのいずれかが標識されているが、標識により生成されたシグナルは複合体形成によりクエンチされる（例えば、イムノアッセイにこのアプローチを利用している米国特許第４，１０９，４９６号を参照）。 事前形成複合体からの種の１つと競合し置き換わる試験物質を添加することにより、バックグラウンドを超えるシグナルの生成がもたらされる。 このように、標的遺伝子産物−結合パートナー相互作用を撹乱する試験物質を同定することができる。 さらに別の態様では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」として使用することで（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体と結合または相互作用し（「ＵＢＡ３−結合タンパク質」、「ＵＡＥ−結合タンパク質」、または「ＵＢＡ６−結合タンパク質」、または他の「Ｅ１酵素変異体−結合タンパク質」または「ＵＢＡ３−ｂｐ」、「ＵＡＥ−ｂｐ」、「ＵＢＡ６−ｂｐ」、または他の「Ｅ１酵素変異体−ｂｐ」）、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性に関与する、他のタンパク質を同定することができる。 そのようなＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体−ｂｐは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質、または例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体が仲介するシグナル経路の下流要素としてのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の標的によるシグナルの活性化剤または阻害剤であり得る。 ツーハイブリッド法は、分離可能ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインから成る、大部分の転写因子のモジュール的な性質に基づいている。 簡潔には、前記アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。 一方の構築物において、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。 もう一方の構築物において、未同定タンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーから得られたＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。 （あるいは：ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質が、活性化ドメインに融合され得る。）「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＵＢＡ３変異体依存性複合体を形成可能であるならば、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインはかなり近接することになる。 この近接により、転写因子に反応性の転写制御部位に機能的に連結する、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）の転写が可能となる。 レポーター遺伝子の発現は検出することが可能でり、機能的転写因子を含有する細胞群体を単離し用いることで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。 別の実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現の調節物質が同定される。 例えば、細胞混合物または無細胞混合物が候補化合物と接触させられ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物非存在下のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較して、評価される。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、その非存在下においてよりも、候補化合物の存在下でより大きい場合、その候補化合物は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質であると同定される。 あるいは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、その非存在下においてよりも、候補化合物の存在下でより少ない（統計的に有意に少ない）場合、その候補化合物はＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤であると同定される。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法により、決定することができる。 調節は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸の阻害による、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸と結合することによる、直接的な調節であり得る。 そのような実施形態では、調節物質はアンチセンス核酸、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡであり得る。 本発明には、第一に細胞を試験化合物と接触させ、次に、化合物に暴露した細胞における耐性配列（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体）の発現を、化合物に暴露していない対照細胞における耐性配列の発現に対して、測定および比較することによる、細胞の薬剤耐性を調節する化合物を同定する方法も含まれる。 化合物に曝された細胞中の耐性配列の発現レベルが、化合物に曝されていない細胞中の耐性配列の発現レベルと異なる場合、化合物は薬剤耐性の調節物質として同定される。 本方法の一実施形態では、細胞は薬剤耐性表現型を有する。 別の実施形態では、細胞は哺乳類細胞（例えば、腫瘍細胞）である。 別の実施形態では、細胞は寄生生物の細胞、またはそれ由来の細胞である。 本方法は、同定された薬剤耐性調節物質の存在下で細胞の薬剤耐性を測定する任意のステップを含んでいてもよい。 上記方法において同定された耐性を調節する化合物も本発明の範囲内に含まれる。 本発明は、ａ）試験化合物存在下での細胞内の耐性配列（例えば、内在性または異種のＵＢＡ３、ＵＡＥ、ＵＢＡ６または他のＥ１酵素遺伝子にコードされる耐性タンパク質）の発現レベルを測定し；ｂ）試験化合物非存在下での細胞内の耐性配列の発現レベルを測定し；ｃ）試験化合物存在下での細胞内の耐性配列の発現レベルが試験化合物非存在下での細胞内の耐性配列の発現レベルと異なる場合に、化合物を細胞の薬剤耐性の調節物質として特定することを含む、試験化合物が細胞の薬剤耐性を調節するかどうかを決定するための方法に関する。 別の態様では、本発明は、本明細書に記載のアッセイの２つ以上の組み合わせに関する。 例えば、調節物質は細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイを用いて同定することができ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の活性を調節する薬剤の能力は、インビボで、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸またはタンパク質を含む、または生成可能な腫瘍の異種移植片を有する免疫無防備状態のげっ歯類等の動物において、確認することができる。 別の例では、調節物質は、Ｅ１酵素阻害剤（例えば、ＮＡＥ阻害剤）に抵抗性の生物による病原性感染モデルを用いて同定することができる。 本態様に関連して、本発明は、ａ）耐性タンパク質（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体、または少なくとも１つのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の活性を遂行するその部分を含む組成物を、試験化合物の存在下でインキュベートし；ｂ）試験化合物が耐性タンパク質に結合するかどうかを決定し；ｃ）耐性タンパク質に結合する試験化合物を選択し；ｄ）薬剤耐性細胞を有する非ヒト哺乳動物にステップｃ）で選択した試験化合物を投与し；ｅ）試験化合物が非ヒト哺乳動物の細胞の薬剤耐性を調節するかどうかを決定し；ｆ）化合物がステップｅ）において細胞の薬剤耐性を調節する場合、試験化合物を細胞の薬剤耐性の調節物質として同定すること、を含む、試験化合物が細胞の薬剤耐性を調節するかどうかを決定するための方法に関する。 本発明はさらに、ａ）試験細胞内での耐性配列の発現を測定し；ｂ）ステップａ）で測定された耐性配列の発現を、薬剤耐性表現型を有さない対照細胞内での耐性配列の発現に対して比較し；ｃ）耐性配列が上方制御された配列であるとき、試験細胞内での耐性配列の発現が対照細胞内での耐性配列の発現よりも大きい場合に、試験細胞が薬剤耐性表現型を有することを決定すること、を含む、試験細胞（例えば、生物試料から得た細胞）が薬剤耐性表現型を有するかどうかを決定するための方法に関する。 本発明の本態様の別の実施形態では、耐性配列が下方制御された配列であるとき、試験細胞内での耐性配列の発現が対照細胞内での耐性配列の発現よりも低い場合に、ステップ（ｃ）の試験細胞は、薬剤耐性表現型を有し得る。 別の態様では、本発明は、ａ）試験細胞内での耐性配列の活性を測定し；ｂ）ステップａ）で測定された耐性配列の活性を、薬剤耐性表現型を有さない対照細胞内での耐性配列の活性に対して比較し；ｃ）耐性配列が上方制御された配列であるとき、試験細胞内での耐性配列の活性が対照細胞内での耐性配列の活性よりも大きい場合に、試験細胞が薬剤耐性表現型を有することを決定すること、を含む、試験細胞（例えば、生物試料から得た細胞）が薬剤耐性表現型を有するかどうかを決定するための方法に関する。 別の実施形態では、耐性配列が下方制御された配列であるとき、試験細胞内での耐性配列の活性が対照細胞内での耐性配列の活性より低い場合に、ステップ（ｃ）の試験細胞は、薬剤耐性表現型を有する。 本発明はさらに、前述のスクリーニング検査で同定される新規の薬剤に関する。 従って、さらに、本明細書に記載の通りに同定した薬剤（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の調節薬、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のアンチセンス核酸分子、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に特異的な抗体、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の結合パートナー）を適切な動物モデルで使用して、そのような薬剤を用いた処置の効能、毒性、副作用、または作用機序を決定することが、本発明の範囲内である。 さらに、前述のスクリーニング検査で同定される新規薬剤は、本明細書に記載の処置に使用することができる。 検出アッセイ 本発明のさらなる態様は、生物試料中のＵＢＡ３変異体の存在を検出するための方法；並びに／または生物試料中に存在するＵＢＡ３変異体によるＥ１酵素阻害剤（例えば、ＮＡＥ阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４））への耐性を検出するための方法；並びに／または配列番号１のヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される一つまたは複数の塩基において配列番号１と異なっている、生物試料中のＵＢＡ３変異体の核酸の存在を検出するための方法である。 他の実施形態では、アッセイによって、アミノ酸５８０において配列番号２９と異なっているＵＡＥ変異体の存在、またはアミノ酸５７３において配列番号３２と異なっているＵＢＡ６変異体の存在を検出することができる。 本明細書で同定される核酸配列の部分または断片は、ポリヌクレオチド試薬として使用することができる。 例えば、これらの配列を使用することで、（ｉ）それらの各遺伝子を染色体上にマッピングして、例えば、遺伝病に関連する遺伝子領域を位置付ける、あるいはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を疾患と関連付けることができ；（ｉｉ）微小生物試料から個体を同定することができ（組織適合試験）；（ｉｉｉ）生物試料の法鑑定に役立つことができる。 これらの応用は以下の小節に記載される。 組織適合試験 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列を使用することで、例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を用いて、生物試料から個体を同定することができる。 この技術では、個体のゲノムＤＮＡが一つまたは複数の制限酵素で消化され、断片が、例えばサザンブロットで分離され、プローブされることにより、同定のためのバンドが得られる。 本発明の配列は、ＲＦＬＰに対するさらなるＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５，２７２，０５７号に記載）。 さらに、本発明の配列を用いることで、個体のゲノムの選択された部分の実際の一塩基毎のＤＮＡ配列を決定することもできる。 従って、本明細書に記載のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のヌクレオチド配列を用いることで、配列の５'末端および３'末端から２つのＰＣＲプライマーを作製することができる。 次に、これらのプライマーを用いることで、個体のＤＮＡを増幅し、その後それを配列決定することができる。 このようにして作製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、対立遺伝子の差異により各個体は一連のそのような独特なＤＮＡ配列を有するために、独特な個体同定法を提供し得る。 対立遺伝子変化は、これらの配列のコード領域にはある程度生じ、非コード領域にはより高頻度に生じる。 本明細書に記載の各配列は、個体から得られたどのＤＮＡが同定のために比較できるかに対する基準として、ある程度、使用することができる。 より多い数の多形が非コード領域に生じるので、個体を区別するのに必要な配列はより少ない。 配列番号１の非コード配列は、確実な個体同定（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に、１００塩基の非コード増幅配列をそれぞれ与える、おそらくは１０〜１，０００のプライマーのパネルを提供し得る。 予測されたコード配列が使用される場合、確実な個体同定のためのより多くの適切な数のプライマーは、５００〜２，０００となるであるだろう。 本明細書に記載のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のヌクレオチド配列から得られた試薬のパネルが、個体に対する独特な同定データベースを作製するのに使用される場合、後にそれらの同じ試薬を用いることで、その個体由来の組織を同定することができる。 独特な同定データベースを用いて、個体の確実な同定を、生死にかかわらず、非常に小さな組織試料から行うことができる。 予測医療 本発明は、診断検査、予後検査、およびモニタリング臨床試験を予後の（予測的な）目的に用いることにより個体を治療する、予測医療の分野にも関する。 細胞の耐性配列の、発現、特に望ましくない発現を評価する方法は有用である。 望ましくない発現（例えば、上方制御された配列の発現増加または下方制御された配列の発現減少）は、個体の組織における薬剤耐性（例えば、Ｅ１酵素阻害剤、例えば、ＮＡＥ阻害剤、例えば、１−メチルスルファメート、例えば、ＭＬＮ４９２４に対する耐性）腫瘍細胞の存在、持続または再出現を示す場合がある。 より一般的には、異常な発現は、耐性配列の発現が寄与する、有害なまたは疾患関連性の表現型の発生を示す場合がある。 一般的に、本発明は、対象が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体をコードする遺伝子における傷害またはその誤発現に関連する障害のリスクを有するかどうかを決定する方法を提供する。 そのような障害には、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子の誤発現に関連する障害；細胞増殖性障害および／または分化性障害、感染（例えば、寄生虫感染）、免疫性（例えば、炎症性）障害または神経変性障害が含まれる。 さらに別の態様では、本発明は、ａ）対象から得た（例えば、ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子を用いて）生物試料中の、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の発現を測定し；ｂ）ステップａ）で測定されたｍＲＮＡの発現を、薬剤耐性腫瘍を有さない対照対象から得られた生物試料中のｍＲＮＡの発現（例えば、野生型のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の発現）と比較し；ｃ）患者から得られた生物試料中のｍＲＮＡの発現が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡが上方制御された配列である場合の対照対象から得られた生物試料中のｍＲＮＡの発現よりも高い場合に、患者が薬剤耐性腫瘍を有するかまたはそれを発達させる危険性があると決定することを含む、対象が薬剤耐性腫瘍を有するかどうかまたはそれを発達させる危険性があるかどうかを決定するための方法に関する。 別の実施形態では、患者から得られた生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡの発現が、ｍＲＮＡが下方制御された配列である場合の対照対象から得られた生物試料中のｍＲＮＡの発現よりも低い場合に、患者は薬剤耐性腫瘍を有するかまたはそれを発達させる危険性がある。 さらに別の態様では、本発明は、ａ）対象から得られた（例えば、ＮＡＥβ変異体タンパク質に結合する薬剤を用いて）生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の活性を測定し；ｂ）ステップａ）で測定されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性を、薬剤耐性腫瘍を有さない対照対象から得られた生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の野生型配列の発現と比較し；ｃ）患者から得られた生物試料中の耐性配列の活性が、耐性配列が上方制御された配列である場合の対照対象から得られた生物試料中の耐性配列の活性よりも高い場合に、患者が薬剤耐性腫瘍を有するかまたはそれを発達させる危険性があると決定することを含む、対象が薬剤耐性腫瘍を有するかどうかまたはそれを発達させる危険性があるかどうかを決定するための方法に関する。 別の実施形態では、患者から得られた生物試料中の耐性配列の活性が、耐性配列が下方制御された配列であるときの対照対象から得られた生物試料中の耐性配列の活性よりも低い場合、患者は薬剤耐性腫瘍を有するかまたはそれを発達させる危険性がある。 本方法には以下のうちの一つまたは複数が含まれる： 対象の組織内で、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子の発現に影響を与える変異の有無を検出すること、または遺伝子の発現を制御する領域内での変異（例えば、５'制御領域における変異）の有無を検出すること； 対象の組織内で、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素遺伝子の構造を変化させる変異の有無を検出すること； 対象の組織内で、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子の誤発現をｍＲＮＡレベルで検出すること、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡの非野生型レベルを検出すること； 対象の組織内で、遺伝子の誤発現をタンパク質レベルで検出すること、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリペプチドの非野生型レベルを検出すること。 生物試料中の耐性配列の有無を検出するための方法の一例は、試験対象から生物試料を得て（患部組織または悪性組織の可能性診断に関わる身体部位等から）、生物試料を、耐性配列（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ポリペプチド）を検出することができる化合物または薬剤と接触させることで、耐性配列の存在を生物試料中で検出すること、を含む。 耐性配列の存在および／または相対的存在量（例えば、正常組織または同型の非薬剤耐性腫瘍と比較）は、細胞性耐性遺伝子の異常なまたは望ましくない発現を示し、薬剤耐性表現型を有する細胞のインサイツでの出現と関連がある。 いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１のＵＢＡ３遺伝子内のヌクレオチド間に以下の変化のうちの少なくとも１つが存在することを確認することを含む：ＵＢＡ３遺伝子からの一つまたは複数のヌクレオチドの欠失；該遺伝子への一つまたは複数のヌクレオチドの挿入；該遺伝子の一つまたは複数のヌクレオチドの点変異（例えば、置換）；該遺伝子の大規模染色体再編（例えば、転座または逆位）；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変化；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子の異常な修飾（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの修飾）；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の非野生型レベル；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素の野生型遺伝子の対立遺伝子欠失、並びに１０）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の不適切な翻訳後修飾。 いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１のヌクレオチド５３１、５３２、５３３、６２１、６２２、６２３、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６４５、６４６、６４７、６５１、６５２、６５３、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７６５、７６６、７６７、９３３、９３４、９３５、９５１、９５２、９５３、９６０、９６１、９６２、９８９、９９０、および９９１からなる群から選択される一つまたは複数の塩基において配列番号１と異なるＵＢＡ３変異体の核酸を検出することを含む。 例えば、遺伝子損傷の検出は、以下を含み得る：（ｉ）配列番号１由来のセンス配列もしくはアンチセンス配列、またはその自然発生的な変異体、またはＵＢＡ３変異体遺伝子に天然に付随している５'もしくは３'フランキング配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有するオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供すること、；（ｉｉ）そのプローブ／プライマーを組織の核酸に曝し；核酸へのプローブ／プライマーのハイブリダイゼーション（例えば、インサイツハイブリダイゼーション）によって、遺伝子損傷の有無を検出すること。 ＵＢＡ３変異体の核酸を検出することができる試薬の例は、実施例に見出すことができる。 いくつかの実施形態では、誤発現の検出は、以下のうちの少なくとも１つの存在を確認することを含む：ＵＢＡ３変異体遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変化；該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；またはＵＢＡ３変異体の非野生型レベル。 本発明の方法は出生前に用いることができ、または対象の子孫が障害のリスクを有しているかどうかを決定するのに用いることができる。 いくつかの実施形態では、本方法は、障害のリスクを示す異常構造である、ＵＢＡ３変異体遺伝子の構造を決定することを含む。 いくつかの実施形態では、本方法は、対象から得た試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に対する抗体と接触させることを含む。 他の実施形態では、本方法は、対象から得た試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズする核酸と接触させることを含む。 これらおよび他の実施形態は以下で考察される。 診断アッセイおよび予後アッセイ がん治療に関連して、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列の発現レベルは、１）がん、特に薬剤耐性のがんが、薬剤または薬剤の組み合わせによって治療可能であるかどうかを決定するために；２）がんが薬剤または薬剤の組み合わせによる治療に応答しているかどうかを決定するために；３）がんを治療するための適切な薬剤または薬剤の組み合わせを選択するために；４）進行中の治療の有効性をモニターするために；および５）新規がん治療（単剤または薬剤の組み合わせ）を特定するために、使用してもよい。 具体的には、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列は、適切な治療を決定するために、効能について試験されている薬剤の臨床治療およびヒト治験をモニターするために、並びに新規の薬剤および併用療法を開発する際に、マーカー（代替マーカーおよび／または直接マーカー）として使用してもよい。 従って、本発明は、ａ）がん細胞の試料を得て；ｂ）がん細胞内での耐性配列の発現レベルを決定し；ｃ）耐性配列が薬剤耐性に関連しないレベルで発現されている場合に薬剤が有効であると同定する（例えば、上方制御された耐性配列は発現されないか、または非薬剤耐性のがん細胞と比較して比較的低いレベルで発現され；下方制御された耐性配列は比較的高いレベルで発現され得る）ステップを含む、薬剤（例えば化学療法剤、例えばＥ１酵素阻害剤、例えばＮＡＥ阻害剤、例えば１−メチルスルファメート、例えばＭＬＮ４９２４）が、がん細胞の成長速度を遅めるのに有効であるかどうかを決定するための方法を提供する。 あるいは、ステップ（ｃ）において、薬剤は、耐性配列がその薬剤への耐性に関連するレベルで発現されてる場合に、がんを治療するのに比較的に無効であると同定され得る（例えば、非薬剤耐性細胞と比較して比較的高いレベルに上方制御された耐性配列、または下方制御された耐性配列は比較的低いレベルで発現され得る）。 本明細書で使用される場合、薬剤は、がん細胞の成長を少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９５％低減することができる場合に、がん細胞の成長速度を低減していると言われる。 そのような阻害は、生存能における低減およびがん細胞の死の割合における増加をさらに含み得る。 この決定に使用される薬剤の量は、選択される薬剤に応じて変化する。 典型的には、量は所定の治療量である。 生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質または核酸の存在、レベル、または不在は、試験対象から生物試料を得て、生物試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することが可能な化合物または薬剤と接触させ、それによって、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質または核酸の存在を生物試料中で検出することにより、評価することができる。 「生物試料」という用語には、対象から分離された組織、細胞および生体液、並びに対象内に存在する組織、細胞および体液が含まれる。 一実施形態では、生物試料は試験対象由来のタンパク質分子を含有する。 あるいは、生物試料は試験対象由来のｍＲＮＡ分子または試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。 生物試料は対象から常法により分離された末梢血白血球試料であり得る。 生物試料は血清であり得る。 生物試料は腫瘍試料であり得る。 生物試料は対象から取得されたリンパ球、感染細胞または寄生虫を含み得る。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子の発現レベルはいくつかの方法で測定することができ、例えば、限定はされないが、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子にコードされるｍＲＮＡを測定すること；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子にコードされるタンパク質の量を測定すること；またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することによるものである。 別の実施形態では、本方法はさらに、対照対象または試験対象の非患部から対照生物試料を得て、対照試料を、耐性のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出することが可能な化合物または薬剤と接触させることで、耐性タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物試料中で検出し、対照試料中の耐性タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中の耐性タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較すること、を含む。 別の実施形態では、本方法はさらに、対照試料をＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出することが可能な化合物または薬剤と接触させ、対照試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較すること、を含む。 細胞内のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子に対応するｍＲＮＡのレベルは、インサイツおよびインビトロの両方の形式で決定することができる。 単離されたｍＲＮＡは、サザン解析またはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイを含むがこれらに限定はされない、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイに使用することができる。 ｍＲＮＡレベルを検出するための１つの診断法は、単離されたｍＲＮＡを、検出されている遺伝子にコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。 核酸プローブは、例えば、完全長のＵＢＡ３変異体核酸、例えば、配列番号１の核酸、またはその一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００のヌクレオチド長の、ストリンジェントな条件下でＵＢＡ３変異体のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに充分な、オリゴヌクレオチドであり得る。 診断検査での使用に適した他のプローブは、本明細書に、例えば実施例に、記載されている。 １つの型式において、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）は、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ｍＲＮＡをゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース）に転写することによって、表面に固定され、プローブと接触させられる。 別の型式において、例えば、二次元 遺伝子チップアレイでは、プローブが表面に固定され、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）がプローブと接触させられる。 当業者は、公知のｍＲＮＡ検出法を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子にコードされるｍＲＮＡのレベルを検出するのに使用するために適合させることができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の１つにコードされる試料中のｍＲＮＡのレベルは、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ （１９８７）、米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） ＰｒｏＣ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自立的（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，８５４，０３３号）またはあらゆる他の核酸増幅法による核酸増幅、続いて当該技術分野において公知の技術を用いた増幅された分子の検出によって、評価することができる。 本明細書で使用される場合、増幅プライマーは、遺伝子の５'領域または３'領域（それぞれ、プラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）にアニールすることができ、間に短い領域を含有する、一対の核酸分子であると定義される。 一般的に、増幅プライマーは約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域の横に位置する。 適切な条件下で、且つ適切な試薬を用いて、そのようなプライマーは、プライマーに隣接されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を増幅させる。 インサイツ法において、細胞または組織試料は、調製／処理され、担体、典型的にはスライドガラス上に固定され、次に、解析されているＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させられ得る。 「物理的検出法」は、本明細書では、先の、一つまたは複数のヌクレオチド配列多形性を含む標的ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅は除外されないが、検出のために一つまたは複数の物理的プロセスを必要とする、ヌクレオチド配列の多形性の検出法を意味する。 物理的プロセスの例としては、電気泳動、クロマトグラフィー、分光測定（ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、光シグナル感知および分光法（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が挙げられる。 様々な方法を用いて、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体にコードされるタンパク質のレベルを決定することができる。 一般的に、これらの方法は、タンパク質に選択的に結合する薬剤（例えば、抗体）を試料と接触させて、試料中のタンパク質のレベルを評価することを含む。 一実施形態では、抗体は検出可能な標識を有する。 「標識された」という用語は、プローブまたは抗体に関連して、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合（すなわち、物理的に連結）させることによるプローブまたは抗体の直接標識、および検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することが意図される。 検出可能な物質の例が本明細書に記載されている。 検出法を用いることで、インビトロの生物試料中およびインビボで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を検出することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を検出するためのインビトロ法には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット解析が含まれる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を検出するためのインビボ法は、対象にＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する標識抗体を導入することを含む。 例えば、抗体は、標準的な画像処理技術により対象内でのその存在および位置を検出することができる放射性マーカーで、標識することができる。 これらの方法に使用することができる抗体は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素におけるアミノ酸変異（例えば、置換）と選択的に結合することができる。 例えば、抗体は、変異した（例えば、置換された）残基を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素は認識し、野生型残基を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素のポリペプチドは認識しないだろう。 いくつかの実施形態では、これらの方法で使用するための抗体は、例えば、配列番号２の１７１、２０１、２０４、２０５、２０９、２１１、２２８、２２９、２４９、３０５、３１１、３１４および３２４における残基と等しくないアミノ酸残基からなる群から選択される、野生型ＵＢＡ３からの変異を含むＵＢＡ３変異体タンパク質と結合することができる 別の実施形態では、本方法はさらに、対照試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質を検出することが可能な化合物または薬剤と接触させ、対照試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の存在を、試験試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質の存在と比較すること、を含む。 本発明には、生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の存在を検出するためのキットも含まれる。 そのようなキットを使用することで、対象が、耐性の異常な発現と関連する障害（例えば、薬剤耐性のがんの存在）に罹患しているかどうか、またはそれを発症するリスクが増加しているかどうかを決定することができる。 例えば、キットは、生物試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはｍＲＮＡを検出することが可能な化合物または薬剤を含み得；耐性配列の量を決定するための手段は、正常レベル（例えば、標準）より高いか、またはそれより低いということである。 化合物または薬剤は適切な容器内にパッケージングすることができる。 キットはさらに、キットを使用してＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質または核酸を検出するための説明書を含み得る。 抗体をベースとしたキットにおいて、キットは、（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合する一次抗体（例えば、固相に付着した）；および、所望により、（２）ポリペプチドまたは一次抗体に結合する、検出可能な薬剤と複合体化している様々な二次抗体を含み得る。 さらに別の実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体は表現型的に検出することができる、すなわち、前記ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体は、野生型残基を含むＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体と共有されない、独特なＥ１阻害剤感受性パターンを示し得る。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の表現型検出には、例えば、Ｅ１酵素阻害剤のパネルに対する、生物試料中に存在する野生型のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素からのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性の感受性を決定するステップが含まれる。 オリゴヌクレオチドをベースとしたキットにおいて、キットは、（１）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド、例えば、検出可能なように標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に対応する核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含み得る。 キットは、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤も含み得る。 キットは、検出可能な薬剤（例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な構成要素も含み得る。 キットは、アッセイすることができ、含有される試験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料も含有し得る。 キットの各構成要素は個々の容器内に封入することができ、それらの種々の容器は全て、キットを用いて行われたアッセイの結果を解釈するための説明書と一緒に、１つのパッケージ内に含むことができる。 さらに、前記１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが固相に付着または固定された、前記オリゴヌクレオチドをベースとしたキットが具現化される。 それに対する他の実施形態は、ａ． 前記生物試料中に存在する標的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のポリ核酸を得るための手段および／またはそのヌクレオチド配列を得るための手段；ｂ． 適切な場合、本発明の標的のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のポリ核酸を増幅するのに適した、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対；ｃ． 適切な場合、核酸を変性するための手段；ｄ． 適切な場合、少なくとも１つの本発明のオリゴヌクレオチド；ｅ． 適切な場合、二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子を修飾することが可能な酵素；ｆ． 適切な場合、ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を作製するのに必要な成分；ｇ． 適切な場合、洗浄液、または前記溶液を作製するのに必要な成分；ｈ． 適切な場合、部分的もしくは完全に変性したポリ核酸を検出するための手段、および／または前述のハイブリダイゼーションで形成されたハイブリッドを検出するための手段、および／または核酸の酵素による修飾を検出するための手段；ｉ． 適切な場合、オリゴヌクレオチドを固相の既知の位置に付着させるための手段；ｊ． 全て（ｈ）で検出された、部分的もしくは完全に編成したポリ核酸から、および／またはハイブリッドから、および／または酵素による修飾から、並びに／または（ａ）で得られたヌクレオチド配列から、前記生物試料中の前記ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の存在を推量するための手段を含む、前記キットを含む。 一般的に、変異した（例えば、置換された）アミノ酸Ｘ（Ｘは表示されるアミノ酸である）をコードする変異体の配列中のヌクレオチドＹ（Ｙは表示される番号である）における変異（例えば置換）の存在を核酸配列から推論することは、（ｉ）変異した（例えば、置換された）ヌクレオチドＹを含むコドンの前記核酸配列中での位置を突きとめ、（ｉｉ）変異した（例えば、置換された）ヌクレオチドＹを含む前記コドンをそのコドンにコードされるアミノ酸に翻訳し、（ｉｉｉ）変異した（例えば、置換された）ヌクレオチドＹを含む前記コドンにコードされるアミノ酸が、前記アミノ酸Ｘをコードするコドンと同一であるかまたは異なるかどうかを、（ｉｉ）から結論するための、いかなる技術または方法をも意味する。 前記技術には、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全てが手動でおよび／またはコンピューターにより実行される方法が含まれ得る。 前記技術には、データベース内に含まれる得られた核酸配列の一連の核酸配列とのアラインメントおよび／または比較が含まれていてもよい。 前記技術にはさらに、紙形態である、電子形態である、またはコンピューター可読の担体もしくは媒体上に存在するレポートの形態で存在している、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の結果が含まれていてもよい。 前記技術にはさらに、（核酸および／またはアミノ酸）配列データベースの検索、および／または（核酸および／またはアミノ酸）配列アラインメントの作成が含まれていてもよく、その結果は前記レポートに含まれていても含まれていなくてもよい。 本明細書に記載の診断法は、誤発現されたまたは異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性に関連する疾患または障害を有する、またはそれを発症する危険性がある対象を特定することができる。 本明細書で使用される場合、「望まれない」という用語には、疼痛または制御されない細胞増殖等の生物学的反応に関わる望まれない現象が含まれる。 一実施形態は、異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性に関連する疾患または障害（例えば、Ｅ１酵素阻害剤への耐性）の同定を含む。 試験試料を対象から得て、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を評価するが、ここでＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質または核酸のレベル（例えば、有無）は、異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性に関連する疾患または障害を有する、またはそれを発症する危険性がある対象を診断するものである。 本明細書で使用される場合、「試験試料」とは、生体液（例えば、血清）、細胞試料（例えば、腫瘍細胞を含む試料）、または組織を含む、目的の対象から得られた生物試料を指す。 本明細書に記載の予後検査を利用することで、対象に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補）を投与して、異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性に関連する疾患または障害を治療することが可能であるかどうかを決定することができる。 例えば、そのような方法を用いることで、対象がＥ１酵素阻害剤によって効果的に治療され得るかどうかを決定することができる。 変化は、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、アンカーＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒ ＰＣＲ）またはＲＡＣＥ ＰＣＲ）において、または、ライゲーション連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）において、プローブ／プライマー無しで検出することができ、後者は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子において点変異を検出するのに特に有用であり得る。 この方法は、対象から細胞の試料を収集するステップ、その試料から核酸（例えば、ゲノム核酸、ｍＲＮＡまたは両方）を単離するステップ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が（仮に存在すれば）生じるような条件下で、その核酸試料を、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたは複数のプライマーと接触させるステップ、並びに増幅産物の有無を検出するステップ、または増幅産物のサイズを検出するステップ、および長さを対照試料と比較するステップが含まれ得る。 ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載の変異の検出に使用される技術のいずれかと組み合わせて、予備的な増幅ステップとして使用されることが望ましい場合があることが予測される。 あるいは、本明細書に記載の、または当該技術分野において公知の他の増幅法を用いることができる。 別の実施形態では、試料細胞からの、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子における変異は、制限酵素の切断パターンにおける変化を検出することで、同定することができる。 例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、（所望により）増幅し、一つまたは複数の制限酵素で消化し、断片の長さ・サイズを例えばゲル電気泳動により決定し、比較する。 試料および対照ＤＮＡの間の断片の長さ・サイズにおける差異は、試料ＤＮＡにおける変異を示すものである。 さらに、配列特異的なリボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号参照）を使用することで、リボザイム切断部位の発生または消失による、特定の変異の存在のスコア化が可能である。 他の実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体における遺伝子変異は、試料および対照核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、二次元アレイ（例えば、チップをベースとしたアレイ）をハイブリダイズすることによって、同定することができる。 そのようなアレイには、それぞれがその他と位置的に区別可能である複数のアドレスが含まれている。 異なるプローブが複数のそれぞれのアドレスに配置される。 アレイは高密度のアドレスを有し得る（例えば、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有し得る）（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７： ２４４−２５５； Ｋｏｚａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２： ７５３−７５９）。 例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体における遺伝子変異は、上記Ｃｒｏｎｉｎ， Ｍ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． に記載の光生成ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイにおいて同定することができる。 簡潔には、プローブの第一のハイブリダイゼーションアレイを用いることで、試料および対照中の長いＤＮＡを走査して、連続的な重複プローブの直線的アレイを作成することにより、これらの配列間での塩基変化を同定することができる。 このステップは点変異の同定を可能にする。 このステップの次に、検出される全ての変種または変異体に対し相補的な、より小さな特殊化されたプローブアレイを用いることで特定の変異の特徴付けを可能にする、第二のハイブリダイゼーションアレイが続く。 各変異アレイは、一方は野生型遺伝子に対し相補的なプローブで、もう一方は突然変異遺伝子に対し相補的なプローブである、平行なプローブセットから構成される。 さらに別の実施形態では、当該技術分野において公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用することで、試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することにより、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子を直接的に配列決定し、さらに変異を検出することができる。 自動化された配列決定手順は診断検査を行う際に利用することができ（Ｎａｅｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８−５３）、例えば、質量分析による配列決定である。 いくつかの配列決定法に関する記述は、実施例に見出すことができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子内の変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護を利用してＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２； Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＰｒｏＣ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７； Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２８６−２９５）。 さらなる別の実施形態では、ミスマッチ切断反応（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、細胞の試料から得られたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｃＤＮＡ中の点変異を検出およびマッピングするための定義された系において、二本鎖ＤＮＡ（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）中の不適正塩基対を認識する一つまたは複数のタンパク質を使用する。 例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞から得られるチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２；米国特許第５，４５９，０３９号）。 他の実施形態では、電気泳動移動度における変化が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子における変異を同定するために用いられる。 例えば、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いることで、変異型核酸および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差異を検出することができる（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ： ８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ （１９９３） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ （１９９２） Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ９：７３−７９も参照）。 試料および対照のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は変性され、再生される。 一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、結果として生じる電気泳動移動度における変化は、一塩基変化の検出ですら可能にする。 ＤＮＡ断片は標識プローブで標識または検出することができる。 アッセイの感度は、二次構造が配列における変化に対してより感受性が高いＲＮＡ（ＤＮＡではない）を用いることで増強することができる。 一実施形態では、主題の方法は、電気泳動移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するために、ヘテロ二本鎖解析を利用する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。 さらに別の実施形態では、変性剤の濃度勾配を含むポリアクリルアミドゲル中の変異体または野生型の断片の移動が、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイされる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。 ＤＧＧＥが解析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより、およそ４０ｂｐのＧＣクランプである高融点ＧＣリッチＤＮＡを付加することによって、完全には変性していないことを保証するために、修飾される。 更なる実施形態では、対照および試料ＤＮＡの移動度における差異を同定するために、温度勾配が変性剤濃度勾配の代わりに使用される（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ （１９８７） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３）。 点変異を検出するための他の技術の例としては、限定はされないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられる（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３）； Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０）。 あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子の特異的増幅技術を、本発明と組み合わせて用いることができる。 特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に（増幅をディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存させるため）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止または低減し得る一方のプライマーの３'最末端に（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ （１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）、目的の変異を有し得る。 さらに、切断に基づく検出を行うために、変異の領域に新規の制限酵素認識部位を導入することが望ましい場合がある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。 ある実施形態において、増幅用のＴａｑリガーゼを用いても、増幅を行うことができることが予測される（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１８９−９３）。 そのような場合では、ライゲーションは、５'配列の３'末端に完全一致が存在し、増幅の有無を探索することによって、特定の部位にある既知の変異の存在を検出することを可能にしている場合にのみ、生じる。 本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含み、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子が関わる疾患または病気の症状または家族歴を示している患者を診断するための臨床背景において使用ことが好都合であり得る、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって、行うことができる。 本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体分子は、薬力学的マーカーとしても有用である。 本明細書で使用される場合、「薬力学的マーカー」は、薬剤効果と特異的に相関する客観的な生化学マーカーである。 薬力学的マーカーの存在または量は、薬剤の投与対象である病状または障害に関連せず；従って、マーカーの存在または量は、対象における薬剤の存在または活性、例えば、Ｅ１酵素阻害剤が阻害効果を生んでいるかどうかを示すものである。 例えば、薬力学的マーカーは生物組織中の薬剤の濃度を示すものであり得、マーカーは、薬剤のレベルと関連して、その組織中で発現もしくは転写されるかまたは発現もしくは転写されない。 このようにして、薬剤の分布または取り込みは、薬力学的マーカーによってモニターすることができる。 同様に、薬力学的マーカーの存在または量は薬剤の代謝産物の存在または量に関連し得るため、マーカーの存在または量はインビボにおける薬剤の相対的な分解速度を示すものである。 薬力学的マーカーは、薬剤効果の検出の感度を増加させる際に、特に薬剤が低用量で投与される際に、特に有用である。 少量の薬剤でさえ何段階にもわたるマーカー（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のマーカー）の転写または発現を活性化させるのに充分であり得るため、増幅されたマーカーは薬剤それ自体よりもより容易に検出することができる量で存在し得る。 また、マーカーはマーカーそれ自体の性質によってより容易に検出することができ；例えば、本明細書に記載の方法を用いて、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質のマーカーに対する免疫に基づく検出系において使用することができ、あるいは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に特異的な放射性標識プローブは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のｍＲＮＡマーカーを検出するのに使用することができる。 さらに、薬力学的マーカーの使用によって、可能な直接観察の範囲を超えて、機序に基づいて、薬剤処置によるリスクを予測することができる。 当該技術分野における薬力学的マーカーの使用の例としては、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ． 米国特許第６，０３３，８６２号； Ｈａｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｅｎｖ． Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． ９０： ２２９−２３８； Ｓｃｈｅｎｔａｇ （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ５６ Ｓｕｐｐｌ． ３： Ｓ２１−Ｓ２４；およびＮｉｃｏｌａｕ （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ５６ Ｓｕｐｐｌ． ３： Ｓ１６−Ｓ２０が挙げられる。 本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体分子は、薬剤ゲノミクスマーカーとしても有用である。 本明細書で使用される場合、「薬剤ゲノミクスマーカー」は、対象における特定の臨床薬への応答または感受性と相関する、客観的な生化学マーカーである（例えば、ＭｃＬｅｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３５：１６５０−１６５２参照）。 「薬剤ゲノミクス」とは、本明細書で使用される場合、遺伝子配列決定、統計遺伝学、および遺伝子発現解析等のゲノミクス技術の、臨床開発中の薬剤および市販されている薬剤への応用を指す。 より具体的には、前記用語は、患者の遺伝子がどのようにして彼ら個人の薬剤に対する応答（例えば、患者の「薬剤応答表現型」、または「薬剤応答遺伝子型」）を決定しているかに関する研究を指す。 薬剤ゲノミクスマーカーの存在または量は、薬剤投与に先立つ、特定の薬剤または薬剤群に対する対象の予測応答に関連する。 対象中の一つまたは複数の薬剤ゲノミクスマーカーの存在または量を評価することによって、対象に最も適切な、または成功の程度がより高いと予測される薬物療法を選択することができる。 例えば、対象中の特定の腫瘍マーカーに対するＲＮＡまたはタンパク質（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはＲＮＡ）の存在または量に基づいて、対象中に存在している可能性がある特定の腫瘍の治療に最適な薬剤または治療コースを選択することができる。 いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の、例えば本明細書に記載の変異（例えば、置換）を含む、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の存在は、対象が、Ｅ１阻害剤（例えばＭＬＮ４９２４）による治療に対する耐性を有する、または耐性を発症する危険性があることを示唆するものであろう。 同様に、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素のＤＮＡにおける特定の配列変異の有無は、Ｅ１酵素阻害剤への耐性と相関し得る。 従って、薬剤ゲノミクスマーカーの使用は、治療を施す必要なしに、各対象に対して最も適切な治療の適用を可能にする。 本発明はまた、ａ）患者から得られた腫瘍試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の発現を測定し（例えば、耐性ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子を用いて）；ｂ）ステップａ）で測定されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の発現を、対照細胞試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の発現と比較し；ｃ）腫瘍試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の発現が、耐性配列が上方制御された配列である対象細胞試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の発現よりも高い場合に、抗腫瘍処置を中止または変更すべきであることを決定すること、を含む、患者に対する抗腫瘍処置の効果をモニタリングするための方法に関する。 別の実施形態では、腫瘍試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の発現が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列が下方制御された配列である対象細胞試料中の耐性配列の発現よりも低い場合に、ステップ（ｃ）のように、抗腫瘍処置は中止または変更されるべきである。 本発明はまた、ａ）患者から得られた腫瘍試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の活性を測定し（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性タンパク質に結合する薬剤を用いて）；ｂ）ステップａ）で測定されたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の活性を、対照細胞試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の活性と比較し；ｃ）腫瘍試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の活性が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列が上方制御された配列である対象細胞試料中の耐性配列の活性よりも高い場合に、抗腫瘍処置を中止または変更すべきであることを決定すること、を含む、患者に対する抗腫瘍処置の効果をモニタリングするための方法に関する。 別の実施形態では、腫瘍試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の活性が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列が下方制御された配列である対象細胞試料中のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の耐性配列の活性よりも低い場合に、ステップ（ｃ）のように、抗腫瘍処置は中止または変更されるべきであると決定される。 薬剤ゲノミクス 本明細書に記載のスクリーニング検査により同定される、本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体分子、およびＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子発現）に対し刺激効果または阻害効果を有する薬剤または調節物質は、本明細書に記載されるようなアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換）に関連するＥ１酵素阻害剤への耐性を（予防的にまたは治療的に）処置するために、個体に投与することができる。 そのような処置と併せて、薬理ゲノミクス（すなわち、個体の遺伝子型および外来の化合物または薬剤に対するその個体の応答の間の相互関係の研究）は考慮され得る。 従って、本発明の別の態様は、本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体分子またはその個体の薬剤応答遺伝子型に応じたＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の調節物質による、個体の予防的または治療的な処置を調整するための方法を提供する。 例えば、治療薬の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬剤の用量および血中濃度の間の関係を変化させることによって、重度の毒性または治療の失敗をもたらし得る。 従って、医師または臨床医は、Ｅ１阻害剤、例えば耐性を克服する阻害剤を投与するかどうかを決定する際に、並びにＥ１阻害剤を用いた処置の投与量および／または治療的投与計画を調整する際に、関連する薬理ゲノミクス研究で得られた知識を適用することを考慮することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸またはタンパク質の発現または活性（例えば、細胞の薬剤耐性表現型を調節する能力）に対する作用物質（例えば、薬剤、化合物）の影響のモニタリングは、基礎的な薬物スクリーニングにだけでなく、臨床試験にも応用することができる。 例えば、スクリーニング検査によって決定される、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子発現、タンパク質レベルを低減することに対する、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の活性を下方制御することに対する、作用物質の有効性は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の遺伝子発現、タンパク質レベルの増加、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性の上方制御を示している対象の臨床試験において、モニターすることができる。 そのようなアッセイまたは臨床試験において、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の遺伝子、および場合によっては、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に関連する障害と関連付けられている他の遺伝子のの発現または活性を、特定の細胞の表現型の「読み出し」またはマーカーとして使用することができる。 例えであって限定する目的はないが、（例えば、スクリーニング検査において同定される、または本明細書に記載される）耐性配列の活性を調節する、すなわち、耐性を克服するＥ１酵素阻害剤（例えば、化合物、薬剤または小分子）での処理によって細胞において調節される遺伝子（例えば、耐性遺伝子）を、同定することができる。 従って、細胞増殖性障害に対する作用物質の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され、ＲＮＡが調製され、耐性配列および障害と関連付けられる他の配列（核酸またはポリペプチド）の発現レベルについて解析され得る。 発現レベル（すなわち、遺伝子 発現パターン）は、本明細書に記載のノーザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、産生されたタンパク質の量を測定することによって、本明細書に記載の方法のうちの１つによって、または耐性配列もしくはそのような配列をコードする遺伝子を含む他の配列の活性レベルを測定することによって、定量化することができる。 このようにして、遺伝子発現パターンは、作用物質に対する細胞の生理応答を示すマーカーとして役立ち得る。 従って、この応答状態は、作用物質を用いた個体の処置の前、およびその期間の様々な時点において、決定されてもよい。 一実施形態では、本発明は、作用物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニング検査により同定された、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補、例えば、Ｅ１酵素阻害剤、例えば、ＮＡＥ阻害剤）による対象の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、該方法は、（ｉ）作用物質の投与前に対象から投与前試料を得るステップ；（ｉｉ）投与前試料中の耐性配列（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡ）の発現レベルを検出するステップ；（ｉｉｉ）対象から一つまたは複数の投与後試料を得るステップ；（ｉｖ）投与後試料中の耐性配列の発現または活性のレベルを検出するステップ；（ｖ）投与前試料中の耐性配列と１つまたは複数の投与後試料中の耐性配列の発現または活性のレベルを比較するステップ；並びに（ｖｉ）それに応じて、対象に対する作用物質の投与を変更するステップを含む。 例えば、作用物質の投与の増加は、投与後試料で検出された耐性配列の発現または活性を超えて、上方制御された耐性配列の発現または活性を減少させるために、すなわち、作用物質の有効性を増加させるために、望ましい場合がある。 いくつかの実施形態では、がん細胞として、急性骨髄性白血病細胞またはメラノーマ細胞が含まれる。 がん細胞としては、限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支原性癌、メラノーマ、腎細胞癌、肝細胞腫−肝細胞癌、胆管癌（ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌、移行上皮癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、乳癌、消化器癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、および頭頸部領域の扁平上皮癌等の癌；線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨肉腫（ｃｈｏｒｄｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫および中皮肉腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）等の肉腫；白血病およびリンパ腫（例えば、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ球性白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫、またはホジキン病）；並びに神経系腫瘍（例えば、神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、シュワン細胞腫または上衣腫（ｅｐｉｄｙｍｏｍａ））が挙げられる。 本発明の方法で使用されるがん細胞の供給源は、本発明の方法がどのように使用されているかに基づく。 例えば、本方法が患者のがんが作用物質、または作用物質の組み合わせにより治療できるかどうかを決定するために使用されている場合、がん細胞の供給源は、患者からのがん生検から得られたがん細胞であり得る。 あるいは、治療されているがん細胞株と類似型のがん細胞株がアッセイされ得る。 例えば乳がんが治療されている場合、乳がん細胞株が使用され得る。 本方法が治療プロトコルの有効性をモニタリングするために使用されている場合、組織試料（例えば、腫瘍細胞、リンパ球、神経組織または病原体感染細胞もしくは寄生虫感染細胞を含む試料）は、治療されている患者から得るれ得る。 本方法が新規治療薬または組み合わせを同定するために使用されている場合、いかなるがん細胞（例えば、がん細胞株の細胞）も使用され得る。 当業者は、本発明の方法で使用される適切ながん細胞を、容易に選択し入手することができる。 例えば、実施例で使用される、ＨＣＴ−１１６、Ｃａｌｕ−６およびＮＣＩ−Ｈ４６０がん細胞株を使用することができる。 患者から得られたがん細胞のために、標準的な生検法（例えば、針生検）を使用することができる。 本発明の方法において、耐性配列の発現のレベルまたは量は決定される。 本明細書で使用される場合、発現のレベルまたは量とは、耐性ｍＲＮＡの発現の絶対レベルまたは耐性タンパク質の発現の絶対レベル（すなわち、発現ががん細胞内で生じているいないにかかわらない）を指す。 選択された遺伝子の絶対発現レベルに基づいて決定を為す替わりとして、決定は正規化された発現レベルに基づいていてもよい。 発現レベルは、感受性または耐性の配列の絶対発現レベルを、その発現を感受性または耐性の配列ではない配列（例えば、恒常的に発現されるハウスキーピング遺伝子にコードされる配列）の発現に対して比較することにより、補正することによって、正規化される。 正規化に適した遺伝子としては、アクチン遺伝子等のハウスキーピング遺伝子が挙げられる。 この正規化により、ある試料（例えば、患者試料）中の発現レベルを別の試料（例えば、非がん試料）と比較すること、または異なる供給源から得られた試料間で比較することを可能にする。 あるいは、発現レベルは相対発現レベルとして得ることができる。 遺伝子の相対発現レベルを決定するために、試験対象の試料における発現レベルの決定に先立ち、その遺伝子の発現のレベルを、１０以上の試料、または５０以上の試料において決定する。 多くの試料においてアッセイされた遺伝子の平均発現レベルを決定し、これを、試験対象の遺伝子におけるベースライン発現レベルとして使用する。 試験試料において決定された遺伝子の発現レベル（発現の絶対レベル）を次に、その遺伝子において得られた平均発現値で除算する。 これは、相対発現レベルを与えるものであり、さらに、感受性または耐性の極端な例を特定する際に役立つ。 腫瘍細胞内の発現を測定する実施形態において、使用される正規化された試料は、類似の腫瘍から、または試験対象の腫瘍と類似した組織起源の非がん性細胞から得られる。 細胞供給源の選択は、相対発現レベルデータの用途に依存する。 例えば、平均発現スコアを得るために類似型の腫瘍を使用することは、感受性または耐性の極端な例の特定を可能にする。 正常組織で見られる発現を平均発現スコアとして使用することは、アッセイされた遺伝子が（正常細胞と比較して）腫瘍特異的であるかどうかを確認する際に役立つ。 耐性配列の発現を変化させる化合物を投与することにより耐性配列の発現のレベルを変化させることによって、細胞の薬剤耐性を増加させるための方法も、本発明の範囲内である。 例えば、細胞における上方制御された配列の発現を増加させることによって、薬剤耐性を増加させてもよい。 下方制御された配列の発現の減少は、薬剤耐性を増加させ得る。 そのような方法は、化学療法の間の、非腫瘍性細胞の保護に有用である。 本発明に有用な化合物は、Ｅ１酵素活性の阻害剤である。 具体的には、前記化合物はＮＡＥ、ＵＡＥ、および／またはＳＡＥの阻害剤であるよう意図されている。 阻害剤には、標的タンパク質へのｕｂｌ結合におけるＥ１酵素の促進効果を低減させる（例えば、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、ＳＵＭＯ化の低減）、ｕｂｌ結合を介した細胞内シグナル伝達を低減する、および／またはｕｂｌ結合を介したタンパク質分解を低減させる（例えば、カリン依存性ユビキチン化およびタンパク質分解（例えば、ユビキチン−プロテアソーム経路）の阻害）、化合物が含まれることが意図される。 従って、本発明の化合物は、インビトロもしくはインビボで、または細胞もしくは動物モデルで、本明細書でさらに詳細に提供される方法または当該技術分野において公知の方法に従って、Ｅ１酵素を阻害するその能力についてアッセイされてもよい。 本化合物は、その結合能、または直接的にＥ１酵素活性を媒介する能力について、例えば、ピロリン酸交換アッセイにおいて、アッセイされてもよい。 あるいは、化合物の活性を、間接的な細胞アッセイを通じて、またはＥ１活性化の下流効果のアッセイを通じてアッセイすることで、Ｅ１阻害の下流効果の阻害（例えば、カリン依存性のユビキチン化およびタンパク質分解の阻害）を評価してもよい。 例えば、活性は、ｕｂｌ結合型基質（例えば、ｕｂｌ結合型Ｅ２、ＮＥＤＤ化カリン、ユビキチン化基質、ＳＵＭＯ化基質）の検出；下流のタンパク性基質の安定化（例えば、ｐ２７の安定化、ＩκＢの安定化）の検出；ＵＰＰ活性の阻害の検出；タンパク質Ｅ１阻害および基質安定化の下流効果の検出（例えば、レポーターアッセイ、例えば、ＮＦκＢレポーターアッセイ、ｐ２７レポーターアッセイ）によって、アッセイされてもよい。 活性を評価するためのアッセイは、下記の実施例において記載されている、および／または当該技術分野において公知である。 医薬組成物 本発明の核酸およびポリペプチド、その断片、並びにＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する抗体（「活性化合物」とも呼ばれる）は、医薬組成物中に組み入れることができる。 そのような組成物は典型的に、核酸分子、タンパク質、または抗体、および薬剤的に許容できる担体を含む。 本明細書で使用される場合、「薬剤的に許容できる担体」という用語には、薬剤の投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。 補充的な活性化合物も組成物に組み入れることができる。 「薬剤的に許容できる担体」という用語は、レシピエントとなる対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に適合し、作用物質の活性を停止させることなく標的部位に活性薬剤を送達するのに適した物質を指すように、本明細書では使用される。 医薬組成物はその意図される投与経路と適合するように製剤化される。 投与経路の例としては、非経口経路（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口経路、経皮経路（例えば局所的）、経粘膜的経路（例えば、エアロゾルの吸入または点眼剤の吸収）、直腸内投与または移植されたリザーバーを介した投与が挙げられる。 非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される液剤または懸濁剤には、以下の成分が含まれ得る：無菌希釈剤（例えば、注射用蒸留水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）並びに張度調整剤（例えば、塩化ナトリウム、デキストロースまたは多価アルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール））。 ｐＨは酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整することができる。 非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアル中に容れることができる。 本発明の医薬組成物は、特に従来的な造粒、混合、溶解、カプセル封入、凍結乾燥、または乳化工程等の当該技術分野において周知の方法によって、製造することができる。 組成物は、種々の形態、例えば、粒剤、沈降物、または微粒子物、散剤（例えば、凍結乾燥した、回転乾燥した、またはスプレー乾燥した散剤）、無定形散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、乳剤、エリキシル剤、懸濁剤または液剤で、生産されてもよい。 製剤は、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、リオプロテクタント、可溶化剤、生物学的利用能調整剤およびこれらの組み合わせを所望により含有していてもよい。 一実施形態に従うと、本発明の組成物は、哺乳動物（例えば、ヒトまたは家畜）への医薬品投与用に製剤化される。 「非経口」という用語には、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内および頭蓋内の、注射または点滴法が含まれる。 本発明の製剤は、短時間作用性、早期放出性（ｆａｓｔ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ）、または長時間作用性となるように設計されていてもよい。 またさらに、化合物は、全身的な方法よりも局所的に（例えば、腫瘍部位への投与（例えば、注射による））投与することができる。 医薬製剤は、液体、例えば、限定はされないが、油、水、アルコール、およびこれらの組み合わせを用いて、液体懸濁剤または液剤として調製してもよい。 シクロデキストリン等の可溶化剤が含まれていてもよい。 経口投与または非経口投与用に、薬剤的に適切な界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を添加してもよい。 懸濁剤としては、油剤、例えば、限定はされないが、落花生油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油およびオリーブ油またはそれらのポリオキシエチル化型が含まれ得る。 懸濁剤調製物は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースもしくは同様の分散剤、または脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドを含有していてもよい。 懸濁剤製剤物は、アルコール、例えば、限定はされないが、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、およびポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびプロピレングリコール）およびそれに適した混合物を含んでいてもよい。 エーテル、例えば、限定はされないが、ポリ（エチレングリコール）、石油炭化水素、例えば、ミネラルオイルおよびワセリン；並びに水を、懸濁剤製剤で使用してもよい。 他の一般的に使用される界面活性剤、例えば、薬剤的に許容できる固体、液体、または他の剤形の製造に一般的に使用される、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および他の乳化剤または生物学的利用能賦活剤を、製剤のために使用してもよい。 化合物は、注射（例えば、ボーラス投与または持続点滴）による非経口投与用に製剤化されてもよい。 注射用の単位剤形はアンプル中または複数回投与用容器中に存在してもよい。 注射可能な用途に適した医薬組成物には、無菌の注射剤または分散剤を即時調製するための、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および無菌散剤が含まれる。 静脈内投与用に、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。 注射可能な形態では、組成物は無菌でなければならず、容易に注入できる程度に流動性であるべきである。 組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌等の微生物の混入活動から保護されなければならない。 適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持により、界面活性剤の使用により、維持することができる。 微生物の活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。 注射可能組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる作用物質、例えば、ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより、もたらされ得る。 無菌注射剤は、上記成分の１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を混和し、必要ならば、その後フィルター滅菌することによって、調製することができる。 一般的に、分散液は、基礎（ｂａｓｉｃ）分散媒および上記成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって、調製される。 無菌注射剤調製用の無菌散剤の場合、その予めフィルター無菌された溶液から、活性成分およびあらゆる所望の追加成分の粉末を生ずる調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり得る。 本発明の医薬組成物は、あらゆる経口的に許容できる剤形、例えば、限定はされないが、カプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル、錠剤、トローチ、水性懸濁剤または液剤の形態で、経口投与されてもよい。 水性懸濁剤が経口用途に必要な場合、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と混合される。 所望であれば、ある特定の甘味剤、香味剤または着色料が添加されてもよい。 錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ等は、以下の成分、または類似する性質の化合物のいずれをも含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン等の結合剤；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅ等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味剤等の香味剤。 ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤も典型的に添加される。 コーティングは、様々な目的に、例えば、味を付けるため、溶解もしくは吸収の場所に影響を与えるため、または薬効を延長させるために、用いられる場合がある。 コーティングをカプセル用の錠剤または顆粒状粒剤に塗布してもよい。 吸入による投与のために、本化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素等のガス）を含む圧縮容器もしくは分注器（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）、または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。 全身投与は経粘膜的または経皮的手段によるものであってもよい。 経粘膜投与または経皮投与において、透過すべき障壁に適した浸透剤が、製剤中に使用される。 そのような浸透剤は当該技術分野において周知であり、例えば、経粘膜的投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。 経粘膜的投与は経鼻噴霧剤または坐剤の使用により達成することができる。 経皮投与において、活性化合物は、当該技術分野において周知の、軟膏剤、軟膏剤、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。 あるいは、本発明の医薬組成物は、直腸内投与用の坐剤の形態で投与されてもよい。 作用物質を、室温で固体であるが直腸の温度では液体であるために直腸内で溶けて薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、これらを調製してもよい。 そのような物質としては、カカオ脂、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。 本発明の医薬組成物は、特に、処置の標的が局所投与で容易に到達可能な領域または器官を含む場合（例えば、眼、皮膚、または下部腸管の疾患）、局所的に投与されてもよい。 適切な局所的製剤は、これらの各領域または各器官用に容易に調製される。 一実施形態では、活性化合物は、徐放性製剤（例えば植込錠およびマイクロカプセル化送達系）等、身体からの急速な排出から本化合物を保護する担体と共に調製される。 エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性生体適合性のポリマーを使用することができる。 そのような製剤の調製法は当業者には明白である。 これらの物質は、アルザ・コーポレーション（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ・ファーマスーティカルズ社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ）から購入することもできる。 リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）も、薬剤的に許容できる担体として使用することができる。 これらは、当業者に既知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の通りに、調製することができる。 本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の障害（例えば、増殖性障害、例えば、がん、炎症性、神経変性障害または寄生虫感染）に関連する治療適用において、特に有用である。 本組成物は、Ｅ１酵素阻害剤への耐性を通じて治療されている関連障害を有する、またはそれを発症する危険性がある、またはそれの再発を経験している患者への投与用に、製剤化することができる。 「患者」という用語とは、本明細書で使用される場合、動物、哺乳動物、またはヒトを意味する。 いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口投与用、静脈内投与用、または皮下投与用に製剤化された医薬組成物である。 しかし、治療有効量の本発明の化合物を含有する上記剤形のいずれも、通例の実験法の十分に範囲内であり、したがって、本発明の十分に範囲内である。 ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、別の治療薬をさらに含んでいてもよい。 そのような他の治療薬は、通常、治療中の障害、疾患または状態を有する患者に投与される治療薬であり得る。 経口用組成物または非経口用組成物を、投与を容易にするため、および投与量を均一にするための投薬単位形態に製剤化することが有利である。 投薬単位形態とは、本明細書で使用される場合、治療される対象に対する単位投与量として適している物理的に分離された単位を指し；各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を、所望の医薬担体と共に含有している。 「治療有効量」とは、単回投与または複数回投与時に、Ｅ１酵素変異体の活性および／または治療中の障害または病状の重症度において検出可能な減少を引き起こすのに充分な、化合物または組成物の量を意味する。 「治療有効量」はまた、そのような処置をしなかった場合に予測されるものよりも優って、細胞を処置する、治療中の障害または病状の進展を遅延または防止する（例えば、がんのさらなる耐性腫瘍の成長を防止し、炎症または寄生虫の耐性を防止し）、対象の障害の症状を改善する、軽減する、緩和する、または改善するのに十分な量を含むことも意図される。 必要とされるＥ１酵素阻害剤の量は、所与の組成物の特定の化合物、治療中の障害のタイプ、投与経路、および障害を治療するのに必要な期間に依存する。 いかなる特定の患者への具体的な投与量および治療計画も、種々の要因、例えば、使用される特定の化合物の活性、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与時期、排泄速度、薬剤の組み合わせ、治療医の判断、並びに治療中の特定の疾患の重症度に依存することも、理解すべきことである。 本阻害剤が別の作用物質と共に投与されるある特定の態様では、本発明の組成物中に存在するさらなる治療薬の量は、典型的に、唯一の活性薬剤としてその治療薬を含む組成物の中で通常投与されるであろう量を超えない。 いくつかの実施形態では、さらなる治療薬の量は、その作用物質を唯一の治療的活性薬剤として含む組成物中に通常存在する量の、約５０％〜約１００％の範囲である。 そのような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ ５０ （集団の５０％に対して致死の用量）およびＥＤ ５０ （集団の５０％において治療効果のある用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。 毒性効果および治療効果の間の用量比が治療指数であり、治療指数はＬＤ ５０ ／ＥＤ ５０の比として表すことができる。 いくつかの実施形態では、化合物は高い治療指数を示す。 毒性副作用を示す化合物が使用され得る場合、非感染細胞への潜在的損傷を最小化して、それによって副作用を低減するために、そのような化合物を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意がなされるべきである。 細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトで使用するためのある範囲の投与量を考案する際に使用することができる。 そのような化合物の投与量は、ＥＤ ５０を含み毒性がほとんどない血中濃度の範囲内であり得る。 投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動させることができる。 本発明の方法で使用されるいかなる化合物においても、治療効果のある用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。 細胞培養において決定されたＩＣ ５０ （すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルにおいて考案することができる。 そのような情報を用いることで、より正確にヒトにおいて有用な用量を決定することができる。 血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。 本明細書で定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。 タンパク質またはポリペプチドは、約１〜１０週間、２〜８週間、約３〜７週間、または約４、５、もしくは６週間、週１回投与することができる。 ある特定の要因、例えば、限定はされないが、疾患または障害の重症度、種々の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、並びに他の疾患の存在が、対象を有効に治療するために要求される投与量およびタイミングに影響を与え得ることは、当業者に理解される。 さらに、本明細書に記載の非結合型または結合型の、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体での対象の処置は、単回処置を含むこともあれば、一連の処置を含むこともある。 抗体について、投与量は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重（一般的には、３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。 抗体が脳で作用することとなっている場合、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量が適切であり得る。 一般的に、部分ヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体よりも長い、ヒトの体内での半減期を有する。 従って、より低い投与量およびより低頻度の投与が可能であり得る。 脂質化等の修飾を用いることで、抗体を安定化させ、取り込みおよび組織透過性（例えば、脳への）を増強することができる。 抗体を脂質化するための方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ ｅｔ ａｌ． （（１９９７） Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３）に記載されている。 本発明は、発現を調節する作用物質も包含する。 作用薬剤は、例えば、小分子であり得る。 例えば、そのような小分子としては、限定はされないが、約１０，０００グラム／モル未満（例えば、５，０００、１，０００または５００グラム／モル）の分子量を有する、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ｄｓＲＮＡ分子、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機（ｈｅｔｅｒｏｏｒｇａｎｉｃ）化合物および有機金属化合物を含む）、並びにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬剤的に許容できる形態が挙げられる。 用量の例としては、対象または試料重量の１キログラムあたりミリグラム量またはマイクログラム量の小分子（例えば、約１マイクログラム／キログラム〜約５００ミリグラム／キログラム、約１００マイクログラム／キログラム〜約５ミリグラム／キログラム、または約１マイクログラム／キログラム〜約５０マイクログラム／キログラムが挙げられる）。 さらに、小分子の適切な用量が、調節されるべき発現または活性ごとに、その小分子の作用強度に依存することも、理解される。 本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、これらの小分子のうちの一つまたは複数が動物（例えば、ヒト）に投与されることとなる場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、比較的低い用量を最初に処方し、その後、適切な応答が得られるまでその用量を増加させていくことができる。 さらに、いかなる特定の動物対象への具体的な服用レベルも、種々の要因、例えば、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、任意の薬剤の組み合わせ、並びに調節すべき発現または活性の程度に依存することが、理解される。 本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。 遺伝子治療 ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号参照）、または定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７参照）によって、対象に送達することができる。 遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、あるいは、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。 あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞からインタクトに産生できる場合（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬製剤は遺伝子送達系を産生する一つまたは複数の細胞を含み得る。 医薬組成物は、容器、パック、または分注器中で、投与のための説明書と共に、含まれ得る。 処置方法 本発明は、障害のリスクを有する（またはそれに罹患し易い）、または異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の発現若しくは活性に関連した障害（例えば、Ｅ１酵素阻害剤への耐性または感受性低下）を有する対象の、予防的および治療的な処置方法の両方を提供する。 本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、疾患、病徴もしくは疾患への素因を治療、治癒、軽減、緩和、変化、修復、寛解、改善するまたはそれに影響を与えることを目的として、疾患、病徴もしくは疾患への素因を有する患者への治療薬の適用もしくは投与、またはそのような患者から単離した組織もしくは細胞株への治療薬の適用もしくは投与と定義される。 治療薬としては、限定はされないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、ｄｓＲＮＡ分子およびアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、Ｅ１酵素阻害に対する耐性を克服できる作用物質が挙げられる。 いくつかの実施形態では、耐性を克服できる作用物質の例には、本明細書に記載のスクリーニング検査で同定された作用物質、Ａ２７１Ｔ／ＷＴのＩＣ５０比が約４倍以下であるとして表１３に列挙される作用物質、ＵＢＬとの付加体形態（例えば、ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体）である場合に変異型Ｅ１酵素に堅固に結合し得るＥ１酵素阻害剤、または巨大なＮ６置換（すなわち、嵩のある基、例えば、ヘテロアリールのアミノ置換基から遊離したインダン（例えば、プリン）））を持たないアデノシンスルファメート様阻害剤が含まれ得る。 予防的および治療的な処置方法の両方に関して、そのような処置は、薬理ゲノミクス分野から得られた知見に基づいて、具体的に調整または調節することができる。 薬剤ゲノミクスにより、臨床医または医師は、予防的または治療的な処置を、その処置から最も恩恵を受ける患者に標的化することが可能となり、毒性薬剤に関連する副作用に陥る、または処置に応答しないもしくはそれに耐性である患者にはこの処置を提供しないことが可能となる。 一つの態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の発現、もしくは少なくとも１つのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の活性を調節する作用物質を対象に投与することによって、対象において、異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。 異常なまたは望まれないＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性によって引き起こされる、またはそれが寄与する疾患のリスクを有する対象は、例えば、本明細書に記載のあらゆる、または組み合わせた診断検査または予後検査によって、特定することができる。 予防薬の投与は、疾患または障害が予防、または、その進行が遅延されるように、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の異常を特徴とする症状が発現する前に、行うことができる。 例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の異常のタイプに応じて、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のアゴニスト、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のアンタゴニスト作用物質が対象を処置するために使用され得る。 適切な作用物質は、本明細書に記載のスクリーニング検査に基づいて決定することができる。 本発明の別の態様は、治療を目的として、耐性核酸またはタンパク質の発現または活性を調節する方法に関する。 例えば、化学療法の有効性は、細胞内の耐性配列の発現を減少させることによって効果がより弱くなるであろう化学療法剤の細胞毒性効果に対する、形質転換細胞の脆弱性を修復または改善することによって、「増強」（強化）される。 本発明の調節法は、細胞を、細胞に関連する耐性タンパク質活性のうちの一つまたは複数の活性を調節する作用物質と接触させることを含む。 耐性タンパク質の活性を調節する作用物質は、本明細書に記載の作用物質、例えば、核酸またはタンパク質、耐性タンパク質の自然発生的な同起源リガンド、ペプチド、耐性ペプチド模倣薬、または他の小分子であり得る。 一実施形態では、作用物質は、耐性タンパク質の生物活性のうちの一つまたは複数を刺激する。 そのような刺激性作用物質の例には、活性耐性タンパク質および細胞に導入されている耐性タンパク質をコードする核酸分子が含まれる。 そのような作用物質は、薬剤耐性細胞において下方制御された耐性核酸またはタンパク質の発現または活性を増加させるのに特に有用である。 別の実施形態では、作用物質は、耐性タンパク質の生物活性のうちの一つまたは複数を阻害する。 そのような阻害剤の例としては、アンチセンス耐性核酸分子、ｄｓＲＮＡ分子および抗耐性タンパク質抗体が挙げられる。 これらの調節法は、インビトロ（例えば、細胞を作用物質と一緒に培養することによって）、または、インビボ（例えば、作用物質を対象に投与することによって）、実施することができる。 そのような作用物質は、薬剤耐性細胞において上方制御された耐性核酸またはタンパク質の発現または活性を低減させるのに特に有用である。 従って、本発明は、耐性配列分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。 一実施形態では、本方法は、耐性の発現もしくは活性を調節（例えば、上方制御または下方制御）する、作用物質（例えば、スクリーニング検査により同定された、または本明細書に記載の作用物質）、または作用物質の組み合わせを投与することを含む。 別の実施形態では、本方法は、低減されたまたは異常な耐性の発現または活性を補う治療として、耐性配列分子（例えば、核酸またはタンパク質）を投与することを含む。 本発明の一実施形態は、試料を、本発明の化合物、または本発明の化合物を含む組成物と接触させることを含む、試料中のＥ１酵素活性を阻害または低減する方法に関する。 試料としては、本明細書で使用される場合、限定はされないが、精製されたまたは部分的に精製されたＥ１酵素、培養細胞または細胞培養物の抽出物；哺乳動物から生検した細胞もしくは体液、またはその抽出物；および体液（例えば、血液、血清、唾液、尿、糞便、精液、涙）またはその抽出物、を含む試料が挙げられる。 試料中のＥ１酵素活性の阻害は、インビトロまたはインビボ、インセルロ（ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ）、またはインサイツで行ってもよい。 別の実施形態では、本発明は、患者に本発明の化合物または医薬組成物を投与することを含む、障害、障害の症状を有する、障害の再発を発症する危険性があるまたはそれを経験している患者を処置するための方法を提供する。 処置は、障害、障害の症状または障害への素因を治療、治癒、軽減、解放、変化、修復、寛解、緩和、改善するまたはそれに影響を与えるものであり得る。 理論に束縛されることを望むものではないが、処置は、インビトロまたはインビボにおいて細胞もしくは組織の成長の阻害、切除、もしくは殺傷を引き起こすこと、または障害（例えば、本明細書に記載の障害（例えば、増殖性疾患、例えば、がん、炎症性疾患または寄生虫感染））を媒介する細胞もしくは組織（例えば、異常細胞、患部組織）の能力を低減することと考えられる。 本明細書で使用される場合、細胞または組織（例えば、増殖性細胞、腫瘍組織）の「成長を阻害する」または「成長の阻害」とは、その成長および転移を遅延、中断、抑止または停止させることを指し、必ずしも成長の完全な排除を表すものではない。 本発明は、薬剤耐性細胞の存在に関連する障害を有するされる哺乳動物を処置する方法にも関する。 本方法は、哺乳動物が薬剤耐性細胞の存在に関連する障害（例えば、薬剤耐性がんまたは寄生虫感染）を有するかどうかを決定するステップ、および例えば、上方制御された耐性配列の活性または発現を十分に変化させる化合物をその哺乳動物に投与して、障害に関連する細胞の薬剤耐性を調節する（すなわち、低減させる）ステップを含む。 下方制御された耐性配列の場合、哺乳動物に投与される化合物は、配列の活性または発現を増加させることで、薬剤耐性を調節（すなわち、低減（ｒｅｄｕｃｉｎｇ））させる。 本発明はまた、ａ）化学療法化合物を患者に投与し；ｂ）患者において上方制御された耐性配列の発現を低減させる化合物を投与することを含む、薬剤耐性の新生細胞、病原性細胞または寄生中細胞の存在に関連する障害に罹患している患者における、化学療法化合物の有効性を増加させる方法に関する。 本発明はさらに、ａ）化学療法化合物を患者に投与し；ｂ）患者において下方制御された耐性配列の発現を低減（ｒｅｄｕｃｅ）させる化合物を投与することを含む、薬剤耐性の新生細胞の存在に関連する障害に罹患している患者における、化学療法化合物の有効性を増加させる方法に関する。 本発明は、耐性配列が上方制御された耐性配列である場合に、薬剤耐性細胞内の耐性配列の活性または発現を低減させる化合物を哺乳動物に投与することを含み、その低減が薬剤耐性細胞の薬剤耐性を低減させるのに充分である、薬剤耐性細胞の存在に関連する障害を有するとされる哺乳動物を治療する方法に関する。 別の実施形態では、本発明は、耐性配列が下方制御された耐性配列である場合に、薬剤耐性細胞内の耐性配列の活性または発現を増加させる化合物を哺乳動物に投与することを含み、その低減が薬剤耐性細胞の薬剤耐性を低減させるのに充分である、薬剤耐性細胞の存在に関連する障害を有するとされる哺乳動物を治療する方法に関する。 適用される疾患（ｄｉｓｅａｓｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）には、Ｅ１酵素活性の阻害が異常細胞または組織の生存および／または増殖に有害であるような障害が含まれる（例えば、細胞はＥ１阻害に感受性が高く；Ｅ１活性の阻害は疾患機序を撹乱し；Ｅ１活性の低減は疾患機序の阻害剤であるタンパク質を安定化させ；Ｅ１活性の低減は疾患機序の活性化因子であるタンパク質の阻害をもたらす）。 適用される疾患には、Ｅ１酵素活性（例えば、ＮＡＥ、ＵＡＥ、ＵＢＡ６の活性）を低減させることにより制御することができる、効果的なカリンおよび／またはユビキチン化活性を必要とする、いかなる障害、疾患または状態も含まれることが意図される。 例えば、本発明の方法は、細胞増殖が関わる障害、例えば、限定はされないが、病状の維持および／または進行のために、効率的なカリン依存性ユビキチン化およびタンパク質分解経路（例えば、ユビキチンプロテアソーム経路）を必要とする障害の治療に有用である。 本発明の方法は、Ｅ１活性（例えば、ＮＡＥ活性、ＵＡＥ活性、ＳＡＥ活性）によって調節されるタンパク質（例えば、ＮＦκＢ活性化、ｐ２７ Ｋｉｐ活性化、ｐ２１ ＷＡＦ／ＣＩＰ１活性化、ｐ５３活性化）により媒介される障害の治療に有用である。 関連疾患としては、増殖性疾患（例えば、がん）および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、変形性関節症、皮膚病（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬）、血管増殖性疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、組織および器官拒絶））；並びに感染に関連する炎症（例えば、免疫応答）、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、神経因性疼痛、トリプレットリピート病、星状細胞腫、およびアルコール性肝疾患の結果としての神経変性）、虚血傷害（例えば、脳卒中）、並びに悪液質（例えば、様々な生理的および病理的状態（例えば、神経損傷、空腹、発熱、アシドーシス、ＨＩＶ感染、がん罹患、およびある特定の内分泌疾患）に伴う筋肉タンパク質分解の促進）が挙げられる。 本発明の化合物および医薬組成物は、がんの治療に特に有用である。 本明細書で使用される場合、「がん」という用語（また、用語「過剰増殖性」および「新生」と同義的に使用される）とは、制御されないもしくは調節不全の細胞増殖、細胞分化の減少、周辺組織に浸潤する不適切な能力、および／または異所に新生物を確立する能力を特徴とする、細胞の障害を指す。 がんの病状は、病理的な、すなわち、病状を特徴付けするまたは構成する病状（例えば、悪性腫瘍の成長）として分類されてもよいし、あるいは非病理的な、すなわち、正常から逸脱しているが病状には関連していない病状（例えば、創傷修復に伴う細胞増殖）として分類されてもよい。 この用語には、侵襲性病理組織学的なタイプもしくは段階にかかわりなく、あらゆるタイプのがん性増殖もしくは発癌プロセス、転移性組織、または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官も含まれることが意図される。 「がん」という用語には、限定はされないが、固形腫瘍および体液または血液に由来する腫瘍、すなわち、血液または他の体液中の細胞懸濁液が含まれる。 「がん」という用語は皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液、および血管の疾患を包含する。 「がん」という用語はさらに、原発性がんおよび転移性がんを包含する。 いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。 本発明の方法により治療することができる固形腫瘍の例としては、限定はされないが、膵がん；膀胱がん；結腸直腸がん；乳がん（例えば、転移性乳癌）；前立腺がん（例えば、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺がん）；腎がん（例えば、転移性腎細胞癌）；肝細胞がん；肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）、および肺腺癌）；卵巣がん（例えば、進行性上皮性または原発性の腹膜がん）；子宮頸がん；胃がん；食道がん；頭頸部がん（例えば、頭頸部の扁平上皮癌）；メラノーマ；神経内分泌がん（例えば、転移性神経内分泌腫瘍）；脳腫瘍（例えば、神経膠腫、退形成乏突起膠腫、成人多形神経膠芽腫、および成人未分化星状細胞腫；骨がん；並びに軟部肉腫が挙げられる。 他のいくつかの実施形態では、がんは造血器腫瘍である。 造血器腫瘍の例としては、限定はされないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（例えば、加速性ＣＭＬおよび急性転化期ＣＭＬ（ＣＭＬ−ＢＰ））；急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；ホジキン病（ＨＤ）；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、濾胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫）；Ｂ−細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫（ＭＭ）；ワルデンストローム・マクログロブリン血症；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（例えば、不応性貧血（ＲＡ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｒｉｎｇｅｄ ｓｉｄｅｒｂｌａｓｔ）（ＲＡＲＳ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、および移行期の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−Ｔ））；並びに骨髄増殖性症候群が挙げられる。 いくつかの実施形態では、本発明の化合物または組成物は、結腸直腸がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、および膵がんからなる群から選択されるがんを有する、またはそれを発症もしくは再発する危険性がある患者を治療するために使用される。 ある特定の実施形態では、がんは、肺がん、結腸直腸がん、卵巣がんおよび血液のがんからなる群から選択される。 治療されるべき特定の障害または状態に応じて、いくつかの実施形態では、本発明のＥ１酵素阻害剤は、追加の治療薬または作用物質と共に投与される。 いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、治療されるべき障害または状態を有する患者に通常投与される。 治療薬である。 本明細書で使用される場合、特定の障害または状態を治療するために通常投与される追加の治療薬は、「治療されるべき障害または状態に適した」ものとして知られている。 さらに、耐性遺伝子の発現を阻害するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、またはリボザイム）分子を本発明において用いることで、耐性遺伝子発現の発現レベルを低減させ、それによって耐性遺伝子の活性レベルを効果的に低減させることができる。 またさらに、標的遺伝子の活性レベルを低減させる際に三重らせん体分子を利用することができる。 例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド医薬組成物（または、上方制御された耐性配列に標的化されたポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを、一つもしくは複数の他のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと共に含む混合組成物）を、化学療法剤の投与に先立って、充分に個体に投与することで、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド組成物が、個体の組織、特に根絶されるべき形質転換細胞を含む組織に浸透することが可能となり；形質転換細胞によって内部移行されることが可能となり；耐性（例えば、上方制御された）配列の発現を妨げることが可能となる（例えば、耐性ｍＲＮＡの発現および／または耐性タンパク質産生の妨げ）。 アンチセンス、リボザイム、および／または三重らせん体分子を用いて変異遺伝子発現を低減または阻害することで、正常な標的遺伝子対立遺伝子により生成されるｍＲＮＡの転写（三重らせん体）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）も低減または阻害され、それにより、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型であるために必要な濃度よりも小さくなることが起こり得る。 そのような場合、正常な標的遺伝子活性を示す野生型ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素遺伝子のポリペプチドをコードし発現する野生型核酸分子を、遺伝子治療法によって、細胞に導入することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現を特徴とする疾患を治療または予防するのに核酸分子が使用され得るもう１つの方法は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に特異的なアプタマー分子を使用することによるものである。 アプタマーは、タンパク質リガンドに特異的または選択的に結合することを可能にする三次構造を有する核酸分子である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． １： ５−９； ａｎｄ Ｐａｔｅｌ （１９９７） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １：３２−４６）。 多くの場合、治療的タンパク質分子よりも、核酸分子が標的細胞に導入されることの方がより都合が良いため、アプタマーは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質活性を、多能な作用を有し得る薬剤または他の分子を導入することなく特異的に低減することができる方法を提供する。 標的遺伝子産物に対し特異的であり、且つ、標的遺伝子産物の活性を低減する抗体を作製することができる。 そのような抗体は、従って、負の調節技術がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の障害の治療に適している場合に投与され得る。 抗体に関する記載については、上記の抗体の節を参照されたい。 抗体産生を促すためのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質またはエピトープの動物対象またはヒト対象への注射が対象にとって有害である場合、抗イディオタイプ抗体を用いることにより、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に対する免疫応答を起こすことが可能である（例えば、Ｈｅｒｌｙｎ （１９９９） Ａｎｎ Ｍｅｄ ３１：６６−７８；およびＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ａｎｄ Ｆｏｏｎ （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ． ９４：５１−６８参照）。 抗イディオタイプ抗体が哺乳動物またはヒト対象に導入される場合、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のタンパク質に対して特異的であるはずの、抗イディオタイプ抗体に対する抗体の産生が刺激されるはずである。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現を特徴とする疾患を対象とするワクチンは、この様に作製することもできる。 標的抗原が細胞内に存在し抗体全体が使用される場合、抗体を内部移行させることが有用であり得る。 リポフェクションまたはリポソームを用いることで、標的抗原に結合する抗体またはＦａｂ領域断片を細胞の中に送達することができる。 抗体断片を用いる実施形態では、標的抗原に結合する、分子量が最も小さな阻害性断片を使用することができる。 例えば、抗体のＦｖ領域に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができる。 あるいは、細胞内標的抗原に結合する一本鎖中和抗体も投与することができる。 そのような一本鎖抗体は、例えば、一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を標的細胞集団内で発現させることにより、投与することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：７８８９−７８９３参照）。 標的遺伝子の発現、合成および／または活性を阻害する、同定された化合物は、治療有効量で患者に投与することで、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の障害を予防、治療または改善することができる。 治療有効量とは、障害の症状の改善をもたらすのに充分な化合物の量を指す。 そのような化合物の毒性および治療効果は、上記の標準的な薬学的手法によって決定することができる。 細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトで使用するための、投与量範囲を考案する際に使用することができる。 そのような化合物の投与量は、ＥＤ ５０を含み毒性がほとんどない血中濃度の範囲内であり得る。 投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動させることができる。 本発明の方法で使用されるいかなる化合物においても、治療効果のある用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。 細胞培養において決定されたＩＣ ５０ （すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルにおいて考案することができる。 そのような情報を用いることで、より正確にヒトにおいて有用な用量を決定することができる。 血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。 個体に対する有効量決定の別の例は、試験対象の血清中の「遊離型」化合物および「結合型」化合物のレベルを直接的にアッセイする能力（ａｂｉｌｉｔｙ）である。 そのようなアッセイでは、分子インプリンティング技術により作製された抗体模倣体および／または「バイオセンサー」を利用することができる。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の活性を調節することができる化合物は、重合可能なモノマーを触媒試薬によってそれらの重合の前に空間的に組織化するための鋳型、または「インプリンティング分子」として使用される。 後にインプリンティングされた分子を除去することで、化合物の反復した「ネガティブイメージ」を含有し、生物検定の条件下で分子と選択的に再結合することができるポリマーマトリックスが残る。 この技術に関する詳細な総説は、Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：８９−９４およびＳｈｅａ （１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２：１６６−１７３において見出すことができる。 そのような「インプリンティングされた」アフィニティーマトリックスは、固定化されたモノクローナル抗体成分が適切にインプリンティングされたマトリックスで置換される、リガンド結合アッセイに適している。 そのようなマトリックスをこのように使用する一例は、Ｖｌａｔａｋｉｓ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１：６４５−６４７において見出すことができる。 同位元素標識の使用により、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現または活性を調節する化合物の「遊離型」の濃度を、容易にモニタリングすることができ、ＩＣ ５０の算出に用いることができる。 そのような「インプリンティングされた」アフィニティーマトリックスは、標的化合物の局所的および選択的な結合時に光子放出能が測定可能に変化する蛍光基を含むように設計することもできる。 これらの変化は、適切な光ファイバー装置を用いてリアルタイムで容易にアッセイすることができ、その後、試験対象における用量をその個々のＩＣ ５０に基づいて迅速に最適化することができる。 そのような「バイオセンサー」の基本例は、Ｋｒｉｚ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７：２１４２−２１４４に記載されている。 併用療法で使用される場合、本発明のＥ１阻害剤は、単一剤形において、または別々の剤形として、他の治療薬と共に投与されてもよい。 別々の剤形として投与される場合、他の治療薬は、本発明のＥ１阻害剤の投与に対して前、同時、後に、投与されてもよい。 いくつかの実施形態では、本発明のＥ１酵素阻害剤は、増殖性疾患およびがんの治療に適した細胞毒、放射線療法剤（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、および免疫療法剤（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）からなる群から選択される治療薬と組み合わせて投与される。 本発明のＥ１酵素阻害剤と組み合わせての使用に適した細胞毒の例としては、限定はされないが、代謝拮抗剤（例えば、カプシタビン（ｃａｐｅｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン、５−フルオロウラシルまたは５−フルオロウラシル／ロイコボリン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、およびメトトレキサート）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ドキソルビシン、およびダウノルビシン）；ビンカアルカロイド類（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）；タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）；白金系薬剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン）；抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンおよびペグ化リポソームドキソルビシン；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、およびシクロホスファミド）；例えば、ＣＣ−５０１３およびＣＣ−４０４７；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブおよびゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、サリドマイドおよび関連類似体）；抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ）；ミトキサントロン；デキサメタゾン；プレドニゾン；およびテモゾロミドが挙げられる。 本発明の阻害剤を組み合わせてもよい作用物質の他の例としては、抗炎症剤（例えば、副腎皮質ステロイド類、ＴＮＦ遮断剤、Ｉｌ−１ ＲＡ、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびスルファサラジン）；免疫調節剤および免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、インターフェロン類、副腎皮質ステロイド類、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、およびスルファサラジン）；抗細菌剤および抗ウイルス剤；並びにアルツハイマーの治療剤（例えば、ドネペジル、ガランタミン、メマンチンおよびリバスチグミン）が挙げられる。 他の実施形態 別の態様では、本発明は複数の捕捉プローブを解析する方法に関する。 前記方法は、例えば、遺伝子発現を解析するのに有用である。 前記方法は、それぞれが互いに位置的に区別可能であり、それぞれが独特な捕捉プローブ（例えば、核酸またはペプチド配列）を有し、その捕捉プローブはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体を発現する細胞もしくは対象由来である、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体が媒介する反応が誘発されている細胞もしくは対象由来ゆらいである複数のアドレス有する二次元アレイを提供し；そのアレイを、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の核酸（例えば、精製された）、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体のポリペプチド（例えば、精製された）、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に対する抗体と接触させ、それによって複数の捕捉プローブを評価することを含む。 複数のアドレスにおける捕捉プローブとの結合（例えば、核酸の場合は、ハイブリダイゼーション）は、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸、ポリペプチド、または抗体に結合された標識から発せられるシグナルによって検出される。 捕捉プローブは、選択された試料、例えば、対照または非誘導組織または細胞から得られた核酸の試料から得られる一連の核酸であり得る。 前記方法は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸、ポリペプチド、または抗体を、複数の捕捉プローブを有する第一のアレイおよび異なる複数の捕捉プローブを有する第二のアレイと接触させることを含み得る。 それぞれのハイブリダイゼーションの結果を比較することで、例えば、第一および第二の試料の間の発現における差異を解析することができる。 第一の複数の捕捉プローブは、対照試料（例えば、野生型の、正常な、または非疾患の、非誘導の、試料（例えば、生体液、組織、または細胞試料））から得ることができる。 第二の複数の捕捉プローブは、実験試料、例えば、変異型の、リスクを有する、疾患の状態もしくは障害の状態にある、または誘導された、試料（例えば、生体液、組織、または細胞試料）から得ることができる。 複数の捕捉プローブは、そのそれぞれがＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の対立遺伝子と特異的にハイブリダイズする複数の核酸プローブであり得る。 そのような方法を使用することで、対象を診断することができ、例えば、疾患または障害のリスクを評価することができ、対象の選択された治療の適合性を評価することができ、対象がＥ１酵素阻害剤への耐性を特徴とする疾患または障害を有するかどうかを評価することができる。 別の態様では、本発明は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を解析する方法、例えば、構造、機能、または他の核酸もしくはアミノ酸配列との関連性を解析する方法に関する。 前記方法は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の核酸またはアミノ酸配列を準備し；ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列を、配列の集合（例えば、核酸またはタンパク質の配列データベース）から得られる一つもしくは複数の、または複数の配列と比較し；それによってＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体を解析すること、を含む。 前記方法は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列と、データベースの配列の間の配列同一性を評価することを含み得る。 前記方法は、例えば、インターネットで、２つ目のサイトのデータベースにアクセスすることによって、行うことができる。 データベースの例としては、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）（国立バイオテクノロジー情報センター）およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（スイスバイオインフォマティクス研究所）が挙げられる。 別の態様では、本発明は、例えば、一塩基変異多型を同定するのに有用な、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の特定の対立遺伝子を同定するのに有用な、一セットのオリゴヌクレオチドに関する。 セットには複数のオリゴヌクレオチドが含まれ、そのそれぞれは、照合位置、例えば、ＳＮＰまたは変異部位において異なるヌクレオチドを有している。 一実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、配列において互いに同一である（長さの違いを除いて）。 オリゴヌクレオチドに異なる標識が与えられることで、１つの対立遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは第二の対立遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと区別可能なシグナルを与え得る。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体分子の配列は、その使用を促す種々の媒体に提供される。 配列は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の分子を含有する、単離核酸またはアミノ酸分子以外の、製造物として提供され得る。 そのような製造物は、天然に、または精製された形態で存在するように、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列、またはそのサブセットの試験に直接適用できない手段を用いて、製造物を試験することを可能にする形態で、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列（例えば、オープンリーディングフレーム）を与え得る。 ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、コンピューター可読の媒体上に記録することができる。 本明細書で使用される場合、「コンピューター可読の媒体」とは、コンピューターによって直接読み取ることができアクセスすることができる、いかなる媒体をも指す。 そのような媒体としては、限定はされないが、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；光学記憶媒体（例えば、コンパクトディスクおよびＣＤ−ＲＯＭ）；電気的（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ）記憶媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等）；並びにこれらのカテゴリーの一般的なハードディスクおよびハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）が挙げられる。媒体は、本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列情報をその上に有するように適合され、形成される。 本明細書で使用される場合、「電子装置」という用語には、データまたは情報を保存するように設計または適合された、他の機器のいかなる適切な演算装置または処理装置も含まれることが意図される。 本発明での使用に適した電子装置の例としては、独立型演算装置；ネットワーク（例えば、構内ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ） インターネット、イントラネット、およびエクストラネット）；電子装置（例えば、携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケットベル等）；並びに局域内および分散処理システムが挙げられる。 本明細書で使用される場合、「記録された」とは、電子装置可読媒体上の情報を保存またはコード化するためのプロセスを指す。 当業者は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列情報を含む製造物を作製するための、公知の媒体に情報を記録する現在公知の方法のいずれをも、容易に取り入れることができる。 本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を記録して有するコンピューター可読の媒体を作製するために、当業者は種々のデータ保存構造体を利用することができる。 データ保存構造体の選択は、一般的には、保存された情報にアクセスするために選択される手段に基づく。 さらに、種々のデータプロセッサのプログラムおよびフォーマットを用いることで、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター可読媒体に保存することができる。 配列情報は、市販のソフトウェア（例えば、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ）でフォーマットされた文書処理テキストファイルで表すことができ、またはデータベースアプリケーション（例えば、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅ等）に保存されたＡＳＣＩＩファイルの形態で表すことができる。 当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報を記録しているコンピューター可読媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサ構造化フォーマット（ｄａｔａｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒｍａｔ）（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に採用できる。 コンピューターで読み取り可能な形態で本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を提供することによって、当業者は様々な目的でその配列情報に日常的にアクセスすることができる。 例えば、当業者は、本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をコンピューターで読み取り可能な形態で用いることで、標的配列または標的構造モチーフを、データ保存手段内に保存された配列情報と比較することができる。 検索が、特定の標的配列または標的モチーフと一致する本発明の配列の断片または領域を同定するために用いられる。 従って、本発明は、対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の素因を有しているかどうかを決定するための方法を実行するための説明書を保存するための媒体を提供し、ここで、該方法は、対象に関連しており、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列情報に基づく、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列情報を決定するステップ、その対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害を有しているかどうかを決定するステップ、および／またはその疾患、障害、もしくは罹患前状態に対する特定の治療を推薦するステップを含む。 本発明はさらに、電子装置および／またはネットワークにおいて、対象が、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患素因を有するかどうかを決定するための方法を提供し、ここで、該方法は、対象に関連しており、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列情報に基づく、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列情報を決定するステップ、その対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の素因を有しているかどうかを決定するステップ、および／またはその疾患、障害、もしくは罹患前状態に対する特定の治療を推薦するステップを含む。 前記方法はさらに、対象に関連する表現型の情報を受け取るステップ、および／または対象に関連する表現型の情報をネットワークから入手するステップを含んでいてもよい。 本発明はまた、ネットワークにおいて、対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の素因を有しているかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は、対象からのＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の配列情報および／またはそれに関する情報を受け取るステップ、対象に関連する表現型の情報を受け取るステップ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に対応する、および／またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害に対応し、表現型の情報、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の情報（例えば、配列情報および／またはそれに関する情報）、およびその得られた情報のうちの一つまたは複数に基づく情報をネットワークから入手するステップ、その対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の素因を有しているかどうかを決定するステップを含む。 前記方法はさらに、その疾患、障害、もしくは罹患前状態に対する特定の治療を推薦するステップを含んでいてもよい。 本発明はまた、対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の素因を有しているかどうかを決定するためのビジネスモデルを提供し、前記モデルは、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関する情報（例えば、配列情報および／またはそれに関する情報）を受け取るステップ、対象に関連する表現型の情報を受け取るステップ、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する、および／またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害に関連し、表現型の情報、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の情報、およびその得られた情報のうちの一つまたは複数に基づく情報をネットワークから入手するステップ、その対象がＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害、またはＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の素因を有しているかどうかを決定するステップを含む。 前記方法はさらに、その疾患、障害、もしくは罹患前状態に対する特定の治療を推薦するステップを含んでいてもよい。 本発明には、本発明のＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列を含むアレイも含まれる。 アレイを用いることで、アレイにおける一つまたは複数の遺伝子の発現をアッセイすることができる。 一実施形態では、アレイを用いることで、組織における遺伝子発現をアッセイして、アレイにおける遺伝子の組織特異性を確認することができる。 このようにして、最大で約７６００個の遺伝子を発現について同時にアッセイすることができ、そのうちの１つをＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体にすることができる。 これにより、一つまたは複数の組織において特異的に発現される一連の遺伝子を示すプロファイルを作成することが可能となる。 そのような定性的な情報に加え、本発明は遺伝子発現の定量化を可能にする。 従って、組織特異性だけでなく、確認できるのであれば、組織内の一連の遺伝子の発現レベルもである。 従って、遺伝子は、それらの組織内発現それ自体、および組織内の発現レベルに基づいて分類され得る。 これは、例えば、その組織における遺伝子発現の関連性を確認する際に有用である。 従って、ある組織を混乱させ、第二の組織における遺伝子発現に対するその影響を決定することができる。 これに関連して、生物学的刺激に応答しての、ある細胞型の別の細胞型に対する影響を決定することができる。 これに関連して、生物学的刺激に応答しての、ある細胞型の別の細胞型に対する影響を決定することができる。 そのような決定は、例えば、遺伝子発現レベルでの細胞間相互作用の影響を知るために有用である。 作用物質が、ある細胞型を処置するために治療的に投与され、別の細胞型に対して望ましくない影響を有する場合、本発明は、望ましくない影響の分子基盤を決定するアッセイを提供し、それによって、相殺的な作用物質を同時投与する、または望ましくない影響を治療する機会を提供する。 同様に、単一細胞型の中であっても、望ましくない生物学的効果は、分子レベルで決定することができる。 このように、標的遺伝子以外の発現に対する作用物質の影響は、確認および相殺が可能である。 別の実施形態では、アレイを用いて、アレイにおける一つまたは複数の遺伝子の経時的な発現をモニタすることができる。 これは、種々の生物学的な関連において、本明細書に記載されるような、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体に関連する疾患もしくは障害の発症、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に関連する疾患または障害の進行、およびＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体に関連する疾患または障害に伴う細胞形質転換等のプロセスを生じ得る。 アレイはまた、同一の細胞または異なる細胞における、ある遺伝子の発現の他の遺伝子の発現に対する影響（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の発現の他の遺伝子の発現に対する影響の確認）を確認するのに有用である。 これは、例えば、最終的または下流の標的を制御することができない場合に、治療介入のための替わりとなる分子標的の選択を与える。 アレイはまた、正常細胞および異常細胞における、一つまたは複数の遺伝子の発現差異パターンを確認するのにも有用である。 これにより、診断または治療介入のための分子標的として機能し得る一連の遺伝子（例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体）が提供される。 本明細書で使用される場合、「標的配列」は、６以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸から成る、あらゆるＤＮＡまたはアミノ酸配列であり得る。 標的配列が長くなるほど、標的配列がデータベースに偶発的に発生する可能性が低くなることは、当業者には容易に理解され得る。 標的配列の典型的な配列長は約１０〜１００アミノ酸または約３０〜３００ヌクレオチド残基である。 しかし、商業上重要な断片（例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関わる配列断片）がより短い長さであってもよいことは、周知である。 当業者が、解析および他の配列との比較のために、コンピューター可読媒体中に提供される配列情報にアクセスすることを可能にするコンピュータソフトウェアは、公的に利用可能である。 様々な公知のアルゴリズムが公開されており、検索手段を実行する様々な市販ソフトウェアが、本発明のコンピューターに基づくシステムにおいて、使用され、使用可能である。 そのようなソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩ）が挙げられる。 従って、本発明は、コンピューター可読のマトリックス上に配列を記録することを含む、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列のコンピューター可読の配列記録を作成する方法に関する。 一実施形態では、前記記録には以下のうちの一つまたは複数が含まれる：ＯＲＦの同定；ドメイン、領域、または部位の同定；転写開始の同定；転写ターミネーターの同定；タンパク質の完全長アミノ酸配列、またはその成熟型；コード領域の５'末端。 別の態様では、本発明は配列を解析する方法に関する。 前記方法は、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体の配列、またはコンピューターで読み取り可能な形態の記録を提供し；第二の配列をＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列と比較し；それによって配列を解析することを含む。 比較には、配列同一性について配列を比較すること、またはある配列がその他の配列の中に含まれているかどうかを決定すること、例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、または他のＥ１酵素変異体の配列が比較されている配列を含むかどうかを決定すること、が含まれ得る。 一実施形態では、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体、または第二の配列は、第一のコンピューター（例えば、第一のサイト）に保存され、第二のコンピューター（例えば、第二のサイト）で比較が実行、読み出し、または記録される。 例えば、ＵＢＡ３、ＵＡＥ、もしくはＵＢＡ６、もしくは他のＥ１酵素変異体、または第二の配列は、あるコンピューターにおける公的なまたは私有のデータベースに保存することができ、実行された比較の結果は、第二のコンピューターに読み出しまたは記録することができる。 一実施形態では、前記記録には以下のうちの一つまたは複数が含まれる：ＯＲＦの同定；ドメイン、領域、または部位の同定；転写開始の同定；転写ターミネーターの同定；タンパク質の完全長アミノ酸配列、またはその成熟型；コード領域の５'末端。 本発明がより完全に理解されるために、以下の調製例および試験例を記載する。 これらの例は例示のみが目的であって、いか様にも本発明の範囲を限定していると解釈されるべきではない。 実施例１ 細胞株培養物を、ＡＴＣＣにより推奨されており、以前に報告されている（Ｓｏｕｃｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）適切な細胞培地を用いて維持した。 耐性細胞株を得るために、ＨＣＴ−１１６細胞、Ｃａｌｕ−６細胞およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を、高濃度のＭＬＮ４９２４（ＥＣ ９０濃度以上、ＨＣＴ−１１６、Ｃａｌｕ−６は１μＭおよびＮＣＩ−Ｈ４６０は１０μＭ）と共に４日間インキュベートし、その後、残った細胞を取り出し、単一細胞クローンとして播種し、薬剤を含まない培地中で培養した。 細胞生存アッセイを、以前に報告されたように（Ｓｏｕｃｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９）、９６時間のＡＴＰｌｉｔｅアッセイ（パーキンエルマー社）を用いて、完了した。 薬剤排出阻害剤実験 定量ＲＴ−ＰＣＲ 結果 ＮＥＤＤ８経路における変化によりＭＬＮ４９２４耐性が説明できるかどうかを決定するために、細胞を、遺伝子転写物レベルの変化またはＮＡＥβ、ＮＡＥ１、ＮＥＤＤ８もしくはＵｂｃ１２におけるＤＮＡ変異の存在について評価し、ＮＥＤＤ化（ｎｅｄｄ化）についてプライマリーＥ２（ｐｒｉｍａｒｙ Ｅ２）を評価した。 ＮＥＤＤ化経路遺伝子のｍＲＮＡレベルに有意な変化は見られなかった（表１参照）。 ＡＢＣ輸送タンパク質のｍＲＮＡレベルに変化が観察されたが；ＭＬＮ４９２４活性は薬剤排出阻害剤との共インキュベーションにより影響を受けていなかった（図８Ａ〜Ｃ）。 高濃度のＭＬＮ４９２４への短期間暴露（４日）の後に、耐性細胞株を選択した。 全ての細胞株をクローン集団として単離し、ＭＬＮ４９２４に対して耐性であり、他の化学療法剤（例えば、プロテアソーム阻害（ボルテゾミブ）、アントラサイクリン（ドキソルビシン）およびトポイソメラーゼＩ阻害剤（ＳＮ−３８））に対してなお感受性であることを示した。 これらのクローンのＲＴ−ＰＣＲ分析により、いくつかの細胞株において、薬剤排出機序の上昇、並びにＰｇＰおよびＢＣＲＰのｍＲＮＡの検出増加が示された。 しかし、いくつかのＰｇｐ阻害剤、ＢＣＲＰ阻害剤およびＭＲＰ２阻害剤と共に細胞を同時処理しても細胞のＭＬＮ４９２４（ジピリダモール（Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、ＭＫ５１９（Ｇｅｋｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、ＧＦ１２０９１８（Ｈｙａｆｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、Ｋ０１４３（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）およびＬＹ５９７９（Ｄａｎｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）に対する感受性が増加しなかったことから、薬剤排出の上昇は耐性に大きく寄与していないように思われる。このデータ、およびＮＡＥβにおける変異の存在は、耐性が標的酵素における変異により決定されることを示している。 実施例２． 耐性ｃＤＮＡ配列の単離および特徴付け ゲノム単離およびＤＮＡ塩基配列決定法 ＳＡＮＧＥＲ配列決定法 ＳＥＱＵＥＮＯＭ配列決定法 １５ｎｌの増幅産物および伸長産物を、Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ ＲＳ１０００を用いて３８４ ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ ＩＩにスポットする。 ３点キャリブラントを全てのチップに加えて、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ小型質量分析計の適切な実行を確認する。 ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ ＩＩをＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ小型質量分析計中に設置する。 質量分析計を、３８４ウェルｓｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ上の各スポットに対して、最高９回の読み取りが行われるように設定する。 セクエノム社（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から入手したＴｙｐｅＰＬＥＸ ＧｏｌｄキットＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ ＩＩ（１０１４２−２）を、製造業者推奨のプロトコルに従って使用する。 セクエノム社製解析ソフトウェアであるＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｔｙｐｅｒ Ａｎａｌｙｚｅｒ ｖ４を用いて解析を行う。 次世代配列決定（ＮＧＳ）法 結果 これらの変異を、さらなる質量分析ベースの配列決定法および次世代配列決定法を用いて確認した（表５）。 変異の位置は、ヌクレオチド結合ポケット内の、またはＮＥＤＤ８がＮＡＥβ（Ｇ２０１Ｖ、Ｅ２０４Ｋ、Ｎ２０９Ｋ、Ｃ３２４Ｙ）に結合する能力に影響を与える際の、ＭＬＮ４９２４結合の改変（Ａ１７１ＴおよびＡ１７１Ｄ）と一致するであろう。 注意すべきことに、ＮＥＤＤ８内のヘテロ接合変異（Ｉ４４Ｔ）が耐性クローンの中で維持される野生型ＨＣＴ−１１６細胞において検出された。 しかし、このＮＥＤＤ８変異体の活性は生化学分析では野生型ＮＥＤＤ８と同一であった（データ未記載）。 Ｙ２２８Ｈ変異はＮＥＤＤ８のＣ末端をアデニル化ドメインに「固定」するのに重要であることが以前に示された残基と一致し、Ｙ２２８の変異はＮＥＤＤ８アデニル化を減少させることが以前に示されている（Ｗａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。 このことは、この変異酵素がＮＥＤＤ８活性化に機能しないことを示唆するものであろう。 さらに、Ｃ３２４Ｙで検出される変異は、切断されたＮＥＤＤ８結合の構造的混乱を通じてＮＥＤＤ８結合にも影響を与え得るＮＡＥβの領域に存在する（図９Ｂ参照）。 興味深いことに、１７１位のアラニンは大部分のＥ１活性化酵素（例えば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ６およびＳｕｍｏ−活性化酵素）において保存されており、このことは、これらの酵素の選択的阻害剤が同じ耐性機序の影響を受け易い場合があることも示唆している。 実施例３． ウエスタンブロット解析 細胞周期解析 対数増殖中の細胞をＭＬＮ４９２４またはＤＭＳＯと共に表示される時間インキュベートした。 集めた細胞を７０％エタノールで固定し、４℃で一晩保存した。 固定した細胞を遠心してエタノールを除去し、ペレットを、ＰＢＳ中のヨウ化プロピジウムおよびＲＮａｓｅＡに、遮光した氷上で１時間かけて再懸濁した。 細胞周期分布を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ベクトン・ディッキンソン社）を用いて決定し、Ｗｉｎｌｉｓｔソフトウェア（ベリティ社（Ｖｅｒｉｔｙ））を用いて解析した。 結果 これらのデータは、インビトロで得たＭＬＮ４９２４耐性細胞株がＮＡＥβにヘテロ接合変異を有し、結果としてＮＡＥ阻害に対する感受性が低いことを示すものである。 実施例４． 免疫無防備状態のラットおよびマウスにおける抗腫瘍性試験 耐性ｃＤＮＡ配列の単離および特徴付けを実施例２の通りに行った。 薬力学的マーカー解析 腫瘍異種移植片中のＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体のレベル測定 結果 腫瘍がＭＬＮ４９２４に対して安定な耐性を有していることを確認するために、Ａ１７１Ｔ変異を有する１つの異種移植片をヌードラットに再移植した。 野生型異種移植片と比較した場合、ＭＬＮ４９２４の抗腫瘍活性は劇的に低減され、１サイクルの１５０ｍｇ／ｋｇのＭＬＮ４９２４（１、４、８、１１日目）により、腫瘍成長の阻害は、野生型異種移植片において観察された９４％（腫瘍退縮も含む）と比較して、たった３８％だけであった（図１３Ｂ）。 ＳａｎｇｅｒおよびＳｅｑｕｅｎｏｍ法の両方で確認したところ、Ａ１７１Ｔ ＮＡＥβ変異はこの耐性異種移植モデルにまだ存在していた。 ＷＴ ＨＣＴ−１１６およびＡ１７１Ｔ ＨＣＴ−１１６耐性異種移植片におけるＭＬＮ４９２４によるＮＥＤＤ８経路阻害の薬力学的解析を、１５０ｍｇ／ｋｇのＭＬＮ４９２４の単回投与の後に行った。 ＮＥＤＤ８−カリンレベルの最大阻害は、Ａ１７１Ｔ耐性モデルにおいての投与から８時間後と比較して、ＷＴ ＨＣＴ−１１６異種移植片においては投与の早くも１時間後に起こった（図１３Ｃ）。 ＮＥＤＤ８−カリンレベルに対する影響の減少と一致して、Ａ１７１Ｔ ＨＣＴ−１１６において、ＷＴ ＨＣＴ−１１６異種移植片と比較して、Ｃｄｔ１（図１３Ｄ）および切断型カスパーゼ３により測定されるアポトーシス（図１３Ｅ）およびＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体（図１３Ｆ）のレベルの減少があった。 これらのデータは、臨床的に意義のある用量スケジュールで処置された腫瘍異種移植片が、ＮＡＥβ内の変異と関連する、ＭＬＮ４９２４に対する耐性を獲得し得ることを示している。 ＮＡＥβ変異はこの研究における耐性の最大の原因であると思われるため、ＮＡＥ阻害後の細胞の成行きに関わらず、これによりＭＬＮ４９２４のその標的に対する選択性が確認される。 ＮＡＥβに変異を含まないＴＨＰ−１ ＡＭＬ異種移植片の再成長を観察したところ、ＭＬＮ４９２４に対する耐性の他の機構も生汁可能性が高いことが示唆された。 実施例５． 方法 結果 活性化Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）が、恒常的活性型ＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害を通じてＭＬＮ４９２４に対して特に感受性になり得ることを以前に示した（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 再複製が末期的予後（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ）を促さないモデルにおいて、ＮＡＥβ変異を介したＭＬＮ４９２４に対する耐性が生じるかどうかを決定するために、ＯＣＩ−Ｌｙ１０異種移植片を有するマウスに、９０ｍｇ／ｋｇのＭＬＮ４９２４を１日２回、週２回、１００日間より長期に亘って投与した。 以前の発見と一致して、ＭＬＮ４９２４によりＯＣＩ−Ｌｙ１０モデルにおいて腫瘍退縮が誘導された（図１４Ｆ）。 １種の腫瘍のみが処置中に再成長し、続く解析により、ＮＡＥβのＥ２０４Ｇにおけるヘテロ接合変異が明らかにされた。 その腫瘍を再移植したところ、その他の再導入された耐性腫瘍と同様に、９０ｍｇ／ｋｇ、１日２回のＭＬＮ４９２４処置に対して耐性であった（図１４Ｇ）。 これらのデータは、ＭＬＮ４９２４依存性の末期的予後または遺伝的背景にかかわらず、ある特定のＮＡＥβ変異がＭＬＮ４９２４に対する耐性を促進し得ることを示している。 ＭＬＮ４９２４は再複製を介して細胞にＤＮＡ損傷を誘導するが（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）、このＤＮＡの過剰複製を誘導する機構は、ランダム変異誘発の増加による耐性の発達を補助し得る。 ＨＣＴ−１１６細胞、Ｈ４６０細胞およびＣａｌｕ−６細胞は全てＤＮＡ再複製を起こすが、ＯＣＩ−Ｌｙ１０細胞は起こさない（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 ＯＣＩ−Ｌｙ１０モデルにおいてＮＡＥβ変異を検出することができたが、このことは、耐性変異体はＭＬＮ４９２４の作用機序にかかわらず発生し得ることを示唆している。 ＨＣＴ−１１６細胞はＤＮＡミスマッチ修復タンパク質のＭＬＨ１が欠失しており（Ｔａｖｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、これによりＨＣＴ−１１６細胞は、ゲノム不安定性が増加することによって、耐性変異をより起こし易くなっている可能性がある。 この主張は、これらの研究で使用される、ＤＮＡ修復に同じ欠失を持たない他のものと比較した、ＨＣＴ−１１６細胞株および異種移植片において検出される変異の数によって裏付けることができる。 実施例６． ＮＡＥβおよび変異型酵素の生化学的な特徴付け 材料 アッセイ ５ｎＭのＮＡＥ、１ｍＭのＡＴＰおよび０．２ｍＭのＰＰｉ（５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［３２Ｐ］ＰＰｉ）を含む９６ウェルアッセイプレート中に各化合物を段階希釈することにより、ＩＣ ５０を決定した。 ＮＥＤＤ８（ＷＴ、Ａ１７１Ｔ／Ｄについては０．１６μＭ、Ｎ２０９Ｋ、Ｅ２０４ＫおよびＧ２０１Ｖについては２．５μＭ）を添加して反応を開始させた。 アッセイを５０μＬの最終体積で３７℃で６０分間インキュベートし、前述の通りに停止させた。 酵素可逆性アッセイを、以前に記載された（Ｓｏｕｃｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８−ＧＳＴ−ＵＢＣ１２ ＨＴＲＦ ＳＨ基転移アッセイにおいて実行した。 希釈後の各酵素の最終濃度は、１０ｐＭ ＷＴ ＮＡＥβ、１２．５ｐＭ Ａ１７１Ｔ ＮＡＥβ、３０ｐＭ Ｎ２０９Ｋ ＮＡＥβ、および３３ｐＭ Ｅ２０４Ｋ／Ｇ２０１Ｖ ＮＡＥβであった。 ＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１装置（ＧＥヘルスケア社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で行った。 Ｎ末端ＧＳＴ標識化ＮＡＥ酵素調製物を、抗ＧＳＴ抗体捕捉法（Ｃｈｅｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８６：４０８６７−４０８７７に記載）を用いてセンサーチップ表面に固定化した。 ＳＰＲデータを、２５℃で、９０μＬ／分の流速を用いて、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％Ｐ−２０（界面活性剤）、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ含有する試料泳動緩衝液（ｐＨ７．５）中で集めた。 全てのデータ収集（二連）および後の解析は、組換えＧＳＴを対照として用いて行った。 結合および解離速度のデータを単一指数関数的増加式または減少式に当てはめた。 平衡親和結合データを、単一部位結合結合モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて当てはめた。 結果 ＭＬＮ４９２４が、ヌクレオチド結合部位を占有し、ＮＥＤＤ８およびＭＬＮ４９２４間で共有結合付加体を形成することによって、ＮＡＥのＮＥＤＤ８−ＮＡＥβチオエステル形態を阻害することが以前に示された（Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 ＷＴおよび変異型酵素に対するＭＬＮ４９２４の阻害活性の影響を決定するために、１ｍＭの濃度のＡＴＰを用いてＰＰｉ−ＡＴＰアッセイを行った。 興味深いことに、Ａ１７１Ｔ変異体は、ＷＴ酵素と比較して作用強度においてわずか２倍の減少で、ＭＬＮ４９２４により阻害され得た（表７および表８）。 ＭＬＮ４９２４は１００μＭの濃度までＡ１７１Ｄを阻害しなかったが、このことは、ヌクレオチド結合ポケットにおいて嵩が大きいアスパラギン酸残基がＭＬＮ４９２４の結合を妨害していることを示している。 ＭＬＮ４９２４は、ＷＴ酵素と比較して、ＮＥＤＤ８結合間隙変異体に対して、およそ１０倍活性が低かった。 構造的に類似したＮ６置換アデノシンスルファメートである、化合物１を、ＭＬＮ４９２４との比較用に使用した（Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 ＡＴＰ−ＰＰｉアッセイによる化合物１の作用強度は、Ａ１７１Ｔ変異体に対しては７倍減少し、Ａ１７１Ｄ変異体に対しては１７，０００倍減少した。 作用強度における顕著な減少が、ＮＥＤＤ８結合ポケット変異体において、化合物１によっても観察された。 インビトロにおける酵素阻害のＩＣ ５０は観察されたＭＬＮ４９２４への耐性を完全には説明していなかったため、さらなる化合物の特徴付けを行って、酵素不活性化の速度および化合物阻害の可逆性を評価した。 Ａ１７１Ｄ ＮＡＥβ変異体は、ＭＬＮ４９２４阻害に対して完全に非感受性であったため、これらの研究で使用しなかった。 酵素−阻害剤複合体である、ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４またはＮＥＤＤ８−Ｃｐｄ１を酵素上に予め形成させ、精製し、ＵＢＣ１２ ＳＨ基転移反応に添加して、酵素活性の回復を測定した（図１５Ａ〜Ｅ）。 以前に報告されたように、ＭＬＮ４９２４−ＮＥＤＤ８はＷＴ ＮＡＥβに対して堅固に結合する阻害剤であり、その酵素活性は２４０分間でＤＭＳＯ対照レベルのおよそ３０％まで回復する。 対照的に、ＭＬＮ４９２４阻害後の酵素活性の回復は、Ａ１７１Ｔ、Ｎ２０９Ｋ、Ｅ２０４ＫおよびＧ２０１Ｖ変異体に対するＤＭＳＯ対照のそれに類似していた。 これらのデータは、ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４９２４付加体は、変異型酵素によって形成されはするが、もはや堅固に結合する阻害剤ではないことを示している。 化合物１−ＮＥＤＤ８付加体は、２４０分において酵素活性の検出可能な回復無しに、ＭＬＮ４９２４−ＮＥＤＤ８付加体よりも堅固にＷＴ ＮＡＥβに結合する。 さらに、化合物１−ＮＥＤＤ８付加体は、変異型ＮＡＥ酵素全てのより堅固な結合剤であると思われ、このことは、ＭＬＮ４９２４と比較して、化合物１が細胞における変異型酵素のより強力な阻害剤であり得ることを示唆している。 （結合速度の概要については表９を、解離の半減期については表１０を参照されたい） Ａ１７１Ｔ変異体およびＮ２０９Ｋ変異体の両方についてのＭＬＮ４９２４による酵素の不活性化の速度も、ＷＴ酵素および変異型酵素の不活性化の速度がＭＬＮ４９２４よりも速かった化合物１とは対照的に、ＷＴと比較して劇的に低速化した（表１１）。 これらのデータは、ＮＡＥβにおける変異によって付与される耐性、すなわち、ＮＥＤＤ８−ＭＬＮ４２９４付加体の不活性化速度の低下および解離速度の上昇を説明するための理論的根拠を与える。 ＭＬＮ４９２４および化合物１はアデノシン基により大きなインダンＮ６置換を有する。 置換がないアデノシンスルファメートはＡ１７１Ｔ ＵＢＡ３変異体に対するその作用強度を失わない。 ＡＴＰ結合ポケット内の保存的アラニンにおける変異は、Ｎ ６置換アデノシン（ａｎｄｅｎｏｓｉｎｅ）スルファメート様阻害剤に対する耐性の機構として機能し得る。 実施例７． 細胞培養の洗浄除去および免疫沈降解析 結果 生化学的アッセイおよび細胞系アッセイにおけるデータにより、酵素により堅固に結合することができたＮＥＤＤ８−Ｃｐｄ付加体が、ＭＬＮ４９２４治療誘発性ＮＡＥ変異への耐性を克服し得ることが示されるであろう。 この仮説を試験するために、生化学分析においてＭＬＮ４９２４と比較して、酵素阻害速度がより速く、回復速度がより遅かった化合物１を用いた。 ＨＣＴ−１１６のＷＴ細胞、Ａ１７１Ｔ変異型細胞およびＧ２０１Ｖ変異型細胞を、漸増濃度の化合物１に４時間暴露し、経路活性をウェスタンブロッティングで評価した（図１８Ａ〜Ｃ）。 化合物１はＵＢＡ１も阻害するため、全ての細胞におけるＵＢＣ１０（ユビキチンのＥ２）のユビキチン化およびポリユビキチン化の同程度の阻害を示せた。 ＭＬＮ４９２４とは対照的に（図１０参照）、化合物１は、ＷＴ細胞と比較して、Ｇ２０１Ｖ変異型細胞においてＮＡＥβ−ＮＥＤＤ８、ＮＥＤＤ８−カリンおよびＮＥＤＤ８−ＵＢＣ１２の同程度の阻害を生むことができたが、ＷＴと比較して、Ａ１７１Ｔ変異型細胞には中程度の減少があった。 これは、Ａ１７１Ｔ生化学分析の化合物１で見られたより速い酵素活性回復を反映したものであり得る。 これらのデータは、向上した結合親和性を有するＮＥＤＤ８−化合物が、特定されたＮＡＥβ変異において観察される耐性を克服し得ることを示唆している。 ＮＡＥβにおける治療誘発性変異が、ＡＴＰ結合ポケットおよびＮＥＤＤ８結合間隙で検出され、アラニン１７１におけるおよそ２／３が潜在的なホットスポットである可能性が示された。 両領域内の変異は一般にＡＴＰまたはＮＥＤＤ８に対する親和性の変化をもたらすものであるが、これは、ＮＡＥの触媒反応速度に劇的な変化をもたらさなかった（Ａ１７１ＤおよびＧ２０１Ｖの場合を除く）。 しかし、ＮＡＥβの両領域における変異は、酵素阻害の速度低下およびもはや堅固に結合していないＭＬＮ４９２４−ＮＥＤＤ８付加体をもたらす。 ＭＬＮ４９２４−ＮＥＤＤ８付加体の形成がＭＬＮ４９２４による強力なＮＡＥ阻害に必要であること、並びに付加体の堅固な結合性質がインビトロおよび細胞での作用強度に必要であることが以前に示された（Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。 この見解と一致して、細胞における経路阻害の低減および細胞洗浄除去実験における化合物阻害からのより迅速な回復が示された。 非選択的Ｅ１阻害剤（化合物１）を用いて、インビトロおよび細胞におけるより強力な酵素阻害の影響を探索した。 化合物１はインビトロでＮＥＤＤ８と付加体を形成し、試験されたＷＴ酵素およそ変異型酵素において、ＭＬＮ４９２４と比較して、酵素阻害からの回復速度の低下を示す。 これらのデータは、化合物１−ＮＥＤＤ８付加体が、ＭＬＮ４９２４と比較して、ＷＴ型ＮＡＥβ酵素および変異型ＮＡＥβ酵素のより堅固な結合剤であることを示している。 実際、Ａ１７１Ｔ変異型およびＧ２０１Ｖ変異型のＨＣＴ−１１６細胞では、化合物１はＭＬＮ４９２４よりも、ＮＥＤＤ８−カリンおよびＮＥＤＤ８−ＵＢＣ１２チオエステルレベルをより強力に阻害することができた。 これらのデータは、変異型酵素およびＷＴ酵素に対する高親和性を有するＮＡＥ選択的化合物−ＮＥＤＤ８付加体が、細胞および腫瘍異種移植片における耐性を克服するはずであるという考えを裏付けるものである。 残念なことに、阻害が生存率への影響を生じ得る他のＥ１酵素に対して化合物１は非選択的であるため（Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、細胞生存率実験または異種移植片実験においてこれを試験することはできなかった。 実施例８． 臨床的ヒト腫瘍試験 対応したＰＢＭＣも配列決定し、野生型であることが判った。 結腸： メラノーマ： 結果 およそ１０％の感度限界を有するＳｅｑｕｅｎｏｍ法での方法によっても、ＮＡＥβ変異は検出されなかった。 検出の感度を上げるため、２１のＡＭＬ試料を、ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを用いてＮＡＥβの次世代配列決定にかけたが、ＮＡＥβに変異は検出されなかった。 同様に、ＮＡＥβにおける「既存」の変異は、次世代配列決定によってＷＴ ＨＣＴ−１１６細胞、Ｃａｌｕ−６細胞またはＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に検出されなかった。 興味深いことに、一つのヘテロ接合性ＮＡＥＢ変異（アミノ酸変化Ｇ＞Ａから生じるＣ２４９Ｙ）が、Ｃｏｓｍｉｃデータベースにおいて、卵巣がん患者で報告されている（全２１８の腫瘍試料が試験された。Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（イギリス、ケンブリッジ、ヒンクストン）によって管理されるＣｏｓｍｉｃデータベースに記録されるＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＵＢＡ３を参照されたい）。 この変異は、ＮＡＥ１と結合するＮＡＥβのある領域内に存在するため（Ｗａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３）、ヘテロ二量体形成および酵素活性に干渉し得る。 従って、患者腫瘍、白血病芽細胞またはがん細胞株から単離されたＤＮＡ内で、ＮＡＥβに既存の変異を検出することができなかった。 これらの研究において、ＮＡＥβにヘテロ接合変異が検出されていることにより、細胞はＮＡＥβの１つの野生型コピーを維持している。 ＮＡＥβにおける変異が耐性を促すことを確証的に証明するための重要なモデル系は、変異型酵素のみを発現し野生型酵素は発現しない、操作された細胞株であろう。 これまでに、そのようなモデル系の開発は成功していない。 野生型酵素が成長を支持するために必要であり、細胞および異種移植片におけるＭＬＮ４９２４によってＷＴ酵素が一過性阻害の下にある場合に、変異型酵素の役割がＮＥＤＤ８結合を可能とさせることである可能性がある。 細胞および異種移植片の個体群におけるＮＡＥβの変異頻度は約５０％であるため、約０．５％の頻度までＮＡＥβ変異を検出することを可能にする質量分析法および次世代配列決定法を開発した。 細胞株、異種移植片または患者腫瘍のＤＮＡ試料に既存であったＮＡＥβにおける変異を検出することができなかったが、このことは、選択過程の間に変異が獲得されたことを示唆している。 一塩基多型データベースの検索によって、ヒト個体群において報告された変異の存在は明らかにならなかったが、変異が腫瘍においてその０．５％より低い頻度で存在するという可能性を除外することはできない。 実際に、ＮＡＥβにおける変異は、卵巣がん試料のＣ２４９Ｙにおいて、ＣＯＳＭＩＣデータベースで報告されている。 この残基は、ＮＡＥ１との結合に関わるＮＡＥβのある領域であるため（Ｗａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３）、これが恐らくはヘテロ二量体形成および酵素活性に干渉しているのであろう。 実施例９． 方法 結果 実施例１０． ウシ未標識ユビキチン（カタログ番号Ｕ６２５３）を、シグマ社（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。 Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて、バキュロウイルスを作製した。 野生型およびＡ５７３Ｄ／Ｔ Ｎ末端Ｈｉｓ６−ＵＢＡ６をＳｆ９細胞の単感染によって作製した。 ＵＡＥ Ａ５８０Ｔの発現コンストラクトを、生化学的研究用のバキュロウイルスおよび細胞培養研究用の哺乳類発現ベクターの両方で作製した。 発現タンパク質を、記載（Ｓｏｕｃｙ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７３２−７３６）の通りに、アフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、キアゲン社）または従来のクロマトグラフィーによって精製した。 変異型ＵＡＥ酵素を生化学用に精製し、哺乳類発現コンストラクトを、変異体を発現するそれらの能力について確認した。 精製したＮＥＤＤ８−化合物付加体を作製し、記載（Ｃｈｅｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８６：４０８６７−４０８７７）の通りに精製した。 Ｕｂａ６生化学反応について、実施例６と同様のアッセイ条件を使用した。 未標識ユビキチン滴定のために、Ｅ１緩衝液（上記）中に１５ｎＭのＵｂａ６、１ｍＭのＡＴＰ、０．２ｍＭのＰＰｉ（５０ＣＰＭ／ｐｍｏｌｅ［ ３２ Ｐ ＰＰｉ）を含有する反応物を、３０℃で３０分間インキュベートし、その後１０ｍＭのＰＰｉを含有する５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で停止させ、記載（Ｂｒｕｚｚｅｓｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００９）の通りに処理した。 ユビキチンを４μＭに固定した以外は同様の条件下で、ＡＴＰおよびＰＰｉ滴定を実行した。 ユビキチンはより高い濃度では阻害性であったため、阻害のトップポイントを推定Ｋ Ｍ適合から除外した。 ｋ ｃａｔ値を、１ｍＭのＡＴＰ、０．２ｍＭのＡＴＰ、４μＭのユビキチンの最適条件でのＰＰｉ−ＡＴＰ交換反応の速度から、［α− ３２ Ｐ］ＡＴＰ検量線を用いて、算出した。 ５ｎＭのＵｂａ６、１ｍＭのＡＴＰおよび０．２ｍＭのＰＰｉ（５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［ ３２ Ｐ］ＰＰｉ）を含む９６ウェルアッセイプレート中に各化合物を段階希釈することにより、ＩＣ ５０を決定した。 ４μＭのユビキチンを添加して反応を開始させた。 アッセイを５０μＬの最終体積で３０℃で６０分間インキュベートし、以前に報告された通りに（Ｂｒｕｚｚｅｓｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００９）停止および処理した。 ＵＢＡ６変異体の生化学的検討の結果を表１４にまとめる。 ＵＢＡ６変異体に対するＥ１酵素阻害剤の作用強度についてのアッセイの結果を、表１５にまとめる。 ＵＢＡ３ Ａ１７１置換と同様、巨大なＮ６置換（すなわち、嵩のある基、例えば、ヘテロアリールのアミノ置換基から遊離したインダン（例えば、プリン））を有するアデノシン−スルファメート様阻害剤（例えば、ＭＬＮ４９２４および化合物１）は、類似の位置Ａ５７３に変異を有する変異型ＵＢＡ６酵素において、作用強度を失った。 巨大な置換を持たない化合物（例えば、アデノシンスルファメート）は、それ程作用強度を失わなかった。 実施例１１． Ｅ１酵素の作製 Ｅ２酵素の作製 Ｕｂｌタンパク質の作製 Ｅ１酵素アッセイ ＮＡＥ酵素反応は計５０μＬであり、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０５％ＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ ２ 、２０μＭのＡＴＰ、２５０μＭのＧＳＨ、０．０１μＭのＵＢＣ１２−ＧＳＴ、０．０７５μＭのＮＥＤＤ８−Ｆｌａｇおよび０．２８ｎＭの組換えヒトＮＡＥ酵素を含有する。 酵素反応混合物を、化合物阻害剤と共に、およびそれ無しで、３８４ウェルプレート中で、２４℃で９０分間インキュベートし、その後、２５μＬの停止／検出緩衝液（０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０５％トウィーン２０、２０ｍＭのＥＤＴＡ、４１０ｍＭのＫＦ、０．５３ｎＭのユウロピウムクリプテート標識モノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シスバイオ・インターナショナル社）、および８．１２５μｇ／ｍＬのＰＨＹＣＯＬＩＮＫヤギ抗ＧＳＴアロフィコシアニン（ＸＬ−ＡＰＣ）抗体（プロザイム社（Ｐｒｏｚｙｍｅ）））で停止させる。 ２４℃、３時間のインキュベーション後、Ａｎａｌｙｓｔ（商標）ＨＴ９６．３８４（モレキュラーデバイス社）でＦＲＥＴの定量化を行う。 ＳＡＥ酵素反応を、ＵＢＣ１２−ＧＳＴおよびＮＥＤＤ８−Ｆｌａｇがそれぞれ０．０１μＭのＵＢＣ９−ＧＳＴおよび０．１２５μＭのＳｕｍｏ−Ｆｌａｇによって置き換えられ、ＡＴＰの濃度が０．５μＭである以外は、ＮＡＥにおいての上記の通りに行う。 組換えヒトＳＡＥ（０．１１ｎＭ）は酵素の供給源である。 ＵＡＥ酵素反応を、ＵＢＣ１２−ＧＳＴおよびＮＥＤＤ８−Ｆｌａｇがぞれぞれ０．００５μＭのＵＢＣ２−ＧＳＴおよび０．１２５μＭのユビキチン−Ｆｌａｇによって置き換えられ、ＡＴＰの濃度が０．１μＭである以外は、ＮＡＥにおいての上記の通りに行う。 組換えマウスＵＡＥ（０．３ｎＭ）は酵素の供給源である。 抗増殖アッセイ（ＷＳＴ） 抗増殖アッセイ（ＡＴＰＬｉｔｅ） インビボアッセイ インビボ腫瘍効能モデル 本明細書で参照される特許および科学文献は、当業者が利用できる知識を確立する。 別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により共通に理解されるものと同じ意味を有する。 本明細書で引用される交付済み特許、出願、および参考文献は、それぞれが参照によって組み入れられたことを具体的および個々に示された場合と同じ程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。 不一致がある場合、本開示が、定義も含めて、優先される。 本発明のいくつかの実施形態を記載したが、提供した基本例を変更することで、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を得てもよいことは明らかである。 従って、本発明の範囲が、本明細書においては例として示されており、特定の実施形態に限定することを意図したものではなく、むしろ添付の請求項によって定義されるものであることは理解されよう。 |
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