一种产小柱孢酮的灰霉菌突变株Δbcscd1及其构建方法 |
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| 申请号 | CN201710605754.3 | 申请日 | 2017-07-24 | 公开(公告)号 | CN107513502A | 公开(公告)日 | 2017-12-26 |
| 申请人 | 华东师范大学; | 发明人 | 朱品宽; 向升; 何一凡; 张成花; 许玲; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 技术领域，以野生型灰霉菌菌株为背景菌株，对其黑色素合成途径一个关键酶小柱孢 酮 脱 水 酶进行基因敲除，构建能够大量产生小柱孢酮的灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1，主要步骤如下：利用融合PCR技术，将目的基因bcscd1的5'-UTR和3'-UTR分别与潮霉素 片段 Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得基因缺失突变株Δbcscd1。通过本发明方法构建得到的基因缺失突变株遗传 稳定性 高且具有较低的毒性。本发明还提出了一种通过萃取，旋蒸以及柱层析等步骤特异性地提纯小柱孢酮的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种大量积累小柱孢酮的灰霉菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于，将小柱孢酮脱水酶编码基因Bcscd1进行敲除，得到所述大量积累小柱孢酮的灰霉菌基因工程菌株。 |
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| 说明书全文 | 一种产小柱孢酮的灰霉菌突变株Δbcscd1及其构建方法技术领域背景技术[0002] 黑色素是由酚类或吲哚类物质氧化聚合形成的多聚物，细菌、真菌、植物和动物均可以产生黑色素。研究表明，黑色素的天然理化特性赋予黑色素诸多普遍的生物学功能，如抗紫外辐射、抗氧化、抗水解酶类、结合重金属、抗杀菌剂、抗极端温度及干旱等等。这些功能使得黑色素对于生物体的生存和自我保护具有重要的作用。因此，真菌合成的黑色素对于其生理活动有重要的作用。 [0003] 真菌黑色素对于人类的日常生活也有很大的用途，具有多种应用价值，如黑色素具有防紫外线辐射的功能，因此可被用于日用化妆品工业制备防晒霜和染发剂；黑色素可以保护生物体减少重金属和极端温度的伤害，也可用作生物抗氧化剂，还可以作为生物半导体材料；食用真菌栽培过程中菌丝体转色和黑色素积累是出菇的重要前提；研究发现一些可溶性的黑色素对一些病毒如艾滋病病毒有显著的抑制效果等等。目前黑色素已经小规模用于医药、化妆品、电子及食品领域。因此来源于真菌的天然黑色素具有巨大的潜在利用价值。然而真菌黑色素的终产物因为是非均质类多酚聚合体而极难提取，相应的前体物质将有望用于合成黑色素，利于开发黑色素的应用价值。 [0004] 目前已报道存在两条黑色素合成途径，一条是出现在植物、哺乳动物、真菌和细菌中的DOPA(多巴)途径，另一条则是首先在子囊菌和半知菌中发现的DHN(二羟基萘)途径。其中，DHN途径在重要的植物病原真菌中十分普遍，包括链格孢菌(Alternaria spp.)、玉米小斑病菌(Cochliobolus heterotrophus)、炭疽菌(Colletotrichum spp.)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)以及大丽花轮枝菌(Verticillium dahliae)等。基于大丽花轮枝菌(V.dahliae)和皮炎瓶霉菌(Wangiella dermatidis)，DHN-黑色素的合成途径已经通过分子及生化手段得到确认。DHN-黑色素的合成起始于乙酸盐，通过聚酮合酶的催化生成1,3,6,8-四羟基萘(1,3,6,8-THN)，再通过特定的还原酶将1,3,6,8-THN转化为小柱孢酮(scytalone)。小柱孢酮脱水形成1,3,8-三羟基萘(1,3,8-THN)，再通过还原和脱水生成1,8-二羟基萘(1,8-DHN)，经氧化聚合生成DHN-黑色素(见图1)。 [0005] 黑色素由于其良好的应用前景及卓越的功能，长久以来倍受人们青睐。传统的真菌黑色素提取途径以及从头合成工艺都十分复杂，因此通过微生物突变株生产黑色素已经成为研究热点。 [0006] 目前，提取真菌黑色素主要是采用高温碱溶液的方法。依据黑色素在强碱溶液中溶解、强酸条件下沉淀的性质，通常采用高温条件下用1mol/LNaOH浸泡溶解真菌菌丝或粉碎后提取菌丝内的黑色素，然后用7mol/L HCl沉淀溶解在NaOH中的黑色素。目前报道的高温提取条件主要有3种，分别是高压灭菌锅内121℃20min、沸水浴2h和沸水浴5h。 [0007] 这几种方法的缺点包括：其一，菌丝处理时间成本高，于28℃、120r/min恒温摇床中培养7d，然后过滤菌丝，于70～75℃烘箱内干燥48h。其二，提取耗时且操作繁琐，提取时，分别用高压灭菌锅内121℃20min、沸水浴2h和沸水浴5h进行提取，其中沸水浴过程中需要注意补充NaOH，每30min左右摇晃一次小瓶。其三，提取效果差，菌丝黑色素提取效果为沸水浴5h＞沸水浴2h＞121℃20min。3种高温提取条件中，高温灭菌锅内121℃20min提取最简便，但提取效果较差，溶解的黑色素较少。只有增加提取温度和时间才能提高提取效果。 [0008] 目前尚未有报道获得能够大量提取真菌黑色素或相关中间产物的方法。 发明内容[0009] 本发明采用野生型灰霉菌(Botrytis cinerea)菌株B05.10，对其黑色素合成途径一个关键酶(小柱孢酮脱水酶，Scytalone dehydratase,BcSCD1)进行定点敲除，获得了一种能够大量产生小柱孢酮(scytalone)的灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1。本发明所用背景菌株B05.10是由英国Bristol大学的Risha M Patel博士馈赠。 [0010] 本发明通过对野生型灰霉菌B05.10进行遗传改造，利用分子生物学方法，获得能够稳定遗传的灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1，该菌株能够大量产生小柱孢酮(分子量大小为194)。通过分离与纯化，可获得小柱孢酮的纯物质结晶。 [0011] 本发明是通过以下技术方法实现的，本发明提出的能够大量产生小柱孢酮的基因缺失突变株Δbcscd1的构建方法，所述基因Bcscd1编码的小柱孢酮脱水酶为黑色素合成途径的关键酶包括如下步骤： [0012] 对灰霉菌黑色素合成途径中的一个关键酶小柱孢酮脱水酶的编码基因进行敲除，获得能积累黑色素合成的中间产物的突变菌株。利用同源重组片段构建法，将含有潮霉素基因Hph的上下游编码区融合，获得转化用的载体片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型的原生质体中进行同源重组，通过筛选鉴定能够大量积累黑色素合成的中间产物的基因缺失突变菌株Δbcscd1。 [0013] 小柱孢酮脱水酶编码基因是灰霉菌黑色素合成途径中的关键酶编码基因，核苷酸序列为：ATGGCTCAAGGCAGAATTTCATTCGAGGgtaagcactttccgctgtgtcttgggacaatatatcgatcataaggaataatgctaataagatatagACTACCTCGACCTCACAGCATTGGTCTTCGATTGGGGTGACAGCTACGATGCAAAGgtaacccaaccccatacccccctcccatctaattccccacatctcctaacactcccacagGACTGGAAACGACTCGAATCCATCATCGCGCCCGAGCTTCTCGTAGACTACACCACCATTGGCAAAGGCTGCTGGGAATCCATGCCCGCTTCCCAATTCATGGCCATGGTAACCGATGACGATTTCCTCGGCGATCCATGCGTCAAGACCCAACATCTTCTCGGTGCTACCCGCTGGGAGAAAATCTCAGATGATTATGTCATTGGACATCATCAATTGAGGGCTGGTCACCAAGTGTACAAAGCTGCAGATTTGAAGGAAATCAAATTGAAGGGTCACAGTCATGCCACCAATGAACATTATTACAAGAAGGTTAATGGGGTCTGGAAATTCGCGGGATTGAAACCACTTGTAAGATGGAATGAGGGTGATGGAGAGAACGATTTCTTGAAGGTTTTCAAGGGAAGCTATAAACAATAA。所述小柱孢酮脱水酶是黑色素合成途径的关键酶，小柱孢酮脱水酶编码基因缺失突变菌株，其黑色素合成缺陷，在菌落形态上与野生型菌株显著不同。同时，该突变菌株黑色素合成途径被阻断，会大量积累黑色素合成的中间产物小柱孢酮。本发明可采用任何灰霉菌(Botrytis cinerea)菌株来构建大量产生小柱孢酮的灰霉菌基因缺失突变菌株。 [0014] 本发明采用同源重组技术敲除灰霉菌小柱孢酮脱水酶编码基因bcscd1，即用潮霉素抗性基因替代目的基因表达框区域来达到使目的基因突变的目的(如图2所示)。将Bcscd1的上游5’非编码区1kb左右的片段、潮霉素基因Hph、Bcscd1的下游3'非编码区1kb左右的片段，三者通过两轮融合PCR进行连接，获得5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1融合片段，将其作为转化载体转入野生型灰霉菌原生质体细胞中，通过基因的同源重组而发生基因的替换，实现潮霉素Hph片段将目的基因Bcscd1敲除的目的。图2中所示引物的功能是检测突变的正确性。灰霉菌黑色素合成途径小柱孢酮脱水酶编码基因bcscd1(BC1G_14488)全长631bp，cDS长度为504bp，包含二个内含子，三个外显子，编码168个氨基酸。 [0015] 本发明提出的能够大量产生小柱孢酮的灰霉菌Δbcscd1基因缺失突变株的构建方法，利用融合PCR技术，将目的基因bcscd1的5'-UTR和3'-UTR分别与潮霉素片段Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型的原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得能够大量积累小柱孢酮的Δbcscd1基因缺失突变株；具体包括以下步骤： [0016] (1)融合PCR获得转化片段 [0017] 以野生型B05.10的DNA为模板，在基因bcscd1的上游非编码区设计特异性引物Bcscd1-U-F和Bcscd1-U-R(表1)，利用这一对引物和PCR技术扩增Bcscd1起始密码子上游非编码区5'Bcscd1片段(1007bp)；以野生型B05.10的DNA为模板，在基因Bcscd1的下游非编码区设计特异性引物Bcscd1-D-F和Bcscd1-D-R(表1)，利用这一对引物和PCR技术扩增Bcscd1终止密码子下游非编码区3'Bcscd1片段(1122bp)；以质粒P22为模板，用引物Hph-F和Hph–R(表1)扩增含5'和3'两个接头的潮霉素抗性基因Hph片段(2177bp)。 [0018] 其中，所述扩增bcscd1起始密码子上游非编码区5'Bcscd1片段的PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，得到5'Bcscd1片段。 [0019] 其中，所述扩增bcscd1终止密码子下游非编码区3'Bcscd1片段PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，得到3'Bcscd1片段。 [0020] 其中，所述扩增Hph片段的PCR条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，得到Hph片段。 [0021] 将上述三种PCR产物(5'Bcscd1片段，3'Bcscd1片段，Hph片段)进行等摩尔数混合，以该混合物为模板，用引物Bcscd1-U-F和Bcscd1-D-R进行高保真融合PCR扩增，得到融合片段5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1，为4306bp。 [0022] 其中，所述扩增5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1的融合PCR条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，得到5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1片段，回收产物在-20℃保存备用。 [0023] 表1同源重组片段构建所需引物 [0024] [0025] (2)PEG介导的灰霉菌原生质体转化法 [0026] 利用PEG介导的原生质体转化法，将回收后的5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1扩增产物转入野生型菌株B05.10的原生质体中，转化后的原生质体平铺在含有潮霉素抗性的平板上，在长出的单菌落中挑取转化子传代培养。转化过程中的基因同源重组策略如图2所示。 [0027] 其中，所述野生型菌株B05.10的原生质体的获得方法为： [0028] (2.1)用葡萄糖浓度为0.8％的PDA产孢培养基，23±1℃，培养野生型灰霉菌5至76 7 天，收集孢子并制成孢子悬浮液，至终浓度为10-10个孢子/ml，向100ml 1％的麦芽糖(ME)液体培养基中加入3ml上述孢子悬浮液，180rpm-200rpm，23±1℃下，振荡培养约16h，直至长出幼嫩菌丝； [0029] (2.2)将上述幼嫩菌丝转移至15ml离心管中(8管)，4500rpm离心5min； [0030] (2.3)弃去上清，用去离子水清洗菌丝(合并4管)，4500rpm离心5min； [0031] (2.4)弃去上清，用KC溶液洗涤菌丝(合并2管)，4500rpm离心5min； [0032] (2.5)重复步骤(2.4)； [0033] (2.6)将脱色的酶液转移至15ml离心管中，4500rpm离心5min，取上清，过滤除菌； [0034] (2.7)用上述酶液将洗涤好的菌丝悬浮，倒入无菌锥形瓶中，120rpm，23±1℃下，震荡酶解约1.5h至2h(大约酶解1h后，显微镜下观察原生质体裂解情况)； [0035] (2.8)PEG溶液的配制(现配现用)：称取PEG33500.25g，100μL CaCl2(500mM)，100μL Tris-HCl(100mM pH 7.4)，再用KC溶液补至1ml，过滤除菌； [0036] (2.9)将含有原生质体的酶液过滤至离心管中，1800rpm，离心10min，富集原生质体，回收酶液，重复使用； [0037] (2.10)用KC溶液轻轻地悬浮原生质体，1800rpm离心10min； [0038] (2.11)重复上述步骤； [0039] (2.12)加入少量KC溶液悬浮原生质体，显微镜下调至终浓度为106-107个/ml，冰上放置5min； [0040] (2.13)制备转化片段：根据浓度取纯化的转化片段(2ug)，加5ul亚精胺，然后用冰浴的KC溶液补至100ul，于冰上放置5min； [0041] (2.14)将冰浴好的原生质体与转化片段轻轻混合均匀，置于冰上孵育15min； [0042] (2.15)向上述混合溶液中加入PEG溶液100μl，室温下放置10min； [0043] (2.16)向上述混合溶液中加入PEG溶液200μl，室温下放置10min； [0044] (2.17)最后向上述混合溶液中加入PEG溶液500μl，室温下放置10min； [0046] (2.19)第二天在上述平板上加入一层0.8％琼脂浓度、75mg/l潮霉素浓度的PDA上层板；3-7天后在上述平板上挑取含有潮霉素抗性的单菌落于75mg/l潮霉素的PDA上培养。 [0047] 其中，所述裂解细胞壁酶液的制备方法包括：称崩溃酶0.51g(1.7％g/mL)，几丁质酶 [0048] 0.0135g(0.045％g/mL)，裂解酶0.45g(1.5％g/mL)溶解于30ml KC溶液中，200rpm，23±1℃下，振荡脱色30min。 [0049] 其中，试剂包括：KC溶液(0.6M KCl,0.05M CaCl2)；CaCl2(500mM)；Tris-HCl(100mM pH 7.4)；亚精胺(100mM)。 [0050] (3)突变体的筛选与鉴定 [0051] 将转化上层板中长出的单菌落(转化子)转移至含75mg/l潮霉素的PDA平板上，23±1℃下培养，隔天挑取菌落最边缘幼嫩菌丝，转移至新的含75mg/l潮霉素的PDA平板上，传代培养3-4代，直至转化子表型稳定。在DNA水平上分别用目的基因内部引物、潮霉素内部引物进行PCR鉴定Bcscd1敲除突变菌株，获得黑色素合成缺陷，能够大量积累黑色素合成中间产物小柱孢酮(scytalone)的突变体ΔBcscd1。 [0052] 其中，采用CTAB法提取DNA： [0054] (3.2)向上述离心管中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)溶液，震荡混匀后，12000rpm，离心10min； [0055] (3.3)取上清液于新的2ml离心管中，并重复上述步骤； [0056] (3.4)取上清液于1.5ml离心管中，依次加入等体积的异丙醇溶液和1/10体积的NaAc，轻轻上下颠倒混匀，-20℃静置30min； [0057] (3.5)12000rpm离心10min，小心倒去上清，加入300μl 75％的乙醇，洗涤沉淀； [0058] (3.6)12000rpm离心10min，弃去上清，室温放置，晾干； [0059] (3.7)加入20-30ul无菌水溶解DNA，-20℃保存备用。 [0060] 其中，CTAB提取液配方(1L)：CTAB 20g；NaCl 81.82g；1M Tris-Hcl(PH＝8.0)100ml；0.5M EDTA(pH＝8.0)40ml；蒸馏水定容至1L。 [0061] 表2突变菌株鉴定引物 [0062]引物名称 核苷酸序列(5'→3') P7 GTGACAGCTACGATGCAAAG P8 GTGACCAGCCCTCAATTGATG P9 GTCCTGCGGGTAAATAGC P10 TCGTCCATCACAGTTTGC [0063] 本发明中，所述获得的灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1的菌丝在4℃冰箱中用CM或PDA斜面培养基保存，孢子可用PDA培养基诱导产生，孢子悬浮液(1×106个/ml)中加入甘油(终浓度20％)，在-80℃冰箱中保存。 [0064] 本发明还提出了由上述方法构建得到的灰霉菌基因缺失突变菌株。 [0065] 本发明还提出了由上述方法构建得到的灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1。所述缺失突变菌株Δbcscd1能够稳定遗传，能够大量产生小柱孢酮，毒性低。 [0066] 本发明从灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1的培养方法和提取方法两方面对小柱孢酮的提取进行了条件优化。研究发现在YSS液体培养基中静置培养有利于小柱孢酮在滤液中大量积累，同时滤液pH 2-3的酸化对小柱孢酮的高效提取是必要条件。 [0067] 本发明还提出了一种灰霉菌小柱孢酮的提取方法，所述方法包括以下步骤： [0068] (1)取灰霉菌菌落边缘幼嫩菌丝，用打孔器打取菌碟，置于YSS液体培养基中，在22℃-25℃的温度条件下，静置培养12-15天； [0069] (2)将菌丝体和滤液分开，保留滤液；采用酸将滤液pH调至2-3，用乙酸乙酯萃取，然后采用无水亚硫酸钠干燥，过滤； [0070] (3)萃取滤液获得的乙酸乙酯在真空下进行干燥，获得灰霉菌小柱孢酮粗提物。 [0071] 步骤(1)中，所述YSS培养基的组成为：1L培养基中含有酵母提取物2g，葡萄糖10g，K2HPO42g，KH2PO41.5g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 0.5g。 [0072] 步骤(1)中，优选地培养的温度为23±1℃。 [0073] 步骤(1)中，优选地，培养的时间为12天。 [0074] 步骤(1)中，可采用滤纸将菌丝体和滤液分开。 [0075] 步骤(2)中，所述酸选自盐酸(HCl)、冰乙酸(aceticacid)。 [0076] 步骤(2)中，优选采用等体积乙酸乙酯萃取两次，然后合并乙酸乙酯部分，用无水亚硫酸钠干燥并过滤。 [0078] 在一个具体实施方式中，本发明灰霉菌小柱孢酮的提取方法，包括灰霉菌小柱孢酮的粗提取与初步检测，具体包括以下步骤： [0079] (4)取灰霉菌野生型及黑色素缺失突变株菌落边缘幼嫩菌丝，用直径5mm打孔器打取菌碟，置于YSS液体培养基中进行培养。YSS液体培养基培养12天后，用滤纸将菌丝体和滤液分开； [0080] (5)保留滤液，用盐酸(HCl)或冰乙酸(aceticacid)将滤液pH调至2-3，用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯部分，并用无水亚硫酸钠干燥并过滤； [0081] (6)将菌丝和滤液萃取获得的乙酸乙酯分别在真空下进行干燥获得粗提物，并将粗提物溶于少量乙酸乙酯并用薄层色谱法(TLC)进行分析； [0082] (7)薄层色谱法(TLC)分析：将粗提物溶解于乙酸乙酯并在硅胶板(F254)(青岛海洋，青岛)上点样，在乙酸乙酯：石油醚(1:1)中展开。将展开后的硅胶板在日光下和紫外光(254nm)下分别进行观察。然后将平板浸泡于1％氯化铁(FeCl3)水溶液中数秒，晾干后重新观察是否有小柱孢酮与氯化铁的颜色反应。 [0083] 本发明还提出了一种小柱孢酮的柱层析纯化方法，所述方法包括以下步骤： [0084] (1)拌样：将上述获得的粗提物用乙酸乙酯溶解，与少量硅胶混匀，在真空下除去乙酸乙酯，使粗提物充分吸附于硅胶上； [0086] (3)上样：待石油醚液面距柱子上端1-2cm时，将吸附好样品的硅胶轻轻加在柱子顶端，上面轻轻放上棉花(避免后续加淋洗剂时冲坏液面)； [0087] (4)淋洗：用石油醚：乙酸乙酯＝2:1至1:1进行淋洗，淋洗时每3-5ml收集1管； [0088] (5)将每管淋洗液逐一进行薄层层析，将仅含有目的物质的淋洗液合并； [0089] (6)将合并的淋洗液在真空下旋蒸，获得纯化的目的物质； [0090] (7)重新进行薄层色谱法(TLC)分析，确认所分离的纯物质是小柱孢酮。 [0091] 其中，所述层析柱的填料包括硅胶与60-90℃石油醚的混合物，所述硅胶与60-90℃石油醚的用量比为1:1-1:2；优选地，为1:1.5； [0092] 其中，采用“硅胶与60-90℃石油醚(petroleum ether)充分混合”作为层析柱填料的优点在于，(1)填充得到的柱子更加结实，没有气泡；(2)石油醚作为硅胶的溶剂，也可以充当层析过程中的洗液，且对层析过程无干扰。 [0093] 在一个具体实施方式中，本发明小柱孢酮的柱层析纯化方法包括以下步骤： [0094] (1)拌样：将获得的粗提物用乙酸乙酯溶解，与少量硅胶混匀，在真空下除去乙酸乙酯，使粗提物充分吸附于硅胶上； [0095] (2)装柱：将粗提物质量5-10倍的硅胶与60-90℃石油醚(petroleum ether)充分混合，并沿层析柱倒入，用洗耳球轻轻敲击层析柱使硅胶装实； [0096] (3)上样：待石油醚液面距柱子上端1-2cm时，将吸附好样品的硅胶轻轻加在柱子顶端，上面轻轻放上棉花(避免后续加淋洗剂时冲坏液面)； [0097] (4)淋洗：用石油醚：乙酸乙酯＝2:1至1:1进行淋洗，淋洗时每3-5ml收集1管； [0098] (5)将每管淋洗液逐一进行薄层层析，将仅含有目的物质的淋洗液合并； [0099] (6)将合并的淋洗液在真空下旋蒸，获得纯化的目的物质； [0100] (7)重新进行薄层色谱法(TLC)分析，确认所分离的纯物质是小柱孢酮。 [0101] 其中，所述层析柱的填料包括硅胶与60-90℃石油醚的混合物，所述硅胶与60-90℃石油醚的用量比为1:1-1:2；优选地，为1:1.5。 [0102] 本发明还提出了一种层析柱，所述层析柱的填料包括硅胶与60-90℃石油醚的混合物，所述硅胶与60-90℃石油醚的用量比为1:1-1:2；优选地，为1:1.5。 [0103] 本发明还提出了所述层析柱在用于分离纯化小柱孢酮中的应用。 [0104] 本发明的有益效果在于，本发明采用同源重组技术，PEG介导的原生质体转化法进行转化，成功将小柱孢酮脱水酶编码基因用潮霉素基因代替，获得了正常培养条件下大量积累小柱孢酮(scytalone)的基因工程菌株Δbcscd1。该菌株具有培养简单，表型稳定，致病性减弱的优点，可用于生产小柱孢酮，也可用于研究真菌的黑色素与致病性之间的关系。本发明采用利用简单的萃取，旋蒸，柱层析，能够提取小柱孢酮。小柱孢酮(scytalone)是真菌(如灰霉菌)黑色素合成途径(DHN合成途径)中的中间产物，利用其合成真菌黑色素，能够大大减少其合成步骤，简化合成工艺，并在一定程度上节约人力及物力成本，可以克服传统提取真菌黑色素方法中的耗时及步骤繁琐的缺点。 附图说明 [0105] 图1是丝状真菌以及子囊真菌的DHN黑色素合成途径。图中所示，黑色素合成途径中有三个关键酶，即聚酮合酶，还原酶，以及小柱孢酮脱水酶。小柱孢酮脱水酶的作用底物即为小柱孢酮(scytalone)。在灰霉菌B05.10中，小柱孢酮脱水酶的编码基因为Bcscd1。 [0106] 图2是同源重组法构建转化片段。 [0107] 图3是实施例2突变菌株DNA水平鉴定结果，左图为引物P9/P10鉴定抗性标记Hph的扩增产物，右图为引物P7/P8鉴定目的基因Bcscd1是否敲除的扩增产物。 [0108] 图4是实施例2，3构建得到的突变菌株与野生型菌株的菌落形态差异。在相同培养条件下，与野生型菌株相比，突变菌株连续3代单孢分离的菌落颜色呈现橘黄色，不合成黑色素，突变表型能稳定遗传。 [0109] 图5是实施例4中不同时间段，野生型菌株与突变菌株的发酵液颜色。不同菌株对应的发酵液的颜色有差异，结果显示，培养7天时，突变菌株的发酵液颜色为橘黄色；培养15天时，突变菌株的发酵液颜色为橘红色。而野生型菌株则表现为无色。 [0110] 图6是实施例4中提取的小柱孢酮(scytalone)TLC后，在紫外及FeCl3处理下的显色反应。定性检测发酵液中的小柱孢酮，TLC后，结果显示突变菌株积累小柱孢酮，而野生型菌株不积累小柱孢酮。 [0111] 图7是实施例5中将野生型灰霉菌B05.10，突变菌株ΔBcscd1以及回补菌株ΔBcscd1-C同时接种在拟南芥、番茄和葡萄上，观察其致病力。图中A为接种于拟南芥叶片上，B为接种于番茄果实上，C为接种于葡萄果实上。结果表明，与野生型灰霉菌B05.10及回补菌株ΔBcscd1-C相比，突变菌株ΔBcscd1的致病性显著减弱。 具体实施方式[0112] 在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。 [0113] 以下实施例中使用的质粒以及试剂均可以通过公开的市售渠道获得。 [0114] 实施例1、灰霉菌小柱孢酮脱水酶编码基因bcscd1的序列克隆 [0115] 本发明所用的野生型菌株B05.10为野生型灰霉菌参考菌株。首先从灰霉菌基因组数据库(Ensembl Fungi)中查找出灰霉菌标准菌株B05.10的小柱孢酮脱水酶编码基因Bcscd1的基因序列，并在该基因表达框的非编码区域设计引物，以野生型B05.10的DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，扩增产物由公司进行测序。 [0116] 实施例2、敲除片段的构建 [0117] 通过同源重组的方法，将小柱孢酮脱水酶编码基因Bcscd1用潮霉素抗性基因Hph替换敲除。具体实施步骤如下： [0118] 以野生型B05.10的DNA为模板，在基因bcscd1的上游非编码区设计特异性引物Bcscd1-U-F和Bcscd1-U-R(表1)，利用这一对引物和PCR技术扩增Bcscd1起始密码子前面的1007bp的非编码区5'Bcscd1；以野生型B05.10的DNA为模板，在基因Bcscd1的下游非编码区设计特异性引物Bcscd1-D-F和Bcscd1-D-R(表1)，利用这一对引物和PCR技术扩增Bcscd1终止密码子下游非编码区(1122bp)3'Bcscd1；以质粒P22为模板，用引物Hph-F和Hph–R(表1)扩增含5'和3'两个接头的潮霉素抗性基因Hph(2177bp)。将上述三种PCR产物(5'Bcscd1片段，3'Bcscd1片段，Hph片段)进行等摩尔数混合，以该混合物为模板，用引物Bcscd1-U-F和Bcscd1-D-R进行高保真融合PCR扩增，得到融合片段5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1为4306bp，产物在-20℃保存备用。 [0119] 利用PEG介导的原生质体转化法，将回收后的5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1扩增产物转入野生型菌株B05.10的原生质体中，转化后的原生质体平铺在含有潮霉素抗性的平板上，在长出的单菌落中挑取转化子传代培养。转化过程中的基因同源重组策略如图2所示。 [0120] 实施例3、突变菌株的获得与鉴定 [0121] 将转化上层板中长出的单菌落(转化子)转移至含75mg/l潮霉素的PDA平板上，23±1℃下培养，隔天挑取菌落最边缘幼嫩菌丝，转移至新的含75mg/l潮霉素的PDA平板上，传代培养3-4代，直至转化子表型稳定。在DNA水平上分别用目的基因内部引物、潮霉素内部引物、目的基因上游同源臂外侧引物/潮霉素内部引物及潮霉素内部引物/目的基因下游同源臂外侧引物鉴定突变菌株，用CTAB法提取基因组DNA，选取DNA水平上验证不含目的基因但转化片段插入正确的转化子，鉴定结果见图3，以引物P9和P10能从突变菌株中通过PCR扩增出潮霉素基因和hph的特征条带，不能从野生型菌株中扩增出相应条带；而以引物P7和P8进行PCR扩增，只能从野生型中得到Bcscd1的特征条带，不能从特变体中得到相应条带。综合上述结果，证明所得到的三株突变菌株中Bcscd1发生了完全的敲除，被替换为潮霉素抗性标记基因，最终确定目标突变的正确性。 [0122] 实施例4、突变菌株的发酵培养和小柱孢酮提取检测 [0123] 挑选突变菌株ΔBcscd1进行发酵培养和小柱孢酮提取检测，以野生型B05.10作为对照。 [0124] 将灰霉菌突变菌株ΔBcscd1，同时接种于已灭菌的液体YSS培养基上，放于23±1℃条件下恒温静置培养7天，15天。对发酵液进行观察记录，如图5所示，培养7天时，突变菌株的发酵液颜色为橘黄色；培养15天时，突变菌株的发酵液颜色为橘红色。而野生型菌株则表现为无色。 [0125] 对发酵液进行旋蒸处理。获得的粗提物溶于1ml乙酸乙酯，并在硅胶板上点样，用展开剂(乙醚：正己烷：甲酸＝60：40：1)对粗提物的成分进行分离。将硅胶板置于紫外光，观察小柱孢酮的积累，再用1％FeCl3处理，观察小柱孢酮的特征显色反应，如图6所示，结果显示突变菌株积累小柱孢酮，而野生型菌株不积累小柱孢酮。 [0126] 实施例5、突变菌株反接种实验验证其致病性下降 [0127] 将实施例2构建的灰霉菌黑色素合成途径下游步骤关键酶基因缺失突变体Δbcscd1、野生型灰霉菌B05.10以及回补菌株ΔBcscd1-C在拟南芥、番茄、葡萄等寄主上的致病性进行系统的比较。由图7可以看出，野生型灰霉菌B05.10和回补菌株ΔBcscd1-C的致病能力几乎一致，而突变菌株Δbcscd1的致病能力则显著下降。由于该突变菌株是黑色素合成途径缺失的菌株，这就暗示，在灰霉菌中黑色素合成的终产物对于其致病能力没有显著的影响。由于突变菌株Δbcscd1能够大量积累小柱孢酮，且由前述实验可知小柱孢酮对野生型灰霉菌的孢子萌发有一定的抑制作用，因此，可能是小柱孢酮的积累影响了突变菌株的致病能力。 [0128] 由上结果可以看出，本发明构建的突变菌株ΔBcscd1的发酵液中会大量积累黑色素合成所需的中间产物小柱孢酮，说明将小柱孢酮脱水酶编码基因bcscd1敲除后，突变菌株ΔBcscd1的黑色素合成缺陷，积累小柱孢酮，且突变菌株ΔBcscd1致病力减弱。综上所述，本发明通过同源重组技术，成功将小柱孢酮脱水酶编码基因Bcscd1敲除，获得了正常培养条件下大量积累小柱孢酮的基因工程菌株ΔBcscd1。该菌株具有培养简单，表型稳定，致病性减弱的优点，可用于工业生产小柱孢酮，也可用于研究真菌的黑色素与致病性之间的关系。 [0129] 本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。 |
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