深海微杆菌产生的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶 |
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| 申请号 | CN201710849502.5 | 申请日 | 2017-09-20 | 公开(公告)号 | CN107475271A | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 国家海洋局第三海洋研究所; | 发明人 | 汤熙翔; 许薷方; 黄平; 于丽波; 林文珍; | ||||
| 摘要 | 深海微杆菌产生的6- 磷酸 海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶，两种酶分别是深海来源的放线菌Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的TPS/TPP海藻糖合成通路中的两个酶，6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶。克隆所述两种酶，并将克隆 片段 插入载体pET-28a(+)。质粒载体转化到感受态E.coli BL21细胞后，进行诱导表达。所获得的重组酶液用His纯化柱Ni SepharoseTM6Fast Flow进行分离和纯化，得纯化的重组酶。所提供的两种重组酶在低温条件下仍具有较高的活性，如在4℃条件下，达到72.78％和50.20％的活性。 | ||||||
| 权利要求 | 1. 6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)基因为Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的6-磷酸海藻糖合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 |
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| 说明书全文 | 深海微杆菌产生的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶 技术领域[0001] 本发明涉及基因工程，尤其是涉及来源于深海的微杆菌(Microbacterium sediminis sp.nov.)YLB-01海藻糖合成TPS/TPP途径中的两个新型酶，分别是6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的编码基因以及重组表达所得到的6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)及其制备方法。 背景技术[0002] 海藻糖是一种非还原性双糖，由两个葡萄糖单体以1,1糖苷键连结而成[1]，分子式为C12H22O11·2H20，相对分子质量为Mr＝378.33。海藻糖在许多生物体内，以游离态或各种糖脂的形式存在，是细胞壁的重要组成成分，其不仅可以作为某些生物体的碳源，而且可以调控生物体的生长。海藻糖不仅是生物体内的一种能量代谢储备物质，而且通过维持蛋白质、核酸等生物大分子的稳定性，海藻糖在某些物种适应恶劣环境(如深海极端环境)中发[2]挥了重要作用 。此外，海藻糖具有独特的物理及化学性质，使其成为一种加工性能极为稳定的食品原料，适合不同类食品的加工过程[3]，在食品领域有着广阔的应用[1]。 [0003] 目前，海藻糖的生产方法主要包括化学合成法、微生物提取法、微生物发酵法、基因工程法及酶合成法等。酶合成法生产海藻糖是利用海藻糖合成酶所具有的转糖基作用，在离体条件下作用于相应底物催化生成海藻糖。迄今已发现生物体中海藻糖的合成途径至少有5条，包括TPS/TPP途径、TreS途径、TreY/TreZ途径、TreT途径和TreP途径。其中以TPS/TPP途径分布最广泛，在细菌、古细菌、真菌、昆虫和植物中最常见[4-6]，也导致其被发现较早，也应用最为广泛[7]。此途径以6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate,G6P)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose,UDPG)为底物，首先经6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)催化葡萄糖基转移反应生成6-磷酸海藻糖(Trehalose-6-phosphate,T6P)，随后经6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)催化T6P发生去磷酸化而生成海藻糖[8-11]。最初是从大肠杆菌中克隆到分别编码6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶的基因OtsA和OtsB[12]，这2个基因与E.coli细胞的渗透压抗性密切相关而得名[9]，本途径也被称作OtsA/OtsB途径。 [0004] 参考文献： [0005] [1]Elbein A D,Pan Y T,Pastuszak I,et al.New insights on trehalose:a multifunctional molecule[J].glycobiology.2003,13(4):17R-27R. [0006] [2]张玉华，凌沛学，籍保平.海藻糖的研究现状及其应用前景[J].食品与药品.2005(03). [0007] [3]刘红梅.海藻糖的加工性能及在食品行业中的应用[J].轻工科技.2013(08).[0008] [4]Pan Y T,Carroll J D,Elbein A D.Trehalose-phosphate synthase of Mycobacterium tuberculosis[J].european journal of biochemistry.2002,269(24):6091-6100. [0009] [5]Valenzuela-Soto E M,Marquez-Escalante J A,Iturriaga G,et al.Trehalose 6-phosphate synthase from Selaginella lepidophylla:purification and properties[J].Biochemical and biophysical research communications.2004, 313(2):314-319. [0010] [6]Silva Z,Alarico S,Da Costa M.Trehalose biosynthesis in Thermus thermophilus RQ-1:biochemical properties of the trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase[J].extremophiles.2005,9(1):29- 36. [0011] [7]杨艳，李增波.海藻糖TPS/TPP生物合成途径的进化研究[J].科技情报开发与经济.2008(16). [0012] [8]Cabib E,Leloir L F.The biosynthesis of trehalose phosphate.[J].The Journal of biological chemistry.1958,231(1):259-275. [0013] [9]Kaasen I,Falkenberg P,Styrvold O B,et al.Molecular cloning and physical mapping of the otsBA genes,which encode the osmoregulatory trehalose pathway of Escherichia coli:evidence that transcription is activated by katF(AppR)[J].Journal of bacteriology.1992,174(3):889-898. [0014] [10]Lunn J E,Delorge I,Figueroa C M,et al.Trehalose metabolism in plants[J].plant journal.2014,79(4SI):544-567. [0015] [11]Paul M J,Primavesi L F,Jhurreea D,et al.Trehalose metabolism and signaling[M].2008:59,417-441. [0016] [12]李镭，丁宏标，余晓斌，等.海藻糖酶法合成途径及其酶基因的重组表达研究[J].生物技术通报.2007(03). [0017] [13]De Smet K A,Weston A,Brown I N,et al.Three pathways for trehalose biosynthesis in mycobacteria.[J].Microbiology(Reading,England).2000,146(Pt1):199-208. 发明内容[0018] 本发明的第一目的在于提供6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)基因。 [0019] 本发明的第二目的在于提供6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)基因。 [0020] 本发明的第三目的在于提供6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)的重组酶。 [0021] 本发明的第四目的在于提供6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的重组酶。 [0022] 本发明的第五目的在于提供6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的制备方法。 [0023] 所述6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)基因为Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的6-磷酸海藻糖合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0024] 所述6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)基因为Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 [0025] 所述6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)的重组酶为Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的6-磷酸海藻糖合成酶的重组酶，该重组酶在低温条件下仍具有较高的活性。 [0026] 所述6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的重组酶为Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的6-磷酸海藻糖磷酸酯酶的重组酶，该重组酶在低温条件下仍具有较高的活性。 [0027] 所述6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的生产菌株为Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01，是国家海洋局第三海洋研究所生物资源与遗传重点实验室汤熙翔课题组从中国大洋一号考察船20航次(Nov.2008)在西南太平洋2327m深采集的深海沉积物中分离出的一株新型革兰氏阳性球状菌，是一株模式菌株，已于 2010年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：AB2010363，地址是武汉，武汉大学，邮编430072。 [0028] 所述6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的制备方法包括以下步骤： [0029] 1)克隆msTPS或msTPP基因，msTPS基因克隆所使用的上下游引物如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；msTPP基因克隆所使用的上下游引物如序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示； [0030] 2)PCR产物采用同源重组策略插入载体pET-28a(+)中，构建含msTPS或msTPP基因的重组质粒； [0031] 3)将重组质粒转化入感受态细胞E.coli DH5α中，以扩增质粒； [0032] 4)选取构建成功的重组质粒，转化至感受态细胞E.coli BL21中； [0033] 5)选取阳性克隆子进行蛋白诱导表达； [0035] 本发明克隆了Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的编码基因，并在E.coli BL21细胞中构建表达了这两种酶。重组msTPS最适反应温度和pH分别为40℃和7.5，但在低温条件下依然具有较高的活性，如在4℃时酶活达到了72.78％。另外，Mg2+、Co2+或Ba2+能极大的促进其活性，Mn2+、Zn2+、Ca2+和Hg2+对活性没有影响。在本发明条件下对6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖的Km值分别为1.38mM和1.53mM，最大反应速度Vmax为62.5U/min·mg。重组msTPP酶最适反应温度和pH分别为30℃和7.5，相似地，该酶在低温下也具有较高的活性，在4℃条件下能保持50.20％的活性。其在Mg2+存在的条件下活性达到最高，Co2+或Ba2+对活性有较大的促进作用，Mn2+、Zn2+、Ca2+对重组酶活性没有影响，在本发明条件下对6-磷酸海藻糖的Km为2.45mM，最大反应速度Vmax为82.64U/min·mg。附图说明 [0036] 图1为本发明msTPS编码基因扩增结果。其中泳道M是Trans2K Plus DNA Marker，泳道1是mstps基因扩增产物。 [0037] 图2为本发明重组质粒TPS@pET-28a的质粒PCR扩增结果。其中泳道M是Trans2K Plus DNA Marker，泳道1是质粒TPS@pET-28a扩增产物。 [0038] 图3为本发明构建的重组质粒TPS@pET-28a的质粒图谱。 [0039] 图4为SDS-PAGE检测重组msTPS的诱导表达情况。其中泳道M是TaKaRa protein Marker，泳道1是诱导前的重组菌株的总蛋白，泳道2是诱导后的重组菌株的总蛋白。 [0040] 图5为SDS-PAGE检测重组质粒TPS@pET-28a的重组情况。其中泳道M是TaKaRa protein Marker，泳道1是重组质粒TPS@pET-28a的总蛋白，泳道2是空质粒的总蛋白。 [0041] 图6是重组msTPS纯化情况。其中泳道M是TaKaRa protein Marker，泳道1是粗酶液，泳道2是洗脱液，泳道3是纯化液。 [0042] 图7是温度对重组msTPS酶活性影响。 [0043] 图8是pH对重组msTPS酶活性影响。 [0044] 图9是金属离子对重组msTPS酶活性影响。 [0045] 图10是重组msTPS对G6P的Lineweaver-Burk图。 [0046] 图11是重组msTPS对UDPG的Lineweaver-Burk图。 [0047] 图12为本发明msTPP编码基因扩增结果。其中泳道M是Trans2K Plus DNA Marker，泳道1是mstpp基因扩增产物。 [0048] 图13为本发明重组质粒TPP@pET-28a的质粒PCR扩增结果。其中泳道M是Trans2K Plus DNA Marker，泳道1是质粒TPS@pET-28a扩增产物。 [0049] 图14为本发明构建的重组质粒TPP@pET-28a的质粒图谱。 [0050] 图15为SDS-PAGE检测重组msTPP的诱导表达情况。其中泳道M是TaKaRa protein Marker，泳道1是诱导前的重组菌株的总蛋白，泳道2是诱导后的重组菌株的总蛋白。 [0051] 图16为SDS-PAGE检测重组质粒TPP@pET-28a的重组情况。其中泳道M是TaKaRa protein Marker，泳道1是重组质粒TPP@pET-28a的总蛋白，泳道2是空质粒的总蛋白。 [0052] 图17是重组msTPP纯化情况。其中泳道M是TaKaRa protein Marker，泳道1是粗酶液，泳道2是洗脱液，泳道3是纯化液。 [0053] 图18是温度对重组msTPP酶活性影响。 [0054] 图19是pH对重组msTPP酶活性影响。 [0055] 图20是金属离子对重组msTPP酶活性影响。 [0056] 图21是重组msTPP对T6P的Lineweaver-Burk图。 具体实施方式[0057] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。本实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、DNA聚合酶、dNTP等为大连宝生物工程有限公司产品，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21和质粒pET-28a为本实验室保存。其余试剂均为国产分析纯，仪器均为分子生物学及基因工程实验室常用仪器设备。所有引物序列合成和基因测序均在上海美吉生物医药科技有限公司。 [0058] 实施例1Microbacterium sediminis YLB-01 6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)的编码基因的克隆 [0059] (1)细菌的培养 [0060] Microbacterium sediminis YLB-01菌液按照1︰100的比例接种于TSB培养基中，于28℃，180rpm的摇床中培养18h至对数期。 [0061] (2)细菌基因组DNA的提取 [0062] 使用OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒进行该gDNA的提取，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 [0063] (3)目的基因的扩增 [0064] 1)扩增引物 [0065] msTPS编码基因扩增引物为： [0066] TPS-F：5′-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCGACCGTGCCGATCTTGTCGTCG-3′[0067] TPS-R：5′-CATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCTCATTCGCGCGGCTTCTTCCTC-3′[0068] 划线部分为同源臂，分别与设计插入点位置上、下游27bp序列完全配对，斜体部分为Nhe I酶切位点。 [0069] msTPP编码基因扩增引物为： [0070] TPP-F：5′-TGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCACCGAGCCCACCACCGACTG-3 [0071] TPP-R：5′-CCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCTCAGGATGCCCGCAGATCGGC-3′[0072] 划线部分为同源臂，分别与设计插入点位置上游29bp，下游28bp序列完全配对，斜体部分为Nhe I酶切位点。 [0073] 2)PCR反应体系：参见表1。 [0074] 表1 [0075] [0076] 3)PCR循环条件：94℃，2min；98℃，10s，68℃，120s，重复35个循环；68℃，7min。 [0077] 4)PCR产物用1％的凝胶电泳检测，检测结果如图1和图12所示。 [0078] (4)PCR产物测序鉴定 [0079] 对msTPS编码基因扩增的PCR产物进行测序以鉴定所扩增序列是否发生突变，测序引物如下： [0080] TPS-1470F：5′-GACCGTGCCGATCTTGTCGTCG-3′ [0081] TPS-1470R：5′-TCATTCGCGCGGCTTCTTCCTC-3′ [0082] 对msTPP编码基因扩增的PCR产物进行测序以鉴定所扩增序列是否发生突变，测序引物如下： [0083] TPP-789F：5′-ACCGAGCCCACCACCGACTG-3′ [0084] TPP-789R：5′-TCAGGATGCCCGCAGATCGGC-3′ [0085] (5)PCR产物的纯化 [0086] 将鉴定正确的产物参考捷瑞PCR产物纯化试剂盒说明书进行PCR产物纯化。纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20℃冻存。 [0087] 实施例2构建重组质粒TPS@pET-28a和重组质粒TPP@pET-28a [0088] (1)载体pET-28a(+)的线性化 [0089] 对质粒载体pET-28a(+)进行单一酶切位点(Nhe I)酶切是为了制备线性化载体，线性化载体对后续同源重组实验至关重要，没有线性化的载体会产生非常高的背景。线性化后的载体通过凝胶回收纯化。将反应体系按照表2充分混匀后于37℃恒温金属浴中过夜酶切。酶切后用1％琼脂糖凝胶电泳验证载体是否已成线性。 [0090] 表2 [0091] [0092] (2)酶切产物的回收 [0093] 对酶切后得到的线性载体进行胶回收纯化，按照Omega凝胶回收试剂盒说明书进行操作。 [0094] (3)PCR产物与载体pET-28a(+)连接 [0095] 纯化后的PCR产物采用同源重组策略插入已线性化的载体pET-28a(+)中，同源重组反应体系参见表3。 [0096] 表3 [0097] [0098] 将反应体系25℃孵育30min，立即转化或者-20℃冻存，后续转化。 [0099] (4)CaCl2法E.coli DH5α及E.coli BL21感受态细胞的制备 [0100] 1)挑取E.coli DH5α单菌落于5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下过夜培养(12h左右)。将该菌悬液以1︰100比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养至OD600至0.5左右(2～3h)。 [0101] 2)将菌液转移至50ml离心管中,冰浴10min,于4℃、5000g条件下离心5min。 [0102] 3)用预冷去离子水洗涤菌体，4℃、5000g条件下离心5min。 [0103] 4)弃上清，用10ml预冷的0.05mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴15min,4℃、5000g条件下离心5min。 [0104] 5)弃上清，用4ml预冷的含15％甘油的0.05mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴5min，即成感受态细胞悬液。 [0105] 6)分装成100μl小份，立即冻存于-70℃。 [0106] (5)重组质粒的转化与阳性克隆子的筛选 [0107] 重组质粒的转化参考《分子克隆实验指南》(第三版)的具体步骤，将重组质粒转化于大肠杆菌E.coli DH5α中，操作步骤如下： [0108] 1)取-70℃冻存的100μl DH5α感受态细胞，于冰上完全解冻后轻轻悬浮细胞。 [0109] 2)加入10μl连接液，轻轻混匀，冰浴30min。 [0110] 3)42℃热激90sec.，冰浴2min。 [0111] 4)加600μl不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃、250rpm条件下培养1h，使细胞复苏。 [0112] 5)室温、4000rpm条件下离心5min，吸除500μl上清培养液，将细胞悬浮。 [0113] 6)将菌液涂布于筛选平板(含50μg/ml卡那霉素的LB板)上。 [0115] (6)阳性克隆子的筛选 [0116] 次日挑取单菌落，接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，220rpm、37℃条件下过夜培养后，提取质粒。质粒的提取按照生工(中国)质粒DNA小量抽提试剂盒说明书进行。 [0117] 对所提质粒进行质粒PCR初步验证其正确性。并将验证正确的质粒送测序，其中测序引物序列如下： [0118] T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ [0119] T7ter：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’ [0120] 重组质粒TPS@pET-28a和重组质粒TPP@pET-28a的说明书如图3和图14所示。重组质粒TPS@pET-28a和重组质粒TPP@pET-28a的质粒PCR扩增结果如图2和图12所示。 [0121] 实施例3重组菌株构建与蛋白诱导表达 [0122] (1)msTPS重组菌株构建与蛋白诱导表达 [0123] 取1μl测序验证正确的质粒，转化于E.coli BL21中，培养后对阳性克隆子进行保种。将重组菌株接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，过夜培养后取2ml菌液按1︰100接种于200ml含卡那霉素的LB液体培养基中；于37℃、220rpm条件下培养至OD600为0.6时，加入IPTG溶液至终浓度为1mM；于30℃、180rpm培养4h后在4℃、6000g条件下离心5min，收集菌体。将菌体重悬于10ml Binding Buffer(20mM Tris-HCl pH7.4,0.5M NaCl,20mM咪唑)中，加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上裂解1h后，超声破碎15min，使菌体完全裂解，4℃、8000g条件下离心30min，上清即为粗酶液。另取1μl空载质粒pET-28a(+)，按以上方法进行处理，作为重组菌株诱导表达的对照菌株。重组菌株诱导表达结果如图4所示。 [0124] (2)msTPP重组菌株构建与蛋白诱导表达 [0125] 取1μl测序验证正确的质粒，转化于E.coli BL21中，对阳性克隆子保种。将重组菌株接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，取2ml过夜培养物按1︰100接种于200ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，在30℃、180rpm条件下诱导培养4h，6000g离心5min收集菌体。将菌体重悬于10ml Binding Buffer(20mM Tris-HCl pH7.4,0.5M NaCl,20mM咪唑)中，加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上裂解1h后，超声破碎15min使菌体完全裂解，8000g离心30min，收集上清即得到重组msTPP粗酶液。另取1μl空载质粒pET-28a(+)，转化于E.coli BL21中，按以上方法进行处理，作为重组菌株诱导表达的对照。重组菌株诱导表达结果如图15所示。 [0126] (3)重组蛋白的分离纯化 [0127] 分别留取重组菌株诱导前后及对照组诱导后培养液各1ml，以及重组菌株诱导后上清液进行SDS-PAGE电泳，检测重组蛋白表达情况。 [0128] 1)过柱分离 [0129] 重组TPS酶和重组TPP酶的纯化按His纯化柱Ni SepharoseTM 6 Fast Flow操作说明书进行。 [0130] 2)酶液除咪唑和高浓度NaCl [0132] 对浓缩液进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白分离纯化效果。检测结果如图6和图17所示。 [0133] 实施例4重组msTPS的酶学性质的研究 [0134] (1)重组msTPS酶活测定方法 [0135] msTPS酶活测定方法参照De Smet,K.A.等[13]的相关研究方法加以调整之，在G6P足量的条件下，测定UDPG反应后体系中释放出的UDP含量。 [0136] 测定方法分为两步：⑴UDPG和G6P在msTPS催化作用下进行反应，释放出UDP；⑵磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及第一步获得的催化液在丙酮酸激酶(PyK)和乳酸脱氢酶(L-LDH)的催化下进行反应，在340nm处测定吸光值，根据UDP标准曲线计算出反应体系所释放的UDP含量。 [0137] 1)第一步反应(100μl体系) [0138] 将1.5ml EP管置于冰水混合物中，加入50mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，10mM G6P，5mM UDPG，2mM MgCl2，100ng msTPS。轻微离心混匀，40℃孵育30min。沸水煮5min，使msTPS失活，至于冰上冷却，13,000rpm/min、10min离心。一个酶活力单位(U)定义为：在该反应条件下，每分钟转化1μmol UDPG所需酶量。 [0139] 2)第二步反应(200μl体系) [0140] 将1.5ml EP管置于冰水混合物中，加入50mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，30μl第一步反应上清液，2.5mM PEP，0.5mM NADH，2mM MgCl2，3U/ml PyK，3U/ml LDH。轻微离心混匀，37℃孵育30min。沸水煮5min，至于冰上冷却，13,000r/min、1min离心。将反应液转移至96孔酶标板中，20min内测定完吸光值。 [0141] (2)msTPS最适温度测定 [0142] 设置反应温度分别为：4℃，12℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃。按上所述方法测定酶活，以最适温度下测得酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力，每一温度梯度设置三个重复。 [0143] 温度对重组msTPS酶活性影响如图7所示。结果表明重组msTPS活性随着反应温度的增高而增大，40℃时活性达到最大，之后酶活性随着反应温度的升高急剧下降。重组msTPS的最适反应温度为40℃。在4～40℃范围内酶活力均在最高酶活力的60％以上，这说明了该酶在低温下依然能保持相对较高的酶活力，可能是一种适冷酶。 [0144] (3)msTPS最适pH测定 [0145] 设置pH梯度分别为：5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，当pH范围在5.0～7.5之间，采用Mes-NaOH缓冲液，pH范围在7.0～9.0之间，采用Tris-HC1缓冲液。按上所述方法测定酶活，以最适pH值下测得酶活力为100％，计算不同pH值下的相对酶活力，每一pH梯度设置3个重复。 [0146] pH对重组msTPS酶活性影响如图8所示。重组msTPS最适pH为7.5，且具有较宽的pH值范围，在pH 6.5～8之间，活性仍达最大活性的70％以上。在pH值高于8时，重组酶活性显著降低。 [0147] (4)金属离子对msTPS活性的影响 [0148] 分别加入终浓度为2mM的Mg2+，Co2+，Mn2+，Ba2+，Zn2+，K+，Ca2+，Hg2+，Mg2+/Ca2+。以不加任何金属离子的反应液作为阴性对照，按上所述方法测定酶活，每一种阳离子设置3个重复。 [0149] 金属离子对重组msTPS酶活性影响如图9所示。重组msTPS在不含任何金属离子的反应溶液中，只有微弱的活性，在Mg2+、Co2+或Ba2+存在的条件下，重组酶活性达到最高。K+对重组酶活性有一定的促进作用，但效果不如Mg2+、Co2+或Ba2+。Mn2+、Zn2+、Ca2+和Hg2+对重组酶活性没有影响，且Ca2+与Mg2+同时存在时不会抑制Mg2+效应。 [0150] (5)msTPS酶动力学常数的测定 [0151] 1)设定G6P浓度分别为1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM，UDPG浓度恒定为5mM； [0152] 2)设定UDPG浓度分别为1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM，G6P浓度恒定为5mM。 [0153] 3)按上所述方法测定酶活，分别测定出两组反应中不同底物浓度[S]下的反应速度V。求出两者的倒数，以对作图，绘出直线，根据曲线方程计算出msTPS分别对G6P和UDPG的Km值及Vmax。 [0154] 图10是重组msTPS对G6P的Lineweaver-Burk图。由图可求得曲线的回归方程为y＝0.022x+0.016，修正R2＝0.99148。由该方程可得出重组msTPS酶对G6P的米氏常数Km＝ 1.38mM及最大反应速度Vmax＝62.5U/min·mg。 [0155] 图11为重组msTPS对UDPG的Lineweaver-Burk图。由图可求得曲线的回归方程为y＝0.0252x+0.0156，修正R2＝0.99338。由该方程可得出重组msTPS酶对UDPG的米氏常数Km＝1.62mM及最大反应速度Vmax＝64.1U/min·mg。 [0156] 实施例5重组msTPP的酶学性质研究 [0157] (1)重组msTPP酶活测定方法 [0158] 取1μl测序验证正确的质粒，转化于E.coli BL21中，对阳性克隆子保种。将重组菌株接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，取2ml过夜培养物按1︰100接种于200ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，在30℃、180rpm条件下诱导培养4h，6000g离心5min收集菌体。将菌体重悬于10ml Binding Buffer(20mM Tris-HCl pH7.4,0.5M NaCl,20mM咪唑)中，加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上裂解1h后，超声破碎15min使菌体完全裂解，8000g离心30min，收集上清即得到重组msTPP粗酶液。另取1μl空载质粒pET-28a(+)，转化于E.coli BL21中，按以上方法进行处理，作为重组菌株诱导表达的对照。重组msTPP纯化情况如图17所示。 [0159] (2)msTPP最适温度测定 [0160] 将温度分别设置为4℃，12℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃。按照上面所述方法分别测定无机磷浓度，以最适温度下测得无机磷浓度为100％，计算相对无机磷浓度，每一温度梯度设置3个重复。 [0161] msTPP最适温度测定结果见图18。结果表明重组msTPP活性随着反应温度的增高而增高，30℃时，酶活性到最大，之后活性随着反应温度的升高而下降；重组msTPP最适反应温度为30℃；在4～50℃范围内酶活力均在最高酶活力的50％以上，这说明了该酶在较低温下仍能保持相对较高的酶活力。 [0162] (3)重组msTPP的最适pH的测定 [0163] 将pH分别设置为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，分别加入50mM不同pH值缓冲液。按照上面方法分别测定无机磷浓度，以最适pH值下测得无机磷浓度为100％，计算不同pH值下的相对无机磷浓度，每一pH梯度设置三个重复。 [0164] 在不同pH值条件下测定无机磷浓度，以最适pH值下测得无机磷浓度为100％，计算不同pH值下的相对无机磷浓度。以不同反应缓冲液的pH值为横坐标，相对无机磷浓度为纵坐标，作出pH-相对无机磷浓度曲线图(参见图19)。结果表明重组msTPP的最适pH为7.5，且具有较宽的pH值范围，在pH 6～8.5之间，活性仍达最大活性的70％以上；在pH值高于8.5时，重组酶活性显著降低。 [0165] (4)金属离子对重组msTPP活性的影响 [0166] 分别加入终浓度为2mM的Mg2+，Co2+，Mn2+，Ba2+，Zn2+，K+，Ca2+，Hg2+，Mg2+/Ca2+。以不加任何金属离子体系为阴性对照，按照上面方法分别测定无机磷浓度，每一种阳离子设置3个重复。 [0167] 重组msTPP在不含任何金属离子的反应溶液中，只有非常微弱的活性，在Mg2+存在的条件下，重组酶活性达到最高；Co2+或Ba2+对重组酶活性有较大的促进作用，但效果不如Mg2+；K+或Hg2+对维持重组酶活性有一定的作用；Mn2+、Zn2+、Ca2+对重组酶活性没有影响，且Ca2+与Mg2+同时存在时不会抑制Mg2+效应(参见图20)。 [0168] (5)重组msTPP酶动力学常数的测定 [0169] 设定T6P浓度分别为1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM。按照上面所述方法测定出不同T6P浓度[S]下的反应速度V。求出两者的倒数，以对作图，绘出直线，根据曲线方程计算出重组msTPP对T6P的Km值及Vmax。 [0170] 图21为重组msTPP对T6P的Lineweaver-Burk图。由图可求得曲线的回归方程为y＝0.0297x+0.0121，修正R2＝0.98163。由该方程可得出重组msTPS酶对UDPG的米氏常数Km＝ 2.45mM及最大反应速度Vmax＝82.64U/min·mg。 [0171] 本发明公开了两种海藻糖合成相关的酶的基因序列和这两种酶的表达纯化方法。所述的两种酶分别是深海来源的放线菌Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-01的TPS/TPP海藻糖合成通路中的两个酶，6-磷酸海藻糖合成酶(msTPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(msTPP)。克隆所述的两种酶，并将克隆片段插入载体pET-28a(+)。质粒载体转化到感受TM 态E.coli BL21细胞后，进行诱导表达。所获得的重组酶液用His纯化柱Ni Sepharose 6 Fast Flow进行分离和纯化，便可得到纯化的重组酶。实验证明，本发明所提供的两种重组酶在低温条件下仍具有较高的活性，如在4℃条件下，分别达到了72.78％(msTPS)和 50.20％(msTPP)的活性。 |
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