一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201710851725.5 | 申请日 | 2017-09-19 | 公开(公告)号 | CN107475226A | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 青岛农业大学; | 发明人 | 黄国清; 肖军霞; 孙欣; 郭丽萍; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备菠萝汁；(2)配制天然聚阴离子多糖溶液；(3)分别调节菠萝汁、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将菠萝汁与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使菠萝汁中的菠萝蛋白酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀；(4)离心收集菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到菠萝蛋白酶制剂。本发明采用聚阴离子多糖和菠萝蛋白酶，通过静电相互吸引作用产生沉淀的原理来达到菠萝蛋白酶分离和制剂的目的，该制剂既可以保持菠萝蛋白酶在贮藏加工过程中的 稳定性 ，还能克服菠萝蛋白酶对热敏感、易 氧 化的缺点，并具有良好的缓释和 控释 性能。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法技术领域[0001] 本发明属于蛋白酶制剂技术领域，具体涉及一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法。 背景技术[0002] 菠萝蛋白酶是从菠萝皮和菠萝茎中提取得到的一种蛋白酶，菠萝蛋白酶的生产可以解决菠萝产业中大量废料被丢弃造成的环境污染和资源浪费问题，还可使菠萝产品高值化利用。菠萝蛋白酶属于木瓜酶系，根据分离提取部位的不同分为茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.32)和果菠萝蛋白酶(EC3.4.22.33)，两者的分子量分别为33kDa和28kDa，等电点分别为9.5和4.6，商业用菠萝蛋白酶大多为茎酶。菠萝蛋白酶在制药和食品行业中应用范围广泛。在医药领域中，因为菠萝蛋白酶具有抗血栓、抗水肿、抗炎等作用，其可用于溃疡和烧伤创面坏死组织的清除。在食品工业领域中，菠萝蛋白酶广泛应用于肉质的嫩化、啤酒澄清、干酪生产和水解蛋白等。 [0003] 目前，分离纯化菠萝蛋白酶的工业方法主要有高岭土吸附法、单宁沉淀法和超滤浓缩法等。高岭土吸附法所得产品酶活性较高，但生产工艺较为复杂，设备和原材料消耗多，酶活回收率低，污染环境，环保投资较大；单宁沉淀法操作简单，但是专一性较差，酶活回收率和酶活性较低，且单宁是一种有毒物质，会对环境造成污染；超滤浓缩法操作简单，酶活损失和环境污染较少，但是其专一性较差，菠萝蛋白酶制品中含有的杂蛋白较多，难以满足使用要求。 [0004] 通过固定化技术制备菠萝蛋白酶以提高其稳定性也是现有技术中常用的一种手段，固定化酶与游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、抵抗性强、不易水解以及对变性剂耐受性好等特性，因而固定化技术成为生物酶得到广泛而有效利用的重要手段。 [0005] 固定化酶常用的包埋材料有很多，其中海藻酸钠最为常见。高尚欣等(“海藻酸钠-壳聚糖共固定化菠萝茎蛋白酶的研究”，高尚欣等，食品工业科技，第32卷第5期，第209-211页，2011年)用移液器将菠萝茎蛋白酶缓慢注入到海藻酸钠溶液中，然后用七号针头注射器将海藻酸钠-酶混合液以5cm高度注入含CaCl2的壳聚糖溶液中形成光滑微球，这种以海藻酸钠、壳聚糖为材料共固定化制备获得的菠萝茎蛋白酶可重复使用，其最适反应温度和热稳定性等酶学特性也得到了改善。张琛等(“海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶”，张琛等，生物加工工程，第7卷第6期，第31-34页)提出以海藻酸钠为载体固定化菠萝蛋白酶，提高了菠萝蛋白酶的最适pH及对碱性环境和温度的稳定性。以上文献利用可溶性海藻酸钠与2+ 二价金属离子Ca 反应可形成微球的原理对菠萝蛋白酶进行包埋，能够在温和条件下实现酶的固定化，有助于保持酶的生物活性。该固定化技术中，酶与海藻酸钠之间是否发生相互作用对包埋没有影响；但是，钙化的海藻酸钠微球粒径大、稳定性差，容易在多离子作用或在钙离子扩散而钾、钠离子大量聚集时变软出现“漏酶”现象；并且，固定化过程在酶分离工序完成后进行，需要在原有的酶生产流程上添加额外的工艺，造成固定化技术成本较高；而且，通过固定化技术包埋制备的酶制剂在使用时，由于酶被包埋在基质中而无法实现酶的缓释和控释，因此只能应用于具有良好扩散性的液体食品中，无法在粘度较大的液体及固态食品中发挥作用。 [0006] 发明专利CN102108352A公开了一种新的菠萝蛋白酶的固定化方法，该发明以壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖制备成微球，然后利用壳聚糖微球固定菠萝蛋白酶，既提高了载体的机械强度，也有利于提高固定化酶的载酶量、酶活力及酶回收率，同时也使酶与水解产物易于分离。但是，该发明采用戊二醛作为交联剂，戊二醛常用做杀菌剂，对眼镜、皮肤和粘膜具有强烈的刺激且不易去除，由此影响了该发明在食品工业中的应用；该发明需要在菠萝蛋白酶的分离纯化工艺基础之上采用额外的工艺；并且，由于该发明的酶制剂无法实现酶的缓释和控释，这也同样限制了该发明制备的酶制剂在粘度较大的液体及固态食品中的应用。 [0007] 因此，探索一种操作步骤简单、成本低廉、无污染、稳定性高且具有缓释和控释功能的菠萝蛋白酶制剂及其制备方法，对于扩大菠萝蛋白酶的应用范围具有重要意义。 发明内容[0008] 针对现有技术中菠萝蛋白酶制剂存在的上述问题，本发明提供了一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法。 [0009] 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现： [0010] 一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤： [0012] (2)配制天然聚阴离子多糖溶液，于4℃过夜充分水合； [0013] (3)分别调节菠萝汁、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将菠萝汁与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使菠萝汁中的菠萝蛋白酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀； [0014] (4)离心收集菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到菠萝蛋白酶制剂。 [0015] 进一步，所述步骤(1)中用柠檬酸或苹果酸溶液调节滤液pH值至2.5-4.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液；所述步骤(1)中在10000r/min条件下离心20min，取上清液得到澄清的菠萝汁。 [0017] 进一步，所述步骤(3)中采用柠檬酸或苹果酸溶液分别将菠萝汁和聚阴离子多糖溶液pH值调至2.5-4.0；所述步骤(3)中将稀释至10％的菠萝汁与0.5％-2％(w/v)的聚阴离子多糖溶液等体积充分混合，于4-45℃下搅拌反应10-30min。 [0018] 进一步，所述步骤(4)中采用4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀。 [0020] 进一步，所述步骤(4)中菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀中的酶活回收率为76.7％-83.4％，在离心的上清液中酶活回收率为14.5％-20.6％，酶活损失率为2.1％- 2.7％。 [0021] 进一步，根据本发明的新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法制备得到的菠萝蛋白酶制剂。 [0022] 进一步，所述菠萝蛋白酶制剂的最适反应温度为55-65℃；所述菠萝蛋白酶制剂的最适反应pH为6.6-7.2；所述菠萝蛋白酶制剂在70℃下加热2h后，剩余酶活力为62％-73％。 [0023] 进一步，所述菠萝蛋白酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶；所述菠萝蛋白酶制剂在pH 5.0及以上的酸性条件下2h内会释放出所有菠萝蛋白酶；所述菠萝蛋白酶制剂在pH 2.5-4.0时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。 [0024] 与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是： [0025] (1)本发明能够将菠萝产业中大量被丢弃的废料制备成菠萝蛋白酶制剂，使菠萝产品高值化利用，解决了环境污染和资源浪费的问题。 [0026] (2)相对于现有技术中采用固定化技术来包埋酶，本发明利用菠萝蛋白酶在等电点以下带正电，可与带负电荷的聚阴离子多糖发生静电相互作用形成聚电解质复合物，使两者在复合物中均匀分布，以保护菠萝蛋白酶中巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基免受环境因素影响，使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高。目前，还没有发现采用聚阴离子多糖与菠萝蛋白酶形成聚电解质复合物制剂的研究报道。 [0027] (3)相对于海藻酸钠固定化制备的菠萝蛋白酶，通过本发明制备的菠萝蛋白酶粒径小，安全性强，酶稳定性高，不仅可用于液体食品，还可用于粘度较大的液体及固态食品，并且，本发明的制备条件简单易操作，设备投入少，易于工业化生产。 [0028] (4)本发明通过聚电解质间静电相互作用来制备菠萝蛋白酶制剂，此方法无需任何有机溶剂、催化剂或化学交联剂，具有安全性高、生物相容性好、工艺简单、成本低廉等显著优点，因此,通过聚电解质复合物来制备菠萝蛋白酶制剂可提高菠萝蛋白酶的热稳定性,延长其贮藏期和使用期，可提高处理加工食品的生产效率，降低成本。 [0029] (5)本发明在菠萝汁中添加适当的聚阴离子多糖，通过调节菠萝汁与多糖比例、混合溶液pH等来形成不溶性聚电解质复合物，经过干燥即得菠萝蛋白酶制剂，不仅能够达到浓缩分离菠萝蛋白酶的目的，而且还可以同时提高酶的稳定性并获得所需的控释性能，可弥补现有菠萝蛋白酶制剂技术的不足，因此，在新型食品酶制剂的开发中具有良好的应用潜力。 [0030] (6)本发明与传统的高岭土吸附法、单宁沉淀法和超滤浓缩法等相比，工艺简单可行，安全性好，酶活回收率高、稳定性高，并且，本发明具有较强的专一性，可通过控制溶液的pH值将菠萝蛋白酶选择性的从溶液中分离出来，因此可显著提高酶制剂的活力。 [0031] (7)本发明采用壳聚糖作为澄清剂，在菠萝汁的制备中将pH值调至4.0以下，使滤液中的菠萝蛋白酶带上正电，因此，菠萝蛋白酶不会与壳聚糖发生反应形成沉淀而产生损失，以保证菠萝蛋白酶的纯度和回收效率。 [0033] 综合上述，本发明采用聚阴离子多糖和菠萝蛋白酶，通过静电相互吸引作用产生沉淀的原理来达到菠萝蛋白酶分离和制剂的目的，该酶制剂剂型既可以保持菠萝蛋白酶在贮藏加工过程中的稳定性，还能克服菠萝蛋白酶对热敏感、易氧化的缺点，并具有良好的缓释和控释性能，而且，本发明的制备方法操作简单，安全性好，生产成本低，专一性较强，酶活回收率高，设备投入少，易于工业化生产。附图说明 [0034] 结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。 [0035] 图1为本发明的流程示意图； [0036] 图2为本发明中的菠萝蛋白酶制剂的形态示意图。 具体实施方式[0037] 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。 [0038] 2％(w/v)聚阴离子多糖溶液：准确称取2g聚阴离子多糖，加入适量的去离子水，用恒温磁力搅拌器搅拌至充分溶解，用去离子水定容至100mL，得到2％聚阴离子多糖储备液，放置于4℃冰箱过夜充分水合。使用前用去离子水稀释至所需浓度。 [0039] 用于制备2％(w/v)聚阴离子多糖溶液的天然聚阴离子多糖包括海藻酸钠、果胶、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、黄原胶中的一种或几种混合物。 [0040] 实施例1 [0041] 取100g菠萝皮，清洗，加入100mL去离子水，榨汁、尼龙布过滤后，用柠檬酸调节清液pH值到3.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液，搅拌混合均匀。4℃冰箱放置24h，10000r/min离心20min后取上清液，用去离子水定容到100mL，即得到10％菠萝汁。4℃冰箱保存备用。 [0042] 用去离子水将2％(w/v)的海藻酸钠溶液稀释至0.5％(w/v)，分别将10％菠萝汁和0.5％(w/v)海藻酸钠溶液用柠檬酸溶液调节pH值至3.0，然后将相同pH的两种溶液等体积混合，4℃下搅拌30min，4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-海藻酸钠聚电解质复合物沉淀，冷冻干燥得到菠萝蛋白酶制剂。该条件下复合物沉淀中的酶活回收率为76.7％，离心的上清液中的酶活回收率为20.6％，酶活损失率为2.7％。 [0043] 该酶制剂最适反应温度为55℃，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高5℃；最适反应pH为6.6，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高0.6，能耐受更宽的pH范围；70℃下加热2h，商品菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力29％，本发明中菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力65％。该酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶，在pH 5.0以上的酸性条件下2h内释放出所有菠萝蛋白酶，pH 3.0左右时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。菠萝蛋白酶仅当介质中的pH值或离子强度能够导致复合物解离时才能够被触发而释放出来，并且该触发条件可以通过改变该酶制剂的制备条件而进行调节。 [0044] 实施例2 [0045] 取100g菠萝皮，清洗，加入100mL去离子水，榨汁、尼龙布过滤后，用苹果酸调节清液pH值到2.5，加入等体积的1％壳聚糖溶液，搅拌混合均匀。4℃冰箱放置24h，10000r/min离心20min后取上清液，用去离子水定容到100mL，即得到10％菠萝汁。4℃冰箱保存备用。 [0046] 用去离子水将2％(w/v)的果胶溶液稀释至1％(w/v)，分别将10％菠萝汁和1％(w/v)果胶溶液用苹果酸溶液调节pH值至2.5，然后将相同pH的两种溶液等体积混合，35℃下搅拌10min，4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-果胶聚电解质复合物沉淀，真空干燥得到菠萝蛋白酶制剂。该条件下复合物沉淀中的酶活回收率为78.5％，离心的上清液中的酶活回收率为19.2％，酶活损失率为2.3％。 [0047] 该酶制剂最适反应温度为60℃，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高10℃；最适反应pH为6.8，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高0.8，能耐受更宽的pH范围；70℃下加热2h，商品菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力29％，本发明中菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力66％。该酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶，在pH 5.0以上的酸性条件下2h内释放出所有菠萝蛋白酶，pH 2.5左右时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。 [0048] 实施例3 [0049] 取100g菠萝皮，清洗，加入100mL去离子水，榨汁、尼龙布过滤后，用柠檬酸调节清液pH值到4.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液，搅拌混合均匀。4℃冰箱放置24h，10000r/min离心20min后取上清液，用去离子水定容到100mL，即得到10％菠萝汁。4℃冰箱保存备用。 [0050] 用去离子水将2％(w/v)的羧甲基纤维素钠溶液稀释至1％(w/v)，分别将10％菠萝汁和1％(w/v)羧甲基纤维素钠溶液用柠檬酸溶液调节pH值至4.0，然后将相同pH的两种溶液等体积混合，40℃下搅拌20min，4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-羧甲基纤维素钠聚电解质复合物沉淀，真空干燥得到菠萝蛋白酶制剂。该条件下复合物沉淀中的酶活回收率为83.4％，离心的上清液中的酶活回收率为14.5％，酶活损失率为2.1％。 [0051] 该酶制剂最适反应温度为65℃，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高15℃；最适反应pH为7.2，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高1.2，能耐受更宽的pH范围；70℃下加热2h，商品菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力29％，本发明中菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力73％。该酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶，在pH 5.0及以上的酸性条件下2h内释放出所有菠萝蛋白酶，pH 4.0左右时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。 [0052] 实施例4 [0053] 取100g菠萝皮，清洗，加入100mL去离子水，榨汁、尼龙布过滤后，用柠檬酸调节清液pH值到3.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液，搅拌混合均匀。4℃冰箱放置24h，10000r/min离心20min后取上清液，用去离子水定容到100mL，即得到10％菠萝汁。4℃冰箱保存备用。 [0054] 分别将10％菠萝汁和2％(w/v)阿拉伯胶溶液用柠檬酸溶液调节pH值至3.0，然后将相同pH的两种溶液等体积混合，45℃下搅拌15min，4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-阿拉伯胶聚电解质复合物沉淀，冷冻干燥得到菠萝蛋白酶制剂。该条件下复合物沉淀中的酶活回收率为80.5％，离心的上清液中的酶活回收率为17.1％，酶活损失率为2.4％。 [0055] 该酶制剂最适反应温度为60℃，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高10℃；最适反应pH为7.0，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高1.0，能耐受更宽的pH范围；70℃下加热2h，商品菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力29％，本发明中菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力68％。该酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶，在pH 5.0及以上酸性条件下2h内释放出所有的菠萝蛋白酶，pH 3.0左右时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。 [0056] 实施例5 [0057] 取100g菠萝皮，清洗，加入100mL去离子水，榨汁、尼龙布过滤后，用苹果酸调节清液pH值到4.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液，搅拌混合均匀。4℃冰箱放置24h，10000r/min离心20min后取上清液，用去离子水定容到100mL，即得到10％菠萝汁。4℃冰箱保存备用。 [0058] 用去离子水将2％(w/v)的黄原胶溶液稀释至0.5％(w/v)，分别将10％菠萝汁和0.5％(w/v)黄原胶溶液用苹果酸溶液调节pH值至4.0，然后将相同pH的两种溶液等体积混合，30℃下搅拌15min，4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-黄原胶聚电解质复合物沉淀，用去离子水稀释后经喷雾干燥得到菠萝蛋白酶制剂。该条件下复合物沉淀中的酶活回收率为78.5％，离心的上清液中的酶活回收率为19.2％，酶活损失占2.3％。 [0059] 该酶制剂最适反应温度为55℃，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高5℃；最适反应pH为6.8，相对于商品菠萝蛋白酶制剂提高0.8，能耐受更宽的pH范围；70℃下加热2h，商品菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力29％，本发明中菠萝蛋白酶制剂剩余酶活力62％。该酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶，在pH 5.0及以上的酸性条件下2h内释放出所有菠萝蛋白酶，pH 4.0左右时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。 [0060] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 |
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