一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用专利检索- 酶专利检索查询-专利查询网

一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用
申请号	CN201710949621.8	申请日	2017-10-13	公开(公告)号	CN107460138A	公开(公告)日	2017-12-12
申请人	河北省微生物研究所;			发明人	董聪; 高庆华; 王玥; 王庆庆; 罗同阳; 刘蕾;
摘要	本发明提供了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了包含FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pMD-GDH，FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因经密码子偏好性调整后在序列两端添加EcoRI限制酶切位点和NotI限制酶切位点，且在3’端加上六个组氨酸标签。所述重组毕赤酵母菌是以巴斯德毕赤酵母菌为表达宿主，包括所述重组质粒。产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母在发酵生产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶中的应用。实施例表明，采用所述重组毕赤酵母菌在10L 发酵罐培养时经过136h诱导培养，酶活达到257600U/L，是现有技术中报道的酶活的5.3倍。
权利要求	1.一种包含FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pMD-GDH，其特征在于，在质粒pMD的EcoRI和NotI限制性酶切位点处连接有FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因；所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。 2.一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母菌，其特征在于，以巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris为表达宿主，包括权利要求1所述重组质粒。 3.一种权利要求2所述的重组毕赤酵母菌的构建方法，包括以下步骤： 1)将权利要求1所述的重组质粒pMD-GDH进行线性化处理，将线性化的重组质粒pMD-GDH电转至巴斯德毕赤酵母菌中； 2)将步骤1)中电转化的巴斯德毕赤酵母菌在28～32℃条件下在固体培养基上静置培养2～6d； 3)挑取所述步骤2)中巴斯德毕赤酵母菌单菌落，接种到筛选培养基上进行筛选培养，得到重组毕赤酵母菌。 4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中线性化处理为采用酶解法；所述线性化用酶的种类为SacI酶。 5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中电转条件：电转化的电压为4Kv，电转化时间为3ms。 6.根据权利要求3～5任意一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中筛选培养基以固体培养基为基础培养基，包含质量浓度为80～120μg/mL遗传霉素和质量百分浓度为 2～3％琼脂糖；所述固体培养基为添加质量浓度为2.0％～3.0％琼脂糖的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。 7.一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母在发酵生产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵的培养基是以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基为基础培养基，包含有质量浓度为0.3％～0.8％的甘油、体积浓度为0.8％～ 1.2％甲醇和质量浓度为0.3％～0.8％的山梨醇中的一种和多种。 9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为28～32℃；所述发酵的时间优选为48～96h。 10.根据权利要求7～9任意一项所述的应用，其特征在于，所述发酵期间为振荡发酵；所述振荡发酵的转速为200～250rpm。
说明书全文	一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用技术领域 [0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用。背景技术 [0002] FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称FAD-GDH，EC 1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)+家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P) 等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。 [0003] 在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(GOD)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而GDH不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，因此GDH被认为是代替GOD的最具潜力的检测用酶。虽然到目前为止已经有不少FAD-GDH被分离和鉴定，但是针对特定FAD-GDH全面深入的研究很少，主要的一个原因是FAD-GDH很难实现可溶的重组表达。目前商品化的FAD-GDH主要还是采用培养原始生产菌株然后分离纯化得到目标酶，然而这种生产方式不仅耗时耗力，而且效率低下，不能满足市场需求。 [0004] 而FAD-GDH在大肠杆菌进行重组表达时，都会形成包涵体。与GOD的原核载体表达不同的是，GOD通过包涵体复性，可以得到有活性的蛋白，但是同样的尝试在FAD-GDH中没有获得成功。五种不同真菌来源的FAD-GDH被构建到E.coli中进行表达，其中只有一种FAD-GDH在SDS-PAGE分析中可以看到清晰的条带，其它的要么不能表达，要么形成包涵体；上清中检测到的酶活普遍较低，最低的只有93U/L，最高的一个也只有13000U/L(K.Mori,M.Nakajima,K.Kojima,K.Murakami,S.Ferri,K.Sode,Screening of Aspergillus-derived FAD-glucose dehydrogenases from fungal genome database[J].Biotechnol Lett 33(2011)2255-2263.)。 [0005] 在真核表达系统，毕赤酵母中实现可溶表达，得到有活性的FAD-GDH的报道。虽然杉木炭疽病菌来源的FAD-GDH在毕赤酵母中表达效果比原核表达有明显的优势，但是目前报道了采用巴斯德毕赤酵母菌重组表达FAD-GDH，通过采用7L的发酵罐，经过约50.5h的发酵，产量为48000U/L(C.Sygmund,et cl,Heterologous overexpression of Glomerella cingulata FAD-dependent glucose dehydrogenase in Escherichia coli and Pichiapastoris[J].Microbial cell factories10(2011)1-9.)。根据本领域其他酶的真核载体表达相比，真核载体重组表达的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶并没有得到理想的酶活。发明内容 [0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用，使高效表达的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶具有较高的酶活力特点。 [0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0008] 本发明提供了一种包含FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pMD-GDH，在质粒pMD的EcoRI和NotI限制性酶切位点处连接有FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因；所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因具有如序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。 [0009] 本发明提供了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母菌，以巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris为表达宿主，包括所述重组质粒。 [0010] 本发明提供了一种所述产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，包括以下步骤： [0011] 1)将所述的重组质粒pMD-GDH进行线性化处理，将线性化的重组质粒pMD-GDH电转至巴斯德毕赤酵母菌中； [0012] 2)将步骤1)中电转化的巴斯德毕赤酵母菌在28～32℃条件下在固体培养基中静置培养2～6d； [0013] 3)挑取所述步骤2)中培养后的巴斯德毕赤酵母菌单菌落，接种到筛选培养基上进行筛选培养，得到重组毕赤酵母菌。 [0014] 优选的，所述步骤1)中线性化处理为采用酶解法；所述线性化用酶的种类为SacI酶。 [0015] 优选的，所述步骤2)中电转条件：电转化的电压为4Kv，电转化时间为3ms。 [0016] 优选的，所述步骤3)中筛选培养基以固体培养基为基础培养基，包含质量浓度为80～120μg/mL遗传霉素； [0017] 所述固体培养基为添加质量浓度为2.0％～3.0％琼脂糖的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。 [0018] 本发明还提供了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母在发酵生产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶中的应用。 [0019] 优选的，所述发酵的培养基是以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基为基础培养基，包含有质量浓度为0.3％～0.8％的甘油、体积浓度为0.8％～1.2％甲醇和质量浓度为0.3％～0.8％的山梨醇中的一种和多种。 [0020] 优选的，所述发酵的温度为28～32℃；所述发酵的时间优选为48～96h。 [0021] 优选的，所述发酵期间为振荡发酵；所述振荡发酵的转速为200～250rpm。 [0022] 本发明提供了一种包含FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pMD-GDH，所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行优化密码子，同时3’端接上6个组氨酸标签的核苷酸序列，以便重组表达蛋白的分离纯化。 [0023] 本发明提供了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母菌，以巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris为表达宿主，包括所述重组质粒。巴斯德毕赤酵母P.pastoris在高效启动子AOX1的作用下达到大量表达异源重组蛋白-FAD依赖的葡萄糖脱氢酶，具备许多如同高等真核生物那样的翻译后蛋白加工能力。在本发明中，所述巴斯德毕赤酵母菌对如SEQ ID No.1的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的基因的表达、正确折叠和蛋白质的后期修饰具有较高的表达偏好性，从而使重组表达的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的具有较高的酶活性。实施例表明，采用所述重组毕赤酵母菌在10L 发酵罐扩大培养时经过136h诱导培养，酶活达到257600U/L，是现有技术中报道的酶活的5.3倍。 [0024] 生物保藏信息 [0025] 重组巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，于2017年7月4日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.14382，保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。具体实施方式 [0026] 本发明提供了一种包含FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pMD-GDH，在质粒pMD的EcoRI和NotI限制性酶切位点处连接有FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因；所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因具有如序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。 [0027] 所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，是在5’端加上EcoRI限制酶切位点，3’端加上六个组氨酸标签后再加NotI限制酶切位点。 [0028] 本发明中，所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因是利用密码子优化软件http://www.jcat.de/对蛋白酶基因(GENBANK中登录号为XM_001216916的序列)进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶的基因序列。 [0029] 本发明中，所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的生物来源为土曲霉Aspergillus terreus。 [0030] 所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列采用人工合成获得。所述人工合成的方式没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的人工合成的方案即可。本发明实施例中，所述人工合成委托安徽通用生物公司合成。 [0031] 本发明中，所述pMD质粒是由中科院微生物研究所提供的pMD-AOX经过酶切得到；所述pMD-AOX质粒经过EcoRI和NotI限制性酶酶切，切除外源基因AOX，得到空白质粒pMD。本发明对所述酶切的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的EcoRI和NotI限制性酶酶切酶切方案即可。所述pMD-AOX质粒在高庆华等人发表的名称为点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究中有关报道，具体参见文献(高庆华,胡美荣,吴芳彤,陶勇,王云鹏,罗同阳,胡常英.点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究[J/OL].生物技术通报,2016,32(07):152-159.(2016-07-22))。所述EcoRI和NotI限制性酶的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的EcoRI和NotI限制性酶即可。所述酶解温度采用常规的EcoRI和NotI限制性酶的温度即可。 [0032] 本发明中，所述包含FAD依赖的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pMD-GDH的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的重组质粒的制备方法即可。 [0033] 本发明提供了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母菌，以巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris为表达宿主，包括上述技术方案所述重组质粒。 [0034] 本发明中，所述巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris即可。本发明实施例中，所述巴斯德毕赤酵母菌Pichiapastoris X-33由中科院微生物研究所提供。 [0035] 本发明提供了一种所述产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，包括以下步骤： [0036] 1)将上述方案所述的重组质粒pMD-GDH进行线性化处理，将线性化的重组质粒pMD-GDH电转至巴斯德毕赤酵母菌中； [0037] 2)将步骤1)中电转化的巴斯德毕赤酵母菌在28～32℃条件下在液体培养基中静置培养2～6d； [0038] 3)挑取所述步骤2)中培养后的巴斯德毕赤酵母菌的单菌落，接种到筛选培养基上进行筛选培养，得到重组毕赤酵母菌。 [0039] 本发明中，将上述方案所述的重组质粒pMD-GDH进行线性化处理，将线性化的重组质粒pMD-GDH电转化至巴斯德毕赤酵母菌中。 [0040] 本发明中，所述线性化处理优选为采用酶解法；所述线性化用酶的种类为SacI酶。本发明中，线性化处理的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的线性化处理方法即可。 [0041] 本发明中，所述电转条件优选如下：电转化的电压为4Kv，电转化时间为3ms。 [0042] 本发明对所述电转化的设备没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的电转化设备即可。 [0043] 得到电转化的巴斯德毕赤酵母菌后，本发明将所述巴斯德毕赤酵母菌在28～32℃条件下在固体培养基中静置培养2～6d。 [0044] 本发明中，所述静置培养的温度优选为30℃。所述静置培养的时间优选为3～5d，更优选为4d。本发明中，所述静置培养能够使电转化的巴斯德毕赤酵母菌得到适应性修复。 [0045] 得到培养后的巴斯德毕赤酵母菌后，本发明挑取所述培养后的巴斯德毕赤酵母菌单菌落，接种到筛选培养基上进行筛选培养，得到重组毕赤酵母菌。 [0046] 本发明中，所述筛选培养的方式没有特殊限制，采用上述技术方案中的静置培养的条件即可。 [0047] 本发明中，所述筛选培养基优选以固体培养基为基础培养基，包含质量浓度为80～120μg/mL遗传霉素；所述液体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。所述遗传霉素的质量浓度优选为100μg/mL。所述琼脂糖的质量百分浓度优选为2.5％。本发明对所述遗传霉素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的市售产品即可。本发明对所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基即可。本发明实施例中，所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基购自OXOID公司。 [0048] 本发明还提供了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母在发酵生产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶中的应用。 [0049] 本发明中，所述发酵的培养基是以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基为基础培养基，包含有质量浓度为0.3％～0.8％的甘油、体积浓度为0.8％～1.2％甲醇和质量浓度为0.3％～0.8％的山梨醇中的一种和多种。甘油、甲醇或山梨醇作为碳源。 [0050] 本发明中，发酵生产前，所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母的接种量优选为4％～10％，更优选为5％～8％。本发明对发酵生产的接种方式没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种方案即可。所述FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母优选经扩大培养得到的菌液形式接种。所述扩大培养的条件优选如下：培养温度为30℃；培养的时间优选为3～5d，更优选为4d。本发明中，所述发酵的温度优选为28～32℃，更优选为30℃。所述发酵的时间优选为48～98h，更优选为96h。 [0051] 本发明中，所述发酵期间优选伴随搅拌；所述搅拌的转速优选为200～250rpm，更优选为220rpm。所述发酵用设备优选采用10L发酵罐。本发明对所述发酵罐的型号没有特殊限制，采用本领域所熟知的微生物发酵罐即可。 [0052] 本发明中，所述发酵期间，优选包括每隔14～18h添加体积百分浓度1％的甲醇溶液。所述甲醇溶液起诱导作用。 [0053] 下面结合实施例对本发明提供的一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0054] 实施例1 [0055] FAD依赖葡萄糖脱氢酶基因的合成 [0056] 以NCBI上登录号为XM_001216916的土曲霉NIH2624基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因的密码子进行优化，利用密码子优化软件http://www.jcat.de/分析，发现蛋白酶基因中有多处是毕赤酵母的稀有密码子，利用密码子优化软件http://www.jcat.de/对蛋白酶基因进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶的基因序列。在序列的5’端加上EcoRI限制酶切位点，3’端加上六个组氨酸标签后再加NotI限制酶切位点。然后将优化构建的基因序列送安徽通用生物公司合成。合成的基因连到PUC57T载体上。 [0057] 序列表所示为本发明所述核苷酸、氨基酸序列信息： [0058] (1)SEQ ID NO.1序列信息为人工合成的编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列； [0059] (2)SEQ ID NO.2序列信息为编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的氨基酸序列。 [0060] 实施例2 [0061] 重组质粒pMD-GDH的构建 [0062] 由于在目的基因片段两端分别引入了EcoRI和NotI限制性酶切位点，中科院微生物研究所提供的PMD-AOX质粒也存在这两个酶切位点，将实施例1制备得到的pUC57-GDH和实验室保存的pMD-AOX质粒分别进行EcoRI和NotI双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体pMD；用T4连接酶连接回收产物，连接后的pMD-GDH转化入大肠杆菌DH5α，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行测序，比对分析重组质粒pMD-GDH构建成功。 [0063] 实施例3 [0064] 重组毕赤酵母产FAD-GDH的菌株构建 [0065] 重组质粒pMD-GDH采用SacI线性化后电转表达宿主Pichiapastoris X-33，构建重组菌X33/pMD-GDH，电转条件：4Kv，3ms，快速加入1ml预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养4h，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml过滤除菌的饱和生理盐水洗3次，然后取500μL涂布在终浓度为250μg/mLG418的YPD平板上，3天后获得阳性转化子。 [0066] 实施例4 [0067] 高酶活重组毕赤酵母菌株的筛选 [0068] 将阳性转化子挑取单菌落接种于盛装有10LYPCS培养基的发酵罐中，16h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，136h培养后离心收集毕赤酵母菌，毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力，具体方法如下：DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，300μM DCIP和100mM葡萄糖。具体如下： [0069] 1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/L DCIP 100μl、酶液100μl； [0070] 2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)； [0071] 3、计算公式： [0072] 酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。 [0073] 酶活测定方法参见Sygmund C,Staudigl P,KlausbergerM,et al.Heterologous overexpression ofGlomerella cingulataFAD-dependent glucose dehydrogenase in Escherichia coli andPichiapastoris[J].Microbial Cell Factories,10,1(2011-12-12),2011,10(1):1-9. [0074] 该菌株在10L发酵罐扩大培养时经过136h诱导培养，酶活达到257600U/L，筛选出高酶活重组菌株。经SDS-PAGE检测分子量在60-70kD之间。 [0075] 采用上述方法培养50h的菌体，按照上述方法测定酶活力，得到酶活力为56350U/L，相较于现有技术报道，酶活力提高了17.4％。 [0076] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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