[0001] 本发明属于普鲁兰酶制备技术领域，具体涉及一种嗜热普鲁兰酶及其制备方法专利申请事宜。

[0002] 淀粉是地球上丰富的生物质资源，它广泛存在于植物的种子、块根、块茎中。淀粉除了直接作为食品原料外，还可通过化学或生物的方法生成其他有价值的物质，包括：氨基酸、葡萄糖浆、有机酸、酒精等。天然淀粉由直链淀粉（amylose）和支链淀粉（amylopectin）组成，其中，直链淀粉是由250-300个D-葡萄糖分子以 α-1,4-糖苷键连接而成的多糖，其含量约占淀粉总量的15%-25%；而支链淀粉是高度分支的结构，由24-30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键首尾相连而成，大约每20个葡萄糖分子就有一个分支，在分支处由α-1,6-糖苷键连接，其中α-1,6-糖苷键的含量约占5% ，而支链淀粉的含量约占淀粉总量的 75%-85%。然而大多数的淀粉水解酶（如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等）对 α-1,6-糖苷键均不起作用，α-淀粉酶和糖化酶联合使用也不能使淀粉的完全分解，因此 α-1,6-糖苷键的水解效率直接影响到淀粉的利用率。

[0003] 普鲁兰酶是一种重要的淀粉脱支酶，可以专一性切下支链淀粉的整个支链，从而形成直链淀粉，因此普鲁兰酶在淀粉加工工业中具有十分重要的作用。根据普鲁兰酶作用的底物特异性，可将普鲁兰酶分为两类：I型普鲁兰酶（EC.3.2.1.41）可以专一性水解普鲁兰糖和支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，生产麦芽三糖（maltotriose）和直链淀粉；Ⅱ型普鲁兰酶（EC.3.2.1.1/41），又称淀粉普鲁兰酶  ,不仅可以水解普鲁兰糖和支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，同时也可水解其中的 α-1,4-糖苷键。

[0004] 普鲁兰酶在工业上的应用非常广泛，但是大部分普鲁兰酶的热稳定性和比酶活不高，或者是不能适应酸性高温的作用环境，而我国对普鲁兰酶的研究始于20世纪70年代，起步比较晚。但是目前国内市场对普鲁兰酶的需求量大，主要依赖进口，价格昂贵。这在一定程度上限制了国内相关行业的发展。因此，开发具有自主知识产权的普鲁兰酶就显得尤为重要了。

[0005] 本申请目的在于提供一个利用特定菌株的嗜热普鲁兰酶基因通过异源表达后所制备的耐热普鲁兰酶，该酶具有较好的热稳定性、催化效率和对普鲁兰糖底物较高的亲合力，在淀粉酶解过程中具有一定的应用前景。

[0006] 本申请所采取的技术方案详述如下。

[0007] 嗜热普鲁兰酶的制备方法，通过克隆特定嗜热菌株的普鲁兰酶基因，进而利用载体转化异源菌株构建重组表达菌株，最终异源诱导表达获得嗜热普鲁兰酶，具体包括如下步骤：（1）克隆嗜热菌株的普鲁兰酶基因；
以德国菌株保藏中心 DSMZ保藏的编号为DSM13995的嗜热菌 Thermotogapetrophila为基础，提取其基因组，以此为模板，设计引物，PCR扩增获得普鲁兰酶基因TP-pulA，PCR扩增时，引物序列具体设计如下：
上游引物FTP：5′-CATAT GGTGAAGACTAAACTCTGGTTGTTA-3′，引物5′端磷酸化；
下游引物RTP：5′-GGTGGTGGTGGTGGTGCTCTCTGTACAAAACGTACGCG-3′，引物5′端含有一段载体上的序列；
对PCR扩增产物进行电泳检测、并纯化获得普鲁兰酶基因TP-pulA后，4℃保存备用；
克隆所得普鲁兰酶基因TP-pulA进一步测序分析后，其碱基序列如 SEQ ID NO.1所示；
（2）扩增出线性PCR产物TP-pulA-pET21a，并连接构建获得TP-pulA-pET21a表达载体；
首先设计下游引物VR如下：
下游引物VR：5′-GTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTA-3′，引物5′端磷酸化；
以pET21a载体为模板，以步骤（1）中纯化后的普鲁兰酶基因TP-pulA为上游引物，和下游引物VR共同进行PCR扩增，获得线性扩增产物TP-pulA-pET21a；对扩增产物进行电泳、切胶纯化后，直接进行后续实验或者4℃保存备用；
利用T4连接酶（T4 DNA ligase）对纯化后线性扩增产物TP-pulA-pET21a进行连接，构建获得TP-pulA-pET21a表达载体；
（3）热激转化并筛选鉴定；
将步骤（2）中的连接产物（所构建TP-pulA-pET21a表达载体）用热激法转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，将转化复苏后感受态细胞涂布在含有氯霉素的抗性LB平板上（氯霉素浓度终浓度0.034 μg/mL），培养12 16 h以进行抗性筛选；
~
挑选抗性LB平板上的阳性单克隆菌落，进行电泳检测验证，并最终提取质粒进行测序验证，以确保转化及重组正确；
（4）诱导表达并制取酶液；
对步骤（3）中鉴定正确的重组阳性克隆接种到含有氯霉素的抗性LB培养基中（氯霉素浓度终浓度0.034 μg/mL），培养至OD600约为0.6时加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，30℃、
220 r/min培养6h左右以进行诱导表达，
诱导表达结束后，取菌液，离心收集菌体，蒸馏水重悬后进行超声破碎，破碎后离心收集上清液即为粗酶液，进一步地，可对粗酶液进行Co2+ 螯合琼脂糖凝胶电泳以纯化获得纯普鲁兰酶。

[0008] 利用所述嗜热普鲁兰酶制备方法所制备嗜热普鲁兰酶。

[0009] 所述嗜热普鲁兰酶在淀粉酶解中的应用，具体应用时，适宜pH6.2 6.6，最适~pH6.4；适宜温度为80 90℃，最适温度为85℃。
~

[0010] 就普鲁兰酶制备及改进而言，现有技术中主要的及常规做法均是从自然界中筛选产普鲁兰酶产生菌，进而对出版筛选所获菌株进行进一步筛选或培养体系优化。但是这种筛选方式具有很大的盲目性和随机性，而且筛选获得具有较好热稳定性和较好活性普鲁兰酶产酶菌株可能性较低，而且所制备获得普鲁兰酶往往无法适应实际生产中特定温度和pH需求，进而限制了相关生产技术的改进。

[0011] 随着基因工程技术进步，利用生物信息学方法对相关基因进行初步预筛，可大幅降低相关菌株筛选工作的盲目性和筛选周期。本发明即是在此思路上，从数据库 KEGG 和 NCBI 中筛选确定了嗜热菌 Thermotoga petrophila（DSM13995）。

[0012] 对嗜热菌 Thermotoga petrophila（DSM13995）的普鲁兰酶基因进行克隆并异源表达后，初步酶学性质分析表明，所制备嗜热普鲁兰酶的适宜pH6.2 6.6，适宜温度为80 90~ ~℃，具有较高的热稳定性、催化效率以及对普鲁兰糖底物的较高亲和能力，具有一定的生产应用价值，而较好的应用效果也为其他菌株筛选及生物酶制备提供了较好地借鉴参考。
附图说明

[0013] 图1为普鲁兰酶基因TP-pulA和二步PCR产物的电泳图，其中M  是λ-HindⅢ marker，1、2是TP-pulA 基因的PCR产物，3是TP-pulA-pET21a的线性片段；图2为重组质粒TP-pulA-pET21a的电泳图，其中M 是λ-HindⅢ marker，1、2、3 是TP-pulA-pET21a重组质粒；
图3为纯酶TP-pulA的 SDS-PAGE检测图，其中M是 protein marker， 1是TP-pulA；
图4为TP-pulA的最适pH测定图；
图5为TP-pulA的最适温度测定图；
图6为TP-pulA半衰期测定图；
图7为TP-pulA的酶促动力学参数的测定图(普鲁兰糖作为底物)。

[0014] 下面结合实施例对本申请做进一步解释说明。在介绍具体实施例前，首先就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂等背景情况简要介绍说明如下。

[0015] 生物材料：嗜热厌氧菌Thermotoga petrophila，保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ，保藏编码为DSM13995，由发明人购买获得；
大肠杆菌Rosetta（DE3），实验室常用转化菌，为公开渠道获得；
相关引物合成及测序，由金唯智科技有限公司提供完成；
实验试剂：
LB培养基（1 L）：胰蛋白胨 10 g，氯化钠 10 g，酵母提取物 5 g，固体培养基另外加入
1.5%的琼脂粉，121℃、30 min 高压蒸汽灭菌；
普鲁兰糖，东京化成工业株式会社产品；
酵母提取物（Yeast Extract），胰蛋白胨（Trytone）购自OXID公司；
T4 DNA Ligase，Q5 超保真DNA聚合酶购自NEB公司；
λ-HindⅢ DNA Marker购自上海近岸蛋白质科技有限公司；
蛋白质分子量Marker 购自Smobio科技有限公司；
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNA产物纯化试剂盒，质粒小量提取试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；
Co2+螯合琼脂糖凝胶TALON Metal Affinity Resin购自TaKaRa公司。

[0016] 实施例1本申请所提供的嗜热普鲁兰酶，通过如下步骤制备获得。

[0017] （1）克隆嗜热菌株的普鲁兰酶基因；以德国菌株保藏中心 DSMZ保藏的编号为DSM13995的嗜热菌 Thermotoga petrophila为基础，提取其基因组备用。

[0018] 设计引物序列如下：上游引物FTP：5′-CATAT GGTGAAGACTAAACTCTGGTTGTTA-3′，其中引物的5′进行端进行磷酸化处理；
下游引物RTP：5′-GGTGGTGGTGGTGGTGCTCTCTGTACAAAACGTACGCG-3′，引物时5′端含有一段后续扩增时载体上的序列。

[0019] 以所提取嗜热菌DSM13995基因组为模板，利用上述上游引物FTP和下游引物RTP进行PCR扩增，扩增程序设计为：98℃预变性3 min；98℃变性40 s，63℃退火40 s，72℃延伸1 min 20 s，共25个循环；
72℃延伸4 min；
对PCR扩增产物进行电泳检测（结果如图1所示）、并纯化获得普鲁兰酶基因TP-pulA后，
4℃保存备用。

[0020] （2）扩增出线性PCR产物TP-pulA-pET21a，并连接构建获得TP-pulA-pET21a表达载体；首先设计下游引物VR如下：
下游引物VR：5′-GTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTA-3′，引物5′端磷酸化；
以pET21a载体为模板，以步骤（1）中纯化后的普鲁兰酶基因TP-pulA为上游引物，和下游引物VR共同进行PCR扩增，PCR反应条件设计如下：
98℃预变性3 min；98℃变性40 s，64℃退火40 s，72℃延伸4 min，共20个循环；72℃延伸7 min；
对PCR扩增获得的线性产物TP-pulA-pET21a进行电泳（结果如图1所示）、切胶纯化后，直接进行后续连接或者4℃保存备用。

[0021] 利用T4连接酶（T4 DNA ligase）对纯化后线性扩增产物TP-pulA-pET21a进行连接，16℃连接16h，然后65℃灭活30min，最终构建获得TP-pulA-pET21a表达载体。

[0022] （3）热激转化并筛选鉴定；将步骤（2）中的连接产物（所构建TP-pulA-pET21a表达载体）用热激法转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，具体操作为：
取步骤（2）中含有TP-pulA-pET21a表达载体的连接产物10 μL加入到200 μL大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中，轻轻吹打均匀后，冰置30 min，然后42℃热激90 s，再冰置90 s；
将复苏后感受态细胞涂布在含有氯霉素的抗性LB平板上（氯霉素浓度终浓度0.034 μg/mL），培养14 h左右以进行抗性筛选。

[0023] 挑选抗性LB平板上的阳性单克隆菌落，进行扩增后，进行检测验证，具体操作为：将阳性单克隆菌落接种到液体LB培养基中（含氯霉素0.034 μg/mL），37℃、220 r/min培养12 16 h左右；取100 μL发酵液，12000 r/min离心1 min收集菌体；然后加入100 μL快~
检液（参见张桂敏等，一种简便快速筛选重组子的方法，2005，湖北大学学报(自然科学版)），充分混匀后，12000 r/min离心10 min；然后取6 7 μL上清进行琼脂糖胶电泳验证，位~
置正确的为阳性克隆（验证结果如图2所示）；对正确的阳性克隆进一步提取质粒进行测序验证，以确保转化及重组正确。

[0024] （4）诱导表达并制取酶液；具体操作为：对步骤（3）中鉴定正确的重组阳性克隆接种到含有氯霉素的抗性LB培养基中（氯霉素浓度是0.034 μg/mL），37℃培养至OD600约为0.6时加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，30℃、220 r/min培养6h左右以进行诱导表达；
诱导表达结束后，取菌液，4℃、6000 r/min离心10 min，收集菌体，加入蒸馏水使菌体充分混匀，放置冰上进行超声波破碎（3s×4s×99次），再4℃、6000 r/min离心10 min，收集上清分装到 1.5 mL 的离心管中，再4℃、12000 r/min离心30 min，收集上清即为粗酶液；
进一步的，利用Co2+螯合琼脂糖凝胶对纯化该粗酶液获得纯化的普鲁兰酶TP-pulA（检测结果如图3所示）。

[0025] 实施例2为对实施例1所制备的普鲁兰酶TP-pulA的酶学性质有所了解，利用DNS法测定普鲁兰酶的酶活（以实施例1所制备粗酶液为例进行检测），发明人对其最适pH、最适温度、半衰期、酶促动力学等方面性能进行了检测，相关实验简要介绍如下。

[0026] 最适pH值的测定分别配置 pH 梯度为：5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的磷酸缓冲液；
在冰浴条件下，每100 μL酶液中，加入100μL、1%普鲁兰糖（质量分数）和100μL不同 pH 的磷酸缓冲液；
70℃条件下反应15 min，最后加入600μL 的DNS溶液终止反应，煮沸10 min显色，冷却后用蒸馏水定容至5 mL，混和均匀，在540 nm波长下测吸光值；
以灭活的酶液作为对照，重复上述操作；
每个反应设置 3 个重复，取平均值作为最终结果。

[0027] 结果如图4所示，测定结果表明，所制备普鲁兰酶TP-pulA的最适pH是6.4。

[0028] 最适温度的测定按照上述最适pH反应过程，在pH6.4条件下，分别在：55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃进行反应，以灭活的酶液做对照；具体反应过程参考上述最适pH测定时的反应操作；
结果如图5所示，测定结果表明，所制备普鲁兰酶TP-pulA的最适温度为85℃，说明该普鲁兰酶能够耐受较高的反应温度。

[0029] 半衰期的测定将实施例1所制备普鲁兰酶TP-pulA粗酶液在70℃下保温，分别在保温的第0 h、3 h、6 h、9 h、12 h取出450 μL样品置于冰水混合物中，待全部取出后，在pH6.4、85℃条件下进行反应，具体反应过程参考上述最适pH测定时的反应操作；以保温0h的酶液测得的酶活作为
100%，以灭活的酶液做对照。

[0030] 结果如图6所示。测定结果表明，所制备普鲁兰酶TP-pulA在70℃条件下的半失活时间为26.28 h，说明该酶具有较高的热稳定性。

[0031] 酶促动力学性质测定分别配制浓度为：2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL、14 mg/mL、16 mg/mL的普鲁兰糖溶液作为底物；
pH6.4、85℃条件下进行反应，以灭活的酶液做对照；具体反应过程参考上述最适pH测定时的反应操作。

[0032] 将测得的 OD 值代入葡糖糖标准曲线，计算普鲁兰酶TP-pulA 水解不同浓度底物得到的还原糖质量，从而算出不同底物浓度（[S]）下酶的反应速度（v），根据 Hanes-Woolf 法作图，以 [S]/v-[S] 作散点图，并进行线性拟合得一直线，斜率为 1/Vmax，与坐标轴横轴的截距为-Km；作图如图7所示。

[0033] 最终计算结果表明：普鲁兰酶TP-pulA的Km、Vmax、Kcat及Kcat/Km值分别为0.72 mg/mL、0.0049 μmol·mL-1·s-1、154.63 s-1、214.76。结果表明普鲁兰酶TP-pulA具有较高的底物亲和能力和催化效率。