田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子及其基因和应用专利检索- 酶专利检索查询-专利查询网

田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子及其基因和应用
申请号	CN201610373222.7	申请日	2016-05-31	公开(公告)号	CN107446899A	公开(公告)日	2017-12-08
申请人	中国农业科学院上海兽医研究所;			发明人	张厚双; 周金林; 王中华; 龚海燕; 曹杰; 周勇志;
摘要	本发明公开了一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子的氨基酸序列。本发明还公开了田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因，包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子，在消除过氧化氢等过氧化物方面具有很高的反应能力，适用于筛选治疗巴贝斯虫病的BmPrx1 抑制剂药物。
权利要求	1.一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。 2.一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因，其包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。 3.根据权利要求2所述的过氧化物氧化还原酶分子基因，其特征在于，所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 4.一种重组载体，其特征在于，包含：权利要求2或3所述的田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因的核苷酸序列。 5.一种抑制权利要求1所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子活性的过氧化物氧化还原酶抑制剂。 6.一种抗寄生虫疫苗，包含权利要求1所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子。 7.一种抗氧化剂，包含权利要求1所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子。 8.一种用权利要求1所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子免疫动物制得的抗血清。 9.权利要求1所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子的应用，用于制备或筛选治疗巴贝斯虫病的药物。 10.权利要求1所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子的应用，用于制备诊断田鼠巴贝斯虫感染的产品，该产品包括试剂盒或生物芯片。
说明书全文	田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子及其基因和应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子及其基因和应用。背景技术 [0002] 田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)是一种寄生于红细胞内的顶覆门原虫，主要通过硬蜱叮咬及输血传播，是引起人畜共患病的主要病原体之一。自1969年首例田鼠巴贝斯虫感染病例在美国马萨诸塞岛发现以来，全球已有数千例感染病例报道。近年来，我国与缅甸的交界处云南的部分地区也出现了田鼠巴贝斯虫感染病例的散发报道，越来越引起人们的重视。 [0003] 众所周知，红细胞内是一种天然的富氧环境，在红细胞正常的新陈代谢过程中会产生过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子( )和羟基自由基(HO)等活性氧族分子(ROS)以及与一氧化氮(NO)、过氧化亚硝酸盐(ONOOˉ)等活性氮族分子(RNS)，它们与细胞内氧化还原环境调控和细胞信号传导有关，但当浓度过高时会对核酸、蛋白质和生物脂膜等造成不同程度的损伤。巴贝斯虫之所以能在其生活史的胞内阶段适应此种环境并且得以生存繁衍，是因为在其体内存在着一类能够抵御自由基氧化反应的物质，使其能免受ROS和RNS的毒性效应，从而可以使自身体内的氧化还原反应保持平衡。这其中主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)、过氧化氢酶和过氧化物氧化还原酶(Prxs)。 [0004] Prxs是一类带有高度保守Cys残基的过氧化物氧化还原酶，属于抗氧化蛋白超家族，广泛地存在于酵母、植物和动物细胞，以及原生动物、寄生虫和古细菌中，据报道有3种同种型存在于大肠杆菌，5种在酿酒酵母中，6种在人类以及9种在拟南芥中。1987年，Prx首次在酵母体内确认并且命名为巯基特异性抗氧化剂(TSA)。后来发现该家族中某些成员在代谢过程中不需要依赖供电子体提供电子，因此改名为Prx。其中，Prxs大多数分布在胞浆，少部分存在于线粒体、叶绿体、过氧化酶体中。这些半胱氨酸依赖性Prxs显示出与过氧化氢、有机氢过氧化物和过氧化亚硝酸盐的高亲和力，它们在抗氧化防御过程中起着重要作用，也有学者报道Prxs可以通过调节过氧化物介导的细胞信号转导，与细胞因子协同作用控制过氧化物的水平，由此在细胞增殖、分化甚至凋亡过程中发挥重要作用。目前，恶性疟原虫的Prx系统的研究较为广泛，在田鼠巴贝斯虫中的研究还未报道。因此，为了寻找疫苗候选分子以及药物靶标，需要研究田鼠巴贝斯虫Prx的特点，以便针对药物靶标设计合理的抑制剂。发明内容 [0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子及其基因，该田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子可用于制备治疗巴贝斯虫病的药物。 [0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: [0007] 在本发明的一个方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。 [0008] 在本发明的另一方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因，其包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。 [0009] 优选的，所述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 [0010] 在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子基因的核苷酸序列。 [0011] 所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。 [0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。 [0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种抑制上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子活性的过氧化物氧化还原酶抑制剂。将本发明的田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子作为药物靶标，可以筛选出一系列与其直接或间接作用并抑制其活性的抑制剂。 [0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种抗寄生虫疫苗，包含上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子。将本发明的田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子作为免疫抗原免疫动物后，可以刺激机体产生抗体等免疫反应。 [0015] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子的抗氧化剂。 [0016] 在本发明的另一方面，还提供了一种用上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子免疫动物制得的抗血清。 [0017] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子的应用，用于制备或筛选治疗巴贝斯虫病的药物。 [0018] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子的应用，用于制备诊断田鼠巴贝斯虫感染的产品，该产品包括试剂盒或生物芯片。 [0019] 本发明田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子，由酶活动力学分析实验表明，在消除过氧化氢等过氧化物方面具有很高的反应能力，可作为新的抗寄生虫药物靶点，为药物筛选提供新思路。附图说明 [0020] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 [0021] 图1是本发明实施例1的BmPrx1基因与其他物种Prx1的氨基酸序列比对图； [0022] 图2是本发明实施例2的重组蛋白rBmPrx1的表达与纯化结果图； [0023] 图3是本发明实施例3的Western Blotting检测结果图； [0024] 图4是本发明实施例4的间接免疫荧光检测结果图； [0025] 图5是本发明实施例5的质粒保护试验电泳结果图； [0026] 图6是本发明实施例5的H2O2标准曲线图； [0027] 图7是本发明实施例5的Prx1催化H2O2反应趋势图； [0028] 图8是本发明实施例5的Prx1抗氧化活性测定结果图。具体实施方式 [0029] 本发明首次从田鼠巴贝斯虫虫体裂殖子中获得一个新的过氧化物氧化还原酶分子，简称BmPrx1，将其基因编码区克隆到表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达。由酶活动力学实验分析表明，BmPrx1在消除过氧化氢等过氧化物方面具有高反应能力，可用于制备抗氧化剂，或作为药物靶标，研制出新的抗寄生虫药物。 [0030] 实施例1田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子(BmPrx1)的基因克隆和序列分析[0031] 1.材料与方法 [0032] 1.1.寄生虫与实验动物 [0033] 田鼠巴贝斯虫由美国标准菌库(ATCC)下的ATCCR PRA-99TM提供，在本实验室经过小鼠体内红细胞传代保存。 [0034] 1.2.细菌与质粒 [0035] 质粒构建及蛋白表达用到的是大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)和大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。克隆测序载体用到的是pGEM-T Easy(Promega)，表达载体用的是pET30a vector(Novagen)。 [0036] 1.3.田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶(BmPrx1)的分子克隆 [0037] 用TRIzol reagent(Invitrogen)提取虫体裂殖子的RNA，然后RNA经过DNaseⅠ(Toyobo)的消化，来去除其中的基因组DNA。通过反转录从虫体的总RNA中获得cDNA，整个步骤按照反转录试剂盒Reverse Transcription System Kit(TaKaRa,Dalian,China)说明书进行操作。 [0038] BmPrx1全长引物为：F：5’-GCACTACACATACCCACGTATTAT-3’(SEQ ID NO.3),R：5’-TGCGTCAATTCCAGTGACAATTAC-3’(SEQ ID NO.4)；开放阅读框的扩增引物是F:5’-TTCATATGACTTTGAAAGTCGGTTC-3’(SEQ ID NO.5)和R:5’-TTCTCGAGGTGCAATTTGGAAGTCAA-3’(SEQ ID NO.6)，纯化后的PCR扩增产物连接到克隆载体pGEM-T Easy(Promega)及表达载体pET30a(Novagen)中进行测序。 [0039] 2.结果 [0040] 应用B.microti裂殖子的mRNA，获得了基因BmPrx1的全长733bp的cDNA片段(SEQ ID NO.2)，编码一个完整的开放阅读框591bp(87-677bp)，编码197个氨基酸(SEQ ID NO.1)。预测的蛋白分子量为21.9kDa，等电点为6.73。预测其无信号肽序列。将预测蛋白进行BLAST非冗余数据库分析，结果显示预测蛋白与其他物种的Prx1具有显著的相似度。BmPrx1的氨基酸序列(Bm)与Theileria annulata(Ta)Prx1同源性为71％，与Theileria orientalis(To)Prx1同源性为71％，与Babesia bovis(Bb)Prx1同源性为71％，与Babesia gibsoni(Bg)Prx1同源性为70％，与Eimeria acervulina(Ea)Prx1同源性为62％，如图1所示。 [0041] 实施例2田鼠巴贝斯虫过氧化物氧化还原酶分子(BmPrx1)的重组表达与纯化[0042] BmPrx1全长基因通过NdeⅠ和XhoⅠ两个酶切位点进行双酶切后，亚克隆到表达载体pET-30a(Novagen)中，进行测序确保序列的准确性。全长基因通过构建His标签蛋白在E.coli BL21(DE3)中进行表达。表达菌经过1mM IPTG诱导，21℃孵育约12小时后收集菌体，保存在-80℃。重组蛋白rBmPrx1通过Ni-NTA His·Bind Resin(Novagen)进行纯化，诱导后的菌体用binding buffer(NI-NTA Buffer Kit,Novagen)重悬，然后超声破碎，12,000×g，4℃离心10min，可溶的上清蛋白载入纯化树脂，然后用wash buffer洗两次，最后用elution buffer(NI-NTA Buffer Kit,Novagen)将目的蛋白洗脱下来，最后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析定量。 [0043] 结果：重组蛋白rBmPrx1得到成功表达，分子量约为23kDa，与预测的大小一致(图2)。同时，也看到一条46kDa的条带，预测为该蛋白的二聚体形式。蛋白以可溶形式表达，表达菌用1mM IPTG 21℃诱导12小时，然后用Ni2+亲和树脂进行纯化。 [0044] 实施例3重组蛋白rBmPrx1抗血清的制备及Western Blotting检测 [0045] 纯化后的重组蛋白与完全佐剂混合后，通过腹腔注射免疫小鼠(每只约200g重组蛋白)，然后重组蛋白与不完全佐剂混合，对这些小鼠每隔两周进行加强免疫一次，共两次。通过眼眶采血收集小鼠血液样品，用ELISA方法检测抗体滴度。 [0046] 田鼠巴贝斯虫感染的小鼠红细胞与未感染的小鼠红细胞分别与等量的2×SDS gel-loading buffer混合，然后煮10分钟将蛋白变性。在12％的SDS-PAGE进行凝胶电泳之后转印到NC膜上，用5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜。封闭后的NC膜与重组蛋白的抗血清(1:200稀释)室温孵育1小时，然后用PBST每10分钟洗一次，共5次。用HRP标记的羊抗鼠IgG(1: 2000稀释)室温孵育1小时后，同一抗一样洗膜。最后用底物DAB显色。 [0047] 结果：纯化后的重组蛋白rBmPrx1免疫小鼠，获得多克隆抗体。用抗血清鉴定B.microti虫体裂解物中的天然蛋白BmPrx1。如图3所示，在感染B.microti的小鼠红细胞裂解物中检测到特异性蛋白条带，分子量约为23与46kDa(第1泳道)，而在未感染B.microti的细胞中未检测到(第2泳道)，表明重组蛋白具有免疫效应，并且抗血清与天然蛋白BmPrx1发生了特异性的免疫反应。用Prx免疫动物后作为抗原可以刺激机体产生抗体等免疫反应，因此有望用于寄生虫感染的血清学诊断，也可用作疫苗候选分子制备抗寄生虫疫苗。 [0048] 实施例4间接免疫荧光实验检测天然蛋白BmPrx1在虫体中的定位 [0049] 通过激光共聚焦显微镜进行间接免疫荧光试验，检测重组蛋白抗血清对巴贝斯虫裂殖子的识别。将血涂片用甲醇和丙酮(体积比1:1)固定10min后，用PBS洗三次，每次5min。然后0.1％TritonX-100透化血细胞20min后，用重组蛋白抗血清作为一抗孵育45min，PBS洗三次，每次5min。二抗用羊抗鼠IgG孵育45min，用PBS洗三次。最后用DAPI(Thermo)染色 20min，PBS洗干净后，在玻片上滴上抗荧光淬灭剂(Sigma)。通过激光共聚焦显微镜检测荧光信号。 [0050] 结果：绿色荧光显示BmPrx1定位于小鼠红细胞内B.microti裂殖子的核周围(图4)。没有荧光被检测到在孵育抗rBmPrx1鼠血清的未感染虫体的鼠红细胞。这个结果证明BmPrx1表达在B.microti裂殖子的细胞质中，该结果也与BmPrx1缺乏一个信号肽的结论相符合。 [0051] 实施例5重组蛋白rBmPrx1酶活动力学分析 [0052] 1.质粒保护试验 [0053] Prx1保护质粒DNA免受氧化损伤。环形双链质粒具有三种不同的构型：超螺旋构型，开环构型和线性分子构型。在正常情况下，pBluescript质粒DNA呈超螺旋状态(super-coiledform)，然而在受到氧自由基或其它氧化损伤的情况下pBluescript质粒则会由超螺旋状态变成缺口状态(nicked form)。若超螺旋质粒出现缺口，则在电泳时的迁移速度变慢，因此可以应用琼脂糖凝胶电泳对其是否缺口进行鉴定。MFO(Mixed-function oxidation system)是一种用于体外营造氧化环境的体系，其原理为体系内的Fe3+可以造成DNA的氧化损伤。本试验利用MFO体系验证Prx1保护DNA免受氧化损伤的能力。 [0054] 具体的操作步骤为： [0055] 将不同浓度的Prx1在MFO反应液中共孵育，反应体系总体积为20μl，包含11mM/L FeCl3，20mM/L EDTA，10mM/L DTT和25mM/L HEPES(pH 7.4)。孵育1h后各加500ng pBluescript质粒，在37℃条件下，再孵育2.5小时。取样进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。 [0056] 结果：pBluescript质粒受到氧化损伤时会由超螺旋状态(SF)变成缺口状态(NF)，在电泳图上出现在一个位置上的迁移(shift)。从图5上可以看出，正常情况下的3+ pBluescript绝大部分是呈超螺旋状态(SF,泳道1-3)，而在Fe 的氧化下相当一部分则由超螺旋变成了缺口状态(NF,泳道4)。Prx1的存在可以很大程度上阻止质粒由超螺旋变成缺口状态(泳道5-9，分别为25,33,50,100和1000μg/mL的rBmPrx1)，说明Prx1可以保护质粒免受过氧环境的损伤，并且呈现出剂量依赖效应。 [0057] 2.硫氰酸铁法测Prx1催化H2O2的反应活性 [0058] 在测定过程中选择接近人体体温37℃作为统一测定温度，采用接近人血液酸碱度的pH 7.4为测定条件。将5μl重组Prx1蛋白(约2μg)加入85μl的反应缓冲液(1mmol/L DTT/0.03×PBS/0.5％甘油，pH 7.4)中，室温孵育2分钟，然后加入10μl不同浓度的H2O2(0.1～ 2mmol/L)使反应开始，反应温度为37℃，待反应至所设定时间时加入40μl 26％的三氯乙酸终止反应。然后向体系中加入40μl硫酸亚铁铵(Fe(NH4)2(SO4)2)和20μl硫氰酸钾(KSCN)，与剩余过氧化氢反应后形成红色络合物，在多功能酶标仪(SpectraMax M5,Molecular Devices)上，25℃条件下进行测定吸光度A475nm，然后与H2O2标准曲线对比即可得到剩余过氧化氢的含量，从而可以了解过氧化氢浓度的变化趋势。 [0059] 结果：首先，利用硫酸亚铁铵(Fe(NH4)2(SO4)2)和硫氰酸钾(KSCN)与过氧化氢反应后形成红色络合物的特性，设置一系列浓度梯度的H2O2，在A475nm处测得吸光度，然后制成H2O2标准曲线(图6)。标准曲线方程式为y＝2.0708x+0.135，其中R2＝0.9602，R2值说明拟合度较高，可以进行相应的浓度换算。再利用Prx1催化H2O2转化成H2O和O2的反应，再应用硫氰酸铁法测定剩余的H2O2含量，在37℃，pH为7.4的条件下，加入10μl不同浓度的H2O反应5分钟后测定体系中残余的H2O2含量，作出Prx1催化H2O2反应趋势图(图7)。分析可知，2μg重组Prx1蛋白催化H2O2反应，Prx1反应速率较高，说明酶与底物之间亲和力比较好。 [0060] 3.Prx1抗氧化活性测定 [0061] 在Trx和TrxR的存在下，在NADPH的参与下，Prx完成了过氧化氢的还原。为了验证Prx1经大肠杆菌原核表达体系表达的重组蛋白是否具有生物活性，利用Trx和TrxR作为辅助成分，过氧化氢作为底物，通过检测Prx1重组蛋白与过氧化物作用后，检验对过氧化氢浓度的影响。 [0062] 具体操作步骤为： [0063] 将18μl重组Prx1蛋白(约2μg)加入到182μl的反应体系中：50mmol/L HEPES 145μl，6.4μmol/L Trx 15μl，0.14μmol/L TrxR 15μl，375μmol/L NADPH 3μl。然后各加入5μl 250μmol/L的H2O2使反应开始，在340nm处测吸光度，间隔15s测一次，时间为15分钟，反应温度为37℃，同时设置阴性对照。 [0064] 结果：如图8所示，实线代表的是在rBmPrx1存在的情况下，虚线表示的是在缺少rBmPrx1的情况下。在硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和NADPH等的参与下，rBmPrx1可以明显促进过氧化氢的分解。 [0065] 根据以上结果，可以得出半胱氨酸依赖性Prx1在消除过氧化氢等过氧化物方面具有高反应能力，Prx1在寄生性原虫中广泛存在，显示出它们在清除内生性和外源性ROS和RNS过程中的重要作用。而且，Prx1可以帮助寄生性原虫在有氧环境下生存进而致病，表明Prx1可作为新的抗寄生虫药物靶点，为药物筛选提供了新的思路。 [0066] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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