一种酿造方法 |
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| 申请号 | CN201680016060.X | 申请日 | 2016-03-10 | 公开(公告)号 | CN107429207A | 公开(公告)日 | 2017-12-01 |
| 申请人 | 诺维信公司; | 发明人 | C·伦德; M·耶蒙森; | ||||
| 摘要 | 一种制备具有增加 水 平的游离 氨 基氮(FAN)的 麦芽汁 的方法，该方法包括：a)从包括麦芽和/或辅料的碎麦芽制备醪液；并且b)添加与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％序列同一性的蛋白酶。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种制备具有增加水平的游离氨基氮(FAN)的麦芽汁的方法，该方法包括： |
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| 说明书全文 | 一种酿造方法[0004] 本发明的背景 [0007] 通常将麦芽汁氮确定为FAN(游离氨基氮)。FAN包括所有的游离伯胺并且因此还包括核苷酸胺以及其他不是氨基酸的化合物。 [0008] 诸位发明人已经发现增加麦芽汁中FAN水平的一种出乎意料地良好方法。 [0009] 发明概述 [0010] 出乎意料地，已经发现了可以显着提高麦芽汁中的FAN水平，因此我们要求如下： [0011] 一种制备具有增加水平的游离氨基氮(FAN)的麦芽汁的方法，该方法包括： [0012] a)从包括麦芽和/或辅料的碎麦芽制备醪液；并且 [0013] b)添加与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％序列同一性的蛋白酶。 [0014] 在一个实施例中，该蛋白酶包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。 [0015] 在一个实施例中，该蛋白酶是SEQ ID NO：1的多肽的变体，该变体包括在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。 [0016] 在一个实施例中，将该蛋白酶添加到该醪液或该麦芽汁中。 [0017] 在一个实施例中，与在蛋白酶不存在下产生的麦芽汁相比，该游离氨基氮(FAN)的量增加了至少20％。 [0018] 在一个实施例中，另外将一种α-淀粉酶添加至该醪液中。 [0019] 在一个实施例中，另外将一种β-葡聚糖酶添加至该醪液中。 [0020] 在一个实施例中，另外将一种普鲁兰酶添加至该醪液中。 [0021] 在一个实施例中，另外将一种木聚糖酶添加至该醪液中。 [0022] 在一个实施例中，另外将一种脂肪酶添加至该醪液中。 [0023] 在一个实施例中，以1-100mg酶蛋白/kg碎麦芽的量添加该蛋白酶。 [0024] 在一个实施例中，该碎麦芽包括至少10％(w/w)的辅料。 [0025] 在一个实施例中，该辅料选自下组，该组由以下各项组成：大麦、大米、玉米、高粱和木薯。 [0026] 在一个实施例中，将该麦芽汁发酵以获得啤酒。 [0027] 在一个实施例中，根据本发明所述的蛋白酶缩短了啤酒的总发酵时间。 [0028] 本发明还描述了与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％序列同一性的蛋白酶在麦芽汁生产中的用途。 [0029] 定义 [0030] 具有蛋白酶活性的多肽 [0032] 术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考来自NC-IUBMB的1992年酶命名法[Enzyme Nomenclature 1992]，加利福尼亚州圣地亚哥市学术出版社(Academic Press，San Diego，California)，包括在Eur.J.Bio-chem.[欧洲生物化学期刊]，1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1997，250，1-6；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1999，264，610-650中出版的增刊1-5。该命名法定期被增补并且更新，参见例如万维网(WWW)http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。 [0033] 可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃或95℃。蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(AZCL-酪蛋白)。 [0034] 蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性。用于确定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。出于本发明的目的，可以使用Protazyme AK片剂(交联并且染色的酪蛋白，来自麦格酶公司(Megazyme))或suc-AAPF-pNA，来确定蛋白酶活性。本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:1的多肽的至少20％，例如至少30％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的蛋白酶活性。 [0035] 等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。 [0036] 催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的包含该酶的催化机构的区域。 [0037] cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列步骤进行加工，包括剪接。 [0038] 编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般通过开放阅读框架确定，该开放阅读框架以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。 [0039] 控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。 [0040] 表达：术语“表达”包括涉及多肽的产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。 [0041] 表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。 [0042] 片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。 [0043] 宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。 [0044] 分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。 [0045] 成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸1至301。 [0046] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。 [0047] 核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者其是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。 [0048] 可操作地连接：术语“可操作地连接”意指以下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列以控制序列指导编码序列的表达的方式放置在适当位置。 [0049] 序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。 [0050] 出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16：276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分 10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是计算如下： [0051] (相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。 [0052] 出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是计算如下： [0053] (相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。 [0054] 子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。 [0055] 变体：术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指占据位置的氨基酸用不同的氨基酸替换；缺失意指去除占据位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:1的多肽的至少20％，例如至少30％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的蛋白酶活性。 [0056] 饮料：如在此使用的术语饮料具有在本领域中的常规含义并且包括，但不限于，啤酒以及任何基于麦芽汁的饮料。 [0057] 啤酒：如在此使用的，术语“啤酒”意在至少涵盖制备自以下各项的啤酒：制备自未发芽谷类的醪液，连同所有制备自发芽的谷类的醪液，以及所有制备自发芽的与未发芽的谷类的混合物的醪液。术语“啤酒”还涵盖用辅料制备的啤酒，以及具有所有可能酒精度的啤酒。 [0058] 碎麦芽：将术语“碎麦芽”理解为作为啤酒生产的基础的包含淀粉或糖的材料，例如大麦芽和辅料。通常，碎麦芽不包含任何添加的水。 [0059] 麦芽：术语“麦芽”理解为任何发麦芽的粮谷，特别是大麦。 [0060] 辅料：术语“辅料”理解为碎麦芽的非大麦芽部分。辅料可以是任何富含淀粉的植物材料，例如未发芽的谷物，如但不限于大麦、玉米、大米、高粱以及小麦，并且还包括容易发酵的糖和/或糖浆。一些辅料的淀粉具有相对低的糊化温度，这使得它们能够与麦芽一起淀粉糖化，而其他辅料(如大米、玉米和高粱)具有较高的糊化温度，此类辅料在将其添加至醪液中之前通常分开煮熟并用α-淀粉酶液化。 [0061] 醪液：术语“醪液”理解为包含淀粉的浆液，该浆液包括浸泡在水中以制造麦芽汁的压碎的大麦芽和/或压碎的未发芽的谷物和/或其他含淀粉材料或其组合。 [0062] 麦芽汁：术语“麦芽汁”理解为在淀粉糖化过程中提取碎麦芽后流出的未发酵液体。 [0063] 发明详细说明 [0064] 本发明的优点在于它允许啤酒厂关于辅料内含物和麦芽质量具有较高水平的原料灵活性。 [0065] 当在酿造过程中添加辅料(如玉米糁、大麦或大米)而不是麦芽时，FAN(游离氨基氮)的水平将不足以进行适当的酵母醇发酵。当使用未经改良的低质量麦芽时，会发生同样的问题。 [0066] 在淀粉糖化期间，内源性麦芽蛋白酶能够增加总体FAN水平。这种增加主要发生在蛋白质休止期间(例如，20分钟，50℃下)。 [0067] 添加根据本发明所述的蛋白酶到醪液中可以允许啤酒厂消除蛋白质休止而不失去FAN。消除蛋白质休止将在酿造过程中节省时间和能量，并且还使导致最终产品中的异味的脂氧合酶(LOX)催化的脂质氧化最小化。 [0068] 麦芽汁生产 [0069] 本发明涉及一种生产具有增加的FAN水平的麦芽汁的方法，其中将与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％序列同一性的蛋白酶添加到醪液或麦芽汁中。 [0070] 该醪液可通过研磨(grounding)包括麦芽和/或辅料的碎麦芽来获得。优选地，可以将水添加至碎麦芽,并且通常预热以便在醪液形成的时刻醪液便达到所希望的醪液温度。如果形成的醪液的温度低于所希望的淀粉糖化温度，优选供给额外的热量以便达到所希望的过程温度。 [0071] 淀粉糖化过程的温度特征曲线可以是来自常规的淀粉糖化过程的曲线，其中设置温度以实现通过麦芽酶和所添加酶的碎麦芽干物质的最佳降解。 [0072] 麦芽优选源自于选自以下列表的谷物中的一种或多种，该列表由以下各项组成，例如：玉米、大麦、小麦、黑麦、高粱、粟和大米。 [0073] 优选地，麦芽是大麦芽。碎麦芽优选包括从0.5％至99％(w/w)麦芽，优选从1％至95％(w/w)麦芽，更优选从5％至90％(w/w)麦芽，甚至更优选从10％至80％(w/w)麦芽。 [0074] 除了发芽的谷物之外，该碎麦芽可以包括一种或多种辅料，如未发麦芽的玉米，或其他未发麦芽的谷物，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、蜀黍(milo)、粟和/或高粱(sorghum)，或未加工和/或精制的源自于植物的包含淀粉和/或糖的材料，这些植物是像小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、蜀黍(milo)、粟、高粱、豌豆、马铃薯、甘薯、木薯、木薯淀粉、西米、香蕉、甜菜和/或甘蔗。根据本发明，辅料可获得自块茎、根、茎、叶、豆荚、谷类和/或完整谷物。 [0075] 优选的是获得自大麦、玉米、大米、高粱和/或木薯的辅料；例如，大米淀粉、玉米淀粉、和/或玉米糁。 [0076] 碎麦芽典型地包括从1％至80％(w/w)的辅料，例如从5％至75％(w/w)的辅料，例如10％至70％(w/w)的辅料；具体地，该碎麦芽包括至少10％(w/w)的辅料。在优选的实施例中，该碎麦芽包括从30％至70％(w/w)的辅料。 [0077] 在一个方面，该蛋白酶是在淀粉糖化开始时引入的。在另一个方面，该蛋白酶是在淀粉糖化过程中引入的。在另一个方面，该蛋白酶被添加到麦芽汁中。 [0078] 根据本发明所述的添加蛋白酶的量通常取决于各种因素。出于本发明的目的，使用的蛋白酶的量通常为从0.1mg至100mg EP(酶蛋白)/kg碎麦芽，优选地1mg至100mg EP(酶蛋白)/kg碎麦芽；优选地从1mg至50mg EP(酶蛋白)/kg碎麦芽。 [0079] 在优选的实施例中，与在根据本发明所述的蛋白酶不存在下产生的麦芽汁相比，该麦芽汁中游离氨基氮的量增加至少20％，例如与在根据本发明所述的蛋白酶不存在下产生的麦芽汁相比，该麦芽汁中游离氨基氮的量增加至少30％，例如与在根据本发明所述的蛋白酶不存在下产生的麦芽汁相比，该麦芽汁中游离氨基氮的量增加至少40％，例如与在根据本发明所述的蛋白酶不存在下产生的麦芽汁相比，该麦芽汁中游离氨基氮的量增加至少50％。 [0080] 在另一个优选实施例中，将一种或多种另外的酶添加至醪液中，所述一种或多种酶包括但不限于α淀粉酶、异淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、β葡聚糖酶、普鲁兰酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、植酸酶以及酯酶。 [0081] 在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括普鲁兰酶。 [0082] 在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括淀粉酶，优选α淀粉酶。 [0083] 在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括β葡聚糖酶。 [0084] 在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括木聚糖酶。 [0085] 在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括脂肪酶。 [0086] 在从碎麦芽的干酒糟中分离出麦芽汁之后，可以将该麦芽汁照原样使用，或它可以被脱水以提供浓缩和/或干燥的麦芽汁。可以将浓缩的和/或干燥的麦芽汁用作酿造提取物、用作麦芽提取物调味品、用于非酒精麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷类食品、用于糖果等。 [0087] 在一个优选实施例中，将麦芽汁发酵以生产酒精饮料，优选啤酒，例如爱尔啤酒(ale)、烈性爱尔啤酒、苦啤酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、出口啤酒、麦芽酒(malt liquor)、大麦酒、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。 [0088] 麦芽汁的发酵可以包括以包括新鲜酵母，即先前未曾使用的酵母或其可为回收酵母的酵母浆投入麦芽汁。应用的酵母可以为适于碑酒酿造的任何酵母，尤其是选自酵母属的酵母，如酿酒酵母和葡萄汁酵母，包括这些有机体的天然或人工产生的变体。 [0089] 一个优点是，根据本发明所述的蛋白酶可以缩短总发酵时间。 [0090] 用于生产啤酒的麦芽汁的发酵方法是本领域的技术人员熟知的。 [0091] 根据本发明所述的蛋白酶 [0092] 蛋白酶SEQ ID NO:1可获自努比卤地无氧芽孢杆菌(Anoxybacillus rupiensis)，并在WO 2014/194054中披露用于洗涤剂中。 [0093] 在一个实施例，本发明涉及与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或100％序列同一性的分离的多肽，该多肽具有蛋白酶活性。 [0094] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包括SEQ ID NO:1的多肽或由其组成。 [0095] 在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件或高严格条件下与SEQ ID NO:1的多肽编码序列，或其全长互补体杂交(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，Cold Spring Harbor[冷泉港]，纽约)。 [0096] 在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:1的多肽的变体。 [0097] 在一个实施例中，引入SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。 [0098] 这些氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。 [0099] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，在：The Proteins[蛋白质]，学术出版社(Academic Press)，纽约描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。 [0100] 可替代地，这些氨基酸改变具有如下此种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。 [0101] 可以根据本领域已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。 [0102] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因] 46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。 [0103] 诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。 [0104] 该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。 [0105] 该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中以翻译后方式产生融合多肽(Cooper等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994,Science[科学]266:776-779)。 [0106] 融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568- 576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics[蛋白：结构、功能和遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。 [0107] 酶组合物 [0108] 本发明还涉及包括本发明的多肽的组合物，这些组合物用于麦芽汁生产。 [0109] 根据本发明所述的组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如,单组分组合物。 [0110] 可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。 [0111] 优选地，用于麦芽汁生产的组合物可以包括与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％序列同一性的蛋白酶；或者用于麦芽汁生产的组合物可以包括具有至少80％序列同一性的蛋白酶和一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：α淀粉酶、β葡聚糖酶、普鲁兰酶、木聚糖酶和脂肪酶。 [0112] 这些组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。这些组合物可根据本领域中已知的方法进行稳定化。 [0113] 下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量以及组合物使用的其他条件可以基于本领域已知的方法来确定。 [0114] 通过以下实例对本发明进行进一步描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。 [0115] 实例1 [0116] 在小规模淀粉糖化期间添加具有改进的游离氨基氮(FAN)产生的蛋白酶(SEQ ID NO:1) [0117] 使用以下程序将蛋白酶(SEQ ID NO:1)与蛋白酶NeutraseTM(诺维信公司)进行比较： [0118] 1.添加5g玉米淀粉到具有磁力搅拌器的100mL蓝盖瓶中。 [0119] 2.以间隙0.2mm(布勒磨粉机(Bühler mill))研磨麦芽(来自丹麦麦芽制造集团(Danish Malting Group)(生产号2012-0646))，用称量塑料杯称5g。 [0120] 3.向每个具有5g玉米淀粉的瓶中添加25mL 95℃的H2O、300μL的CaCl2(0.2M)和300ppm的TermamylTM(诺维信公司)。 [0121] 4.根据淀粉糖化曲线进行煎煮(见下表1)。 [0122] 5.通过在水浴中添加冰或冷水冷却至50℃，根据设置(5、10和15mg酶蛋白/kg碎麦芽)添加5g麦芽、25mL 52℃的H2O、0.3mL CaCl2和蛋白酶至每个蓝盖瓶。 [0123] 6.准备淀粉糖化，设置时间，并通过设置水浴温度手动进行淀粉糖化。 [0125] 8.使用NOPA测定和Gallery Plus来测量游离氨基氮的水平。(NOPA测定是来自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)的α-氨基氮(Alpha-Amino Nitrogen，NOPA)测试试剂盒(目录号984342))。 [0126] 表1：淀粉糖化曲线： [0127] 玉米淀粉-煎煮： [0128] [0129] 有蛋白质休止的麦芽和玉米淀粉糖化 [0130] [0131] 无蛋白质休止的麦芽和玉米淀粉糖化 [0132] [0133] 结果： [0134] 表2：有蛋白质休止的FAN结果： [0135] [0136] 表3：无蛋白质休止的FAN结果： [0137] [0138] 从表2和表3可以看出，出乎意料地，蛋白酶SEQ ID NO:1给出比Neutrase更多的FAN。 [0139] 实例2 [0140] 在实验室发酵中添加具有改进的游离氨基氮(FAN)的蛋白酶(SEQ ID NO:1)[0141] 淀粉糖化： [0142] 1.研磨1000g麦芽(间隙0.2mm) [0143] 2.向12个烧杯中每个添加75g麦芽 [0144] 3.添加300mL 52℃水和4.5mL CaCl2(0.2M)溶液 [0145] 4.制作以下淀粉糖化曲线： [0146] [0147] 5.在刚刚开始之后，添加蛋白酶(SEQ ID NO:1或NeutraseTM-10mg Ep/kg碎麦芽)和300ppm TermamylTM [0148] 6.淀粉糖化后，在每个烧杯中，用水调节至450g [0149] 7.使用Falten过滤器597 1/2过滤样品 [0150] 8.根据设置，在8个蓝盖瓶中混合500mL麦芽汁 [0151] 9.在每个瓶子中称量159mg啤酒花(哈勒道哈拉道陶瑞斯(Hallertau Hallertauer Taurus)(阿尔法(Alpha)17％))，并且煮沸40min [0152] 10.冷却并用无菌水调节瓶子的失水 [0153] 11.以8000rpm离心30min，并将上清液转移到无菌蓝盖上 [0154] 酵母： [0155] ●在包含1个搅棒的2000mL Pyrex烧瓶中称量100g的YPD(用于酵母生长的酵母蛋白胨葡萄糖培养基)-添加1000mL MQ水并使溶液高压灭菌。 [0156] ●使其冷却至25℃ [0157] ●“在无菌条件下”，将一袋干酵母(Saflager w-34/70(11.5g；Lesafre))添加至到YPD培养基中 [0159] ●使其鼓泡并搅拌过夜 [0160] ●将酵母转移到2x 500mL离心瓶中 [0161] ●将酵母以2000rpm离心3分钟 [0162] ●弃去上清液，并将上清液重新悬浮于250mL无菌水中。将所有酵母转移到一个500mL离心瓶中。重复此过程3次 [0163] ●最终冲洗后，将酵母沉淀物重新悬浮于200mL无菌水中 [0164] ●制备稀释系列：1:10、1:100和1:1.000。在1:1000稀释液中计数酵母细胞[0165] ●将繁殖的酵母添加到麦芽汁中以达到2x 107个细胞/mL并松弛地关闭盖子[0166] 发酵： [0167] ●在145rpm、12℃下，将蓝盖在摇床上放置5天 [0168] ●5天后-在接下来的2天内将摇床降至120rpm [0169] ●将样品冷却至0℃(将其放在带有盖子的泡沫聚苯乙烯盒中的冰上，并将盒子放在5℃地下室的冷藏室中) [0170] ●使其在那静置5天 [0171] 结果： [0172] 结果证实了小规模淀粉糖化(实例1)： [0173] 当添加10mg EP/kg碎麦芽时，蛋白酶(SEQ ID NO:1)比NeutraseTM释放显著更多的FAN(大于40％)。 [0174] 对最终啤酒进行了分析，并且没有观察到不良影响(泡沫损伤等)。 |
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