[0001] 相关申请本申请要求2014年12月30日提交的美国临时申请系列号62/098085的优先权的权益，该申请通过引用结合到本文中。

[0002] 关于联邦资助研究的声明本发明在美国国立卫生研究院授予的NS50210和NS052789-S1的政府支持下进行。政府对本发明具有一定权利。

[0003] 背景亨延顿病(HD)是一种由编码蛋白质亨延顿蛋白(HTT)(1993)的亨延顿蛋白的外显子1
中的CAG重复延伸引起的致死性的常染色体显性的神经变性疾病。尽管HTT在所有组织和脑区域中表达，但纹状体显示最显著和早期的变性。突变体HTT (mHTT)负面影响多个细胞途径，包括线粒体生物发生(Cui等, 2006; Tsunemi等, 2012)、胆固醇体内稳态(Karasinska和Hayden, 2011; Valenza和Cattaneo, 2011; Valenza等, 2005)、轴突生长(Li等, 
2001)和突触发生(Milnerwood和Raymond, 2010)，其全都可有助于神经元功能障碍和损失。这些各种表型可产生自调节各种基本生物学过程的核心成分的破坏。鉴定这样的初级病原性事件可促进治疗开发。

[0004] 基因转移现在被广泛认为是一种在细胞和分子水平上分析生物学事件和疾病过程的强有力的工具。最近，应用基因疗法治疗人类疾病，无论是遗传的(如，ADA缺乏)或后天获得的(如，癌症或感染性疾病)，已受到相当的关注。随着改进的基因转移技术的出现和不断扩大的有缺陷的基因相关疾病库的鉴定，基因疗法已从治疗理论快速地发展到实践现实。

[0005] 传统上，基因疗法已被定义为一个程序，其中外源基因被引入患者的细胞，以纠正先天遗传错误。虽然超过4500种人类疾病目前被归类为遗传的，但仅确定了相对较少的这些疾病的人类基因组中的特定突变。直到最近，这些罕见的遗传性疾病代表了基因治疗努力的唯一目标。因此，到目前为止，大多数NIH批准的基因疗法方案已涉及将缺陷基因的功能拷贝引入具有已知先天遗传错误的个体的体细胞。仅仅在最近，研究者和临床医师已开始意识到，大多数人类癌症、某些形式的心血管疾病和许多变性疾病也具有重要的遗传成分，并且为了设计新基因疗法的目的，应该被认为是“遗传性病症”。因此，基因疗法最近已被广泛地定义为通过将新的遗传信息引入受影响的生物体而纠正疾病表型。

[0006] 在体内基因疗法中，转移的基因被原位(即在受体内)引入受体生物的细胞。体内基因疗法已在几种动物模型中进行了检查。几种最近的出版物已报道直接原位基因转移至器官和组织例如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统和肺的可行性。也有报道DNA直接注入骨骼肌、心肌和将DNA-脂质复合物注入脉管系统，体内产生可检测的表达水平的插入基因产物。

[0007] 中枢神经系统的疾病治疗仍是一个难以处理的问题。这样的疾病的实例是亨延顿病。当静脉内递送时，该疾病中缺乏的蛋白不跨越血脑屏障，或者当直接递送至脑时，不广泛分配。较早的数据表明，抑制mTOR途径可能是有益的。然而，我们的工作揭示这是有害的，并且还表明刺激该途径的疗法是有益的。

[0008] 简述在某些实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中(例如，在已遗传了疾病基因的受试者中)治疗或预防亨延顿病(HD)的方法，包括给予下述治疗剂：与在治疗之前在受试者中的功能或水平相比，在受试者的脑中激活mTORC1功能和/或增加纹状体中富集的Ras同系物(Ras Homolog Enriched in Striatum, Rhes)水平的治疗剂。在某些实施方案中，受试者可具有线粒体功能障碍、异常的胆固醇体内稳态、纹状体萎缩、受损的多巴胺信号转导和/或减少的自噬作用。

[0009] 在某些实施方案中，本发明提供调节mHTT-相关的代谢表型和/或逆转纹状体萎缩的方法，其通过给予下述治疗剂进行：与在治疗之前在受试者中的功能或水平相比，在受试者的脑中激活mTORC1功能和/或增加纹状体中富集的Ras同系物(Rhes)水平的治疗剂。

[0010] 本发明提供了递送治疗剂至哺乳动物的脑细胞的方法，包括给予脑细胞包含载体的AAV颗粒，所述载体包含在一对AAV反向末端重复序列之间插入的核酸，从而递送核酸至脑细胞。在某些实施方案中，AAV是AAV2/1。在某些实施方案中，AAV是AAV2/5。如本文所用的，术语AAV2/1用于指AAV2 ITR和AAV1衣壳，术语AAV2/2是AAV2 ITR和AAV2衣壳，术语AAV2/4是AAV2 ITR和AAV4衣壳，等等。在某些实施方案中，AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6和/或AAV9。在某些实施方案中，AAV是AAV1。在某些实施方案中，AAV是AAV2。在某些实施方案中，AAV是AAV5。在某些实施方案中，AAV是AAV6。在某些实施方案中，AAV是AAV8。在某些实施方案中，AAV是AAV9。在某些实施方案中，AAV是AAVrh10。

[0011] 在某些实施方案中，AAV衣壳与任何参比AAV血清型衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有至少80%同源性，所述衣壳蛋白例如AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV3衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV4衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV5衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV6衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV7衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV8衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV9衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAVrh10衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAVrh74衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3。

[0012] 在某些实施方案中，AAV衣壳与任何参比AAV血清型衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有100%同源性，所述衣壳蛋白例如AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV3衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV4衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV5衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV6衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV7衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV8衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAV9衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAVrh10衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如AAVrh74衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3。

[0013] 在某些实施方案中，受试者是人。

[0014] 在某些实施方案中，治疗剂是治疗性核酸。在某些实施方案中，治疗剂是蛋白质。

[0015] 在某些实施方案中，将所述剂给予所述受试者的脑。在某些实施方案中，在脑的1-5个位置处，例如在脑的1、2或3个位置处，注射所述剂。在某些实施方案中，将所述剂给予哺乳动物的纹状体、皮层或脑室空间。

[0016] 附图简述图1A-1B. mTORC1活性在HD人和小鼠纹状体中减少。(A) mTOR、Rictor、Raptor和
mTORC1活性(pS6)的免疫印迹显示与不受影响的个体(N=6)相比，在HD患者的纹状体中mTORC1活性减少(N=10；对于展开的系列，见图S1A)。β-肌动蛋白用作加载对照。数据表示平均值+ SEM。***P<0.001, Student’s t-检验。(B) 来自6周龄N171-82Q和WT小鼠纹状体的裂解物的mTOR、Rictor、Raptor和pS6的免疫印迹。β-肌动蛋白用作加载对照。子图A和B的密度测定分析显示HD患者(N=10)与对照(N=6)相比，以及6周龄N171-82Q小鼠(N=4)与年龄和性别匹配的WT同窝小鼠(N=4)相比，pS6水平减少。数据表示平均值+ SEM。*P<0.05; ***P<
0.001, Student’s t-检验。

[0017] 图2A-2G. mTORC1途径的活化纠正HD小鼠中代谢相关的缺陷。(A) 蛋白质印迹显示与未处理的小鼠相比，用单侧注射AAV.caRheb处理的N171-82Q小鼠中pS6和DARPP-32免疫反应性增加。小鼠在7周龄时注射，和在10周龄时收获纹状体的裂解物。右侧，DARPP-32免疫反应性的密度测定定量(N=4小鼠/组; *P<0.05, 单侧ANOVA以及Tukey事后检验)。(B) 在来自在7周龄时用单侧注射AAV.caRheb处理的10周龄N171-82Q小鼠的纹状体的匀浆中PGC1-α的RT-qPCR分析。来自未注射对侧半球的纹状体的裂解物用作内部对照(N=8/组)。(C-G) 来自在7周龄时单侧注射AAV.caRheb后的10周龄N171-82Q和WT小鼠的纹状体的匀浆中ROS解毒基因的RT-qPCR分析。来自未注射对侧半球的裂解物用作内部对照(N=8/组)。所有基因被归一化至内源的β-肌动蛋白。数据表示平均值+ SEM。C=对照。*P<0.05, **P<
0.01, ***P<0.001, Student’s t-检验。

[0018] 图3A-3F. mTOR调节HD小鼠纹状体中的胆固醇生物合成途径基因。(A和B) 在正常培养基中生长的WT (Q7)和突变体(Q111)纹状体细胞用250 nM Torin1或DMSO (对照)处理。处理后24小时获得总细胞提取物。HMGCR和HMGCS1的基因表达水平被归一化至内源的β-肌动蛋白。(C-F) 来自在7周龄时单侧注射AAV.caRheb后的10周龄N171-82Q和WT小鼠的纹状体匀浆的脂肪生成基因的RT-qPCR分析。来自未注射对侧半球的裂解物用作内部对照(N=8/组)。所有基因被归一化至内源的β-肌动蛋白。数据表示平均值+ SEM。C=对照。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student’s t-检验。

[0019] 图4A-4D. AAV.caRheb增加N171-82Q小鼠的基础自噬作用。(A和B) 在来自7周龄时单侧注射AAV.caRheb后的N171-82Q小鼠的纹状体裂解物中自噬作用的生物化学评估(LC3和Beclin1)。在注射后3周收获纹状体。未注射对侧纹状体用作内部对照(N=6只小鼠/组)。代表性的蛋白质印迹和密度测定分析显示在AAV.caRheb-处理的N171-82Q小鼠纹状体中LC3II和Beclin1水平增加。β-肌动蛋白用作加载对照。数据是平均值+ SEM。**P<0.01; Student’s t-检验。(C) 左侧子图：自噬体(箭头)和自溶酶体(双箭头)的代表性的显微照片。比例尺为0.5 μm。右侧子图：在来自AAV.eGFP和AAV.caRheb处理的N171-82Q小鼠的纹状体的神经元中检出自噬体和自溶酶体的次数(每组检查3只小鼠；7-10个细胞/半球/动物)。比率表示在计算的细胞总数中自噬体或自溶酶体的数量。(D) 在AAV.eGFP或AAV.caRheb注射至对侧半球后来自N171-82Q小鼠的纹状体切片的超微结构TEM分析(N=3只小鼠/组)。左侧子图：来自对照处理的纹状体的纹状体神经元的代表性的显微照片显示低电子密度的细胞质，没有内质粒状团块和细胞器。右侧子图：AAV.caRheb处理的神经元显示富含细胞器和内质粒状团块的正常细胞质。比例尺是5 μm。

[0020] 图5A-5G. mTORC1调节参与mHTT聚集体清除的基因。(A-F) 来自在7周龄时单侧注射AAV.caRheb后的10周龄N171-82Q和WT小鼠的纹状体匀浆的基因的RT-qPCR分析。未注射对侧用作内部对照(N=8/组)。(A和B) 涉及mHTT的SUMO修饰的基因的表达。(C-E) IKK相关基因(Ikbkb、Ikbkap和Ikbke)的表达。(F) HDAC4的表达。所有基因被归一化至内源的β-肌动蛋白。数据表示平均值+ SEM。C=对照。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student’s t-检验。(G) 左侧子图，单次单侧注射AAV.caRheb和AAV.eGFP至10周龄N171-82Q小鼠的海马后2周，用EM48的N171-82Q小鼠纹状体的免疫组织化学染色(N=4/处理组；比例尺：50 μm)。右侧子图，AAV.caRheb减少EM48阳性聚集体。箭头：Em48阳性聚集体。数据表示平均值+ SEM。*P<0.05. Student’s t检验。

[0021] 图6A-6E. mTORC1促进MSN生长并中和mHTT-诱导的运动表型。(A) 单次单侧注射AAV.caRheb至11周龄N171-82Q小鼠的纹状体后2周，用抗-DARPP-32的MSN的免疫组织化学染色。给予小鼠溶媒或RAD001达2周。(B和C) 来自按(A)处理的动物的组织的MSN细胞面积和纹状体体积的定量(N=4/处理组；平均值+ SEM)。(D) 在6周龄时用AAV.mHTT/AAV.eGFP或AAV.mHTT/AAV.caRheb单侧注射的WT小鼠。当注射后4周检测时，AAV.mHTT/AAV.eGFP诱导响应安非他明的同侧旋转行为。共注射AAV.caRheb改变了安非他明给予后AAV.mHTT-诱导的同侧旋转，其中小鼠显示对侧旋转(N=4/处理组)。*P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001, Student’s t-检验。比例尺：100 μm (A-D)。(E) 左侧子图，来自(D)的AAV.mHTT/AAV.eGFP或AAV.mHTT/AAV.caRheb注射小鼠的切片的用抗-DARPP-32的MSN的免疫组织化学染色。对侧未注射半球作为对照。右侧子图，MSN面积的定量，表示为未注射对侧纹状体的百分比。*P<0.05, Student’s t-检验。比例尺：50 μm。

[0022] 图7A-7D. 纹状体内的Rhes过表达改善N171-82Q小鼠中的疾病表型。(A) 来自未受影响的个体(Ctl, N=4)和HD患者(N=10)，以及6周龄N171-82Q (N=5)和WT (N=4)同窝小鼠的纹状体裂解物的内源的Rhes水平的RT-qPCR分析。数据表示平均值+ SEM。*P<0.05, ***P<0.001, Student’s t-检验。(B) 在7周龄时双侧注射AAV.Rhes、AAV.RhesS33N或盐水至纹状体后，N171-82Q和WT小鼠的Rotarod评估(在14周龄时，N=10-14只小鼠/组；在18周龄时，N=6-13只小鼠/组)。在14和18周龄时来自三个连续日的Rotarod数据显示为下落等待时间。在14和18周龄时与AAV.Rhes-注射的N171-82Q小鼠相比，盐水和AAV.RhesS33N-注射的N171-82Q小鼠在rotarod上表现显著更差。NS=统计学不显著。数据表示平均值+ SEM。*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, 单向ANOVA以及Tukey事后检验。(C) 在7周龄时在单侧注射AAV.Rhes和对侧注射AAV.GFP后，N171-82Q小鼠纹状体组织切片的MSN面积的DARPP-32染色和定量。在19周龄时收获组织(N=3只小鼠/组；GFP=245个细胞；Rhes=251个细胞)。数据表示平均值+ SEM。***P<0.001, Student’s t-检验。比例尺：50 μm。(D) 在来自研究结束(19周龄)时收获的AAV.Rhes-或盐水-处理的N171-82Q和WT小鼠(n=6-9只/组)的纹状体中的PGC-1α的qPCR分析。C=对照。*P<0.05, Student’s t-检验。

[0023] 图8. 受损的mTOR促进HD的复杂疾病表型的提议的机制。在正常生理条件下，mTOR调节对神经元功能和存活关键的各种生物学过程。在HD中，mHTT通过与mTOR直接相互作用破坏mTORC1功能，通过负面影响多个途径导致神经元功能障碍。在纹状体中，mHTT通过干扰Rhes，一种纹状体富集的mTOR调节剂，进一步损害mTORC1活性。因此，Rhes和mTORC1活性的同时损失可致使纹状体组织对HD的早期变性易感。

[0024] 图S1A-S1B. mTORC1活性在HD人和小鼠纹状体中减少。(A) 蛋白质印迹显示与未受影响的个体(N=6)相比，在HD患者的纹状体(N=10)中mTORC1活性(pS6)减少。β-肌动蛋白用作加载对照(涉及图1A)。(B) 来自14周龄N171-82Q和WT小鼠纹状体裂解物的内源的mTORC1活性(pS6)的生物化学分析。β-肌动蛋白用作加载对照。密度测定分析显示与年龄和性别匹配的WT同窝小鼠(N=4)相比，在14周龄N171-82Q小鼠(N=5)中pS6水平减少。数据表示平均值+ SEM。*P<0.05, Student’s t-检验。

[0025] 图S2A-S2H. AAV1有效地转导小鼠的纹状体神经元。HD小鼠纹状体的代表性的免疫组织化学图片显示在6周龄时AAV1.eGFP注射后在18周龄小鼠中稳健的神经元(NeuN)转导。亦参见McBride等, PNAS: 105(15):5868-73, 2008。(B-H) AAV.caRheb改进N171-82Q小鼠纹状体中的代谢相关的缺陷。B) 蛋白质印迹显示与AAV.eGFP处理的动物相比，用单侧注射AAV.caRheb处理的N171-82Q小鼠中纹状体裂解物的pS6和DARPP-32水平增加。小鼠在10周龄时注射，和在13周龄时收获组织。右侧，DARPP-32免疫反应性的密度测定定量(N=4只小鼠/组; *P<0.05, Student’s t-检验)。(C-H) 在10周龄时单侧注射AAV.caRheb和对侧注射AAV.eGFP后，来自13周龄N171-82Q小鼠的纹状体匀浆的代谢相关基因和N171-82Q转基因的RT-qPCR分析(N=4/组)。所有基因被归一化至β-肌动蛋白。数据表示平均值+ SEM。*P<
0.05, **P<0.01, Student’s t-检验。

[0026] 图S3A-S3F. A,B. 在HD的纹状体细胞模型中Torin1抑制代谢基因表达基因。在正常血清条件下生长的Q7和Q111纹状体细胞用Torin1或DMSO (对照)处理。24小时后获得总细胞提取物。(A) 生物化学评估显示在用Torin1处理的Q7和Q111细胞中mTORC1活性(pS6和p4E-BP1)、PGC1-α和DARPP-32表达减少。(B) Torin1处理后24小时CREB和其共活化物TORC1的代表性的蛋白质印迹。密度测定分析显示在Q7和Q111细胞中Torin1抑制TORC1和CREB水平。数值为四次独立实验的溶媒处理的对照的百分比+ SEM (N=4/处理组)。内源的β-肌动蛋白为加载对照。*P<0.05; **P<0.01, Student’s t-检验。C-F. 在AAV.caRheb对比AAV.eGFP处理的HD转基因小鼠纹状体中mTOR改变胆固醇生物合成基因表达。在10周龄时单侧注射AAV.caRheb后，来自13周龄N171-82Q和WT小鼠的纹状体匀浆的脂肪生成基因的RT-qPCR分析。来自AAV.eGFP注射的对侧半球的裂解物用作内部对照(N=4只/组)。所有基因被归一化至内源的β-肌动蛋白。数据表示平均值+ SEM。C=对照。*P<0.05, **P<0.01, Student’s t-检验。

[0027] 图S4. 基础自噬作用在N171-82Q小鼠纹状体中提高。在10周龄时注射AAV.eGFP后，来自N171-82Q和WT小鼠的纹状体裂解物中的LC3II的生物化学评估。注射后3周收获纹状体。密度测定分析显示与WT (N=5)相比，在N171-82Q小鼠(N=9)的纹状体中LC3II水平增加。β-肌动蛋白用作加载对照。数据为平均值+ SEM。*P<0.05, Student’s t-检验。

[0028] 图S5. 海马的AAV.eGFP转导。在10周龄时AAV1.eGFP注射至齿状回后2周，在N171-82Q小鼠的海马中的eGFP表达。比例尺：1mm (左), 100 μm (右)。

[0029] 图S6A-S6B. 在N171-82Q小鼠的纹状体中RAD001抑制mTORC1活性。(A) 在来自接受溶媒(2% DMSO)或mTORC1抑制剂RAD001的N171-82Q小鼠(N=3只小鼠/组)的纹状体裂解物中的mTORC1活性(pS6)的生物化学评估。小鼠处理2周和最后给药后24小时收获纹状体。来自小鼠的样品的免疫印迹的密度测定分析。β-肌动蛋白用作加载对照。数据表示平均值+ SEM。***P<0.001, Student’s t-检验。(B) 单次单侧注射AAV.caRheb至11周龄N171-82Q小鼠的纹状体后2周，pS6 (绿色)和Hoescht染色(蓝色)的免疫组织化学染色的代表性的显微照片。给予小鼠溶媒(N=3)或RAD001 (N=4)达2周。比例尺：25 μm。

[0030] 图S7A-S7C. Rhes表达水平在HD转基因小鼠纹状体中减少。(A) 在17周龄N171-82Q (N=4)和WT小鼠(N=6)中的内源的纹状体Rhes水平。Rhes mRNA丰度归一化至内源的β-肌动蛋白。数据表示平均值+ SEM。*P<0.05; Student’s t-检验。(B) 在来自6周龄N171-
82Q (N=5)和WT小鼠(N=4)，以及17周龄N171-82Q (N=4)和WT小鼠(N=6)的N171-82Q小鼠纹状体中，Rheb水平未变化。Student’s t-检验。(C) 在5和10周龄时N171-82Q小鼠表现与正常难以区分(N=10-14只小鼠/组)。来自4个连续日的Rotarod数据显示为下落等待时间。数据表示平均值+ SEM。单向ANOVA以及Tukey事后检验。

[0031] 图S8. 用Rhes和GTP酶缺陷的Rhes S33N转导N171-82Q小鼠纹状体。在纹状体中用AAV.Rhes、AAV.RhesS33N或盐水转导的N171-82Q小鼠中，mTORC1活性(p-4E-BP1)和Rhes转基因(Flag)的代表性的蛋白质印迹。小鼠在7周龄时注射，和注射后3周收获纹状体组织。β-肌动蛋白用作加载对照。

[0032] 详细描述治疗剂
在某些实施方案中，本发明向有需要的受试者提供治疗剂。在某些实施方案中，治疗剂包含mTORC1调节剂。

[0033] 在某些实施方案中，mTORC1调节剂是Rheb (智人(Homo sapiens)的脑中富集的Ras同系物(RHEB)，mRNA NCBI参考序列: NM_005614.3)。Rheb序列(编码序列以黑体显示)：GGCGTAATTAAAAAGCGGCGGAAGAAGGTGGGAGGGTCATGACGCAGCGAGTTTCAGTCGTGACTTTTCTGGGGGCATCGCGGCGTCCCCTTTTTTTGCCTTTAAAGTAAAACGTCGCCCCGACGCACCCCCCGCGTATTTCGGGGGGCGGAGGCGGCGGGCCACGGCGCGAAGAGGGGCGGTGCTGACGCCGGCCGGTCACGTGGGCGTGTTGTGGGGGGGAGGGGCGCCGCCGCGCGGTCGGTTCCGGGCGGTTGGGAGCGCGCGAGCTAGCGAGCGAGAGGCAGCCGCGCCCGCCGCCGCCCCTGCTCTGTATGCCGCTCTCTCCCGGCGCGGCCGCCGCCGATCACAGCAGCAGGAGCCACCGCCGCCGCGGTTGATGTGGTTGGGCCGGGGCTGAGGAGGCCGCCAAGATGCCGCAGTCCAAGTCCCGGAAGATCGCGATCCTGGGCTACCGGTCTGTGGGGAAATCCTCATTGACGATTCAATTTGTTGAAGGCCAATTTGTGGACTCCTACGATCCAACCATAGAAAACACTTTTACAAAGTTGATCACAGTAAATGGACAAGAATATCATCTTCAACTTGTAGACACAGCCGGGCAAGATGAATATTCTATCTTTCCTCAGACATACTCCATAGATATTAATGGCTATATTCTTGTGTATTCTGTTACATCAATCAAAAGTTTTGAAGTGATTAAAGTTATCCATGGCAAATTGTTGGATATGGTGGGGAAAGTACAAATACCTATTATGTTGGTTGGGAATAAGAAAGACCTGCATATGGAAAGGGTGATCAGTTATGAAGAAGGGAAAGCTTTGGCAGAATCTTGGAATGCAGCTTTTTTGGAATCTTCTGCTAAAGAAAATCAGACTGCTGTGGATGTTTTTCGAAGGATAATTTTGGAGGCAGAAAAAATGGACGGGGCAGCTTCACAAGGCAAGTCTTCATGCTCGGTGATGTGATTCTGCTGCAAAGCCTGAGGACACTGGGAATATATTCTACCTGAAGAAGCAAACTGCCCGTTCTCCTTGAAGATAAACTATGCTTCTTTTTTCTTCTGTTAACCTGAAAGATATCATTTGGGTCAGAGCTCCCCTCCCTTCAGATTATGTTAACTCTGAGTCTGTCCAAATGAGTTCACTTCCATTTTCAAATTTTAAGCAATCATATTTTCAATTTATATATTGTATTTCTTAATATTATGACCAAGAATTTTATCGGCATTAATTTTTCAGTGTAGTTTGTTGTTTAAAATAATGTAATCATCAAAATGATGCATATTGTTACACTACTATTAACTAGGCTTCAGTATATCAGTGTTTATTTCATTGTGTTAAATGTATACTTGTAAATAAAATAGCTGCAAACCTCAGTCCTTTGTGCTACTTGATGTGGCTTTCAAAGAAGAGAAGCCTTGTCCTGAGTTTCTCACTTGGCTTCAGGAAGGCCCCAGGTTGGATTCCAGAAACCAGTGAAGATGTGGCCACAGGAGGAGGTGTGCTGAGGTGGCTGCTGACCGTGGACTCCCTGCGCAGTGGCCTGCAGATGTTGGGGCTGGGTTACAGCTGATTGAAGCTGAGTGGCCCTGGGGGGTCTGTGAGGGGAGTTCCTCCCCAGTGATGAAATTCTCTCCTTCCACCCTCAAATCCCTAGACCTTGACTGAAATGCTCCGTGGTCGGGAGCCTGGTCAAGGAGGAGGAGCTGCTGAGAGGCATTGTTCGCCCTTGCTCATAGCTTAGCTCGATGTCCGTGTCAGACAGGAGATGATTGAGAACAGCCTTGCCTGTCACTGTCCTAGAACACCCTGGAGTTTAGTGTTCTGTGTCAGAGTCTTGGGAGCCTCCTTCAGACCCAGATGACGGGCCTCCCTCTGTCCAAGGAGCAGCTGTAAAGGAGAAGAGGGATTTCATTTGTTTGGTGGCTGTTACCTTGTCTGTAAGTCAAACTTGGAGTTGAGCAGTGCTTTTTAAACGATTCCCTTTTGCAGCTAAAATTTCACAGGGCTATTTCTAATACGTAAGCAAATGTTACCATTGACTTTATTAATAAAATATAGTTTTGCTTTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中，Rheb与SEQ ID NO:1编码的蛋白具有至少90%同一性(例如，与SEQ ID NO:1编码的蛋白具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在某些实施方案中，Rheb与上文黑体表示的Rheb编码序列SEQ ID NO:2编码的蛋白具有至少90%同一性(例如，与SEQ ID NO:2编码的蛋白具有90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在某些实施方案中，Rheb是组成型活性的Rheb突变体(caRheb; S16H)。在某些实施方案中，编码Rheb的核酸是SEQ ID NO: 
1或2的片段或变体，或与SEQ ID NO: 1或2基本上相同。

[0034] 在某些实施方案中，mTORC1调节剂是Rhes (智人的RASD家族，成员2 (RASD2)，mRNA NCBI参考序列: NM_014310.3)。Rhes序列(编码序列以粗体表示)：CCCTTGCGCCTCCTTGCCCGGCCGCGCCCAGCCCGGCGTCCCGAGCAGCGCAGGGGAGGATCCCCGCGCAGTGACCCGGGAGCCACCACAGACTCTGGGAGGCTCGGCGGCTGGAGCAGCAGGCAGCTCCCCGCAGCTCCCGGCGCTTCCAGGCAGCTCTCTGAGCCGTGCCAGAGGCCCGGCCCGCCATTCCCAGCCCCGAGCCATGATGAAGACTTTGTCCAGCGGGAACTGCACGCTCAGTGTGCCCGCCAAAAACTCATACCGCATGGTGGTGCTGGGTGCCTCTCGGGTGGGCAAGAGCTCCATCGTGTCTCGCTTCCTCAATGGCCGCTTTGAGGACCAGTACACACCCACCATCGAGGACTTCCACCGTAAGGTATACAACATCCGCGGCGACATGTACCAGCTCGACATCCTGGATACCTCTGGCAACCACCCCTTCCCCGCCATGCGCAGGCTGTCCATCCTCACAGGGGATGTCTTCATCCTGGTGTTCAGCCTGGATAACCGGGAGTCCTTCGATGAGGTCAAGCGCCTTCAGAAGCAGATCCTGGAGGTCAAGTCCTGCCTGAAGAACAAGACCAAGGAGGCGGCGGAGCTGCCCATGGTCATCTGTGGCAACAAGAACGACCACGGCGAGCTGTGCCGCCAGGTGCCCACCACCGAGGCCGAGCTGCTGGTGTCGGGCGACGAGAACTGCGCCTACTTCGAGGTGTCGGCCAAGAAGAACACCAACGTGGACGAGATGTTCTACGTGCTCTTCAGCATGGCCAAGCTGCCACACGAGATGAGCCCCGCCCTGCATCGCAAGATCTCCGTGCAGTACGGTGACGCCTTCCACCCCAGGCCCTTCTGCATGCGCCGCGTCAAGGAGATGGACGCCTATGGCATGGTCTCGCCCTTCGCCCGCCGCCCCAGCGTCAACAGTGACCTCAAGTACATCAAGGCCAAGGTCCTTCGGGAAGGCCAGGCCCGTGAGAGGGACAAGTGCACCATCCAGTGAGCGAGGGATGCTGGGGCGGGGCTTGGCCAGTGCCTTCAGGGAGGTGGCCCCAGATGCCCACTGTGCGCATCTCCCCACCGAGGCCCCGGCAGCAGTCTTGTTCACAGACCTTAGGCACCAGACTGGAGGCCCCCGGGCGCTGGCCTCCGCACATTCGTCTGCCTTCTCACAGCTTTCCTGAGTCCGCTTGTCCACAGCTCCTTGGTGGTTTCATCTCCTCTGTGGGAGGACACATCTCTGCAGCCTCAAGAGTTAGGCAGAGACTCAAGTTACACCTTCCTCTCCTGGGGTTGGAAGAAATGTTGATGCCAGAGGGGTGAGGATTGCTGCGTCATATGGAGCCTCCTGGGACAAGCCTCAGGATGAAAAGGACACAGAAGGCCAGATGAGAAAGGTCTCCTCTCTCCTGGCATAACACCCAGCTTGGTTTGGGTGGCAGCTGGGAGAACTTCTCTCCCAGCCCTGCAACTCTTACGCTCTGGTTCAGCTGCCTCTGCACCCCCTCCCACCCCCAGCACACACACAAGTTGGCCCCCAGCTGCGCCTGACATTGAGCCAGTGGACTCTGTGTCTGAAGGGGGCGTGGCCACACCTCCTAGACCACGCCCACCACTTAGACCACGCCCACCTCCTGACCGCGTTCCTCAGCCTCCTCTCCTAGGTCCCTCCGCCCGACAGTTGTGCTTTGTTGTGGTTGCAGCTGTTTTCGTGTCATGTATAGTAGTAGAAATGGAAATCATTGTACTGTAAAAGCCTAGTGACTCCCTCCTTGGCCAGGCCCTCACCCAGTTCAGATCCACGGCCTCCACCCGGGACGCCTTCCTCCTCTGCTCCCAAACAGGGTTTCCGTGGCCTGTTTGCAGCTAGACATTGACCTCCGCCATTGAGCTCCACGGTTTACAGACAATTGCACAAGCGTGGGGTGGGCAGGCCAGGACTGCTTTTTTTTAATGCTCCCATTTCACAGAGGATACCACCGAGACTCGGAGGGGACACGATGAGCACCAGGCCCCACCTTTGTCCCCTAGCAAATTCAGGGTACAGCTCCACCTAGAACCAGGCTGCCCTCTACTGTGCTCGTTCCTCAAGCATTTATTAAGCACCTACTGGGTGCTGGGTTCACTGTGTCCTAGGAAACCAAGAGGGTCCCCAGTCCTGGCCTCTGCCCGCCCCTGCTGCCCCACCACCTTCTGCACACACAGCGGTGGGGAGGCGGGGAGGAGCAGCTGGGACCCAGAACTGAGCCTGGGAGGGATCCGACAGAAAAGCTCAGGGCGGGTCTTCTCCTTGTGCCCGGGATTGGGCTATGCTGGGTACCACCATGTACTCAGGCATGGTGGGTTTTGAACCCATAAACCAAAGGCCCTTGTCATCAGCTCTTAACAAGTATATTTTGTATTTTAATCTCTCTAAACATATTGAAGTTTTAGGGCCCTAAGGAACCTTAGTGATCTTCTATTGGGTCTTTCTGAGGTTCAGAGAGGGTAAGTAACTTCCTCCAGGTCACACAGCAAGTCTGTGGGTGGCAGAAGCAAGCTAGCGCTGGGCATTCAGTACATACCACGATGTGCTCCCTCTCTTGATGCTTGGCCCCTGGGGCCTTCAGGGCTTTGGGACATCTTGTCCTCAACCCTCTCCCTAGATCAGTCTGTGAGGGTCCCTGTAGATATTGTGTACACCATGCCCATGTATATACAAGTACACACAGATGTACACACAGATGTACACATGCTCCAGCCCCAGCTCTGCATACCTGCACCTGCACCCCAGCCTTGGCCCCTGCCTGCGTCTGTGCTCAAAGCAGCAGCTCCAACCCTGCCTCTGTCCCCTTCCCCACCCACTGCCTGAGCCTTCTGAGCAGACCAGGTACCTTGGCTGCACCGGTGTGTGGCCCGCTCTCACCCAGGCACAGCCCCGCCACCATGGATCTCCGTGTACACTATCAATAAAAGTGGGTTTGTTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中，Rhes与SEQ ID NO:3编码的蛋白具有至少90%同一性(例如，与SEQ ID NO:3编码的蛋白具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在某些实施方案中，Rhes与上文黑体表示的Rhes编码序列SEQ ID NO:4编码的蛋白具有至少90%同一性(例如，与SEQ ID NO:4编码的蛋白具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在某些实施方案中，编码Rheb的核酸是SEQ ID NO: 3或4的片段或变体，或与SEQ ID NO: 3或4基本上相同。

[0035] 在某些实施方案中，治疗剂包含在病毒载体中。在某些实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒(AAV)载体。

[0036] 表达盒和载体本发明还提供包含编码Rhes或Rheb的序列的表达盒。

[0037] 在某些实施方案中，表达盒进一步包含启动子。在某些实施方案中，启动子是可调节启动子。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子。在某些实施方案中，启动子是PGK、CMV或RSV启动子。

[0038] 本发明提供包含上述表达盒的载体。在某些实施方案中，载体是病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是腺病毒、慢病毒、腺伴随病毒(AAV)、脊髓灰质炎病毒、HSV或基于鼠Maloney的病毒载体。

[0039] 如本文所用的"表达盒"意指能够在合适的宿主细胞中指导特定核苷酸序列的表达的核酸序列，其可包括与目标核苷酸序列可操作连接的启动子，目标核苷酸序列可与末端信号可操作连接。其还可包括正确翻译核苷酸序列所需要的序列。编码区通常编码目的蛋白。包括目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。表达盒还可以是天然存在的但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒中的核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或可调节启动子的控制下，可调节启动子仅当宿主细胞暴露于某些特定的刺激物时才起始转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可对特定的组织或器官或发育阶段具有特异性。

[0040] "可操作连接"是指在单一核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个序列的功能受另一个影响。例如，如果两个序列的位置使得调节性DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，编码序列或功能RNA在启动子的转录控制下)，则调节性DNA序列被认为与编码RNA或多肽的DNA序列"可操作连接"或"缔合"。编码序列可在有义或反义方向上与调节性序列可操作连接。

[0041] 腺伴随病毒(AAV)腺伴随病毒(AAV)是一种微小病毒科的小的非致病性病毒。AAV通过其对复制的辅助病毒的依赖，与这个科的其它成员区分开。在缺乏辅助病毒时，AAV可以位点特异性方式整合进入染色体19的q臂中。AAV的大约5 kb基因组由具有加极性或减极性的一段单链DNA组成。
基因组的末端是短的反向末端重复序列，其可折叠成发夹结构并用作病毒DNA复制的起点。
物理上，微小病毒病毒体是非-包膜的且其二十面体衣壳直径为大约20 nm。

[0042] 到目前为止，许多血清学不同的AAV已被鉴定，且超过十几个AAV已从人或灵长类动物分离。AAV2的基因组的长度为4680个核苷酸并含有两个可读框(ORF)。左ORF编码非-结构Rep蛋白Rep 40、Rep 52、Rep 68和Rep 78，其除了单链子代基因组的生产外，还参与复制和转录的调节。而且，两个Rep蛋白已与AAV基因组优先整合进人染色体19的q臂区有关。Rep68/78也已显示具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白具有核定位信号，以及几个潜在的磷酸化位点。这些激酶位点之一的突变导致复制活性的丧失。

[0043] 基因组的末端是短的反向末端重复序列(ITR)，其具有折叠成用作病毒DNA复制起点的T-形发夹结构的潜力。在ITR区域内，已描述了对ITR的功能是重要的两个元件，GAGC重复基序和末端解离位点(trs)。当ITR以线性构型或者发夹构型存在时，重复基序已显示结合Rep。这种结合起着定位Rep68/78的作用，用于在trs处以位点-和链-特异性方式发生裂解。这两个元件，除了其在复制中的作用外，似乎对病毒整合也是重要的。具有邻近的trs的Rep结合位点被包含在染色体19整合位点内。这些元件已显示对于位点特异性整合是功能性的和必要的。

[0044] AAV病毒体是非-包膜的、直径大约25 nm的二十面体颗粒，由3个称为VP1、VP2和VP3的相关蛋白组成。右ORF编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白分别以1:1:10的比例存在并均衍生自右手ORF。衣壳蛋白通过使用选择性剪接和不寻常的起始密码子而彼此不同。缺失分析已显示，从选择性剪接信息翻译的VP1的除去或修改导致感染性颗粒的产生减少。
VP3编码区域内的突变导致不能产生任何单链子代DNA或感染性颗粒。AAV颗粒是包含AAV衣壳蛋白的病毒颗粒。AAV衣壳多肽可编码完整的VP1、VP2和VP3多肽。所述颗粒可以是包含AAV2和其它AAV衣壳蛋白(即，嵌合蛋白，例如AAV1和AAV2)的颗粒。本文涵盖AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变化，只要生成的包含AAV2衣壳的病毒颗粒在抗原性或免疫性方面不同于AAV1，如可按标准方法常规确定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹法可被用来确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫性方面不同于AAV1。而且，AAV2病毒颗粒优选地保留不同于AAV1的组织向性。

[0045] AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。编码完整的VP1、VP2和VP3多肽的AAV2衣壳多肽总体上可具有与具有由在NC_001401中提出的核苷酸(编码AAV2衣壳蛋白的核苷酸序列)编码的氨基酸序列的多肽至少约63%的同源性(或同一性)。衣壳蛋白可具有与NC_001401中提出的核苷酸序列编码的蛋白约70%的同源性、约75%的同源性、80%的同源性、85%的同源性、90%的同源性、95%的同源性、98%的同源性、99%的同源性，或甚至100%的同源性。
衣壳蛋白可具有与NC_001401中提出的核苷酸序列编码的蛋白约70%的同一性、约75%的同一性、80%的同一性、85%的同一性、90%的同一性、95%的同一性、98%的同一性、99%的同一性，或甚至100%的同一性。颗粒可以是包含另一种AAV和AAV2衣壳蛋白，即嵌合蛋白的颗粒。本文涵盖AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列中的变化，只要生成的包含AAV2衣壳的病毒颗粒在抗原性或免疫性方面不同于AAV4，如可按标准方法常规确定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹法可被用来确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫性方面不同于AAV1。而且，AAV2病毒颗粒优选地保留与AAV1区分的组织向性，例如在本文实施例中所举例说明的，虽然包含至少一种AAV2外壳蛋白的AAV2嵌合颗粒可具有与仅由AAV2外壳蛋白组成的AAV2颗粒的组织向性不同的组织向性。

[0046] 在某些实施方案中，本发明还提供含有(即包壳)包含一对AAV2反向末端重复序列的载体的AAV2颗粒。AAV2 ITR的核苷酸序列是本领域已知的。而且，所述颗粒可以是包含AAV1和AAV2衣壳蛋白二者，即嵌合蛋白的颗粒。此外，所述颗粒可以是包含一对来自其它AAV (如，AAV1-AAV9和AAVrh10)的AAV反向末端重复序列的载体包壳化的颗粒。包壳在颗粒中的载体还可包含插入在反向末端重复序列之间的外源性核酸。

[0047] AAV的以下特征已经使它成为一个有吸引力的供基因转移的载体。AAV载体已显示在体外能稳定地整合到细胞基因组中；具有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂细胞和非分裂细胞两者，并维持转导基因的高水平表达。病毒颗粒是热稳定的，耐溶剂、去垢剂、pH的变化、温度，并可在CsCl梯度液中或通过其它手段浓缩。本发明提供给予AAV颗粒、重组AAV载体和重组AAV病毒体的方法。例如，AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒，或AAV1颗粒是包含AAV1衣壳蛋白的病毒颗粒。重组AAV2载体是包含至少一种独特的AAV2核酸的核酸构建体。重组AAV2病毒体是含有重组AAV2载体的颗粒。在术语"AAV2 ITR"内要考虑的是，核苷酸序列必须保留一种或两种在此描述的区分AAV2 ITR与AAV1 ITR的特征：(1) 3个(而不是如在AAV1中的4个) "GAGC"重复序列和(2) 在AAV2 ITR Rep结合位点中，在头两个"GAGC"重复序列中的第四核苷酸是C而不是T。

[0048] 驱动编码要传递的另一种药物的蛋白或序列表达的启动子可以是任何所需启动子，通过已知的考虑，例如与启动子功能相关的核酸的表达水平和其中使用载体的细胞类型来选择。启动子可以是外源性或内源性启动子。启动子可包括，例如，已知的强启动子例如SV40或诱导型金属硫蛋白启动子，或AAV启动子，例如AAV p5启动子。启动子的另外的实例包括源自肌动蛋白基因、免疫球蛋白基因、细胞巨化病毒(CMV)、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒启动子的启动子，例如腺病毒主要晚期启动子、诱导型热休克启动子、呼吸道合胞病毒、Rous肉瘤病毒(RSV)等。另外的实例包括调节型启动子。

[0049] AAV载体还可包含功能性地连接于启动子的外源性(异源性)核酸。所谓"异源性核酸"意指任何异源性或外源性核酸可被插入到载体中，用于转移进入细胞、组织或生物体。核酸可例如编码多肽或蛋白或反义RNA。所谓"功能性地连接"意指启动子可促进异源性核酸的表达，如同本领域已知的，例如相对于异源性核酸的启动子的适当取向。而且，异源性核酸优选地具有表达核酸的所有适当的序列，如本领域已知的，以功能性地编码，即允许核酸被表达。核酸可包括，例如，表达控制序列，例如增强子，和必要的信息处理位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。核酸可编码超过一个基因产物，仅受可被包装的核酸大小的限制。

[0050] 在本发明的某些实施方案中，异源性核酸可编码有益的蛋白，其代替载体转移进入的受试者所需要的缺失或缺陷蛋白，例如Rheb或Rhes。

[0051] AAV1颗粒是包含AAV1衣壳蛋白的病毒颗粒。本文涵盖AAV1衣壳蛋白的氨基酸序列的变化，只要生成的包含AAV1衣壳的病毒颗粒在抗原性或免疫性方面不同于其它AAV衣壳，如可按标准方法常规确定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹法可被用来确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫性方面不同于其它AAV血清型。

[0052] 如本文所用的术语"多肽"指氨基酸的聚合物并包括全长蛋白及其片段。因此，"蛋白"和“多肽"在本文通常可互换使用。可通过已知的中间参数选择替换。如将为本领域技术人员理解的，本发明也包括在氨基酸序列或其它特性方面有稍微变化的那些多肽。这样的变化可能会作为等位基因变异自然产生(例如由于遗传多态性)或可能由人为干预产生(如，通过克隆的DNA序列的诱变)，例如诱导的点、缺失、插入和取代突变体。氨基酸序列的细微变化通常是优选的，例如保守的氨基酸替代、小的内部缺失或插入，和分子末端的添加或缺失。这些修饰可导致氨基酸序列的变化，提供沉默突变，修饰限制位点，或提供其它特异性突变。

[0053] 本方法提供一种传递核酸至细胞的方法，其包括给予细胞含有载体的AAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的核酸，从而传递核酸至细胞。给予至细胞可通过任何手段，包括简单地使任选地包含在所需液体例如组织培养基，或缓冲盐水溶液中的颗粒与细胞接触来实现。颗粒可被允许保持与细胞接触任何所需时间长度，通常颗粒被给予并允许无限期地保持。对于这样的体外方法，病毒可通过如本领域已知的和如本文所例举的标准病毒转导方法给予细胞。要给予的病毒的滴度可以变化，特别是取决于细胞类型，但一般来说是用于AAV转导的细胞类型所特有的。另外可使用用来转导本文实施例的特定细胞的滴度。细胞可包括人以及其它大型(非-啮齿动物)哺乳动物，例如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪和狗的任何所需细胞。

[0054] 更特别地，本发明提供了递送核酸至脑中的细胞，特别是中间多刺神经元的方法，包括在一对AAV反向末端重复序列之间插入核酸，从而递送核酸至细胞。

[0055] 本发明进一步提供了在受试者中递送核酸至细胞的方法，包括给予所述受试者包含在一对AAV反向末端重复序列之间插入的核酸的AAV颗粒，从而在受试者中递送核酸至细胞。

[0056] 还提供了在受试者中递送核酸至脑细胞，例如纹状体或皮层中的神经元的方法，包括给予所述受试者包含在一对AAV反向末端重复序列之间插入的核酸的AAV颗粒，从而在受试者中递送核酸至神经元或其它细胞。

[0057] 本公开内容的某些实施方案提供了包含本文所述的病毒载体的细胞。

[0058] AAV载体在一个实施方案中，本公开内容的病毒载体是AAV载体。"AAV"载体指腺伴随病毒，并可用来指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有亚型、血清型和假型，可天然存在的和重组形式二者，另有规定的除外。如本文所用的，术语"血清型"指基于衣壳蛋白与确定抗血清(例如存在8个已知血清型的灵长类动物AAV，AAV-1至AAV-9和AAVrh10)的反应性鉴定的并与其它AAV区分的AAV。例如，血清型AAV2被用来指含有从AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白和含有来自相同的AAV2血清型的5'和3' ITR序列的基因组的AAV。如本文所用的，例如，rAAV1可被用来指具有来自相同血清型的衣壳蛋白和5'-3' ITR二者的AAV或它可指具有来自一种血清型的衣壳蛋白和来自不同的AAV血清型的5'-3' ITR，如来自AAV血清型2的衣壳和来自AAV血清型5的ITR的AAV。对于本文举例说明的每个实例，载体设计和生产的描述说明了衣壳和5'-3' ITR序列的血清型。缩写"rAAV"指重组腺伴随病毒，也称为重组AAV载体(或"rAAV载体")。

[0059] "AAV病毒"或"AAV病毒颗粒"指至少一种AAV衣壳蛋白(优选地所有的野生型AAV的衣壳蛋白)和包壳多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源性多核苷酸(即，并非野生型AAV基因组的多核苷酸，例如待传递至哺乳动物细胞的转基因)，它通常称为"rAAV"。

[0060] 在一个实施方案中，AAV表达载体使用已知的技术构建，以至少在转录的方向上提供包括转录起始区、感兴趣的DNA和转录终止区的控制元件，作为可操作连接的元件。选择在哺乳动物细胞中具有功能性的控制元件。生成的含有可操作连接的元件的构建体的两侧(5'和3')与功能性AAV ITR序列连接。

[0061] 所谓"腺伴随病毒反向末端重复序列"或"AAV ITR"意指在AAV基因组的每个末端发现的本领域公认的区域，其以顺式作为DNA复制起点和作为对病毒的包装信号而一起发挥作用。AAV ITR，与AAV rep编码区一起，提供自在两个侧翼ITR之间插入的核苷酸序列有效的切除和拯救，并且将在两个侧翼ITR之间插入的核苷酸序列整合至哺乳动物细胞基因组中。

[0062] AAV ITR区域的核苷酸序列是已知的。如本文所用的，"AAV ITR"不必具有描述的野生型核苷酸序列，但可例如通过插入、缺失或取代核苷酸而改变。另外，AAV ITR可源自几种AAV血清型的任一种，包括而不限于，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。而且，在AAV载体中侧接选定的核苷酸序列的5'和3' ITR不必一定是相同的或源自相同的AAV血清型或分离物，只要它们按照预定的发挥功能，即允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列，并在AAV Rep基因产物存在于细胞中时，允许异源性序列整合进入受体细胞基因组。

[0063] 在一个实施方案中，AAV ITR可源自几种AAV血清型的任一种，包括而不限于，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。而且，在AAV表达载体中侧接选定的核苷酸序列的5'和3' ITR不必一定是相同的或源自相同的AAV血清型或分离物，只要它们按照预定的发挥功能，即从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列，并在AAV Rep基因产物存在于细胞中时，允许DNA分子整合进入受体细胞基因组。

[0064] 在一个实施方案中，AAV衣壳可源自AAV2。用于AAV载体的合适的DNA分子的大小将少于约5千碱基(kb)，少于约4.5 kb，少于约4kb，少于约3.5 kb，少于约3 kb，少于约2.5 kb并是本领域已知的。

[0065] 在一个实施方案中，选择的核苷酸序列可操作地连接于控制元件，其在受试者中指导其体内的转录或表达。这样的控制元件可包含正常地与所选择的基因有关的控制序列。或者，可采用异源性控制序列。有用的异源性控制序列通常包括源自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括，但不限于，SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、细胞巨化病毒(CMV)启动子例如CMV即刻早期启动子区域(CMVIE)，劳氏肉瘤(rous sarcoma)病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成的启动子、杂合启动子等。此外，源自非病毒基因，例如小鼠金属硫蛋白基因的序列，也将在此找到用途。这样的启动子序列可从例如Stratagene (San Diego, Calif.)经市售购得。

[0066] 在一个实施方案中，异源性启动子和其它控制元件二者，例如CNS-特异性和诱导型启动子、增强子等，将具有特定的用途。异源性启动子的实例可CMV启动子。CNS-特异性启动子的实例包括从得自髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的基因分离的那些。诱导型启动子的实例包括对蜕皮激素、四环素、缺氧和aufin的DNA反应元件。

[0067] 在一个实施方案中，带有由AAV ITR限定的感兴趣的DNA分子的AAV表达载体，可通过将选定的序列直接插入AAV基因组中构建，所述基因组已具有主要的AAV可读框("ORF")从其中切除。AAV基因组的其它部分也可缺失，只要ITR的足够部分仍然允许复制和包装功能。这样的构建体可采用本领域熟知的技术设计。

[0068] 或者，AAV ITR可从病毒基因组或从含有所述AAV ITR的AAV载体切离，并使用标准连接技术在存在于另一个载体中的选定的核酸构建体的5'和3'融合。例如，连接可在20 mM Tris-Cl pH 7.5、10 mM MgCl2、10 mM DTT、33 µg/ml BSA、10 mM-50 mM NaCl，和或者40 uM ATP、0.01-0.02 (Weiss)单位T4 DNA连接酶于0℃ (用于"粘端"连接)或1 mM ATP、0.3-0.6 (Weiss)单位T4 DNA连接酶于14℃ (用于"平端"连接)实现。分子间"粘端"连接通常以
30-100 µg/ml总DNA浓度(5-100 nM总末端浓度)进行。AAV载体含有ITR。

[0069] 另外，嵌合基因可经合成产生以包含一个或多个选定的核酸序列的5'和3'排列的AAV ITR序列。用于在哺乳动物CNS细胞中表达嵌合基因序列的优选的密码子可被采用。完全嵌合序列从由标准方法制备的重叠寡核苷酸装配。

[0070] 为产生rAAV病毒体，使用已知的技术，例如通过转染，将AAV表达载体引入合适的宿主细胞。许多转染技术通常是本领域已知的。见例如Sambrook等(1989)分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning, laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratories, New York。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接微量注入培养的细胞、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质-介导的转导和使用高速微弹发射的核酸传递。

[0071] 在一个实施方案中，用于产生rAAV病毒体的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，它们可用作，或已经用作异源性DNA分子的受体。该术语包括已经转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用的"宿主细胞"通常指已用外源性DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系，293的细胞(可通过例如美国典型培养物保藏中心按索取号ATCC CRL1573容易地获得)可被用于实施本公开的内容。特别地，人细胞系293是已用腺病毒类型-5 DNA片段转化，并表达腺病毒E1a和E1b基因的人类胚胎肾细胞系。293细胞系是容易转染的，并提供特别方便的在其中产生rAAV病毒体的平台。

[0072] 所谓"AAV rep编码区域"意指本领域公认的AAV基因组区域，其编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40。这些Rep表达产物已显示具有许多功能，包括DNA复制的AAV起点的识别、结合和切口，DNA解旋酶活性和从AAV (或其它异源性)启动子转录的调节。Rep表达产物共同需要用于复制AAV基因组。AAV rep编码区域的合适的同源基因包括人疱疹病毒
6 (HHV-6) rep基因，其也已知介导AAV-2 DNA复制。

[0073] 所谓"AAV cap编码区域"意指本领域公认的AAV基因组区域，其编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，或其功能性同源物。这些Cap表达产物提供包装功能，这些功能整体需要用于包装病毒基因组。

[0074] 在一个实施方案中，通过用AAV辅助构建体在AAV表达载体的转染之前，或者同时转染宿主细胞，将AAV辅助功能引入宿主细胞。AAV辅助构建体因此被用来提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充缺失的AAV功能，其对产生AAV感染是必要的。AAV辅助构建体缺乏AAV ITR，因而既不能复制，也不能包装它们本身。这些构建体可呈现为质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体的形式。已描述了许多AAV辅助构建体，例如通常所用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其编码Rep和Cap两种表达产物。编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体已有描述。

[0075] 传递病毒载体的方法包括将AAV注入受试者。一般来说，rAAV病毒体可使用体内或者体外转导技术引入CNS的细胞。如果体外转导，所需受体细胞将从受试者中除去，用rAAV病毒体转导并再次引入受试者。或者，可使用同种或异种细胞，其中那些细胞将在受试者中不产生不适当的免疫反应。

[0076] 将转导的细胞传递和引入受试者的合适的方法已有描述。例如，细胞可通过使重组AAV病毒体与CNS细胞例如在适当的介质中合并而在体外转导，筛选带有感兴趣的DNA的那些细胞可使用常规技术例如DNA印迹和/或PCR，或通过使用可选择的标记筛选。然后转导的细胞可配制成下文更充分地描述的药用组合物，并将组合物通过各种技术引入受试者，例如通过移植、肌内、静脉内、皮下和腹膜内注入。

[0077] 在一个实施方案中，药用组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的感兴趣的核酸，即足以减轻或缓解所提及疾病状态的症状的量或足以赋予所需益处的量。药用组合物也将含有药学上可接受的赋形剂。这样的赋形剂包括自身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并可给予而无过度毒性的任何药用试剂。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，山梨醇、吐温80，和液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可包括于其中，例如，无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可存在于这样的溶媒中。药学上可接受的赋形剂的深入讨论可在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)中获得。

[0078] 应该理解，一个以上的转基因可通过传递病毒载体来表达。或者，独立的载体，每个表达一个或多个不同的转基因，也可传递至如本文描述的受试者。而且，也打算通过本公开内容的方法传递的病毒载体与其它合适的组合物和疗法组合。

[0079] 正如本领域技术人员在考虑了本申请的教导后所显而易见的，必须加入的病毒载体的有效量可凭经验确定。给药可在整个治疗过程以一个剂量、连续地或间歇地进行。确定最有效的给药方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的并将随病毒载体、疗法的组成、靶细胞和待治疗的受试者而变化。单次和多次给药可按照由治疗主治医师选择的剂量水平和模式进行。

[0080] 在某些实施方案中，rAAV以1x105 -1x1016vg/ml的约0.3-2 ml的剂量给予。在某些实施方案中，rAAV以1x107 -1x1014vg/ml的约1-3 ml的剂量给予。在某些实施方案中，rAAV以1x108 -1x1013vg/ml的约1-2 ml的剂量给予。

[0081] 含有rAAV颗粒的制剂将含有在媒介中的有效量的rAAV颗粒，有效量由本领域技术人员容易地确定。rAAV颗粒可典型地介于从约1%至约95% (w/w)的组合物的范围内，或如果适合时可甚至更高或更低。要给予的量取决于诸如为治疗考虑的动物或人类受试者的年龄、体重和身体状况等因素。有效的剂量可由本领域普通技术人员通过常规试验建立剂量反应曲线来确立。受试者通过给予一个或多个剂量的rAAV颗粒来治疗。当需要维持足够的酶活性时，可给予多个剂量。

[0082] 溶媒，包括水、盐水溶液、人造CSF，或其它已知的物质，可用于本发明。为制备制剂，可分离、冻干和稳定纯化的组合物。然后可将组合物调节至适当的浓度，任选地与抗炎剂合并，并包装以供使用。

[0083] 本发明提供了在细胞中通过引入足以在细胞中增加靶蛋白水平的量的上述蛋白或编码蛋白的核酸分子至细胞，增加靶蛋白水平的方法。在某些实施方案中，靶蛋白的积聚增加至少10%。靶蛋白的积聚增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 95%或99%。

[0084] 编码治疗剂的核酸术语"核酸"指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链-或者双链-链形式的聚合物，由含有糖、磷酸盐和为嘌呤或者嘧啶的碱的单体(核苷酸)组成。除非特别限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸类似的结合特性并以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指明，特定的核酸序列也涵盖其保守修饰的变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确表示的序列。特别地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置用混合的-碱和/或脱氧肌苷残基取代的序列而实现。

[0085] "核酸片段"是给定核酸分子的部分。在大多数生物体中的脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与将DNA中含有的信息转移到蛋白中。所公开的核苷酸序列和蛋白的片段和变体或由此编码的部分-长度蛋白也被本发明涵盖。所谓"片段"或"部分"意指全长或少于全长的编码多肽或蛋白的核苷酸序列，或其氨基酸序列。在某些实施方案中，片段或部分是有生物学功能的(即保留5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的Rheb或Rhes)。

[0086] 分子的"变体"是基本上类似于天然分子的序列的序列。对于核苷酸序列，由于遗传密码的简并性，变体包括编码天然蛋白的相同氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体例如这些可采用分子生物学技术，如例如用聚合酶链反应(PCR)和杂交技术鉴别。变体核苷酸序列也包括合成来源的核苷酸序列，例如通过使用位点-定向诱变产生的编码天然蛋白的那些，以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些。一般来说，本发明的核苷酸序列变体将具有与天然(内源性)核苷酸序列至少40%、50%、60%、至70%，如71%、72%、73%、74%、
75%、76%、77%、78%、至79%、通常至少80%，如81%-84%、至少85%，如86%、87%、88%、89%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、至98%的序列同一性。在某些实施方案中，变体是有生物学功能的(即保留5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、99%或100%的野生型Rhes或Rheb的活性)。

[0087] 特定核酸序列的“保守地修饰的变化”指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列。由于遗传编码的简并性，大量功能性相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，在每一个由密码子指定精氨酸的位置，密码子可被更改为描述的对应的任何密码子，而不改变编码的蛋白。这样的核酸变异是"沉默变异"，其是一种"保守地修饰的变异"。本文描述的编码多肽的每一核酸序列也描述每一种可能的沉默变化，除非另外注明。本领域技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了ATG，其通常是用于甲硫氨酸的唯一密码子)可通过标准技术修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”涉及每个描述的序列。

[0088] 术语多核苷酸序列的"基本上同一性"意指使用采用标准参数描述的比对程序之一，与参考序列比较，多核苷酸包含具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%，或至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，或至少90%、91%、92%、93%或
94%，或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。本领域技术人员应认识到，这些值可被适当地调节，以通过考虑密码子简并性、氨基酸类似性、阅读框定位等，确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应同一性。为了这些目的，氨基酸序列的基本上同一性通常意指至少70%、至少80%、90%或甚至至少95%的序列同一性。

[0089] 在肽的上下文中的术语"基本上同一性"指在指定的比较窗口包含与参考序列至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%，或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，或至少90%、91%、92%、93%或94%，或甚至95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列的肽。两个肽序列是基本上相同的指示是，一个肽与针对第二个肽引起的抗体有免疫反应性。因此，肽与第二个肽是基本上相同的，例如，其中两个肽的不同之处仅在于保守的取代。

[0090] 用于将遗传物质引入细胞的方法通过遗传转移方法，例如转染或转导，将外源性遗传物质(如，编码一个或多个治疗性蛋白的cDNA)引入细胞体内，以提供基因修饰细胞。各种表达载体(即，用于促使外源性遗传物质传递到靶细胞中的媒介物)是本领域普通技术人员已知的。

[0091] 如本文所用的，"细胞的转染"指通过掺入加入的DNA，细胞获得新的遗传物质。因此，转染指使用物理或化学方法将核酸插入细胞中。几种转染技术是本领域普通技术人员已知的，包括：磷酸钙DNA共-沉淀；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；和钨颗粒-促进的微粒轰击。磷酸锶DNA共-沉淀是另一种可能的转染方法。

[0092] 相反，"细胞的转导"指使用DNA或RNA病毒，将核酸转移到细胞中的过程。用于将核酸转移到细胞中的RNA病毒(即，逆转录病毒)在此被称为转导嵌合逆病毒。包含在逆转录病毒中的外源性遗传物质被结合到转导细胞的基因组。已用嵌合DNA病毒(如，携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒)转导的细胞，将不具有掺入到其基因组中的外源性遗传物质，但将能够表达在细胞内染色体外保留的外源性遗传物质。

[0093] 典型地，外源性遗传物质包括异源性基因(通常呈现一种包含编码治疗性蛋白的外显子的cDNA的形式)和启动子一起，以控制新基因的转录。启动子特征性地具有启动转录所必要的特定核苷酸序列。任选地，外源性遗传物质还包括获得所需基因转录活性所需要的另外的序列(即，增强子)。为了这样的讨论的目的，"增强子"仅仅是任何非翻译的DNA序列，其与相邻的编码序列一起工作(顺式)，以改变由启动子指示的基础转录水平。外源性遗传物质可从启动子的下游直接引入细胞基因组，以致启动子和编码序列可操作地连接，以允许转录编码序列。逆转录病毒表达载体可包括外源性启动子元件，以控制插入外源性基因的转录。这样的外源性启动子包括组成型和诱导型两种启动子。

[0094] 天然存在的组成型启动子控制基本细胞功能的表达。结果，在组成型启动子的控制下的基因在细胞生长的所有情况下表达。示例性组成型启动子包括用于编码某些组成型或"持家"功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子，和本领域技术人员已知的其它组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型地发挥功能。这些包括：SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒(Moloney Leukemia Virus)和其它逆转录病毒的长端重复序列(LTR)；和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子，以及其它等等。因此，任何上面-提及的组成型启动子可用来控制异源性基因插入片段的转录。

[0095] 在诱导型启动子控制下的基因仅仅或很大程度上在诱导剂的存在下表达(如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子的存在下有很大增加)。诱导型启动子包括反应元件(RE)，其在它们的诱导因子被结合时刺激转录。例如，有用于血清因子、甾体激素、维甲酸和环状AMP的RE。可选择含有特定RE的启动子以获得诱导型反应并在一些情况下，RE本身可附接于不同的启动子，从而将可诱导性赋予重组基因。因此，通过选择适当的启动子(组成型对比诱导型；强对比弱)，有可能控制治疗剂在基因修饰细胞中的存在和表达水平二者。如果编码治疗剂的基因是在诱导型启动子的控制下，治疗剂原位的传递通过使基因修饰细胞原位暴露于允许治疗剂转录的条件，如通过腹膜内注射控制药物转录的诱导型启动子的特异性诱导剂来引发。例如，在金属硫蛋白启动子的控制下，由基因编码的治疗剂的基因修饰细胞的原位表达，通过使基因修饰细胞与含有适当的(即，诱导性)金属离子的溶液原位接触来提高。

[0096] 因此，原位传递的治疗剂的量通过控制这样的因素调节，这样的因素有例如：(1) 用来指导插入基因的转录的启动子的性质(即，启动子是组成型的还是诱导型的，强或弱的)；(2) 插入细胞中的外源性基因的拷贝数目；(3) 给予(如，植入)患者的转导/转染细胞数目；(4) 植入物(如，移植或包囊表达系统)的大小；(5) 植入物的数目；(6) 转导/转染细胞或植入物放置在部位的时间长度；和(7) 由基因修饰细胞生产治疗剂的速率。在考虑了以上公开的因素和患者的临床性质后，用于传递治疗有效剂量的特定治疗剂的这些因素的选择和优化被认为是在本领域普通技术人员的范围内，而无需过多的实验。

[0097] 除了至少一个启动子和至少一种编码治疗剂的异源性核酸外，表达载体还可包括选择基因，例如，新霉素抗性基因，用于促进已用表达载体转染或转导的细胞的选择。或者，细胞用两个或更多个表达载体转染，至少一个载体含有编码治疗剂的基因，其它载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列(下述)的选择被认为是在本领域普通技术人员的范围内，而无需过多的实验。

[0098] 治疗剂可以被靶向而传递到细胞外、细胞内或膜位置。如果从细胞中分泌基因产物是理想的，则表达载体被设计以包括适宜的分泌"信号"序列，用于从细胞分泌治疗性基因产物至细胞外环境。如果基因产物被保留在细胞内是理想的，则这种分泌信号序列被省略。在类似的方式中，表达载体可被构建以包括"保留"信号序列，用于锚定治疗剂在细胞浆膜内。例如，所有膜蛋白具有疏水性跨膜区，其停止蛋白在膜中的易位且不允许蛋白分泌。包括将基因产物靶向特定位置的信号序列的表达载体的构建被认为是在本领域普通技术人员的范围内，而无需过多的实验。

[0099] 治疗方法本公开内容的某些实施方案提供了在哺乳动物中治疗疾病的方法，包括给予本文所述的蛋白或编码蛋白的载体至哺乳动物。

[0100] 在某些实施方案中，哺乳动物是人。

[0101] 本公开内容的某些实施方案提供本文所述的蛋白或编码蛋白的载体制备用于在哺乳动物中治疗亨延顿病的药物的用途。

[0102] 本公开内容还提供了包含本文所述的载体的哺乳动物细胞。细胞可以是人的，和可以来自脑。

[0103] 本公开内容的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和基因工程改造的细胞(体内修饰的)，和它们的用途。特别是，本公开内容涉及用于基因或蛋白疗法的方法，其能够系统递送治疗有效剂量的治疗剂。

[0104] 根据一个方面，提供用于在哺乳动物受体中表达治疗剂的细胞表达系统。表达系统(本文亦称为"遗传修饰的细胞")包含用于表达治疗剂的细胞和表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒和其它媒介，用于递送异源遗传物质至细胞。因此，如本文所用的术语"表达载体"是指用于递送异源遗传物质至细胞的媒介。特别是，表达载体是重组腺病毒、腺伴随病毒或慢病毒或逆转录病毒载体。

[0105] 表达载体进一步包括用于控制异源基因转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子(下文描述)。表达系统适合给予哺乳动物受体。表达系统可包含多个非永生的遗传修饰的细胞，每个细胞包含编码至少一种治疗剂的至少一个重组基因。

[0106] 细胞表达系统在体内形成。根据又一个方面，提供用于在体内治疗哺乳动物受体的方法。所述方法包括原位引入用于表达异源基因产物的表达载体至患者的细胞，例如通过静脉内给予。为形成体内表达系统，在体内i.v.引入用于表达治疗剂的表达载体至哺乳动物受体，其中载体通过血管迁移至脑。

[0107] 根据又一个方面，提供用于体内治疗哺乳动物受体的方法。所述方法包括引入靶蛋白至患者体内。

[0108] 用于表达异源基因的表达载体可包括诱导型启动子以控制异源基因产物的转录。因此，原位递送治疗剂通过将细胞原位暴露于诱导异源基因转录的条件进行控制。

[0109] 多肽(例如，Rhes或Rheb)之一的“变体”是与天然蛋白不完全相同的多肽。这样的变体蛋白可通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或置换来改变氨基酸序列获得。蛋白的氨基酸序列通过例如置换进行修饰，以产生与天然多肽相比具有基本上相同或改进质量的多肽。置换可以是保守置换。“保守置换”是用具有类似侧链的另一个氨基酸的氨基酸置换。保守置换可以是用产生氨基酸电荷或氨基酸的侧链大小(或者，侧链中的化学基团的大小、电荷或类型)的最小可能变化的氨基酸的置换，使得整个肽保持其空间构型，但具有改变的生物活性。例如，常见的保守变化可以是Asp至Glu、Asn或Gln；His至Lys、Arg或Phe；Asn至Gln、Asp或Glu；和Ser至Cys、Thr或Gly。丙氨酸通常用于置换其它氨基酸。20种必需氨基酸可如下分组：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有不带电极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；和具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

[0110] 通过改变相应的核酸序列的密码子来实现氨基酸变化。已知这样的多肽可根据在多肽结构中将某些氨基酸置换为其它氨基酸来获得，以改变或改进生物学活性。例如，通过置换可选的氨基酸，可在多肽上得到小的构象变化，导致活性增加。或者，在某些多肽中的氨基酸置换可用于提供残基，其然后可连接至其它分子，以提供肽分子缀合物，其保留起始多肽的足够的性质用于其它目的。

[0111] 可在赋予多肽相互作用生物学功能中使用氨基酸的水性指数，其中发现某些氨基酸可置换为具有类似水性指数的其它氨基酸，和仍保留类似的生物学活性。或者，可根据亲水性进行类似氨基酸的置换，特别是其中产生的多肽所需的生物学功能意图用于免疫学实施方案的情况下。由邻近氨基酸的亲水性规定的“蛋白”的最大局部平均亲水性，与其免疫原性有关。因此，注意置换可基于分配给每个氨基酸的亲水性进行。

[0112] 在使用亲水性指数或水性指数(其对每个氨基酸分配值)中，优选在这些值为±2的情况下进行氨基酸的置换，特别优选±1，和最优选的置换是±0.5的那些。

[0113] 变体蛋白与相应的天然蛋白的氨基酸序列具有至少50%、至少约80%或甚至至少约90%，但小于100%的连续氨基酸序列同源性或同一性。

[0114] 变体多肽的氨基酸序列基本上对应于天然多肽的氨基酸序列。如本文所用的“基本上对应于”是指发挥与天然蛋白产生的反应基本上相同的生物学反应的多肽序列。这样的反应可以是天然蛋白产生的水平的至少60%，和甚至可以是天然蛋白产生的水平的至少80%。

[0115] 变体可包括相应的天然蛋白中不存在的氨基酸残基，或相对于相应的天然蛋白的缺失。变体还可以是与相应的天然蛋白相比截短的“片段”，即仅为全长蛋白的一部分。蛋白变体还包括具有至少一个D-氨基酸的肽。

[0116] 变体蛋白可自编码变体蛋白的分离的DNA序列表达。“重组体”定义为通过基因工程改造方法产生的肽或核酸。应注意，本领域众所周知，由于遗传密码子的冗余，密码子中的单个核苷酸可容易地发生交换，和仍得到相同的氨基酸序列。

[0117] 本公开内容提供了在哺乳动物中通过给予细胞或患者表达载体来治疗疾病的方法。对于基因治疗方法，分子生物学和基因疗法的领域的普通技术人员将能够确定本公开内容的新方法中使用的表达载体的合适剂量和给予途径，无需过度实验。

[0118] 根据一个实施方案，细胞在体内转化或以其它方式遗传修饰。来自哺乳动物受体的细胞用包含外源遗传物质的载体体内转化(即转导或转染)，以表达编码治疗剂的异源(例如，重组)基因，和治疗剂在原位递送。

[0119] 如本文所用的，"外源遗传物质"是指天然或合成的核酸或寡核苷酸，其天然不存在于细胞中；或如果其天然存在于细胞中，其不通过细胞以生物学显著水平转录或表达。因此，"外源遗传物质"包括例如，可转录为反义RNA的非天然存在的核酸，以及"异源基因" (即，编码在相同类型的天然存在的细胞中不表达或以生物学不显著水平表达的蛋白的基因)。

[0120] 简言之，术语"治疗剂"包括但不限于与上述病况相关的试剂，以及其功能等效物。如本文所用的，术语"功能等效物"是指在其被视为哺乳动物受体的治疗剂的功能等效物时，对哺乳动物受体具有相同或改进的有益效果的分子(例如，肽或蛋白)。

[0121] 上述适合于基因置换疗法的治疗剂和病况仅是说明性的，和不意图限制本公开内容的范围。选择用于治疗已知病况的合适的治疗剂被认为在本领域普通技能的范围内，无需过度实验。

[0122] 本发明的试剂的剂量、制剂和给予途径本发明的试剂经给予以导致与亨延顿病有关的至少一个症状的减少。给予的量根据各种因素而变化，包括但不限于选择的组合物、具体的疾病、哺乳动物的重量、身体条件和年龄，和实现预防还是治疗。这样的因素可通过临床医师使用本领域众所周知的动物模型或其它试验系统容易地确定。

[0123] 本发明预期通过给予本发明的试剂(例如，Rhes或Rheb)、表达载体或病毒颗粒来治疗亨延顿病。给予本发明的治疗剂可以是连续或间歇的，取决于例如受体的生理条件，给予的目的是治疗性还是预防性的，和技术人员已知的其它因素。本发明的试剂的给予可以在预定的一段时间内基本上是连续的，或可以是一系列分开的剂量。局部和系统给予是预期的。

[0124] 具有本发明的治疗剂的一个或多个合适的单位剂型，其如下所述可任选地经配制用于持续释放(例如使用微胶囊化)，可通过各种途径给予，包括胃肠外，包括通过静脉内和肌内途径，以及通过直接注射至疾病组织。例如，治疗剂可直接注射至脑。或者，对于脑和脊髓病况，治疗剂可鞘内引入。在合适时，制剂可方便地以离散单位剂型的形式提供，和可通过药学上众所周知的任何方法制备。这样的方法可包括使治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细粉固体载体或其组合结合，然后如果需要的话，将产物引入需要的递送系统或将产物在需要的递送系统中成形的步骤。

[0125] 当本发明的治疗剂经制备用于给予时，它们可与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合，以形成药物制剂或单位剂型。这样的制剂中的总活性成分包括0.1-99.9%重量的制剂。"药学上可接受的"是这样的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐，其与制剂的其它成分相容，并对其受体无害。给予的活性成分可作为粉末或颗粒，作为溶液、混悬液或乳液提供。

[0126] 包含本发明的治疗剂的药物制剂可通过本领域已知的程序使用众所周知和容易获得的成分制备。本发明的治疗剂还可配制为适合于胃肠外给予的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉内途径。

[0127] 本发明的治疗剂的药物制剂还可呈水性或无水溶液或分散液的形式，或者乳液或混悬液的形式。

[0128] 因此，治疗剂可配制用于胃肠外给予(例如，通过注射，例如推注或连续输注)和可以在安瓿、预填充注射器、小体积输注容器中或在含加入的防腐剂的多剂量容器中以单位剂型提供。活性成分可以呈例如在油或水性溶媒中的混悬液、溶液或乳液的形式，和可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，其通过无菌分离无菌固体或通过自溶液冻干获得，在使用前用合适的溶媒，例如，无菌无热源的水构建。

[0129] 将理解，各剂型的单个气溶胶剂量中包含的一种或多种成分的单位含量本身不需要构成治疗特定适应症或疾病的有效量，因为需要的有效量可通过给予多个剂量单位实现。此外，有效量可单独或在一系列给予中，使用小于剂型的剂量实现。

[0130] 本发明的药物制剂可包括药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂，和本领域众所周知的类型的盐，作为任选成分。可用于本发明的药物制剂的载体和/或稀释剂的具体的非限制性实例包括水和生理上可接受的缓冲盐水溶液，例如pH 7.0-8.0的磷酸缓冲盐水溶液和水。

[0131] 本发明现在通过以下非限制性实施例进行说明。

[0132] 实施例1在亨廷顿疾病小鼠中恢复异常的mTORC1活性改进疾病表型
雷帕霉素的机制靶标(mTOR)是丝氨酸-苏氨酸激酶，其整合信号以调节细胞生长和代谢(Laplante和Sabatini, 2012)。mTOR形成2个不同的复合物，mTORC1和mTORC2。在营养素富集的条件下，mTORC1被激活和促进蛋白翻译和细胞生长。相比之下，营养素撤回灭活mTORC1和启动大自噬作用(下文称为自噬作用)作为细胞存活机制。mTORC1正面控制线粒体生物发生(Cunningham等, 2007)和通过控制胆固醇合成调节脂质稳态(Peterson等, 
2011; Porstmann等, 2008)。此外，在脑中，mTORC1促进髓鞘形成、轴突生长和再生(Kim等, 
2012; Park等, 2008; Sun等, 2011)，和在脑中富集的Ras同系物(Rheb) (mTORC1的关键激活物)的遗传缺失导致皮层厚度减少和髓鞘形成不足(Zou等, 2011)。

[0133] 在纹状体中Rhes (在纹状体中富集的Ras同系物)用作mTORC1的关键激活物(Subramaniam等, 2012)。Rhes的基因敲除减少mTORC1活性，和削弱对L-DOPA诱导的运动障碍的不利反应(Subramaniam等, 2012)。此外，Rhes促进SUMO化(Subramaniam等, 2009)，一个参与HD发病的过程(Steffan等, 2004)。在体外，Rhes促进mHTT的SUMO化以诱导细胞毒性(Subramaniam等, 2009)，和用siRNA减少外源加入的Rhes增加用mHTT片段转染的细胞的存活(Lu和Palacino, 2013; Seredenina等, 2011)。在体内，Rhes的基因废除保护免于神经毒性诱导的4种纹状体损伤(Mealer等, 2013)和在R6/1 HD小鼠中瞬时延迟运动症状发作(Baiamonte等, 2013)。因为Rhes在纹状体中高度表达(Spano等, 2004)，已提议Rhes-mHTT相互作用可成为HD中突出的纹状体变性的基础。

[0134] 然而，其它数据质疑了Rhes在HD中的致病作用。Rhes水平在HD患者尾状核中减少(Hodges等, 2006)，和在R6/1 HD模型中Rhes废除不阻止脑变性(Baiamonte等, 2013)。此外，Rhes KO小鼠发生类似于HD小鼠中见到的脑萎缩和行为异常(Baiamonte等, 2013; Spano等, 2004)。此外，Rhes促进自噬作用(Mealer等, 2014)，一个充分确立的HD保护机制。因此，鉴于Rhes在介导纹状体mTORC1信号转导中的关键功能，我们假设Rhes和mTORC1活性的同时损失促进HD的早期纹状体病理，和通过Rheb或Rhes上调来增强mTORC1功能将是神经保护性的。

[0135] 为了测试该假设，我们严重调节了在HD转基因小鼠的成年纹状体中的Rhes和mTORC1活性。我们发现具有mTORC1活化的有利效果，包括改进mHTT-相关的代谢表型和逆转纹状体萎缩。一致的是，体内恢复mTORC1活性或Rhes水平是保护性的。此外，我们显示Rhes的神经保护性质依赖于其GTP酶活性，其是活化mTORC1所需要的，但不依赖于SUMO化相关的活性。总之，这些数据表明，受损的Rhes/mTORC1活性与显著的HD纹状体发病相关，和表明受损的mTORC1功能可提供作为HD的复杂疾病表型的基础的重要机制。

[0136] 结果mTORC1活性在HD的纹状体中减少
作为我们的假设的第一个试验，我们检查了HD脑中的mTORC1活性。我们发现mTORC1活性在来自HD患者和N171-82Q小鼠的纹状体组织中减少，如通过核糖体蛋白S6  (pS6) (mTORC1活性的已建立的标志物)的磷酸化减少所检测的(图1A; 图S1A,B)。在HD小鼠中，在神经学症状发生之前mTORC1活性在6周龄时受损(图1B)。减少的mTORC1活性与mTOR或mTOR复合物的组分(例如Rictor和Raptor)表达减少无关(图1A,B; 图S1A)。我们接下来改造了腺伴随病毒(AAV)，其转导纹状体神经元(图S2A) (McBride等, 2008)以表达Rheb，一个充分确立的mTORC1正调节剂(Laplante和Sabatini, 2012)。以此方式，我们可严重体内增强mTORC1活化。我们使用组成型活性的Rheb突变体(caRheb; S16H)，其之前显示在小鼠脑中激活mTORC1信号转导(Kim等, 2012; Zou等, 2011)。单侧注射AAV.caRheb至N171-82Q小鼠纹状体显著诱导mTORC1活性，如通过在注射后3周时pS6增加所显示的(图2A)。DARPP-32水平(中间多刺神经元(MSN)中多巴胺信号转导的重要组分)的选择性减少，是HD小鼠和人脑中病理学进展的指示物(Bibb等, 2000; Hodges等, 2006)。与对侧未注射组织相比，AAV.caRheb转导促进在N171-82Q小鼠纹状体中DARPP-32水平的33%增加(图2A)。此外，AAV.caRheb上调线粒体-转录调节剂PPARγ共活化物1α (PGC1-α)的表达(图2B)，其为线粒体生物发生的主要调节剂，当其增加时改进线粒体功能和HD模型的运动缺陷(Cui等, 
2006; Tsunemi等, 2012)。与线粒体活性增加一致，活性氧物质解毒(ROS)基因SOD2、cyt-c和ANT1的水平在AAV.caRheb处理的脑中也增加(图2C-F)。谷胱甘肽过氧化物酶，一种在HD模型生物中最近鉴定的神经保护性抗氧化酶(Mason等, 2013)，在caRheb转导后在HD脑中选择性增加(图2G)。改进的概况不能通过病毒注射或mHTT转基因的下调的间接作用解释；
当AAV.caRheb注射的脑与AAV.eGFP处理的脑相比时获得类似结果，并且caRheb不影响mHTT转基因表达(图S2B-H)。我们接下来进行体外研究和用mTOR的ATP-竞争性抑制剂Torin1处理表达扩增的(Q111)和正常的(Q7) Htt的纹状体细胞(Trettel等, 2000)。Torin1有效抑制TOR功能，包括抵抗雷帕霉素的抑制的那些(Thoreen等, 2009)。在Q7和Q111细胞中Torin1治疗减少pS6和p-4E-BP1水平以及DARPP-32表达(图S3A)。Torin1还表达PGC1-α，PGC1- α-调节的基因cAMP响应元件结合蛋白(CREB)和调节的CREB 1的传感器(TORC1) (图S3A, B)。总之，我们的体外和体内结果表明，在WT和突变体HTT等位基因的情况下mTORC1调节PGC1-α和PGC1-α调节的代谢基因。

[0137] mTORC1控制HD脑中的脂肪生成基因表达我们接下来测定了受损的mTORC1活性是否是其它HD-特异性代谢途径替代方案的基
础。在HD小鼠和人脑中已观察到异常的胆固醇生物合成(Karasinska和Hayden, 2011; Valenza和Cattaneo, 2011)。脂质生物合成所需要的基因的表达受固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的核转活的控制。已报道mHTT抑制细胞和HD小鼠中的SREBP的核易位，这可促进功能障碍性胆固醇合成(Valenza等, 2005)。mTORC1还调节SREBP转活(Peterson等, 2011; Porstmann等, 2008)。为了测定在HD情况下mTORC1活性减少是否改变胆固醇合成，我们应用Torin1至培养的Q7或Q111纹状体细胞。在突变和正常细胞系中Torin1减少SREBP靶基因HMG-CoA还原酶(HMGCR)(胆固醇合成的限速酶)和HMGCS1的表达(图3A, B)。

[0138] 在N171-82Q小鼠中，与对照相比HMGCR显著减少(图3C)，类似于在HD患者脑中已见到的(Hodges等, 2006)。AAV.caRheb使HMGCR水平正常化，还增加固醇生物合成所需要的酶的表达：HMG-CoA合酶1 (HMGCS1)、羊毛固醇14α-去甲基化酶(CYP51)和7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)(图3C-F; 图S3 C-F)。类似于我们的体外发现，纹状体脂肪生成基因表达的mTOR调节不依赖于HTT中多谷氨酰胺伸展的状态，因为AAV.caRheb也增加在WT纹状体中这些基因的表达(图3C-3F)。尽管HMGCR基因表达减少在N171-82Q小鼠(自朊病毒启动子表达的转基因)中轻微，但HMGCR、HMGCS1、DHCR7和CYP51的表达减少在HD人和其它小鼠模型中观察到(Hodges等, 2006; Valenza等, 2005)。总之，我们的结果表明，mTORC1促进纹状体中的脂肪生成基因表达，和表明受损的mTORC1活性可促进HD中的脂肪生成基因表达减少。

[0139] mTORC1增强参与mHTT清除的途径mTORC1活性通常与拮抗自噬诱导相关，尽管自噬可通过mTORC1依赖和独立的途径发
生。与HD相关，基础自噬活性对于维持神经元存活和促进总体清除率至关重要（Jeong等，
2009; Ravikumar等，2004; Yamamoto等，2006）。因此，我们接下来研究了mTORC1激活对AAV.caRheb处理的HD小鼠纹状体中的自噬的影响。与WT小鼠相比，我们发现N171-82Q小鼠中自噬体膜相关蛋白LC3-II的基础水平增加（图S4）。AAV.caRheb处理提高了LC3-II（图4A）和Beclin-1（一种自噬诱导所必需的蛋白质）（图4B）的水平。为了区分增强的自噬和自噬溶酶体成熟的损伤，使用电子显微镜（EM）来定量在一个半球中用AAV.caRheb处理或在另一半球中用AAV.eGFP处理的小鼠的脑中的自噬体和自溶酶体的相对数量。尽管半球之间的自噬体/自溶酶体比例相似，但是与对照处理的对侧相比，用AAV.caRheb处理，自噬体和自溶酶体二者均增加（图4C），这表明在体内mTORC1活性增加的情况下，自噬被激活。我们还注意到，对照处理（AAV.eGFP）N171-82Q小鼠脑耗尽电子致密内质颗粒物质和细胞质细胞器（图
4D），一种类似于由核仁应激引起的纹状体病理学的表型（Kreiner等， 2013）。相反，AAV.caRheb处理的半球中的细胞显示富集的电子致密的细胞质细胞器。

[0140] 最近的工作表明，mHTT的自噬/蛋白酶体降解发生在整个翻译后修饰（PTM）中（Jeong等，2009; Jia等，2012; O'Rourke等，2013; Thompson等，2009）。例如，SUMO E3连接酶PIAS1通过在细胞模型中促进与mHTT的SUMO2缀合而增加mHTT聚集体形成，并且减少表达mHTT蛋白的果蝇中的PIAS1直向同源物是保护性的（O'Rourke等，2013）。我们发现14周龄的N171-82Q小鼠纹状体中SUMO2水平升高，AAV.caRheb在N171-82Q小鼠和WT对照同窝小鼠中抑制PIAS1和SUMO2表达（图5A，B）。我们还检测了IκB激酶（IKK），一种诱导mHTT降解和靶向mHTT以进行蛋白酶体和溶酶体的清除的激酶（Thompson等人，2009）。内源性IKK相关基因（Ikbkb、Ikbkap和Ikbke）在N171-82Q小鼠纹状体中减少，AAV.caRheb恢复其表达（图5C-E）。此外，HDAC4是mHTT聚集体形成的重要调节因子，和HDAC4的减少降低细胞质聚集体，改善神经元功能，延长HD小鼠的寿命（Mielcarek等，2013）。在这里，我们发现AAV.caRheb转导在N171-82Q小鼠纹状体中降低HDAC4表达（图5F）。含有HTT片段的聚集体在纹状体中很少且不一致，但在N171-82Q小鼠的海马中是稳定的。因此，我们测试了海马的总体负载。AAV有效转导海马神经元（图S5），与AAV.eGFP注射的小鼠相比，AAV.caRheb注射的动物显示出显著降低的mHTT总体负载（图5G），与AAV.caRheb对参与mHTT清除的基因的观察效果一致。

[0141] 增强的mTORC1活性拯救纹状体萎缩并改善HD小鼠的运动表型N171-82Q小鼠显示明显的纹状体萎缩，具有保持的MSN数（Cheng等，2011; Schilling等，1999）。为了研究mTORC1活性如何影响患病脑中的纹状体积，我们进行单侧AAV.caRheb注射至11周龄的N171-82Q小鼠的纹状体(该年龄时存在可测量的纹状体萎缩)（Cheng等，
2011），并将处理的半球与未处理的一侧进行比较。与未处理的对侧半球相比，AAV.caRheb阳性影响MSN细胞大小和纹状体体积（图6A-C）。为了证实caRheb通过mTORC1起作用，我们施用了一种已知的mTORC1抑制剂RAD001（Fox等，2010）。 RAD001处理逆转了caRheb的形态学作用和减弱了S6磷酸化（图6A-6C;图S6A，B）。另外，我们发现，在不存在caRheb的情况下2周的RAD001处理导致N171-82Q小鼠MSN萎缩轻度但显著恶化（图6A，B）。这些结果表明，AAV.caRheb促进MSN生长或通过mTORC1途径保留MSN大小，并且在体内损害mTORC1加剧了该表型。

[0142] 损伤的纹状体多巴胺回路与HD小鼠的运动症状相关（Bibb等，2000; Johnson等，2006）。因此，为了确定AAV.caRheb对多巴胺途径的功能影响，我们单侧注射N171-82Q小鼠，并进行安非他明诱导的旋转测试。如果在半球之间中存在不平衡的多巴胺信号传导，安非他明引发多巴胺释放并诱导小鼠的旋转行为。为此，我们将具有AAV.caRheb或对照病毒（AAV.eGFP）的表达mHTT的AAV（AAV.mHTT）共注射到6周龄WT小鼠中。单侧注射AAV.mHTT / AAV.eGFP引起向注射侧的同侧旋转，表明mHTT毒性（图6D）。相比之下，AAV.caRheb与AAV.mHTT的共注射没有引起同侧旋转，而是小鼠显示对侧旋转（图6D）。与行为结果一致，与未处理的对侧纹状体相比，注射AAV.mHTT / eGFP导致MSN萎缩，而AAV.caRheb与AAV.mHTT共同注射阻止MSN萎缩（图6E）。因此，增强mTORC1活性有利于mHTT驱动的神经元萎缩和多巴胺途径损伤。

[0143] 外源性加入Rhes，一种纹状体富集的mTOR激活剂，在HD转基因小鼠中拯救mHTT相关疾病表型在纹状体中，mTOR主要由纹状体富集的GTP酶蛋白Rhes（Subramaniam等人，2012）调节。
以前的体外研究意味着Rhes在HD中的毒性作用（Subramaniam等人，2009），但其在体内的疾病相关性尚不清楚。我们发现HD人和小鼠纹状体中的Rhes水平降低（图7A和S7A）。Rheb水平不降低（图S7B）。值得注意的是，在发生神经症状之前，Rhes显著减少; 6周龄的N171-82Q小鼠具有73％的野生型Rhes水平，即使在12-14周龄之前临床症状不明显（图7A和S7C）。因此，我们研究了提高Rhes水平如何影响疾病表型。由于mHTT的N末端片段以前显示与Rhes相互作用并在体外赋予细胞毒性，所以N171-82Q模型是体内测试这个问题的理想选择
（Subramaniam等，2009）。如果Rhes是HD毒性的关键介质，N171-82Q小鼠纹状体中Rhes的急性过表达将预期会加剧疾病表型。将表达Rhes的AAV（AAV.Rhes）注射到7周龄的N171-82Q小鼠和WT同窝出生鼠中。与早期体外工作预期相反，但与我们对Rheb的mTORC1活化的结果相一致，与盐水处理的疾病同窝小鼠相比，Rhes过表达改善了N171-82Q小鼠的运动功能，如通过14和18周龄的旋转测试确定的（图7B）。此外，单侧注射后，与对照处理的对侧半球相比，AAV.Rhes显著增加MSN细胞大小（图7C）。类似于Rheb，AAV.Rhes上调线粒体转录调节因子PGC1-α的表达（图7D）。

[0144] 在基于细胞的测定中，Rhes通过促进mHTT的SUMO化来增强mHTT的毒性（Subramaniam等，2009）。为了确定Rhes在体内观察到的疾病修复作用是否通过mTORC1或SUMO化途径，我们产生表达RhesS33N的AAV（AAV.RhesS33N），一种具有消除的GTP酶活性并且减少mTORC1活化但是完整的SUMO化调节活性的Rhes突变体（Subramaniam等，2012; Subramaniam等，2009）。在纹状体注射后，与注射AAV.Rhes的N171-82Q小鼠相比，AAV.RhesS33N处理的N171-82Q小鼠显示出降低的mTORC1活性（图S8）。 AAV.RhesS33N未能修改N171-82Q小鼠的运动缺陷，其与对照处理的N171-82Q小鼠类似地进行（图7B）。值得注意的是，Rhes S33N不引起进一步的行为恶化，正如根据以前的体外观察所预测的一样（Subramaniam等人，2009）。总而言之，这些数据表明，Rhes部分通过mTORC1激活来拯救HD行为缺陷。

[0145] 讨论总体上，我们显示受损的mTORC1活性是与HD相关的各种表型变化的上游，并且可能是代谢和变性表型的基础。我们发现mTORC1激活促进HD小鼠的能量代谢，自噬和纹状体细胞功能。与mTORC1的神经保护作用一致，我们发现，在神经系统症状发作之前，Rhes，一种纹状体富集的mTOR激活剂在HD脑中降低，外源性Rhes添加减轻HD小鼠的运动缺陷和脑部病理。
值得注意的是，在症状性HD小鼠中促进纹状体细胞生长和功能的能力支持了在mHTT负载的神经元中存在可塑性的观念（Yamamoto等，2000），并且突出了通过mTORC1激活在疾病发作后恢复纹状体萎缩的可能性。因为mHTT具有增加的结合Rhes（Subramaniam等人，2009）和mTOR（Ravikumar等人，2004）的倾向，mHTT伴随的Rhes和mTOR功能丧失可能在HD中使纹状体更易于早期变性（图8）。鉴于纹状体体积是HD患者疾病进展的强烈预测因子（Tabrizi等，
2013），将纹状体mTORC1活性恢复至正常水平的疗法可减轻疾病。 mHTT干扰能量产生的关键疾病机制是抑制PGC-1α活性，其表达在人尾状核和HD转基因小鼠纹状体中降低（Cui等，
2006; Hodges等，2006; Tsunemi等 ，2012）。 PGC-1α水平的降低也可能使HD脑对氧化应激敏感，因为PGC-1α KO小鼠中的多巴胺能神经元易受MPTP介导的氧化损伤（St-Pierre等人，
2006）。恢复脑PGC-1α表达改善了R6 / 2 HD小鼠纹状体萎缩（Cui等，2006），并改善了N171-
82Q和R6 / 2 HD小鼠模型中的运动表型（Cui等，2006; Tsunemi和La Spada，2011）。我们发现mTOR是HD小鼠脑中PGC-1α活性的正调节因子，为提高PGC-1α活性提供了一种治疗靶点，并提供了PGC-1α活性可能受损的潜在机制。

[0146] 初看起来，这些数据可能与表明mTORC1抑制是保护性的HD领域的传统观点相矛盾（Ravikumar等，2004; Roscic等，2011）。通过系统性递送雷帕霉素抑制mTORC1减弱了果蝇和N171-82Q HD小鼠中的疾病表型（Ravikumar等，2004）。然而，雷帕霉素诱导的行为改善可能反映对骨骼肌的有益作用，而不是脑中的mTORC1抑制。与此一致，在用雷帕霉素治疗的R6 / 2HD小鼠中，旋转的改善是短暂的，与加速的体重减轻和增强的脑萎缩有关（Fox等，2010）。有趣的是，在R6 / 2小鼠骨骼肌中，mTORC1活性异常升高（She等，2011）。与我们的数据一起，这些发现支持恢复平衡mTORC1活性至关重要的观念，并提出了有意义的观点，即mHTT对mTOR活性可能具有组织特异性作用；与骨骼肌不同，脑mTORC1活性已经在HD中受损。

[0147] mTORC1增强是神经保护的发现也为早期研究提供了机制基础，支持各种药物在HD模型中显示出治疗作用。例如，恢复BDNF-TrkB信号转导在几种临床前HD模型中具有完善的神经保护作用（Jiang等，2013; Simmons等，2013; Xie等，2010; Zuccato等，2001）。该信号转导级联的生理结果是mTORC1激活（Troca-Marin等，2011; Zhou等，2010）。此外，RNAi筛选鉴定出Lkb-1作为细胞和果蝇HD模型中有效的疾病改良剂（Schulte等，2011）。 Lkb-1是负调节mTORC1的肿瘤抑制因子（Shaw等，2004）。抑制Lkb-1改善了原代神经元中mHTT诱导的畸形神经突生长，并且在表达mHTT等位基因的果蝇中拯救了致死率和神经变性表型（Schulte等，2011）。总而言之，这些结果与我们的观点一致，即重新平衡mTORC1活性在HD中是有益的。

[0148] 自噬是细胞体内平衡和蛋白质清除所必需的（Wong和Cuervo，2010）。我们发现mTORC1激活刺激HD小鼠脑中的自噬活性，并改变与促进mHTT降解有关的基因表达（PIAS1，SUMO2，IKK和HDAC4）。这些结果可能是出乎意料的，因为mTORC1通常被认为对自噬是抑制的。然而，最近的证据表明，自噬可以在mTOR刺激条件下发生（Narita等，2011），并且在长时间的饥饿条件下，mTOR的再活化促进溶酶体的形成，这是持续自噬所需要的（Yu等，2010） 。我们怀疑增强的基础或质量控制自噬是细胞生长和代谢活动的必要反应，不同于饥饿诱导的自噬，与mTORC1激活一致。虽然mTORC1诱导自噬的精确机制尚不清楚，但我们发现mTORC1增强增加beclin1水平，这是参与自噬囊泡成核的基本成分。有趣的是，beclin 1的过表达引起mHTT聚集体的自噬清除（Shoji-Kawata等，2013）。此外，我们发现mTORC1上调IKK的表达，IKK是促进mHTT降解的已知自噬诱导物（Thompson等，2009）。此外，刺激IGF1 / Akt信号转导，其进而激活mTORC1，诱导mHTT磷酸化并靶向mHTT降解（Humbert等，2002; Yamamoto等，2006）。总之数据显示，mHTT降解的不同机制是由mTORC1活性相互关联和控制的。

[0149] 提出了纹状体富集蛋白Rhes，通过促进mHTT的SUMO化引起纹状体变性; siRNA敲除SUMO1消除体外Rhes介导的细胞毒性（Subramaniam等，2009）。与Rhes的潜在毒性作用相反，我们发现Rhes添加改善了HD小鼠的神经病理学和运动表型，并且Rhes的这种神经保护性质需要其GTP酶活性。这与体外条件相反，其中Rhes的GTP酶活性不涉及mHTT介导的细胞毒性。引人关注的是，我们发现体内降低Rhes水平导致SUMO1在HD小鼠纹状体中的补偿性上调（数据未显示）。这与SUMO1和SUMO2修饰的蛋白质在HD死亡人脑中积累的观察一致（O'Rourke等，2013）。另外，过表达GTP酶缺陷但SUMO化完整的Rhes突变体不会加剧N171-82Q小鼠的运动表型，正如以前的体外结果（Subramaniam等人，2009）所预测的那样，这意味着MSN毒性的体内调节剂与在分离的培养体系中的不同。

[0150] 与Rhes的细胞保护作用一致，我们最近报道，Rhes的siRNA敲低会加剧转基因HD小鼠的纹状体萎缩和行为表型（Lee等，2014）。另一方面，其他工作表明，用R 6/1小鼠杂交Rhes KO小鼠延迟了旋转缺陷（Baiamonte等，2013）。然而，Rhes的遗传缺失不能阻止R6 / 1小鼠的纹状体萎缩；和Rhes KO小鼠表现出类似于HD小鼠的严重脑变性（Baiamonte等，2013）。此外，HD患者和HD小鼠模型纹状体中的Rhes水平降低，与未受影响的个体相比，症状性HD患者的纹状体Rhes显著降低83％（图7A）。最近，Rhes已经显示出促进自噬（Mealer等，
2014），并调节细胞内铁平衡（Choi等，2013）。因此，恢复而不是减少Rhes可能有益于HD脑。

[0151] 正常化mTORC1活性改善HD表型的发现可能对具有失控的mTOR活性的神经系统疾病具有广泛的治疗意义。例如，诸如脆性X智力迟钝和自闭症的神经发育障碍通常与极度活跃的mTORC1活性相关；在这些条件下抑制mTORC1可改善疾病表型（Bhattacharya等，2012; Tsai等，2012）。相比之下，在神经元mTORC1活性降低的肌萎缩性侧索硬化（ALS）的情况下，mTORC1的刺激抵消变性过程（Saxena等，2013）。因此，恢复mTORC1功能的稳态水平可能会大大有益于神经系统疾病。

[0152] 总之，我们的研究提供了对在HD中复杂病理表型的相互关联的新的洞察，其聚集在mTORC1途径上。并且，与其他神经变性疾病领域的先前工作一起，突出了观察到必须认真控制mTORC1激活的程度用于治疗效用。虽然降低脑中mHTT的表达将是在HD的情况中拯救mTORC1活性的直接途径，mTORC1活性的再平衡可能具有治疗益处。

[0153] 实验步骤动物。所有动物方案均由爱荷华大学动物保护和使用委员会批准。 N171-82Q小鼠获自Jackson Laboratories（Bar Harbor，ME），并保持在B6C3F1 / J背景上。使用特异于突变型人HTT转基因的引物对小鼠进行基因分型，并对所述实验使用半合子和年龄匹配的野生型同窝出生鼠。小鼠在12小时光照/黑暗循环的受控温度环境中饲养。食物和水随意提供。对于药理学研究，RAD001从LC实验室获得，在2％DMSO中稀释至2mg / ml，并储存在-20℃。如前所述，新鲜解冻的溶媒和RAD001（30μmol/ kg）通过管饲法每周（星期一，星期三和星期五）给予3次，进行两周（Fox等人，2010）。在最后一次给药后24小时处死小鼠。

[0154] 质粒和AAV本研究使用AAV载体血清型1（AAV2 / 1）。从小鼠纹状体cDNA文库扩增Rhes和Rheb cDNA序列。Flag表位通过PCR结合到3'末端用于蛋白质印迹检测。通过QuikChange定点诱变（Agilent Technology）产生GTP酶活性Rhes突变体（RhesS33N）和高活性Rheb突变体（caRheb; S16H）。基于QuikChange引物设计程序（http://www.stratagene.com）设计用于诱变的引物。 Rhes、RhesS33N和caRheb序列克隆到鸡β-肌动蛋白启动子控制下的AAV表达载体中。 AAV.Rhes和AAV.RhesS33N载体还在IRES序列的控制下表达增强的GFP（eGFP）。此外，从pCMVHD-N171-82Q质粒（Harper等人，2005）PCR扩增N末端myc标记的N171-82Q序列，并克隆到相同的AAV表达载体中以产生AAV.mHTT。所有AAV都是由爱荷华大学载体中心制作的。通过RT-PCR测定AAV滴度（Rhes：3×1012病毒基因组/ ml，RhesS33N：3×1012病毒基因
12 12
组/ ml，caRheb：3×10 病毒基因组/ ml，eGFP：3×10 病毒基因组/ ml，和mHTT（N171-
82Q）：3×1012病毒基因组/ ml）。

[0155] 注射用于纹状体的立体定位坐标为至前囟尖端0.86毫米，至中线横向±1.8毫米，至颅骨表面腹侧3.5毫米。7周龄的N171-82Q小鼠和WT同窝小鼠注射AAV.Rhes、AAV.RhesS33N或盐水。
对于所有行为研究，用5μl AAV双侧注射小鼠。对于单侧注射研究，使用5μl注射AAV。用于海马的立体定位坐标是相对于前囟，AP：-2.0mm，ML：+ 1.5mm，DV：-2.3mm;小鼠单侧注射1ul AAV。对于WT小鼠中安非他命诱导的旋转测试，将3μl AAV.mHTT与2μl AAV.caRheb或2μl AAV.eGFP共同注射到纹状体中。所有研究的注射速率为0.2μl/ min。使用标准批准的方法在指定的年龄处死小鼠（Harper等人，2005; McBride等，2008）。

[0156] 细胞培养和转染具有全长HTT的突变体（Q111）和WT（Q7）纹状体细胞（Trettel等，2000）由Marcy MacDonald博士友好提供。 Q7和Q111细胞在补充有10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺和400μg/ ml G418（Geneticin; Invitrogen，Carlsbad，CA）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM; Sigma Chemical Co，St.Louis，MO）中在37℃下生长。对于mTOR抑制研究，用DMSO或250nM Torin1（Tocris，Bristol，UK）处理细胞24小时。

[0157] 小鼠脑分离在组织学分析中使用的小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉，并用20ml的0.9％冷盐
水，然后用20ml的在0.1M PO4缓冲液中4％多聚甲醛经心脏灌注。取出脑并后固定过夜，收集40μm厚的切片。将用于分子分析的小鼠用20ml的0.9％冷盐水灌注，并将脑取出并成块为
1mm厚的冠状切片。通过使用组织取芯器（直径1.4mm）获得纹状体的组织冲孔。将组织冲孔在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至使用。

[0158] 免疫组织化学和定量使用生物素标记的抗体处理浮动的40μm冠状脑切片用于中间多刺神经元或mHTT聚集体的免疫组织化学染色。切片在5％正常山羊血清中封闭1小时，然后与一抗（DARPP-32,1：
200，Cell Signaling）孵育过夜并洗涤。 mHTT聚集体用em48抗体（1：200，mEM48;来自X.J.Li，Emory University School of Medicine的馈赠）免疫染色。用磷酸S6抗体（S235 / 
236,1：300，Cell Signaling）检测S6磷酸化。将切片在山羊抗兔或山羊抗小鼠生物素化IgG二抗（1：200; 载体实验室）中在室温下温育1小时，然后用抗生物素蛋白 - 生物素化的辣根过氧化物酶复合物（ABC; 载体实验室）进行处理。在所有程序中，一抗的缺失作为对照。
将染色切片安装在Superfrost Plus载玻片（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）上。使用Olympus BX60光学显微镜和具有Olympus DP控制器软件（Olympus，Melville，NY）的DP70相机捕获图像。对于每个脑，选择四个代表性切片，并且从每个半球在40x物镜下手动追踪70个DARPP-32阳性中间多刺神经元（MSN）的面积。 DARPP-32阳性MSN的区域由Olympus DP2-BSW软件（2.1版）定量。将同侧注射侧的平均MSN面积与对侧对照侧进行比较，并以平均值±SEM表示。通过对处理组盲法的实验者对EM48阳性内含物进行计数。

[0159] 体视以Cavalieri体积估计器，使用点计数方法计算纹状体积（Michel和Cruz-Orive，
1988）。简而言之，使用Olympus BX60光学显微镜和具有Olympus DP控制器软件（Olympus，Melville，NY）的DP70相机捕获DARPP-32染色的冠状切片（40μm厚）的图像。将具有网格图案的乙酸酯片材以随机角度放置在图像上，并计数覆盖纹状体的网格交叉点的数量。使用间隔480μm的连续切片的随机系统集合。至少有200个点被计入5个切片。通过使用公式Vol (object)= ΣP  (object) · t ·a(p)，在点计数的相同切片上独立确定左侧和右侧纹状体体积，其中ΣP  (object)=覆盖纹状体的点的总和， t =切片之间的距离，Ap =每点的面积。

[0160] 电子显微术将小鼠麻醉并用盐水溶液经心脏灌注，然后用在0.1M二甲胂酸纳缓冲液pH 7.4中的
2.5％戊二醛灌注。去除脑并在2.5％戊二醛，0.1M二甲胂酸钠缓冲液pH7.4中后固定24小时。用振动切片机切割100微米冠状切片，并在0.1M二甲胂酸盐中的1％OsO4中固定1小时，用1％乙酸双氧铀染色，脱水并包埋在Eponate 812中。在光学显微镜下检查半薄的1-μm甲苯胺蓝染色切片以识别纹状体。用JEOL EX 1200透射电子显微镜检查纹状体的超薄切片（80nm）。

[0161] 蛋白质印迹分析收获小鼠纹状体并在含有50mM Tris（pH 8.0）、150mM NaCl，1％NP450洗涤剂、0.1％SDS洗涤剂、0.5％脱氧胆酸和1mM β-巯基乙醇与蛋白酶抑制剂（Complete Mini， Roche Applied Science，Mannheim，Germany）和磷酸酶抑制剂（PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail，Roche Applied Science，Mannheim，Germany）的RIPA缓冲液中裂解。
将组织在冰上匀浆并以14000g离心20分钟。上清液用于分析。通过BCA测定（Pierce，Rockford，IL）测定蛋白质浓度，并将20-30μg蛋白质还原并通过SDS-PAGE在4％-10％丙烯酰胺凝胶上分离并转移至0.2μm Immobilon PVDF膜（Millipore，Billerica，MA）。使用的一抗如下：DARPP-32 (1:1000, Cell Signaling), β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich, 1:5000), S6 (1:1000, Cell Signaling), 磷酸-S6 (S235/236, 1:1000, Cell Signaling), 
4EBP1 (1:1000, Cell Signaling), 磷酸-4E-BP1 (T37/46, 1:1000, Cell Signaling), mTOR (1:1000, Cell Signaling), Rictor (1:1000, Cell Signaling), Raptor (1:
1000, Cell Signaling), CREB (1:1000, Cell Signaling), TORC1 (1:1000, Cell Signaling), PGC1-α (1:1000, abcam), LC3 (1:1000, Novus Biologicals)和Beclin1 (1:1000, Cell Signaling)。使用的二抗是HRP-山羊抗小鼠IgG和HRP-山羊抗兔IgG（Cell Signaling）。印迹使用ECL Plus Western Blotting Detection System（GE Healthcare，Pittsburg，PA）显色，然后曝光于胶片。使用NIH ImageJ软件或VersaDocTM成像系统（Biorad）和Quantity One R分析软件进行蛋白质定量。条带密度归一化为来自相同的样品和泳道的持家（β-肌动蛋白）条带。

[0162] 脑样品人尸检脑组织的冠状切片从未受影响的个体和Vansattel 2级、3级和4级HD患者获得（Dr. Christopher Ross, Johns Hopkins University; New York Brain Bank at Columbia University, Alzheimer Disease Research Center, Taub Institute）。组织被快速冷冻，死后间隔（PMI）范围为13至49小时。从置于冰冷金属台上的冷冻组织中切下尾状核/壳核，并用RIPA缓冲液与蛋白酶抑制剂（Complete Mini, Roche Applied Science, Mannheim, Germany）和磷酸酶抑制剂（PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail, Roche Applied Science, Mannheim, Germany）匀浆。裂解液以14000g离心20分钟。收集上清液进行蛋白质印迹分析。使用TRIzol处理另外的冷冻组织用于RNA提取。

[0163] 定量实时PCR（RT-qPCR）使用1ml TRIzol从纹状体冲孔中分离RNA。根据制造商的方案，使用500ng总RNA（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Applied Biosystems，Foster City，CA）进行随机引物的第一链互补DNA（cDNA）合成。使用SYBR green PCR mix（Invitrogen）或TaqMan 2x Universal Master Mix（Applied Biosystems）在序列检测系统（Prism 
7900HT，Applied Biosystems）上进行实时PCR。以下Taqman引物/探针组得自Applied Biosystem：Rhes（Mm04209172_m1和Hs04188091_mH），PGC1-α（Mm01208835_m1）和HMGCS1（Mm01304569_m1）和HDAC4（Mm01299557_m1）。 SYBR green RT PCR的引物序列可应要求提供。使用ΔΔCT方法测定相对基因表达，归一化至β-肌动蛋白。

[0164] 行为测试安非他明诱导的旋转测定
注射小鼠腹腔内安非他明（3mg / kg; Sigma），然后分别放置在方形塑料活动室（50×
50cm）的中心。在安非他明诱导前，允许小鼠在室内习惯20分钟。然后通过天花板安装的摄像机记录旋转行为40分钟。净旋转表示为在40分钟内的同侧转数 - 对侧转数。

[0165] 加速旋转在6周龄，然后在10、14和18周龄时测试雄性N171-82Q小鼠的基线运动功能。在每次测试之前，将小鼠首先习惯于旋转4分钟并静置1小时。测试每天进行三次试验（试验之间休息
30分钟），连续四天。对于每次试验，将小鼠放置在棒上，在4分钟内以4-40转/分钟的速度加速，然后将速度保持在40rpm。下落等待时间（或者如果小鼠悬挂连续两圈而不跑动），用作运动性能的评级。试验在300秒停止，并且此时保持旋转上的小鼠被记录为300秒。来自每天每组三次试验的数据以平均值±SEM表示。总是在光/暗周期的黑暗阶段测试小鼠。所有行为实验都是用对小鼠基因型和处理盲法的实验者进行的。

[0166] 统计分析数据使用Student's t检验或单向ANOVA分析，然后Tukey事后分析进行分析，来评估个体组之间的显著性差异。所有统计分析使用GraphPad Prism版本5.0c进行。数据表示为平均值±SEM。在所有情况下，P <0.05被认为是显著的。

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所有出版物、专利和专利申请通过引用结合到本文中。虽然在前述的说明书中已经关于其某些优选的实施方案描述了本发明，和许多细节都是为了说明目的而提出的，本领域技术人员显而易见的是，本发明易受到另外的实施方案的影响和本文描述的某些细节在不背离本发明的基本原则下可有相当的变化。

[0168] 在描述本发明的上下文中使用的术语“一”、“一个”、“该”和类似的指代被认为覆盖单数和复数二者，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放性术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外注明。本文叙述的值的范围仅仅打算用作分别地提及落入该范围内每个单独的值的缩写方法，除非本文另有指明，和每个单独的值结合到说明书中，如同它在本文被单独叙述一样。本文描述的所有方法可以任何合适的次序进行，除非本文另外指明或上下文另有明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言(如，“例如”)的使用，仅仅打算更好地阐明本发明并不构成对本发明范围的限制，除非另有要求。在本说明书中没有语言应被解释为指明任何非-要求的要素为实施本发明所必要的。

[0169] 本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人为实施本发明已知的最佳方式。那些实施方案的变化在本领域普通技术人员阅读前述说明书后可变得显而易见。本发明人期望技术人员在适宜时采用这样的变化，并且本发明人打算与本文特别描述的不同的方式实施本发明。因此，本发明包括在所附权利要求书中叙述的主题的所有适用法律允许的修饰和等价物。而且，本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化的任何组合，除非本文另外指明或上下文另有明显矛盾。