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一种深海细菌来源新型耐盐碱性酯酶及应用
申请号	CN201710668979.3	申请日	2017-08-08	公开(公告)号	CN107384891A	公开(公告)日	2017-11-24
申请人	国家海洋局第二海洋研究所;			发明人	霍颖异; 许学伟; 简书令; 吴月红; 王春生;
摘要	本发明公开了一种深海细菌来源新型耐盐碱性酯酶E84及其编码基因与应用。本发明涉及酯酶基因e84来自深海细菌Altererythrobacter atlanticus 26DY36T，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活为50U/mg。酯酶E84酯酶催化水解最适pH为9.5；在0.5mol/LNaCl中仍能保持70％以上活性；在添加有机溶剂甘油或去垢剂TritonX-100条件下，酶学活性增大。该酯酶具有耐盐和碱性的特征，可应用于手性药物合成、废水处理和洗涤工业等碱性含盐条件下的工业生产。
权利要求	1.一种具有酯酶活性的分离的多肽，其选自下组： (a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致； (b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少 90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。 2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的具有酯酶活性的多肽来源于细菌种属Altererythrobacter atlanticus。 3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述酯酶的催化中心为SEQ ID NO:2所示的234-238、348和443号氨基酸位置。 4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的突变体为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于5个氨基酸得到的突变体。 5.一种编码具有权利要求1所述多肽的多核苷酸，其选自下组： (a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致； (b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除700-714、1042-1044和1327- 1329位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。 6.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求5的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。 7.一种重组表达载体，其包含权利要求6的核酸构建体。 8.一种宿主，其由权利要求7所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。 9.一种产生权利要求1-4任一项所述多肽的方法，其包括： (a)、在有助于产生酯酶的条件下培养权利要求8所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID N0:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸； (b)、回收所述多肽。 10.权利要求1所述的酯酶或权利要求8所述的能表达酯酶的宿主菌在催化酯类水解中的应用。
说明书全文	一种深海细菌来源新型耐盐碱性酯酶及应用技术领域 [0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海细菌来源新型耐盐碱性酯酶、其编码基因及其应用。背景技术 [0002] 酯酶(EC 3.1.1.2)是一类能够将酯类化合物分解为酸和醇的水解酶类。酯酶因其广泛的底物谱、良好的有机溶剂耐受性和独特的手性选择性等特点，可广泛应用于食品、造纸、纺织、制药以及化妆品等工业生产领域。为了适应生产过程中的一些相对极端条件，例如高温、高盐、酸性、碱性或高浓度有机溶剂，寻找能够适应极端条件的新型酯酶已成为研究热点之一。 [0003] 深海是一个天然的微生物资源宝库，深海来源酯酶通常具有与环境相关的优良性质，例如热稳定、耐盐、耐碱、耐低温等，从海洋微生物中筛选具有独特性质的酯酶已成为开发新型工业用酶的一个重要方向。近年来，随着测序技术的快速发展，微生物全基因组测序已成为常规研究手段。基于全基因组测序信息，直接从基因组序列中筛选目的基因成为了获得新型酶资源的一种重要方法，称为“in silicon分析”。 [0004] 本发明从一种深海细菌中筛选到一种新型碱性酯酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有碱性、耐盐、耐金属离子、耐有机溶剂和去垢剂等特点，可用于精细化工、制药、洗涤和废水处理等工业领域。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供一种新的深海细菌来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。 [0006] 本发明涉及具有酯酶活性的分离的多肽，其选自下组： [0007] (a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致； [0008] (b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。 [0009] 本发明所述的具有酯酶活性的多肽，其来源于细菌种属Altererythrobacter atlanticus。细菌Altererythrobacter atlanticus26DY36T分离自大西洋深海沉积物，分类命名为Altererythrobacter atlanticus，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保T藏编号为CGMCC No.1.12411 ，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(100101)，保藏日期为2013年2月4日。该菌种于保藏之日起即向社会公众公开并不受限制使用。 [0010] 基于全基因组序列分析筛选从细菌Altererythrobacter atlanticus26DY36T获得酯酶基因e84，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。酯酶基因e84大小为1665bp，碱基组成为：322A(19.34％)、275T(16.52％)、525C(31.53％)和543G(32.61％)，编码蛋白大小为554个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该酯酶E84序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的是同属细菌Altererythrobacter sp.Root672中的假定蛋白，蛋白序列一致性为78％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_082553670)。系统发育分析结果表明，酯酶E84属于酯酶家族中的第VII家族。氨基酸序列分析结果显示，活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为234至238)，236位丝氨酸与348位谷氨酸和443位组氨酸共同构成酯酶催化中心。综上所述，E84应为酯酶家族中的一名新成员。 [0011] 在不影响酯酶E84蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到突变体。如前所述，本发明所述的酯酶E84的催化中心为SEQ ID NO:2所示的234-238、348和443氨基酸位置。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域如234-238、348和443氨基酸位置的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶E84突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留原蛋白质E84酯酶的生物学功能，优选该突变体具有至少90％以上的酯酶活性，更优选具有至少95％以上的酯酶活性，更优选具有至少99％以上的酯酶活性。 [0012] 本发明涉及SEQ ID N0:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，更优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill,1979于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。 [0013] 可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5,223,409； WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；1988,DNA7:127)。 [0014] 本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有酯酶活性的酯酶e84的核苷酸序列，或由编码本发明具有酯酶E84活性的突变体的核苷酸序列组成。 [0015] 本发明涉及编码具有酯酶E84活性的分离的多核苷酸，其选自下组： [0016] (a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致； [0017] (b)多核苷酸，其为编码SEQ ID NO:1所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体的多核苷酸，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。本发明还提供了编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酯酶基因e84，其与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致。酯酶基因e84大小为1665bp，碱基组成为：322A(19.34％)、275T(16.52％)、525C(31.53％)和543G(32.61％)。本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除700-714、1042-1044和1327-1329位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶E84蛋白生物学活性的突变体基因。优选的酯酶E84突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。 [0018] 本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明酯酶的分离的多核苷酸以提供酯酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，并插入到表达载体中，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。 [0019] 利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶e84基因连接到合适的载体上。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体和pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D2、pPIC9、pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。 [0020] 本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于酯酶的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的酯酶的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶e84基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶E84。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达生产酯酶。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因e84连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酯酶。， [0021] 本发明还涉及用于产生本发明所述酯酶的方法，其包括：(a)在有助于产生酯酶的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID N0:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸，和(b)回收所述多肽。 [0022] 在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述酯酶的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酯酶的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。 [0023] 所得酯酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。 [0024] 本发明还提供了酯酶E84或能表达酯酶E84的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯酶E84或上述能表达E84酯酶的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C8短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚癸酸酯等，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活为50U/mg。 [0025] E84酯酶催化水解温度范围为20～50℃，优选为35℃；所述水解的pH值为5.0～10.0，优选为9.5。在添加EDTA、Ba2+、Ca2+、Mg2+和Sr2+条件下，对酶活影响不大；在添加有机溶剂甘油和去垢剂TritonX-100条件下，酶学活性增大；在0.5mol/L NaCl中仍能保持70％以上活性。 [0026] 本发明从深海沉积物来源细菌Altererythrobacter atlanticus26DY36T中筛选获得新的耐盐碱性酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产耐盐碱性酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的耐盐碱性酯酶起始材料。该酶的生产可在食品加工、洗涤剂和废水处理等碱性或含盐生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。附图说明 [0027] 图1为纯化酯酶E84的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。 [0028] 图2为酯酶E84的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12：对硝基苯酚十二酸酯；C14：对硝基苯酚十四酸酯；C16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为C6时测定值为100％。 [0029] 图3为酯酶E84最适反应温度图。 [0030] 图4为酯酶E84最适反应pH图。 [0031] 图5为二价阳离子对酯酶E84活性影响图。 [0032] 图6为有机溶剂和去垢剂对酯酶E84活性影响图。 [0033] 图7为NaCl对酯酶E84活性影响图。具体实施方式 [0034] 实施例1酯酶基因e84的获取 [0035] 基于深海沉积物来源细菌Altererythrobacter atlanticus 26DY36T全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知酯酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得e84基因，大小为1665bp，碱基组成为322A(19.34％)、275T(16.52％)、525C(31.53％)和543G(32.61％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为554个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的是同属细菌Altererythrobacter sp.Root672中的假定蛋白，序列一致性为78％，其在GenBank数据库中的注册号为WP_082553670。 [0036] 氨基酸序列分析结果显示，酯酶E84活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为234至238)，236位丝氨酸与348位谷氨酸和443位组氨酸共同构成酯酶催化中心。系统发育分析结果表明E84属于酯酶第VII家族。 [0037] 综上所述，E84应为酯酶家族中的一名新成员。 [0038] 实施例2酯酶基因e84的重组表达质粒和重组菌株的构建 [0039] 将本发明获得的酯酶基因e84克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI ORF Finder的ORF分析获得的酯酶基因的开放阅读框序列，设计扩增酯酶全基因的上游引物E84F(5’-TCGCGGATCCATGCTGAAAGCTTCCACCATTCG-3’，BamHI)和下游引物E84R(5’-ATTTGCGGCCGCTTATTCGCCGGAATCGATC-3’，NotI)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和NotI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和NotI双酶切的质粒pET28a连接，采用CaCl2转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取阳性克隆的质粒，经BamHI和NotI双酶切鉴定，获得1700bp左右的DNA片段，经测序鉴定为酯酶基因e84。将重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株。 [0040] 实施例3利用重组表达菌株表达重组酯酶基因e84 [0041] 将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有20μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，转入20℃以150r/min振荡培养16h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM 氯化钠，10mM咪唑， 20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni2+亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测，得到电泳纯的重组酯酶蛋白E84，分子量约60kDa(图1)。用Lowry法测定蛋白质浓度，得到约0.4mg/100ml发酵液的表达量。 [0042] 实施例4重组酯酶E84的活性检测 [0043] 利用对硝基苯酚已酸酯法测定纯化的重组酯酶E84活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)和0.85ng纯酶蛋白(为10μl经稀释的纯化酶液)，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于35℃条件下连续测定吸光值A405 2min，使用高温失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为50U/mg。 [0044] 实施例5酯酶E84底物特异性分析 [0045] 酯酶E84的底物特异性分析采用体系：100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)，1mM底物，加入0.85ng纯酶蛋白，在35℃下连续测定吸光值A405 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，酯酶E84对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C2、C4、C6和C8)具有催化活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，对硝基苯酚癸酸酯(C10)、对硝基苯酚十四酸酯(C12)、对硝基苯酚十四酸酯(C14)和对硝基苯酚十六酸酯(C16)为底物时无催化活性(图2)。结果表明，酯酶E84对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。 [0046] 实施例6酯酶E84最适反应条件分析 [0047] 酯酶E84最适反应温度在20～60℃范围内测定。具体操作为：100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)，1mM对硝基苯酚己酸酯，加入0.85ng纯酶蛋白，分别在20、25、30、35、40、45、50、55和60℃条件下连续测定吸光值A405 2min。测定结果表明E84的反应温度范围为20～50℃，最适反应温度为35℃(图3)。 [0048] 酯酶E84最适反应pH在3.0～10.5范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚己酸酯和0.85ng纯酶蛋白，在35℃下连续测定吸光值A348 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～7.5)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.5)。测定结果表明，酯酶E84在pH 5.0～10.0范围内具有活性，最适反应pH为9.5，在pH 6.5～10.0范围内活性较高，说明E84具有碱性特征(图4)。 [0049] 实施例7酯酶E84酶学稳定性分析 [0050] 二价阳离子和金属螯合剂对酯酶E84活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Sr2+、Zn2+和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚己酸酯，0.85ng纯酶蛋白，于35℃下连续测定吸光值A405 2min。测定结果表明，酯酶E84活性会被Cu2+完全抑制，Co2+、Ni2+和Zn2+对E84抑制作用较大，在EDTA、Ba2+、Ca2+、Mg2+和Sr2+存在下对酶活影响不大(图5)。 [0051] 有机溶剂和去垢剂对酯酶E84活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂：丙酮(Acetone)、乙腈(Acetonitrile)、乙醇(Alcohol)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、异丙醇(Isopropanol)和甲醇(Methanol)或1％去垢剂(w/v或v/v)：SDS、吐温20(Tween 20)、吐温80(Tween80)和Triton X-100，测定酶的活性。测活体系为：100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)，1mM对硝基苯酚己酸酯，0.85ng纯酶蛋白，于35℃下连续测定吸光值A405 2min。测定结果表明，丙酮、乙腈、乙醇、二甲基甲酰胺、异丙醇和SDS对酯酶E84活性的抑制作用较强，E84在甲醇、吐温20和吐温80中可保留50％以上活性，而甘油和TritonX-100可增强其活性(图6)。 [0052] NaCl对酯酶E84活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入0、0.5、1、2、3、4和5mol/L NaCl，测定酶的活性。测活体系为：100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5)，1mM对硝基苯酚己酸酯，0.85ng纯酶蛋白，于35℃下连续测定吸光值A405 2min。结果表明，在0.5mol/L和1mol/L NaCl条件下，E84仍能保留70％和40％以上活性，说明E84具有较好的耐盐特性(图7)。 [0053] [0054] [0055]

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