一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201710601630.8 | 申请日 | 2017-07-21 | 公开(公告)号 | CN107298716A | 公开(公告)日 | 2017-10-27 |
| 申请人 | 成都亿妙生物科技有限公司; | 发明人 | 刘开云; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种重组幽 门 螺杆菌蛋白 疫苗 及其制备方法，所述疫苗的活性成分重组融合蛋白是由重组LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白构成，所述重组LTA1-UreA1蛋白的 氨 基酸序列如Seq ID No.1所示，所述LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。本发明将Hp尿素酶A亚单位富含 抗原 表位的基因 片段 插入编码LTA亚单位的基因的中，并替换其包含毒性部位的片段制成重组质粒，进行表达获取重组融合蛋白多聚体作为疫苗抗原，本发明融合抗原与LTB蛋白五聚体结合形成六聚体结构，既保留了LT的粘膜佐剂结构 基础 及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导 机体 粘膜免疫应答，产生特异性IgA 抗体 ，提供了一种用于 预防 和 治疗 幽门螺杆菌感染的疫苗方式。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白是由重组LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白构成，所述重组LTA1-UreA1蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。 |
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| 说明书全文 | 一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法技术领域背景技术[0002] 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种螺旋状、微需氧革兰阴性杆菌，主要定植于人胃粘膜，已造成全球50％以上人口感染(Lee A.Prevention of Helicobacter pylori infection.Scand-J-Gastroenterol.1996.Suppl 215:11-15.)。Hp感染是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，并与胃癌的发生密切相关，已被WHO列为Ⅰ类致癌因子。目前质子泵抑制剂加两种抗生素的三联疗法是全球推荐的Hp根除治疗一线方案，但是随着抗生素在Hp感染治疗中的广泛应用，Hp耐药株的发生率不断上升，以致Hp根除的难度加大。由于Hp在胃内栖居部位的特殊性，以及现在药物治疗的不足，单纯依靠药物根除Hp并不是一件易事，对Hp感染所致的胃、十二指肠疾病的防治难度仍很大，必须寻找新的有效方法进行防治。借鉴人类与传染病作斗争的经验，接种疫苗有望成为预防Hp感染、大幅度降低Hp相关性疾病发病率的最佳途径。 [0003] 目前，Hp疫苗取得了极大的进展，我国已成功研制出一种Hp疫苗并获得新药证书，国外也有多种Hp疫苗已进入临床实验。所有的研究都表明，Hp疫苗需要添加粘膜免疫佐剂，才具有免疫保护效果。目前公认的最强的粘膜免疫佐剂是霍乱肠毒素(CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)，但是CT和LT对人具有较强的毒性，限制了它们的应用。在粘膜疫苗研究中，作为佐剂的LT无毒或减毒突变体研究较多[Park EJ,Chang0JH,Kim JS,et al.The mucosal adjuvanticity oftwo nontoxic mutants ofEscherichia coli heat-labile enterotoxin varies with immunization routes.Exp.Mol.Med.,2000,32(2):72-78]，其基本原理是对LT具有肠毒素毒性的A亚单位进行氨基酸点突变，使LT不具有毒性或降低毒性，但是仍保留其很强的粘膜佐剂活性。 发明内容[0004] 综上所述，本发明目的在于提供一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，将Hp尿素酶A亚单位富含抗原表位的基因片段插入编码LT A亚单位的基因中，并替换其包含毒性部位的片段制成重组质粒，进行表达获取重组融合蛋白多聚体作为疫苗抗原，本发明融合抗原与LTB蛋白五聚体结合形成六聚体结构，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，提供了一种用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式。 [0005] 本发明通过下述技术方案实现： [0006] 一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白是由重组LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白构成，所述重组LTA1-UreA1蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。 [0007] 进一步地，所述重组融合蛋白是由重组LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白五聚体通过LTA2亚单位连接构成的六聚体结构。 [0008] 一种编码上述重组融合蛋白的基因，所述基因是由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)的尿素酶A亚单位中富含抗原表位的基因片段插入大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因中并替换A亚单位毒性基因片段制成。 [0009] 进一步地，所述编码重组融合蛋白基因的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述编码重组融合蛋白基因用于编码重组LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白。 [0010] 一种重组质粒，所述重组质粒包括表达载体和外源基因，所述外源基因如Seq ID No.3所示。所述表达载体可采用现有基因工程常用表达质粒作为表达载体。 [0011] 进一步地，所述表达载体为pET-11c。 [0012] 一种制备上述重组融合蛋白的方法，包括以下步骤： [0013] 步骤A，将大肠杆菌不耐热肠毒素基因中A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp去除以形成基础基因，并将幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段插入所述基础基因获得了lt-ureA1融合基因序列； [0014] 步骤B，将所述lt-ureA1融合基因序列与质粒表达载体pET-11c连接，获得重组质粒pET-11c/lt-ureA1； [0015] 步骤C，将所述组质粒pET-11c/lt-ureA1转入宿主菌进行表达获取重组融合蛋白。 [0016] 一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述重组融合蛋白。 [0017] D-半乳糖填料(Thermo，20372)仅能与LTB五聚体结合，不能与LTA1-UreA1蛋白结合。如果LTA1-UreA1蛋白与LTB蛋白五聚体解离，则纯化产物中就不含有LTA1-UreA1蛋白。而采用D-半乳糖填料纯化获得的产物，电泳可见LTA1-UreA1蛋白条带。这一结果，间接证实了LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白五聚体结合形成六聚体。 [0018] 本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果： [0019] 本发明一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，将候选抗原尿素酶A亚单位中富含抗原表位的片段插入LT的A亚单位片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，通过LTA2片段与LTB蛋白五聚体连接，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，无需添加佐剂即可获得较高的免疫效果，提供了一种用于预防和治疗治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式，具有重要的社会价值和经济价值。附图说明 [0021] 图1为本发明重组质粒pET-11c/lt-ureA1的构建示意图； [0022] 图2为本发明重组质粒酶切鉴定结果； [0023] 图3为本发明SDS-PAGE观察目的蛋白表达鉴定结果； [0024] 图4为本发明蛋白纯化鉴定结果； [0025] 图5为对比例重组质粒pET-22b/ureA-1构建示意图； [0026] 图6为对比例UreA-1蛋白表达鉴定结果； [0027] 图7为对比例UreA-1蛋白纯化鉴定结果； [0028] 图8为唾液特异性IgA检测结果； [0029] 图9为血清特异性IgG检测结果。 具体实施方式[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。 [0031] 实施例1 [0032] 合成基因： [0033] 以GenBank公布的大肠杆菌不耐热肠毒素基因(GenBank:AB011677.1)核酸序列为模板进行改造，具体设计如下： [0034] 编码LT的基因全长1148bp，包括：LTA信号肽(18个氨基酸)基因、编码LTA(240个氨基酸)的基因、编码LTB信号肽(21个氨基酸)基因及编码LTB(103个氨基酸)的基因。在编码LTA的基因末尾与编码LTB信号肽基因开头处有一个移码阅读框，因而编码整个LT的基因是一个连续的DNA序列。其完整基因核苷酸序列如Seq ID No.4所示。 [0035] 经生物信息学分析及结构分析，去除LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp，将幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA1插入其中以替换去除的LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp，并在5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入BamHI酶切位点，形成编码重组融合蛋白的融合基因lt-ureA1，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。 [0036] 所述幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA1核苷酸序列如Seq ID No.5所示。合成基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 [0037] 实施例2 [0038] 重组质粒pET-11c/lt-ureA1的构建，如图1所示： [0039] 表达载体采用pET-11c，购于Novagen公司。该表达载体携带氨苄抗性基因，是化学物质IPTG诱导控制的模式，表达水平高。未诱导前IacIq编码阻遏蛋白，该蛋白可同操纵子中的操纵基因相结合，从而控制相邻结构基因的转录作用；当诱导物存在时，阻遏蛋白因受诱导物的作用，其构形发生变化，从而失去同操纵基因的亲和性而解脱下来，聚合酶便可对结构基因进行转录，进而进行表达。在该质粒NdeI位点后插入含有LTA信号肽的重组目的基因及含有LTB信号肽的ltB基因，pET-11c能在宿主菌中共表达重组目的蛋白LTA1-UreA1及LTB蛋白，利用LTA及LTB信号肽，分别将目的蛋白LTA1-UreA1蛋白和LTB蛋白分泌至胞周质组装成LTA1-UreA1+5LTB的六聚体而发挥相应的靶向和佐剂作用。编码蛋白LTA1-UreA1蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，编码LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。 [0040] 将合成基因序列，上游引入NdeI、下游引入BamH I酶切位点，双酶切后连接经同样酶双酶切的pET-11c，酶切反应体系配制如表1所示： [0041] 表1重组质粒构建酶切反应体系 [0042] [0043] 将上述反应物混匀，酶切，经琼脂糖凝胶电泳观察，酶切鉴定结果如图2所示。 [0044] 转化E.coli/DH5a感受态，氨苄抗性LB平板37℃培养，调取单菌落用氨苄抗性液体LB培养基培养，提取重组质粒测序鉴定，质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，融合基因序列与预计完全一致。 [0045] 实施例3 [0046] 目的蛋白表达、纯化及鉴定： [0047] 宿主菌采用E.coli/BL21(DE3)，购于天根生化科技(北京)有限公司。基因型：F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 [0048] (1)转化 [0050] (2)重组工程菌鉴定 [0051] 挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，接种10ml氨苄抗性LB液体培养基中培养，抽提质粒，用NdeI和BamHI做双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，见5.6kb表达载体片段和996bp lt-ureA1基因片段，Lane1：pET-11c/lt-ureA1经NdeI和BamHI双酶产物，Lane2：核酸Marker(TaKaRa，DL5000)。 [0052] (3)表达鉴定 [0053] (a)取鉴定正确的菌液，加入氨苄抗性LB培养基中，37℃，振荡培养；然后加入M IPTG，16℃诱导表达。 [0055] (c)SDS-PAGE观察目的蛋白表达情况： [0056] 分别取破菌未离心样品(全菌)、离心后上清及沉淀样品，调整至适合的浓度，以LT及未诱导全菌样品作对照，用5×SDS-PAGE上样buffer处理后，各15μl上样，进行15％SDS-PAGE电泳观察结果，如图3所示。Lane 1：16诱导前全菌，Lane 2：16诱导后全菌，Lane 3：16诱导后超声上清，Lane 4：蛋白Marker(Thermo，26616)，Lane 5：16诱导后超声沉淀。见21.1kd重组LTA1-UreA1表达及11.7kdltB表达，如图中箭头所指。 [0057] (4)目的蛋白纯化鉴定 [0058] (a)取D-半乳糖填料(Thermo，20372)1ml，按说明书操作，用PBS洗涤，将诱导表达的菌体超声破菌上清10ml加入层析柱中，室温结合1h。 [0059] (b)用PBS洗涤，用含300mM D-半乳糖的PBS洗脱，分管收集。 [0060] (c)SDS-PAGE观察目的蛋白表达情况：取15μl样品上样，进行15％SDS-PAGE电泳观察结果，如图4所示，Lane 1：蛋白Marker(Thermo，26616)，Lane 2-5：纯化样品，见21.1kd LTA1-UreA1及11.7kd ltB条带。 [0061] 对比例 [0062] UreA-1蛋白的制备，所述UreA-1蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.6所示： [0063] 1、pET-22b/ureA-1重组质粒获得 [0064] 采用幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA1编码UreA1，所述幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA1核苷酸序列如Seq ID No.5所示，上游引入NdeI、下游引入Xho I酶切位点，插入pET-22b(+)中构建重组质粒，pET-22b(+)购自Novagen(69744-3)。重组质粒构建结构示意图如图5所示。 [0065] 2、UreA-1的蛋白表达 [0066] (1)表达 [0067] 取pET-22b/ureA-1质粒转化E.coli/BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，Code：CB105)，按操作说明书进行，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，接种10ml氨苄抗性LB液体培养基中培养，抽提质粒，用NdeI和BamHI做双酶切鉴定。取鉴定正确的菌液，接种氨苄抗性的LB培养基中，振荡培养。加入IPTG，37℃诱导表达。 [0068] 3、UreA-1的蛋白鉴定 [0069] (1)细菌破碎 [0070] 将诱导表达后的菌液取出，离心处理，弃上清，加入A液重悬(A液：50mM PB(pH7.4)+300mM NaCl+50mM imidazole)，冰水浴超声破菌。取样涂片革兰染色镜检，见破菌完全后，离心处理，分离上清和沉淀。 [0071] (2)纯化 [0072] 用镍离子亲和柱纯化破菌上清(HisTrapTM FF，GE)，A液：50mM PB(pH7.4)+300mM NaCl+50mM imidazole，B液：50mM PB(pH7.4)+300mM NaCl+200m M imidazole。分管收集纯化样品。 [0073] (3)SDS-PAGE观察目的蛋白表达情况 [0074] 分别取破菌未离心样品(全菌)、离心后上清及沉淀样品，调整至适合的浓度，以LT及未诱导全菌样品作对照，用5×SDS-PAGE上样buffer处理后，各15μl上样，进行15％SDS-PAGE电泳观察结果，UreA-1表达如图6所示，Lane 1：诱导前全菌，Lane 2：诱导后超声沉淀，Lane 3：诱导后超声上清，Lane 4：诱导后全菌，见蛋白表达(箭头所示)。UreA-1纯化和如图7所示，Lane 1-4：UreA-1纯化样品，Lane 5：蛋白Marker(Thermo，26616)，纯化获得12.6kd蛋白。 [0075] 免疫性能测试： [0076] (一)、免疫原性检测 [0077] 以纯化实施例1制备的重组蛋为免疫原，分别通过注射(50μg)和灌胃(200μg)方式免疫小鼠，检测血清、唾液特异性抗体，以鉴定重组蛋白的免疫原性。 [0078] 1、实验动物：BALB/c小鼠，6～8周龄，雌性，SPF级，60只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。 [0079] 2、动物分组，如表1所示： [0080] 表1实施例制备的重组融合蛋白A1和对比例制备的UreA-1蛋白免疫原性检测动物分组 [0081]分组 动物数(只) 抗原及免疫剂量 免疫方式 1组 10 A1 50μg/只 注射 2组 10 A1 200μg/只 灌胃 3组 10 UreA-1 50μg/只 注射 4组 10 UreA-1 200μg/只 灌胃 5组 10 PBS 注射 6组 10 PBS 灌胃 [0082] 注：本发明制备的重组融合蛋白命名为A1。 [0083] 3、免疫方案 [0084] 动物分别于0、7、14天免疫，共3次。 [0085] 4、特异性抗体检测 [0086] 免疫后21天，采集血液和唾液标本，ELISA检测抗原特异性血清IgG及唾液sIgA。每个样品做双重复。 [0087] (1)酶标板包被 [0089] (2)标本稀释：以抗体稀释液按1：1000稀释血清；1：5稀释唾液。 [0090] (3)加样：按100μl/孔向酶标板加入稀释后的待检测样品，37℃放置60min，PBST洗涤4次，拍干。 [0091] (4)抗体稀释：以抗体稀释液按1：10000分别稀释辣根酶标记羊抗小鼠IgG及辣根酶标记羊抗小鼠IgA。 [0092] (5)加二抗：按100μl/孔向酶标板加入抗体，37℃放置40min，PBST洗涤4次，拍干； [0093] (6)显色：向各孔加入100μl显色液，37℃显色10min，50μl/孔加入2M H2SO4终止反应。 [0094] (7)结果记录：测定450nm各孔吸光度值，保存数据。 [0095] 测定结果如图8和图9所示，经统计学分析(t检验)，A1蛋白免疫组与UreA1蛋白免疫组及PBS组比较，A1蛋白免疫组唾液抗原特异性sIgA水平显著升高(P<0.01)，血清抗原特异性IgG水平也显著升高(P<0.01)。UreA1蛋白免疫组与PBS组比较，唾液抗原特异性sIgA及血清抗原特异性IgG水平均无显著性差异(P>0.05)。口服免疫A1蛋白有利于唾液抗原特异性sIgA水平升高(2组与1组比较，P<0.01)，注射免疫A1蛋白有利于血清抗原特异性IgG水平升高(1组与2组比较，P<0.01)。 [0096] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
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