香菇发酵生产纤维素酶的方法及所产纤维素酶的应用 |
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| 申请号 | CN201710363342.3 | 申请日 | 2017-05-22 | 公开(公告)号 | CN107245482A | 公开(公告)日 | 2017-10-13 |
| 申请人 | 河池学院; | 发明人 | 何海燕; 覃拥灵; 姚东梅; 卢福芝; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种香菇 发酵 生产 纤维 素酶的方法，涉及 生物 技术领域，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养12‑16 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入60‑90 mL液体培养基，置于24‑32℃、100‑160 r/min的摇床条件下发酵培养96‑192 h。本发明培养基以及补料的组分、浓度等配置合理、互相配合，通过合理的组分和浓度，即对香菇 纤维素 酶基因的表达促进，又对香菇纤维素酶的产生实行诱导，还不会因组分、浓度不合理而造成酶活的抑制，从而实现高效生产纤维素酶的目的。本发明还提供香菇发酵生产的纤维素酶在降解草本或木本 植物 中的纤维物质的应用，为降解草本或木本植物中的纤维物质提供了一种新的方式。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养12-16 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入60-90 mL液体培养基，置于24-32℃、100-160 r/min的摇床条件下发酵培养96-192 h。 |
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| 说明书全文 | 香菇发酵生产纤维素酶的方法及所产纤维素酶的应用技术领域背景技术[0002] 纤维素酶在蜗牛的消化道中被科学家发现以后，纤维素在微生物降解的问题上就受到世界科学家们较大的关注。美军的Natick实验室随后就已经研究了有关微生物降解在军用纤维素材料方面的防护问题，在后来研究中发现纤维素除了能够被微生物降解以外，生产出来的生产原料也十分丰富经济，自然界中不断产生的固体废物问题也有望能够得到解决。在此以后，纤维素酶得到了更为广泛的关注。纤维素在地球上分布最广，也是含量最丰富的碳水化合物，且植物总干重的35％-50％都是纤维素。对人类来说，纤维素更是自然界中数量最为庞大的可再生性物质，自然界的碳素循环机制中必不可少的中心环节就是它的降解过程。充分利用纤维素与它的转化条件对于解决目前世界性重大问题如世界粮食短缺、能源危机、环境污染等上具有十分重要的意义。纤维素酶在食品加工、化工生产、医药保健、酿造行业、饲料生产、农副产品深加工、环境保护等领域有着非常广阔的应用前景和十分深厚的潜力。然而，纤维素酶存在产生菌的产酶能力低，而且所产生的酶的组分不完整或不平衡等问题，纤维素酶作用的机制至今尚未被研究得完全清楚的重要原因，也是实际的应用和研究存在距离较大的最为主要的原因。 [0003] 香菇在伞菌目中属于口蘑科，是一种既能药用，也受民众喜爱的一类食用菌，成为世界上第二大食用菌。在民间，香菇在烹饪时味道非常鲜美，肉质肥厚，香气沁人心脾，营养含量又极其丰富，被人们称誉为“山珍”，更享有“植物皇后”美誉。目前，中国在香菇生产上一年的产量可达8万吨，在世界总年产量中占有80%以上的比例，高居于世界第一位，出口量达到3.6万吨，也居于世界的首位。在香菇栽培中，锯末、秸秆等这类富含纤维素、半纤维素、木质素的物质是碳源的主要来源。香菇拥有将这些大的分子物质分解成小分子物质从而能够被利用的胞外酶，这说明纤维素酶系在香菇中有十分丰富的含量。目前研究香菇产多糖的居多，而对香菇发酵产纤维素酶的研究却很少见，这方面的空白如果得不到填补将是极大的浪费。 发明内容[0004] 针对以上不足，本发明的目的是提供一种高效的香菇发酵生产纤维素酶的方法。 [0005] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养12-16 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入60-90 mL液体培养基，置于24-32℃、100-160 r/min的摇床条件下发酵培养96-192 h。 [0006] 在上述技术方案的基础上，本发明还有进一步的优化和改进。 [0008] 进一步地，所述PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0009] 进一步地，所述液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0010] 进一步地，在加入所述液体培养基时，还同时加入培养氮源或培养碳源；所述培养氮源为酵母膏、牛肉膏、玉米面、(NH4)2SO4中的一种，且所加入的所述培养氮源的量为4-6g/L；所述培养碳源为蔗糖、葡萄糖、羧甲基纤维素、甘蔗渣、淀粉中的一种，且所加入的所述培养碳源的量为18-25g/L。 [0011] 进一步地，所述菌片的数量为3-5片。 [0012] 进一步地，所述香菇菌种在所述PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为3-8 min。 [0013] 进一步地，所述发酵培养时间为144 h。 [0014] 进一步地，所述摇床转速为120 r/min。 [0015] 本发明的另一个目的是提供香菇发酵生产的纤维素酶在降解草本或木本植物中的纤维物质的应用。 本发明公开的香菇发酵生产纤维素酶的方法所生产的纤维素酶可以有效应用于降解草本或木本植物中的纤维物质，提高草本或木本植物中的纤维物质的降解效率。 [0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，通过新的培养基以及补料的组分、浓度等，来提高香菇发酵生产纤维素酶的水平，从而提高纤维素酶的产量。新的培养基以及补料的组分、浓度等配置合理、互相配合，通过合理的组分和浓度，即对香菇纤维素酶基因的表达促进，又对香菇纤维素酶的产生实行诱导，还不会因组分、浓度不合理而造成酶活的抑制，从而实现高效生产纤维素酶的目的。本发明还提供香菇发酵生产的纤维素酶在降解草本或木本植物中的纤维物质的应用，为降解草本或木本植物中的纤维物质提供了一种新的方式。 具体实施方式[0017] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0018] 实施例1本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养14 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到75 mL液体培养基中，菌片为4片，置于28 ℃、120 r/min的摇床条件下发酵培养144 h。 [0019] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0020] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0021] 实施例2本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养12 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到60 mL液体培养基中，菌片为3片，置于24 ℃、100 r/min的摇床条件下发酵培养96 h。 [0022] 在加入液体培养基时，还同时加入培养碳源，培养碳源为蔗糖，加入的蔗糖的量为18g/L。 [0023] 香菇菌种在PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为3 min。 [0024] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0025] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0026] 实施例3本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养16 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到90 mL液体培养基中，菌片为5片，置于32 ℃、160 r/min的摇床条件下发酵培养192 h。 [0027] 在加入液体培养基时，还同时加入培养碳源，培养碳源为葡萄糖，加入的葡萄糖的量为25g/L。 [0028] 香菇菌种在PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为8 min。 [0029] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0030] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0031] 实施例4本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养15 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到75 mL液体培养基中，菌片为4片，置于28 ℃、120 r/min的摇床条件下发酵培养144 h。 [0032] 在加入液体培养基时，还同时加入培养碳源，培养碳源为羧甲基纤维素，加入的羧甲基纤维素的量为20g/L。 [0033] 香菇菌种在PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为5 min。 [0034] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0035] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0036] 实施例5本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养14 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到60 mL液体培养基中，菌片为3片，置于24 ℃、100 r/min的摇床条件下发酵培养96 h。 [0037] 在加入液体培养基时，还同时加入培养氮源，培养氮源为酵母膏，加入的酵母膏的量为18g/L。 [0038] 香菇菌种在PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为3 min。 [0039] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0040] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0041] 实施例6本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养12 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到90 mL液体培养基中，菌片为5片，置于32 ℃、150 r/min的摇床条件下发酵培养192 h。 [0042] 在加入液体培养基时，还同时加入培养氮源，培养氮源为牛肉膏，加入的牛肉膏的量为25g/L。 [0043] 香菇菌种在PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为8 min。 [0044] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0045] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0046] 实施例7本实施例提供一种香菇发酵生产纤维素酶的方法，在PDA培养基上接种香菇菌种进行培养15 d，用无菌打孔器打孔成10 mm的菌片后加入到75 mL液体培养基中，菌片为4片，置于28 ℃、120 r/min的摇床条件下发酵培养144 h。 [0047] 在加入液体培养基时，还同时加入培养氮源，培养氮源为玉米面，加入的玉米面的量为20g/L。 [0048] 香菇菌种在PDA培养基上培养时，置于15 W、25 cm的紫外灯条件下进行诱变处理，处理时间为5 min。 [0049] 其中，PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、琼脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，进行倒平板操作。 [0050] 其中，液体培养基的制备方法为：取马铃薯200 g，去皮、切块，加水1000 mL，煮沸，纱布过滤；分别加入蔗糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 0.01 g，加热溶化；pH自然；置于121 ℃灭菌锅中灭菌20 min，装于锥形瓶中。 [0051] 在进行完香菇发酵培养纤维素酶后，对产酶效率进行测定。 [0052] 香菇发酵培养纤维素酶后获得发酵液，发酵液经4层纱布过滤，再经过离心机3000 r/min转速离心15 min后，取溶液的上清液，为粗酶液，此时粗酶液即为纤维素酶液。取已离心的粗酶液置于沸水浴中持续灭活10 min，待用。 [0053] 将灭活后的粗酶液适当稀释后取0.5 mL，加入2.0 mL 底物（底物指将0.6g的羧甲基纤维素钠溶于100 mL、pH 值4. 8的柠檬酸缓冲溶液的所得物中，振荡混匀，于60 ℃条件下，持续保温30 min后，加入2.5 mL 的3，5-二硝基水杨酸溶液后，置沸水浴中5 min后，马上用自来水冷却。在iMark酶标仪上测出540 nm的吸光值，对照葡萄糖的标准曲线，计算出酶的活力。 [0054] 对实施例1 7的技术方案所获纤维素酶液进行酶活计算，计算结果见下表。~ 方案 酶活（mg/mL） 实施例1 0.23 实施例2 0.48 实施例3 0.35 实施例4 0.33 实施例5 0.39 实施例6 0.41 实施例7 0.45 [0055] 从上表中可以看出，本发明实施例提供的方案具有很好的产酶能力，尤其是添加培养碳源或培养氮源和引进紫外光光源后，酶活提高明显，香菇产纤维素酶的能力得到进一步加强，产酶效率大大提高，说明了本发明提供的香菇发酵生产纤维素酶的方法简单而高效，能实现低投入高产出的香菇产纤维素酶的目的。 [0056] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 |
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