[0001] 本发明涉及一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母及表达方法。

[0002] 溶菌酶(lysozyme)又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，专一的破坏细菌细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，从而使细胞壁破裂而溶解细菌。溶菌酶是一种蛋白质类的抗菌酶，它不同于抗生素，在杀死致病菌的同时不易产生耐药性，因此正逐步发展成为新型的抗生素替代品。

[0003] 乳酸克鲁维酵母是一种优秀的畜禽用益生菌，可分泌多种消化酶类，促进动物肠道健康，同时乳酸克鲁维酵母营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广、分泌蛋白能力强,不产生内毒素，是一种安全级的微生物。同时超强的分泌能力使得乳酸克鲁维酵母已成功地应用于多种蛋白的表达，相比其它酵母，乳酸克鲁维酵母拥有诸多优点，如良好的大规模发酵特性、超强的整合表达能力等,其做为表达系统已显示出巨大的潜力。

[0004] 本发明其目的就在于提供一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母及表达方法，具有工艺简单、易操作的特点。

[0005] 为实现上述目的而采取的技术方案是，一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母，所述乳酸克鲁维酵母为GG779。

[0006] 一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母的表达方法，包括以下步骤：（1）以乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化并合成猪溶菌酶基因，基因两端同时引入NcoI 与EcoRI两个限制性内切酶位点；
（2）使用NcoI 与EcoRI同时对该基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2进行双酶切；
（3）回收酶切产物，4℃连接过夜，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中；
（4）PCR扩增鉴定疑似阳性转化子并测序，同时提取疑似阳性转化子的质粒进行双酶切鉴定，得到正确的重组质粒；
（5）提取重组质粒lys- pKLAC2并使用SacII酶切线性化，线性化的重组质粒转化乳酸克鲁维酵母GG779,经PCR扩增鉴定，获得重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779。

[0007] 有益效果与现有技术相比本发明具有以下优点。

[0008] 本发明与现有技术相比具有工艺简单、易操作的特点。附图说明

[0009] 以下结合附图对本发明作进一步详述。

[0010] 图1为猪溶菌酶基因与pKLAC2质粒连接的阳性克隆子电泳图（引物LYS-F和LYS-R，产物约420bp）；图2为乳酸克鲁维酵母GG779表达LYS蛋白的western bolt图（蛋白大小在15KD左右）；
图3为pKLAC2质粒图谱；
图4为pKLAC2质粒的多克隆位点图谱。

[0011] 一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母，所述乳酸克鲁维酵母为GG779。

[0012] 包含权利要求1所述猪溶菌酶基基因的质粒，所述质粒为乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2。

[0013] 所述猪溶菌酶基因是按乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化并合成的。

[0014] 一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母的表达方法，如图1-4所示，包括以下步骤：（1）以乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化并合成猪溶菌酶基因，基因两端同时引入NcoI 与EcoRI两个限制性内切酶位点；
（2）使用NcoI 与EcoRI同时对该基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2进行双酶切；
（3）回收酶切产物，4℃连接过夜，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中；
（4）PCR扩增鉴定疑似阳性转化子并测序，同时提取疑似阳性转化子的质粒进行双酶切鉴定，得到正确的重组质粒；
（5）提取重组质粒lys- pKLAC2并使用SacII酶切线性化，线性化的重组质粒转化乳酸克鲁维酵母GG779,经PCR扩增鉴定，获得重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779。

[0015] 实施例1猪溶菌酶基因合成
NCBI上发表的猪源溶菌酶序列（ACCESSION：P12069），去掉上游18氨基酸信号肽即为所需表达的成熟肽序列（序列表中序列1），在序列上游添加6个组氨酸的核苷酸序列，以便于后期纯化重组蛋白，通过乳酸克鲁维酵母的密码子偏好性表进行密码子优化，并在其上下游分别设计NcoI 与EcoRI两个限制性内切酶位点及其保护性碱基，对优化好的序列进行人工合成。序列如序列表中序列2所示。

[0016] 序列1Kvydrcefarilkksgmdgyrgvslanwvclakwesnfntkatnynpgsqstdygifqinsrywcndgktpkavnachisckvlldddlsqdiecakrvvrdpqgikawvawkahcqnkdvsqyirgckl
序列2
CATGCCATGGCATCATCATCATCATCATAAGGTTTACGATAGATGTGAATTCGCTAGAATTTTGAAGAAGTCTGGTATGGATGGTTACAGAGGTGTTTCTTTGGCTAACTGGGTTTGTTTGGCTAAATGGGAATCTAATTTCAACACTAAAGCTACTAACTACAACCCAGGTTCTCAATCTACTGATTACGGTATTTTTCAAATCAACTCTAGATACTGGTGTAACGATGGTAAAACTCCAAAAGCTGTTAATGCTTGTCATATTTCTTGTAAGGTTTTGTTGGATGATGATTTGTCTCAAGATATTGAATGTGCTAAAAGAGTTGTTAGAGATCCACAAGGTATTAAGGCTTGGGTTGCTTGGAAAGCTCATTGTCAAAACAAGGATGTTTCTCAATACATTAGAGGTTGTAAATTGGAATTCGC
实施例2
重组质粒lys-pKLAC2的构建
1、lys基因和pKLAC2质粒的双酶切反应
用NcoI 与EcoRI分别对猪溶菌酶基因和pKLAC2质粒双酶切，酶切反应体系为：NcoI 2 uL，EcoRI 2 uL，猪溶菌酶基因/ pKLAC2质粒 40 uL，BSA 1uL，10×H buffer 5 uL，共50 uL，于37℃温箱反应3h。

[0017] 2、lys基因和pKLAC2质粒的连接反应酶切反应结束后，加入10ul的6×loading buffer，使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳分别跑胶，分别回收猪溶菌酶基因和pKLAC2质粒的酶切片段进行连接反应，连接体系为：基因7 uL，质粒10 uL，T4DNA连接酶 1 uL，10×buffer 2 uL，总体积20 uL，4℃连接反应过夜。

[0018] 3、连接产物转化JM109大肠杆菌感受态细胞3.1 取出-80℃冻存的大肠杆菌JM109感受态细胞（100ul装），握于手心中15sec快速融化后置于冰上；
3.2 吸取10uL连接产物轻轻加至大肠杆菌JM109感受态细胞底部，冰浴30min；
3.3 42℃水浴热击90sec，迅速放置冰上1-2min；
3.4 加入LB液体培养基900uL，置于37℃摇床培养120rpm缓慢复苏40min；
3.5 复苏的转化产物涂于含氨苄西林100ug/mL的LB固体平板上， 37℃培养18h。

[0019] 4、转化子菌落PCR鉴定使用LYS-F和LYS-R引物对转化子进行菌落PCR扩增鉴定,引物序列为：
LYS-F：CCATGGCATCATCATCATCATCATAAG；
LYS-R：GAATTCCAATTTACAACCTCTAATGTA
PCR体系如下：LYS-F 5uL， LYS-R 5uL，dNTP 5uL，10×buffer 5uL，transT-Taq酶 1 uL，转化子菌液 1 uL，ddH2O 28 uL，总体积50 uL
PCR扩增程序为：预变性，95℃，5min；变性，95℃，30sec；退火，55℃，30sec；延伸，72℃，
1min；总延伸，72℃，5min。

[0020] 其中，变性，退火，延伸，30 cycle。

[0021] 扩增完成后加入10ul 6×loading buffer， 0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，疑似阳性转化子有420bp的目的条带；将疑似阳性转化子的PCR原液送北京奥科生物工程有限公司测序，测序结果与目的基因序列比对一致。

[0022] 实施例3重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779的构建
1、重组质粒lys-pKLAC2转化乳酸克鲁维酵母GG779使用SacII对重组质粒lys- pKLAC2进行酶切线性化，酶切反应体系为：SacII 2 uL，lys- pKLAC2重组质粒 34uL，10×H buffer 4 uL，共40 uL。于37℃温箱反应3h，酶切完成后，回收线性化质粒，转化乳酸克鲁维酵母GG779感受态细胞，乳酸克鲁维酵母GG779感受态细胞过程及转化步骤如下：
1.1于YPD平板上划线分离乳酸克鲁维酵母GG799，30℃培养48-64h；
1.2挑取乳酸克鲁维酵母GG799单菌落接种于50 mL YPD液体培养基，250rpm 30℃过夜培养种子液；
1.3取50uL过夜培养的种子液，接种于100 mL YPD液体培养基，250rpm，30℃培养至OD600=0.8-1.0；
1.4 4℃ 4000rpm离心5min，收集菌体，用预冷的无菌水25 mL缓慢重悬；
1.5 4℃ 4000rpm离心5min，收集菌体，加1mL 100mM的氯化锂，转入1.5 mL EP管中，
12000rpm离心30sec；
1.6 用400ul 100mM 氯化锂缓慢重悬菌体，50uL/管分装；
1.7取一管新鲜制备的感受态细胞，依次加入50% PEG3350 240uL、1M氯化锂36ul、2mg/mL单链鲑鱼精DNA 25uL、10ug/50uL线性化质粒，剧烈涡旋；
1.8 30℃培养30min，再于42℃培养20min；
1.9 4℃ 4000rpm收集菌体，用1mL YPD液体培养基缓慢重悬菌体，30℃ 120rpm 4h；
1.10 4℃ 4000rpm收集菌体，用1mL无菌水缓慢重悬，涂布于添加5mM乙酰胺的YCB平板，30℃静置3-5天。

[0023] 2、PCR扩增鉴定转化子使用酵母基因组提取试剂盒提取疑似阳性转化子的基因组，以该基因组为模板进行PCR扩增鉴定，PCR反应体系和扩增体系与JM109转化子鉴定相同，从而获得重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779。

[0024] 实施例4重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779的表达
于YPD平板上划线分离重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779，30℃培养48-64h，挑取乳酸克鲁维酵母GG799单菌落接种于10 mL YPD液体培养基，250rpm 30℃过夜培养种子液，取5mL过夜培养的种子液，接种于500 mL YPG液体培养基（1%酵母提取物；2%蛋白胨；2%半乳糖），250rpm，30℃培养48h，5000rpm离心10min，所得上清液即为溶菌酶酶液。

[0025] 实施例5重组猪溶菌酶的纯化
1、饱和硫酸铵沉淀培养基上清中的猪溶菌酶
培养完成的菌液最大转速离心30min，弃菌体沉淀，将等体积的饱和硫酸铵溶液（4.1mol/L，25℃）边搅拌边慢慢加入，加完放磁力搅拌器上4℃搅拌过夜，使蛋白充分沉淀。 
10000rpm 4℃离心30min，弃上清保留沉淀，将沉淀溶于少量（10-20mL）PBS-0.2g/L叠氮钠中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小时更换透析缓冲液，以彻底去除硫酸铵。

[0026] 2、猪溶菌酶蛋白镍柱纯化 相关试剂如下：母液1：29.22g氯化钠，2.42gTris-Base，ddH2O定溶至1L，调节pH=8.0。

[0027] 母液2：6.06gTris-Base，ddH2O定溶至1L，调节pH=8.0。

[0028] Binding buffer：0.1702g咪唑，溶于500 mL母液1。

[0029] Elution buffer：17.02g咪唑，溶于500 mL母液1。

[0030] Washing buffer: 2.3828g咪唑，溶于500 mL母液2。

[0031] 先用Binding buffer平衡镍离子亲和层析柱，然后将待纯化的样品上样于镍柱，结合30min左右，收集留出液Flow Through，用Washing buffer洗3个柱体积，收集Wash throngh，最后用Elution  buffer洗脱蛋白，收集Eluent.将Binding buffer，Wash throngh，Eluent。

[0032] 将镍柱收集的蛋白用Milipore压力超滤浓缩装置通过30kDa超滤膜截留浓缩至10mL左右，将样品通过Gel filtration buffer平衡过的Superdex200分子筛进行分离。

[0033] 实施例6猪溶菌酶的SDS-PAGE验证
1、相关试剂的配制
1.1、Tris-HCl缓冲液(1mol/L,pH8.8)、Tris-HCl缓冲液(0.5mol/L,pH6.8)购于北京诺博莱德科技有限公司
1.2、SDS-PAGE分离胶（15%）
成分 体积（ml）
ddH2O 4.6
30 %丙烯酰胺 10
1.5M Tris-HCl（PH=8.8） 5
10 %SDS 0.2
10 %过硫酸铵 0.2
TEMED 0.008
总体积 20
成分 体积（ml）
ddH2O 4.1
30 %丙烯酰胺 1.0
1.0M Tris-HCl（PH=6.8） 0.75
10 %SDS 0.06
10 %过硫酸铵 0.06
TEMED 0.006
总体积 6
1.3 SDS-PAGE浓缩
1.4、SDS-PAGE电泳缓冲液（Tris-Glycine）：9.4g甘氨酸、1.51g Tris-base、0.5gSDS，ddH2O定容至500ml；
1.5、考马斯亮蓝染色液：称取1.0g考马斯亮蓝R-250，加入50ml冰醋酸、25ml无水乙醇和425mlddH2O，搅拌溶解后过滤；
1.6、考马斯亮蓝脱色液：50ml冰醋酸、25ml无水乙醇，用ddH2O定容至500ml； 1.5 1×Tris-Glycine电泳缓冲液（0.5L）：1.51gTris粉末、9.4g甘氨酸、0.5gSDS、ddH2O定容至
0.5L；
2、纯化猪溶菌酶的SDS-PAGE验证
将纯化的猪溶菌酶中添加SDS-PAGE loading buffer，沸水浴15min，以蛋白质标准分子量为参考，在分离胶为15%的SDS-PAGE蛋白胶上电泳；按以下步骤操作：
2.1、清洗Bio-Rad玻璃板，干燥后安装，按上配方配制分离胶，1mm胶板中加入2ml分离胶液体，至梳齿下1.5cm，覆盖少量ddH2O，待凝固后倒掉覆盖的ddH2O，用滤纸吸净残留的ddH2O；
2.2、同样的方法按上配方配制浓缩胶，灌制于分离胶之上，立即插入1mm胶梳，室温下凝固；
2.3、待浓缩胶制备完成，拔下胶梳，立即将胶板固定于电泳装置上，电泳槽内加入电泳缓冲液，排尽凝胶底部玻璃板间的气泡；
2.4、每孔加样20μL,接通电源，设定电压80V/cm，待染料进入浓缩胶后，调节电压至
120V/cm，至溴酚兰染料距胶底部2cm处停止电泳；
2.5、取下凝胶，考马斯亮蓝染色液中染色过夜；
2.6、过夜染色完成后，使用考马斯亮蓝脱色液进行脱色，每30分钟换脱色液，直到看到清晰的条带为止，结果如图2所示。

[0034] 实施例7重组猪溶菌酶酶活的测定
磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠10.4g，磷酸氢二钠7.86g，乙二胺四乙酸二钠0.37g，加ddH2O定容至1000mL，pH 6.2
底物悬浮液的制备：称取溶酶小球菌20mg，加磷酸盐缓冲液1mL,于研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液，使总体积约为50mL，使悬浮液于25℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05。

[0035] 精密量取25℃的底物悬浮液3mL，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A<[0]>，然后精密量取25℃的纯化的重组溶菌酶0.15mL,加到上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时,至60秒时再测定吸收度A；同时精密量取磷酸盐缓冲液0.15mL，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数A'<[0]>及60秒的读数A'。

[0036] 在室温25℃、pH值6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。按下式计算：                 （A<[0]>－A）－（A'<[0]>－A'）
效价单位数(u/mL)＝───────────────
                          10<6> V
式中 V为所测纯化重组溶菌酶的体积（mL）
经测定，1L乳酸克鲁维酵母培养基表达上清，经纯化后获得20mL重组溶菌酶，其活性为
500U/mL。